Arbeitsanleitung - bei Immundiagnostik
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1. eine Gebrauchsanleitung Bezeichnung Reagenz Konfektion 32 Konfektion 96 Deckelfarbe Enzym Mix 1x 26ul 3x 26ul Primer Sonden Mix 1x 460 ul 3x 460 ul Positivkontrolle 1x 50ul 2x 50yul Negativkontrolle 1x 50Oyul 1x 50ul 5 ERFORDERLICHE LABORGER TE UND HILFSMITTEL Ben tigte Materialien mitgeliefert e Reagenzien f r die real time RT PCR in offenen Systemen z B Mikrotiterplatten e Gebrauchsanweisung Ben tigte Materialien nicht mitgeliefert e real time PCR System z B Applied Biosystems Stratagene Corbett Research RotorGene Cepheid SmartCycler oder Roche LightCycler 480 etc e PCR ReaktionsgefaBe oder optische Mikrotiterplatten mit transparenten optischen Abdeckfolien e Tischzentrifuge 13000 rpm und K hlbeh lter f r PCR Gef e e RNA Extraktionskit f r Stuhlproben z B MutaCLEAN Stool Viral RNA KG1035 Immundiagnostik e Pipetten 0 5 1000 ul mit sterilen Filterspitzen e Sterile Reaktionsgef e 1 5 und 2 0 ml 6 LAGERUNG UND HALTBARKEIT e Alle Reagenzien A1 bis A4 sollten bis zum unmittelbaren Gebrauch bei lt 20 C gelagert werden e Ein mehrfaches Auftauen Einfrieren der Reagenzien A1 A2 und AS ist unbedingt zu vermeiden bei Bedarf nach dem erstmaligem Auftauen geeignete Aliquots herstellen und die Reagenzien dann sofort wieder einfrieren e W hrend der PCR Vorbereitung alle Arbeitsschritte z gig in einem Kryobeh lter durchf hren bzw alle Reagenzien ste2. 000 rpm Vortexer and Cryo container for PCR tubes RNA extraction kit for stool samples e g MutaCLEAN Stool Viral RNA KG1035 from Immundiagnostik Pipettes 0 5 ul 200 ul with sterile filter tips sterile reaction tubes 1 5 ml and 2 0 ml 6 STORAGE AND HANDLING The MutaPLATE Enterovirus real time RT PCR Kit is shipped on dry ice All components must be stored at 20 C in the dark immediately after receipt Do not use reagents after the date of expiry printed on the package After initial usage reagents are stable for up to six months The reagents should not be thawed and frozen more than 2 times If necessary the Primer Probe Mix and the Positive Control have to be aliquoted 7 WARNINGS AND PRECAUTIONS Date 2011 03 22 3 N WINDAT AL MB K eMP EV For in vitro diagnostic use only This assay needs to be carried out by in Molecular Biology methods skilled personnel Clinical samples should be regarded as potentially infectious materials and all equipment used has to be treated as potentially contaminated This assay needs to be run according to GLP Good Laboratory Practice otick to the protocol described below Do not use the kit after its expiration date The Enzyme Mix is liquid even at 18 C Take it out of the freezer shortly before usage and put it back immediately Don t combine MutaPLATE Enterovirus kit components with different lot numbers AMPLIFICATION The PCR technology is utmost sensitive Thus amplifi
3. Immun m Cigar MutaPLATE Enterovirus real time RT PCR Kit Screening Test f r den Nachweis humaner Enterovirus RNA Polio Coxsackie A Coxsackie B und Echoviren in klinischen Proben mittels offenen z B Mikrotiterplattenformat real time PCR Systemen z B von Applied Biosystems Stratagene Corbett Research RotorGene Cepheid SmartCycler etc sowie im LightCycler 480 Roche KG1900232 N KG1900296 V7 y 20 C Nur f r in vitro Diagnostik Immundiagnostik AG Stubenwald Allee 8a 64625 Bensheim Germany www immundiagnostik com Tel 49 0 6251 701900 C info immundiagnostik com Fax 49 0 6251 849430 Stand 22 03 2011 1 N WINDAT AL MB K MPEV 1 VERWENDUNGSZWECK Der MutaPLATE Enterovirus real time RT PCR Kit ist ein qualitativer Screening Test zum Nachweis von Enterovirus RNA Polio Coxsackie A Coxsackie B und Echoviren in klinischen Proben Stuhl Vollblut Plasma Respirationstraktproben CSF cerebrospinal fluid und anderen K rperfl ssigkeiten mittels offenen z B Mikrotiterplattenformat real time PCR oystemen z B von Applied Biosystems Stratagene Corbett Research RotorGene Cepheid omartCycler etc sowie im LightCycler 480 Roche 2 EINLEITUNG Humane Enteroviren sind ubiquit r vorkommende hochinfekti se Krankheitserreger die zur Familie der Picornaviridae geh ren Die mit hoher Inzidenz weltweit ca 500 Millionen Infektionen Jahr vorkommenden Pathogene
4. cation of a single molecule generates millions of identical copies These copies may evade through aerosols and sit on surfaces In order to avoid contamination of samples with RNA which previously was amplified it is important to physically strictly divide sample and reagent preparation units from sample amplification units Set up three separate working areas 1 Area for sample preparation 2 Area for preparation of Master Mix 3 Area for pipetting Master Mix and samples to the PCR tubes Pipets vials and other working materials should not circulate among working units Use always sterile pipette tips with filters Wear separate coats and gloves in each area Avoid aerosols Routinely decontaminate your pipettes and laboratory benches with decontaminant do not use ethanol solutions 8 PROCEDURE 8 1 SAMPLE PREPARATION MutaPLATE Enterovirus real time RT PCR is suitable for the analysis of Enterovirus RNA that has been extracted from clinical specimens with appropriate isolation methods Commercially available kits for RNA isolation are recommended e g MutaCLEAN Stool Viral RNA Immundiagnostik KG1035 Stool Samples Suspend stool sample approx the size of a pea in 1 5 ml sterile water do not use buffers by intensive vortexing and let sediment solid particles if necessary support by centrifugation for 5 min at 3500g Use the supernatant for RNA extraction without any further dilution Very liquid stool samples can b
5. ch mehrmaliges Auf und Abpipettieren ca 15 20 x gut mischen NICHT VORTEXEN Enzym Mix A1 und Primer Sonden Mix A2 Diese Mischung stellt den Master Mix dar kurz in einer Tischzentrifuge abzentrifugieren 15 pl des Master Mix mit einer Mikropipette und sterilen Filterspitzen in jede der LightCycler Kapillaren pipettieren 5 pl der Proben RNA bzw Positiv und Negativ Kontrollen A3 und A4 zu den jeweiligen Kapillaren zupipettieren es empfiehlt sich zuerst die Negativkontrolle zu pipettieren und diese erst am Schluss zu verschlie en um Kontaminationen zu berpr fen Die Kapillaren jeweils unverz glich verschlie en um Kontaminationen zu vermeiden und dann in einer LightCycler Kapillar Zentrifuge kurz abzentrifugieren 4 Folgendes LightCycler RT PCR Protokoll durchf hren 50 C f r 10min reverse Transkription 95 C f r 10min initiale Denaturierung 95 C f r 15sec 45 Zyklen 53 C f r 30sec ramping time 20 C sec aqu mode here SINGLE 72 C fur 15sec 4 C fur 10sec Abkuhlung ev geratebedingt Raumtemperatur Stand 22 03 2011 5 N WINDAT AL MB K MPEV C RT PCR ANALYSE UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE 1 Durchf hrung der real time RT PCR im entsprechenden offenen System 2 Enterovirus spezifische Amplifikation wird mittels FAM Fluoreszenz bei Source 470 Detector 510 nm detektiert Die interne Kontrolle wird mittels VIC bzw HEX JOE Fluoreszenz bei Source 530 Detector 555 nm geme
6. e before setting up the PCR e In every PCR run at least one Positive Control and one Negative Control should be included e Before each use all reagents except the Enzyme Mix should be thawed completely at room temperature briefly vortexed and centrifuged very briefly Then place all reagents on ice or on a cooling block 2 to 8 C Procedure The Master Mix contains all components needed for RT PCR except for the sample Prepare a volume of reaction mix with at least one extra virtual sample more than required for the total number of RT PCR assays to be performed due to the reason of imprecise pipetting Preparation of the Master Mix Primer Probe Mix A2 14 2 pl 14 2 ul x n 1 Enzyme Mix A1 0 8 ul 0 8 ul x n 1 Gently mix Primer Probe Mix and Enzyme Mix in a sterile reaction tube IDO NOT VORTEX Briefly centrifuge in a bench top centrifuge Put the required number of PCR reaction tubes into the cooling block Pipet 15 pl of the Master Mix using micropipets with sterile filter tips into each PCR reaction tube or well of an optical 96 well microtiter plate do not forget the controls Add 5 ul of the RNA eluates do not forget the Water Control the Positive Control A3 and the Negative Control A4 to the corresponding PCR reaction tube It is recommended to close the tubes immediately after filling We further recommend pipetting the Negative Control first but closing its tube at the very end This way contamina
7. e used directly without further resuspension for the RNA extraction to that end vortex intensively and let sediment solid particles if necessary support by centrifugation for 5 min at 35009 Liquor Liquor samples can be used directly native for RNA extraction without prior preparation Swab Soak the swab in 500 ul sterile water do not use buffers and resuspend thoroughly by vortexing Hemove the swab and use remaining liquid for RNA extraction Important In addition to the samples always run a Water Control in your extraction Treat this water control analogous to a sample Comparing the amplification of the Internal Control in the samples to the amplification of the Internal Control in the Water Control will show possible inhibitions of the RT PCR Furthermore possible contaminations during RNA extraction will be detectable If the real time RT PCR is not performed immediately store the extracted RNA at 20 C Further information about RNA isolation are to be found in the extraction kit manual or from the extraction kit manufacturer s technical service Date 2011 03 22 4 N WINDAT AL MB K eMP EV 8 2 Real time Enterovirus MutaPLATE RT PCR PROTOCOL e Please pay attention to the WARNINGS AND PRECAUTIONS on page 3 e Before setting up the PCR familiarize yourself with the real time PCR instrument and read the user manual supplied with the instrument e he programming of the thermal profile should take plac
8. egested in stool even weeks after an acute infection Infections with Enteroviruses can occur throughout the year however in summer contaminated water in swimming pools or lakes lead to an increased number of Enterovirus infections The symptoms caused by Enteroviruses are numerous infections of the upper respiratory tract undifferentiated fever herpangina hand foot mouth disease rash disease paralyses etc 3 PRINCIPLE OF THE TEST The MutaPLATE Enterovirus contains specific primers and fluorescence labelled hydrolysis probes for the detection of Enterovirus RNA in clinical samples Human stool samples or other clinical samples such as whole blood plasma respiratory samples CSF cerebrospinal fluid etc can be used as starting material for RNA extraction and subsequent pathogen analysis with MutaPLATE Enterovirus real time RT PCR Kit The reverse transcription RT of potentially present viral RNA to cDNA and the subsequent amplification of Enterovirus specifc fragments are performed in a one step RT PCR The target sequence for the detection is located in the 5 untranslated region 5 UTR of the viral genome Detection of Enterovirus amplificates is achieved in real time by hybridization and subsequent hydrolysis of Enterovirus specific fluorescence probes Their emitted signal is measured during the PCR process by the optical unit of the real time PCR system in use ABl PRISM SDS Stratagene MxPRO Corbett Research Rot
9. en aber auch hier gut vortexen und nach ggf notwendigem zentrifugieren 2 min 5000 rpm den Uberstand unverd nnt verwenden otand 22 03 2011 4 N WINDAT AL MB K MPEV b Liquor Liquorproben werden unmittelbar nativ in die Extraktion eingesetzt c Abstrichtupfer Bl scheninhalt 2 B Abstrichtupfer zun chst in 500 ul sterilem Reinst Wasser einweichen lassen dann gut vortexen AnschlieBend den Tupfer entnehmen und die verbleibende Fl ssigkeit zur Extraktion einsetzen Falls die real time PCR nicht sofort durchgef hrt wird m ssen die Proben bei 20 C aufbewahrt werden REAL TIME Enterovirus MutaPLATE RT PCR PROTOKOLL Es ist ratsam das gesamte Protokoll zu lesen bevor mit der Durchf hrung begonnen wird Der Ansatz einer Gesamtmenge an Master Mix f r die jeweilige Anzahl an Proben und die entsprechenden Kontrollen sollte folgenderma en erfolgen 1 Die Enzym Mix Menge f r eine Reaktion mit der Anzahl N der durchzuf hrenden 2 Reaktionen inklusive Kontrollen A3 und A4 multiplizieren und zum Ausgleich der Pipettierungenauigkeit einen zus tzlichen virtuellen Ansatz berechnen Mit allen weiteren Reagenzien in der gleichen Weise verfahren Reagenzien w hrend der Arbeitsschritte stets geeignet k hlen Reaktionsvolumen Master Mix Volumen 0 8 pl Enzym Mix A1 0 8 ul x n 1 14 2 ul Primer und Sonden Mix A2 14 2 ul x n 1 Die folgenden Reagenzien in einem sterilen Reaktionsgef dur
10. instructions Make sure that the ethanol containing washing buffer of the isolation kit has been completely removed An additional centrifugation step at high speed is recommended before elution of the RNA Incorrect storage conditions for one or more components or kit expired Check the storage conditions and the date of expiry printed on the kit label If necessary use a new kit and make sure kit components are stored as described in Storage and Handling page 3 Detection of a fluorescence signal in the FAM channel of the negative control Contamination during preparation of the RT PCR Repeat the RI PCR in replicates If the result is negative in the repetition with the old kit components the contamination occurred when the samples were pipetted into the optical PCR reaction tubes Make sure to pipette the Positive Control last and close the optical PCR reaction tube immediately after adding the sample If the same result occurs one or more of the kit components might be contaminated Make sure that work space and instruments are decontaminated regularly Use a new kit and repeat the RT PCR Date 2011 03 22 8 N WINDAT AL MB K eMP EV
11. kulieren e Sterile Pipettenspitzen mit Filtereinsatz benutzen Aerosolbildung vermeiden e F r jeden Arbeitsplatz neue Handschuhe benutzen und Kittel tragen e Regelm ig Pipetten und Laborb nke dekontaminieren keine ethanolhaltigen L sungen benutzen TESTDURCHF HRUNG Die gesamte Durchf hrung ist in folgende drei Schritte aufgeteilt A B C RNA Extraktion aus Stuhlproben Reverse Transkription der RNA und nachfolgende Amplifikation kombinierte Detektion der entstandenen cDNA Templates mittels der Hybridisierungssonden Interpretation der Ergebnisse mit Hilfe der Software des verwendeten real time PCR Kapillarsystems A PROBENVORBEREITUNG 1 Die Extraktion viraler RNA wird mit Hilfe eines kommerziell erh ltlichen RNA Isolierungs Kits z B MutaCLEAN Stool Viral RNA KG1035 von Immundiagnostik aus Stuhlproben bzw anderen klinischen Proben Vollblut Plasma Respirations traktproben CSF cerebrospinal fluid etc durchgef hrt und erfolgt entsprechend den Angaben des Herstellers Dazu bet a Stuhlproben eine erbsengro e Stuhlmenge in ca 1 5 ml sterilem Reinst wasser keine Puffer verwenden aufschwemmen gut vortexen und nach Absinken der festen Bestandteile gegebenenfalls 2 min bei 5000 rpm in einer Tischzentrifuge zentri fugieren den Uberstand als Ausgangsmaterial verwenden Sehr fl ssige Stuhlproben k nnen auch direkt also ohne vorherige Aufschwemmung zur Extraktion eingesetzt werd
12. ng signal in the Enterovirus specific FAM channel is not due to RT PCR inhibition but the sample is a true negative Date 2011 03 22 7 N WINDAT AL MB K eMP EV 9 Troubleshooting The following troubleshooting guide is included to help you with possible problems that may arise when performing a real time RT PCR No fluorescence signal of the Positive Control in the FAM channel e The selected channel for analysis does not comply with the protocol Select the FAM channel for analysis of the Enterovirus specific amplification and the HEX VIC JOE TET channel for the amplification of the Internal Control Incorrect configuration of the RT PCR Check your work steps and compare with procedure on pages 5 e The programming of the thermal profile is incorrect Compare the thermal profile with the protocol on page 5 Incorrect storage conditions for one or more kit components or kit expired Check the storage conditions and the date of expiry printed on the kit label If necessary use a new kit and make sure kit components are stored as described in Storage and Handling page 3 Weak or no signal of the Internal Control and simultaneous absence of a signal in the Enterovirus specific FAM channel RT PCR conditions do not comply with the protocol Check the RT PCR conditions page 5 RT PCR inhibited Make sure that you use an appropriate isolation method see sample Preparation page 4 and follow the manufacturer s
13. nterovirus RNA The detected signal of the Internal Control excludes the possibility of RT PCR inhibition If the Ct value from the Internal Control of the Water Control and the sample differ significantly a partial inhibition has occurred which may lead to negative results in very weak positive samples see Troubleshooting page 8 Neither in the FAM nor in the HEX VIC JOE TET channel a signal is detected A diagnostic statement cannot be made An inhibition of the RT PCH reaction has occurred Date 2011 03 22 6 N WINDAT AL MB K eMP EV Figure 1 and Figure 2 show examples for positive and negative real time RT PCR results 035 ositive sample ET p p 0 25 er c e Ch f orm F hacer E uu TIN negative sample Figure 1 The positive sample shows Enterovirus specific amplification in the FAM channel whereas no fluorescence signal is detected in the negative sample 0 30 ie negative sample 0 20 uu positive sample Norm Fluoro c CH 0 05 4 Threshold 0 00 Em 7 5 10 13 20 25 3l 3t Cycle Figure 2 The positive sample shows a weaker signal in the Internal Control specific HEX VIC JOE TET channel compared to the signal of the Internal Control in the negative sample This is due to competition between both amplification systems Enterovirus specific vs Internal Control The amplification signal of the Internal Control in the negative sample shows that the missi
14. on von Enterovirus RNA in offenen real time PCR Systemen Stuhlproben oder andere klinische Proben wie z B Vollblut Plasma Respirationstrakt Proben CSF cerebrospinal fluid etc k nnen als Ausgangsmaterial f r die RNA Extraktion und den nachfolgenden Erregernachweis eingesetzt werden Zielsequenz zur Detektion ist innerhalb der 5 untranslatierten Region 5 UTR des Enterovirus Genoms W hrend der PCR wird die Spezifit t des entstandenen Amplikons durch real time Hybridisierung und anschlie ende Hydrolyse von Enterovirus spezifischen Sonden mit Fluorophor und Quencher Molek l markierte Oligonukleotide berpr ft Bei spezifischer Enterovirus Amplifikation wird ein Fluoreszenssignal emmittiert welches von der optischen Einheit des real time PCR Mikrotiterplatten Systems ABl PRISM SDS Stratagene MxPRO Corbett Research Rotor Gene 3000 6000 Software detektiert wird Enterovirus spezifische Amplifikation wird dabei mittels FAM Fluoreszenz 470 510 nm gemessen Zudem berpr ft eine in jede Reaktion eingeschlossene interne Kontrolle welche parallel zu den Erregersequenzen koamplifiziert und detektiert wird eine m gliche RT bzw PCR Inhibition Die Detektion dieser amplifizierten internen Kontrolle wird mittels VIC bzw HEX JOE Fluoreszenz 530 555 nm gemessen Stand 22 03 2011 2 N WINDAT AL MB K MPEV 4 KITBESTANDTEILE Jedes Testkit enth lt Reagenzien zur Durchf hrung von 32 bzw 96 Bestimmungen sowie
15. orGene 3000 6000 Cepheid SmartCycler Roche LC480 software Enterovirus specific amplification is measured in the FAM channel 470 510 nm Furthermore MutaPLATE Enterovirus real time RT PCR Kit contains also a separate RNA Internal Control IC which is detected in a second independent amplification system This IC allows the detection of a potential inhibition of the reverse transcription or the PCR By doing so the risk for false negative results is minimized extensively The fluorescence of the RNA internal control is measured in the VIC HEX JOE TET channel 530 555 nm Date 2011 03 22 2 N WINDAT AL MB K eMP EV 4 KIT CONTENT Each kit contains enough reagents to perform 32 or 96 tests the vials contain the indicated amounts and a further surplus and also a package insert Please check provided manual always for current date and use it together with the reagents in the kit Reagent Confection 32 Confection 96 Colour Enzyme Mix 1x 26u l Primer Probe Mix IC 1x 460 ul Positive Control 1x 50yul Negative Control 1x 50ul 5 TEST PERFORMANCE Required materials provided Reagents for real time RT PCR Package insert Required materials not provided Real time PCR instrument e g from ABI Stratagene Mx3500 Corbett Research Rotor Gene Cepheid Smart Cycler Amplifa ECO or Roche Light Cycler 480 PCR reaction tubes or optical microtiter plates with transparent optical covers Table centrifuge 13
16. rus in clinical samples using open real time PCR systems e g Applied Biosystems ABI Corbett Research RotorGene Cepheid omart Cycler Stratagene Mx3500 Amplifa ECO sowie Roche Light Cycler 480 KG1900232 N77 KG1900296 V7 20 C r For in vitro diagnostic use only Immundiagnostik AG Stubenwald Allee 8a 64625 Bensheim Germany www immundiagnostik com Tel 49 0 6251 701900 C info immundiagnostik com Fax 49 0 6251 849430 Date 2011 03 22 1 N WINDAT AL MB K eMP EV 1 INTENDED USE The MutaPLATE Enterovirus real time RT PCR kit is an assay for the specific detection of Enterovirus RNA Polio Coxsackie A Coxsackie B and Echoviruses in stool samples respiratory samples liquor or vesicle fluid using open real time RT PCR systems e g from ABl Corbett Research RotorGene Cepheid Smart Cycler Stratagene Mx3500 Amplifa ECO sowie Roche Light Cycler 480 2 INTRODUCTION Enteroviruses are highly contagious pathogens belonging to the family of Picornaviridae They are small non enveloped ssRNA viruses which are very resistant to environmental conditions Even at pH 3 9 or in the presence of detergence Enteroviruses remain infectious Thus far there are no effective antiviral chemotherapeutics available Until now about 70 serotypes are known The transmission from person to person mainly is fecal orally Contaminated foods and drinking water are important sources of infection The viruses can be
17. sind kleine unbeh llte RNA Viren die sehr resistent gegen ber Umwelteinfl ssen sind So behalten Enteroviren selbst bei pH Werten 3 9 sowie in Anwesenheit von Detergenzien ihre Infektiosit t Bislang sind ca 70 verschiedene Serotypen beschrieben aber kein effektives antivirales Chemotherapeutikum zur Bek mpfung der Viren ist verf gbar Die bertragung der Viren erfolgt von Mensch zu Mensch f kal oral d h ausschlie lich ber Kontakt und Schmierinfektion Kontaminierte Lebensmittel Trink wasser stellen dabei eine wichtige Infektionsquelle dar Das Virus kann noch ber Wochen nach der akuten Erkrankung mit dem Stuhl ausgeschieden werden Enterovirusinfektionen k nnen das ganze Jahr ber auftreten und lebensbedrohende Infektionen hervorrufen insbesondere bei Kindern Im Sommer kommt es in Deutschland zu H ufungen der Infektionen aufgrund kontaminierter Badegew sser Schwimmbad See Enteroviren l sen zahlreiche Krankheitsbilder aus z B Infektionen des oberen Respirations trakts Sommergrippe Herpangina Hand Fu Mund Krankheit jugendlicher Diabetes mellitus Infektionen des Gastrointestinaltrakts Augeninfektionen oder epidemische Myalgie Aber auch Myocarditis Paralysis multiples Organversagen Meningitis und Encephalitis sind h ufig mit einer Enterovirusinfektionen assoziiert 3 TESTPRINZIP MutaPLATE Enterovirus real time RT PCR enth lt spezifische Primer Hydrolysis Sonden und weitere Reagenzien zur Detekti
18. ssen Folgende Einstellung sollten f r die Bestimmung von Reporter Quencher Molek len mit der ABI PRISM SDS Software bzw der vergleichbarer Instrumente gew hlt werden Detection Reporter Quencher Enterovirus RNA 510 nm FAM Interne Kontrolle 555 nm VIC HEX JOE 3 Folgende Resultate sind moglich 1 0354 0 30 Phorm Fluor 0 10 4 0 05 4 c3 LE on E L2 Es wird FAM Fluoreszenz wird detektiert Das Ergebnis ist positiv die Probe enthalt Enterovirus RNA In diesem Fall ist die Detektion der VIC bzw HEX JOE Fluoreszenz nicht notwendig da hohe Enterovirus cDNA Konzentrationen zu einem verminderten fehlenden Fluoreszenz Signal der internen Kontrolle f hren kann Kompetition Es wird keine FAM Fluoreszenz detektiert jedoch eine VIC bzw HEX JOE Fluoreszenz Signal der internen Kontrolle Das Ergebnis ist negativ Die Probe enth lt keine Enterovirus RNA Das detektierte Signal der internen Kontrolle schlie t die M glichkeit einer RT PCHR Inhibition aus Weder FAM noch VIC bzw HEX JOE Fluoreszenz wird detektiert Es kann keine diagnostische Aussage gemacht werden Die PCR Reaktion wurde inhibiert PC v NC 5 10 15 20 25 a0 35 4i Cycle Stand 22 03 2011 6 N WINDAT AL MB K MPEV Immun en MutaPLATE Enterovirus real time RT PCR Kit Version 201 1 For detection of Enterovirus RNA Polio Coxsackie A Coxsackie B and Echovi
19. tions occurring during this pipetting step can be detected In case optical microtiter plates are used cover the used wells with an optical adhesive foil For the real time RT PCR use following thermal profile 1 Reverse Transcription 10 min 50 C 2 Initial Denaturation 10 min 95 C 3 Amplification of cDNA Number of cycles 45 Denaturation 15 sec 95 C Annealing 30 sec 53 C Extension 15 sec 72 C 4 Cooling 10 sec 4 C Date 2011 03 22 5 N WINDAT AL MB K eMP EV 8 3 RT PCR ANALYSIS AND INTERPRETATION OF RESULTS The Enterovirus specific amplification is measured in the FAM channel source 470 nm detection 510 nm The amplification of the Internal Control internal control is measured in the HEX VIC JOE TET channel source 530 nm detection 555 nm Use following settings to define a reporter quencher with the ABI PRISM SDS software Detection Reporter Queer Internal Control IC HEX VIC JOE TET mm Following results can occur A signal in the FAM channel is detected The result is positive The sample contains Enterovirus RNA In this case detection of a signal of the Internal Control in the HEX VIC JOE TET channel is inessential as high concentrations of Enterovirus cDNA may reduce or completely inhibit the amplification of the Internal Control No signal in the FAM channel but a signal in the HEX VIC JOE TET channel is detected The result is negative The sample does not contain E
20. ts geeignet k hlen e Primer Sonden Mix A2 vor Lichtkontakt sch tzen e Alle Reagenzien k nnen bis zum Ablauf des auf der Kit Packung angegebenen Mindesthaltbarkeitsdatum verwendet werden Stand 22 03 2011 3 N WINDAT AL MB K MPEV r 8 HINWEISE UND VORSICHTSMABNAHMEN e Nur zur in vitro Diagnostik e Dieser Test muss durch speziell in Molekularbiologie Techniken geschultes Personal durchgef hrt werden e Die klinischen Proben m ssen als potentiell infekti ses Material angesehen und entsprechend auch entsorgt werden e Die Regeln der Good Laboratory Practice GLP m ssen eingehalten werden e Testkit nach Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatum nicht mehr verwenden AMPLIFIKATION Die PCR Technologie ist sehr sensitiv d h die Vermehrung eines einzelnen Molek ls generiert Millionen identischer Kopien Diese Kopien k nnen in Form von Aerosolen entweichen und sich auf Unterlagen in der Umgebung festsetzen Um eine Kontamination von Proben mit Amplifikaten aus vorausgegangenen Experimenten zu vermeiden sollte in drei m glichst auch r umlich von einander getrennten Bereichen gearbeitet werden und zwar 1 Bereich in dem die Proben vorbereitet werden 2 Bereich in dem der Master Mix angesetzt wird 3 Bereich in dem der Master Mix und die Proben RNA in die PCR Gef e pipettiert werden Pipetten Reaktionsgef e und andere Arbeitsmittel sollten nicht innerhalb dieser drei verschiedenen Arbeitsbereiche zir
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