BProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA
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1. BD ProbeTec ET Legionella pneumophila LP Amplified DNA Assay CE pier Portugu s Patente EUA N 5 270 184 5 547 861 5 648 211 5 712 124 5 744 311 5 846 726 5 851 767 5 866 336 5 919 630 5 928 869 5 958 700 6 054 279 6 090 552 6 117 635 6 251 609 6 316 200 6 656 680 6 743 582 Consulte o gloss rio de s mbolos no fim do folheto informativo UTILIZA O PRETENDIDA O BD ProbeTec ET Legionella pneumophila LP Amplified DNA Assay Ensaio de ADN Amplificado de Legionella pneumophila BD ProbeTec ET para utiliza o com o Sistema BD ProbeTec ET utiliza a tecnologia de Amplifica o por deslocamento de cadeia SDA Strand Displacement Amplification para a detec o qualitativa directa do ADN de Legionella pneumophila grupos serol gicos 1 14 em amostras de expectora o de doentes nos quais h suspeita cl nica de pneumonia Destina se a auxiliar no diagn stico presuntivo de doen a do legion rio em conjunto com a cultura e outros m todos RESUMO E EXPLICA O A doen a do legion rio pode ser adquirida por inala o de aeross is contendo Legionella ou por microaspira o de gua contaminada Em estudos realizados na Europa e na Am rica do Norte foi referido que a Legionella respons vel por 2 a 15 dos casos de pneumonia adquirida na comunidade CAP community acquired pneumonia que requerem internamento hospitalar A taxa de fatalidade dos casos para os doentes com doen a do legion rio de 5 a2. 7 Apesar de n o serem necess rias reas de trabalho dedicadas pelo facto de o desenho do BD ProbeTec ET reduzir a possibilidade de contamina o por produtos de amplifica o no ambiente de teste s o necess rias outras precau es para controlar a contamina o especialmente para evitar a contamina o de amostras durante o processamento 8 As bolsas de reagente que contenham micropo os de inicializa o e de amplifica o n o usados DEVEM ser cuidadosamente seladas ap s a abertura Antes de voltar a selar as bolsas de reagente verificar se cont m dessecante 9 A placa que cont m os micropo os de amplifica o DEVE ser correctamente selada com o selador da placa de amplifica o antes de deslocar a placa do Aquecedor para Inicializa o e Aquecimento BD ProbeTec ET para o instrumento BD ProbeTec ET A selagem garante uma reac o fechada para amplifica o e detec o e necess ria para evitar a contamina o do instrumento e da rea de trabalho com produtos da reac o de amplifica o Nunca retirar o material de selagem dos micropo os 10 Os micropo os de inicializa o com l quido residual ap s transfer ncia de l quido dos micropo os de inicializa o para os micropo os de amplifica o representam uma fonte de contamina o Selar cuidadosamente os micropo os de inicializa o com o selador de placas antes de os eliminar 11 Para evitar a contamina o do ambiente de trabalho com produtos
3. Durante o passo de incuba o a 70 C utilizar um suporte para recipiente de banho maria com uma tampa de rosca para possibilitar uma conten o adicional relativamente a amostras do tracto respirat rio inferior com potencial risco biol gico 4 O BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent cont m dimetil sulf xido DMSO O DMSO altamente t xico por inala o em contacto com a pele ou por ingest o Evitar o contacto com os olhos e usar sempre luvas durante o manuseamento Em caso de contacto com os olhos lavar imediatamente com gua abundante e consultar um m dico Em caso de contacto com a pele lavar imediata e abundantemente com gua 5 Consultar o QlAamp DNA Stool Mini Kit Handbook para obter informa es de seguran a sobre os reagentes QIAGEN utilizados neste procedimento N o eliminar os reagentes QIAGEN para solu es com lix via N o expor os reagentes QIAGEN a lixivia 6 T m havido relat rios que sugerem que os kits de extrac o de ADN QIAGEN n o s o adequados para a reac o em cadeia da polimerase PCR Polymerase Chain Reaction da Legionella devido possibilidade de os reagentes serem contaminados com ADN de Legionella 8 9 Apesar da probabilidade desta ocorr ncia ser baixa e de terem sido identificadas nestes estudos outras esp cies de Legionella al m de L pneumophila o utilizador deve verificar o desempenho de todos os novos lotes de reagentes QIAGEN antes de os utilizar com amostras de doentes
4. tabela 4 Tabela 4 Ensaio BD ProbeTec ET LP Especificidade anal tica Acinetobacter calcoaceticus Actinomyces israelii Adenovirus 5 Aeromonas hydrophila Blastomyces dermatitidis Bordetella bronchiseptica Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Branhamella catarrhalis Candida albicans Chlamydia trachomatis ser tipo L2 Chlamydophila pneumoniae AR 39 Citrobacter freundii Coccidioides immitis Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium jeikeium Cryptococcus neoformans Cytomegalovirus Eikenella corrodens Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterovirus Echovirus Escherichia coli Fusobacterium nucleatum Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae Herpesvirus 1 Histoplasma capsulatum Virus influenza A Virus influenza B Kingella kingae Klebsiella pneumoniae subsp ozaenae tipo 4 Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae Lactobacillus acidophilus Legionella anisa Legionella bozemanii Legionella cherrii Legionella cincinnatiensis Legionella dumoffii Legionella erytha Legionella fairfieldensis Legionella feeleii Legionella gormanii Legionella hackeliae Legionella jordanis Legionella longbeachae Legionella maceachernii Legionella oakridgensis Legionella sainthelensi Legionella spiritensis Legionella worsleiensis Moraxella osloensis Mycobacterium tuberculosis Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Ne
5. 30 apresentando os doentes idosos e imunocomprometidos um risco de morte mais elevado Foram identificadas quarenta esp cies diferentes de Legionella metade das quais est relacionada com doen a em seres humanos A Legionella pneumophila respons vel por 90 dos casos n o diagnosticados de doen a do legion rio Apesar de serem conhecidos catorze grupos serol gicos de L pneumophila 80 das infec es por L pneumophila s o causadas pelo grupo serol gico 1 2 A import ncia do estabelecimento de um diagn stico de pneumonia e respectiva etiologia real ada pela crescente preocupa o sobre a utiliza o excessiva de antibi ticos Os resultados dos testes de diagn stico de L pneumophila devem ser disponibilizados o mais rapidamente poss vel ao m dico uma vez que foi demonstrado que a mortalidade aumenta se houver um atraso na administra o de terap utica apropriada Nos m todos de cultura tradicionais necess rio um per odo m nimo de dois dias para o crescimento de microrganismos Legionella a partir de amostras de expectora o positivas e um total de sete dias para finalizar um resultado negativo Como auxiliares cultura existem kits de imunoensaio enzim tico dispon veis no mercado para detec o do antig nio de L pneumophila grupo serol gico 1 em amostras de urina 3 Contudo os testes de diagn stico das infec es por Legionella que fornecem resultados r pidos com boa sensibilidade e especificidade continuam
6. controlos s o fornecidos em conjunto no Respiratory and Media Diluent and Control Kit CF LP MP Em cada s rie de ensaios numa placa e para cada novo n mero de lote do kit de reagentes devem ser inclu dos um controlo positivo e um controlo negativo Os controlos devem ser colocados de forma aleat ria O controlo positivo monitoriza falhas substanciais nos reagentes O controlo negativo monitoriza a contamina o ambiental e ou de reagentes Os controlos positivo e negativo devem ser testados como positivo e negativo respectivamente de forma a relatar os resultados da amostra Se o desempenho dos controlos n o for o esperado a s rie do ensaio considerada inv lida e o instrumento n o apresenta os resultados do doente Caso os controlos da an lise n o forne am os resultados esperados repita toda a s rie utilizando um novo conjunto de controlos novos micropo os e amostras processadas Se para um teste de repeti o a amostra processada continuar a ser inadequada volte a processar outra al quota da amostra prim ria Se a repeti o dos controlos n o apresentar os resultados esperados contacte os Servi os T cnicos consultar Interpreta o dos resultados do teste No micropo o de inicializa o encontra se um Controlo de amplifica o interno IAC liofilizado O IAC cont m cido nucleico alvo que amplificado na presen a da matriz da amostra O IAC foi concebido para confirmar a validade da reac o de amplifica o
7. da an lise das amostras de expectora o retrospectivas no Ensaio BD ProbeTec ET LP e da cultura resumida na Tabela 3 1 NA 0 0 Global NA 5 2 Tabela 3 O Ensaio BD ProbeTec ET LP resultados retrospectivos comparados com cultura de amostras de expectora o Cultura Estimativas da concord ncia da percentagem IC 95 Local ie Positiva Negativa Total Positiva Negativa Global 6 Positivo 1 0 Negativo 0 0 0 100 1 1 100 1 1 Total 1 0 1 2 5 100 NA 2 5 100 8 Positivo 16 5 21 Negativo 1 24 25 94 1 16 17 82 8 24 29 87 40 46 rota w vi 46 71 3 99 9 64 2 94 2 73 7 95 1 9 Positivo 1 3 4 Negativo 0 22 22 100 1 1 88 22 25 88 5 23 26 motel 22 6 2 59 100 68 8 97 5 69 8 97 6 10 Positivo 3 0 3 Negativo 1 6 7 75 3 4 10096 6 6 90 9 10 total 4 6 10 19 4 99 4 54 1 100 55 5 99 7 Global Positivo 21 8a 29 Negativo 2b 52 54 91 3 21 23 86 7 52 60 88 73 83 potai E ay 83 72 98 9 75 4 94 1 79 94 1 a Oito amostras apresentaram resultados negativos na cultura e positivos no Ensaio BD ProbeTec ET LP Todas as oito amostras obtiveram resultados positivos num ensaio de antig nio urin rio O teste da PCR foi realizado em seis das oito amostras a totalidade das seis amostras obteve um res
8. da reac o de amplifica o utilizar os sacos para res duos fornecidos nas embalagens de reagentes para eliminar micropo os de amplifica o testados Certificar se de que todos os sacos est o correctamente fechados antes de os eliminar 12 TROCAR AS LUVAS nos passos especificados durante o processamento de amostras e procedimento de ensaio de forma a evitar a contamina o cruzada das amostras Se as luvas contactarem com a amostra trocar imediatamente de luvas para evitar contaminar outras amostras 13 Caso a rea de trabalho ou o equipamento sejam contaminados com amostras ou controlos limpar minuciosamente a rea contaminada com hipoclorito de s dio a 1 v v com Alconox e lavar minuciosamente com gua Antes de prosseguir com outros testes deixar a superf cie secar completamente Antes de limpar eventuais reagentes de processamento de amostras QIAGEN limpar as reas afectadas com gua antes de utilizar a solu o de hipoclorito de s dio a 1 v v com Alconox 14 Utilizar apenas o Pipetador BD ProbeTec ET e as Pontas de Pipeta BD ProbeTec ET para transfer ncia de amostras processadas para os micropo os de inicializa o e transfer ncia de amostras dos micropo os de inicializa o para os micropo os de amplifica o 15 Para elimina o de pontas de pipetas tubos de ensaio micropo os e outros materiais descart veis usados seguir as pr ticas laboratoriais estabelecidas Eliminar os materiais descart veis co
9. e aquecimento requer aproximadamente 90 min para aquecimento e estabiliza o A temperatura definida para o componente de inicializa o do aquecedor para inicializa o e aquecimento de 72 5 C A temperatura definida para o componente de aquecimento do aquecedor para inicializa o e aquecimento de 54 C b O instrumento BD ProbeTec ET controlado atrav s de software e requer aproximadamente 30 min para aquecer 2 As temperaturas dos aquecedores devem ser verificadas antes do in cio do ensaio Registe as temperaturas no Registo de Manuten o do Sistema BD ProbeTec ET a Aquecedor para inicializa o e aquecimento O term metro do aquecedor para inicializa o deve situar se entre 72 e 73 C O term metro do aquecedor para aquecimento deve situar se entre 53 5 e 54 5 C 3 Verifique a temperatura exibida no ecr do instrumento BD ProbeTec ET A temperatura deve situar se entre 47 5 e 55 C Registe as temperaturas no Registo de Manuten o do Sistema BD ProbeTec ET B Pipetador Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD ProbeTec ET para obter explica es pormenorizadas sobre as fun es do teclado do Pipetador BD ProbeTec ET Para al m disso necess rio limpar o Pipetador BD ProbeTec ET ap s cada utiliza o Consulte o representante dos Servi os T cnicos para obter orienta es sobre a limpeza e manuten o correctas do Pipetador BD ProbeTec ET Para efectuar o ensaio BD ProbeTec ET LP s o necess r
10. e identificar a inibi o potencial proveniente da amostra processada Controlos De Processamento De Amostras Os controlos de processamento de amostras podem ser testados de acordo com os requisitos dos organismos de acredita o apropriados Um controlo positivo deve testar todo o sistema de ensaio Para este fim amostras com resultados positivos podem servir como controlos para serem processadas e testadas em conjunto com amostras desconhecidas As amostras utilizadas como controlos de processamento devem ser armazenadas processadas e testadas de acordo com o folheto informativo do produto Os controlos de processamento de amostras que simulam amostras do tracto respirat rio inferior tamb m podem ser preparados tal como descrito abaixo 1 Retire um frasco de L pneumophila ATCC 33152 Philadelphia 1 liofilizada do armazenamento a uma temperatura de 20 C ou inferior 2 Reidrate com 1 mL de soro fisiol gico a 0 85 p v com albumina bovina frac o V a 0 2 p v 3 Dilua a L pneumophila de stock reidratada numa propor o de 1 100 000 em soro fisiol gico a 0 85 p v com albumina bovina frac o V a 0 2 p v 4 Pipete 350 uL de L pneumophila dilu da para um tubo com tampa de press o 5 Processe conforme descrito em Processamento de amostras do tracto respirat rio inferior Sec o D Monitoriza o da Presen a de Contamina o com ADN Pelo menos uma vez por m s dever efectuar os procedimentos de teste
11. maria com gua destilada e ferva para utiliza o no passo 38 35 36 37 38 39 40 Transfira 200 uL de l quido de elui o para o tubo correctamente identificado com 400 uL de Respiratory and Media Diluent CF LP MP Tape o tubo e agite no vortex durante 5 s Prepare os controlos Consultar Prepara o de controlo de amostras do tracto respirat rio inferior Sec o E Transfira as amostras e os controlos para um suporte para recipiente de banho maria Coloque o suporte no recipiente de banho maria a ferver durante 5 min No fim deste per odo de tempo retire o suporte no recipiente de banho maria e deixe os tubos arrefecerem temperatura ambiente durante 15 min ADVERT NCIA tenha cuidado para evitar queimaduras provocadas pela gua a ferver o suporte para recipiente de banho maria ou as superf cies do recipiente de banho maria que possam estar quentes 4 Depois de os tubos arrefecerem centrifugue os 16 000 x g durante aproximadamente 5 s NOTA Depois de ferver as amostras 42 NO cri 10 11 12 a Podem ser armazenadas entre 18 e 33 C durante um per odo m ximo de 6 h e podem ser testadas sem ser necess rio repetir a fervura b Podem ser armazenadas at 3 dias entre 2 e 8 C Antes de serem testadas as amostras devem voltar a ser agitadas no vortex e fervidas c Podem ser armazenadas at 14 semanas temperatura de lt 20 C necess rio descongelar as amostras te
12. mes AAAA MN DD AAAA MM MM slutet p m naden Catalog number Katalogov c slo Katalognummer Catalogusnummer Kataloogi number Tuotenumero REF Num ro catalogue Bestellnummer ApiB G kataA you Katal gussz m Numero di catalogo Katalogo Use by Spotrebujte do Anvendes fer Houdbaar tot Kasutada enne Viimeink ytt p iv A utiliser numeris Numer katalogowy N mero do cat logo Katal gov slo N mero de cat logo Authorized Representative in the European Community Autorizovany z stupce pro Evropskou unii Autoriseret repraesentant i EU Erkend vertegenwoordiger in de Europese Unie Volitatud esindaja Euroopa N ukogus Valtuutettu edustaja Euroopan yhteis ss Repr sentant agr pour la C E E Autorisierte EG Vertretung E amp oucto otrju voq avurip ourioa omv Eupwraikr Kov mra Hivatalos k pviselet az Eur pai Uni ban Rappresentante autorizzato nella Comunit europea galiotasis atstovas Europos Bendrijoje Autorisert representant i EU Autoryzowane przedstawicielstwo w Unii Europejskiej Representante autorizado na Uni o Europeia Autorizovany z stupca v Eur pskom spolocenstve Representante autorizado en la Comunidad Europea Auktoriserad representant i EU In Vitro Diagnostic Medical Device L ka sk za zen ur en pro diagnostiku in vitro In vitro diagnostisk medicinsk anordning Medisch hulpmiddel voor in vitro diagnose In vitro dia
13. utilize as gradua es existentes na face lateral do tubo para ajudar a garantir que colocado no tubo o volume correcto Em alternativa utilize um tubo com 350 pL de gua para servir como guia 6 TROQUE DE LUVAS ap s a adi o de amostras 7 Pipete 150 pL de tamp o QIAGEN ASL para cada um dos tubos de ensaio 8 Pipete 25 uL de Proteinase K QIAGEN para cada um dos tubos de ensaio 9 Pipete 500 uL de tamp o de lise QIAGEN AL para cada um dos tubos de ensaio 10 Tape os tubos e agite no vortex durante 5 s Coloque os tubos num suporte de recipiente para banho maria com uma tampa de rosca Todos os passos indicados a seguir devem ser executados numa C mara de Seguran a Biol gica BSC 11 Incube os tubos num recipiente de banho maria a 70 C 5 C durante 15 min 12 Ap s este per odo retire os tubos do recipiente de banho maria e centrifugue 16 000 x 9 durante aproximadamente 5 s 13 Retire os tubos da centrifuga Abra os tubos e adicione 500 uL de etanol a 96 100 14 Volte a tapar os tubos e agite no vortex durante 5 s 15 Centrifugue as amostras 16000 x g durante aproximadamente 5 s 16 Para cada amostra identifique uma coluna de centrifuga o e um tubo de colheita QIAGEN 17 Transfira 700 pL de amostra para a coluna de centrifuga o QIAGEN correctamente identificada 18 Centrifugue os tubos 16 000 x g durante 1 min 19 Transfira as colunas para os novos tubos de colheita QlAamp Elimine os tubo
14. 4 NA 88 8 100 api 100 114 114 96 8 100 a Das 114 amostras negativas em cultura todas obtiveram resultados negativos no ensaio de anticorpos por fluoresc ncia directa Oitenta e sete dos 114 doentes foram igualmente testados com um ensaio de antig nio urin rio tendo obtido resultados negativos b Uma amostra com resultado negativo repetido foi inclu da no c lculo da especificidade Uma amostra n o tinha um volume suficiente para repeti o da an lise Duas amostras mantiveram resultados indeterminados ap s a repeti o da an lise Uma amostra n o tinha um volume suficiente para repeti o da an lise NA N o aplic vel Estudo Retrospectivo O Ensaio BD ProbeTec ET LP foi igualmente avaliado com 83 amostras de expectora o retrospectivas obtidas em centros cl nicos nos Estados Unidos da Am rica Europa e Canad As amostras retrospectivas foram congeladas at um per odo m ximo de seis anos tendo sido a maioria das amostras 65 1 54 83 armazenada durante menos de dois anos Todos os locais registaram o resultado da cultura original para cada uma das amostras retrospectivas Todos os locais testaram as amostras de expectora o no Ensaio BD ProbeTec ET LP e compararam os resultados com os resultados da cultura Uma amostra foi considerada positiva se o resultado da cultura foi positivo Uma amostra foi considerada negativa se o resultado da cultura foi negativa A compara o entre os resultados
15. 9 1712 2 Stout J E Yu V L 2000 Legionellosis N Engl J Med 337 682 687 3 Bartlett J G Dowell S F Mandell L A File T M Musher D M Fine M J 2000 Guidelines from the Infectious Diseases Society of America Practice guidelines for the management of community acquired pneumonia in adults Clin Infect Dis 31 347 82 4 National Committee for Clinical Laboratory Standards 2001 Approved Guideline M29 A2 Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections 2nd ed NCCLS Wayne Pa 12 Garner J S 1996 Hospital Infection Control Practices Advisory Committee U S Department of Health and Human Services Centers for Disease Control and Prevention Guideline for isolation precautions in hospitals Infect Control Hospital Epidemiol 17 53 80 U S Department of Health and Human Services 1999 Biosafety in microbiological and biomedical laboratories HHS Publication CDC 4th ed U S Government Printing Office Washington D C Directive 2000 54 EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work seventh individual directive within the meaning of Article 16 1 of Directive 89 391 EEC Official Journal L262 17 10 2000 p 0021 0045 Van der Zee A Peeters M de Jong C Verbakel H 2002 QIAGEN DNA extraction kits for sample preparation for Legionella PCR are not suitable for diag
16. a podem causar a doen a e 2 o n vel de ADN presente poder situar se abaixo do limite de detec odo teste 0 0 Indeterminado Controlo de amplifica o inibido Necess rio teste adicional para interpreta o do resultado a Repetir o Ensaio BD ProbeTec ET LP a partir do tubo de ensaio processado Se a amostra processada n o tiver um volume insuficiente repita o teste a partir da amostra original Se ap s a repeti o o resultado for positivo ou negativo interprete conforme descrito abaixo Se ap s a repeti o o resultado for indeterminado dever ser pedida uma nova amostra Determina o do limiar para LP e IAC Os valores limiares para o ADN alvo de L pneumophila e IAC foram inicialmente estabelecidos utilizando an lises da curva caracter stica do operador receptor elaborada com os dados obtidos a partir de controlos positivos e negativos Estes valores limiares foram observados em estudos cl nicos e com amostras retrospectivas do tracto respirat rio inferior positivas e negativas para L pneumophila Os valores limiares foram validados em seguida em estudos cl nicos adicionais LIMITA ES DO PROCEDIMENTO 1 O Ensaio BD ProbeTec ET LP espec fico apenas para os grupos serol gicos 1 14 de L pneumophila N o foram testados outros grupos serol gicos de L pneumophila 2 O Ensaio BD ProbeTec ET LP n o detectar infec es provocadas por outras esp cies de Legionella 3 As c
17. a ser limitados PRINC PIOS DO PROCEDIMENTO O BD ProbeTec ET Legionella pneumophila LP Amplified DNA Assay baseia se na amplifica o e detec o simult neas de ADN alvo utilizando primers de amplifica o e uma sonda de detec o com marca o fluorescente Os reagentes de SDA encontram se liofilizados em dois micropo os individuais descart veis A amostra processada adicionada ao micropo o de inicializa o que cont m os primers de amplifica o a sonda de detec o com marca o fluorescente e outros reagentes necess rios para a amplifica o Os primers amplificam uma regi o com 68 pares de bases do gene potenciador de infectividade de macr fagos mip macrophage infectivity potentiator da L pneumophila que se mant m em todos os grupos serol gicos da esp cie Ap s a incuba o a mistura da reac o transferida para o micropo o de amplifica o que cont m duas enzimas uma ADN polimerase e uma endonuclease de restri o necess rias SDA Os micropo os de amplifica o s o selados para impedir a contamina o e em seguida incubados num leitor de fluoresc ncia com controlo de temperatura que monitoriza as reac es quanto forma o de produtos amplificados Cada uma das reac es co amplifica e detecta um Controlo de amplifica o interno IAC Internal Amplification Control com o objectivo de verificar se existem as condi es adequadas para a amplifica o e para reduzir a possib
18. ade de forma a mostrar 2 quadrados para os passos Encher e Distribuir pue Programa 5 1 Prima a tecla Prog Prima a tecla Vol at ser exibido 5 para seleccionar o programa 5 Prima Enter 2 Para entrar no modo de programac o prima e mantenha premida a tecla Prog Mantendo a tecla Prog premida prima em simult neo a tecla de func o especial com uma ponta de pipeta ou a extremidade de um clipe de papel Prima Fill Prima a seta para cima at ser exibido 100 Prima Enter Prima Disp Prima a tecla de seta para cima at ser exibido 100 Prima Enter Prima Mix Misturar Prima a tecla de seta para cima at ser exibido 50 Prima Enter Prima novamente Enter para guardar o programa e sair Ser emitido um sinal sonoro para indicar que a programa o foi conclu da 7 Verifique o seu programa premindo o gatilho para avan ar passo a passo medida que efectua cada uma dos passos estabele a a velocidade de aspira o distribui o mistura utilizando a tecla Vol Em cada passo aparecer o indicador de velocidade Utilize a tecla Vol para ajustar o indicador de velocidade de forma a mostrar 2 quadrados para as fun es de aspira o e distribui o Utilize a tecla Vol para regular a velocidade de mistura de forma a serem mostrados 3 quadrados EE EL oi ad Revis o de Programa Os programas devem ser revistos antes do in cio do procedimento Para rever o programa LIGUE o pipetad
19. aracter sticas de desempenho do Ensaio BD ProbeTec ET LP apenas foram estabelecidas com amostras de expectora o O desempenho com outros tipos de amostras n o foi determinado O Ensaio BD ProbeTec ET LP apenas foi avaliado com doentes com idade igual ou superior a 13 anos 5 Tal como acontece com muitos testes de diagn stico os resultados obtidos com o Ensaio BD ProbeTec ET LP devem ser interpretados em conjunto com outras informa es cl nicas e laboratoriais que o m dico possua 6 Um resultado de teste negativo n o exclui a possibilidade de infec o uma vez que os resultados dos testes podem ser afectados pela colheita incorrecta de amostras erro t cnico confus o de amostras antibioterapia simult nea ou a presen a de uma quantidade de ADN de L pneumophila na amostra abaixo da sensibilidade anal tica do teste 7 O Ensaio BD ProbeTec ET LP n o pode ser utilizado para avaliar o sucesso ou a falha de terap utica uma vez que os cidos nucleicos de L pneumophila podem persistir ap s terap utica antimicrobiana 8 O Ensaio BD ProbeTec ET LP n o foi avaliado com amostras ambientais por exemplo gua pot vel ou em testes da qualidade da gua 9 O desempenho ptimo deste ensaio requer a colheita e manuseamento adequados das amostras 10 A utiliza o do Ensaio BD ProbeTec ET LP est limitada a pessoal com forma o no procedimento de ensaio e no Sistema BD ProbeTec ET 11 O Ensaio BD ProbeTec ET LP fornece resu
20. c o contudo o limite de detec o LOD Limit of Detection real pode ser inferior ao n vel mais baixo testado Com base em 100 de positividade a sensibilidade anal tica para os grupos serol gicos 1 e 11 foi de 300 UFC reac o foi de 450 UFC reac o para o grupo serol gico 13 e 700 UFC reac o para o grupo serol gico 14 A sensibilidade anal tica do Ensaio BD ProbeTec ET LP na presen a de uma matriz de amostras do tracto respirat rio inferior foi determinada atrav s da adi o de um stock de L pneumophila grupo serol gico 1 infectadas com macr fagos a expectora o em n veis de 0 150 300 e 450 UFC por reac o As amostras foram processadas e analisadas em triplicado Com base em 100 de positividade a sensibilidade anal tica para as amostras do tracto respirat rio inferior adicionadas foi de 150 UFC reac o contudo o limite de detec o real pode ser inferior ao n vel mais baixo testado Especificidade Anal tica Utilizando o Ensaio BD ProbeTec ET LP avaliaram se 79 microrganismos 69 bact rias uma levedura e nove v rus Os isolados bacterianos foram testados em concentra es que variaram entre 1 x 108 UFC mL a 1 x 108 UFC mL Os v rus foram testados numa concentra o de 1 x 106 part culas virais mL Coccidioides immitis foi preparado como uma suspens o de mic lios equivalente a um padr o n 5 de McFarland Nenhum dos microrganismos testados produziu um resultado positivo ou foi inibido pelo IAC
21. cropo os de inicializa o 1 A H NOTA N o esvazie o pipetador sobre as amostras ou micropo os pois poder ocasionar contamina o Os movimentos abruptos poder o originar a forma o de got culas ou aeross is 5 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Elimine as pontas Pressione o gatilho do pipetador para redefinir o pipetador NOTA Elimine as pontas com cuidado para evitar a ocorr ncia de derrames ou got culas que possam contaminar a rea de trabalho Encaixe novas pontas expanda o pipetador e aspire 200 uL da 2 coluna de amostras Esvazie suavemente o pipetador toque com as pontas das pipetas nas paredes laterais dos po os e distribua 150 uL na coluna correspondente de micropo os de inicializa o 2 A H Elimine as pontas Continue a transferir as restantes amostras para essa s rie Tape a placa do micropo o de inicializa o com a cobertura de placa de inicializa o e deixe a placa incubar temperatura ambiente durante pelo menos 20 min Pode permanecer at 6 h NOTA Volte a tapar as amostras processadas com novas tampas TROQUE DE LUVAS No fim da incuba o da reac o de inicializa o prepare a placa do micropo o de amplifica o Configure os micropo os de amplifica o na placa de forma a corresponderem ao Relat rio de Disposi o da Placa igual placa de inicializa o Volte a selar a b
22. de amostras do tracto respirat rio inferior Sec o D F Procedimento de Teste para o Ensaio BD ProbeTec ET LP NOTA Antes de efectuar este procedimento de reste disponha as amostras e os controlos processados num suporte com capacidade para tubos de ensaio de 2 mL tais como o suporte de tubos de ensaio BD ProbeTec ET de 2 mL compat vel com o Pipetator BD ProbeTec ET 1 2 3 Qoid Retire e elimine as tampas das amostras e controlos arrefecidos Antes de prosseguir TROQUE DE LUVAS para evitar a contamina o Utilizando o Relat rio de Disposi o da Placa prepare a placa do micropo o de inicializa o consultar Disposi o da placa Secc o C Volte a selar as bolsas do micropo o conforme indicado a seguir a Coloque a bolsa numa superf cie plana Com uma m o mantenha a extremidade aberta plana b Enquanto aplica press o deslize os dedos atrav s da face exterior do selo de uma extremidade da bolsa para a outra c Examine para garantir que a bolsa est fechada Seleccione o programa 1 no Pipetador BD ProbeTec ET Encaixe as pontas de pipetas Expanda o Pipetador BD ProbeTec ET puxando totalmente o bot o de afastamento NOTA Certifique se de que as pontas est o bem encaixadas no pipetador para evitar derrames Aspire 200 pL da 1 coluna de amostras Esvazie suavemente o pipetador toque com as pontas das pipetas nas paredes laterais dos po os e distribua 150 uL na coluna correspondente de mi
23. descritos em seguida de forma a monitorizar a rea de trabalho e as superf cies do equipamento em rela o contamina o com ADN A monitoriza o ambiental essencial para detectar a contamina o antes da ocorr ncia de um problema 1 Para cada uma das reas a ser testada utilize uma zaragatoa BBL CultureSwab EZ 2 Identifique um tubo com tampa de rosca de 2 mL para cada rea a ser testada Pipete 600 uL de diluente de amostras do tracto respirat rio e de meios para cada um dos tubos e adicione 300 uL de tamp o QIAGEN AE ou gua destilada de grau molecular Agite no vortex durante 5 s para misturar 3 Mergulhe a primeira zaragatoa no diluente preparado no passo 2 e limpe a primeira rea com um movimento de varrimento alargado 4 Rode a zaragatoa no diluente pressionando contra a face lateral do tubo Volte a tapar o tubo e agite no vortex durante 5 s Elimine a zaragatoa 5 Repita o procedimento para todas as reas a serem testadas Coloque os tubos num suporte para recipiente de banho maria e aqueca num banho maria de gua a ferver durante 5 min Retire o suporte do banho maria e deixe as amostras arrefecerem 15 min temperatura ambiente 7 Depois de os tubos arrefecerem centrifugue os 16 000 x g durante aproximadamente 5 s 8 Enquanto os tubos estiverem a aquecer utilize toalhas limpas saturadas com gua para remover res duos da mistura de tamp o das superf cies testadas 9 Logo que as amostras
24. e total heparina 2 65 Lidoca na a 2 0 21 Solu o de indu o de expectora o NaCl a 3 0 32 Azitromicina 0 42 ug mL Penicilina G 17 ug mL Tetraciclina 2 3 ug mL Doxiciclina 26 5 ug mL Ciprofloxacina 4 88 pg mL Mycoplasma pneumoniae 5 x 108 cells mL Chlamydophila pneumoniae 1 06 x 107 EBs mL Mycoplasma pneumoniae e Chlamydophila 1 06 x 107 c lulas mL e 1 06 x 107 CE mL pneumoniae respectivamente Reprodutibilidade A reprodutibilidade do Ensaio BD ProbeTec ET LP foi avaliada em tr s laborat rios atrav s do teste de um painel constitu do por 24 amostras adicionadas a PBS BSA O painel era composto por 12 amostras negativas para L pneumophila tr s eram amostras positivas fracas 300 UFC reac o e tr s eram amostras positivas elevadas 500 UFC reac o para L pneumophila e tr s amostras positivas fracas 30 corpos elementares reac o 300 UFC reac o 900 c lulas reac o respectivamente e tr s amostras positivas elevadas 50 corpos elementares reac o 500 UFC reac o 1500 c lulas reac o respectivamente contendo Chlamydophila pneumoniae CP L pneumophila LP e Mycoplasma pneumoniae MP Um operador em cada local testou os pain is uma vez por dia durante tr s dias apresentado um resumo dos resultados na Tabela 6 Tabela 6 Estimativas de reprodutibilidade do tracto respirat rio inferior por n vel de amostra Em dias diferentesNo Em diferentes mesmo local
25. etes de papel ou compressas de gaze com hipoclorito de s dio a 1 v v com Alconox e limpe o man pulo do pipetador APENAS O MAN PULO Ap s um per odo de 2 a 3 min limpe o man pulo com toalhetes de papel ou compressas de gaze humedecidas com gua b Mergulhe o suporte para recipientes de banho maria e as placas em hipoclorito de s dio a 1 v v com Alconox durante 1 a 2 min Lave minuciosamente com gua e deixe secar ao ar c Volte a encher o pipetador d Elimine o saco para res duos e o saco de materiais com risco biol gico selados de acordo com os procedimentos estabelecidos para elimina o de res duos contaminados Execute os seguintes procedimentos pelo menos uma vez por semana a Elimine a gua utilizada nos banhos maria b Limpe os recipientes de banho maria com hipoclorito de s dio a 1 v v com Alconox Lave com gua e deixe secar ao ar c Volte a encher com gua destilada Controlo de Qualidade Os requisitos do controlo de qualidade devem ser efectuados de acordo com os regulamentos ou requisitos de acredita o europeus e ou nacionais aplic veis e com os procedimentos padr o de controlo de qualidade do seu laborat rio recomendado que o utilizador consulte as normas do CLSI anteriormente NCCLS e os regulamentos da CLIA que dizem respeito a este assunto para obter orienta es sobre as pr ticas de controlo de qualidade apropriadas O diluente de amostras do tracto respirat rio e de meios e os
26. gnostika meditsiiniaparatuur L kinn llinen in vitro diagnostiikkalaite Dispositif m dical de diagnostic in vitro Medizinisches In vitro Diagnostikum In vitro tayvoocrkr rarpikr euokeur In vitro diagnosztikai orvosi eszk z Dispositivo medico diagnostico in vitro In vitro diagnostikos prietaisas In vitro diagnostisk medisinsk utstyr Urzadzenie medyczne do diagnostyki in vitro Dispositivo m dico para diagn stico in vitro Medic nska pom cka na diagnostiku in vitro Dispositivo m dico de diagn stico in vitro Medicinsk anordning f r in vitro diagnostik Temperature limitation Teplotn omezen Temperaturbegraensning Temperatuurlimiet Temperatuuri piirang L mp tilarajoitus Temp rature limite Zul ssiger Temperaturenbereich Opto Oeppokpao aq H m rs kleti hat r Temperatura limite Laikymo temperat ra Temperaturbegrensning Ograniczenie temperatury Limita o da temperatura Ohrani enie teploty Limitaci n de temperatura Temperaturbegr nsning Consult Instructions for Use Prostudujte pokyny k pou it L s brugsanvisningen Raadpleeg gebruiksaanwijzing Lugeda kasutusjuhendit Tarkista k ytt ohjeista Consulter la notice d emploi Gebrauchsanweisung beachten ZuufiouAeure re ti o ny eq xprjong Olvassa el a haszn lati utas t st Consultare le istruzioni per l uso Skaitykite naudojimo instrukcijas Se i bruksanvisningen Zobacz instrukcja u ytkowania Con
27. iar para aplicar o selador Pressione o selador para baixo de forma a garantir que todos os micropo os ficam totalmente selados Na interface do utilizador do instrumento BD ProbeTec ET desloque o transportador para fora abra a porta e levante a cobertura da placa Transfira IMEDIATAMENTE m ximo de 30 s a placa de micropo os de amplifica o selada para o instrumento BD ProbeTec ET e inicie a an lise Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD ProbeTec para obter instru es pormenorizadas Depois de iniciar a an lise prossiga com a parte do procedimento de limpeza descrita a seguir a Sele os micropo os de inicializa o com um selador de placa de amplifica o e retire a placa do aquecedor para inicializa o e aquecimento ADVERT NCIA A temperatura superior a 70 C Utilize uma luva resistente ao calor para retirar a placa b Deixe a placa arrefecer na bancada durante 5 min c Retire os micropo os de inicializa o selados da placa segurando ambos os lados do selador e levantando os po os a direito como uma unidade Coloque os micropo os selados num saco para res duos e sele d Limpe a placa de metal Lave a placa com solu o de hipoclorito de s dio a 1 v v Alconox Lave a placa com gua Envolva a placa numa folha de papel limpa e deixe secar completamente ao ar antes de voltar a utilizar Quando a an lise estiver conclu da ser elaborada uma c pia impressa dos resultados do teste Desloq
28. ilada L pneumophila ATCC 33152 Philadelphia 1 Albumina Bovina Frac o V a 0 2 P V em soro fisiol gico a 0 85 P V hipoclorito de s dio a 1 v v com Alconox Dissolva 7 5 g de Alconox com 1 L de solu o de hipoclorito de s dio a 1 v v e misture Prepare diariamente Requisitos de Armazenamento e Manuseamento As embalagens de reagentes BD ProbeTec ET LP podem ser armazenadas entre 2 e 33 C N o utilizar as embalagens de reagentes fechadas ap s o fim do prazo de validade Depois da abertura de uma bolsa os micropo os permanecer o est veis durante 12 semanas desde que tenham sido correctamente resselados ou at ao prazo de validade o que ocorrer primeiro N o congelar O BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit CF LP MP pode ser armazenado entre 2 e 33 C N o utilizar os reagentes ap s o fim do prazo de validade N o congelar Advert ncias e Precau es Para diagn stico in vitro 1 Nas amostras podem existir microorganismos patog nicos incluindo os v rus das hepatites e o v rus da imunodefici ncia humana No manuseamento de todos os itens contaminados com sangue e outros fluidos corporais devem ser seguidas as Precau es padr o 47 e as linhas de orienta o da institui o 2 O manuseamento e prepara o das amostras do tracto respirat rio inferior antes do passo de incuba o a 70 C devem ser executados numa C mara de seguran a biol gica de classe II BSC 3
29. ilidade de apresenta o de um resultado falso negativo devido presen a de inibidores do ensaio A presen a ou aus ncia de ADN de L pneumophila determinada pelo c lculo dos resultados PAT Passes After Threshold Passagem ap s limiar para a amostra com base em valores limiares predeterminados O instrumento apresenta automaticamente estes resultados como positivos negativos ou indeterminados REAGENTES E MATERIAIS Cada embalagem de reagentes BD ProbeTec ET Legionella pneumophila LP Amplified DNA Assay cont m Micropo os de inicializa o de Legionella pneumophila LP 1 x 24 6 oligonucle tidos gt 7 5 pmol dNTP gt 15 2 nmol 2 sondas de detec o gt 22 5 pmol Oligonucle tido sint tico gt 1500 c pias Micropo os de amplifica o de Legionella pneumophila LP 1 x 24 Enzima de restri o gt 33 unidades ADN polimerase gt 14 unidades 10 coberturas de placas de inicializa o 16 seladores de placas de amplifica o 1 2 8 sacos para res duos BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit CF LP MP Conte do Diluente Respirat rio e de Meios Bicina Fosfato de Pot ssio Hidr xido de Pot ssio DMSO e Proclin 10 Controlos Positivos CF LP MP gt 1050 ng DNA de Esperma de Salm o gt 47 3 ug Tris gt 9 0 ug EDTA gt 3600 C pias de Plasm deo de CF gt 4800 C pias de Plasm deo de LP gt 5400 C pias de Plasm deo de MP 10 Controlos Negativos CF LP MP gt 1050
30. ios os seguintes programas O programa 1 transfere l quido das amostras processadas para os micropo os de inicializa o LP O programa 5 transfere l quido dos micropo os de inicializa o LP para os micropo os de amplifica o LP Programe o pipetador da seguinte forma Programa 1 1 LIGUE o pipetador O pipetador ir emitir um sinal sonoro mostrar rapidamente ZERO mostrar rapidamente o n de vers o do software e por fim emitir novo sinal sonoro 2 Prima a tecla azul Prog Programa Prima a tecla Vol Volume at ser exibido 1 para seleccionar o programa 1 Prima Enter 3 Para entrar no modo de programa o prima e mantenha premida a tecla Prog Mantendo a tecla Prog premida prima em simult neo a tecla de fun o especial com uma ponta de pipeta ou a extremidade de um clipe de papel Prima Fill Encher Prima a seta para cima at ser exibido 200 Prima Enter Prima Disp Distribuir Prima a tecla de seta para cima at ser exibido 150 Prima Enter 6 Prima novamente Enter para guardar o programa e sair Ser emitido um sinal sonoro para indicar que a programa o foi conclu da 7 Verifique o seu programa premindo o gatilho para avan ar passo a passo medida que efectua cada um dos passos estabele a a velocidade de aspira o distribui o utilizando a tecla Vol Em cada passo aparecer o indicador de velocidade Utilize a tecla Vol para regular o indicador de velocid
31. isseria meningitidis Neisseria mucosa Virus parainfluenza Peptostreptococcus anaerobius Porphyromonas asaccharolytica Prevotella oralis Pseudomonas aeruginosa Virus sincicial respiratorio estirpe longa Rhinovirus Salmonella choleraesuis ser tipo Enteriditis Salmonella choleraesuis ser tipo Typhi Serratia marcescens Staphylococcus aureus produtor de proteina A Staphylococcus aureus n o produtor de prote na A Staphylococcus epidermidis Stenotrophomonas maltophilia Streptococcus do Grupo B Streptococcus mutans Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Tatlockia Legionella micdadei Veillonella parvula Subst ncias Interferentes Subst ncias potencialmente interferentes que se podem encontrar em amostras do tracto respirat rio inferior foram testadas com o Ensaio BD ProbeTec ET LP na aus ncia de alvo ou na presen a de 750 UFC reac o de L pneumophila Nas concentra es apresentadas na Tabela 5 e na aus ncia de alvo nenhuma das subst ncias testada produziu um resultado positivo ou inibiu o IAC Quando o alvo estava na presen a das subst ncias nas concentra es apresentadas na Tabela 5 todas as amostras testadas produziram um resultado positivo 11 Tabela 5 Ensaio de LP BD ProbeTec ET Subst ncias pesquisadas relativamente a interfer ncia Amostras do tracto respirat rio inferior Subst ncias testadas Concentra o Sangu
32. locais Membro do painel N correcto PAT m dio DP CV DP CV LP HIGH 27 100 0 47 2 0 94 2 00 1 42 3 02 LP LOW 27 100 0 44 8 0 44 0 98 2 06 4 59 CP LP MP HIGH 27 100 0 46 2 1 13 2 45 1 79 3 88 CP LP MP LOW 26a 100 0 43 0 0 00 0 00 2 59 6 01 Negativo 108 100 0 0 0 IAC com amostras negativas para LP 108 100 095 47 8 0 43 0 91 0 34 0 70 a Uma amostra exclu da da an lise devido a um erro de procedimento APRESENTA O Est o dispon veis os seguintes produtos BD ProbeTec ET N de Cat Descri o 440728 BD ProbeTec ET Legionella pneumophila LP Amplified DNA Assay 440731 BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit 440457 BD ProbeTec ET Accessories Kit 10 coberturas de placas de inicializa o 16 seladores de placas de amplifica o 1 2 e 8 sacos para res duos 440458 BD ProbeTec ET Pipette Tips 6 x 120 440661 BD ProbeTec ET 2 mL Sample Tubes and Caps 200 cada 440679 BD ProbeTec ET 2 mL Caps 100 440477 BD ProbeTec ET Instrument Fora dos EUA 440478 BD ProbeTec ET Instrument E U A e Canad 440479 BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater 220V 440480 BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater 120V 440487 BD ProbeTec ET Pipettor 440502 BD ProbeTec ET Lysing Rack BIBLIOGRAFIA 1 Cloud J L Carroll K C Pixton P Erall M Hillyard D R 2000 Detection of Legionella species in respiratory specimens using PCR with sequencing confirmation J Clin Micro 38 170
33. ltados qualitativos N o pode ser estabelecida nenhuma correla o entre a grandeza do valor PAT e a quantidade de ADN de L pneumophila presente numa amostra RESULTADOS ESPERADOS A Preval ncia O grau de positividade observado nos testes de L pneumophila vari vel dependendo do m todo de teste utilizado da idade do doente da presen a de factores de risco subjacentes da localiza o geogr fica e mais importante da preval ncia local da doen a incluindo poss veis situa es de surtos B Distribui o da Frequ ncia dos Resultados PAT Em quatro centros cl nicos dos EUA Europa e Canad foi colhido um total de 83 amostras retrospectivas de expectora o que foram testadas com o Ensaio BD ProbeTec ET LP A distribui o da frequ ncia dos valores PAT para LP comparada com cultura mostrada na figura 1 Figura 1 Distribui o da frequ ncia dos resultados PAT para LP comparada com cultura 60 50 S 40 v B Cultura 330 g U Cultura E 20 10 0 0 1 19 20 39 40 60 Resultado PAT para LP Resultado da cultura 0 1 19 20 39 40 60 Total Negativo 52 0 4 4 60 Positivo 2 0 2 19 23 Total 54 0 6 23 83 C Controlos Durante a avaliac o cl nica foram observadas falhas do controlo para o Ensaio BD ProbeTec ET LP em uma entre 46 an lises ou seja uma an lise apresentou um erro de procedimento Os resultados PAT para LP para as restantes 45 a
34. m cuidado Selar e eliminar os reservat rios de res duos quando atingirem da capacidade ou diariamente o que ocorrer primeiro 16 N o permutar nem misturar micropo os controlos ou reagentes de processamento provenientes de kits com n meros de lote diferentes 17 Contactar os Servi os T cnicos se ocorrem situa es invulgares tais como derrame no instrumento BD ProbeTec ET ou contamina o com ADN que n o possa ser removida atrav s de limpeza 2 COLHEITA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS 1 Colheita de amostras A colheita de amostras deve ser efectuada de acordo com as recomenda es do Clinical Microbiology Procedures Handbook Manual de Procedimentos de Microbiologia Cl nica ou do manual de procedimentos do seu laborat rio 2 Armazenamento e transporte de amostras As amostras podem ser armazenadas transportadas entre 18 e 33 C durante um per odo inferior a 6 h As amostras podem ser refrigeradas entre 2 e 8 C durante um per odo inferior a 3 dias As amostras podem ser refrigeradas a uma temperatura inferior ou igual a 20 C durante um per odo inferior a 14 semanas PROCEDIMENTO DO TESTE Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD ProbeTec ET para obter instruc es espec ficas sobre a utilizac o e manuten o dos componentes do sistema A Prepara o do Instrumento 1 O instrumento deve estar ligado todos os instrumentos dever o aquecer antes de iniciar o ensaio a O aquecedor para inicializa o
35. mostra foi considerada positiva se o resultado da cultura foi positivo Um resultado foi considerado negativo se o resultado da cultura foi negativo Todos os resultados iniciais indeterminados foram repetidos a partir da amostra processada ou da amostra original no caso de existir uma quantidade insuficiente de amostra processada N o foram inclu das nas caracter sticas de desempenho as amostras que obtiveram um resultado indeterminado inicialmente e na repeti o ou seja final As amostras que obtiveram um resultado inicial indeterminado e um resultado positivo ou negativo na repeti o foram inclu das nas caracter sticas de desempenho As amostras cujo resultado inicial tenha sido indeterminado mas cuja an lise n o p de ser repetida devido a um volume de amostra insuficiente permanecerem com um resultado de indeterminado inicial e n o foram inclu das nas caracter sticas de desempenho A compara o entre os resultados da an lise das amostras de expectora o no Ensaio BD ProbeTec ET LP e da cultura resumida na Tabela 2 Tabela 2 Ensaio BD ProbeTec ET LP resultados prospectivos comparados com cultura de amostras de expectora o compara o com cultura Indeterminadoinicial final Sensibilidade IC 95 Especificidade IC 95 Local 100 17 17 80 5 100 100 2 2 2 na 15 8 100 an 100 31 31 3 NA 88 8 100 m 100 33 33 3 6 NA 89 4 100 210 100 31 31
36. mperatura ambiente voltar a agitar no vortex e repetir a fervura antes de serem testadas As amostras est o prontas para o Procedimento de teste do Ensaio BD ProbeTec ET LP Sec o F Prepara o do Controlo de Amostras do Tracto Respirat rio Inferior Para cada s rie de tubos placa a ser testada prepare um tubo de controlo negativo CF LP MP e um tubo de controlo positivo CF LP MP Se uma placa contiver mais de um n mero de lote da embalagem de reagente os controlos devem ser testados com cada lote Inverta suavemente o tamp o QIAGEN AE e o diluente de amostras do tracto respirat rio e de meios antes da utiliza o Retire a tampa do tubo de controlo negativo CF LP MP Utilizando uma pipeta nova para cada um dos tubos de controlo adicione 200 uL de tamp o QIAGEN AE Utilizando uma pipeta nova para cada um dos tubos de controlo adicione 400 pL de diluente de amostras do tracto respirat rio e de meios Recoloque as tampas nos tubos apertando bem Retire a tampa do tubo de controlo positivo CF LP MP Utilizando uma pipeta nova para cada um dos tubos de controlo adicione 200 uL de tamp o QIAGEN AE Utilizando uma pipeta nova para cada um dos tubos de controlo adicione 400 uL de diluente de amostras do tracto respirat rio e de meios Recoloque as tampas nos tubos apertando bem Agite os tubos de controlo no vortex durante 5 s Os controlos est o agora prontos para serem fervidos Consultar Processamento
37. n lises est o resumidos na tabela 1 Tabela 1 Distribuic o dos resultados PAT para LP para controlos de amostras do tracto respirat rio e de meios Controlo Intervalo 5 percentil M dia Mediana 95 percentil Negativo para LP 45 0 0 0 0 0 0 Positivo para LP 45 29 4 50 7 40 1 46 7 47 6 49 7 CARACTER STICAS DO DESEMPENHO Estudo Prospectivo Durante a poca de doen as respirat rias de 2002 2003 o Ensaio BD ProbeTec ET LP foi avaliado de forma prospectiva em sete centros cl nicos nos Estados Unidos da Am rica e no Canad Em cada doente foi colhida uma amostra de expectorac o e uma amostra de urina As amostras de expectora o foram testadas utilizando o Ensaio BD ProbeTec ET LP a cultura de Legionella e um ensaio de anticorpos por fluoresc ncia directa As amostras de urina foram testadas utilizando um ensaio de antig nios urin rios de L pneumophila dispon vel no mercado Um total de 118 doentes cumpriu os crit rios para inclus o no estudo ou seja pneumonia evidente em radiografia doentes gt 13 anos de idade antibioterapia lt 14 dias colheita de tipos de amostra v lidos execu o de m todos de refer ncia apropriados etc Dos 118 doentes houve 114 resultados v lidos para o Ensaio BD ProbeTec ET LP Os resultados da an lise das amostras de expectora o foram comparados com os resultados de cultura do mesmo tipo de amostras para calcular as caracter sticas de desempenho Uma a
38. ng DNA de Esperma de Salm o gt 47 3 ug Tris gt 9 0 ug EDTA 100 Tubos de 2 mL com Tampa de Encaixe Refere se ao Ensaio de DNA Amplificado BD ProbeTec ET para a Fam lia Chlamydiaceae CF Refere se ao Ensaio de DNA Amplificado BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae MP Instrumentos equipamento e acess rios BD ProbeTec ET Instrument and Instrument Plate Instrumento e Placa de Instrumento BD ProbeTec ET Lysing Heater Aquecedor para Lise BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater Aquecedor para Inicializa o e Aquecimento BD ProbeTec ET Pipettor Pipetador Suporte e Fonte de Alimenta o Suporte de Tubos de Amostra de 2 mL BD ProbeTec ET Accessories Kit Kit de Acess rios BD ProbeTec ET Pipette Tips Pontas de Pipeta Material Necess rio mas N o Fornecido C mara de Seguran a Biol gica de Classe Il BSC agitador vortex congelador sem descongela o autom tica a 20 C e ou 70 C ou mais baixa microcentrifuga com capacidade para 16 000 x g recipientes de banho maria term metro digital suporte para recipiente de banho maria com tampa de rosca outros suportes para tubos de amostra apropriados QIAGEN QlAamp DNA Stool Mini Kits Etanol a 96 100 BBL CultureSwab EZ Swabs Zaragatoas Tubos de Amostra de 2 mL e Tampas BD ProbeTec ET luvas descart veis marcadores resistentes a lcool micropipetas com capacidade para distribuir volumes de 25 1000 uL pontas de pipeta resistentes a aeross is gua dest
39. nostic purposes J Clin Microbiol 40 3 1126 Evans G E et al 2003 Contamination of QIAGEN DNA extraction kits with Legionella DNA J Clin Microbiol 41 7 3452 3453 10 Isenberg H D ed 1992 Clinical Microbiology Procedures Handbook Vol 1 American Society for Microbiology Washington D C Manufacturer Vyrobce Producent Fabrikant Tootja Valmistaja Fabricant Hersteller Kataokeuaonis Gy rt Ditta produttrice Gamintojas Producent Fabricante V robca Tillverkare avant Verwendbar bis Huepoyun a An ns Felhaszn lhat s g d tuma Usare entro Naudokite iki Brukes for Stosowa do Utilizar em Pou ite do Usar antes de Anv nd f re YYYY MM DD YYYY MM MM end of month RRRR MM DD RRRR MM MM konec m s ce AAAA MN DD AAAA MM MM slutning af m ned JJJJ MM DD JJJJ MM MM einde maand AAAA KK PP AAAA KK KK kuu l pp VVVV KK PP VVVV KK kuukauden loppuun menness AAAA MM JJ AAAA MM MM fin du mois JJJJ MM TT JJJJ MM MM Monatsende EEEE MM HH EEEE MM MM T XOG TOU urjva EEEE HH NN EEEE HH HH h nap utols napja AAAA MM GG AAAA MM MM fine mese MMMM MM DD MMMM MM MM m nesio pabaiga AAAA MM DD AAAA MM MM slutten av m neden RRRR MM DD RRRR MM MM koniec miesiaca AAAA MM DD AAAA MM MM fim do m s RRRR MM DD RRRR MM MM koniec mesiaca aaaa mm dd aaaa mm mm fin del
40. ntes de iniciar o processamento de amostras encha um recipiente de banho maria com gua destilada e aque a a 70 C 5 C e Utilize marcadores resistentes ao lcool para identificar os recipientes e os tubos e Troque as pontas de pipeta entre todas as transfer ncias de l quido Recomenda se a utiliza o de pontas com barreira contra aeross is e Antes da utiliza o aguarde at que o BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent CF LP MP atinja a temperatura ambiente e misture suavemente por invers o e Distribua uma al quota da quantidade necess ria de BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent CF LP MP para um recipiente limpo Para calcular a quantidade necess ria utilize 0 4 mL para cada amostra e adicione 1 a 2 mL para maior facilidade de pipetagem Para evitar a contamina o do diluente n o verta o diluente excedente novamente para dentro do frasco 1 Prepare os reagentes QIAGEN consultar Prepara o de reagentes no QlAamp DNA Stool Mini Kit Handbook 2 Deixe as amostras atingirem a temperatura ambiente 3 Identifique um tubo com tampa de press o de 2 mL para cada amostra a ser testada Todos os passos indicados a seguir devem ser executados numa C mara de Seguran a Biol gica BSC 4 Agite as amostras no vortex durante 5 a 15 s para homogeneizar 5 Pipete 350 uL de amostra para o tubo identificado NOTA Poder ser dif cil pipetar com exactid o as amostras de expectora o Nesse caso
41. olsa do micropo o conforme descrito no passo n 4 Retire a cobertura da placa de micropo os de inicializa o e transfira a placa para o aquecedor para inicializa o Coloque IMEDIATAMENTE a placa de micropo os de amplifica o no aquecedor para aquecimento Marque 10 min no temporizador NOTA O tempo neste passo fundamental No fim do per odo de incuba o de 10 min 1 min seleccione o programa 5 no pipetador Encaixe novas pontas de pipeta e transfira 100 pL da 1 coluna da placa de micropo os de inicializa o para a 1 coluna da placa de micropo os de amplifica o Deixe as pontas da pipeta tocarem nas paredes laterais dos po os e distribua o l quido Ap s a distribui o deixe o pipetador misturar automaticamente o l quido dos po os Levante cuidadosamente o pipetador afastando a da placa Evite tocar noutros po os Elimine as pontas Encaixe novas pontas e continue a transferir a mistura da reac o dos micropo os de inicializa o para os micropo os de amplifica o coluna a coluna utilizando pontas novas para cada coluna Quando terminar a transfer ncia da ltima coluna retire a protec o do selador da placa de amplifica o um selador de amplifica o 1 2 cobrir 6 colunas no m ximo Se a placa exceder 6 colunas TEM de ser utilizado um selador completo Segure o selador pelas extremidades e aplique o sobre os micropo os Utilize as guias no aquecedor para aquecimento como auxil
42. or Prima a tecla azul Prog Prima a tecla Vol at ser exibido o n mero de programa apropriado 1 ou 5 Prima a tecla Enter Utilize o gatilho do pipetador para avan ar atrav s de cada um dos passos do programa 3 Programa 1 Este programa aspira 200 uL distribui 150 uL para o micropoco LP O visor do pipetador dever exibir Fill 200 pL SEE Dispense 150 uL SHE Programa 5 Este programa aspira 100 pL distribui 100 uLI e mistura tr s vezes 50 uL O visor do pipetador dever exibir Fill 100 uL SEE Dispense 100 uL SHE Mix 50 uL SENN Zero intermitente C Disposi o da Placa O instrumento BD ProbeTec ET elabora um Relat rio de Disposi o da Placa depois de o tipo de ensaio a identifica o da amostra os n meros de lote do controlo e do kit serem introduzidos no sistema Este relat rio mostra a disposi o f sica de amostras e controlos para cada placa a ser testada Esta orienta o utilizada para a placa de micropo os de inicializa o e para a placa de micropo os de amplifica o Para o ensaio LP os micropo os de inicializa o s o tiras de micropo os de cor cinzenta uniforme Os micropo os de amplifica o s o tiras de micropo os com riscas cinzentas D Processamento de Amostras do Tracto Respirat rio Inferior Notas sobre o Procedimento e Antes de iniciar o procedimento reveja o QIAGEN QlAamp DNA Stool Mini Kit Handbook relativamente a notas e precau es importantes e A
43. produzido em resultado da reac o Para esta m trica n meros mais elevados indicam que o limiar foi alcan ado em fases iniciais da amplifica o enquanto n meros mais baixo indicam que o limiar foi alcan ado mais tarde no decurso da reac o A grandeza do resultado PAT n o constitui uma indica o do nivel de ADN de L pneumophila presente na amostra Se os resultados do controlo do ensaio n o forem os esperados n o apresente o relat rio dos resultados do doente Consulte a sec o Controlo de qualidade relativamente aos valores de controlo esperados Os resultados apresentados s o determinados tal como indicado a seguir Resultado PAT Alvo LP Alvo IAC Resultado Interpreta o Relat rio gt 0 gt ou 0 Positivo ADN de L pneumophila Positivo para microrganismos detectado pela SDA pertencentes aos grupos serol gicos 1 a 14 de L pneumophila sugerindo infec o actual S o necess rios testes adicionais para identificar o grupo serol gico se tal for necess rio para fins epidemiol gicos 0 gt 0 Negativo ADN de L pneumophila n o Presumivel negativo para detectado pela SDA microrganismos pertencentes aos grupos serol gicos 1 a 14 de L pneumophila numa amostra do tracto respirat rio inferior sugerindo a aus ncia de infec o recente ou actual A infec o por Legionella n o pode ser exclu da porque 1 outros grupos serol gicos al m dos grupos 1 14 e outras esp cies de Legionell
44. s que cont m o filtrado 20 Transfira com cuidado mais 700 pL da amostra para a coluna apropriada 21 Centrifugue os tubos 16 000 x 9 durante 1 min 22 Transfira as colunas para os tubos de colheita QlAamp limpos Elimine os tubos que cont m o filtrado 23 Abra as colunas QlAamp e adicione 500 uL de tamp o de lavagem QIAGEN AW1 a cada coluna 24 Centrifugue os tubos 16 000 x 9 durante 1 min 25 Transfira as colunas para os novos tubos de colheita QlAamp Elimine os tubos que cont m o filtrado 26 Abra as colunas QlAamp e adicione 500 uL de tamp o de lavagem QIAGEN AW2 a cada coluna 27 Centrifugue os tubos 16 000 x 9 durante 3 min 28 Transfira as colunas para tubos de colheita QlAamp finais correctamente identificados Elimine os tubos que cont m o filtrado NOTA Neste momento o tubo de colheita deve ser identificado NOTA Tenha cuidado para assegurar que n o existe l quido aderente ao fundo da coluna A transfer ncia de lavagem residual para o tubo de colheita pode afectar os resultados 29 30 31 32 33 34 Abra as colunas e adicione 225 uL de tamp o de eluic o QIAGEN AE a cada coluna Incube 1 min temperatura ambiente Centrifugue os tubos 16 000 x g durante 1 min Elimine as colunas Identifique um tubo com tampa de rosca de 2 mL para cada amostra Transfira 400 uL de Respiratory and Media Diluent CF LP MP para cada um dos tubos com tampa de rosca NOTA Encha um recipiente de banho
45. sulte as instru es de utiliza o Pozri Pokyny na pou vanie Consultar las instrucciones de uso Se bruksanvisningen E 13 BD al Becton Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks Maryland 21152 USA 800 638 8663 BENEX Limited Bay K 1a d Shannon Industrial Estate Shannon County Clare Ireland Tel 353 61 47 29 20 Fax 353 61 47 25 46 Alconox is a trademark of Alconox Inc ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection QlAamp is a trademark of QIAGEN Inc CultureSwab is a trademark of Difco Laboratories subsidiary of Becton Dickinson and Company BD BD Logo BBL and ProbeTec are trademarks of Becton Dickinson and Company O 2006 BD
46. tenham arrefecido prossiga para o Procedimento de teste do Ensaio BD ProbeTec ET LP Sec o F As reas recomendadas para serem testadas incluem superf cies do suporte para recipiente de banho maria microcentr fuga aquecedor para inicializa o e aquecimento placas de micropo os pretos man pulo do pipetador teclas t cteis do instrumento teclado do instrumento superf cies secas dos recipientes de banho maria superf cies dos suportes de amostras e bancadas de trabalho incluindo as reas de processamento de amostras Caso uma rea apresente um resultado positivo limpe a rea com solu o de hipoclorito de s dio a 1 v v com Alconox preparada de fresco Certifique se de que toda a rea fica molhada com a solu o de limpeza Deixe actuar na superf cie durante pelo menos 2 min ou at secar Se necess rio retire o excesso de solu o de limpeza com uma toalha limpa Limpe a rea com uma toalha limpa saturada com gua e deixe a superf cie secar Volte a testar a rea Repita at serem obtidos resultados negativos Se a contamina o n o for resolvida contacte os Servi os T cnicos para mais informa es INTERPRETA O DOS RESULTADOS DO TESTE A presen a ou aus ncia de ADN de L pneumophila determinada pelo c lculo dos resultados PAT Passes After Threshold Passagem ap s limiar para a amostra com base em valores limiares predeterminados O resultado PAT utilizado para avaliar a grandeza do sinal
47. ue o transportador da placa para fora da plataforma abra a porta e retire a placa Feche a porta e volte a colocar a plataforma da placa no interior do instrumento Retire os micropo os de amplifica o selados da placa ATEN O N o retire o material de selagem dos micropo os Os micropo os selados podem ser facilmente removidos como uma unidade segurando na parte superior e inferior do selador e levantando os a direito para fora da placa Coloque os micropo os selados num saco para res duos Sele o saco Limpe a placa de metal Lave a placa com solu o de hipoclorito de s dio a 1 v v Alconox Lave a placa com gua Envolva a placa numa toalha de papel limpa e deixe secar completamente ao ar antes de voltar a utilizar Ap s a ltima an lise do dia execute os seguintes procedimentos de limpeza a Sature toalhas de papel ou compressas de gaze com solu o de hipoclorito de s dio a 1 v v com Alconox e aplique nos topos das bancadas e nas superf cies exteriores do aquecedor para inicializa o e aquecimento do suporte de tubos de ensaio de 2 mL dos recipientes de banho maria da centr fuga e do Instrumento BD ProbeTec ET Deixe a solu o actuar nas superf cies durante 2 a 3 min Sature toalhetes de papel ou compressas de gaze com gua e remova a solu o de limpeza Substitua frequentemente os toalhetes de papel ou as compressas de gaze quando aplicar a solu o de limpeza e quando lavar com gua Humede a toalh
48. ultado positivo com a PCR b Duas amostras apresentaram resultados positivos na cultura e negativos no Ensaio BD ProbeTec ET LP Ambas as amostras obtiveram resultados negativos num ensaio de antig nio urin rio O teste da PCR foi realizado em ambas as amostras Apenas uma apresentou um resultado positivo neste teste As 23 amostras com resultados positivos na cultura apresentaram a seguinte distribui o de grupos serol gicos 47 8 11 23 do grupo serol gico 1 17 4 4 23 do grupo serol gico 3 13 0 3 23 do grupo serol gico 4 4 3 1 23 do grupo serol gico 5 4 3 1 23 do grupo serol gico 6 e 13 3 23 sem informa o dispon vel em rela o ao grupo serol gico NA n o aplic vel 10 NOTA O m todo de PCR utilizado para testar os resultados discordantes entre a cultura e o Ensaio BD ProbeTec ET LP n o foi um m todo aprovado pela FDA Estudos Anal ticos O volume da reac o de amplifica o no Ensaio BD ProbeTec ET LP de 100 uL de amostra processada Sensibilidade Anal tica A sensibilidade anal tica do Ensaio BD ProbeTec ET LP em 14 grupos serol gicos diferentes de L pneumophila foi determinada atrav s da dilui o de suspens es bacterianas para n veis de 0 150 300 e 450 unidades formadoras de col nia UFC por reac o As amostras foram processadas e analisadas em triplicado Com base em 100 de positividade a sensibilidade anal tica para os grupos serol gicos 2 10 e 12 foi de 150 UFC rea
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