QUANTA LiteTM dsDNA
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1. a declara o Os resultados que se seguem foram obtidos com o INOVA QUANTA Plex SLE Profile 8 Valores obtiveram com m todos de ensaio de outros fabricantes n o podem ser utilizados em substitui o A magnitude dos n veis de auto anticorpos IgG reportados nem sempre pode estar correlacionada com um t tulo de par metro de avalia o final 4 Limita es do m todo A presen a de imuno complexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente podem causar um aumento do n vel de liga o n o espec fica e produzir resultados falsos positivos neste ensaio 2 Nem todos os doentes com Lupus ryth mateux syst mique syndrome de Gougerot Sj gren Scl rodermie ou Polymyosite foram positivos a auto anticorpos Sm RNP SS A 60 SS A 52 SS B Scl 70 Jo 1 Ribosome P ou Chromatin 3 Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclus es cl nicas e outros testes serol gicos 4 N o agitar adequadamente os controlos e ou as amostras de soro diluidas com as microesferas conservados na placa pode aumentar os valores de CV em rela o aos valores tipicos encontrados nos testes ELISA 5 Depois da meia hora de incuba o com o conjugado fluorescente ocorre um aumento de fluoresc ncia de aproximadamente 10 por cada meia hora adicional ao tempo de incuba o 6 As caracter sticas de desempenho do ensaio n o foram determinadas para outras matrizes al m do soro 7 A falha na manu2. n 437 Jo 1 ENA Profile 6 Scl 70 Negativo Positivo Negativo 368 15 SLE Profile 8 95 9 o mesmos Positivo 8 positivo perto ELISA 0 positivo perto ELISA grk 51 Jo 1 SLE Profile 8 98 9 o mesmos Negativo Positivo Negativo 412 5 Positivo 0 O eram positivo perto ELISA 20 n 412 Ribosome P ELISA n 412 Chromatin ELISA Ribosome P SLE Profile 8 97 6 o mesmos N 437 Ambos SS A 326 SS B 406 Sm 361 RNP 341 Scl 70 368 Jo 1 412 N 412 383 313 Ribo P Chrom Negativo Positivo Negativo Positivo Ambos 105 30 54 90 51 20 383 Prof 6 Prof 8 Positivo Acordo 6 95 1 97 1 98 4 96 15 77 5 80 Chromatin SLE Profile 8 92 2 o mesmos Negativo Acordo 100 100 95 99 99 100 SS A bead compared to SS A 52 and SS A 60 beads compared to ELISA Precisao e Reprodutibilidade Varia o inter ensaio e varia o intra ensaio No que diz respeito varia o inter ensaio foram avaliadas varias amostras em 6 testes realizados em dias diferentes A varia o em 2 amostras diferentes para cada especificidade de teste encontra se na lista da tabela abaixo No que diz respeito varia o intra ensaio 7 avaliadas v rias amostras dez vezes cada uma num nico ensaio A varia o em 2 amostras diferentes para cada especificidade de teste encontr
3. 60 17 SS A 52 19 SS B 7 Sm 8 RNP 9 Scl 70 11 Jo 1 12 Ribosomal P 13 Chromatin 14 anti IgG de controlo 42 Defina as ocorr ncias por esfera para 50 o tamanho da amostra para 50 uL o d bito para 60 uL minuto r pido e o port o para 7500 a 17000 Utilizam se os valores medianos para a Intensidade M dia de Fluoresc ncia MFI Introduza os nomes da amostra manualmente ou clicando em Load Pa List Carregue a placa na plataforma XY do Luminex Fa a funcionar o Luminex clicando no bot o Start Plate Quando terminar o dia execute as opera es de sanear e embeber antes de desligar o instrumento M todo Antes de iniciar lis 2 Para programar informa es para o equipamento automatizado contacte a Assist ncia T cnica da INOVA Diagnostics Inc Ligue o analisador de fluxo Luminex 100 ou 200 assegure se de que aqueceu e efectue todas as opera es de manuten o di rias conforme previamente descrito Se for necess rio calibre o instrumento e confirme que a calibra o teve sucesso Coloque todos os reagentes e amostras do doente temperatura ambiente 20 26 C e misture bem Se o conjugado fluorescente de anti IgG humana n o tiver sido reconstitu do adicione 6mL de QUANTA Plex Conjugate Diluent ao frasco castanho contendo o p liofilizado e rode o recipiente durante aproximadamente 30 segundos para dissolver o conte do O conjugado fluorescente reconstitu do permanece es
4. QUANTA Plex SLE Profile 8 708910 Para utiliza o em diagn stico n Vitro Complexidade CLIA Elevada Aplica o Diagn stica O QUANTA Plex SLE Profile 8 um imunoensaio fluorescente para a detec o semi quantitativa de auto anticorpos de Sm RNP SS A 60 SS A 52 SS B Scl 70 Jo 1 Ribosome P o Chromatin no soro humano A presen a destes anticorpos pode ser utilizada em conjun o com as conclus es cl nicas e outros testes de laborat rio para ajudar ao diagn stico de l pus eritematoso sist mico e doen as do tecido conjuntivo relacionadas S ndrome de Sj gren Esclerodermia e Polimiosite Resumo e Explica o do teste Os autoanticorpos antinucleares ANA encontram se numa grande variedade de doen as do tecido conjuntivo Testar ANA em c lulas HEp 2 ou ANA ELISA funciona como um ensaio de rastreio de sensibilidade Embora o teste de ANA seja um excelente teste de rastreio de l pus eritematoso sist mico SLE na medida em que um resultado negativo virtualmente exclui SLE activo n o de qualquer forma um teste espec fico Os testes de acompanhamento s o tipicamente feitos em soros que produzem resultados de ANA positivos Nove dos autoanticorpos mais comuns reagem especificamente com autoantig nios a Sm RNP SS A 60 SS A 52 SS B Scl 70 Jo 1 Ribossoma P e cromatina Os autoanticorpos a estes autoantig nios podem contribuir com informa es significativas para diagn stico e progn stico quando se avaliam do
5. Utilize a f rmula equivalente cada uma do outra antig nio MFI da Amostra para Sm Valor da amostra em UL x Valor do Positivo Baixo para MPO em UL MFI Calibrator para Sm A amostra pode ser depois classificada de acordo com o quadro abaixo UL Negativa lt 20 Positiva fraca 20 49 Positiva moderada 50 100 Positiva forte gt 100 A reactividade est relacionada com a quantidade de auto anticorpo presente na esfera de forma n o linear Embora aumentos e diminui es das concentra es de anticorpos dos doentes se reflictam num aumento ou diminui o correspondentes da reactividade da fluoresc ncia a altera o n o proporcional ou seja uma duplica o da concentra o de anticorpos n o se reflecte numa duplica o da reactividade Para al m disso a quantidade total de IgG no soro de um doente afecta a MFI determinada Caso seja necess ria uma quantifica o mais rigorosa dos auto anticorpos do doente a amostra deve ser submetida a um teste quantitativo Interpreta o dos resultados A FIA consiste numa t cnica extremamente sens vel e tem capacidade para detectar pequenas diferen as em popula es de doentes Cada laborat rio deve estabelecer o seu pr prio intervalo do normal com base nas suas t cnicas controlos equipamento e popula o de doentes de acordo com os seus procedimentos estabelecidos Sugere se que os resultados reportados pelo laborat rio devam incluir
6. a se na lista da tabela abaixo Varia o inter ensaio Ant geno M dia UL C V Sm 64 6 Sm 38 5 RNP 74 5 RNP 33 9 SS A 52 158 14 SS A 52 101 8 SS A 60 108 6 SS A 60 75 4 SS B 127 7 SS B 83 6 Scl 70 56 15 Scl 70 31 13 Varia o inter ensaio Ant geno M dia UL C V Jo 1 50 10 Jo 1 69 14 Ribo P 73 7 Ribo P 98 9 Chromatin 65 11 Chromatin 84 8 Varia o intra ensaio Negativo Positivo Negativo Positivo Total Acordo 98 6 99 8 95 0 98 6 95 9 98 9 97 6 92 2 Ant geno M dia UL C V Sm 61 9 Sm 38 2 RNP 64 10 RNP 27 11 SS A 52 167 5 SS A 52 91 5 SS A 60 119 5 SS A 60 69 6 SS B 149 2 SS B 76 3 Scl 70 64 3 Scl 70 48 6 Varia o intra ensaio Ant geno M dia UL C V Jo 1 42 6 Jo 1 59 3 Ribo P 65 10 Ribo P 105 4 Chromatin 61 7 Chromatin 80 6 313 26 Refer ncias 1 2 3 10 11 12 13 von M hlen CA and Tan E Autoantibodies in the Diagnosis of Systemic Rheumatic Diseases Seminars in Arthritis and Rheumatism 24 323 358 1995 Tan EM et al The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus Arthritis and Rheumatism 25 1271 1277 1982 Jonsson R Haga HJ and Gordon TP Current concepts on diagnosis autoantibodies and therapy in Sj gren s syndrome Scand J Rheumatol 29 341 348 2000 Giordano M Valentini IG Migliaresi S et al Different antibody patterns and
7. aram no c lculo do desvio padr o Estes resultados s o provenientes do mesmo doente Compara o entre os Ensaios SLE Profile 8 ENA Profile 6 e ELISAs SS A ENA Profile 6 SS A ENA Profile 6 92 0 o mesmos Negativo Positivo Negativo 326 35 Positivo 0 Este SS A contem SS A 52 e SS A 60 29 destes eram positivos por SS A 60 Luminex n 437 76 SS A ENA Profile 6 93 1 o mesmos Negativo Positivo Negativo 326 30 Positivo 0 Este SS A contem SS A 52 e SS A 60 24 destes eram positivos por SS A 52 Luminex n 437 81 SS B ENA Profile 6 SS A 52 or 60 SLE Profile 8 98 6 o mesmos Negativo Positivo Negativo 326 6 Positivo 0 105 SS B SLE Profile 8 99 8 o mesmos Negativo Positivo Negativo 406 1 Positivo 0 30 Este SS A contem SS A 52 e SS A 60 4 positivo perto SS A ELISA Isto negativo perto ELISA n 437 Sm ENA Profile 6 n 437 RNP ENA Profile 6 Sm Negativo Positivo RNP Negativo Positivo Negativo 361 t SLE Profile 8 95 0 o mesmos Positivo 21 54 Negativo perto ELISA 12 positivo perto ELISA SLE Profile 8 Negativo 341 4 98 6 O mesmos Positivo OR 90 3 positivo perto ELISA 0 positivo perto ELISA n 437 Scl 70 ENA Profile 6
8. componentes do dispositivo por outros que n o perten am a este sistema pode originar resultados inconsistentes Todos os controlos s o espec ficos para o n mero de lote do kit 3 A adapta o total ou parcial deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de l quidos pode dar origem a diferen as nos resultados obtidos nos testes por t cnica manual E da responsabilidade de cada laborat rio garantir que o seu procedimento autom tico d origem a resultados dentro dos limites aceit veis 4 Existem v rios factores que influenciam o desempenho do ensaio Entre estes inclui se a temperatura inicial dos reagentes a temperatura ambiente a precis o e reprodutibilidade da t cnica de pipetagem a reprodutibilidade da t cnica de mistura o analisador de fluxo Luminex 100 ou 200 utilizado para ler os resultados e a dura o dos tempos de incuba o durante o ensaio E necess ria especial aten o consist ncia para se obterem resultados rigorosos e reprodut veis 5 O protocolo deve ser criteriosamente respeitado 6 Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropo os e dessecantes pode provocar a degrada o do antig nio e baixa precis o dos resultados 7 Pode ser observada uma fluoresc ncia inaceitavelmente baixa depois de m ltiplas utiliza es de um nico frasco de conjugado de fluoresc ncia durante algum tempo E importante cumprir todos os procedimentos recomendados para man
9. contendo tamp o estabilizadores proteicos e conservantes 7mL Advert ncias 1 ADVERT NCIA Este produto cont m um qu mico 0 02 cloranfenicol no diluente da amostra considerado como cancer geno no Estado da Calif rnia 2 Todo o material de origem humana utilizado na prepara o dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para m todos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV HBsAg e HCV Contudo 1 nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a aus ncia de HIV HBV HCV ou outros agentes infecciosos Assim QUANTA Plex Negative Control SLE Profile 8 Calibrator o Positive Control devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso 3 A azida de s dio utilizada como conservante Este produto venenoso e pode ser t xico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos A azida de s dio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canaliza es formando azidas met licas explosivas Por esta raz o ao deitar fora os restos de reagentes necess rio deixar correr gua em quantidade abundante para evitar a forma o destas subst ncias 4 Usar equipamento de protec o apropriado para trabalhar com os reagentes 5 Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente Observar todas as regulamenta es ambientais nacionais e locais relativas elimina o de res duos Precau es Utilizar somente para diagn stico In Vitro q A substitui o de
10. different prognoses in patients with scleroderma and various extent of skin sclerosis J Rheumatol 13 911 916 1986 Arnett J et al The Jo 1 antibody system in myositis relationships to clinical features and HLA J Rheumatol 8 925 1981 Bonfa E et al Association between lupus psychosis and anti Ribosome P protein antibodies N Engl J Med 317 265 1987 Burlingame RW and Cervera R Anti chromatin anti nucleosome autoantibodies Autoimmunity Reviews 1 321 328 2002 McCauliffe DP Wang L Satoh M Reeves WH and Small D Recombinant 52 kDa Ro SSA ELISA detects autoantibodies in Sj gren s syndrome sera that go undetected by conventional serologic assays J Rheumatol 24 860 866 1997 Frank MB V McCubbin E Trieu Y Wu DA Isenberg IN Targoff The association of anti Ro52 autoantibodies with myositis and scleroderma autoantibodies J Autoimmun 12 137 142 1999 Martins TB Burlingame R von M hlen CA et al Evaluation of multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for detection of autoantibodies to nuclear antigens Clin Diagn Lab Immunol 11 1054 1059 2004 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Centers for Disease Control National Institutes of Health 5 edition 2007 CLSI NCCLS Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens Approved Guideline Third Edition CLSI Document H18 A3 Vol 24 38 2004 National Committee for Clinical Laboratory Standards Feb 1999 Statistical quality cont
11. do doente se a esfera anti lgG da amostra do doente tiver sido inferior a 3 0 LU e se tiver sido negativa nas outras esferas Neste caso o doente deve ser testado novamente para confirmar o resultado negativo d O utilizador deve recorrer ao documento C24 A3 da CSLI anteriormente NCCLS para obter instru es suplementares sobre as pr ticas do Controlo de Qualidade apropriadas 1 QUANTA Plex Negative Control e do SLE Profile 8 Profile Calibrator Profile Positive e as Positive Control para monitorizar falhas substanciais dos reagentes 6 Se se desejar pode testar se um po o com diluente da amostra mas sem soro para confirmar se a esfera de controlo anti IgG detectar um po o sem soro Este controlo isento de soro deve ser lt 3 0 LU na esfera Anti IgG e negativo em todas as outras esferas C lculo dos resultados As MFIs para todos os controlos e amostras do doente para cada antig nio s o determinadas em primeiro lugar A reactividade em UL de uma determinada amostra para cada tipo de antig nio pode ser depois calculada atrav s da f rmula que se segue Divida a MFI da amostra pela MFI do SLE Profile 8 Calibrator para esse antig nio e multiplique o resultado pelo n mero de UL atribu do ao Perfil de SLE Profile 8 Calibrator para esse antig nio A Uls value do SLE Profile 8 Calibrator para cada antig nio est indicada no r tulo da caixa para esse lote do kit O exemplo seguinte destina se a determinar a reactividade anti Sm
12. e adicionarem manualmente as amostras e se misturarem as esferas Utilize uma das sequ ncias de coordena o para adicionar os controlos conforme descrito o passo 3 Pipete vigorosamente pelo menos 30 pL do C QUANTA Plex Negative Control SLE Profile 8 Calibrator e Positive Control para cima e para baixo quatro vezes para misturar as esferas e os controlos em cada micropo o O tempo de incuba o de 30 minutos inicia se depois de adicionar o QUANTA Plex Negative Control ao primeiro micropo o Prossiga imediatamente com o ensaio adicionando 5 uL de soro do doente dilu do aos micropo os adequados nota tal produz uma dilui o final a 1 1010 do soro do doente Mantenha a mesma sequ ncia de coordena o utilizada no passo 4 Misture a amostra do doente dilu da e o HRP Diluente para Amostras no micropo o pipetando vigorosamente pelo menos 30 uL dos conte dos do micropoco para cima e para baixo quatro vezes Adicione 50 uL do Positivo Baixo ANCA Profile pr dilu do ao micropo o adequado depois da ltima adi o da amostra do doente e misture conforme descrito acima Prossiga com a coordena o da incuba o durante 30 minutos a partir do momento da adi o do QUANTA Plex Negative Control Coloque a tira de micropo os temperatura ambiente numa superf cie nivelada e afastada da luz solar directa 3 durante o resto do per odo de incuba o 6 No final do primeiro per odo de incuba o adicione 50 uL do conjugado fluor
13. e NCCLS recomenda as seguintes condi es de armazenamento para as amostras 1 N o armazenar as amostras temperatura ambiente durante mais de 8 horas 2 Se o teste n o for conclu do num prazo de 8 horas guardar a amostra a 2 8 C 3 Se o teste n o for conclu do num prazo de 48 horas ou se houver transporte da amostra congelar a 20 C ou a uma temperatura inferior As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas Procedimento Material fornecido Placa de micropo os de SLE Profile 8 12 1 x 8 po os cor de rose estampado na cor com suporte 1 2 mL QUANTA Plex Negative Control pr dilu do pronto a utilizar 1 2 mL SLE Profile 8 Calibrator pr dilu do pronto a utilizar 1 2 mL SLE Profile 8 Positive Control pr dilu do pronto a utilizar 50 mL Diluente da amostra HRP Conjugado IgG marcado com fluoresc ncia cabra anti IgG humana espec fica para fc 7 mL QUANTA Plex Conjugate Diluent dass Material adicional necess rio mas n o fornecido Fluido de preserva o de analisador de fluxo Luminex 100 ou 200 Micropipetas de 5 e 500 uL Pontas descart veis para as micropipetas Tubos de teste para dilui es de amostras de doentes volume de 1 4 mL Agua destilada ou desionizada Analisador de fluxo Luminex 100 ou 200 Pipetador electr nico de 8 canais para a dispnesa de 5 45 e 50 uL ou Dispositivo de pipetagem dilui o automatizado Utiliza
14. entes que se suspeita sofrerem de uma variedade de doen as do tecido conjuntivo tais como SLE S ndrome de Sj gren Esclerodermia e Polimiosite Os anticorpos a Sm RNP SS A 52 SS A 60 Ribossoma P e Cromatina encontram se em doentes com SLE anti SS A 52 SS A 60 e SS B encontram se em pessoas com s ndrome de Sj gren anti Scl 70 e SS A 52 em doentes com esclerodermia e anti Jo 1 e SS A 52 em doentes com polimiosite gt Utilizou se uma variedade de m todos incluindo ELISA dupla difus o de Ouchterlony Western blot e aglutina o passiva para detectar anticorpos a Sm RNP SS A 60 SS A 52 SS B Scl 70 Jo 1 Ribossoma P e cromatina A t cnica de imunoensaio fluorescente FIA utilizada por QUANTA Plex SLE Profile 8 objectiva semi quantitativa e pode utilizar se convenientemente para testar em simult neo grandes quantidades de doentes Obt m se resultados semi quantitativos para cada reactividade de autoanticorpos Princ pio do m todo Sm nativo RNP SS B Scl 70 SS A 60 e Cromatina de timo de novilho Jo 1 recombinante e SS A 52 e um p ptido sint tico de 23 amino cidos da sequ ncia Ribossoma P est o ligados a esferas diferentes coloridos por fluoresc ncia Foi comunicado que os autoanticorpos a SS A 60 e SS A 52 s o importantes a n vel de diagn stico As nove esferas revestidas por antig nio diferentes bem como uma esfera de controlo anti lgG s o misturadas em conjunto e co
15. eras de 10 cores diferentes Cada uma das esferas coloridas est revestida com um antig nio purificado diferente Sm RNP SS A 60 SS A 52 SS B Scl 70 Jo 1 Ribosome P Chromatin e anti IgG e um numa embalagem de folha de alum nio contendo exsicantes 2 QUANTA Plex Negative Control 1 frasco de tamp o contendo conservante e soro humano sem anticorpos IgG humanos contra Sm RNP SS A 60 SS A 52 SS B Scl 70 Jo 1 Ribosome P e Chromatin antig nios no SLE Profile 8 pr dilu do pronto a utilizar 1 2mL 3 SLE Profile 8 Calibrator 1 frasco de tamp o contendo conservante e anticorpos de soro humano contra os antig nios Sm RNP SS A 60 SS A 52 SS B Scl 70 Jo 1 Ribosome P o Chromatin pr dilu do pronto a utilizar 1 2mL 4 SLE Profile 8 Positive Control 1 frasco de tamp o contendo conservante e anticorpos de soro humano contra os antig nios Sm RNP SS A 60 SS A 52 SS B Scl 70 Jo 1 Ribosome P o Chromatin pr dilu do pronto a utilizar 1 2mL 5 Diluente para Amostras HRP 1 frasco de cor rosa contendo solu o salina com tamp o Tris Tween 20 estabilizadores proteicos e conservantes 50mL 6 Conjugado IgG marcado com fluoresc ncia cabra anti IgG humana espec fica para fc 1 frasco castanho p liofilizado contendo tamp o estabilizadores proteicos e conservantes Consulte a sec o de M todos para as instru es de reconstitui o 7 QUANTA Plex Conjugate Diluent 1 frasco de cor rosa
16. escente a cada micropo o e pipete vigorosamente pelo menos 60 uL do conte do do micropo o para cima e para baixo quatro vezes Para adicionar o conjugado mantenha a mesma sequ ncia de coordena o utilizada nos passos 4 e 5 O conjugado deve ser removido do frasco em condi es ass pticas padr o e utilizando boas t cnicas de laborat rio Retire apenas do frasco a quantidade de conjugado necess ria para o ensaio PARA EVITAR POTENCIAL CONTAMINA O MICROBIANA E OU QUIMICA NUNCA VOLTE A COLOCAR CONJUGADO NAO UTILIZADO NO FRASCO Incube as tiras de micropo os durante 30 minutos temperatura ambiente numa superf cie nivelada e afastada da luz solar directa O per odo de incuba o inicia se depois da primeira adi o do conjugado 7 No prazo de uma hora depois da conclus o da incuba o de 30 minutos do conjugado fluorescente leia a placa de SLE Profile 8 no Luminex conforme detalhado na sec o acima Utiliza o do Analisador de Fluxo Luminex 100 ou 200 Sonto o de qualidade O SLE Profile 8 Calibrator e Positive Control e QUANTA Plex Negative Control devem ser processados com todos os lotes de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente 2 Uma vez que o Positivo baixo SLE Profile 8 Calibrator e Positive Control e do QUANTA Plex Negative Control se encontram pr dilu dos estes n o controlam o procedimento associado dilui o das amostras 3 Outros controlos podem
17. ipula o dos conjugados fluorescentes visando prevenir esta ocorr ncia 8 A contamina o qu mica do conjugado fluorescente pode resultar de uma limpeza ou lavagem inadequadas do equipamento ou instrumentos Res duos de subst ncias qu micas vulgares de laborat rio tais como formalina lix via etanol ou detergente ir o provocar degrada o do conjugado fluorescente no decurso do tempo Lave exaustivamente todo o equipamento ou instrumentos com gua destilada ou desionizada depois da utiliza o de desinfectantes produtos de limpeza qu micos Precau es particulares de conserva o Conservar todos os reagentes a 2 8 C N o congelar Os reagentes permanecem est veis at data de validade indicada quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo 2 As tiras dos micropo os revestidas com antig nios que n o forem logo utilizadas devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2 8 C Colheita da amostra Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro A adi o de azida ou de outros conservantes s amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados As amostras de soro com contamina o bacteriana que sofreram tratamento t rmico ou contendo part culas vis veis n o devem ser utilizadas Hemolizados ou muito serum dos lip micos n o deve ser usado Ap s a colheita o soro deve ser separado do co gulo O documento H18 A3 da CLSI anteriorment
18. locadas em po os de uma placa de micropo os sob condi es que conservam os antig nios no seu estado reactivo Os controlos pr dilu dos e o soro dilu do dos doentes s o adicionados aos diferentes po os permitindo que quaisquer autoantig nios a Sm RNP SS A 60 SS A 52 SS B Scl 70 Jo 1 Ribossoma P e cromatina presentes se liguem ao antig nio imobilizado De seguida adiciona se a cada micropo o uma IgG anti humana conjugada com uma sonda de fluoresc ncia Uma segunda incuba o permite ao conjugado anti IgG humana fluorescente ligar se a todos os auto anticorpos do doente que se encontram fixos ao antig nio nas esferas As amostras s o depois medidas no analisador de fluxo Luminex 100 ou 200 Este analisador de fluxo tem capacidade para separar a cor de cada esfera e medir a intensidade da fluoresc ncia do conjugado em cada esfera A intensidade da fluoresc ncia conjugada proporcional quantidade de anti lgG humana marcada fixa aos auto anticorpos do doente na esfera Os autoanticorpos podem ser semi quantificados atrav s da compara o da intensidade de fluoresc ncia da amostra do doente com a fluoresc ncia do Calibrador correspondente A esfera de controlo anti IgG revestida est inclu da em cada micropo o para assegurar que os resultados falsos negativos decorrentes de erros operacionais sejam detectados Reagentes i Placa de micropo os de poliestireno 12 1 x 8 tiras de micropo os com suporte contendo esf
19. o do Analisador de Fluxo Luminex 100 ou 200 1 Consulte o manual do utilizador fornecido com o Luminex para instru es detalhadas sobre o funcionamento do analisador de fluxo Luminex 100 ou 200 e a Vers o Sistema Integrado IS do programa de software do 2 Do Tl 0 0 Luminex Vers o 2 0 ou superior Para mais informa es e para a resolu o de problemas com este ensaio contacte a assist ncia t cnica da INOVA Diagnostics Inc na morada ou n mero de telefone presentes na ltima p gina do Folheto Informativo Seguem se instru es resumidas para funcionamento do analisador de fluxo LuminexTM 100 ou 200 Calibre o Luminex utilizando as esferas de Controlo e Calibra o fornecidas pela Luminex Corporation pelo menos uma vez por m s e confirme que a calibra o tem sucesso Para al m disso calibre o Luminex se a temperatura de calibra o delta for superior a 3 graus se os controlos do ensaio estiverem fora do intervalo ou conforme for necess rio Luminex demora 30 minutos a aquecer depois de ter sido ligado Quando o per odo de aquecimento se concluir efectue as opera es de purga irriga o com lcool e lavagem recomendadas pelo fabricante Utilizar a Vers o do software IS carregue o modelo QP SLE Profile 8 e assegure se de que todas as informa es de lote est o correctas Se for necess rio actualize as informa es do lote Defina os par metros da seguinte forma As cores das esferas s o SS A
20. rol Principles and definitions Approved Guideline 3 edition C24 A3 Vol 26 No 25 Fabricado por INOVA Diagnostics Inc 9900 Old Grove Road San Diego CA 92131 United States of America Representante Autorizado Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D 66386 St Ingbert Germany Tel 49 6894 581020 Fax 49 6894 581021 www mt procons com Technical Service 888 545 9495 628910 July 2007 Revision PRT2
21. ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e ou nacionais ou de acordo com as disposi es de organiza es acreditadas Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando al quotas de amostras de soro humano e conservando a lt 20 C 4 Para que os resultados dos testes possam ser considerados v lidos devem ser cumpridos todos os crit rios a seguir definidos Se algum n o for cumprido o teste deve ser considerado inv lido e o ensaio repetido O valor em Unidades de Luminex UL do Calibrator para cada antig nio est indicado no r tulo da caixa para esse kit Consulte a f rmula na sec o de C lculo dos Resultados para determinar as ULs do QUANTA Plex Negative Control e do SLE Profile 8 Positive Control a O valor do Controlo Negativo pr dilu do QUANTA Plex tem de ser lt 20 LU em cada um dos 9 antig nios e entre 10 e 50 LU na esfera anti IgG b O valor do Controlo Positivo de SLE Profile 8 tem de ser gt 100 e lt 300 LU nos antig nios Sm RNP SS A 60 SS B Scl 70 Jo 1 Ribo P e cromatina e tem de ser gt 50 e lt 250 no antig nio SS A 52 O Controlo Positivo de SLE Profile 8 tem de ser entre 10 e 50 LU na esfera anti IgG C A esfera de controlo anti IgG destina se a assegurar que os resultados falsos negativos do doente decorrentes de erros operacionais sejam detectados Existe a possibilidade de que n o se tenha adicionado a amostra e ou o conjugado do doente ao po o da amostra
22. t vel durante 3 meses entre 2 e 8 C N o congele Certifique se de que o recipiente do fluido de preserva o no Luminex est cheio de fluido de protec o dispon vel na Luminex Corporation Prepare uma dilui o a 1 101 de cada amostra do doente adicionando 5uL de cada soro a 500uL de Diluente para Amostras HRP e depois coloque no v rtice para misturar exaustivamente a solu o As amostras dilu das devem ser utilizadas no prazo de 8 horas depois da prepara o NAO DILUA o QUANTA Plex Negative Control SLE Profile 8 Calibrator e Positive Control A determina o da presen a ou da aus ncia de anticorpos a Sm RNP SS A 60 SS A 52 SS B Scl 70 Jo 1 Ribossoma P e cromatina utilizando unidades arbitr rias requer um micropo o para Controlo Negativo e Positivo QUANTA Plex dois micropo os para o Calibrador SLE Profile 8 e um micropo o para cada amostra do doente Recomenda se a execu o das amostras em singleto T cnica 1 Todos os reagentes devem ser colocados temperatura ambiente 20 26 C antes de come ar o ensaio Coloque o n mero necess rio de micropo os tiras no suporte Volte imediatamente a colocar as tiras n o utilizadas no saco contendo exsicantes e vede com firmeza para minimizar a exposi o a vapor de gua e luz Adicionar 45uL de Diluente de Amostra HRP a cada micropo o que contenha uma amostra do doente Nao adicionar Diluente de Amostra HRP aos quatro primeiros micropo os uma vez que es
23. ten o dos tempos de adi o dos reagentes pode provocar um aumento Front to back das varia es dos testes Valores esperados A capacidade do teste QUANTA Plex SLE Profile 8 para detectar anticorpos Sm RNP SS A 60 SS A 52 SS B Scl 70 Jo 1 Ribosome P e Chromatin foi avaliada mediante compara o com testes ELISA e Luminex dispon veis no mercado comercializados pela INOVA Diagnostics Inc Assumiram se os resultados do ELISAs e de cada um dos testes QUANTA Plex ENA Profile 6 e cada um do QUANTA Plex SLE Profile 8 como positivos se a amostra do doente fosse igual ou superior a 20 unidades e negativos se inferior a 20 unidades Intervalo de valores normais Foram testadas 485 amostras de sangue de dadores normais no teste de QUANTA Plex SLE Profile 8 Inclu das na tabela abaixo de cada antig nio est o as percentagens destas amostras que foram negativas a m dia e o desvio padr o deste grupo o valor mais elevado no grupo e o n mero de desvios padr o acima da m dia que foram utilizados para o valor de cut off entre negativo e positivo Antig nio Negativo M dia Desvio Padr o O Valor of DP Acima LU O mais elevado Da M dia Sm 99 4 3 2 4 130 74 RNP 99 6 2 3 5 59 5 1 SS A 52 99 0 5 3 5 226 4 3 SS A 60 99 4 3 4 4 213 3 9 SSB 99 2 3 2 8 44 6 1 Scl 70 100 3 1 2 14 14 2 Jo 1 100 1 0 6 5 31 7 Ribosome P 100 4 1 9 13 8 4 Chromatin 99 0 5 4 8 66 3 1 Os doentes com LU acima de 100 unidades n o const
24. tes cont m o Controlo Negativo QUANTA Plex O Calibrador SLE Profile 8 em duplicado e o Controlo Positivo SLE Profile 8 Nao adicione as amostras dos doentes dilu das aos micropo os neste momento Mantenha um das seguintes sequ ncias de coordena o quando adicionar controlos amostras e conjugado ao micropo os Em virtude das amostras serem lidas sucessivamente a uma taxa de aproximadamente 1 amostra a cada 19 segundos ou uma tira de 8 po os em aproximadamente 21 2 minutos pelo Luminex as amostras dos doentes e tamb m o conjugado devem ser adicionados aos micropo os a esta taxa para minimizar qualquer varia o da frente para tr s do ensaio Se os controlos amostras ou o conjugado forem adicionados um de cada vez protele a adi o destes ao pr ximo micropo o em 19 segundos Se os controlos amostras ou o conjugado forem adicionados 8 de cada vez a uma tira protele cada adi o tira seguinte 2 minutos Estes dois esquemas de coordena o ir o demorar aproximadamente 30 minutos para a adi o de amostras a todas as 12 tiras de uma placa inteira e ir o minimizar a varia o da frente para tr s do ensaio Submeter ao V rtice e depois adicionar 50uL de cada um dos seguintes o Controlo Negativo QUANTA Plex pr dilu do ao primeiro micropo o o Calibrador SLE Profile 8 no segundo e no terceiro micropo os e o Controlo Positivo SLE Profile 8 no quarto micropo o Tem que ser utilizada uma pipeta electr nica quando s
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