QUANTA LiteTM dsDNA
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1. o acima Utiliza o do Cit metro de Fluxo Luminex Gentoo de qualidade O Positivo baixo ENA Profile 5 Calibrador e Positivo Controlo e QUANTA Plex Negative Control devem ser processados com todos os lotes de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente 2 Uma vez que o Positivo baixo ENA Profile 5 Calibrador e Positivo Controlo e QUANTA Plex Negative Control se encontram pr dilu dos estes n o controlam o procedimento associado dilui o das amostras 3 Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e ou nacionais ou de acordo com as disposi es de organiza es acreditadas Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando al quotas de amostras de soro humano e conservando a lt 20 C 4 Para que os resultados dos testes possam ser considerados v lidos devem ser cumpridos todos os crit rios a seguir definidos Se algum n o for cumprido o teste deve ser considerado inv lido e o ensaio repetido O valor em Unidades de Luminex UL do Calibrador para cada antig nio est indicado no r tulo da caixa para esse kit Consulte a f rmula na sec o de C lculo dos Resultados para determinar as ULs do QUANTA Plex Negative Control e do controlo Positivo Alto a O valor do QUANTA Plex Negative Control deve ser lt 20 UL em cada um dos 5 ant genos e entre 10 e 50 UL no gr nulo do anti lgG b O valor do Perfil de2. 1 2 mL ENA Profile 5 Calibrator pr dilu do pronto a utilizar 1 2 mL ENA Profile 5 Positive pr dilu do pronto a utilizar 50 mL Diluente da amostra HRP A A A A md 1 1 Conjugado IgG marcado com fluoresc ncia cabra anti lgG humana espec fica para fc 7 mL QUANTA Plex Conjugate Diluent Material adicional necess rio mas n o fornecido Fluido de preserva o de analisador de fluxo Luminex M Micropipetas de 5 e 500 uL Pontas descart veis para as micropipetas Tubos de teste para dilui es de amostras de doentes volume de 1 4 mL gua destilada ou desionizada Analisador de fluxo Luminex M Pipetador electr nico de 8 canais para a dispnesa de 5 30 45 50 e 60uyL ou dispositivo de pipetagem dilui o automatizado Utiliza o do Analisador de Fluxo LuminexTM 1 Consulte o manual do utilizador fornecido com o Luminex para instru es detalhadas sobre o funcionamento do analisador de fluxo Luminex Vers o Sistema Integrado IS do programa de software do Luminex ou Vers o 2 0 ou superior Os dados para o ENA Profile 5 foram obtidos utilizando IS Vers o 1 7 e 2 2 329 Para mais informa es e para a resolu o de problemas com este ensaio contacte a assist ncia t cnica da INOVA Diagnostics Inc na morada ou n mero de telefone presentes na ltima p gina do Folheto Informativo Seguem se instru es resumidas para funcionamento do analisador de fluxo Luminex 2 Calibre o Luminex utiliza
3. Comparative study of 4 diagnosis criteria sets for mixed connective tissue disease in patients with anti RNP antibodies Autoimmunity Group of the Hospitals of Toulouse J Rheumatol 23 2055 2062 1996 6 Frank MB V McCubbin E Trieu Y Wu DA Isenberg IN Targoff The association of anti Ro52 autoantibodies with myositis and scleroderma autoantibodies J Autoimmun 12 137 142 1999 7 Martins TB Burlingame R von Muhlen CA et al Evaluation of multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for detection of autoantibodies to nuclear antigens Clin Diagn Lab Immunol 11 1054 1059 2004 8 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Centers for Disease Control and Prevention National Institutes of Health Fifth Edition 2007 Fabricado por INOVA Diagnostics Inc 9900 Old Grove Road San Diego CA 92131 United States of America Representante Autorizado Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D 66386 St Ingbert Germany Tel 49 6894 581020 Fax 49 6894 581021 Www mt procons com Technical Service 888 545 9495 628920PRT November 2009 Revision 9
4. protele a adi o destes ao pr ximo micropo o em 19 segundos Se os controlos amostras ou o conjugado forem adicionados 8 de cada vez a uma tira protele cada adi o tira seguinte 2 minutos Estes dois esquemas de coordena o ir o demorar aproximadamente 30 minutos para a adi o de amostras a todas as 12 tiras de uma placa inteira e ir o minimizar a varia o da frente para tr s do ensaio 4 Submeter ao V rtice e depois adicionar 50uL de cada um dos seguintes o Controlo Negativo QUANTA Plex pr dilu do ao primeiro micropo o o Calibrador ENA Profile 5 no segundo e no terceiro micropo os e o Controlo Positivo ENA Profile 5 no quarto micropo o Tem que ser utilizada uma pipeta electr nica quando se adicionarem manualmente as amostras e se misturarem as esferas Utilize uma das sequ ncias de coordena o para adicionar os controlos conforme descrito o passo 3 Pipete vigorosamente pelo menos 30 uL do C QUANTA Plex Negative Control ENA Profile 5 Calibrator e Positive Control para cima e para baixo quatro vezes para misturar as esferas e os controlos em cada micropo o O tempo de incuba o de 30 minutos inicia se depois de adicionar o QUANTA Plex Negative Control ao primeiro micropo o 5 Prossiga imediatamente com o ensaio adicionando 5 uL de soro do doente dilu do aos micropo os adequados nota tal produz uma dilui o final a 1 1010 do soro do doente Mantenha a mesma sequ ncia de coordena o utilizada no
5. 4 0 o mesmos Negativa 203 0 Positiva 17 64 4 amostras n o foram testadas devido a volume insuficiente 11 eram positivas baixas 2 eram moderadas e 4 eram altas SLE SS and Scl n 288 INOVA ENA Profile 5 SS A 52 e SS A 60 Este foi um positivo baixo 7 eram positivas baixas 2 eram moderada e 1 era elavado SS A ELISA Negativa Positiva 97 6 o mesmos Negativa 205 2 Positiva Dt 27 Ambos eram positivas baixas 1 era positivas baixas 4 eram moderada positiva SLE SS and Scl n 288 INOVA ENA Profile 5 SS B SS B ELISA Negative Positive 97 9 o mesmos Negative 255 ai Positive 5 76 Este foi um positivo baixo 4 er am positivas ba ixas e 1 era moderada SLE SS and Scl n 288 INOVA ENA Profile 5 Scl 70 Scl 70 ELISA Negativa Positiva 96 2 o mesmos Negativa 241 1 Positiva 10 36 Positiva Negativa e Total Por cento Do Acordo Todos os dados acima mais os dados dos pacientes com artrite reumat ide foram usados para calcular a sensibilidade relativa de cada teste QUANTA Plex em rela o ao ELISA correspondente Todas as amostras Ambos Ambos ELISA Neg ELISA Pos Sensibilidade Especificidade Por cento Do N 527 Neg Pos Q PlexPos Q Plex Neg Relativa Relativa Acordo Sm 416 33 4 7 83 99 97 6 RNP 374 64 0 18 78 100 96 1 SS A 375 76 4 5 94 99 98 0 SS B 426 27 2 5 84 99
6. 98 5 Scl 70 409 38 2 11 78 99 97 2 N 456 para RNP 4 amostras n o foram testadas ele ELISA devido a volume insuficiente Precis o e Reprodutibilidade Varia o inter ensaio e varia o intra ensaio Para a varia o inter ensaio analisaram se v rias amostras em 6 testes executados em dias diferentes No quadro abaixo apresenta se a varia o em duas amostras diferentes para cada especificidade de teste Para a varia o intra ensaio foram analisadas v rias amostras 8 vezes cada num nico ensaio No quadro abaixo apresenta se a varia o em duas amostras diferentes para cada especificidade de teste Varia o inter ensaio Varia o intra ensaio Antigeno M dia UL C V Antigeno M dia UL C V SS A 52 32 17 SS A 52 33 14 Refer ncias 1 von Muhlen CA and Tan E Autoantibodies in the Diagnosis of Systemic Rheumatic Diseases Seminars in Arthritis and Rheumatism 24 323 358 1995 2 Tan EM et al The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus Arthritis and Rheumatism 25 1271 1277 1982 3 Jonsson R Haga HJ and Gordon TP Current concepts on diagnosis autoantibodies and therapy in Sj gren s syndrome Scand J Rheumatol 29 341 348 2000 4 Walker JG and Fritzler MJ Update on autoantibodies in systemic sclerosis Curr Opin Rheumatol 19 580 591 2007 5 Amigues JM Cantagrel A Abbal M and Mazieres B
7. ENA 5 Positivo Alto deve ser 2 100 e lt 300 UL em cada um dos 5 ant genos e entre 10 e 50 UL no gr nulo do anti IgG C A esfera de controlo anti IgG destina se a garantir que se detectam os resultados falsos negativos dos doentes decorrentes de erros de opera o Existe a possibilidade do amostra do doente e ou conjugado n o ter sido adicionado ao po o da amostra do doente se a esfera de anti IgG da amostra do doente for inferior 3UL Neste caso o doente deve ser novamente testado para confirmar o resultado negativo 4 5 O QUANTA Plex Negative Control e ENA Profile 5 Calibrador e o Positivo alto controlo servem para monitorizar falhas substanciais dos reagentes O Positivo alto ENA Profile 5 n o garante precis o no ponto de decis o do teste O utilizador deve recorrer ao documento C24 A3 da CSLI anteriormente NCCLS para obter instru es suplementares sobre as pr ticas do Controlo de Qualidade apropriadas 6 Se desejado bem com Diluente de Amostra HRP mas nenhum serum pode ser funcionado para confirmar que o gr nulo do controle do anti IgG detectar bem com nenhum serum Este controlo isento de soro deve ser lt 3 0 LU na esfera Anti lgG e negativo em todas as outras esferas C lculo dos resultados As MFIs para todos os controlos e amostras do doente para cada antig nio s o determinadas em primeiro lugar A reactividade em UL de uma determinada amostra para cada tipo de antig nio pode ser depois calculada atrav
8. ENA Profile 5 Calibrator 1 frasco de tamp o contendo conservante e anticorpos de soro humano contra os antig nios Sm RNP SS A 52 SS A 60 SS B e Scl 70 pr dilu do 1 2mL 4 ENA Perfil 5 Positive 1 frasco de tamp o contendo conservante e anticorpos de soro humano contra os antig nios Sm RNP SS A 52 SS A 60 SS B e Scl 70 pr dilu do 1 2mL 5 Diluente para Amostras HRP 1 frasco de cor rosa contendo solu o salina com tamp o Tris Tween 20 estabilizadores proteicos e conservantes 50mL 6 Conjugado IgG marcado com fluoresc ncia cabra anti IgG humana espec fica para fc 1 frasco castanho p liofilizado contendo tamp o estabilizadores proteicos e conservantes Consulte a sec o de M todos para as instru es de reconstitui o 7 QUANTA Plex Conjugate Diluent 1 frasco de cor rosa contendo tamp o estabilizadores proteicos e conservantes 7mL Advert ncias 1 ADVERT NCIA Este produto cont m um qu mico 0 02 cloranfenicol no diluente da amostra considerado como cancer geno no Estado da Calif rnia 2 Todo o material de origem humana utilizado na prepara o dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para m todos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV HBsAg e HCV Contudo nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a aus ncia de HIV HBV HCV ou outros agentes infecciosos Assim o ENA Profile 5 Calibrator e Positive e o Controlo negativo devem ser mani
9. QUANTA Plex ENA Profile 5 708920 Para utiliza o em diagn stico In Vitro Complexidade CLIA Elevada Aplica o Diagn stica O QUANTA Plex ENA Profile 5 um imunoensaio de fluoresc ncia para a detec o semi quantitativa de auto anticorpos Sm RNP SS A SS B e Scl 70 em soro humano A presen a destes anticorpos pode ser usada em conjunto com os resultados cl nicos e outros exames laboratoriais para aux lio no diagn stico de l pus eritematoso sist mico e doen as do tecido conjuntivo relacionadas tais como a s ndrome de Sj gren e esclerodermia Resumo e Explica o do teste Os auto anticorpos anti nucleares ANA est o presentes numa ampla variedade de doen as do tecido conjuntivo O teste da presen a de ANA em c lulas HEp 2 ou um ANA ELISA actua como um ensaio de despiste sens vel Embora o teste de ANA constitua um excelente teste de despiste para o l pus eritematoso sist mico LES em que um resultado negativo exclui praticamente a presen a de LES activo este n o de nenhuma forma um teste espec fico Os testes de acompanhamento s o habitualmente efectuados com soros que produzem resultados positivos para ANA Seis dos auto anticorpos mais frequentes reagem especificamente com os antig nios nucleares extra veis Sm RNP SS A 52 SS A 60 SS B e Scl 70 ENAs Os anticorpos destes ENAs podem contribuir com informa o diagn stica e progn stica significativa na avalia o de pacientes suspeitos de uma
10. a 159 amostras normais foram negativas na parte SS B do teste QUANTA Plex A amostra mais elevada apresentou um valor de 82 UL O valor m dio foi de 3 4 UL com um DP de 6 8 O cutoff foi de 2 4 DP acima da m dia Todas as 160 das amostras normais foram negativas na parte Sm do teste QUANTA Plex O valor m dio foi de 2 6 UL com um desvio padr o DP de 2 4 O cutoff foi de 7 2 DP acima da m dia Tudo 160 amostras normais foram negativas na parte RNP do teste QUANTA Plex O valor m dio foi de 2 3 UL com um desvio padr o DP de 2 4 O cutoff foi de 7 4 DP acima da m dia 157 amostras normais foram negativas na parte Scl 70 do Teste QUANTA Plex7M A amostra mais elevada apresentou um valor de 48 UL O valor m dio foi de 5 5 UL com um DP de 4 7 O cutoff foi de 3 1 DP acima da m dia Compara o entre os Ensaios QUANTA Plex e ELISA Para determinar o acordo positivo e negativo dos testes em amostras de paciente clinicamente definido foram testados 288 pacientes com SLE s ndroma de Sj gren ou esclerodermia com a t cnica de Perfil 5 do QUANTA Plex ENA e os 5 ELISAs correspondentes SLE SS and Scl n 288 INOVA ENA Profile 5 Sm Sm ELISA Negativa Positiva 96 2 o mesmos Negativa 244 4 Positiva 7 33 2 eram positivas baixas e 2 eram positiva moderada 6 eram positivas baixas e 1 era positiva moderada SLE SS and Scl n 284 INOVA ENA Profile 5 RNP RNP ELISA Negativa Positiva 9
11. amar informa es para o equipamento automatizado contacte a Assist ncia T cnica da INOVA Diagnostics Ligue o analisador de fluxo Luminex M assegure se de que aqueceu e efectue todas as opera es de manuten o di rias conforme previamente descrito Se for necess rio calibre o instrumento e confirme que a calibra o teve sucesso Coloque todos os reagentes e amostras do doente temperatura ambiente 20 26 C e misture bem Se o conjugado fluorescente de anti IgG humana n o tiver sido reconstitu do adicione 6mL de QUANTA Plex Conjugate Diluent ao frasco castanho contendo o p liofilizado e rode o recipiente durante aproximadamente 30 segundos para dissolver o conte do O conjugado fluorescente reconstitu do permanece est vel durante 3 meses entre 2 e 8 C N o congele Certifique se de que o recipiente do fluido de preserva o no Luminex M est cheio de fluido de protec o dispon vel na Luminex Corporation Prepare uma dilui o a 1 101 de cada amostra do doente adicionando 5uL de cada soro a 500uL de Diluente para Amostras HRP e depois coloque no v rtice para misturar exaustivamente a solu o As amostras dilu das devem ser utilizadas no prazo de 8 horas depois da prepara o N O DILUA o QUANTA Plex Negative Control e ENA Profile 5 Low e High Positives A determina o da presen a ou aus ncia de anticorpos Sm RNP SS A 52 SS A 60 SS B e Scl 70 utilizando unidades arbitr rias necessita de um micropo
12. cial dos reagentes a temperatura ambiente a precis o e reprodutibilidade da t cnica de pipetagem a reprodutibilidade da t cnica de mistura o analisador de fluxo Luminex utilizado para ler os resultados e a dura o dos tempos de incuba o durante o ensaio necess ria especial aten o consist ncia para se obterem resultados rigorosos e reprodut veis 5 O protocolo deve ser criteriosamente respeitado 6 Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropo os e dessecantes pode provocar a degrada o do antig nio e baixa precis o dos resultados 7 Pode ser observada uma fluoresc ncia inaceitavelmente baixa depois de m ltiplas utiliza es de um nico frasco de conjugado de fluoresc ncia durante algum tempo E importante cumprir todos os procedimentos recomendados para manipula o dos conjugados fluorescentes visando prevenir esta ocorr ncia 8 A contamina o qu mica do conjugado fluorescente pode resultar de uma limpeza ou lavagem inadequadas do equipamento ou instrumentos Res duos de subst ncias qu micas vulgares de laborat rio tais como formalina lix via etanol ou detergente ir o provocar degrada o do conjugado fluorescente no decurso do tempo Lave exaustivamente todo o equipamento ou instrumentos com gua destilada ou desionizada depois da utiliza o de desinfectantes produtos de limpeza qu micos Precau es particulares de conserva o 1 Conservar todos os reagentes a 2 8 C N
13. e incuba o com o conjugado fluorescente ocorre um aumento de fluoresc ncia de aproximadamente 10 por cada meia hora adicional ao tempo de incuba o 6 As caracter sticas de desempenho do ensaio n o foram determinadas para outras matrizes al m do soro 7 A falha na manuten o dos tempos de adi o dos reagentes pode provocar um aumento Front to back das varia es dos testes Valores esperados A capacidade do teste QUANTA Plex ENA Profile 5 para detectar anticorpos Sm RNP SS A 52 SS A 60 SS B e Scl 70 foi avaliada mediante compara o com testes ELISA dispon veis no mercado comercializados pela INOVA Diagnostics Inc Os resultados dos ELISAs e de cada um dos testes de Perfil 5 QUANTA Plex ENA foram considerados positivos se a amostra do paciente tiver sido igual ou superior a 20 Unidades Luminex e negativos se tiverem sido inferiores a 20 UL Intervalo de valores normais Analisaram se 168 amostras de dadores de sangue saud veis no teste QUANTA Plex ENA Perfil 5 158 amostras normais foram negativas na parte SS A 52 do teste QUANTA Plex A amostra mais elevada apresentou um valor de 49 UL O valor m dio foi de 3 8 UL com um desvio padr o DP de 4 9 O cutoff foi de 3 3 DP acima da m dia 159 amostras normais foram negativas na parte SS A 60 do teste QUANTA Plex A amostra mais elevada apresentou um valor de 31 UL O valor m dio foi de 2 5 UL com um DP de 2 8 O cutoff foi de 6 3 DP acima da m di
14. ica extremamente sens vel e tem capacidade para detectar pequenas diferen as em popula es de doentes Cada laborat rio deve estabelecer o seu pr prio intervalo do normal com base nas suas t cnicas controlos equipamento e popula o de doentes de acordo com os seus procedimentos estabelecidos Sugere se que os resultados reportados pelo laborat rio devam incluir a declara o Os resultados que se seguem foram obtidos com o INOVA QUANTA Plex ENA Profile 5 Valores obtiveram com m todos de ensaio de outros fabricantes n o podem ser utilizados em substitui o A magnitude dos n veis de auto anticorpos IgG reportados nem sempre pode estar correlacionada com um t tulo de par metro de avalia o final q mn coes do m todo A presen a de imuno complexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente podem causar um aumento do n vel de liga o n o espec fica e produzir resultados falsos positivos neste ensaio 2 Nem todos os doentes com SLE com o s ndroma de Sjogren ou de escleroderma s o Sm RNP SS A 52 SS A 60 SS B ou Scl 70 positivos 3 Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclus es cl nicas e outros testes serol gicos 4 N o agitar adequadamente os controlos e ou as amostras de soro diluidas com as microesferas conservados na placa pode aumentar os valores de CV em rela o aos valores tipicos encontrados nos testes ELISA 5 Depois da meia hora d
15. ndo as esferas de Controlo e Calibra o fornecidas pela Luminex Corporation pelo menos uma vez por m s e confirme que a calibra o tem sucesso Para al m disso calibre o Luminex se a temperatura de calibra o delta for superior a 3 graus se os controlos do ensaio estiverem fora do intervalo ou conforme for necess rio 3 Luminex demora 30 minutos a aquecer depois de ter sido ligado Quando o per odo de aquecimento se concluir efectue as opera es de purga irriga o com lcool e lavagem recomendadas pelo fabricante 4 Utilizar a Vers o do software IS carregue o modelo ENA Profile 5 e assegure se de que todas as informa es de lote est o correctas Se for necess rio actualize as informa es do lote Os par metros no modelo s o os seguintes As cores das esferas SS A 52 19 SS A 60 17 SS B 7 Sm 8 RNP 9 Scl 70 11 anti IgG 42 Os eventos por esfera s o 50 o tamanho da amostra para 50 uL o d bito para 60 uL minuto r pido e o port o para aproximadamente 7500 a 17000 Utilizam se os valores medianos para a Intensidade M dia de Fluoresc ncia MFI 5 Introduza os nomes da amostra manualmente ou clicando em Load Pa List 6 Carregue a placa na plataforma XY do Luminex 7 Fa a funcionar o Luminex clicando no bot o Start Plate 8 Quando terminar o dia execute as opera es de sanear e embeber antes de desligar o instrumento M todo Antes de iniciar 1 2 w Para progr
16. o De seguida adicionada anti lgG humana conjugada com uma sonda de fluoresc ncia a cada micropo o Uma segunda incuba o permite ao conjugado anti IgG humana fluorescente ligar se a todos os auto anticorpos do doente que se encontram fixos ao antig nio nas esferas As amostras s o depois medidas no analisador de fluxo Luminex M Este analisador de fluxo tem capacidade para separar a cor de cada esfera e medir a intensidade da fluoresc ncia do conjugado em cada esfera A intensidade da fluoresc ncia conjugada proporcional quantidade de anti IgG humana marcada fixa aos auto anticorpos do doente na esfera Cada antig nio pode ser semi quantificado comparando a intensidade de fluoresc ncia da amostra do doente com a fluoresc ncia do Calibrador correspondente Uma esfera de controlo revestida por anti lgG est inclu da em cada micropo o para garantir que se detectam os resultados falsos negativos decorrentes de erros de opera o Reagentes 1 Placa de micropo os de poliestireno 12 1 x 8 tiras de micropo os com suporte contendo esferas de 7 cores diferentes Cada uma das esferas coloridas est revestida com um antig nio purificado diferente Sm RNP SS A 52 SS A 60 SS B Scl 70 e um controlo anti lgG numa embalagem de folha de alum nio contendo exsicantes 2 QUANTA Plex 1 frasco de tamp o contendo conservante e soro humano sem anticorpos IgG humanos contra antig nios no ENA Perfil 5 pr dilu do 1 2mL 3
17. o congelar Os reagentes permanecem est veis at data de validade indicada quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo 2 As tiras dos micropo os revestidas com antig nios que n o forem logo utilizadas devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2 8 C Colheita da amostra Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro A adi o de azida ou de outros conservantes s amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados As amostras de soro com contamina o bacteriana que sofreram tratamento t rmico ou contendo part culas vis veis n o devem ser utilizadas Amostras ou soro muito hemolizados ou lip micos devem ser evitados Ap s a colheita o soro deve ser separado do co gulo O documento H18 A3 da CLSI anteriormente NCCLS recomenda as seguintes condi es de armazenamento para as amostras 1 N o armazenar as amostras temperatura ambiente durante mais de 8 horas 2 Se o teste n o for conclu do num prazo de 8 horas guardar a amostra a 2 8 C 3 Se o teste n o for conclu do num prazo de 48 horas ou se houver transporte da amostra congelar a 20 C ou a uma temperatura inferior As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas Procedimento Material fornecido Placa de micropo os de ENA Profile 5 12 1 x 8 po os com suporte 1 2 mL QUANTA Plex Negative Control pr dilu do
18. o para cada um dos controles negativos e elevados positivos controlos e dois micropo o para o Calibrador e um micropo o para cada amostra do doente Recomenda se a execu o das amostras em singleto T cnica 1 Todos os reagentes devem ser colocados temperatura ambiente 20 26 C antes de come ar o ensaio Coloque o n mero necess rio de micropo osfstiras no suporte Volte imediatamente a colocar as tiras n o utilizadas no saco contendo exsicantes e vede com firmeza para minimizar a exposi o a vapor de gua e luz 2 Adicionar 45uL de Diluente de Amostra HRP a cada micropo o que contenha uma amostra do doente N o adicionar Diluente de Amostra HRP aos quatro primeiros micropo os uma vez que estes cont m o Controlo Negativo QUANTA Plex M O Calibrador ENA Profile 5 em duplicado e o Controlo Positivo ENA Profile 5 N o adicione as amostras dos doentes dilu das aos micropo os neste momento 3 Mantenha um das seguintes sequ ncias de coordena o quando adicionar controlos amostras e conjugado ao micropo os Em virtude das amostras serem lidas sucessivamente a uma taxa de aproximadamente 1 amostra a cada 19 segundos ou uma tira de 8 po os em aproximadamente 2 minutos pelo Luminex as amostras dos doentes e tamb m o conjugado devem ser adicionados aos micropo os a esta taxa para minimizar qualquer varia o da frente para tr s do ensaio Se os controlos amostras ou o conjugado forem adicionados um de cada vez
19. passo 4 Misture a amostra do doente dilu da e o Diluente para Amostras no micropo o pipetando vigorosamente pelo menos 30 uL dos conte dos do micropo o para cima e para baixo quatro vezes Prossiga com a coordena o da incuba o durante 30 minutos a partir do momento da adi o do Controlo Negativo Coloque a tira de micropo os temperatura ambiente numa superf cie nivelada e afastada da luz solar directa durante o resto do per odo de incuba o 6 No final do primeiro per odo de incuba o adicione 50 uL do conjugado fluorescente a cada micropo o e pipete vigorosamente pelo menos 60 uL do conte do do micropo o para cima e para baixo quatro vezes Para adicionar o conjugado mantenha a mesma sequ ncia de coordena o utilizada nos passos 4 e 5 O conjugado deve ser removido do frasco em condi es ass pticas padr o e utilizando boas t cnicas de laborat rio Retire apenas do frasco a quantidade de conjugado necess ria para o ensaio PARA EVITAR POTENCIAL CONTAMINA O MICROBIANA E OU QU MICA NUNCA VOLTE A COLOCAR CONJUGADO N O UTILIZADO NO FRASCO Incube as tiras de micropo os durante 30 minutos temperatura ambiente numa superf cie nivelada e afastada da luz solar directa O per odo de incuba o inicia se depois da primeira adi o do conjugado 7 No prazo de uma hora depois da conclus o da incuba o de 30 minutos do conjugado fluorescente leia a placa de ENA Perfil 5 no Luminex conforme detalhado na sec
20. pulados como se fossem material potencialmente infeccioso 3 A azida de s dio utilizada como conservante Este produto venenoso e pode ser t xico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos A azida de s dio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canaliza es formando azidas met licas explosivas Por esta raz o ao deitar fora os restos de reagentes necess rio deixar correr gua em quantidade abundante para evitar a forma o destas subst ncias 4 Usar equipamento de protec o apropriado para trabalhar com os reagentes 5 Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente Observar todas as regulamenta es ambientais nacionais e locais relativas elimina o de res duos Precau es 1 Utilizar somente para diagn stico In Vitro 2 A substitui o de componentes do dispositivo por outros que n o perten am a este sistema pode originar resultados inconsistentes Todos os controlos s o espec ficos para o n mero de lote do kit 3 A adapta o total ou parcial deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de l quidos pode dar origem a diferen as nos resultados obtidos nos testes por t cnica manual da responsabilidade de cada laborat rio garantir que o seu procedimento autom tico d origem a resultados dentro dos limites aceit veis 4 Existem v rios factores que influenciam o desempenho do ensaio Entre estes inclui se a temperatura ini
21. s da f rmula que se segue Divida a MFI da amostra pela MFI do ENA Perfil 5 Calibrador para esse antig nio e multiplique o resultado pelo n mero de UL atribu do ao Perfil de ENA 5 Calibrador para esse antig nio A UL do Calibrador para cada antig nio est indicada no r tulo da caixa para esse lote do kit O exemplo seguinte destina se a determinar a reactividade anti Sm Utilize a f rmula equivalente para cada um dos outros antig nios MFI da Amostra para Sm Valor da amostra emUL x Valor do Calibrador para Sm em UL MFI Calibrador para Sm A amostra pode ser depois classificada de acordo com o quadro abaixo UL Negativa lt 20 Positiva fraca 20 49 Positiva moderada 50 100 Positiva forte gt 100 A reactividade est relacionada com a quantidade de auto anticorpo presente na esfera de forma n o linear Embora aumentos e diminui es das concentra es de anticorpos dos doentes se reflictam num aumento ou diminui o correspondentes da reactividade da fluoresc ncia a altera o n o proporcional ou seja uma duplica o da concentra o de anticorpos n o se reflecte numa duplica o da reactividade Para al m disso a quantidade total de IgG no soro de um doente afecta a MFI determinada Caso seja necess ria uma quantifica o mais rigorosa dos auto anticorpos do doente a amostra deve ser submetida a um teste quantitativo Interpreta o dos resultados A FIA consiste numa t cn
22. variedade de doen as do tecido conjuntivo tais como o SLE a S ndroma de Sjogren a esclerodermia Doen a mista do tecido conjuntivo e a polimiosite T m sido utilizados v rios m todos incluindo ELISA difus o dupla Ouchterlony Western Blot e aglutina o passiva para detectar anticorpos contra Sm RNP SS A SS B e Scl 70 A t cnica de imunoensaio de fluoresc ncia FIA utilizada pelo QUANTA Plex ENA Profile 5 objectiva semi quantitativa e pode ser utilizada para testar um grande n mero de doentes em simult neo relativamente a cada um destes 5 ENAs de forma c moda S o obtidos resultados semi quantitativos para cada reactividade de auto anticorpo Princ pio do m todo Sm nativo RNP e Scl 70 de timo de novilho e SS B humano recombinado ligam se cada um a esferas diferentes fluoroscopicamente coloridas Como foi reportado que ambos auto anticorpos de antigenes SS A 52 e SS A 60 s o diagnosticamente importantes usado SS A 60 nativo de timo de novilho e SS A 52 recombinado em esferas coloridas separadas As seis esferas revestidas por antig nios diferentes s o misturadas em conjunto e colocadas em po os de uma placa de micropo os em condi es que conservam os antig nios no seu estado reactive S o adicionados controlos pr dilu dos e soros de doentes dilu dos a micropo os separados permitindo que os auto anticorpos Sm RNP SS A 52 SS A 60 SS B e Scl 70 presentes se liguem ao antig nio imobilizad
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