Kit HSV2 Q-PCR Alert - Cód. RTS032 e STD032
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1. E OMETRIX IAGN STICA Rev 04 Out 2013 RTS032 HSV2 Q PCR Alert Kit Instru es de Uso USO PRETENDIDO O kit HSV2 Q PCR Alert kit Tempo Real pronto para uso um teste quantitativo de amplifica o dos cidos nucleicos para a pesquisa e a dosagem do DNA do Herpes v rus humano de Simplex do tipo 2 HSV2 em amostras de DNA extra do dos tamp es de les es mucocut neas e do plasma colhido em EDTA O produto empregado juntamente aos dados cl nicos e a outros exames de laborat rio nos diagn sticos e na monitoriza o da infec o do HSV2 PRINC PIO DE A O E REA O O procedimento consiste de uma rea o de amplifica o em Tempo Real em microplaca com termostato program vel fornecido com sistema ptico de detec o fluorescente RT PCR termociclador em tempo real A padroniza o do sistema foi executada no instrumento da Applied Biosystems ABI PRISM s rie 7000 Em cada po o uma rea o de amplifica o espec fica executada para uma regi o que codifica glicoprote na D gpG do HSV2 e para uma regi o do gene humano que codifica beta globina controle interno de adequa o da amostra utilizando o DNA produto da rea o de retro transcri o das amostras testadas Uma sonda espec fica para HSV2 marcada com o fluor foro FAM ativada quando hibridizada com o produto espec fico da rea o de amplifica o para HSV2 Outra sonda espec fica para o gene humano da beta globi2. Descartar as sobras de reagentes e res duos de acordo com as normas de seguran a Ler as instru es de uso antes de utilizar o produto Seguir as instru es N o usar produtos ap s o prazo de validade estabelecido Somente usar os reagentes fornecidos no kit e aqueles recomendados pelo fabricante N o misturar reagentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes de outros fabricantes m SIOMET RIX 18 piacn stica M EEE EE EEE Es E EEE Rev 04 Out 2013 Advert ncias e precau es de biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para prevenir o risco de resultados incorretos em particular devido degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou devido contamina o das amostras por produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular Nunca transfira materiais da rea de amplifica o detec o para a rea de extra o prepara o de rea es As amostras devem ser empregad
3. da Nc de acordo com a f rmula Nc Ve x Quantity VcxVax Ee Onde e Vc a quantidade de amostra usada na extra o em rela o unidade de medida requisitada e Ee a efici ncia da extra o expressa em d cimos e Ve o volume total do produto da extra o expresso em pL e Va o volume do produto da extra o usado na rea o de amplifica o expresso em uL e Quantity o resultado da rea o de amplifica o da amostra expresso em gEq por rea o Quando o kit Extragen usado e o resultado requerido em gEq mL a f rmula fica Vc 0 3 mL Ee 0 8 significa efici ncia de 80 Ve 15 uL Va 5 uL Nc gEq mL 15 x Quantity 0 3x5x 0 8 Nc gEq mL 12 5 x Quantity BOMETAIX 10 FE Rev 04 Out 2013 C lculo de medi o dos limites Quando um m todo particular de extra o usado os limites de medi o em gEq mL da amostra devem ser calculados a partir do limite de medi o linear da rea o de amplifica o de acordo com as f rmulas Limite inferior gEq mL Ve x 10 gEq Vc x Va x Ee Limite superior gEq mL Ve x 1 000 000 gEq Vc x Va x Ee Quando o kit Extragen usado a f rmula fica Limite inferior gEq mL 12 5 x 10 gEq Limite superior gEq mL 12 5 x 1 000 000 gEq LIMITA ES DO PROCESSO A RT PCR um processo din mico que requer altas condi es de controle para garantir amp
4. dl Ml lM ASA ecc gt NR NR NR NR NR NR MW XX W N N NO NO NA L daa Ma NR NR NR VR Illl dl NO NONO NO NO NONO NO NC ANS ANS AS AS XX IN AN AS 10 Deco aco ma A AS AS ASAS AS LAS LAS 0000000000 AS A AN ANANTAN LAN LIANA ASA 20000000 NAN ANN NAN d d d a AIN AN 25 AN S7 O Ss XE AS M Aa ZIN Z AN W o NANA S gt S O N ZINS SN 7 V S gt S Significado A1 A11 Amostras para analisar CN Controle negativo de amplifica o 10 Padr o 10 c pias 10 Padr o 10 c pias 10 Padr o 10 c pias 10 Padr o 10 c pias Programar no termociclador os par metros do ciclo t rmico e o volume de rea o p 25 L Para equipamentos Applied Biosystems ABI PRISM da s rie 7000 escolher a op o 9600 emulation Ciclo t rmico para amplifica o Desnatura o inicial 95C 10 min 95 C 15 seg 45 ciclos 60 C 1 min b Prepara o da amplifica o Antes de iniciar necess rio retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar Centrifugar os tubos m POMETRIX DIAGN STICA 6 Rev 04 Out 2013 para que o material des a para o fundo do tubo ap s descongelamento Mant los em gelo retirar e descongelar os tubos de AmpliMIX necess rios para o processo lembrando que o conte do de cada tubo suficiente para preparar 24 rea es Centrifugar os tubos por
5. do a um t tulo de 10 c pias 5 uL em DNA gen mico humano a uma titula o de 500ng 5 uL Esta amostra foi empregada em 50 repeti es para realizar a amplifica o com nossos produtos Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Amostras N 50 Positivos Negativos 50 0 10 c pias DNA plasm dico 500ng de DNA gen mico humano Sensibilidade anal tica Faixa de Medi o Linear Em termos de Faixa de Medi o Linear a sensibilidade anal tica deste teste permite determinar um t tulo de 1 000 000 a 10 mol culas de DNA alvo nos 5 pL de DNA extra do e acrescentado rea o de amplifica o Em termos da Faixa de Medi o Linear a sensibilidade anal tica do teste foi determinada utilizando um painel de dilui es 1 log entre uma dilui o e a seguinte de DNA plasm dico contendo o produto de amplifica o cuja concentra o inicial foi medida espectrofotometricamente Os pontos do painel de 10 mol culas por rea es a 10 mol culas por rea o foram usados em 9 repeti es para realizar a amplifica o com nossos produtos A an lise dos dados obtidos realizada com a regress o linear demostrou que o teste apresenta uma resposta linear para todos os pontos do painel coeficiente de correla o linear superior a 0 99 O limite superior da Faixa de Medi o Linear foi fixado a 10 mol culas 5yL dentro do logaritmo do valor de concentra o mais alto do padr o de amp
6. laborat rio de biologia molecular As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para aquela rea de trabalho As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncias e precau es espec ficas para os componentes Os produtos AmpliMIX AmpliPROBE AmpliSTANDARD AmpliMASTER apresentam a
7. mistura de rea o obtida para o fundo de cada po o na placa de rea o de amplifica o conforme pr elaborado na planilha OBS Caso n o seja utilizado toda a mistura de reagentes elaborado este tubo identificado como HSV2 poder ser armazenado no escuro a 20 C por no m ximo um m s contanto que esta mistura seja somente uma vez congelada e descongelada 6 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo de seu respectivo po o 5uL de DNA extra do conforme posi o definida na planilha elaborada 7 Transferir depositando cuidadosamente no fundo do po o de controle negativo 5uL de gua ultrapura 8 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo de seu respectivo po o 5uL AmpLiSTANDARD 102 c pias conforme posi o definida na planilha elaborada na mistura de rea o Proceder de igual modo tomando se o cuidado de dispensar cada qual em seu po o 5uL de AmpliSTANDARD com 103 104 105 c pias 9 Fechar a Microplaca de amplifica o com a L mina adesiva de amplifica o precavendo se de que a placa fique bem selada fazendo uso de acess rio adequado para tal procedimento 10 Transferir a placa de amplifica o para o termociclador Real Time que deve estar em rea espec fica e destinada para produtos amplificados p s PCR Rev 04 Out 2013 CALIBRA O DO PROCESSO Para este tipo de ensaio e metodologia n o existe procedimento de calibra o para o processo de medi o
8. o absolute quantitation 5 Rev 04 Out 2013 programar o detector para a sonda HSV2 com o rep rter FAM e o quencher none NFQ um extintor de fluoresc ncia dark quencher programar o detector para a sonda da beta globina com o rep rter VIC e o quencher none NFQ um extintor de fluoresc ncia dark quencher para qualquer po o da microplaca programar o detector tipo de fluoresc ncia para medir o passive reference ROX normaliza o da fluoresc ncia medida e o tipo de rea o amostra controle de amplifica o negativo ou padr o com quantidade relativa reconhecida Completar a planilha que se encontra no final desta Instru o de Uso escrevendo estas informa es ou imprimir a montagem da placa com as respectivas disposi es dos controles e localiza es das amostras A planilha deve ser seguida criteriosamente durante a aplica o da amostra e seus reagentes OBS para a determina o do t tulo de DNA alvo na amostra inicial ser necess rio preparar uma s rie de rea es usando DNA padr es com quantidades conhecidas c pias nas quantidades 10 10 10 10 para que se possa obter a Curva Padr o Ilustra se logo abaixo a t tulo de exemplo como pode ser organizada a an lise de 11 amostras aii XXX Na a NC NO NO NO YN DAL AL AL AL AL AL AL AL AAA 4 az W NONO Y YYYY YW o S da Ma h dl Md
9. uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o para evitar resultados falsos positivos reas de pr e p s PCR Um resultado falso negativo obtido com este produto indica que o DNA de HSV2 n o est detectado no DNA extra do da amostra mas ele pode ainda conter DNA HSV2 a um t tulo menor que o limite de detec o para o produto Verificar par grafo que trata de Caracter sticas de Desempenho neste caso o resultado ser um falso negativo Como para qualquer outro dispositivo diagn stico os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente Como para qualquer outro dispositivo diagn stico existe um risco latente de obter resultados n o v lidos falsos positivos e falsos negativos com este produto Este risco residual n o pode ser eliminado ou reduzido posteriormente Este risco residual em situa es particulares como os diagn sticos de urg ncia pode contribuir a decis es incorretas com consequ ncias graves para o paciente CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE Controles de Qualidade aconselh vel confirmar o procedimento completo de an lises de cada sess o extra o e amplifica o utilizando uma amostra negativa e uma amostra positiva Como amostra negativa utilizar uma amostra negativa j testada ou ainda da gua
10. 5 segundos pulso para que os reagentes que estejam na parede des am para o fundo do tubo ap s o descongelamento Mant los em gelo retirar e descongelar um n mero de tubos de AmpliPROBE iguais aos dos tubos de AmpliMIX Repetir o pulso nesses tubos para que seu conte do des a todo para o fundo do tubo Mant lo em gelo retirar tantos tubos de AmpliMASTER quantos os tubos de AmpliMIX Escreva HSV2 e a data no tubo com caneta com tinta permanente Dar um pulso nos tubos para que os reagentes depois de descongelados des am para o fundo do tubo Mant los em gelo retirar e descongelar os tubos de AmpliSTANDARD necess rios Dar um pulso nos tubos para que os reagentes depois de descongelados des am para o fundo do tubo Mant los em gelo se necess rio cortar a placa de amplifica o para separar a parte que ser utilizada no ensaio tomando o devido cuidado de manipul la com luvas sem p e de n o causar danos aos po os durante o corte separa o 1 Transferir 100 uL de AmpliMIX no tubo de AmpliMASTER Misturar bem pipetando por tr s vezes o volume de 100 uL na mistura 2 Transferir 100 pL de AmpliPROBE no tubo de AmpliMASTER Misturar bem pipetando por tr s vezes o volume de 100 uL na mistura 3 Misturar em V rtex a baixa velocidade por 5 segundos evitando produ o de espuma 4 Centrifugar os tubos por 5 segundos pulso para que todo l quido escorra para o fundo do tubo 5 Transferir 20 uL da
11. 6 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia REGISTRO ANVISA 80298490051 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 20 12 2013 mit ANO X NYO MONO Mauricio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon OME 20 N WORKSHEET 12 11 10 ATTACHMENT
12. C LCULOS E OBTEN O DOS RESULTADOS An lise qualitativa dos resultados Os valores registrados da fluoresc ncia emitidos pela sonda espec fica para HSV2 fluoresc ncia FAM e pela sonda espec fica para o Controle Interno fluoresc ncia VIC nas rea es de amplifica o devem ser analisadas por software espec fico Antes de iniciar a an lise consultar o manual do equipamento e programar manualmente o baseline n vel de background fluorescente do ciclo 6 ao ciclo 15 Nota No caso de uma amostra positiva com alto t tulo de HSV2 a fluoresc ncia FAM da sonda espec fica para HSV2 pode come ar a aumentar antes do 15 ciclo Neste caso o intervalo de c lculo da baseline deve ser adaptado do ciclo 6 ao ciclo em que a fluoresc ncia FAM come ar a aumentar por exemplo o ciclo 10 programar manualmente o Limiar Thereshold para a fluoresc ncia FAM a 0 2 programar manualmente o Limiar Thereshold para a fluoresc ncia VIC a 0 1 Os valores de fluoresc ncia emitidos pelas sondas espec ficas para HSV2 na rea o de amplifica o e o valor Threshold permite determinar o cT ciclo Threshold o ciclo em que a fluoresc ncia atinge o valor Threshold Na rea o de amplifica o do Controle Positivo o valor de cT para a sonda espec fica HSV2 usado para validar a amplifica o e a detec o como descrito na tabela seguinte cT do Controle Positivo HSV2 FAM cT lt 25 POSITIVO CORRETO Resultado do tes
13. ONENTES FORNECIDOS Componente Descri o Quantidade Composi o HSV2 Q PCR Alert histura deprimensde Oligonucleotideos AmpliMIX oligoniiclcotideos 4x 110 pL TRIS base e cloridrato RTS032 M Glicerol Triton X 100 Mistura He sondas Oligonucleotideos HSV2 Q PCR Alert fluorescentes fliorescentes TRIS base e AmpliPROBE marcadas com FAM MGB 4x110 pL ars cloridrato Glicerol TRTI NFQ Triton X 100 e com VIC MGB NFQ TRIS base e cloridrato Glicerol MgCl Nistira dersagentes Desoriboxinucleotideos 4x 340 uL trifosfatos ROX Uracil Q PCR Alert opumizados N glicosilase AMPIIMASTER Taq DNA polimerase hot RTS000 siart Microplaca com a 96 pocinhos de 0 2 mL a Plastico PP L mina adesiva vedante 3 Pl stico e cola E OMETRIX FEeeooooooooooOG T TORO DO ee Rev 04 Out 2013 MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Equipamentos Capela de fluxo laminar Agitador tipo V rtex Microcentr fuga de mesa 12 000 14 000 RPM Micropipetas simples volume vari vel Real Time ABI PRISM 7000 completo com microcomputador Material de Consumo EPI Ponteiras com filtro gua ultrapura Tubos de microcentrifuga o 1 5 mL a 2 0 mL Amostras DNA extra do por metodologia definida pelo usu rio seguindo as normas e padr es de amostras exigidos na descri o abaixo CONDI ES DE ARMAZENAMENTO Componente dba Quan
14. ar es Ferreira CRQ PR 09302336 Aprova o 20 12 2013 X y N H ig UV q U Mauricio Cichon Laborat rio Assinado por Maur cio Cichon OMET A no RR BOMETAIX STDO32 HSV2 Q PCR Standard Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto HSV2 Q PCR Standard destinado ao uso como um controle positivo e como padr o de quantidade conhecida de DNA para obter uma curva padr o em ensaios de amplifica o quantitativa de cidos nucleicos para a detec o e dosagem do DNA do v rus humano Herpes Simplex tipo 2 HSV2 com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER lt HSV2 Q PCR Alert AmpliMIX gt e HSV2 Q PCR Alert AmpliPROBE da Nanogen Advanced Diagnostics S P A DESCRI O DO PRODUTO O produto Q PCR Standard inclui quatro solu es de plasm deos estabilizadas com titula o conhecida contendo a sequ ncia requerida est o divididas em dois tubos de al quotas prontas para uso Cada tubo teste cont m 50 uL de solu o suficiente para oito sess es O plasm deo cont m uma regi o g nica que codifica a glicoprote na G do HSV2 A detec o do DNA alvo durante a rea o de amplifica o em tempo real confirma a habilidade de identificar a presen a do DNA HSV2 e permite o c lculo da curva padr o O kit possibilita a execu o de 16 sess es de an lise separadas concentra o inicial do padr o foi determinada por espectrofot metro pela medi o da absor o da prepara o inicia
15. as exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou serem usadas com ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a este prop sito As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncias e precau es para componentes espec ficos Os tubos contendo Q PCR Standard podem ser congelados e descongelados por no m ximo 8 vezes Um n mero maior de ciclos de congelamento e desco
16. as para a hibridiza o do oligonucleot deo no primer AmpliMIX e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequ ncias dispon veis no banco de dados do gene codificador da glicoproteina D gpG do HSV2 demonstrou sua conserva o e a aus ncia de muta es significativas Sensibilidade diagn stica amostras positivas A sensibilidade diagn stica do teste como confirma o das amostras cl nicas positivas foi verificada utilizando como material de refer ncia alguns swabs mucocut neos positivos para o DNA de HSV2 como material de refer ncia e os resultados foram melhores que 95 4 A sensibilidade diagn stica foi verificada utilizando 22 swabs mucocut neos positivos para o DNA de HSV2 testados com um m todo de amplifica o nested Cada amostra foi z SIOMET RIX DIAGN STICA 14 E IOMETRIX E Rev 04 Out 2013 empregada para realizar o procedimento completo de an lise extra o e amplifica o com nossos produtos Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Negativos 0 22 22 Amostras N Positivos Swabs para amostras genitais positivos para o DNA de HSV2 Especificidade anal tica marcadores interferentes em potencial A sensibilidade anal tica do teste que a rea o cruzada com outros marcadores interferentes foi avaliada pela compara o de sequ ncia com bancos de dados nucleot dicos O teste de alinhamento das regi es selecionadas para a hibrida o do o
17. at rios a sensibilidade anal tica do ensaio foi checado via um painel de plasma para teste profici ncia Os testes foram realizados utilizando como material de refer ncia calibrado um painel de dilui es 1 log entre uma dilui o e a seguinte de HSV2 em plasma entre a concentra o limite PeliCheck HSV 1 2 DNA 02 AcroMetrix Europe B V the Netherlands Cada amostra do painel foi usada em 3 repeti es para realizar o procedimento completo de an lise extra o e amplifica o com os nossos produtos Os resultados s o referidos na tabela seguinte Testes com material de refer ncia calibrado Valor Es Rs M dia dos te rico Valor once valor seno Repeti es Positivos resultados NDU mL NDU extra o NDU rea o sEq rea o 2 5 0 75 0 2 3 3 1 09 25 0 7 50 2 0 3 3 11 30 250 0 75 0 20 0 3 3 179 01 2500 0 750 0 200 0 3 3 1576 34 25 000 0 7 500 0 2000 0 3 3 14978 40 Neste teste uma NDU NAT Detection Unit da AcroMetrix Europe B V demonstra se equivalente a aproximadamente 7 gEq calculados com produtos Nanogen Sensibilidade diagn stica efici ncia de detec o e quantifica o nos diferentes gen tipos subtipos A sensibilidade diagn stica do teste que a efici ncia de detec o e quantifica o nos diferentes gen tipos subtipos foi avaliada pela compara o de sequ ncias com banco de dados de nucleot dicos O teste de alinhamento das regi es selecionad
18. bidestilada est ril Como amostra positiva utilizar do material de refer ncia calibrado de aproximadamente 150 gsEq mL de HSV2 por ex a amostra a 25 NDU mL do PeliCheck HSV 1 2 DNA 2002 AcroMetrix Europe B V the Netherlands Controles de amplifica o absolutamente necess rio confirmar cada sess o de amplifica o preparando uma rea o de controle negativo e uma rea o de controle positivo Para o controlo negativo utilizar gua bidestilada est ril n o inclu da no kit para acrescentar rea o no lugar do DNA extra do da amostra Para o controle positivo utilizar o DNA extra do de uma amostra positiva j testada ou o Q HSV2 AmpliSTANDARD mm SIOMET RIX 12 Dpiacn stica M Rev 04 Out 2013 VALORES DE REFER NCIA OBTIDOS EM POPULA ES SADIAS OU VALORES DEMOGR FICOS EPIDEMIOL GICOS ESTAT STICOS DESEJ VEIS TERAP UTICOS OU T XICOS N o existe este tipo de dado para a metodologia em quest o CARACTER STICAS DE DESEMPENHO Sensibilidade Anal tica Limite de Detec o A sensibilidade anal tica deste teste permite identificar a presen a de aproximadamente 10 mol culas de DNA alvo nos 5 uL de DNA extra do e acrescentado rea o de amplifica o Em termos de detec o a sensibilidade anal tica do teste foi testada utilizando um DNA plasm dico contendo o produto de amplifica o cuja concentra o inicial foi medida espectrofotometricamente O DNA plasm dico foi dilu
19. eicos utilizados neste produto por causa da sua elevada sensibilidade anal tica est sujeito contamina o por parte das amostras cl nicas positivas para o DNA de HSV2 dos controles positivos e dos mesmos produtos da rea o de amplifica o As contamina es levam a resultados falsos positivos O produto foi designado de modo a reduzir contamina o a modalidade de realiza o do produto pode limitar as contamina es contudo estes fen menos podem somente ser m SIOMET RIX 11 Dpiacn stica LLL ESSE FER Rev 04 Out 2013 evitados seguindo as boas pr ticas de laborat rio e seguindo atentamente as instru es fornecidas nestas Instru es de Uso Este produto requer pessoal instru do no manuseio de amostras biol gicas que podem transmitir agentes infecciosos e de reagentes classificados como perigosos para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas Este produto requer roupa de trabalho EPI e rea de trabalho adequadas para a manipula o de amostras biol gicas que podem transmitir agentes infecciosos e de reagentes classificados como perigosos para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o usu rio ou outras pessoas Este produto requer pessoal instru do para o procedimento de biologia molecular tais como extra o amplifica o e detec o de cidos nucleicos para evitar resultados incorretos FP ou FN Este produto requer
20. ito a seguir Rev 04 Out 2013 Curva Padr o Ns E E Coeficiente de Correla o R2 0 990 lt R2 lt 1 000 CORRETO Se o valor do Coeficiente de correla o R2 n o est dentro dos limites isso significa que problemas ocorreram na fase de amplifica o ou de detec o volumes de mistura de rea o incorretos degrada o da sonda degrada o dos padr es dispensa o incorreta dos padr es posicionamento incorreto dos padr es programa o incorreta do ciclo t rmico que podem ter levado a resultados incorretos A sess o n o v lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Os valores de fluoresc ncia emitidos pela sonda espec fica para HSV2 nas rea es de amplifica o de cada amostra e a Curva Padr o da sess o de amplifica o s o utilizados para calcular a Quantidade Quantity de DNA alvo presente nas rea es de amplifica o das amostras Este kit est apto a dosar entre 10 a 1 000 000 c pias do DNA do gene que codifica a prote na gpG do HSV2 por rea o de amplifica o correspondentes aos genomas Equivalentes por rea o como descrito na tabela seguinte ii E no Genomas Equivalentes de HSV2 por rea o Quantity gt 1 x 10 SUPERIOR A 1 000 000 1x 101 lt Quantity lt 1x 10 Quantidade Quantity lt 1 x 10 INFERIOR A 10 Os resultados Quantity de cada amostras s o usados para calcular o genoma Equivalente gEq do HSV2 presente na amostra extra
21. l de DNA de plasm deo MATERIAIS FORNECIDOS Componente Descri o Quantidade Composi o HSV2 Q PCR Solu o de plasm deo Plasm deo TRIS base TRIS Standard 10 em tubo com tampa 2 x50 pL cloridrato EDTA RNA total vermelha de levedura Solu o de plasm deo Plasm deo TRIS base TRIS Rara PCR em tubo com tampa 2 x50 pL cloridrato EDTA RNA total Standarao azul de levedura HSV2 Q PCR Solu o de plasm deo Plasm deo TRIS base TRIS 3 em tubo com tampa 2 x50 pL cloridrato EDTA RNA total Standard 10 verde de levedura HSV2 Q PCR Solu o de plasm deo Plasm deo TRIS base TRIS Standard 10 em tubo com tampa 2 x50 pL cloridrato EDTA RNA total amarela de levedura e Armazenar a 20 C ou inferior 17 Em rereererers tteieeso oooeoess Rev 04 Out 2013 Rev 04 Out 2013 MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Fluxo laminar Luvas descart veis sem talco Agitador v rtex Microcentr fuga de bancada 12 000 14 000 RPM Micropipetas est reis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo 0 5 10 uL 2 20 uL 5 50 uL 50 200 uL 200 1000 uL gua bidestilada est ril Real Time ABI PRISM 7000 completo com computador ACESS RIOS Os reagentes otimizados para amplifica o os primers oligonucleotideos e os reagentes de detec o sondas fluorescentes n o est o inclusas neste produto Para realizar estes passos anal ticos
22. lifica o AmpliSTANDARD 10 mol culas 5uL O limite inferior da Faixa de Medi o Linear foi fixado a 10 mol culas 5yL dentro do logaritmo do valor de concentra o mais baixo do padr o de amplifica o AmpliSTANDARD 10 mol culas 5pL Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Faixa de Medi o Linear c pias DNA rea o gEq mL Limite superior 1 000 000 12 500 000 Limite inferior 10 125 Sensibilidade anal tica Precis o O estudo da precis o do teste entendida como variabilidade dos resultados obtidos em diferentes repeti es de uma amostra com a mesma concentra o analisadas em uma nica BOMETAX 13 Rev 04 Out 2013 sess o permitiu determinar um Coeficiente de Varia o CV de 12 5 na Faixa de Medi o Linear de 10 mol culas 5 uL a 10 mol culas 5 L Sensibilidade anal tica Exatid o O estudo da exatid o do teste entendida como a diferen a entre os resultados m dios obtidos em uma nica sess o com diferentes repeti es de uma amostra mesma concentra o e o valor te rico da concentra o das amostras permitiu determinar uma inexatid o percentual m dia de 5 5 na faixa linear 10 mol culas 5 uL de 10 mol culas 5 uL Sensibilidade anal tica reprodutibilidade com painel para teste de profici ncia Em termos de reprodutibilidade dos resultados comparados com os resultados obtidos usando outros ensaios em diferentes labor
23. lifica o discriminat ria O procedimento Instru es de Uso deve ser seguido rigorosamente A amostra de DNA extra da fornece um molde para um processo de amplifica o espec fico e desta forma a concentra o e a pureza devem estar dentro dos valores especificados no produto Todos os instrumentos m quina RT PCR pipetas centr fuga devem ser calibrados de acordo com as recomenda es do fabricante Utilizar precisamente com este produto o DNA extra do das seguintes amostras humanas swabs de les es mucocut neas e plasma coletado em EDTA N o utilizar com este produto o DNA extra do das amostras heparinizadas A heparina inibe a rea o de amplifica o dos cidos nucleicos e causa resultados inv lidos N o utilizar com este produto o DNA extra do contaminado com hemoglobulina A hemoglobulina inibe a rea o de amplifica o dos cidos nucleicos e pode causar resultados inv lidos N o est o disponiveis dados pertinentes a eventuais fen menos de inibi o por parte dos medicamentos antivirais quimioter picos ou imunossupressores Os resultados obtidos com este produto dependem da correta coleta transporte conserva o e prepara o das amostras para evitar resultados incorretos necess rio portanto ter particular aten o durante estas fases e seguir atentamente as instru es fornecidas com os produtos para a extra o dos cidos nucleicos O m todo de amplifica o Real Time dos cidos nucl
24. ligonucleot deo no primer AmpliMIX e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequ ncias disponibilizadas no banco de dados de diferentes organismos do HSV2 incluindo o genoma completo de HSV2 o Herpes virus humano mais similar ao HSV2 demostrou a sua especificidade e a aus ncia de homologias significativas Em termos de aus ncia de rea o cruzada com outros marcadores interferentes em potencial a sensibilidade anal tica do ensaio foi testado usando como material de refer ncia algumas amostras de swabs genitais positivos para o DNA de HSV2 A especificidade anal tica do teste foi verificada utilizando 5 swabs mucocut neos e 3 al quotas de l quido cefalorraquidiano positivos para o DNA de HSV2 testados com um m todo de amplifica o nested Cada amostra foi empregada para realizar o procedimento completo de an lise extra o e amplifica o com nossos produtos Os resultados s o referidos na tabela seguinte Amostras N Positivos 0 Negativos 8 Amostras positivas para o DNA de HSV2 8 Especificidade diagn stica amostras negativas A especificidade diagn stica do teste como confirma o das amostras cl nicas negativas foi avaliada interpretando a an lise de um painel de plasmas de doadores normais e de algumas amostras de swabs genitais negativos para o DNA de HSV2 e resultou igual a 97 6 A especificidade diagn stica foi avaliada utilizando um painel de amostras de plasma de doadores n
25. na marcada com o fluor foro VIC ativada quando hibridizada com o produto da rea o de amplifica o para o gene humano da beta globina A emiss o da fluoresc ncia aumenta com o aumento do produto espec fico da rea o de amplifica o e medida e registrada pelo aparelho O processamento dos dados determina a presen a e o t tulo do DNA de HSV2 na amostra inicial Assay Chemistry Summary Forward 8 Primer Fam O Quencher Reporter Minor Grove Binder AmpliTaq Gold DNA Polymerase Non Target Template Rev 04 Out 2013 A partir do momento que a sonda TaqMan for ligada parte espec fica do gabarito de DNA depois da desnatura o alta temperatura e resfriamento da rea o os primers se anelam ao DNA A TagPolimerase ent o adiciona nucleot deos e remove a sonda TaqManO do DNA gabarito Isso separa o quencher do rep rter e permite ao rep rter emitir sua energia Isso ent o quantificado usando um computador Quanto mais ocorrer a desnatura o e anelamento mais oportunidades a TaqManO ter de se ligar e em contra partida mais luz emitida ser detectada t y T t o leotides li nucleo O corante do rep rter liberado da from TaqM P a o 1 r Ao dd dupla fita de DNA criada pela Taq Polimerase Longe do corante quencher a luz emitida do 3 corante rep rter dye em estado excitado pode agora ser observada complementary strand 3 template DNA 5 COMP
26. ngelamento pode causar uma redu o do t tulo Q PCR Standard apresenta as seguintes advert ncias S S 23 25 N o inalar vapores Evitar contato com os olhos PROCEDIMENTO O produto HSV2 Q PCR Standard deve ser usado com a mistura de rea o obtida com os produtos Q PCR Alert Amplimaster HSV2 Q PCR Alert AmpliMIX gt e HSV2 Q PCR Alert AmpliPROBE gt Q PCR Standard est pronto para o uso portanto deve ser usado adicionando 5 uL diretamente na mistura de rea o O procedimento completo envolve prepara o e execu o de rea o de amplifica o em tempo real em uma microplaca com termociclador com sistema ptico de detec o de fluoresc ncia descrito em detalhes nas instru es de uso do produto HSV2 Q PCR Alert AmpliMIX gt bem como informa es sobre as caracter sticas de desempenho e limita es do procedimento em E Rev 04 Out 2013 Nota Q PCR Standard pode ser congelado e descongelado por no m ximo 8 vezes Um n mero maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode causar uma redu o do t tulo REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS AURELIUS E et al 1993 J Med Virology 39 179 186 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrixQbiometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 97
27. ormais Painel Normal Humano Plasma AcroMetrix Europe B V the Netherlands Cada amostra do painel foi usada para realizar o procedimento completo de an lise extra o e amplifica o com nossos produtos Os resultados s o referidos na tabela seguinte Amostras N Positivos 21 0 Negativos 21 Painel de plasmas de doadores normais A especificidade diagn stica foi avaliada utilizando 21 swabs genitais negativos para o DNA de HSV2 testados com um m todo de Amplifica o Nested Cada painel de amostra foi usado para realizar o procedimento completo de an lises extra o e amplifica o com nossos produtos Os resultados s o mostrados na tabela seguinte Amostras N Positivos Negativos Swabs genitais negativos para o DNA de HSV2 21 0 21 15 em E Rev 04 Out 2013 REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS AURELIUS E et al 1993 J Med Virology 39 179 186 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrixQbiometrix com br Website www biometrix com br CNPJ 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia REGISTRO ANVISA RTS032 M 80298490099 RTS032 P 80298490045 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guim
28. os produtos a seguir s o recomendados e Q PCR Alert AmpliMASTER RTS000 combina o de reagentes otimizados microplacas e adesivos para PCR em tempo real e determina o al lica total de 96 rea es e HSV2 Q PCR Alert AmpliMIX gt RTS032 M primers oligonucleotideos para PCR em tempo real total de 96 rea es e HSV2 Q PCR Alert AmpliPROBE gt RTS032 P sondas fluorescentes para PCR em tempo real total de 96 rea es ADVERT NCIAS E PRECAU ES Este produto exclusivamente para uso in vitro Advert ncias e precau es gerais Manusear e descartar todas as amostras biol gicas como potencialmente infecciosas Evitar o contato direto com amostras biol gicas Evitar respingos Os materiais que entram em contato com amostras biol gicas devem ser tratados com hipoclorito de s dio 3 por no m nimo 30 minutos ou autoclavados a 121 C por uma hora antes de serem descartados Manusear e descartar todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos Evitar contato direto com reagentes Evitar respingos Os res duos devem ser tratados e descartados de acordo com normas de seguran a Res duos l quidos contendo cidos ou bases devem ser neutralizados antes do descartar Usar jaleco luvas e culos de prote o Nunca pipetar solu es com a boca N o comer beber fumar ou aplicar cosm ticos dentro da rea de trabalho Lavar as m os cuidadosamente ap s manusear amostras e reagentes
29. quidos que cont m cidos ou bases devem ser neutralizados antes da elimina o N o pipetar nenhuma solu o com a boca Lavar bem as m os depois de haver manipulado as amostras e os reagentes Eliminar reagentes e res duos conforme as normas vigentes Ler todas as instru es fornecidas no kit antes de realizar o teste Respeitar as instru es fornecidas no kit durante a execu o do teste Respeitar a data de validade do kit Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante N o intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes Advert ncias e precau es para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para evitar o risco de resultados incorretos em particular por causa da degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou da contamina o das amostras por parte de produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EPI adequado a cada uma das reas de trabalho em
30. s seguintes advert ncias S S 23 25 N o respirar vapores aerossol Evitar o contato com os olhos Observa es importantes e Os tubos que cont m o AmpliMIX e o AmpliPROBE s o descart veis e portanto devem ser utilizados uma nica vez na prepara o da mistura de rea o 4 IOMETRIX Eee ooo oo o Rev 04 Out 2013 e Os tubos que cont m o AmpliSTANDARDO n o podem ser congelados e descongelados por mais de 8 vezes Ciclos sucessivos de congelamento descongelamento podem causar perda no t tulo e Os tubos que cont m o AmpliMASTER n o podem ser congelados e descongelados por mais de 1 vez Ciclos sucessivos de congelamento descongelamento podem causar uma perda na efici ncia da amplifica o CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOL GICA A amostra deve ser tratada como potencialmente infecciosa Amostras Este produto deve ser utilizado com DNA extra do das seguintes amostras biol gicas tamp es de les es mucocut neas e do plasma colhido em EDTA Tamp es de les es mucocut neas Os tamp es de les es mucocut neas para a extra o do DNA devem ser colhidos segundo as indica es do laborat rio colocadas em meio de transporte para culturas celulares ou Solu o fisiol gica est ril ou PBS est ril transportadas a 2 C 8 C e conservadas a 2 C 8 C por um m ximo de quatro horas ou conservadas congeladas a 20 C por um m ximo de trinta dias ou ainda a 70 C por um maior tempo Aconselha se
31. s sondas espec ficas do controle interno s o usados para validar a amplifica o detec o e extra o Verificar no software do instrumento que o cT foi determinado por um r pido e regular crescimento dos valores de fluoresc ncia e n o por picos ou incremento de sinal background Este produto est apto a detectar uma quantidade m nima de 10 c pias de DNA do gene gpG do HSV2 por rea o de amplifica o Os resultados dos cTs s o usados utilizados conforme descrito na tabela seguinte cT da amostra Adequa o da Resultado do DNA de HSV2 FAM ontrole Interno VIC amostra teste HSV2 m a Inadequado Inv lido Indeterminado Indeterminado E TA cT lt 35 adequado varda NAQ negativo DETECTADO a gt a adequado vendo PRESENTE p Indeterminado positivo Determinado v lido cT lt 35 adequado PaE PRESENTE positivo Se o resultado da rea o de amplifica o de uma amostra cT Indeterminado para a sonda espec fica do HSV2 ou cT gt 35 ou Indeterminado para a sonda espec fica do Controle Interno isso significa que n o foi possivel detectar de modo eficiente o DNA do controle interno Neste caso problemas podem ter ocorrido na fase de amplifica o amplifica o n o eficiente ou nula ou na fase de extra o aus ncia de DNA presen a de inibidores ou amostras iniciais com um n mero de c lulas insuficiente que podem ter levado a resultados incorretos e falsos negativos A amostra n o adeq
32. subdividir em mais al quotas as amostras para conservar congeladas de modo a n o submet las a ciclos de congelamento descongelamento repetidos As instru es para o eventual pr tratamento da amostra cl nica e para a extra o do DNA est o contidas no Manual de instru es para o uso de EXTRAgen gt Plasma colhido em EDTA O plasma colhido em EDTA deve ser colhido segundo as indica es do laborat rio transportado a 2 8 C e conservado a 2 8 C por um m ximo de quatro horas ou conservado congelado a 20 C por um m ximo de trinta dias ou ainda a 70 C por um maior tempo Aconselha se subdividir em mais al quotas as amostras para conservar congeladas de modo a n o submet las a ciclos de congelamento descongelamento repetidos As instru es para o eventual pr tratamento da amostra cl nica e para a extra o do DNA est o contidas no Manual de instru es para o uso de EXTRAgen Subst ncias interferentes O DNA extra do da amostra inicial n o deve conter heparina ou hemoglobina para evitar fen menos de inibi o e a possibilidade de frequentes resultados n o v lidos N o h dados dispon veis com rela o inibi o causada por medicamentos antivirais PROCESSO DE MEDI O a Preparo da etapa de amplifica o real time rea de p s PCR Antes de iniciar consultar o manual do equipamento e ligar o termociclador e seu computador iniciar o software apropriado e abrir uma sess
33. te Amplifica o Se o resultado da rea o de amplifica o do Controle Positivo cT gt 25 ou indeterminado a presen a do DNA alvo n o foi corretamente detectada Isto significa que problemas podem ter ocorrido durante amplifica o ou detec o que podem ter levado a resultados incorretos A sess o n o v lida e precisa se repetida desde o passo de amplifica o Quando este produto usado para quantifica o de HSV2 utilizam se as rea es do HSV2 Standard ao inv s do Controle Positivo Neste caso a valida o da rea o feita pelo Standard Na rea o de amplifica o do controle negativo o valor de cT da sonda espec fica para HSV2 usada para validar a amplifica o e a detec o como descrito na tabela a seguir cT do Controle Negativo HSV2 FAM Indeterminado NEGATIVO CORRETO Resultado do teste Amplifica o Se o resultado da rea o de amplifica o do Controle negativo diferente de Indeterminado a presen a do DNA alvo foi detectada Isso significa que problemas ocorreram BOMETAIX s E IOMETRIX E Rev 04 Out 2013 na fase de amplifica o contamina o que podem ter levado a resultados incorretos e falsos positivos A sess o n o v lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Na rea o de amplifica o de cada amostra os valores de cT das sondas espec ficas HSV2 s o usados para detectar a presen a do DNA alvo enquanto os valores de cT da
34. tidade Estocagem HSV2 Q PCR Alert AmpliMIX RTS032 M 4x 110 uL 20 C HSV2 Q PCR Alert AmpliPROBE RTS032 P 4x110 uL 20 C Q PCR Alert AmpliMASTER 4 x 340 uL 2 8 C Microplaca para amplifica o RTS000 3 Temp Ambiente L mina adesiva para amplifica o 3 Temp Ambiente PRECAU ES Este kit reservado para uso exclusivo em diagn stico in vitro Manuseio necess rio ao manusear o kit e as amostras com EPI adequado ao tipo de laborat rio onde os testes ser o realizados devido natureza da amostra material biol gico humano Tratar como potencialmente infeccioso N o beba ou coma na rea de trabalho A rea de trabalho deve ser ambiente limpo e com ventila o adequada Deve se trabalhar dentro de capela de exaust o fluxo Laminar N o manuseie o kit sem luvas Advert ncias e precau es gerais Manipular e eliminar todas as amostras biol gicas reagentes e materiais usados como se fossem agentes infecciosos Evitar o contato direto com as amostras biol gicas Evitar a forma o de aerossol durante o procedimento evitar respingar material ao redor da rea de trabalho ou fora dela O material que est em contato com as amostras biol gicas deve ser tratado com Hipoclorito de s dio a 3 pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121 C durante uma hora antes de ser eliminado O material descart vel E IOMETRIX E Rev 04 Out 2013 combust vel deve ser incinerado Os res duos l
35. uada o teste n o v lido e deve ser repetido a partir da extra o de uma nova amostra Se o resultado da rea o de amplifica o de uma amostra cT Indeterminado para a sonda espec fica do HSV2 e cT lt 35 para a sonda especifica do Controle Interno o DNA de HSV2 n o foi detectado no DNA extra do da amostra mas n o poss vel descartar a presen a do DNA de HSV2 a um t tulo inferior ao limite de detec o do produto verificar dados a seguir em Caracter sticas de Desempenho Neste caso o resultado seria um falso negativo Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exames de laborat rio relativos ao paciente Quando o HSV2 detectado em uma amostra o controle interno pode resultar em um cT gt 35 ou Indeterminado De fato a baixa efici ncia na rea o de amplifica o para o Controle Interno pode ser deslocada pela competi o com a alta efici ncia da rea o para o HSV2 Neste caso a amostra contudo adequada e o resultado positivo do teste v lido An lise quantitativa dos resultados Depois de realizar o procedimento para an lise qualitativa dos resultados poss vel realizar a an lise quantitativa dos resultados de amostras positivas Os valores de cT para sondas espec ficas HSV2 para os quatro Standards s o usados para calcular a curva padr o para a sess o de amplifica o e para validar a amplifica o e a detec o como descr
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