SeroELISATM Chlamydia TRUE IgMTM
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1. no grupo antig nico Com este teste ELISA poder o ser detectados anticorpos contra Chlamydia psittaci Chlamydia pneumoniae TWAR a Acinetobacter calcoaceticus M111 01P 04 10 13 O significado dos t tulos das amostras deve ser considerado em rela o s caracter sticas da popula o estudada Estas caracter sticas devem incluir a idade localiza o geogr fica e comportamentos sexuais al m de outros factores Este teste n o indica o local de infec o por Chalmydia N o substitui o isolamento por cultura quando dispon vel A aus ncia de anticorpos detect veis no soro n o exclui a possibilidade de infec o por Chlamydia Soros contaminados por bact rias ou hiperlip micos poder o originar resultados err neos Caracter sticas de Desempenho O teste SeroELISA Chlamydia foi comparado com o teste IPAzyme Chlamydia IgG IgA produto da Savyon Diagnostic Ltd Cat logo N 011 01 que um teste serol gico aceite para detec o de anticorpos IgG anti Chlamydia A popula o estudada incluiu pacientes com suspeita de infec o por Chlamydia e indiv duos saud veis n 328 Os resultados est o sumariados da seguinte forma Compara o de SeroELISA e IPAzyme eroElisa Positivo Negativo Total IPAzyme Positivo 116 8 124 Negativo 10 194 204 Total 126 202 328 Concordancia geral 310 328 x 100 94 5 Reaccoes Cruzadas Pac2. Huttunen J K Leiononen M Ekman M R Makela P H and Valtonen V 1988 Serological evidence of an association of a novel Chlamydia TWAR with chronic coronary heart disease and acute myocardial infection Lancet Il 983 986 Sarov l Kleinman D Cevenini R Holcber G Potashnik G Sarov B and Insler V 1986 Specific IgG and IgA Antibodies to Chlamydia trachomatis in Infertle Women Int J Fertil 31 193197 Csango P A Sarov B Schiotz H Sarov l 1988 Comparison Between Cell Culture and Serology for Detecting Chlamydia trachomatis in women seeking abortion J Clin Pathol 41 89 92 Tsunekawa t and Kumamoto Y 1989 A Study of IgA and IgG Titers of C trachomatis in Serum and Prostatic Secretion in Chronic Prostatitis J J A Inf Dis 63 130 137 Kletter Y Caspi D Yarom M Sarov B Sarov I And Tanay A 1988 Serum IgA and IgG Antibodies Specific to Chlamydia in Patients with Reiters Syndrome RS In Proceedings of the European Society for Chlamydia Research Societa Editrice Esculapio Bologna p 170 M111 01P 04 10 13 Obelis s a European Authorized Representative Center Boulevard G n ral Wahis 53 1030 Brussels Belgium Tel 32 2 732 59 54 Fax 32 2 732 60 03 e mail mail obelis net
3. do l quido dos po os lavar cinco vezes e secar como nos passos A 3 5 D Incuba o com Substrato TMB 13 Adicionar 100ul de Substrato TMB em cada po o 14 Cobrir as tiras com a tampa da placa e incubar temperatura ambiente durante 15 minutos 15 Parar a reac o adicionando 100ul de Solu o Stop em cada po o Ao adicionar a solu o stop utilizar a mesma sequ ncia e o mesmo intervalo de tempo utilizados na adi o do Substrato TMB no passo 14 16 Calibrar o espectrofot metro com o po o correspondente ao branco Determinar a absorv ncia a 450 nm e registar os resultados E aconselh vel a determina o imediata da absorv nciamas n o obrigat ria A determina o da absorv ncia n o dever exceder os 30 minutos ap s paragem da reac o cromog nica Valida o do Teste Um teste v lido quando A absorvancia do Controlo Positivo gt 0 8 a 450nm m Absorv ncia do Controlo Positivo Baixo gt 0 4 a 450nm A absorv ncia do Controlo Negativo lt 0 15 a 450nm Se estas condi es n o foram cumpridas o teste decorrido inv lido e dever ser repetido C lculo do Valor de Cut off COV O valor de cut off calculado de acordo com a seguinte f rmula COV 0 154 x Cp Cn Cn Cp Absorv ncia do Controlo Positivo a 450nm Cn Absorv ncia do Controlo Negativo a 450nm Interpreta o dos Resultados Absor
4. o tanto de infec es distais como profundas 7 Descobriu se que t tulos elevados de anticorpo IgG anti Chlamydia s o indicativos de infec o activa 3 8 N veis elevados de anticorpos IgG anti Chlamydia t m um valor de diagn stico em infec es cr nicas ou sist micas tais como salpingites infertilidade mec nica perihepatites epididimites s ndroma de Reiter e pneumonias 3 9 10 A Savyon Diagnostics desenvolveu um imunoensaio ELISA para a detec o de anticorpos IgG espec ficos para a Chlamydia O teste SeroELISA Chlamydia emprega o antig nio serovar Lo da C trachomatis de rec o alargada Detecta anticorpos anti C trachomatis C psittaci e C pneumoniae TWAR Fundamento do teste Introdu o A Chlamydia uma bact ria gram negativa intracelular obrigat ria que provoca doen as agudas e cr nicas tanto em esp cies mamiferas como em aves O g nero Chlamydia compreende quatro esp cies C trachomatis C pneumoniae C psittaci e C pecorum C trachomatis est dividida em 15 serovares 1 Os serovares A B Ba e C s o agentes de tracoma 2 a principal causa de cegueira evit vel end mica nos pa ses do terceiro mundo Os serovares L1 L3 s o agentes de linfogranuloma ven reo Os serovares D K s o a causa mundial mais comum de infec es genitais sexualmente transmiss veis cervicite endometrite salpingite 3 nas mulheres e uretrite 4 tanto nos homens como
5. C 0483 SeroELISA Chlamydia IgG Imunoensaio ligado a uma enzima ELISA para detec o de anticorpos IgG espec ficos contra Chlamydia em soro humano Manual de Instru es Kit de testes para 96 determina es Cat logo N 111 01 Para Diagn stico In Vitro Apenas para uso profissional Armazenar a 2 8 C N o Congelar Savyon Diagnostics Ltd 3 Habosem St Ashdod 77610 ISRAEL Tel 972 8 8562920 Fax 972 8 8523176 E mail support savyondiagnostics com Interesse Cl nico O kit SeroELISA Chlamydia IgG foi concebido para detec o de anticorpos espec ficos contra Chlamydia numa nica amostra de soro humano ou avaliar um par de soros por um imunoensaio ligado a uma enzima ELISA Para diagn stico n Vitro infectadas aquando do nascimento podendo provocar conjuntivites ou pneumonia 5 A C pneumoniae um patog nico respirat rio importante nos humanos e provoca at 10 dos casos de pneumonia adquirida em comunidade Foi associada a doen as respirat rias agudas pneumonia asma bronquite faringite s ndroma pulmonar agudo da drepanocitose doen a coron ria e s ndroma Guillain Barr 6 A C psittaci infecta uma gama de esp cies hospedeiras diversa desde moluscos at aves e mam feros e tamb m provoca pneumonia severa Os testes serol gicos que se baseiam em marcadores imunol gicos espec ficos s o usados como ferramenta n o invasiva de diagn stico para identifica
6. Reagentes Composi o do Kit 1 Microplaca pr revestida 96 po os Cada embalagem cont m uma microplaca constitu da por 12 tiras remov veis colocadas num suporte pl stico Cada tira est revestida com antig nios de Chlamydia 1 Unidade 2 Controlo Positivo soro humano positivo para anticorpos IgG anti Chlamydia Pronto a usar 1 Frasco 2 0ml 3 Controlo Positivo baixo soro humano positivo baixo para anticorpos IgG anti Chlamydia Pronto a usar 1 Frasco 2 0ml M111 01P 04 10 13 Todos os materiais fornecidos dever o ser armazenados 2 8 C Quando mantidos a esta temperatura os reagentes do teste permanecer o est veis at expira o da data de validade indicada na embalagem do kit A exposi o de componentes fechados ou selados na origem temperatura ambiente por algumas horas n o ir provocar danos nos reagentes N O CONGELAR Quando um kit est a uso o material original permanecer est vel durante 60 dias a partir do dia da sua abertura Uma vez aberto a embalagem de alum nio que cont m as tiras dever ser selado com fita cola N o dever ser removido o pacote desidratante Colheita das amostras As amostras de soro dever o ser colhidas assepticamente e armazenadas a 2 8 C com 0 05 de azida s dica NaNs como conservante se forem analisadas dentro de alguns dias Para per odos mais longos al quotas dos soros dever o ser mantidas a 20 C Soros turv
7. ac o enzim tica da peroxidase com o per xido cromog nio reactivo Ap s paragem da reac o enzim tica com uma solu o cida as absorv ncias dos po os s o lidas num espectrofot metro a 450nm e A absorvancia a 450nm indicativa do titulo de IgG anti Chlamydia nas amostras de soros dos pacientes Procedimento 1 Antig nio da Soro positivo para IgG Chlamydia ligado a Anti Chlamydia Ab fase s lida Ag Complexo AgAb 2 Complexo AgAb Conjugado HRP Anti IgG humano Abe Complexo AgAb Ab gt 3 Complexo Substrato TMB AgAb Ab2 v Solu o azul Vo Solu o Stop Solu o amarela Leitura de Absov ncias a 450nm 4 Controlo Negativo soro humano negativo para anticorpos IgG anti Chlamydia Pronto a usar 1 Frasco 2 0ml 5 Conjugado HRP Anti lgG Humano espec fico para a cadeia y Pronto a usar 1 Frasco 10ml 6 Diluente de Soro Pronto a usar 1 Frasco 40ml 7 Tamp o de Lavagem concentrado 20x 1 Frasco 100ml 8 Substrato TMB Pronto a usar 1 Frasco 14ml 9 Solu o Stop H gt SO 1 M Pronto a usar 1 Frasco 15ml 10 Tampa da placa Aviso e Precau es m Aviso OS MATERIAIS ANTIG NICOS DE CHLAMYDIA FORAM INACTIVADOS E N O CONT M ORGANISMOS VIVOS DETECT VEIS NO ENTANTO AS TIRAS DEVEM SER CONSIDERADAS E MANIPULADAS COMO MATERIAL DE LABORAT RIO POTENCIALMENTE PERIGOSO Precau es Este kit cont m soros humanos que foram test
8. ados por t cnicas aprovadas pela FDA e deram resultados negativos para antig nios de HBV e para anticorpos de HCV VIH 1 e VIH2 Uma vez que nenhum m todo oferece seguran a total quanto a n o transmissibilidade de infec es a partir de sangue humano todos os componentes sangu neos fornecidos neste kit devem ser manipulados como soros ou sangue potencialmente infecciosos de acordo com a recomenda es publicadas no manual da CDC NIH Bioseguran a em Laborat rios Microbiol gicos e Biom dicos 1988 A Solu o Substrato Cromog neo um produto que provoca irrita o na pele e membranas mucosas Evitar o contacto directo Para Diagn stico In Vitro 1 Unidade 11 Manual de Instru es 1 Material necess rio mas n o fornecido 1 Tubos de ensaio limpos para dilui o das amostras de soro 2 Micropipetas ajust veis ou pipeta multicanal 5 50 50 200 e 200 10004l e pontas descart veis 3 Pipetas de pl stico descart veis tamanhos sortidos e dispositivos para aspira o 4 Bal o volum trico de um litro 5 Proveta volum trica de 50ml 6 Lavador ELISA ou frasco de lavagem para ELISA 7 Toalhas de papel ou papel absorvente 8 Agitador vortex 9 Banho a 37 C com cobertura ou c mara h mida colocada numa incubadora a 37 1 C 10 Leitor de ELISA com filtro de 450nm 11 Agua destilada ou desionizada para dilui o do Tamp o de Lavagem concentrado Conserva o e Estabilidade dos
9. ientes hospitalizados infectados com Neisseria gonorrhea Staphylococcus aureus e Peptostreptococcus anaerobius cujos diagn sticos foram realizados com kits serologicos tamb m foram testados com o kit SeroELISA Chlamydia N o foram detectadas reac es cruzadas significativas Bibliografia 10 Yuan Y Zhang Y X Watkins N G and Caldwell H D 1989 Nucleotide and Deduced Amino Acid Sequences for the Four Variable Domains of the Major Outer Memebrane Proteins of the 15 Chlamydia trachomatis Serovars Infection and Immunity 57 1040 1049 Copyright 1989 American Society for Microbiology Treharne J D 1985 the community epidemiology of trachoma Rev Infect Dis 7 760 763 Piura B Sarov l Kleinman D Chaim W and Insler V 1985 Serum IgG and IgA antibodies especific for Chlamydia trachomatis in salpingitis patients as determined by immunoperoxidase assay Eur J Epidemiol 1 110 116 Wang S P Grauston J T Kuo C C Alexander E R and Holmes K K 1977 SeroDiagnosis of Chlamydia trachomatis infection with the microimmunofluorescence test In Nongooccocidal urethritis and related infection D Hobson and K K Holmes Eds P American Society for Microbiology Washington DC p 237 248 Thompson Ill S E and Dretler R H 1982 Epidemiology and Treatment of Clamydial Infections in Pregnant Women and Infants Review of Infection Diseases 4 S747 Saikku P Mattila K Nieminen M S
10. itar salpicos i Os soros Controlo Positivo Positivo baixo e Negativo dever o ser testado em simult neo com as amostras de soros todas as vezes que se proceda a um teste j Um po o por teste dever ser usado como valor do branco todas as vezes que se proceda a um teste k Todos os passos do procedimento dever o ser realizados sequencialmente sem interrup es Procedimento do teste Manual Protocolo para automatiza o dispon vel sob requisi o A Lavagem das Tiras E aconselh vel a pr lavagem das tiras mas n o obrigat rio Em qualquer dos casos as tiras dever o ser molhadas com solu o Tamp o de Lavagem e devem ser secas batendo levemente sobre papel absorvente limpo antes da aplica o das amostras a testar Se n o houver uma placa de lavagem de ELISA autom tica dever seguir se o seguinte procedimento 1 Remover o n mero desejado de tiras da sua embalagem de alum nio e inserir no suporte de tiras 2 Fazer uma dilui o a 1 20 do Tamp o de Lavagem concentrado com gua destilada Por exemplo Para uma tira preparar 100ml de Tamp o de Lavagem ml de Tamp o de Lavagem concentrado com 95ml de gua destilada Agitar suavemente durante 20 minutos A solu o Tamp o de Lavagem s dever ser preparada imediatamente antes de usar e o excesso dever ser descartado M111 01P 04 10 13 3 Encher cada po o com solu o Tamp o de Lavagem at ao meio 4 Permitir impregna
11. nas mulheres A endometrite salpingite poder conduzir oclus o tubular aumentando o risco de gravidez extra uterina e de infertilidade A infec o genital poder causar uma infec o aguda e persistente ocasionalmente sem quaisquer sintomas cl nicos Geralmente estas infec es s o trat veis aquando do seu diagn stico No entanto sem qualquer tratamento a infec o poder progredir para uma inflama o cr nica severa conduzindo a infertilidade gravidez ect pica indu o de aborto e parto prematuro Al m do mais crian as de mulheres infectadas podem ser M111 01P 04 10 13 e Osoro humano a ser testado posto em contacto com o material antig nico que reveste os po os da microplaca Os anticorpos espec ficos se presentes no soro do paciente ligar se o ao correspondente antig nio formando um complexo e todos os componentes do soro s o removidos na etapa de lavagem e O conjugado anti IgG humano espec fico da cadeia y marcado com peroxidase de r bano HRP adicionado aos po os da microplaca Se o complexo antig nio anticorpo se formou na etapa anterior o conjugado com peroxidase ir ligar se a meio do anticorpo do complexo Se o complexo antig nio anticorpo n o se formou na etapa anterior o conjugado removido na etapa de lavagem e O substrato TMB adicionado Uma reac o positiva indicada pelo aparecimento de uma cor azul ou azul escuro que se desenvolve nos po os atrav s da re
12. o durante 2 minutos depois remover o conte do da s tira s Repetir este passo cinco vezes 5 Secar o topo das tiras batendo suavemente sobre papel absorvente limpo E essencial a lavagem completa dos po os ap s incuba o para obten o de melhores resultados N o se dever o deixar res duos de Tamp o de Lavagem nos po os B Incuba o das Amostras de Soro e dos Controlos 6 Diluir cada soro do paciente a 1 256 com o Diluente de soro fornecido do seguinte modo 1 16 Adicionar 10 ul de soro do paciente a 150 ul de Diluente de soro 1 256 Adicionar 10 ul da dilui o a 1 16 a 150 ul de Diluente de soro Os controlos s o fornecidos pronto a usar e n o devem ser dilu dos 7 Pipetar 50 ul de Controlo Positivo Positivo baixo e Controlo Negativo prontos a usar e amostras de soro dilu das a 1 256 nos po os correspondentes das tiras de teste Pipetar 50 ul do diluente de soro num po o para valor de branco A pipetagem de controlos e amostras nos po os n o deve exceder 10 minutos 8 Cobrir as tiras com a tampa da placa e incubar durante 30 minutos a 37 C numa c mara h mida 9 Descartar o conte do l quido dos po os Lavar os po os cinco vezes e secar como nos passos A 3 5 C Incuba o com Conjugado 10 Adicionar 50ul de solu o Conjugado HRP Anti lgG Humana a cada po o 11 Cobrir as tiras com a tampa da placa e incubar durante 30 minutos a 37 C numa c mara h mida 12 Remover o conte
13. os ou hemolisados poder o originar resultados menos reprodut veis logo altamente recomend vel que as amostras dos soros a testar sejam l mpidas e n o hemolisadas Procedimento da Analise Notas a Os componentes do kit foram testados como unidade N o misturar componentes de kits de lotes diferentes ou com outros kits do mesmo fabricante b Todos os reagentes devem ser colocados temperatura ambiente antes da sua utiliza o O Diluente do Soro e o Diluente do Conjugado gelificam quando refrigerados Se necess rio acelerar a liquefacgao aquecendo estes componentes a 37 C durante alguns minutos Podem formar se cristais de sal no Tamp o de Lavagem concentrado quando armazenando a 2 8 C estes cristais dever o ser completamente dissolvidos a 37 C antes da dilui o c N o proceder ao teste na presen a de vapores reactivos por exemplo de cidos de subst ncias alcalinas ou de alde dos ou poeira pois a actividade enzim tica do conjugado HRP Anti lgG Humana poder ficar afectada d N o tocar no topo das tiras N o tocar no limite dos po os com as pontas aquando da distribui o dos reagentes e Usar pontas descart veis Evitar contamina o cruzada entre reagentes f Bater levemente o frasco sobre uma superf cie dura para libertar o l quido possivelmente retido na tampa 9 Evitar a forma o de bolhas de ar nos po os h Dispensar os reagentes l quidos lentamente para ev
14. v ncia a Interpreta o T tulo de IgG 450nm dos anti Resultados Chlamidya estimado Inferior a COV 0 03 Negativo lt 256 COV 0 03 Duvidoso 256 Superior a COV 0 03 e inferior ao Controlo Positivo Baixo 256 512 Positivo Baixo Acima do Controlo Positivo Baixo e Positivo 1024 2048 inferior ao Controlo Positivo Acima do Controlo Positivo alto gt 2048 Positivo Repetir as amostras classificadas como duvidosas Se o resultado duvidoso se repetir recomend vel testar uma nova amostra Significado dos resultados A experi ncia clinica e os estudos recentes indicam que n veis elevados de anticorpos IgG para a Chlamydia podem servir como marcador para a infec o activa ou cr nica a Chlamydia Determina o do T tulo final Para monitorizar o perfil de imunidade de um paciente devem se comparar os soros de amostras do estado agudo e convalescente A titula o final do par de soros deve ser executada em conjunto no mesmo ensaio A dilui o de soro mais elevada com uma absorv ncia acima do valor de cut off o t tulo final Limita es do teste N o se dever usar apenas um teste serol gico como crit rio de diagn stico Dever o ser tidos em conta todos os dados cl nicos e laboratoriais E O teste um ensaio ELISA de um s serovar L gt O L gt cont m determinantes antig nicos existentes tanto em serovares de Chlamydia trachomatis como
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