HIV BLOT 2.2 - MP Biomedicals
Contents
1. Po os da bandeja ou controle podem ter passado por contamina o cruzada no local 1 Erro na dilui o da amostra de teste ou do conjugado 2 Amostra de teste incuba o do reagente Fitas defeituosas 1 Apresentam trincas 2 Cont m bolhas que causam o surgimento de manchas brancas em zonas reativas grandes o suficiente para evitar a detec o 3 Apresentam manchas escuras devido ao crescimento de fungos quando os tubos de fitas foram inicialmente abertos Contudo se manchas escuras se desenvolverem depois de um certo tempo ap s a abertura inicial do tudo prov vel que o problema deva se a condi es inadequadas de armazenamento das fitas temperatura inadequada 4 Conjugado contaminado com IgG humana 5 pH incorreto do substrato devido a exposi o a luz UV intensa ou agente redutor 6 Bandejas reagentes ou gua com alta concentra o de fosfato 7 Plataforma rotativa usada em lugar de plataforma oscilante 4 A amostra de teste IgG deteriorou se ou desnaturalizou se devido a m ltiplos ciclos de congelamento e descongelamento ou armazenamento inadequado 5 Plataforma rotativa usada em lugar de plataforma oscilante 6 A amostra de teste pode ser um falso positivo ELISA 11 muito longa 3 Lavagem incompleta durante o teste 4 Temperatura de incuba o maior que 30 C 5 Amositra de teste reativa a prote nas n o virais Banda n tida e discreta na r2. Soros definidos como positivos pelo NEW LAV Blot 2 da Di agnostics Pasteur Dados fornecidos pelos Drs Oliviero E Varnier e Flavia Lillo Laborat rio de Retrov rus Humanos Universidade de G nova Tabela 4 Estudo da especificidade da banda do pept deo do HIV 2 com soros positivos para HIV 1 amostras de soros de doadores normais e soros com outras infec es virais TIPO DE AMOSTRA N MERO REATIVIDADE PARA O PEPT DEO DO HIV 2 aQuando analisadas pelo Western Blot para HIV 2 da MPD 6 destas amostras apresentaram reatividade com ENV e GAG ou POL 9 reagiram apenas com GAG e ou POL e 1 amostra era negativa Um total de 15 pain is comerciais de soroconvers o de HIV 1 foram testados com HIV Blot 2 2 MPD e os resultados mostraram que o HIV Blot 2 2 MPD foi capaz de detectar anticorpos contra HIV antecipadamente ou na mesma amostra em todos os pain is ISEN O DE RESPONSABILIDADE EXPL CITA LIMITADA O fabricante n o oferece nenhuma outra garantia expressa sen o a de que o kit de teste funcionar como um ensaio de diagn stico in vitro dentro das especifica es e limita es descritas neste Manual de Instru es do Produto quando usado em conformidade com as instru es nele contidas O fabricante isenta se de qualquer garantia expressa ou impl cita incluindo as garantias expressas ou impl citas em rela o capacidade de comercializa o de utiliza o ou utilidade impl cita para quai
3. descontamina o eficiente 12 N o recomend vel reutilizar as bandejas de incuba o PRECAU ES ANAL TICAS 1 Para garantir um desempenho perfeito do teste necess rio SEGUIR RISCA os procedimentos descritos neste Manual de Instru es A inobserv ncia destes procedimentos podem acarretar resultados an malos 2 N O MODIFIQUE OU SUBSTITUA REAGENTES DE UM LOTE DE KIT PARA OUTRO Os controles o conjugado e as fitas de Western Blot s o combinadas entre si para oferecer um desempenho perfeito Use somente reagentes fornecidos com o kit 3 N o use componentes do kit ap s a data de validade impressa na caixa do kit 4 Evite a contamina o microbiana dos reagentes ao abrir e retirar al quotas dos frascos originais A contamina o reduz prematuramente a vida til dos kits e fornece resultados err neos Use t cnicas ass pticas como por exemplo pipetas ou ponteiras de pipetas descart veis para retirar al quotas dos frascos 5 Em cada processamento de amostras de pacientes deve se testar os controles do kit em paralelo 6 Use uma ponteira de pipeta nova para cada al quota de amostra para evitar contamina o cruzada 7 Para melhores resultados aplique todos os reagentes enquanto ainda estiverem frios e retorne os ao armazenamento entre 2 C e 8 C o mais depressa poss vel 8 Recomenda se que a vidraria a ser usada com os reagentes seja lavada com cido clor drico 2M e enxaguada abundantem
4. e azul de nitrotetraz lio NBT P PARA BLOTTING Leite desnatado em p Bandejas de incuba o 9 po os cada Manual de Instru esl Pin a processamentos Lave cada fita 3 vezes com 2 ml de SOLU O TAMP O DE LAVAGEM DILUIDA e deixe as imersas durante 5 minutos sobre a plataforma oscilante entre cada lavagem Adicione 2 ml de SOLU O DE CONJUGADO DE TRABALHO a cada po o Cubra a bandeja e incube durante 1 hora temperatura ambiente 25 3 C na plataforma oscilante Aspire o CONJUGADO dos po os Lave como na etapa 8 Adicione 2 ml de SOLU O DE SUBSTRATO em cada po o Cubra a bandeja e incube a durante 15 minutos na plataforma oscilante Nota A rea o pode ser parada antes de 15 minutos se todas as faixas forem vis veis Aspire o SUBSTRATO e enx g e as fitas pelo menos tr s vezes com gua de grau reagente para interromper a rea o a lavagem insuficiente nesta etapa poder provocar o desenvolvimento de um fundo escuro Usando pin a retire cuidadosamente as fitas e coloque as sobre toalhas de papel Cubra com toalhas de papel e seque Alternativamente deixe as fitas secarem nos po os da bandeja Monte as fitas sobre folha de papel branco n o absorvente N o aplique fita adesiva sobre as bandas reveladas Observe as bandas ver Interpreta o de Resultados e interprete os resultados Para armazenamento conserve as fitas em local esc
5. 2 min 1 2 min de Lavagem Solu o Tamp o 2 ml para Blotting Amostra 20 ul 60 min Overnight 16 20 horas Solu o Tamp o 3x2ml 3x5min 3x5 min de Lavagem Conjugado 2ml 60 min 30 min Solu o Tamp o 3x2ml 3x5 min 3x 5min de Lavagem Substrato 2ml 15 min 15 min pronto para uso gua destilada ou menos ou menos 3x2ml 9 Enxugue imediatamente derramamentos de materiais infecciosos com papel absorvente e limpe imediatamente a rea contaminada com solu o de hipoclorito de s dio a 1 antes de continuar o trabalho O hipoclorito de s dio n o deve ser usado em derramamentos contendo cidos a n o ser que a rea seja primeiro enxugada com papel absorvente O material usado inclusive as luvas descart veis deve ser descartado como material biol gico potencialmente perigoso N o esterilize em autoclave material que contenha hipoclorito de s dio 10 Antes do descarte esterilize em autoclave a 121 C e 15 p s i durante 30 minutos todo o material contaminado utilizado Alternativamente descontamine o material em solu o de hipoclorito de s dio a 5 durante 30 60 minutos antes de descartar em sacos para lixo biol gico perigoso 11 Descontamine todos os produtos qu micos e reagentes usados adicionando um volume suficiente de hipoclorito de s dio para obter uma concentra o final de pelo menos 1 Deixe agir durante 30 minutos para garantir uma
6. Western Blot INDETERMINADOS mas adicionalmente testadas como negativas pelo teste do RNA como dificilmente infectadas pelo HIV especialmente quando os indiv duos testados s o conhecidos como n o portadores de fator de risco associados exposi o Em particular as pessoas com resultados Western Blot INDETERMINADOS derivados de um algoritmo de teste usando as quatro gera es ELISAs como teste de triagem principal devem ser adicionalmente testadas para o RNA viral usando um teste com base molecular como o RT PCR com conjuntos principais cobrindo HIV 1 2 0 Se necess rio um follow up deve ser considerado com qualquer teste complementar 1 m s mais tarde O design nico da quarta gera o ELISAs para a detec o simult nea do ant geno e do anticorpo Consequentemente os esp cimes identificados como positivos pela quarta gera o ELISA devem conter um anticorpo ou ant geno ou ambos Embora mais de 95 dos casos de positivos verdadeiros identificados pela quarta gera o ELISA fossem relacionados ao anti HIV e verific veis confirmados pelo Western Blot Ly et al 2000 um teste complementar usando RT PCR pareceu inevit vel para as pequenas por es de reatividade relacionada ao ant geno p24 Novamente pessoas sem qualquer risco de exposi o provavelmente n o s o infectadas pelo HIV se identificadas como positivas pela quarta gera o do ELISA acompanhados pelo Western Blot INDETERMINADO mas os resultados n o
7. a 20 C se for previsto que o teste ser realizado em mais de 7 dias ap s coleta E prefer vel usar amostras l mpidas e n o hemolisadas Amostras lip micas ict ricas ou contaminadas part culas devem ser filtradas 0 45um ou centrifugadas antes do teste PESO GENE ANT GENO DESCRI O MOLECULAR gp 160 ENV Forma polim rica Glicoprote na da gp41 difusa e larga gp 120 ENV Membrana externa Glicoprote na difusa p66 POL Transcriptase Banda discreta Reversa p55 GAG Prote na precursora Banda discreta p51 POL Transcriptase Banda discreta reversa logo abaixo de p55 p39 GAG Fragmento de p55 Banda discreta gp41 ENV Transmembrana Glicoprote na difusa p31 POL Endonuclease Dupla p24 GAG Prote na central Banda larga p17 GAG Prote na central Banda larga Alguns dos ant genos mencionados na tabela acima derivam de uma mesma prote na precursora e podem ter ep topos sobrepostos Isto deve ser considerado quando se interpreta o padr o por exemplo 1 pouco prov vel detectar gp41 na aus ncia de gp160 porque a gp160 a forma polim rica da gp41 e a concentra o de gp160 mais elevada do que a de gp41 no HIV BLOT 2 2 MPD A gp41 aparece como uma banda difusa Qualquer banda n tida e discreta na regi o da gp41 n o deve ser interpretada como uma banda gp41 Muitas amostras normais e n o infectadas pelo HIV apresentam se reativas a este ant ge
8. amostras Incline a bandeja para aspirar a mistura dos po os Troque as ponteiras de aspira o entre as aplica es de amostras para evitar contamina o cruzada 2 minutos 60 minutos conmo CONTROLE N O REATIVO A D gt Soro humano normal inativado n o reativo para ant genos superficiais de hepatite B HBsAg nem para anticorpos contra HIV 1 2 e HCV Cont m azida s dica e tiomersal como conservantes ONTROL CONTROLE REATIVO FORTE Soro humano inativado contendo t tulo elevado de anticorpos contra HIV 1 e HIV 2 e n o reativo para HBsAg nem para anticorpos contra HCV Cont m azida s dica e tiomersal como conservantes contRoL weak CONTROLE REATIVO A FRACO Soro humano inativado que cont m t tulo baixo de anticorpos APENAS contra HIV 1 e n o reativo para HBsAg e anticorpos contra HIV 2 e HCV Cont m azida s dica e timerosal como conservantes BUF src SOLU O TAMP O ESTOQUE CONCENTRADA 10x Solu o tamp o Tris com soro caprino normal inativado pelo calor Cont m timerosal como conservante Eur wasa 2 SOLU O TAMP O DE Consucare LAVAGEM CONCENTRADA 20x Tris com Tween 20 Cont m timerosal como conservante CONJUGADO Anticorpo caprino anti lgG humana conjugado fosfatase alcalina Cont m azida s dica como conservante vesec inet SUBSTRATO Nota Solu o de 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato BCIP
9. 1 separados e incorporados em fitas por procedimentos eletrofor ticos seguidos de eletrotransfer ncia combinados na mesma fita com um pept deo sint tico espec fico do HIV 2 permitem observar melhor as respostas mediadas por anticorpos para prote nas virais espec ficas Cada fita inclui tamb m um controle interno de adi o de amostra para minimizar o risco de falso negativos provocados por erros operacionais e para assegurar a adi o de amostras As amostras dos pacientes podem ser inativadas mas esta n o uma exig ncia para um desempenho timo do teste Inative da seguinte forma 1 Afrouxe as tampas dos recipientes de amostra 2 Aque a a amostra a 56 C durante 30 minutos em banho maria 3 Deixe a amostra esfriar antes de reapertar as tampas 4 A amostra pode ser mantida congelada at o momento da an lise Recomendamos que as amostras dos pacientes n o sejam submetidas a m ltiplos ciclos de congelamento e descongelamento antes das an lises MATERIAIS ADICIONAIS NECESS RIOS MAS N O FORNECIDOS gua deionizada ou destilada Luvas descart veis Plataforma oscilante com velocidade de agita o na faixa de 12 a 16 oscila es por minuto e com capacidade de inclina o entre 5 e 10 para lavagem uniforme das membranas Pipetadores e ponteiras de volumes adequados Sistema de aspira o e conten o em hipoclorito de s dio Banho maria a 56 C opcional Hipoclorit
10. Delhi India MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd 85 Science Park Drive 04 01 The Cavendish Singapore Science Park Singapore 118259 Tel N 65 6775 0008 Fax N 65 6775 4536 E mail enquiry_ap mpbio com Medical Technology Promedt EC REP Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D 66386 St Ingbert Alemanha Tel N 49 68 94 58 1020 Fax N 49 68 94 58 1021 E mail info mt procons com Escrit rios Regionais MP Biomedicals Parc d Innovation BP 50067 67402 ILLKIRCH CEDEX France Tel N 33 388 67 4607 Fax N 33 388 67 5420 E mail custserv eurOmpbio com E U A Patente 5 721 095 O nome e o logotipo Genelabs s o licenciados da Genelabs Technologies Inc Desenvolvimento de manchas escuras nas fitas Desenvolvimento de manchas brancas nas fitas 1 As fitas foram viradas durante o teste 2 Bandejas lavadas inadequadamente antes do uso 3 M dilui o do p para Blotting 4 Interfer ncia eletrotransblot durante a fabrica o 1 Contamina o por bact rias ou fungos da amostra de teste Bandas espera desenvolvem ou apresentam baixa intensidade Verifique o controle positivo das n o se Bandas n o espec ficas desenvolvem se sem indica o de HIV 2 Uma forte a o desenvolve se no fundo da fita quando da aus ncia ou presen a de bandas positivas 1 A amostra est muito forte e reage a rastros de quantidades intermedi
11. ICAS DE DESEMPENHO O desempenho do HIV BLOT 2 2 MPD para a detec o de anticorpos contra HIV 1 ou HIV 2 foi avaliado em estudos cl nicos Tabela 1 Estudo da sensibilidade da reatividade do ant geno viral de HIV 1 com amostras soropositivas para HIV 1 N mero de amostras 197 PERFIL HIV BLOT 2 2 HIV 1 WB SOROL GICO N MERO DUPONT ORTHO N MERO GAG POL e ENV 192 97 5 188 95 4 p24 p31 gp41 elou 187 94 9 179 90 9 gp120 gp160 ENV e GAG ou POL 197 100 0 197 100 0 Tabela 2 Estudo da especificidade da reatividade de ant geno viral de HIV 1 com amostras de doadores normais e soros com outras infec es virais REATIVIDADE PARA HIV 1 INDETERMINADA NEGATIVA TIPO DE N MERO POSITIVOS AMOSTRA Doadores Normais 208 HTLV 1 CMV EBV IgM V zoster IgG Sarampo Rub ola Caxumba Adenov rus HSV Dengue Total 258 p E 2 q MA A Aao a aAa aja aloln alaln alalalo RICO O AIAI AAJA Alo ojojoj0o 0 0 0 0 0 0 0 0 N md 237 Todas exibiam apenas as bandas p24 ou p17 Tabela 3 Estudo da sensibilidade da banda do pept deo do Hiv 2 com amostras soropositivas para HIV 2 N mero de amostras 178 Western Blot HIV 2 Reatividade para o pept deo do HIV 2 Perfil sorol gico Positiva Negativa GAG POL e 2 ENV 160 0 GAG POL e 1 ENV 18 0
12. MP Diagnostics HIV BLOT 2 2 TESTE WESTERN BLOT CE 0123 DATA DE REVIS O 03 07 Observa o altera es MAE 0011 BRA 1 real adas kit de 18 testes 11030 018 kit de 36 testes 11030 036 NOME E APLICA O O MP Diagnostics MPD HIV BLOT 2 2 um imunoensaio qualitativo para a detec o in vitro de anticorpos contra o v rus da imunodefici ncia humana tipo 1 HIV 1 e tipo 2 HIV 2 no soro e plasma humanos Destina se a ser usado como um teste complementar mais espec fico para amostras de soro ou plasma humanos que apresentaram resultados repetidamente reativos por procedimentos de triagem ou rastreamento como os testes imunoenzim ticos ELISA INTRODU O Existem v rios testes de triagem ou rastreamento para a detec o de anticorpos tanto contra o HIV 1 como contra o HIV 2 os agentes etiol gicos da s ndrome da imunodefici ncia adquirida AIDS Esses testes podem ser extremamente sens veis por m menos espec ficos levando a interpreta es falso positivas Por isso s o necess rios testes independentes complementares de especificidade elevada para confirmar a presen a de anticorpos contra o HIV 1 e ou HIV 2 O kit HIV BLOT 2 2 da MP Diagnostics foi concebido para ser usado como teste complementar mais espec fico para amostras de soro ou plasma humanos que apresentaram resultados repetidamente reativos pelo teste de ELISA Ant genos virais espec ficos do HIV
13. MP O DE LAVAGEM DILU DA e deixe as imersas durante 5 minutos sobre a plataforma oscilante entre cada lavagem 9 Adicione 2 ml de SOLU O DE 2ml CONJUGADO DE TRABALHO a cada po o 10 Cubra a bandeja e incube durante 30 minutos temperatura ambiente 25 3 C na plataforma oscilante 11 Aspire o CONJUGADO dos po os Lave 3x2ml como na etapa 8 12 Adicione 2 ml de SOLU O DE 2ml SUBSTRATO em cada po o 13 Cubra a bandeja e incube a durante 15 minutos na plataforma oscilante Nota A rea o pode ser parada antes de 15 minutos se todas as faixas forem vis veis 14 Aspire o SUBSTRATO e enx g e as fitas 3x2ml pelo menos tr s vezes com gua de grau reagente para interromper a rea o a lavagem insuficiente nesta etapa poder provocar o desenvolvimento de um fundo escuro 15 Usando pin a retire cuidadosamente as fitas e coloque as sobre toalhas de papel Cubra com toalhas de papel e seque Alternativamente deixe as fitas secarem nos po os da bandeja 16 Monte as fitas sobre folha de papel branco n o absorvente N o aplique fita adesiva sobre as bandas reveladas Observe as bandas Ver Interpreta o de Resultados e interprete os resultados Para armazenamento conserve as fitas em local escuro 30 minutos 15 minutos RESUMO DOS PROTOCOLOS DO TESTE Temp Amb Temp Amb neagentes Qtde Prova R pida Prova Overnight Fita de nitrocelulose 1 Solu o Tamp o 2 ml 1
14. SA 76 4350 4354 3 J Schupbach M Popovic R V Gilden M A Gonds M G Sarngadharan and C Gallo 1984 Serological Analysis of subgroup of Human T Lymphotropic retroviruses HTLV HI associated with AIDS Science 224 503 505 4 M G Sarngadharan M Popovic L Bruch J Schupbach and R C Gallo 1984 Antibodies reactive with human T Lymphotropic retroviruses HTLV III in the serum of patients with AIDS Science 224 506 608 5 Centre for Disease Control 1985 Provisional public health service inter agency recommendations for screening donated blood and plasma for antibody to the virus causing Acquired Immune Deficiency Syndrome United States Morbidity and Mortality Weekly Report 34 1 1 5 6 Proposed WHO criteria for interpreting results from Western blot assays for HIV 1 HIV 2 and HTLV I HTLV Il 1990 WHO Weekly Epidemiological Record No 37 p282 283 7 F Clavel D Guetard F Brun Vezinet etal 1986 Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS Science 233 343 346 8 F Clavel 1987 HIV 2 the West African AIDS virus AIDS 1 135 140 TABELA PARA SOLU O DE PROBLEMAS 9 R S Tedder A Hughes T Corrah et al 1988 Envelope cross reactivity in Western Blot for HIV 1 and HIV 2 may not indicate dual infection Lancet 11 927 930 10 Bottinger B A Karisson F Andreasson et al 1990 Envelope cross reactivity between Human Immunodeficiency Virus Type 1 and 2 detected by different serologic
15. TIVO FORTE Todas as bandas de peso molecular relevantes devem estar evidentes A Figura 1a fornece um guia das posi es relativas de bandas visualizadas com o HIV BLOT 2 2 MPD e permite a identifica o das bandas observadas com o CONTROLE REATIVO FORTE As bandas observadas s o p17 p24 p31 gp41 p51 p55 p66 gp120 9p160 Outras bandas associadas a ant genos do centro core viral p39 p42 tamb m podem estar vis veis Cuidado para n o interpretar estas bandas erroneamente como gp41 Os ant genos de envolt rio gp41 gp120 gp160 sendo t picas de glicoprote nas aparecem como bandas difusas A banda de soro controle estar vis vel A banda espec fica de HIV 2 tamb m dever estar vis vel como mostrado na Figura ta 3 CONTROLE REATIVO FRACO O controle Reativo Fraco fornece uma medida da sensibilidade do kit Devem aparecer bandas fracas em p24 e ou gp41 e em 9p120 9p160 Bandas fracas adicionais podem ou n o estar presentes A banda de soro controle estar vis vel Fig 1b INTERPRETA O DE RESULTADOS NOTA As fitas reveladas devem estar completamente secas para evitar erros de interpreta o A presen a ou aus ncia de anticorpos contra o HIV 1 na amostra determinada pela compara o de cada fita de nitrocelulose sob teste com as fitas de controle analisadas com os controles N O REATIVO REATIVO FORTE e REATIVO FRACO A Figura 1a apresentada como uma ajuda para a identifica o das
16. V ou POL consulte tamb m DIN 58 969 parte 41 Uma banda ENV com p24 ou p31 Uma banda cada de GAG POL e ENV Duas bandas ENV OU uma ENV com banda P24 Uma banda ENV com qualquer uma das t r s de bandas GAG ou POL Para interpretar o HIV BLOT 2 2 MPD recomendamos aplicar as orienta es Os resultados devem ser registrados para cada banda detectada e interpretados como NEGATIVO POSITIVO ou INDETERMINADO PADR O INTERPRETA O Nenhuma banda viral espec fica presente NEGATIVO Detec o de anticorpos contra p17 NEGATIVO UNICAMENTE e aus ncia total de outras bandas Detec o de 2 ENV HIV 1 POSITIVO gp160 gp41 e gp120 e GAG p17 p24 p55 ou POL p31 p51 p66 Detec o de 2 ENV HIV 1 POSITIVO 9p160 gp41 e 9p120 e GAG com p17 p24 p55 ou POL p31 p51 p66 IND CIOS DE HIV 2 e a banda espec fica de HIV 2 vis vel Quaisquer bandas virais espec ficas INDETERMINADO presentes mas o padr o n o satisfaz os crit rios para POSITIVO Quaisquer bandas virais espec ficas INDETERMINADO presentes mas o padr o n o satisfaz os s com crit rios para POSITIVO e a banda INDICIOS DE HIV 2 espec fica de HIV 2 vis vel a b gp 160 ma gp 120 p66 E p 55 p51 a gp 4 p 39 p17 Controle mm soro HIV 2 a Controle Reativo Forte Reativo para HIV 1 e HIV 2 b Controle Reativo Fraco Reativo soment
17. al methods Correlation between cross neutralization and reactivity against the main neutralizing site J Virol 64 7 3492 3499 11 Centers for Disease Control 2001 Revised Guidelines for HIV Counseling Testing and Referral and Revised Recommendations for HIV Screening of Pregnant Women United States Morbid Mortal Weekly Rep 50 RR 19 12 Fiebig E W D J Wright B D Rawal P E Garrett R T Schumacher L Peddada C Heldebrant R Smith A Conrad S H Kleinman and M P Busch 2003 Dynamics of HIV viremia and antibody seroconversion in plasma donors implications for diagnosis and staging of primary HIV infection AIDS 17 1871 1879 13 Ly T D C Edlinger and A Vabret 2000 Contribution of combined detection assays of p24 antigen and anti human immunodeficiency virus HIV antibodies in diagnosis of primary HIV infection by routine testing J Clin Microbiol 38 2459 2461 14 Sethoe S Y A E Ling E H Sng E H Monteiro R K Chan 1995 PCR as a confirmatory test for human immunodeficiency virus type 1 infection in individuals with indeterminate western blot immunoblot profiles J Clin Microbiol 33 3034 3036 15 Constantine N T and H Zink 2005 HIV testing technologies after two decades of evolution Indian J Med Res 121 519 538 16 World Health Organization 2004 Guidelines for HIV Diagnosis and monitoring of antiretroviral therapy Regional Office for South East Asia New
18. ara uso profissional 3 Solicitamos consultar a documenta o dos produtos para informa es sobre componentes potencialmente perigosos INFORMA ES DE SA DE E SEGURAN A CUIDADO Este kit cont m material de origem humana Nenhum m todo de teste pode oferecer garantia total que os produtos de sangue humano n o transmitam infec es MANUSEIE AS AMOSTRAS ASSIM COMO OS CONTROLES REATIVOS FORTES REATIVOS FRACOS E OS CONTROLES N O REATIVOS COMO AGENTES POTENCIALMENTE INFECCIOSOS Recomenda se que os componentes e as amostras do teste sejam manuseados de acordo com as boas pr ticas de laborat rio O descarte dever ser realizado de acordo com procedimentos de seguran a vigentes O Controle Reativo Forte o Controle Reativo Fraco e o Controle N o Reativo cont m timerosal e azida s dica enquanto a Solu o Tamp o Estoque Concentrada e a Solu o Tamp o de Lavagem Concentrada cont m timerosal e o Conjugado cont m azida s dica A azida s dica pode reagir com o cobre e o chumbo usados em alguns sistemas de canaliza o formando sais explosivos Embora as quantidades usadas neste kit sejam pequenas o descarte de materiais contendo azida deve ser feito por lavagem com volumes relativamente altos de gua de forma a evitar a forma o de azida met lica no sistema de canaliza o As frases de risco R pertinentes s o R22 Nocivo se ingerido O Substrato cont m 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato e azul de nit
19. e m todo suficientemente sens vel para detectar quantidades m nimas de anticorpos espec ficos contra o HIV no soro ou plasma COMPONENTES DO KIT Descri o do Componente Quantidade Fornecida ANTIGEN STRIPS FITAS DE NITROCELULOSE Dispon vel Incorporadas com lisado de em 18 ou Hiv 1 com pept deo 36 fitas espec fico do envolt rio do HIV 2 e com uma banda de controle de adi o de soro Mantenha seco e ao abrigo da luz PROCEDIMENTO DO TESTE PROVA R PIDA Nota a Os usu rios podem usar o assay r pido ou de noite funcionar os testes As faixas do HIV s o mais tornadas e mais faixas podem aparecer com o assay de noite mas o desempenho total dos dois assays o mesmo b Aspire todos os reagentes e produtos qu micos usados para um recipiente de conten o com hipoclorito de s dio c Todas as incuba es devem ser realizadas em plataforma de agita o por oscila o Cuidado Algumas amostras provocam manchas escuras no ponto da fita em que s o aplicadas Para evitar este problema deve se i Aplicar a amostra somente ap s a adi o da SOLU O TAMP O PARA BLOTTING i Inclinar a bandeja ligeiramente elevando a extremidade superior ou inferior da bandeja A Solu o Tamp o para Blotting fluir para a extremidade mais baixa da bandeja Adicione a amostra onde a Solu o Tamp o para Blotting coletada Quando todas as amostras tiverem sido adicio
20. e para HIV 1 Controle N o Reativo Um soro soropositivo para HIV 2 caracter stico eo z0 2INTERPRETA O DOS RESULTADOS PARA INTEDERMINADO Os resultados INDETERMINADOS n o devem ser usados como base para diagn stico da infec o por HIV Com base no fato de que a maioria das pessoas com resultado inicial INDETERMINADO infectadas com HIV 1 desenvolver o anticorpos contra o HIV dentro de 1 m s o CDC dos EUA em 2001 recomendou que tais pessoas sejam novamente testadas para a infec o por HIV 1 gt 1 m s mais tarde As pessoas com resultados INDETERMINADOS cont nuos ap s 1 m s provavelmente n o est o infectadas pelo HIV a menos que haja suspeita de exposi o recente ao HIV Com base em um estudo recente do Fiebig et al 2003 embora a janela para o Western Blot no caso de infec o prim ria por HIV 1 possa demorar mais do que 22 dias a progress o de um blot INTERDERMINADO para um perfil totalmente POSITIVO n o demorou mais do que 8 dias Al m disso este est gio no laborat rio de ter o Western Blot INDETERMINADO sempre foi acompanhado por um RNA detect vel do HIV 1 com casos de infec o verdadeira De modo oposto nenhuma soroconvers o foi evidente nos estudos de follow up dos indiv duos que foram definidos como positivos e os resultados do Western Blot INDETERMINADOS ap s confirmados como negativos pelo m todo PCR Sethoe et al 1995 Entretanto razo vel considerar as pessoas com resultados
21. egi o de gp41 Manchas de gua nas fitas desenvolvidas 1 As fitas secaram ap s a pr imers o e antes da adi o da solu o tamp o para blotting 1 N o gp41 pois gp41 uma banda difusa 2 N o interprete como gp41 3 Existe a possibilidade de ser uma linha celular de prote na p42
22. ente com gua destilada ou deionizada antes do uso 9 Use somente gua de qualidade grau reagente deionizada ou destilada para diluir os reagentes 10 Todos os reagentes devem ser bem misturados antes do uso 11 A solu o de Conjugado de Trabalho a Solu o Tamp o de Lavagem Dilu da e a Solu o Tamp o para Blotting devem ser preparadas logo antes do uso 12 A solu o de Conjugado de Trabalho deve ser preparada usando um recipiente ou b cher de polipropileno QUANTIDADE NECESS RIA DE REAGENTES PARA QUANwTIDADES DIFERENTES DE FITAS N MERO DE FITAS A USAR 3 6 9 15 20 27 36 Solu o Tamp o 60 100 140 240 300 400 520 de Lavagem 1X ml Solu o Tamp o 20 40 60 80 100 120 160 para Blotting 1X ml Conjugado ul 11 17 23 35 45 59 77 Substrato ml 11 17 23 35 45 59 77 P para Blotting g 1 2 3 4 5 6 8 Reagentes CONTROLE DE QUALIDADE Recomenda se processar os controles N o Reativo Reativo Forte e Reativo Fraco junto a cada teste independentemente do n mero de amostras sob an lise Para que todos os resultados obtidos nos testes sejam considerados v lidos as seguintes condi es dever o ser preenchidas 1 CONTROLE N O REATIVO N o se devem observar bandas espec ficas para HIV 1 e HIV 2 nas fitas de controle N o Reativo A banda para o controle de soro deve ser vis vel Fig 1c 2 CONTROLE REA
23. guia 3 Ainterpreta o da fita do teste baseia se pois na detec o de padr es de bandeamento espec ficos conforme as recomenda es das autoridades competentes i e Minist rio da Sa de Organiza o Mundial da Sa de etc As diretrizes espec ficas para a interpreta o podem divergir dependendo de normas locais A MPD recomenda seguir as normas aceitas em conformidade com os regulamentos locais Listado abaixo est o algumas das diretrizes de crit rios recomendados para as diferentes organiza es internacionais CRIT RIOS PARA INTERPRETA O SOROPOSITIVA WESTERN BLOT Qualquer dos dois da p gina 24 gp 41 gp 120 gp 160 bandas ORGANIZA O Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors Centros para Controle de Doen as ASTPHLD CDC 1989 EUA Centre National Transfusion Duas bandas ENV com GAG ou POL Sanguine Organiza o Mundial da Sa de Duas bandas ENV com ou sem GAG WHO 1990 ou POL Consortium for Retrovirus Serology Standardization CRSS 1988 USA Cruz Vermelha Americana ARC 1988 USA Chinese Center for Disease Control and Prevention CCDCP 2004 PRC Centro de Controle e Preven o de Doen a Chin s CCDCP 2004 PRC National and State Reference Laboratories NRL 1987 Australia National and State Reference Laboratories NRL 1987 Austr lia German Association for Control Um ENV com pelo menos uma banda GAG of Viral Diseases DV
24. la Organiza o Mundial da Sa de ou por outras autoridades competentes Sabe se que pessoas que se tornaram soropositivas h pouco tempo podem apresentar padr es incompletos mas desenvolver o crescente reatividade tanto no n mero quanto na intensidade das bandas quando s o acompanhadas por per odos de dois a seis meses A maioria dos blots com resultados POSITIVOS apresentar o outras bandas virais espec ficas Os resultados INDETERMINADOS n o devem ser usados como base para o diagn stico da infec o por HIV 1 E recomendado que todos os blots INDETERMINADOS sejam repetidos usando um esp cime e amostras sequenciais Os doares de sangue com blot INTEDERMINADO devem ser novamente testado usando se um esp cime novo ap s um m s CDC dos EUA 2001 Al m disso sabe se que os anticorpos para p24 e p31 diminuem no decorrer da AIDS para uma mudan a na interpreta o do blot de POSITIVO PARA INDETERMINADO A interpreta o dos resultados deve ent o ser baseada em teste de blot subsequente e avalia es cl nicas em tais situa es Devido sua natureza altamente espec fica a N O REATIVIDADE de amostras com o pept deo espec fico do envolt rio do HIV 2 num blot viral classificado como Indeterminado n o exclui a possibilidade de infec o por outras cepas de HIV 2 As amostras que indicam infec es por HIV 2 devem ser posteriormente analisadas com o Kit de Western Blot para HIV 2 CARACTER STICAS ESPEC F
25. nadas retorne a bandeja posi o horizontal original Certifique se que as fitas mant m se sempre midas durante o procedimento Alternativamente caso n o deseje inclinar a bandeja as amostras podem ser adicionadas na extremidade superior ou inferior do po o Desta forma a leitura da fita n o ser afetada caso tenham se desenvolvido manchas escuras Procedimento 1 Adicione 2 ml de SOLU O TAMP O 2ml DE LAVAGEM DILU DA a cada po o 2 Usando pin a retire cuidadosamente o n mero necess rio de FITAS do tubo e coloque as em cada po o com a face numerada voltada para cima Inclua fitas para controles Reativo Forte Reativo Fraco e N o Reativo 3 Incube as fitas durante 1 e 2 minutos temperatura ambiente 25 3 C sobre uma plataforma oscilante velocidade de 12 a 16 ciclos por minuto Remova a solu o tamp o por aspira o Nota N o permita que as tiras sequem a falha pode resultar em marcas aquosas em tiras desenvolvidas para alguns esp cimes 4 Adicione 2 ml de SOLU O TAMP O 2ml PARA BLOTTING a cada po o 5 Adicione 20 ul de cada soro de paciente 20 ul ou de controle nos po os apropriados Deve se ter cuidado para ter a certeza que as amostras n o s o adicionadas diretamente sobre as fitas 6 Cubra a bandeja com a tampa fornecida e incube durante 1 hora temperatura ambiente 25 3 C na plataforma oscilante 7 Retire cuidadosamente a tampa evitando respingos ou misturar as
26. no que n o pertence ao HIV mas que parece ter origem na linhagem de c lulas humanas utilizadas para cultivar o HIV 2 A banda p55 geralmente detectada quando existe reatividade forte para p24 e ou p17 As bandas visualizadas como p42 e p39 s o ambas fragmentos de GAG e n o devem ser interpretadas como gp41 ENV 3 As bandas POL p66 p51 e p31 s o geralmente detectadas simultaneamente Contudo as sensibilidades de p66 e p31 s o maiores que a de p51 4 A reatividade cruzada do HIV 2 vari vel mas tipicamente exibe reatividade com ant genos GAG e ou POL No entanto em alguns casos pode ocorrer reatividade cruzada com a banda 9p160 mas raramente com a gp41 5 Existe tamb m uma banda de alto peso molecular com aproximadamente 160 kDa que se presume ser uma prote na precursora de GAG POL Isto observado em alguns soros com t tulos elevados para HIV 2 ou indeterminados reativos somente para GAG mas o padr o da banda uma banda discreta diferente da banda difusa da 9p160 do ENV O procedimento de interpreta o envolve as seguintes etapas 1 Confirmar se a banda de soro controle est vis vel Se o controle estiver negativo os resultados dever o ser considerados inv lidos visto que isto indica um erro t cnico tal como n o adi o de amostra conjugado ou substrato 2 Identifica o dos pesos moleculares de todas as bandas da fita de teste usando as fitas de Controle REATIVO FORTE e ou FRACO como
27. o de s dio para descontamina o PREPARA O DOS REAGENTES 1 SOLU O TAMP O DE LAVAGEM DILU DA a A SOLU O TAMP O DE LAVAGEM DILU DA deve ser preparada logo antes do uso b Dilua 1 volume de SOLU O TAMP O DE LAVAGEM CONCENTRADA 20X com 19 volumes de gua grau reagente Misture bem 2 SOLU O TAMP O PARA BLOTTING a A SOLU O TAMP O PARA BLOTTING deve ser preparada logo antes do uso Dilua 1 volume de SOLU O TAMP O ESTOQUE CONCENTRADA 10X com 9 volumes de gua grau reagente Misture bem Adicione 1 g de P PARA BLOTTING a cada 20 ml de SOLU O TAMP O ESTOQUE dilu da preparada na etapa 2 b acima Agite para dissolver completamente o p d Agite novamente antes de aplicar b c 3 SOLU O DE CONJUGADO DE TRABALHO Nota Prepare a solu o num recipiente ou b cher de polipropileno a A SOLU O DE CONJUGADO TRABALHO dever ser preparada logo antes do uso b Prepare a SOLU O DE CONJUGADO DE TRABALHO diluindo o CONJUGADO a 1 1000 em SOLU O TAMP O PARA BLOTTING por exemplo 5 ul de CONJUGADO para 5 ml de SOLU O TAMP O PARA BLOTTING 4 SOLU O DE SUBSTRATO pronta para uso a Distribua diretamente o volume necess rio a partir do frasco Use uma pipeta limpa Feche bem ap s o uso DESCRI O DE S MBOLOS USADOS Os s mbolos gr ficos usados ou encontrados nos produtos e embalagens MP Diagnostics est o indicados a seguir Es
28. o tipo frost free para armazenar reagentes e amostras 20 N o recomendamos o uso de amostras dilu das ou liofilizadas pois podem fornecer resultados falsos Se formarem parte ou a totalidade do painel QC dever ser efetuada a valida o INSTRU ES DE ARMAZENAMENTO 1 Conserve o kit HIV BLOT 2 2 MPD e seus componentes entre 2 C e 8 C quando n o estiverem em uso 2 Todos os reagentes e fitas do teste permanecem est veis at a data de validade fornecida no kit se conservados entre 2 C a 8 C N o congele os reagentes A Fitas com ant geno Evite a exposi o desnecess ria das fitas de ant genos luz B Reagentes Conserve os reagentes em seus recipientes originais e mantenha os tampados ao armazen los Aplique todos os reagentes ainda frios e volte a armazen los entre 2 C e 8 C o mais r pido poss vel Quando o substrato for conservado entre 2 C e 8 C poder o se formar precipitados Isto n o afetar o desempenho do kit Cuidado Evite a exposi o desnecess ria do substrato luz COLETA TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Podem ser usadas amostras de soro ou plasma coletadas em EDTA heparina ou citrato de s dio Antes do armazenamento certifique se que os co gulos e ou as c lulas sang neas foram separadas por centrifuga o As amostras devem ser conservadas entre 2 C e 8 C se o teste for realizado dentro de 7 dias ap s a coleta ou congeladas
29. puderam ser mais adiante apoiados por um resultado POSITIVO usando o teste RNA com os conjuntos principais cobrindo o HIV 1 2 0 Entretanto os testes dos cidos do n cleo NAT para o HIV DNA ou RNA n o foram aprovados para fins de diagn stico pelas autoridades pertinentes CDC dos EUA 2001 Constantine amp Zink 2005 at muito recentemente Hoje somente o ensaio qualitativo do RNA foi aprovado pelo FDA dos EUA para diagn stico dos conjuntos principais e da infec o aguda por HIV 1 Assim os algoritmos de teste recomendados pelo CDC dos EUA 2001 e pelo WHO 2004 ainda est o aguardando atualiza o e o NAT ainda est para ser inclu do como m todo para solucionar os resultados Western Blot INDETERMINADOS N o obstante o CDC dos EUA 2001 reconheceu que quando em consulta com especialistas cl nicos e de laborat rio o NAT pode ser til para determinar o status da infec o entre as pessoas com Western Blot inicial INDETERMINADO FIGURA 1 LIMITA ES DO M TODO A detec o de anticorpos contra HIV 1 n o constitui um diagn stico da s ndrome de imunodefici ncia adquirida AIDS Um BLOT NEGATIVO n o garante aus ncia do agente causador da AIDS Embora um blot POSITIVO para anticorpos contra o HIV 1 indique infec o pelo v rus o diagn stico de AIDS s pode ser feito clinicamente se a pessoa reunir as caracter sticas que definem a AIDS estabelecida pelo Center for Disease Control EUA pe
30. rias 2 Amostra cruzada reage com prote nas H 9 presentes em preparados virais por exemplo HLA ABC DR 3 Bandas legitimadas ant genos de glicosados do envelope foram identificadas a cerca de 80 a 90 kD em algumas amostras de teste 1 Fitas superdesenvolvidas 2 Precipita o de complexos imunes em amostras de teste envelhecidas 3 Contamina o da fita por bact rias ou fungos devido a armazenamento inadequado 4 Fitas danificadas trincadas ou arranhadas fisicamente 5 Fitas lavadas inadequadamente entre as etapas do teste seja causado pelos reagentes 2 Erro na dilui o do conjugado 3 Reagentes inst veis devido a exposi o a Controle positivo baixo prov vel que o problema 1 Os reagentes n o foram preparados devidamente a rea o interrompida antes 2 L m incompleta Controle positivo bom avagem incompleta 1 Soro n o adicionado 2 As fitas foram viradas durante o teste teste 3 Conjugado n o adicionado 4 Substrato n o adicionado prov vel que o problema seja causado pela amostra de 1 Erro na dilui o da amostra de teste 2 Amostra de teste contaminada pelo conjugado 3 As amostras de teste formam complexos imunes severos Aus ncia de banda de controle de soro Outras bandas diferentes das bandas de controle de soro desenvolvem se no controle negativo Bandas n o espec ficas e ou fundo escuro desenvolvem se nas fitas
31. rotetraz lio classificado pelas Diretivas da Comunidade Econ mica Europ ia CEE aplic veis como nocivo Xn As frases de risco R pertinentes s o R20 21 22 Nocivo por inala o em contato com a pele e em caso de ingest o 1 Evite a contamina o microbiana dos reagentes ao abrir e retirar al quotas dos frascos originais 2 N o pipete com a boca 3 Manuseie as amostras de testes as fitas de nitrocelulose e os Controles Reativos Fracos e N o Reativos como agentes potencialmente infecciosos 4 Use vestu rio de laborat rio e luvas descart veis durante a realiza o do teste Descarte as luvas em sacos pl sticos para lixo biol gico perigoso A seguir lave bem as m os 5 altamente recomend vel que este teste seja realizado numa c mara adequada para material biol gico perigoso 6 Mantenha todo o material longe de alimentos e bebidas 7 Em caso de acidente ou contato com os olhos lave imediatamente com gua em abund ncia e procure ajuda m dica 8 Consulte imediatamente um m dico caso ocorra ingest o de materiais contaminados ou contato destes com feridas abertas ou outras solu es de continuidade da pele 7 Retire cuidadosamente a tampa evitando respingos ou misturar as amostras Incline a bandeja para aspirar a mistura dos po os Troque as ponteiras de aspira o entre as aplica es de amostras para evitar contamina o cruzada 8 Lave cada fita 3 vezes com 2 ml de 3x2ml SOLU O TA
32. squer outros fins A responsabilidade do fabricante limita se substitui o do produto ou ao reembolso do pre o de compra do produto O fabricante n o ser considerado respons vel pelo comprador nem por terceiros por quaisquer danos preju zos ou perdas de car ter econ mico causados pelo uso ou aplica o do produto PROBLEMAS T CNICOS QUEIXASPROBLEMAS T CNICOS QUEIXAS Caso haja algum problema t cnico ou queixa solicitamos proceder da seguinte forma 1 Anote o n mero de lote do kit e a data de validade 2 Conserve o kit e os resultados obtidos 3 Contate o escrit rio MP Biomedicals mais pr ximo ou o seu distribuidor local REFER NCIAS POSITIVA NEGATIVA Soropositivo para HIV 1 197 16 181 Doadores Normais 208 0 208 Soropositivo para HTLV 1 CMV EBV IgM V zoster IgG Sarampo Rub ola Caxumba Adenov rus HSV Dengue Total 455 aaan A Aa oaoa anl anja ojojo 0 0 0 0 0 0 0 MU Rj oan an anja md e 439 1 V CW Tsang K Hancock M Wilson D F Palmer S Whaley J S Mc Dougal and S Kennedy March 1985 Developental Procedure Enzyme linked Immunoelectrotransfer Blot technique for HTLV III LAV antibodies CDC Altanta 2 H Towbin T Staehlin and J Gordon 1979 Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci U
33. tes s o os s mbolos mais comuns em dispositivos m dicos e respectivas embalagens Estes s mbolos s o explicados com mais detalhes no British and European Standard BS EN 980 2008 3 Usar at Dispositivo Sin nimos m dico Data de Validade para diagn stico in vitro C digo do lote Sin nimos Nada de N mero do lote cat logo C digo da remessa Aten o Limites de A e temperatura 9 Representante m rabricante EC REP Autorizado na Comunidade E E Europ ia Wy Cont m o suficiente para lt n gt testes Cii Consulte as instru es de uso N o reutilize PRINC PIOS QU MICOS E BIOL GICOS DO PROCEDIMENTO As fitas de nitrocelulose s o incorporadas com prote nas antig nicas separadas e fixadas do HIV 1 parcialmente purificado e inativado por procedimentos de transfer ncia blotting eletrofor tica e nas mesmas fitas incorpora se um pept deo sint tico espec fico do HIV 2 Cada fita de nitrocelulose incubada com soro ou plasma dilu dos e controles Os anticorpos espec ficos contra o HIV 1 e HIV 2 caso estejam presentes nas amostras v o fixar se s prote nas do HIV 1 e ao pept deo do HIV 2 nas fitas As fitas s o lavadas para remover o material n o fixados Os anticorpos que se fixam especificamente s prote nas do HIV podem ser visualizados por uma s rie de rea es que envolvem o uso de anticorpo caprino anti lgG humana conjugado fosfatase alcalina e do substrato BCIP NBT Est
34. uro 1 frasco 80 ul 1 frasco 80 ul 1 frasco 80 ul 1 frasco 20 ml 1 frasco 70 ml 1 frasco 120 ul 1 frasco 100 ml 10 embalagens 1 g cada 2 ou 4 bandejas 1 exemplar 1 par O volume de reagentes fornecido suficiente para 4 3x2ml 2ml 60 minutos 3x2ml 2ml 15 minutos 3x2ml PROCEDIMENTO ALTERNATIVO TESTE OVERNIGHT Procedimento i 2 Adicione 2 ml de SOLU O TAMP O DE LAVAGEM DILU DA a cada po o Usando pin a retire cuidadosamente o n mero necess rio de FITAS do tubo e coloque as em cada po o com a face numerada voltada para cima Inclua fitas para controles Reativo Forte Reativo Fraco e N o Reativo Incube as fitas durante 1 e 2 minutos temperatura ambiente 25 3 C sobre uma plataforma oscilante velocidade de 12 a 16 ciclos por minuto Remova a solu o tamp o por aspira o Nota N o permita que as tiras sequem a falha pode resultar em marcas aquosas em tiras desenvolvidas para alguns esp cimes Adicione 2 ml de SOLU O TAMP O PARA BLOTTING a cada po o Adicione 20 ul de cada soro de paciente ou de controle nos po os apropriados Cubra a bandeja com a tampa fornecida e incube overnight 16 20 horas temperatura ambiente 25 3 C na plataforma oscilante 2ml 2 minutos 2ml 20 ql overnight AVISOS E PRECAU ES 1 Para uso exclusivo em diagn stico in vitro 2 Exclusivamente p
35. v rias bandas reveladas na fita que reagiu com o Controle REATIVO FORTE POR FAVOR NOTE A extremidade numerada das fitas deve ser colocada na parte inferior como mostrado na Figura i e as bandas gp120 9p160 s o as mais afastadas da extremidade numerada 13 N o exponha os reagentes nem realize testes em reas que apresentem altos n veis de vapores de desinfetantes qu micos e g vapores de hipoclorito durante as etapas de armazenamento ou de incuba o O contato inibe a rea o colorida Da mesma forma n o exponha os reagentes luz intensa 14 O teste dever preferencialmente ser realizado temperatura ambiente 25 C 3 C 15 Certifique se que as fitas de teste est o dispostas com os n meros nas fitas voltados para cima 16 Para a prova de Western Blot importante usar um agitador de plataforma oscilante e n o um agitador rotativo Caso contr rio o desempenho do kit ficar comprometido A velocidade e o ngulo de inclina o recomendados para o agitador s o de 12 a 16 ciclos por minuto e 5 a 10 graus respectivamente 17 Se usar equipamento autom tico confira se est aferido antes do uso 18 Certifique se que as amostras s o adicionadas longe da fita A bandeja pode ser agitada e a amostra adicionada no local onde a solu o tamp o for coletada na extremidade inferior Isto evitar a forma o de manchas escuras devido adi o de amostra na fita 19 Evite o uso de congeladores d
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