SeroCP™ IgM - Savyon Diagnostics
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1. CE wuss SeroCP IgM Imuno ensaio Enzimatico ELISA para a detec o de anticorpos IgM espec ficos de Chlamydia pneumoniae no soro humano Manual de Instru es Kit para 96 determina es N mero de cat logo A192 01M Kit para 192 determina es N mero de cat logo B192 01M Para ser utilizado em Diagn stico In Vitro Apenas para uso profissional Conservar a 2 8 C N o congelar Savyon Diagnostics Ltd 3 Habosem St Ashdod 77610 ISRAEL Tel 972 8 8562920 Fax 972 8 8523176 E mail support savyondiagnostics com Uso Indicado O kit SeroCP IgM utilizado para a detec o de anticorpos espec ficos da classe IgM contra Chlamydia pneumoniae no soro humano O kit SeroCP IgM um kit de imunoensaio ELISA qualitativo que utilizado como um auxiliar no diagn stico de infec o causada por Chlamydia pneumoniae Para Diagn stico In Vitro Introdu o Chlamydia pneumoniae TWAR um agente infeccioso que apresenta uma variedade de manifesta es cl nicas incluindo infec es do tracto respirat rio superior e inferior 1 A maioria das infec es causadas por C pneumoniae leve ou assintom tica No entanto ele pode causar doen as graves como a faringite sinusite bronquite aguda e pneumonia adquirida na comunidade Infec es n o detectadas ou n o tratadas podem causar doen as persistentes e prolongadas Dados recentes mostram uma poss vel2. Savyon Diagnostics Ltd Cat No 512 01 O estudo foi efectuado em dois centros m dicos usando 113 amostras de soro de indiv duos sintom ticos 33 e crian as sas 80 mem eel eee Dn a ae etal as os Sensibilidade 30 33 x 100 91 Especificidade 76 80 x 100 95 Concordancia entre ambos os m todos 106 113 x 100 94 Precisao Num mesmo Ensaio R plicas 1 469 0 236 Entre Ensaios No de CV R plicas 0 605 0 163 60 Bibliografia 1 Kuo C C Jackson L A and Grayston J T 1995 Chlamydia pneumoniae TWAR Clin Microbiol REV 8 451 461 2 Saikku P Leinonen M Tenkanen L Linnanmaki E Ekman M R Manninen V Manttari M Frick M H and Huttunen J K 1992 Chronic Chlamydia pneumoniae infection as a risk factor for coronary heart disease in the Helsinki heart study Ann Intern Med 116 273 278 3 Puolakkainen M Saikku P Leinonen M Nurminen M Vaananen P and Makela P H 1984 Chlamydia pnemonitis and its serodiagnosis in infants J Infect Dis 149 598 604 4 Campbell L A 1993 PCR detection of Chlamydia pneumoniae In Diagnostic Molecular Microbiology Principles and Applications Persing D H Smith T F Tenover F C and White T J Eds ASM Press pp 247 252 5 Henry Suchet J Askienazy Elbhar M Thibon M Revol C and Akue B A 1994 Post therapeutic evolution of serum chlamydia antibody titer
3. associa o entre infec es causadas por C pneumoniae e doen as cr nicas 2 A seropreval ncia de C pneumoniae em crian as baixa mas aumenta significativamente para a vida adulta ap s o que se mant m a um n vel elevado gt 50 Dificuldades na recolha da amostra e na inacessibildade das reas infectadas afectam s riamente a utilidade dos m todos de detec o direta Portanto os testes serol gicos s o usados rotineiramente e servem como um m todo n o invasivo para a identifica o de Chlamydia tanto passadas como cr nicas e 3 onde os m todos de detec o directa raramente s o eficazes 4 Al m disso a presen a de certos tipos de anticorpos s o um indicador do estado de doen a A infec o prim ria por Chlamydia caracterizada por uma resposta de IgM predominante nas primeiras 2 4 semanas e uma resposta subsequente de IgG e IgA nas seguintes 6 8 01 12 13 M192 01P semanas Ap s uma infec o aguda a IgM de C pneumoniae desaparece na maioria dos casos ap s 2 6 meses 5 e o t tulo de anticorpo IgG diminui lentamente as IgA tendem a desaparecer rapidamente 6 Quando se suspeita de infec o prim ria de Chlamydia a presen a de anticorpos da subclasse IgM tem um alto valor diagn stico 7 No entanto infec es recorrentes ou infec es cr nicas o n vel de anticorpos IgM baixo e por isso que a aus ncia de IgM n o exclui necessariamente uma infec o em curso Em re infec
4. conjunto com a primeira amostra Se voltar a obter um n vel limite a amostra deve ser considerada negativa Para obter um perfil mais completo de anticorpos IgA e IgG devem ser testados 01 12 13 M192 01P Tabela 2 Interpreta o dos resultados combinados dos n veis de anticorpos IgG IgA e IgM a C Pneumoniae Interpreta o dos resultados Interpreta o dos resultados IgM IgG IgA Negativo Negativo Negativo No h indica o de infec o de C pneumoniae Positivo Negativo Negativo Indicativo de infec o em curso ou ou Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo Indicativo de infec o em curso ou passada Negativo Negativo Positivo Indicativo de infec o em curso ou ou cr nica Positivo Limita es do Procedimento N o use apenas um Unico teste sorol gico para o diagn stico final Devem ser levados em conta todos os dados cl nicos e laboratoriais As amostras recolhidas no in cio de uma infec o prim ria n o cont m quantidades detect veis de anticorpos Se suspeitar de uma infec o por Chlamydia uma segunda amostra deve ser obtida decorridas 2 4 semanas e testada em paralelo com a amostra original Caracter sticas do ensaio Tabela 3 Teste de compara o do ensaio SeroCP IgM com um ensaio microimunofluoresc ncia MIF da mesma origem O kit SeroCPTM IgM foi avaliado em compara o com Chlamydia IgM SeroFIATM
5. o o t tulo de IgG e IgA aumenta rapidamente normalmente em 1 2 semanas 8 Os anticorpos da classe IgA demonstraram ser um marcador imunol gico confi vel de infec es prim rias cr nicas e recorrentes Em geral o t tulo de anticorpos diminui rapidamente para n veis de linha de base uma vez que a infec o por clam dia foi erradicada tratada e 3 a persist ncia de elevado t tulo de anticorpos IgA considerado um indicador de infec o cr nica 6 Anticorpos das subclasses de IgG persistem por longos per odos e diminuem lentamente Portanto a presen a de anticorpos IgG indica principalmente uma infec o por Chlamydia com um tempo indeterminado No entanto um aumento de 4 vezes no n vel de IgG ou IgG de um valor muito alto pode indicar uma infec o cr nica em curso SeroCP um ensaio imunoenzim tico ELISA utilizando como antig nio corpos elementares de purificado de C pnemoniae TWAR 183 para detectar a resposta imunol gica em seres humanos Para um completo diagn stico de infec es em curso cr nicas ou passadas recomendado determinar a presen a de anticorpos IgG IgA e IgM contra C pneumoniae Principio do Teste e As placas SeroCP s o revestidas com corpos elementares de C pnemoniae TWAR 183 purificada como antig nio e Osoro a testar dilu do e incuba se nas placas SeroCP durante 1 hora a 37 C Neste passo os anticorpos contra a C pneumoniae ligam se aos antig nios imobil
6. perfeitamente normal Os cristais s o redissolvido por aquecimento da solu o a 37 C antes da dilui o Uma vez dilu da a solu o pode ser guardada a 2 8 C at 21 dias Colheita de soro O soro deve ser preparado a partir de amostras colhidas de forma ass ptica utilizando t cnicas padr o As amostras que tenham sido inactivadas pelo calor n o devem ser utilizadas N o recomendado o uso de soro lip mico turvo ou contaminado Part culas ou precipitados no soro podem causar resultados errados Estas amostras devem ser clarificadas por centrifuga o ou filtragem antes de submete las a avalia o Conserva o das amostras As amostras podem ser armazenadas entre 2 8 C at 7 dias recomendamos a adi o de 0 1 de azida de s dio Se necessitar armazenamento a longo prazo as amostras devem ser armazenadas a 20 C em al quotas Evite repetir o descongelamento e congelamento 01 12 13 M192 01P Protocolo para automatiza o dispon vel sob requisi o A Prepara o dos reagentes 1 Todos os reagentes e amostras devem estar temperatura ambiente da sala Homogeneizar as amostras e os controlos positivos e negativos antes da utiliza o 2 Determinar o n mero de amostras testadas Al m das amostras em cada ensaio deve ser adicionado dois po os com controlo negativo e um com controlo positivo 3 Remova a microplaca da embalagem de alum nio cortando perto do lado
7. 1 frasco 0 2 ml Substrato TMB Solu o pronta para usar Contendo 8 3 3 5 5 tetrametilbenzidina como cromog nio e peroxidase como substrato 1 frasco 24ml Solu o Stop Solu o de paragem Solu o pronta para usar Contendo H2SO04 1M 1 frasco 30ml Cobertura da placa 2 unidades Instru es de uso 1 Materiais Necess rios mas n o Fornecidos w 11 Agua OO NO Oe Tubos de ensaio limpos para a dilui o do soro do paciente Frascos pl sticos descart veis para a dilui o do concentrado de conjugado HRP Micropipetas ajustaveis ou multicanal varia de 5 50 50 200 200 1000ul e pontas descart veis Reservat rio de precipitados 1 litro Proveta 50 ml 6 Frasco pl stico lavagem Papel absorvente Vortex Banho a 37 C com tampa ou c mara de incuba o h mida a 37 C 10 Leitor de placas de ELISA com um filtro de 450 nm desionizada ou duplamente destilada Precau es Procedimento de Ensaio Manual Para utiliza o em Diagnostico In Vitro 1 Este kit cont m soro humano foi analisada por t cnicas aprovadas pela FDA e CE e descobriram que negativa para o HBsAg e anticorpos para o HCV e HIV 1 e 2 No entanto como n o existe um m todo conhecido que possa oferecer total garantia de que os produtos derivados do sangue humano n o transmitem a infec o todos os componentes do sangue humano previstos nas amostras do k
8. it devem ser tratados como amostras de soro ou sangue potencialmente infecciosos de acordo com as recomenda es publicadas no manual do CDC NIH Biosseguran a em Laborat rios de Micro Biol gicas e Biom dicas Biosseguran a em laborat rios de microbiologia e Biom dica 1988 2 O material de substrato TMB irritante para a pele e membranas mucosas Evite o contacto directo 3 Todos os componentes do kit s o calibrados e testados por lote N o recomendado usar solu es de lotes diferentes uma vez que pode afectar os resultados 4 O cido sulf rico dilu do H2SO 4 1M irritante para a pele e olhos Em caso de contacto com os olhos lave imediatamente com gua e consulte um m dico Conserva o e estabilidade dos reagentes 1 Todos os materiais fornecidos devem ser armazenados a 2 8 C Os reagentes em frascos fechados s o est veis at a data de validade indicada no r tulo Expondo os componentes do kit de rec m abertos temperatura ambiente durante algumas horas n o produz quaisquer danos N O CONGELAR REAGENTES 2 O kit expira 90 dias depois de ter sido aberto 3 Tiras n o utilizadas devem ser conservadas em recipientes fechados na bolsa de folha de embalagem com gel de s lica envolvendo a bolsa ao longo da abertura e selagem com fita adesiva 4 E poss vel que exista forma o de cristais na solu o de concentrado de lavagem 20x devido armazenagem a frio isto
9. izados e Os anticorpos que n o reagiram s o removidos pela lavagem e O anticorpo anti lgM humano conjugado com peroxidase de r bano HRP foi adicionado e incubado 1h a 37 C Neste passo o conjugado de peroxidase liga ao complexo antig nio anticorpo j formado e O conjugado n o ligado removido por lavagem Ap s adi o do substrato TMB h hidrolise pela peroxidase e redu o uma vez que o substrato torna se azul e Ao adicionar a solu o de paragem solu o stop a cor azul fica amarela e deve ser lida num leitor de placas ELISA no comprimento de onda de 450 nm e A absorv ncia proporcional quantidade de anticorpo espec fico ligado ao antig nio imobilizado Procedimento Adicionar 2x50ul de Controlo Negativo e 1x50ul controlo positivos assim como as amostras dilu das 1 105 para os po os revestidos com antig nio C pneumoniae Cobrir a placa e incubar durante 1 ha 37 C com uma humidade de 100 Lavar 3 vezes com a solu o de lavagem 300 350ul Wash Buffer Adicionar 50 ul de conjugado com peroxidase HRP conjugado dilu do 1 300 Cobrir a placa e incubar durante 1 h a 37 C com uma humidade de 100 Lavar 3 vezes com a solu o de lavagem 300 350ul Wash Buffer Adicionar 100 ul de substrato TMB TMB substrato v Cobrir a placa e incubar durante 15 min temperatura ambiente Adicionar 100 ul de solu o de paragem Stop Solution Ler a abso
10. o mais duas vezes para um total de tr s vezes 10 Seque o suporte e tiras tocando em papel de filtro C Aincuba o com conjugado 11 0 conjugado HRP concentrado deve ser dilu do imediatamente antes da utiliza o Diluir o concentra do conjugado anti lgM humana HRP 1 300 com diluente do conjugado Por exemplo para preparar duas tiras prepare um m nimo de 3ml conjugado HRP dilu do 10 ul de conjugado HRP concentrado misturado com 3 ml de Diluente do Conjugado 12 Adicionar 50 ul de conjugado dilu do a cada po o 13 Cobrir as tiras com uma tampa de placa e incubar durante 1 hora a 37 C numa c mara h mida 14 Descartar o l quido e lavar os po os como descrito nas etapas 9 e 10 D Incuba o com TMB substrato 15 Adicione 100yl Substrato TMB em cada po o cubra com tampa de placa e incube temperatura ambiente durante 15 minutos 16 Parar a reac o pela adi o de solu o de paragem a cada po o 100ul H gt SO4 1M E Determinagao dos Resultados 17 Determinar a absorvancia a 450 nm e anotar os resultados A leitura nao deve ser feita apds 30 minutos de paragem da reac o cromog nica Nota Todas as bolhas de ar t m de ser removidas antes da leitura A base da placa ELISA deve ser limpa cuidadosamente Valida o do Ensaio Para que o teste seja v lido deve seguir os seguintes crit rios Se estes crit rios n o forem satisfeitos o teste deve ser conside
11. rado inv lido e deve ser repetido 1 Controlo Positivo A absor o deve ser gt 0 8 a 450 nm 2 Controlo Negativo A absorv ncia m dia do controle negativo NC deve ser de 0 1 lt CN lt 0 4 a 450 nm O c lculo do valor de corte VPC e o ndice de ponto de corte IPC O valor de corte foi calculado de acordo com a f rmula seguinte VPC CN 2 CN Absor o m dia a 450nm dos Controlos Negativos testados em duplicado Para normalizar os resultados obtidos nos diferentes ensaios o ndice de corte calculado de acordo com a seguinte f rmula IPC VPC Absorv ncia a 450nm do soro testado Interpreta o dos Resultados Tabela 1 Correla o entre a absorv ncia a 450 nm e a presen a de anticorpos IgM frente a C pneumoniae Absorv ncia IPC Resultado Interpreta o do 450nm diagn stico Negativo N o h indica o de O D lt 1 4xVPC lt 1 4 Anticorpos IgM infec o actual por n o detectados causa de C pneumoniae 1 4xVPC lt 0 D Limite Indicativo de uma lt 1 4 1 5 Nivel baixo de Poss vel exposi o a 1 5xVPC anticorpos IgM C pneumoniae Uma segunda amostra dever ser submetida a avalia o ap s 2 4 semanasi Positivo Indicativo de infec o O D gt 1 5xVPC gt 1 5 N veis em curso por relevantes de anticorpos IgM C pneumoniae 1 Em caso de resultados duvidosos uma segunda amostra deve ser colhida ap s 2 4 semanas e testada em
12. rvancia a 450 nm Calcular e interpretar os resultados Conte do do Kit Kit para 96 testes 1 10 11 Refer ncia A192 01M Microplaca revestida com antig nio de C pneumoniae 96 po os separ veis 8x12 revestidos com o antig nio de C pneumoniae embalados numa bolsa de alum nio contendo uma placa de gel de s lica 1 Placa Solu o de Lavagem Concentrada 20x Solu o de PBS e Tween 1 frasco 100ml Diluente de Soro lgM vermelho Anti IgG humana em tamp o pronto para uso Cont m menos do que 0 05 de Proclin como conservante 1 frasco 60ml Conjugado Diluente verde Uma solu o tamponada pronta para uso Cont m menos do que 0 05 de Proclin como conservante 1 frasco 40ml Controlo negativo soro humano IgM negativo para C pneumoniae solu o pronta a usar Cont m menos do que 0 05 de Proclin e menos de 0 1 de azida de s dio como conservantes 1 frasco 2 5 ml Controlo positivo soro humano IgM positivo para C pneumoniae solu o pronta a usar Cont m menos do que 0 05 de Proclin e menos de 0 1 de azida de s dio como conservantes 1 frasco 2 0 ml Conjugado HRP concentrado 300X Anticorpo anti lgM humano espec fico cadeia u conjugado com peroxidase de r bano HRP que cont m menos de 0 05 de Proclin como conservante 1 frasco 0 2 ml Substrato TMB Solu o pronta para usar Contendo 8 3 3 5 5 tetrametilbenzidina como cromog nio e peroxida
13. s in women with acute salpingitis and tubal infertility Fertility and Sterility 62 No 3 6 Saikku P Matila K Nieminen M S Huttunen J K Leinon M Eckman M R Makela P H and Valtonen V 1988 Serological Evidence of an Association of a Novel Chlamydia TWAR with Chronic Coronary Heart Disease and Acute Myocardial Infarction Lancet 2 983 986 7 Grayston J T Cambell L A Mordhorst C H Saikku P Thom D and Wang S P 1989 A New Respiratory Pathogen Chlamydia pneumoniae Strain TWAR J Inf Dis 161 618 625 8 Saikku P Leinonen M Tenkanen L Linnanmaki E Ekman M R Mannin V Manttari M Frick M H and Huttunen J K 1992 Chronic Chlamydia pneumoniae Infections as a Risk Factor for Coronary Heart Disease in the Helsinki Heart Study Ann of Int Med 116 273 278 C 0483 Representante Europeu Autorizado Obelis S A Boulevard G n ral Wahis 53 B 1030 Brussels Tel 32 2 732 59 54 Fax 32 2 732 60 03 E mail mail obelis net Tim 32 475 45 46 60 01 12 13 M192 01P
14. se como substrato 1 frasco 14ml Solu o Stop Solu o de paragem Solu o pronta para usar Contendo H2SO04 1M 1 frasco 15ml Cobertura da placa 1 unidade Instru es de uso 1 01 12 13 M192 01P Kit para 192 testes 10 11 Refer ncia B192 01M Microplaca revestida com antig nio de C pneumoniae 96 po os separ veis 8x12 revestidos com o antig nio de C pneumoniae embalados numa bolsa de alum nio contendo uma placa de gel de s lica 2 Placas Solu o de Lavagem Concentrada 20x Solu o de PBS e Tween 2 frascos 100ml Diluente de Soro lgM vermelho Anti IgG humana em tamp o pronto para uso Cont m menos do que 0 05 de Proclin como conservante 2 frascos 60ml Conjugado Diluente verde Uma solu o tamponada pronta para uso Cont m menos do que 0 05 de Proclin como conservante 1 frasco 80ml Controlo negativo soro humano IgM negativo para C pneumoniae solu o pronta a usar Cont m menos do que 0 05 de Proclin e menos de 0 1 de azida de s dio como conservantes 1 frasco 2 4 ml Controlo positivo soro humano IgM positivo para C pneumoniae solu o pronta a usar Cont m menos do que 0 05 de Proclin e menos de 0 1 de azida de s dio como conservantes 1 frasco 1 25 ml Conjugado HRP concentrado 300X Anticorpo anti lgM humano espec fico cadeia u conjugado com peroxidase de r bano HRP que cont m menos de 0 05 de Proclin como conservante
15. selado Remova o n mero de tiras necess rias de acordo com o n mero de amostras de ensaio e coloque na microplaca 4 Diluir a solu o de lavagem concentrada 1 20 com gua bidestilada ou desionizada Por exemplo para preparar um litro de solu o de lavagem adicionar 50 ml de solu o de lavagem concentrada para 950 ml de gua destilada ou duplamente desionizada ado a 950ml de gua destilada ou bi desionizada B A incuba o das amostras e controlos 5 Dilui se cada amostra de soro do paciente 1 105 com diluente de soro fornecido da seguinte maneira Adicionam se 5 ul de soro de um paciente para 520ul de diluente de soro Dilui o em duas etapas Diluir cada amostra de soro do paciente 1 105 com diluente de soro fornecido como se segue adicionar 10 ul de soro de um paciente a 200 ul diluente Soro 1 21 e em seguida diluiu se pela adi o de 25 ul da dilui o 1 21 a 1004 diluente soro Nota O diluente do soro cont m anticorpos anti lgG humano para a remo o de anticorpos IgG a partir de soro humano 6 Adicionar 50 ul a cada po o de controlo positivo de controlo negativo e do soro dilu do a 1 105 O Controlo negativo deve ser adicionado em dois po os separados 7 Cobrir as tiras com uma tampa de placa e incubar durante 1 hora a 37 C numa c mara h mida Descartar o l quido dos po os Lavar Encher completamente cada po o com solu o de lavagem e descarte o l quido repita este pass
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