Modelo de Instruções de Uso – RDC 206
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1. 15 mm BIOMETRIX Especificidade diagn stica amostras negativas A especificidade diagn stica do teste confirmando amostras cl nicas negativas foi verificada analisando amostras celulares que foram negativas para DNA de M pneumoniae e o resultado foi de 96 1 A especificidade diagn stica foi avaliada utilizando como material de refer ncia amostras cl nicas de BAL e BA que eram negativas para DNA de M pneumoniae testadas usando ensaio de amplifica o nested Cada amostra do painel foi empregada para realizar um procedimento completo de an lise extra o e amplifica o com produtos Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados s o referidos na tabela seguinte Amostras N Positivos Negativos Negativas para DNA de M pneumoniae 55 2 50 Duas amostras produziram um resultado positivo conflitante com os produtos Nanogen Advanced Diagnostics S P A Estas amostras foram testadas novamente e produziram um teste positivo A amostra foi analisada quantitativamente e mostraram uma titula o abaixo de 10 gEq rea o o que abaixo do limite de detec o do produto e do sistema de amplifica o nested usada para testar as amostras Amostras podem produzir resultados positivos ao acaso em titula es t o baixas Tr s amostras forneceram resultados inv lidos Vigor efeito da matriz Controle Positivo O vigor do ensaio ou seja o efeito da matriz que leva a r2. As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncias e precau es para componentes espec ficos Os tubos contendo Controle Positivo podem ser congelados e descongelados por no m ximo 12 vezes Um n mero maior de ciclos de 20 congelamento e descongelamento pode causar uma redu o do t tulo O Controle Positivo apresenta as seguintes advert ncias 5 S 23 25 N o inalar vapores Evitar contato com os olhos PROCEDIMENTO O produto Mycoplasma pn Controle Positivo deve ser usado com a mistura de rea o obtida com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER Mycoplasma pn Q CR Alert AmpliMIX e Mycoplasma pn Q PCR Alert AmpliPROBE O Controle Positivo est pronto para o uso portanto deve ser usado adicionando 5 uL diretamente na mistura de rea o O procedimento completo envolve prepara o e execu o de rea o de amplifica o com termociclador com sistema ptico de detec o de fluoresc ncia descrito em detalhes nas instru es de uso do produto Mycoplasma pn Q PCR Alert AmpliMIX bem como informa es sobre as caracter sticas
3. e o quencher como nenhum NFQ Quencher n o fluorescente Consultar a documenta o do instrumento configurar o detector para a sonda da betaglobina com o reporter como VIC e o quencher como nenhum NFQ Quencher n o fluorescente Consultar a documenta o do instrumento para cada po o usado na microplaca configurar os detectores tipo de fluoresc ncia a serem medidas a referencia passiva como ROX normaliza o da fluoresc ncia medida e o tipo da rea o amostra controle negativo de amplifica o controle positivo de amplifica o padr o de quantidade conhecida Adicione estas informa es planilha adicionada no fim deste manual de instru es ou imprima a organiza o da microplaca A planilha deve ser seguida cuidadosamente durante a transfer ncia da rea o de mistura e amostras nos po os ilustra se a seguir a t tulo de exemplo como pode ser organizada a an lise de 11 amostras mm POMETRIX NC NO NO NS reo LAI a A AR AM AR az NV N N N a D y o NK AN_AN ax N AS See Aa AY_AY_AN e Va a o AN NO AN Va N AI B KEAN o L W o P NC S W AN o JAINA S TE NS AS ASAS KAN Na S AWN gt B LA e LA VY o ZIS e TE ZS SJ P AK aA R AA d F XS da d XX ZN AS or AIL AI o ZI AI o Ko Z r vy S AS ASA se JAIN KAHN Ox AN a
4. planilha elaborada Prossiga da mesma forma para as demais amostras de DNA extra das 7 Transferir depositando cuidadosamente no fundo do po o de controle negativo 5 uL de gua ultrapura 8 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo de seu respectivo po o 5 ui de controle positivo conforme posi o definida na planilha elaborada na mistura de rea o 9 Selar a Microplaca de amplifica o com a Lamina adesiva de amplifica o 10 Transferir a placa de amplifica o para o termociclador para tempo real que deve estar em rea espec fica de amplifica o detec o e inicie o ciclo de amplifica o As informa es sobre procedimentos adicionais relevantes para executar a medi o e o tempo na qual ela pode ser realizada N o h outros procedimentos al m dos acima mencionados CALIBRA O DO PROCESSO N o o caso pois n o existe procedimento de calibra o para a metodologia em quest o C LCULOS E OBTEN O DOS RESULTADOS An lise qualitativa dos resultados Os valores de fluoresc ncia emitida pela sonda espec fica para o M pneumoniae FAM e pela sonda espec fica para o Controle interno VIC na rea o de amplifica o devem ser analisados pelo software espec fico Antes de analisar consultar a documenta o do instrumento referindo se documenta o do equipamento programar manualmente o baseline n vel de fundo fluorescente do ciclo 6 ao ciclo 15 Observa o No
5. 2 x 65uL cloridrato EDTA Positivo P RNA total de levedura e Armazenar a 20 C ou inferior 18 mm BIOMETRIX MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Fluxo laminar Luvas descart veis sem talco Microcentr fuga de bancada 12 000 14 000 RPM Micropipetas est reis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo 0 5 10 uL 2 20 uL 5 50 uL 50 200 uL gua bidestilada est ril Real Time ABI PRISM 7000 completo com computador ACESS RIOS Os reagentes para amplifica o e detec o do DNA n o est o inclusas neste produto Para realizar estes passos anal ticos os produtos a seguir s o recomendados e Q PCR Alert AmpliMASTER RT5000 combina o de reagentes otimizados microplacas e adesivos para PCR em tempo real e determina o al lica total de 96 rea es e Mycoplasma pn Q PCR Alert AmpliMIX RT5094 M primers oligonucleot deos para PCR em tempo real total de 96 rea es e Mycoplasma pn Q PCR Alert AmpliPROBE RT5094 P sondas fluorescentes para PCR em tempo real total de 96 rea es ADVERT NCIAS E PRECAU ES Este produto exclusivamente para uso n vitro Advert ncias e precau es gerais Manuseie e descarte todas as amostras biol gicas como potencialmente infecciosas Evite o contato direto com amostras biol gicas Evite respingos Os materiais que entram em contato com amostras biol gicas devem ser tratados com hi
6. caso de uma amostra positiva com um alto t tulo de M pneumoniae a fluoresc ncia FAM da sonda espec fica para M pneumoniae pode come ar a crescer antes do 15 ciclo Neste caso o intervalo de c lculo da baseline deve ser adaptado do ciclo 6 ao ciclo em que a fluoresc ncia FAM come ar a aumentar mm BIOMETRIX programar manualmente o Limiar Thereshold para a fluoresc ncia FAM para 0 2 programar manualmente o Limiar Thereshold para a fluoresc ncia VIC para 0 1 Os valores de fluoresc ncia emitidos para a sonda espec fica para M pneumoniae na rea o do controle positivo e os valores de Ct s o usados para validar a sess o de trabalho como mostrado na tabela seguinte Ct Controle Positivo R X M pneumoniae FAM Resultado Amplifica o Detec o Determinado Positivo Correto Se o Ct do controle positivo indeterminado significa que o DNA alvo n o foi detectado Um problema ocorreu durante a fase de amplifica o ou detec o volume das misturas de rea o incorreto degrada o da sonda degrada o do controle positivo dispensa o incorreta do controle positivo configura o incorreta da posi o do controle positivo configura o incorreta do ciclo t rmico que pode ter levado a resultados incorretos A sess o inv lida e deve ser repetida da fase de amplifica o Os valores de fluoresc ncia emitidos por uma sonda espec fica para M pneumoniae na rea o de a
7. de aus ncia de reatividade cruzada com outros marcadores interferentes potenciais a sensibilidade anal tica do ensaio foi avaliada pela an lise de algumas amostras que eram positivas para DNA de Chlamydophila pneumoniae Legionella pneumophila e Mycoplasma hominis A sensibilidade anal tica do ensaio foi avaliada usando como material de refer ncia amostras que eram certificadamente positivas para DNA de C pneumoniae linhagem CM 1 ATCC VR 1360 vircell SL Espanha e DNA de Legionella pneumophila sorogrupo 1 ATCC 33152 Minerva Biolabs GmbH Alemanha Estes microorganismos causam infec es respirat rias e s o frequentemente encontrados em amostras cl nicas Cada amostra foi usada para realizar o procedimento completo para an lise extra o e amplifica o com os produtos Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados s o mostrados na tabela a seguir Amostras N Positivos Negativos Chlamydophila pneumoniae 1 0 1 Legionella pneumophila 1 0 1 A especificidade anal tica do ensaio foi avaliada usando o material de refer ncia de amostras cl nicas que foram testadas como positivas para DNA de Mycoplasma hominis Cada amostra foi usada para realizar o procedimento completo de an lise extra o e amplifica o com os produtos da Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados s o mostrados na tabela a seguir Amostras N Positivos Negativos Amostras positivas para DNA de M Hominis 5 0 5
8. de performance e limita es do procedimento NOTA O Controle Positivo pode ser congelado e descongelado por no m ximo 12 vezes REFER NCIAS BIBLIOGR FICAS BARBEYRAC B et al 1993 Clin Inf Dis 17 583 589 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrixQbiometrix com br Website www biometrix com br CNP 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia BIOMET Rix CE JJ SS REA A 21 REGISTRO ANVISA 80298490073 RESPONS VEL T CNICA Edna Cristina Kurokawa Guimar es Ferreira CRQ PR 09302336 REVIS ES Revis o Descri o da Altera o Data 01 Revis o geral do texto 05 2011 Altera o da raz o social do fabricante 02 revis o do texto do item 10 resultados 09 2012 altera o do DDG 03 Formata o altera o de Respons vel 01 2013 T cnica BOMETAX 22 WORKSHEET
9. do Controle Interno pode ser ocasionada pela alta efici ncia da rea o de amplifica o do DNA de M pneumoniae Neste caso a amostra adequada e o resultado positivo do teste v lido C lculo do Limite de Detec o Quando um m todo de extra o em particular usado e se referem a uma unidade de medida em particular o limite de detec o pode ser calculado a partir do limite de detec o do produto de acordo com a f rmula seguinte Ve x 10 gEq Limite de detec o gEq extra o Va x Ve mm BIOMETRIX e Fe a efici ncia da extra o expressa em d cimos quando utilizado o Extracell 1 0 100 de efici ncia e Ve o volume total do produto da extra o expresso em uL quando utilizado Extracell o Ve 100 e Va o volume do produto da extra o usado na rea o de amplifica o expresso em uL quando este produto utilizado o par metro de 5 uL Quando o kit Extracell usado o limite Kit de extra o F rmula Simplificada EXTRAcelI Limite de detec o 200 gEq extra o LIMITA ES DO PROCESSO Use somente DNA extra do das seguintes amostras humanas com o produto lavagem broncoalveolar BAL aspirado broncotraqueal BA N o utilizar com este produto o DNA extra do das amostras heparinizadas a heparina inibe a rea o de amplifica o dos cidos nucleicos e causa resultados inv lidos N o utilizar com este produto DNA ex
10. presen a de aproximadamente 10 mol culas de DNA alvo nos 5 uL de DNA extra do e acrescentado rea o de amplifica o Em termos de limite de detec o a sensibilidade anal tica do ensaio foi testada usando um DNA plasm dico contendo o produto de amplifica o cuja concentra o inicial foi medida atrav s de espectrofot metro O DNA plasmidico foi dilu do a uma titula o de 10 c pias 5 uL em DNA humano gen mico a um t tulo de 500 ng 5 uL Esta amostra foi usada em 50 repeti es para realizar a amplifica o com produtos Nanogen Advanced Diagnostics S P A Os resultados finais s o resumidos na tabela seguinte Amostras N Positivos Negativos 10 c pias DNA plasm dico 500ng de DNA gen mico humano 50 50 0 Sensibilidade diagn stica efici ncia de detec o e quantifica o nos diferentes gen tipos subtipos A sensibilidade diagn stica do teste que a efici ncia de detec o e quantifica o nos diversos gen tipos subtipos est avaliada por compara o de sequ ncias com banco de dados de nucleot deos O teste de alinhamento das regi es selecionadas para a hibridiza o do primer de oligonucleot deos AmpliMix e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequ ncias dispon veis no banco de dados do gene que codifica Pl de citoades o de M pneumoniae mostrou preserva o e aus ncia de muta es significativas A sensibilidade diagnostica do ensaio que a efici nci
11. usado com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER e MYCOPLASMA pn Q PCR Alert AmpliMIX para obter a mistura de rea o A AmpliPROBE est pronta para uso sendo assim deve ser adicionado diretamente rea o de mistura O procedimento completo envolve prepara o e execu o de amplifica o em tempo real em uma microplaca com um termociclador em tempo real e descrito em detalhe no manual de instru es com o MYCOPLASMA pn Q PCR Alert AmpliMIX As caracter sticas de desempenho e limita es do procedimento do ensaio completo para detec o e dosagem de DNA M pneumoniae s o descritos em detalhes no manual de instru es com o MYCOPLASMA pn Q PCR Alert AmpliMIX As t cnicas de utiliza o dos reagentes e dos demais componentes do produto descrevendo os volumes utilizados os tempos requeridos em cada etapa ou fase as condi es ambientais bem como os ajustes dos instrumentos de medi o do produto da t cnica ou da rea o Preparo da etapa de amplifica o real time Realizado na rea de amplifica o detec o dos produtos da amplifica o Antes de iniciar a sess o necess rio Consultar a documenta o do equipamento ligar o termociclador para tempo real ligar o computador de controle iniciar software e abrir a sess o absolute quantification Consultar a documenta o do instrumento configurar o detector para a sonda de M pneumoniae com o reporter como FAM
12. Gold DNA Polymerase Non Target Template A TagPolimerase ent o adiciona nucleot deos e remove a sonda TaqMan do DNA gabarito isso separa o quencher do reporter e permite o reporter emitir sua energia isso ent o quantificado usando um computador Quanto mais ocorrer a desnatura o e anelamento mais oportunidades a TaqMan ter de se ligar e em contra partida mais luz emitida ser detectada t y T t O corante do reporter 024 nucleotides liberado da dupla fita de DNA v from TaqMan 4 Tr a criada pela Taq Polimerase Longe do corante quencher a luz emitida 3 do corante reporter dye em estado excitado pode agora ser observada complementary strand template DNA o A padroniza o do sistema foi realizada nos instrumentos da Applied Biosystems ABI PRISM s rie 7000 mm BIOMETRIX COMPONENTES FORNECIDOS Componente Descri o Quantidade Composi o Mycoplasma Q wictura de primers Oligonucleotideos PCR Alert de 4x110 ul TRIS base e cloridrato AmpIM S oligonucleotideos Glicerol Triton X 100 RTS094 M Mistura de sondas Mycoplasma Q fluorescentes Oligonucleot deos PCR Alert marcadas com FAM 4 x 110 uL fluorescentes TRIS AmpliPROBE MGB NFQ base e cloridrato RTS094 P e com VIC MGB Glicerol Triton X 100 NFQ TRIS base e cloridrato Glicerol Mistura de MgCl E reagentes 4x 340 pL Desoriboxinucleotide optimizados Me iritostatos ROX Q PCR Alert Urac
13. S l ee ANA TPD JAN AY Y AY l Ml ASA d G ZIS a S Bi A S ZS Z V FON lt P PPP APP 20000009090900 2690 9 0000 Legenda Al Al4 Amostras para analisar CN Controle negativo de amplifica o CP Controle positivo da amplifica o Consultando a documenta o do equipamento programar no termociclador os par metros do ciclo t rmico e um volume de rea o de 25 uL Para equipamentos Applied Biosystems ABI PRISM M da s rie 7000 escolher a op o 9600 emulation Ciclo t rmico para amplifica o Fase Temperaturas Tempos 45 ciclos Tmin Prepara o da amplifica o Realizado na rea de extra o prepara o da rea o de amplifica o Antes de iniciar necess rio mm BIOMETRIX Retirar e descongelar os tubos contendo as amostras a serem analisadas Centrifugar os tubos para que o material des a para o fundo do tubo e mant los em gelo Retirar e descongelar os tubos de AmpliMiX necess rios para o processo lembrando que o conte do de cada tubo suficiente para preparar 24 rea es Centrifugar os tubos por 5 segundos pulso para que os reagentes des am para o fundo e mant los em gelo Retirar e descongelar um n mero igual de tubos de AmpliPROBE e tubos de AmpliMiX Repita o pulso nesses tubos para que seu conte do des a para o fundo tubo Mant los em gelo Retirar o mesmo numero de tubos de AmpliMASTER quantos os t
14. a 01 Revis o geral do texto 05 2011 Altera o da raz o social do fabricante 02 revis o do texto do item 10 resultados 09 2012 altera o do DDG 03 Formata o altera o de Respons vel 01 2013 T cnica 17 mm POMETRIX CTRO94 Mycoplasma pn Controle Positivo Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto Mycoplasma pn Controle Positivo destinado ao uso como um controle positivo em ensaios qualitativos de amplifica o de cidos nucleicos para a detec o do DNA de Mycoplasma pneumoniae M pneumoniae com os produtos Q PCR Alert AmpliMASTER Mycoplasma pn Q PCR Alert AmpliMIX e Mycoplasma pn Q PCR Alert AmpliPROBE da Nanogen Advanced Diagnostics S P A DESCRI O DO PRODUTO O produto Controle Positivo fornece uma solu o estabilizada de plasm deos contendo a sequ ncia requerida dividida em dois tubos de al quotas prontas para uso Cada tubo teste cont m 65 ui de solu o suficiente para 12 sess es O plasm deo cont m a regi o amplificada do gene que codifica a citoadesina P1 do M pneumoniae detec o do DNA alvo durante a rea o de amplifica o confirma a habilidade de identificar a presen a do DNA do M pneumoniae O kit possibilita a execu o de 25 rea es de amplifica o usando 5 uL por rea o MATERIAIS FORNECIDOS Componente Descri o Quantidade Composi o Plasm deo TRIS Myco pn E base TRIS Controle pane
15. a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez s pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para aquela rea de trabalho As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os produtos de amplifica o devem ser manipulados de modo a limitar ao m ximo a dispers o no ambiente para evitar a possibilidade de contamina es As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplifica o devem ser destinadas exclusivamente para sua rea de trabalho Advert ncias e precau es espec ficas para os componentes Os tubos teste contendo AmpliPROBE s o descart veis e sendo assim devem ser usados apenas uma vez na prepara o da mistura de rea o A AmpliPROBE possui os seguintes avisos de seguran a 5 S 23 25 N o aspire g s fuma a vapor spray Evite o contato com os olhos mm BIOMETRIX CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOL GICA Este produto deve ser usado com DNA extra do das seguintes amostras biol gicas lavado broncoalveolar BAL e aspirado broncotraqueal BA As amostras de lavado broncoalveolar e aspirado broncotraqueal que ser o usadas para extra o de DNA devem ser co
16. a de detec o de diferentes gen tipos subtipos foi avaliada pela an lise de algumas amostras que eram positivas para M pneumoniae A sensibilidade diagn stica do ensaio foi testada usando como material de refer ncia amostras certificadamente positivas para DNA de M pneumoniae linhagem FH ATCC 15531 Vircell SL Espanha de M pneumoniae NCTC 010119 Minerva Biolabs GmbH Alemanha e M pneumoniae de uma amostra clinica Cada amostra foi usada para realizar a amplifica o com produtos Nanogen Advanced Diagnostics Os resultados sao mostrados na tabela a seguir 14 mm BIOMETRIX Amostras N Positivos Negativos M pneumoniae linhagem FH 1 1 0 M pneumoniae NCTC 010119 1 1 0 M pneumoniae de amostra cl nica 1 1 0 Sensibilidade Anal tica marcadores potencialmente interferentes Em termos de aus ncia de reatividade cruzada com interfer ncia de outros marcadores potencialmente interferentes a especificidade anal tica foi avaliada por compara o das sequ ncias com nucleot deos de base de dados O teste de alinhamento das regi es escolhidas para hibridiza o com oligonucleotideos primer AMpliMIX e as sondas fluorescentes AmpliPROBE com as sequ ncias dispon veis na base de dados de organismos outros que de M pneumoniae incluindo o genoma completo de Chlamydophila pneumoniae e de Legionella pneumophila demonstrou a especificidade e aus ncia de homologias significativas Em termos
17. dentes de diferentes lotes N o utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes m SOME TA 4 m mm BIOMETRIX Advert ncias e precau es para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para evitar o risco de resultados incorretos em particular por causa da degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou da contamina o das amostras por parte de produtos de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EP adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso s pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem
18. essoas Este produto requer roupa de trabalho EPi e rea de trabalho adequadas manipula o de amostras biol gicas potencialmente infecciosas e de reagentes classificados como perigosos para evitar 12 mm BIOMETRIX incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o usu rio ou outras pessoas Este produto requer pessoal instru do para t cnicas de biologia molecular como extra o amplifica o e detec o de cidos nucleicos para evitar resultados incorretos necess rio possuir reas separadas para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o de produtos de amplifica o para prevenir resultados falsos positivos Este produto requer o uso de roupas de trabalho EPI e instrumentos destinados extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o para evitar resultados falsos positivos Um resultado negativo obtido com este produto indica que o DNA de M pneumoniae n o foi detectado no DNA extra do da amostra mas ele pode a amostra pode conter DNA de M pneumoniae a uma titula o inferior ao limite de detec o do produto veja cap tulo Caracter sticas de Desempenho neste caso o resultado ser um falso negativo Como para qualquer outro dispositivo diagn stico os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados cl nicos e os outros exa
19. esultados falso negativos foi testado pela an lise um painel de extratos de amostras clinicas positivas para DNA de M pneumoniae a uma alta titula o pr xima ao limite de detec o O efeito da matriz foi testada usando como material de refer ncia amostras de DNA extra dos de BAL e BA negativos para Dna de M pneumoniae testados usando um ensaio de amplifica o nested e tornados positivos com DNA plasmatico diluido a uma titula o de 30 copias 5 uL 3 vezes o limite de detec o Estas amostras foram usadas para realizar a amplifica o com produtos Nanogen Advanced tecnologies S P A Os resultados s o mostrados na tabela abaixo Amostras N Positivos Negativos Extratos tornados positivos para DNA M 50 50 0 pneumoniae REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS BARBEYRAC B et al 1993 Clin Inf Dis 17 583 589 16 IDENTIFICA O DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagn stica Ltda Estrada da Graciosa 1081 Curitiba PR CEP 82840 360 Tel 41 2108 5250 Fax 41 2108 5252 DDG 0800 7260504 E mail biometrix biometrix com br Website www biometrix com br CNP 06 145 976 0001 39 INFORMA ES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S P A C so Torino 89 d 10090 Buttigliera Alta TO It lia REGISTRO ANVISA 80298490072 RESPONSAVEL TECNICA Edna Cristina Kurokawa Guimaraes Ferreira CRQ PR 09302336 REVISOES Revisao Descri o da Altera o Dat
20. il N glicosilase AmpliMASTER Taq DNA polimerase RTS000 hot start Microplaca com 96 pocinhos de 0 2 3 Pl stico PP mil camina adesiva 3 Pl stico e cola vedante MATERIAIS NECESS RIOS E N O FORNECIDOS Equipamentos necess rios mas n o fornecidos Capela de fluxo laminar Agitador tipo Vortex Microcentr fuga de mesa 12 000 14 000 RPM Micropipetas simples volume vari vel Real Time ABI PRISM 7000 completo com microcomputador Material de Consumo EPI Ponteiras com filtro gua ultrapura Tubos de microcentrifuga o 1 5 mL a 2 0 mL Amostras DNA extra do por metodologia definida pelo usu rio seguindo as normas e padr es de amostras exigidos na descri o abaixo 7 2 tz m o CONDI ES DE ARMAZENAMENTO Refer ncia 7 Componente modelc Quantidade Estocagem Mycoplasma Q PCR Alert E as AmpIiMIX RT5094 M 4 x 110 uL 20 C Mycoplasma Q PCR Alert E AmpliPROBE RT5094 P 4 x 110 uL 20 C Q PCR Alert AmpliMASTER 4x 340 uL 2 8 C ia R Temp Microplaca para amplifica o RTS000 3 Ambhente L mina adesiva para Temp ma Aaa 3 amplifica o Ambiente PRECAU ES Este kit reservado para uso exclusivo em diagn stico n vitro Manuseio necess rio ao manusear o kit e as amostras com EPI adequado ao tipo de laborat rio onde os testes ser o realizados devido natureza da amostra material biol gico humano Tratar c
21. lhidas de acordo com as dire es do laborat rio em solu o fisiol gica est ril transportadas a 2 C 8 C e armazenadas a 2 C 8 C por no m ximo tr s dias N o congele lavado broncoalveolar e aspirado broncotraqueal para evitar lise celular e perda na titula o do DNA bacteriano instru es para pr tratamento das amostras clinicas se aplic veis e para a extra o de DNA est o no manual de instru o do EXTRAcell A amostra deve ser tratada como potencialmente infecciosa O DNA extra do da amostra inicial n o deve conter heparina ou hemoglobina para evitar o problema de inibi o da amplifica o e a possibilidade de frequentes resultados n o v lidos N o h dados dispon veis pertinentes a inibi o causada por drogas antivirais antibi ticos quimioter picos ou imunossupressores As influ ncias pr anal ticas tais como anticoagulantes luminosidade temperatura ou umidade bem como outras influ ncias f sicas qu micas ou biol gicas j foram descritas acima nos demais cuidados com a amostra PROCESSO DE MEDI O prepara o da medi o com todas as opera es necess rias utiliza o correta do produto incluindo as instru es adequadas para reconstitui o mistura dilui o ou outra forma de preparo dos reagentes de trabalho bem como cita o das especifica es do diluente a ser utilizado O produto MYCOPLASMA pn Q PCR AlertPROBE deve ser
22. mes de laborat rio relativos ao paciente Como para qualquer outro dispositivo diagn stico existe um risco latente de obter resultados n o v lidos falsos positivos e falsos negativos com este produto Este risco residual n o pode ser eliminado ou reduzido Em situa es particulares como diagn sticos de urg ncia o risco residual pode contribuir a decis es incorretas com consequ ncias graves para o paciente CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE absolutamente necess rio confirmar cada sess o de amplifica o com rea o de controle negativo e uma rea o de controle positivo Para o controle negativo utilize gua bidestilada est ril n o fornecida com o produto adicionada rea o no lugar do DNA extra do da amostra Para o controle positivo utilize o produto MYCOPLASMA pn Positive Control Controles de Qualidade recomendado validar todo o procedimento de an lise para cada sess o de extra o e amplifica o pelo processamento de uma amostra negativa e uma positiva que j foram testadas ou material de calibra o de refer ncia 13 mm BIOMETRIX VALORES DE REFER NCIA OBTIDOS EM POPULA ES SADIAS OU VALORES DEMOGR FICOS EPIDEMIOL GICOS ESTAT STICOS DESEJ VEIS TERAP UTICOS OU T XICOS N o existe este tipo de dado para a metodologia em quest o CARACTER STICAS DE DESEMPENHO Sensibilidade Anal tica limite de detec o A sensibilidade anal tica deste teste permite identificar a
23. mm BIOMETRIX RTS094 Mycoplasma pn Q PCR Alert Kit Instru es de Uso USO PRETENDIDO O produto MYCOPLASMA pn Q PCR Alert AmpliPROBE parte de um ensaio quantitativo de amplifica o de cidos nucleicos para detec o de DNA de Mycoplasma pneumoniae M pneumoniae em amostras de DNA extra das de saliva lavagem broncoalveolar BAL e aspirado broncotraqueal O produto deve ser usado com dados cl nicos e outros testes laboratoriais na diagnose e monitoramento de infec es de M pneumoniae O produto fornece a mistura de sondas fluorescentes AmpliPROBE para amplifica o em tempo real em uma solu o estabilizada pr dosada em al quotas em quatro tubos teste descart veis Cada tubo teste cont m 110uL de solu o suficiente para 24 rea es A sonda M peneumoniae marcada com o fluor foro FAM e bloqueada pelo grupo MGB NFQ espec fica para a regi o do gene que codifica citoades o P1 de M pneumoniae A sonda para adequa o do teste interno da amostra marcada com o fluor foro VIC e bloqueada pelo grupo MGB NFQ espec fico para a regi o promotora e 5 UTR do gene da betaglobina humana O procedimento envolve uma rea o de amplifica o em tempo real em um termociclador para tempo real A padroniza o do sistema foi realizada na Applied Biosystems ABI PRISM 7000 series instruments O produto fornece 96 determina es incluindo padr es e controles PRINC PIO DE A O E REA O O
24. mplifica o do controle negativo e o valor de Threshold s o usados para validar a amplifica o e detec o como mostrado na tabela seguinte Ct Controle Negativo P F 3 M pneumoniae FAM Resultado Amplifica o Detec o indeterminado Negativo Correto Se o resultado da rea o de amplifica o do Controle negativo diferente de indeterminado a presen a do DNA alvo foi detectada isso significa que problemas ocorreram na fase de amplifica o contamina o que podem ter levado a resultados incorretos e falso positivos sess o n o v lida e deve ser repetida a partir da fase de amplifica o Os valores de fluoresc ncia emitidos pelas sondas nas rea es de amplifica o de cada amostra e o valor Threshold s o utilizados para detectar a presen a do DNA alvo e para validar a amplifica o e a detec o atrav s pela determina o do Ciclo Threshold Ct o ciclo no qual o valor Limiar de fluoresc ncia foi alcan ado Os resultados do Ct para cada amostra s o interpretados conforme mostrado na tabela 10 mm POMETRIX Ct da Amostra a M M pneumoniae Controle edicao ae eau tae pice pneumoniae 3 da Amostra Analise FAM Interno VIC DNA Ct gt 35 ou a Ct Mao inv lida ct Adequada E indeterminado indeterminado ar x Ct lt s 35 Adequada valida NAG 7 Negativa DETECTADO Ct gt 35 ou V lida Ct Adequada Positiva PRESENTE Ct Determinado indeterminad
25. o Ct lt 35 Adequada valida PRESENTE Positiva Se o resultado da rea o de amplifica o da amostra Ct indeterminado para M pneumoniae e Ct gt 35 ou indeterminado para o controle interno isto significa que o DNA do Controle Interno n o foi detectado de forma eficiente Neste caso problemas ocorreram durante a fase de amplifica o amplifica o inv lida ou ineficiente ou na fase de extra o aus ncia de DNA ou presen a de inibidores os quais podem causar resultados falsos negativos A amostra n o adequada o ensaio inv lido e precisa ser repetido come ando pela extra o de uma nova amostra Se o resultado da rea o de amplifica o de uma amostra Ct indeterminado para M pneumoniae e Ct s 35 para o Controle interno isto significa que o DNA M pneumoniae n o foi detectado no DNA obtido a partir da amostra mas n o poss vel excluir a presen a de DNA em t tulo menor que o limite de detec o do produto verificar Caracter sticas de Desempenho Neste caso o resultado seria um falso negativo Os resultados obtidos com este ensaio devem ser interpretados levando em considera o todos os dados cl nicos e os outros testes laboratoriais efetuados no paciente Obs quando DNA M pneumoniae detectado na rea o de amplifica o da amostra a amplifica o do Controle Interno pode resultar em Ct gt 35 ou indeterminado De fato a baixa efici ncia da rea o de amplifica o
26. omo potencialmente infecciosos por ser a amostra de origem humana N o beba ou coma na rea de trabalho A rea de trabalho deve ser ambiente limpo e com ventila o adequada Deve se trabalhar dentro de capela de exaust o fluxo laminar N o manuseie o kit sem luvas Advert ncias e precau es gerais Manipular e eliminar todas as amostras biol gicas reagentes e materiais usados como se fossem agentes infecciosos Evitar o contato direto com as amostras biol gicas Evitar a forma o de aerosol durante o procedimento evite respingar material ao redor da rea de trabalho ou fora dela O material que est em contato com as amostras biol gicas deve ser tratado com Hipoclorito de s dio a 3 pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121 C durante uma hora antes de ser eliminado O material descart vel combust vel deve ser incinerado Os res duos l quidos que cont m cidos ou bases devem ser neutralizados antes da elimina o N o pipetar nenhuma solu o com a boca Lavar bem as m os depois de haver manipulado as amostras e os reagentes Eliminar reagentes e res duos conforme as normas vigentes Ler todas as instru es fornecidas no kit antes de realizar o teste Respeitar s instru es fornecidas no kit durante a execu o do teste Respeitar a data de validade do kit Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante N o intercambiar reagentes proce
27. os de amplifica o necess rio dispor de uma rea separada para a extra o prepara o das rea es de amplifica o e para a amplifica o detec o dos produtos de amplifica o reas de pr e p s PCR Nunca introduzir um produto de amplifica o na rea de extra o prepara o das rea es de amplifica o necess rio uso de EP adequado a cada uma das reas de trabalho em laborat rio de biologia molecular Nunca transfira materiais da rea de amplifica o detec o para a rea de extra o prepara o de rea es As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de an lise As amostras devem ser manipuladas em uma c mara de fluxo laminar Os tubos que cont m amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo s pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso s pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou serem usadas com ponteiras com barreira filtro As ponteiras utilizadas devem ser est reis sem a presen a de DNAse e RNAse sem a presen a de DNA e RNA Os reagentes devem ser manipulados em c mara de fluxo laminar Os reagentes necess rios para a amplifica o devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma nica vez s pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a este prop sito As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira filtro
28. poclorito de s dio 3 por no m nimo 30 minutos ou autoclavados a 121 C por uma hora antes de serem descartados Manuseie e descarte todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos Evite contato direto com reagentes Evite respingos Os res duos devem ser tratados e descartados de acordo com normas de seguran a Res duos l quidos contendo cidos ou bases devem ser neutralizados antes do descarte Use jaleco luvas e culos de prote o Nunca pipete solu es com a boca N o coma beba fume ou aplique cosm ticos dentro da rea de trabalho Lave as m os cuidadosamente ap s manusear amostras e reagentes Descarte as sobras de reagentes e res duos de acordo com as normas 19 mm BIOMETRIX de seguran a Leia as instru es de uso antes de utilizar o produto Siga as instru es N o use produtos ap s o prazo de validade estabelecido Somente use os reagentes fornecidos no kit e aqueles recomendados pelo fabricante N o misture reagentes de diferentes lotes N o utilize reagentes de outros fabricantes Advert ncias e precau es de biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular como a extra o a transcri o reversa a amplifica o e a detec o de cidos nucleicos requerem pessoal especializado para prevenir o risco de resultados incorretos em particular devido degrada o dos cidos nucleicos das amostras ou devido contamina o das amostras por produt
29. procedimento envolve uma rea o de amplifica o em Tempo Real em microplaca em um equipamento com termostato program vel fornecido com sistema ptico de detec o fluorescente RT PCR termociclador em tempo real Em cada po o uma rea o de amplifica o realizada para uma regi o do gene que codifica P1 de citoades o de M pneumoniae e para a regi o do gene de betaglobina humana teste de adequa o interna da amostra usando o DNA extra do da amostra a ser testada Uma sonda espec fica para M pneumoniae marcada com o fluor foro FAM ativada quando hibridizada com o produto espec fico da rea o de amplifica o M pneumoniae Outra sonda espec fica para o gene da beta globina marcada com o fluor foro VIC ativado quando hibridizado com o produto da rea o BIOMETAIX de amplifica o para o gene da beta globina humana A emiss o de fluoresc ncia aumenta medida que os produtos espec ficos da rea o de amplifica o aumentam e medida e gravada no equipamento O processamento dos dados determina a presen a e a titula o do DNA de M pneumoniae na amostra inicial A partir do momento que a sonda TaqMan for ligada parte espec fica do gabarito de DNA depois da desnatura o alta temperatura e resfriamento da rea o os primers anelam se ao DNA Assay Chemistry Summary Forward Primer mm Quencher Reporter Target Template UGB Minor Grove Binder AmpliTaq
30. tra do contaminado com hemoglobina Esta subst ncia inibe a rea o de amplifica o dos cidos nucleicos podendo causar resultados inv lidos N o est o dispon veis dados pertinentes a eventuais fen menos de inibi o por parte dos medicamentos antivirais quimioter picos ou imunossupressores Os resultados obtidos com este produto dependem da correta coleta transporte armazenamento e prepara o das amostras para evitar resultados incorretos necess rio portanto ter particular aten o durante estas fases e seguir atentamente as instru es fornecidas com os produtos para a extra o dos cidos nucleicos Devido a sua alta sensibilidade anal tica o m todo de amplifica o em tempo real dos cidos nucleicos utilizados neste produto est sujeito a contamina o por amostras cl nicas positivas para DNA de M pneumoniae controles positivos e at mesmo produtos da rea o de amplifica o As contamina es levam a resultados falsos positivos O produto foi desenvolvido de forma a limitar as contamina es mesmo assim estes fen menos podem ser evitados somente com uma boa pr tica de laborat rio e seguindo escrupulosamente as instru es fornecidas nestas instru es Este produto requer pessoal instru do no processamento de amostras biol gicas potencialmente infecciosas e prepara es qu micas classificadas como para evitar incidentes com consequ ncias potencialmente graves para o usu rio ou outras p
31. ubos de AmpliMIX Escreva MYCO pn e a data no tubo com caneta de tinta permanente D um pulso nos tubos para que os reagentes depois de descongelados des am para o fundo Manter em gelo Retirar e descongelar os tubos de controle positivo Pulsar os tubos para que os reagentes depois de descongelados des am para o fundo Mantenha em gelo Se necess rio corte a placa de amplifica o para separar a parte que ser utilizada no ensaio tomando o devido cuidado de manipul la com luvas sem talco e de n o causar danos aos po os Transferir 100 uL de AmpliMIX no tubo de AmpliMASTER Misturar bem e pipetar tr s vezes o volume de 100 uL na mistura Transferir 100 ui de AmpliPROBE no tubo de AmpliMASTER Misturar bem e pipetar tr s vezes o volume de 100 uL na mistura Misturar em Vortex em baixa velocidade por 5 segundos evitando forma o de espuma Centrifugar os tubos por 5 segundos pulso para que todo l quido v para o fundo Transferir 20 uL da mistura de rea o obtida para o fundo de cada po o na placa de amplifica o conforme estabelecido na planilha 8 NOTA Caso n o seja utilizada toda a mistura de rea o armazene no escuro a 20 C por no m ximo um m s em um tubo rotulado como MYCO pn Congele e descongele a mistura de rea o somente uma vez 6 Transferir depositando os cuidadosamente no fundo de seu respectivo po o 5 uL de DNA extra do conforme posi o definida na
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