HTLV BLOT 2.4 - MP Biomedicals
Contents
1. MP Diagnostics HTLV BLOT 2 4 TESTE WESTERN BLOT CE 0123 DATA DE REVIS O 05 05 Observa o altera es MAK 0011 BRA 0 real adas kit de 18 testes 11080 018 kit de 36 testes 11080 036 NOME E APLICA O O BLOT HTLV 2 4 da MP Diagnostics MPD um teste imunoenzim tico qualitativo para a detec o in vitro de anticorpos para HTLV I e HTLV II no soro ou plasma humano Destina se a ser usado como um teste complementar mais espec fico para amostras de soro ou plasma humano que apresentaram resultados repetidamente reativos por procedimentos de triagem ou rastreio como os testes imunoenzim ticos ELISA INTRODU O Estudos epidemiol gicos recentes nos Estados Unidos e Europa confirmaram a ocorr ncia de preval ncia mista de HTLV I e HTLV Il em diferentes popula es de alto risco como em usu rios de drogas intravenosas Existem v rios testes de triagem para HTLV I II dispon veis As amostras repetidamente positivas nos testes de triagem exigem provas adicionais e mais espec ficas para confirmar a soropositividade para HTLV I ou HTLV II Tais testes complementares devem ser capazes de identificar anticorpos contra prote nas centrais gag e do envelope env do HTLV I e do HTLV II As fitas de Western Blot incorporadas com ant genos virais nativos de HTLV I um destes testes complementares largamente usados No entanto devido aus ncia de ant genos de envelope2. 1 10 11 12 13 14 15 16 Usando a pinga retire cuidadosamente o numero necess rio de FITAS do tubo e coloque as em cada po o com a face numerada voltada para cima Inclua fitas para controles Reativo Forte Reativo Fraco e N o Reativo Adicione 2 ml de SOLU O TAMP O DE LAVAGEM DILUIDA a cada po o Incube as fitas durante pelo menos 5 minutos temperatura ambiente 25 3 C sobre uma plataforma oscilante velocidade de 10 a 14 oscila es por minuto Remova a solu o tamp o por aspira o Adicione 2 ml de SOLU O TAMP O PARA BLOTTING a cada po o Adicione 20 ul de cada soro de paciente ou de controle nos po os apropriados Cubra a bandeja com a tampa fornecida e incube durante 1 hora temperatura ambiente 25 3 C na plataforma oscilante Retire cuidadosamente a tampa evitando salpicos ou misturar as amostras Incline a bandeja para aspirar a mistura dos po os Troque as ponteiras de aspira o entre as aplica es de amostras para evitar contamina o cruzada Lave cada fita 3 vezes com 2 ml de SOLU A O TAMP O DE LAVAGEM DILUIDA deixando as imersas durante 5 minutos sobre a plataforma oscilante entre cada lavagem Adicione 2 ml de SOLU O DE CONJUGADO DE TRABALHO a cada po o Cubra a bandeja e incube durante 1 hora a temperatura ambiente 25 3 C na plataforma oscilante Aspire o CONJUGADO dos po os Lave como na etapa 8 Adicione 2 ml de SOL
3. 10 11 12 13 14 15 16 Lee H Swanson P Shorty VS Zack JA Roseblatt JD and Chen ISY High rate of HTLV II infection in seropositive IV drug abusers in New Orleans Science 1989 244 471 475 Lipka JJ Bui K Reyes GR Moeckli R Wiktor SZ Blattner WA Murphy EL Hanson CV Shaw GM Shinsky JJ and Foung SKH Determination of a unique immunodominant epitope of HTLV I Infect Dis 1990 162 353 357 Wiktor SZ Alexandra SS Shaw GM et al Distinguishing between HTLV I and HTLV II by Western Blot Lancet 1990 335 1533 Samuel KP Lautenberger JA Jorcyk CL Josephs S Wong Staal F and Papas TS Diagnostic potential for human malignancies of bacterially produced HTLV I envelope protein Science 1984 226 1094 1097 Hadlock KG Goh CJ Bradshaw PA Perkins S Lo J Habbaz RK Kaplan J and Foung SKH Delineation of an immunodominant and highly HTLV specific epitope within the HTLV I transmembrane glycoprotein Blood 1995 68 4 1392 1399 Varma M Rudolph D Knuchel M Switzer W Hadlock KG Velligan M Chan L Foung SKH Lal RB Enhanced specificity of truncated transmembrane protein for serologic confirmation of HTLV I and HTLV II infection by Western Blot assay containing recombinant envelope glycoproteins J Clin Micro 1995 33 12 3239 3244 Lillehoj EP Alexander SS Dubrule CJ Wiktor S Adams R Thi A Manns CC and Blattner WA Development and evalu
4. s i durante 30 minutos Alternativamente descontamine o material em solu o de hipoclorito de s dio a 5 durante 30 a 60 minutos antes do descarte em sacos para lixo biol gico perigoso Descontamine todos os produtos qu micos e reagentes usados adicionando um volume suficiente de hipoclorito de s dio de forma a obter uma concentra o final de pelo menos 1 Deixe agir durante 30 minutos para garantir uma descontamina o eficiente N o recomend vel reutilizar as bandejas de incuba o PRECAU ES ANAL TICAS 1 Para garantir um desempenho perfeito do teste necess rio SEGUIR A RISCA os procedimentos descritos neste Manual de Instru es A inobserv ncia desses procedimentos pode acarretar resultados an malos N O MODIFIQUE NEM SUBSTITUA REAGENTES DE UM LOTE DO KIT POR OUTRO Os controles o conjugado e as fitas de Western Blot foram combinados entre si para oferecer o melhor desempenho Use somente reagentes fornecidos com o kit N o use componentes do kit al m da data de validade impressa na caixa do kit 10 11 12 18 14 15 16 17 18 19 Evite a contamina o microbiana dos reagentes ao abrir e retirar al quotas dos frascos originais pois a contamina o reduzir prematuramente a vida til dos kits e fornecer resultados err neos Use t cnicas ass pticas como pipetas ou ponteiras de pipetas descart veis para retirar al quotas dos frascos Em cada pr
5. 160 Blotting 1X ml Conjugado ul 11 17 23 35 45 59 77 Substrato ml 11 17 23 35 45 59 77 P para Blotting g 1 2 3 4 5 6 8 Reagentes CONTROLE DE QUALIDADE Recomendamos processar os controles Nao Reativos e ambos os controles Reativos Fortes junto a cada teste independentemente do numero de amostras sob an lise Para que todos os resultados obtidos nos testes sejam considerados v lidos as condi es a seguir dever o ser respeitadas 1 CONTROLE N O REATIVO Nenhuma banda espec fica do HTLV I II rgp46 I rgp46 Il ou GD21 dever ser exibida no controle N o Reativo A banda de controle de soro anti IgG humana deve ser vis vel 2 CONTROLE REATIVO FORTE A banda de controle de soro e todas as bandas espec ficas do HTLV I Il devem estar evidentes As bandas importantes do HTLV I obrigatoriamente presentes s o p19 p24 gp46 rgp46 e GD21 Observe que a banda da gp46 difusa 3 CONTROLE REATIVO FORTE Il A banda de controle de soro e todas as bandas especificas do HTLV I Il devem estar evidentes As bandas importantes do HTLV obrigatoriamente presentes sao p24 GD21 e rgp46 ll INTERPRETAGAO DOS RESULTADOS A banda de controle de soro serve como um controle da adi o da amostra na prova A aus ncia desta banda indica que nao foi adicionado a fita nenhum soro de teste ou o conjugado ou o substrato ou que ocorreram outros erros
6. Diagnostics s o Soropositivo para HTLV Soropositivo para HTLV I Soropositivo para HTLV II Soronegativo ou Indeterminado DESCRI O DOS S MBOLOS USADOS Os s mbolos gr ficos usados ou encontrados nos produtos e embalagens MP Diagnostics est o indicados a seguir Estes s o os s mbolos mais comuns presentes em dispositivos m dicos e em suas respectivas embalagens e s o explicados com mais detalhes no British and European Standard BS EN 980 2008 z Usar at Dispositivo Sin nimo m dico Data de Validade para diagn stico in vitro C digo da Remessa Sin nimos N mero de N mero do Lote cat logo N mero da Remessa 7 Aten o Y Limites de i Ver Instru es Temperatura de Uso Representante bal Fabrcante EC REP Auionzado na Comunidade 7 z Europ ia Y Cont m o suficiente para lt n gt testes Consulte as instru es de uso Q N o reutilize PRINC PIOS QU MICOS E BIOL GICOS DO PROCEDIMENTO As fitas de nitrocelulose s o incorporadas com prote nas virais do HTLV I derivadas de part culas virais rompidas nativas e inativadas e prote nas obtidas por engenharia gen tica As fitas individuais de nitrocelulose s o incubadas com amostras de soro ou plasma dilu dos e com controles Os anticorpos espec ficos contra o HTLV I II caso presentes na amostra ir o se fixar s prote nas do HTLV I II nas fitas As fitas s o lavadas para remover o material n o fixado j os antico
7. LHO diluindo o CONJUGADO a 1 1 000 em SOLU O TAMP O PARA BLOTTING por exemplo 10 ul de CONJUGADO para 10 ml de SOLU O TAMP O PARA BLOTTING 4 SOLU O DE SUBSTRATO pronta para uso a Distribua diretamente o volume necess rio do frasco Use uma pipeta limpa Feche bem ap s o uso PROCEDIMENTO DO TESTE Nota a Aspire todos os reagentes e produtos qu micos usados para um recipiente de conten o com hipoclorito de s dio b Todas as incuba es devem ser realizadas em plataforma de agita o por oscila o Cuidado Algumas amostras provocam manchas escuras no ponto da fita em que s o aplicadas Para evitar este problema proceda como indicado a seguir i Aplique a amostra somente ap s a adi o da SOLU O TAMP O PARA BLOTTING ii Incline a bandeja elevando ligeiramente sua extremidade superior ou inferior A Solu o Tamp o para Blotting ir fluir para a extremidade mais baixa da bandeja Adicione a amostra onde a Solu o Tamp o para Blotting acumulada Quando todas as amostras tiverem sido adicionadas retorne a bandeja posi o horizontal original Certifique se de que as fitas mantenham se sempre midas durante o procedimento iii Alternativamente caso n o deseje inclinar a bandeja as amostras podem ser adicionadas na extremidade superior ou inferior do po o Desta forma caso se desenvolvam manchas escuras a leitura da fita n o ser afetada Procedimento
8. OMO OS CONTROLES REATIVO FORTE I REATIVO FORTE II EOS CONTROLES NAO REATIVOS COMO AGENTES POTENCIALMENTE INFECCIOSOS Recomenda se manusear os componentes e as amostras do teste de acordo com as boas pr ticas de laborat rio O descarte dever ser realizado de acordo com os procedimentos de seguran a vigentes O Controle Reativo Forte I Controle Reativo Forte le o Controle N o Reativo cont m tiomersal e azida s dica j a Solu o Tamp o Estoque Concentrada e a Solu o Tamp o de Lavagem Concentrada cont m tiomersal e o Conjugado cont m azida s dica A azida s dica pode reagir com o cobre e o chumbo usados em alguns sistemas de canaliza o formando sais explosivos Embora as quantidades usadas neste kit sejam pequenas o descarte de materiais que cont m azida deve ser feito por lavagem com volumes relativamente altos de gua de forma a evitar a forma o de azida met lica no sistema de canaliza o As frases de risco R pertinentes s o R20 21 22 Prejudicial se inalado em contato com pele e se ingerido O Substrato cont m 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato e azul de nitrotetraz lio classificado pelas Diretivas da Comunidade Econ mica Europ ia CEE aplic veis como nocivo Xn As frases de risco R pertinentes s o R20 21 22 Nocivo por inala o em contato com a pele e em caso de ingest o 10 11 12 Evite a contamina o microbiana dos reagentes ao abrir e retirar al quotas dos frascos or
9. TLV II serum panels Clin amp Diag Virol 1995 4 149 161 Rouet F Meertens L Courouble G Herrmann Storck C Pabingui R Chancerel B Abid A Strobel M Mauclere P and Gessain A Serological epidemiological and molecular differences between human T cell lymphotropic virus type seropositive healthy carriers and persons with HTLV I gag indeterminate Western blot patterns from the Caribbean J Clin Microbiol 2001 39 1247 1253 Cesaire R Bera O Maier H Lezin A Martial J Ouka M Kerob Bauchet B Ould Amar AK and Vernant JC Seroindeterminate patterns and seroconversions to human T lymphotropic virus type positivity in blood donors from Martinique French West Indies Transfusion 1999 39 1145 1149 Soldan SS Graf MD Waziri A Flerlage AN Robinson SM Kawaninshi T Leist TP Lehky TJ Levin MC and Jacobson S HTLV I II seroindeterminate western blot reactivity in a cohort of patients with neurological disease J Infect Dis 1999 180 685 694 MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd 85 Science Park Drive 04 01 The Cavendish Singapore Science Park Cingapura 118259 Tel N 65 6775 0008 Fax N 65 6775 4536 E mail enquiry ap mpbio com Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D 66386 St Ingbert Alemanha Tel N 49 68 94 58 1020 Fax N 49 68 94 58 1021 E mail info mt procons com Escrit rios Regionais MP Biomedicals Suiss
10. U O DE SUBSTRATO a cada po o Cubra a bandeja e incube a durante 15 minutos na plataforma oscilante Aspire o SUBSTRATO e enx g e as fitas pelo menos tr s vezes com gua de qualidade reagente para interromper a rea o Usando a pin a retire cuidadosamente as fitas e coloque as sobre toalhas de papel Cubra com toalhas de papel e seque Alternativamente deixe as fitas secarem nos po os da bandeja Monte as fitas sobre folha de papel branco n o absorvente N o aplique fita adesiva sobre as bandas reveladas Observe as bandas Ver Interpreta o dos Resultados e interprete os resultados Para armazenamento conserve as fitas em local escuro 2ml 5 minutos 2ml 20 ul 60 minutos 3x2 ml 2 mi 60 minutos 3x2 ml 2 ml 15 minutos 3x2 ml RESUMO DOS PROTOCOLOS DO TESTE Reagentes Qtde Dura o Fita de nitrocelulose 1 Solu o Tamp o de Lavagem 2 ml 5 min Solu o Tamp o para Blotting 2 ml Amostra 20 ul 60 min Solu o Tamp o de Lavagem 3x2ml 3x5 min Conjugado 2ml 60 min Solu o Tamp o de Lavagem 3x 2 ml 3x5 min Substrato pronto para uso 2ml 15 min gua destilada 3x2ml QUANTIDADE NECESS RIA DE REAGENTES PARA VARIAS FITAS N MERO DE FITAS A SEREM USADAS 3 6 9 15 20 27 36 Solu o Tamp o de 60 100 140 240 300 400 520 Lavagem 1X ml Solu o Tamp o para 20 40 60 80 100 120
11. adas por ENV Qualquer prote na de GAG sozinha p19 p24 p26 p28 p32 p36 p53 Amostras soropositivas para HTLV nas quais n o poss vel fazer a tipagem podem ser melhor solucionadas usando o algoritmo de Wiktor et alna aus ncia de rgp46 e de rgp46 Il Este algoritmo usa a reatividade relativa de p19 e de p24 e mostrou se eficiente para diferenciar os dois sorotipos 11 1213 14 A interpreta o como indeterminado baseia se nas diretrizes da OMS de 1990 No entanto v rios estudos sugeriram que alguns padr es de bandas indeterminados conforme indicado podem ser interpretados como soronegativos em especial quando provenientes de doadores de sangue sadios 2 Por exemplo um estudo envolvendo 37 724 doadores de sangue sadios confirmou que HGIPs podem ser interpretados com seguran a como sendo soronegativos No entanto deve se ter cautela quando os padr es indeterminados forem obtidos de usu rios de drogas intravenosas ou de doadores de sangue de reas end micas assim como de pacientes com doen as neuroldgicas 6 7 Embora sejam raras as amostras de soro de indiv duos com infec es duplas elas podem existir e devem ser diferenciadas com base nos crit rios acima indicados Os padr es de bandas de tais amostras indicar o positividade para HTLV I e para HTLV II Os dados dispon veis demonstram que as sororreatividades para rgp46 l e para 46 Il s o espec ficas para HTLV I e HTLV II respectivamente Porta
12. ados casos de interpreta es falso negativas Testes complementares como os de PCR HTLV I e HTLV II podem ser teis para discriminar amostras soropositivas para o HTLV que n o puderam ser identificadas como HTLV I ou HTLV II pelo BLOT HTLV 2 4 da MPD p ex Padr o 4 CARACTERISTICAS DE DESEMPENHO ESPECIFICO O desempenho do HTLV BLOT 2 4 MPD para a detec o de anticorpos para HTLV I e HTLV II foi avaliado usando HTLV I Il soropositivo e amostras soronegativas e foi comparado com dois imunoensaios de linha incorporados com ant genos para HTLV I e HTLVII prote nas recombinantes ou pept dios Sensibilidade Amostras que s o estabelecidas para serem positivas para anticorpos de HTLV e ou HTLV Il por testes ELISAs comercialmente conhecidos foram usadas para determinar a sensibilidade do HTLV BLOT 2 4 MPD A Compara o para Imunoensaio Linha 1 Resultado do Blot 2 4 comparando o HTLV BLOT 2 4 MPD e imunoensaios Linha 1 LI 1 para amostras positivas compradas da Boston Biomedica Inc E U A BBI e ProMedDx foram os seguintes Imunoensaios Linha 1 M todo NEG IND POS Total HTLV NEG IND 3 0 3 BLOT POS 0 102 102 2 4 MPD Total 3 102 105 z HTLV BLOT 2 4 MPD apresentou 2 resultados indeterminados e 1 resultado negativo que tamb m foi detectado negativo com o imunoensaio Linha 1 Imunoensaios Linha 1 apresentou 3 resultados negativos Os dois Blots apresen
13. ation of a human T Cell leukemia virus type serologic confirmatory assay incorporating a recombinant envelope polypeptide J Clin Microbiol 1990 28 2653 2658 Lal RB Brodine SK Coligan JE and Roberts CR Differential antibody responsiveness to p19 gag results in serological discrimination between human T lymphotropic virus type and type II J Med Virol 1991 1 232 236 Hjelle B Cyrus S Swenson S and Mills R Serologic distinction between human T lymphotropic virus HTLV type and HTLV type Il Transfusion 1991 31 731 736 Madeleine MM Wiktor SZ Goedert JI Manns A Levine PH Biggar RJ Blattner WA HTLV I and HTLV II worldwide distribution reanalysis of 4 832 immunoblot results Inte J Cancer 1993 54 2 255 260 World Health Organization s Global Programme on AIDS WHO Global Programme on AIDS Information Update Virus Information Exchange Newsletter 1990 7 2 54 55 Lal RB Rudolph DL Coligan JE Brodine SK and Roberts CR Failure to detect evidence of human T lymphotropic virus HTLV type and type II in blood donors with isolated gag antibodies to HTLV I II Blood 1992 80 544 550 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Khabbaz RF Heneine W Grindon A Hartley TM Shulman G and Kaplan J Indeterminate HTLV serologic results in U S blood donors Are they due o HTLV I or HTLV II J Acquir Immune Defic Syndr 1992 5 400 404 Lipka JJ Yo
14. cipitados Isto n o ir afetar o desempenho do kit CUIDADO Evite a exposi o desnecess ria do substrato luz COLETA TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Podem ser usadas amostras de soro ou plasma coletadas em EDTA heparina ou citrato de s dio Antes do armazenamento certifique se que os co gulos sangu neos ou as c lulas sangu neas foram separados por centrifuga o As amostras devem ser conservadas entre 2 C e 8 C se o teste for realizado no prazo de 7 dias ap s a coleta ou congeladas 20 C ou menos se o teste for adiado para mais de 7 dias ap s a coleta prefer vel usar amostras l mpidas e n o hemolisadas Amostras extremamente lip micas ict ricas ou contaminadas part culas devem ser filtradas 0 45 um ou centrifugadas antes do teste Os soros dos pacientes podem ser inativados mas esta n o uma exig ncia para um desempenho timo do teste Inative da seguinte forma 1 Afrouxe as tampas dos recipientes de soro 2 Aque a o soro a 56 C durante 30 minutos em banho maria 3 Deixe o soro esfriar antes de reapertar as tampas 4 O soro pode ser mantido congelado at o momento da an lise Recomendamos que os soros dos pacientes n o sejam submetidos a m ltiplos ciclos de congelamento e descongelamento antes das an lises MATERIAIS ADICIONAIS NECESS RIOS MAS N O FORNECIDOS e gua deionizada ou destilada e Luvas descart veis e Plataforma oscilan
15. e compra do produto O fabricante n o ser considerado respons vel pelo comprador ou por terceiros por quaisquer danos preju zos ou perdas de car ter econ mico que possam ser causados pelo uso ou aplica o do produto PROBLEMAS T CNICOS RECLAMA ES Caso haja algum problema t cnico ou reclama o solicitamos proceder da seguinte forma 1 Anote o numero de lote do kit e a data de validade 2 Conserve os kits e os resultados obtidos 3 Contate o escrit rio MP Biomedicals mais pr ximo ou o seu distribuidor local REFER NCIAS 1 Towbin H Staehlin T and Gordan J Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci U S A 1976 76 4350 4354 2 Poiesz BJ Ruscetti FW Gazdar AF Bonn PA Minna JD And Gallo RC Detection and Isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T cell lymphoma Proc Natl Acad Sci U S A 1980 77 12 7415 7419 3 Kalyanaraman VS Sarngadharan MG Robert Guroff M Miyoshi I Blayney D Golde and Gallo RC Anew subtype of human T cell leukemia virus HTLV II associated with a T cell variant of hairy cell leukemia Science 1982 218 571 573 4 William AE Fang CT Slamon DJ et al Seroprevalence and epidemiological correlates of HTLV I infection in U S blood donors Science 1988 240 643 646
16. e S A Halle de Fret Aeroport P O Box 1015 1211 Genebra 5 Su a Tel N 4122 788 1908 Fax N 4122 788 1986 E mail mpbiosuisse mpbio com Patente nos EUA 5 066 579 5 614 366 5 763 572 5 814 441 5 871 933 5 643 714 Patente australiana 613350 667189 690540 Patente canadense 1337799 Patente europ ia 0395634 Patente japonesa 2559482 O nome e o logotipo Genelabs s o licenciados da Genelabs Technologies Inc FIGURA 1 Controle soro es z k rgp46 l w em wee gp4et mm je pm rgp46 Il me p53 ae os pS eee gp46 E E wai tem ta p36 E E p32 i waa p28 Ea E p26 i ean ja p24 B gp21 ___ o p19 _ x z ni GD21 E if Bandas virais especificas conforme visualizadas com Um soro com infec o dupla por HTLV I II Controle Reativo Forte Reativo unicamente para HTLV I Controle Reativo Forte Il Reativo unicamente para HTLV II Controle Nao Reativo oo
17. iginais N o pipete com a boca Manuseie as amostras de testes as fitas de nitrocelulose e os Controles Reativos Forte Forte Il e os Controles N o Reativos como agentes potencialmente infecciosos Use vestu rio de laborat rio e luvas descart veis durante a realiza o do teste Descarte as luvas em sacos pl sticos exclusivos para lixo biol gico perigoso A seguir lave bem as m os altamente recomend vel que este teste seja realizado em uma c mara adequada para material biol gico perigoso Mantenha todo o material longe de alimentos e bebidas Em caso de acidente ou contato com os olhos lave imediatamente com gua em abund ncia e procure ajuda m dica Consulte imediatamente um m dico caso sejam ingeridos materiais contaminados ou haja contato destes com feridas abertas ou outros ferimentos Enxugue imediatamente derramamentos de materiais infecciosos com papel absorvente e limpe a area contaminada com solu o de hipoclorito de s dio a 1 antes de continuar o trabalho O hipoclorito de s dio n o deve ser usado em derramamentos que cont m cidos a n o ser que a rea seja primeiro enxugada com papel absorvente O material usado incluindo as luvas descart veis deve ser descartado como sendo material biol gico potencialmente perigoso N o esterilize em autoclave material contendo hipoclorito de s dio Antes do descarte esterilize em autoclave todo o material usado e contaminado a 121 C e 15 p
18. nas provas cl ssicas de Western Blot para o HTLV muitas vezes necess rio usar m todos de radioimunoprecipita o para confirmar a presen a de anticorpos para HTLV I II A discrimina o quanto soropositividade para HTLV I e HTLV II exige testes adicionais i e pept deos espec ficos testes de ELISA e de PCR Por isso s o necess rios testes sorol gicos simples por m espec ficos e sens veis que possibilitem uma confirma o r pida e a diferencia o entre amostras soropositivas para o HTLV I e para o HTLV II O BLOT HTLV 2 4 da MP Diagnostics apresenta sensibilidade e especificidade aprimoradas tanto para confirmar como para diferenciar as sororreatividades para HTLV I e para HTLV II Isto efetuado gra as incorpora o de MTA 1 uma prote na recombinante exclusiva do envelope do HTLV I rgp46 l de K55 uma prote na recombinante exclusiva do envelope de HTLV II rgp46 ll e de GD21 uma prote na recombinante de epitopo de envelopes que embora comum ao HTLV I e HTLV II espec fica Cada fita inclui tamb m um controle interno de adi o de amostra para minimizar o risco de falso negativos provocados por erros operacionais O BLOT HTLV 2 4 da MP Diagnostics foi concebido como um teste complementar para anticorpos que pode caracterizar amostras repetidamente positivas nos testes de triagem iniciais para anticorpos contra HTLV I II Os poss veis perfis sorol gicos definidos pelo BLOT HTLV 2 4 da MP
19. nto as amostras de soro reativas para rgp46 l rgp46 Il GD21 p19 e p24 determinam a presen a de infec o dupla LIMITA ES DO M TODO Para garantir um desempenho perfeito do teste necess rio seguir risca os procedimentos descritos A inobserv ncia desses procedimentos pode acarretar resultados an malos Um resultado NEGATIVO n o exclui a possibilidade de exposi o a ou infec o por HTLV I ou HTLV II Os blots INDETERMINADOS n o dever o ser usados como base para o diagn stico de infec o por HTLV I II Foi tamb m registrada a reatividade para p19 assim como para p24 em popula es n o infectadas e de baixo risco embora os determinantes de p24 sejam relativamente raros A sensibilidade da rgp46 I registrada na Fran a foi de 95 na Jamaica e nos Estados Unidos foi de 100 das amostras confirmadas por PCR e de 98 dos doadores de sangue positivos para HTLV I Foi observado que a sensibilidade da rgp46 Il maior que 98 em amostras dos Estados Unidos confirmadas por PCR Estima se que a sensibilidade geral de cada especificidade de tipo rgp46 l e rgp46 Il seja superior a 97 A pequena porcentagem de amostras HTLV I e HTLV II que n o reagem com rgp46 nem com rgp46 Il s o capazes de reagir pelo menos com GD21 e com uma ou mais bandas GAG p19 ou p24 preenchendo seja os crit rios de soropositividade para HTLV Padr o 4 ou de amostra com padr o Indeterminado Padr o 5 N o foram relat
20. ocessamento de amostras de pacientes deve se testar os controles do kit em paralelo Use uma ponteira de pipeta nova para cada al quota de amostra para evitar contamina o cruzada Para melhores resultados aplique todos os reagentes enquanto ainda estiverem frios e retorne os ao armazenamento entre 2 C e 8 C o mais depressa poss vel Recomenda se que a vidraria a ser usada com os reagentes seja lavada com cido clor drico 2M e enxaguada abundantemente com gua destilada ou deionizada antes do uso Use somente gua de qualidade reagente deionizada ou destilada para diluir os reagentes Todos os reagentes devem ser bem misturados antes do uso A solu o de Conjugado de Trabalho a Solu o Tamp o de Lavagem Dilu da e a Solu o Tamp o para Blotting devem ser preparadas logo antes do uso A solu o de Conjugado de Trabalho deve ser preparada usando um recipiente ou b cher de polipropileno N o exponha os reagentes nem realize testes em reas contendo altos n veis de vapores de desinfetantes qu micos p ex vapores de hipoclorito durante as etapas de armazenamento ou de incuba o O contato inibe a rea o colorida Da mesma forma n o exponha os reagentes luz intensa O teste deve preferencialmente ser realizado temperatura ambiente 25 C 3 C Certifique se de que as fitas de teste est o dispostas com os numeros nas fitas voltados para cima Para a prova de Western Blot imp
21. operacionais Localize e identifique as bandas nas fitas processadas com os controles Reativos Fortes Estas fitas ser o ent o usadas para identificar as bandas presentes na fitas que cont m as amostras sob teste PADR O INTERPRETA O 1 Nenhuma reatividade com SORONEGATIVO prote nas espec ficas do HTLV 2 Reatividade com mol culas SOROPOSITIVO codificadas pelo gene GAG p19 PARA HTLV I com ou sem p24 e com duas codificadas por ENV GD21 e rgp46 l 3 Reatividade com mol culas SOROPOSITIVO codificadas por GAG p24 com PARA HTLV II ou sem p19 e com duas por ENV GD21 e rgp46 Il 4 Reatividade com mol culas SOROPOSITIVO codificadas por GAG p19 e p24 PARA HTLV e por ENV GD21 SOROPOSITIVO PARA HTLV I indicado se p19 gt p24 SOROPOSITIVO PARA HTLV II indicado se p19 lt p24 5 Detec o de bandas espec ficas INDETERMINADO para o HTLV mas que nao preenchem os crit rios de soropositividade para HTLV I HTLV II ou HTLV No entanto os seguintes padr es de bandeamento classificados como indeterminados podem ser interpretados como SORONEGATIVOS Padr es de Western Blot com GAG do HTLV I indeterminado HGIP exibindo presen a de p19 p26 p28 p32 p36 p53 por m aus ncia de p24 e de quaisquer prote nas codificadas por ENV Quaisquer combina es de prote nas codificadas por GAG p19 p26 p28 p32 p36 p53 por m aus ncia de p24 e de quaisquer proteinas codific
22. ortante usar um agitador de plataforma oscilante e nao um agitador rotativo Caso contr rio o desempenho do kit estar comprometido A velocidade e o ngulo de inclina o recomendados para o agitador s o de 12 a 16 ciclos por minuto e 5 a 10 graus respectivamente Se usar equipamento autom tico confira se est aferido antes do uso Certifique se de que as amostras s o adicionadas longe da fita A bandeja pode ser inclinada e a amostra adicionada no local onde a solu o tamp o coletada na extremidade inferior Isto evita a forma o de manchas escuras devidas adi o de amostra na fita Evite o uso de congeladores de descongelamento autom tico frost free para armazenar reagentes e amostras INSTRUGOES DE ARMAZENAMENTO 1 Conserve o kit HTLV BLOT 2 4 MPD e seus componentes entre 2 C e 8 C quando n o estiverem em uso 2 Todos os reagentes e fitas do teste permanecem estaveis at a data de validade fornecida no kit se conservados entre 2 C e 8 C Nao congele os reagentes A Fitas com ant genos e Evite a exposi o desnecess ria das fitas com ant genos luz B Reagentes e Conserve os reagentes em seus recipientes originais que devem ser fechados para armazenamento e Aplique todos os reagentes enquanto est o ainda frios e retorne os ao armazenamento entre 2 C e 8 C o mais depressa poss vel e Quando o substrato for conservado entre 2 C e 8 C poder ocorrer forma o de pre
23. r reconstitu da em gua de qualidade reagente Solu o tamp o Tris com prote nas de origem animal e n o animal inativadas pelo calor Cont m tiomersal como conservante SOLU O TAMP O DE LAVAGEM CONCENTRADA 20x Tris com Tween 20 cont m tiomersal como conservante CONJUGADO Anticorpo caprino anti lgG humana conjugado fosfatase alcalina fornecida Dispon vel em 18e 36 fitas 1 frasco 80 ul 1 frasco 80 ul 1 frasco 80 ul 1 ou 2 frascos cada um a ser reconstituido para completar 100 ml 1 frasco 70 ml 1 frasco 120 ul 1 frasco SUBSTRATO aon m Solu o de 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato BCIP e azul de nitrotetraz lio NBT PO PARA BLOTTING Leite desnatado em p 10 embalagens 1g cada Bandejas de incuba o 2 ou 4 bandejas 9 po os cada Manual de Instru es 1 exemplar Pin a 1 pe a Nota O volume de reagentes fornecido suficiente para 4 processamentos AVISOS E PRECAU ES 1 Para uso exclusivo em diagn stico in vitro 2 Exclusivamente para uso profissional 3 Solicitamos consultar a documenta o dos produtos para informa es sobre componentes potencialmente perigosos INFORMA ES DE SA DE E SEGURAN A CUIDADO Este kit cont m material de origem A humana Nenhum m todo de teste pode oferecer garantia total que os produtos de sangue humano n o transmitir o infec es MANUSEIE AS AMOSTRAS ASSIM C
24. rpos que se fixam especificamente s prote nas do HTLV podem ser visualizados por uma s rie de rea es mediante o uso de anticorpo caprino anti lgG humana conjugado fosfatase alcalina e do substrato BCIP NBT Este m todo suficientemente sens vel para detectar quantidades m nimas de anticorpos espec ficos contra o HTLV no soro ou plasma COMPONENTES DO KIT Descri o dos Componentes Quantidade FITAS DE NITROCELULOSE contro IN CoNTROLTITE IN ONTROL TA IN BUF LYO STOCK BUF WASH 20x T CONJUGATE Incorporado com HTLV I lisado viral antigenos de envelope recombinante e um controle de adi o de soro o anti humano IgG banda Mantenha secas e ao abrigo da luz CONTROLE N O REATIVO Soro humano normal inativado n o reativo para HBsAg nem para anticorpos contra HCV HIV 1 2 e HTLV I Il Cont m azida s dica e tiomersal como conservantes CONTROLE REATIVO FORTE Soro humano inativado contendo t tulo elevado de anticorpos contra HTLV I e n oreativo para HBsAg nem para anticorpos contra HCV e HIV 1 2 Cont m azida s dica e tiomersal como conservantes CONTROLE REATIVO FORTE Il Soro humano inativado contendo t tulo elevado de anticorpos contra HTLV II e n o reativo para HBsAg nem para anticorpos contra HCV e HIV 1 2 Cont m azida s dica e tiomersal como conservantes SOLU O TAMP O ESTOQUE LIOFILIZADA A se
25. specificidade Um total de 200 amostras de doadores de sangue foram testadas resultando em uma especificidade de 92 5 15 amostras apresentaram resultados indeterminados e n o houve nenhum resultado falso positivo Se 150 amostras cl nicas 50 amostras de gravidez 50 amostras potencialmente indeterminadas 10 com ictericia hemolizadas triglic rides lip mica amostras de prote nas totais e 73 amostras apresentando potencialmente rea o cruzada TB Helicobactor pylori HEV Dengue HBV HCV HIV 1 HIV 2 s o inclu das a especificidade global foi 89 2 461 517 56 amostras apresentaram resultados indeterminados e nao houve nenhum resultado falso positivo 6 amostras foram verdadeiramente positivas confirmadas por outro teste confirmat rio ISEN O DE RESPONSABILIDADE EXPL CITA E LIMITADA O fabricante n o oferece nenhuma outra garantia expressa sen o a de que o kit de teste funcionar como um teste para diagn stico in vitro dentro das especifica es e limita es descritas neste Manual de Instru es do produto quando usado em conformidade com as instru es nele contidas O fabricante isenta se de qualquer garantia expressa ou impl cita incluindo as garantias expressas ou impl citas em rela o capacidade de comercializa o de utiliza o ou utilidade impl cita para quaisquer outros fins A responsabilidade do fabricante limita se substitui o do produto ou ao reembolso do pre o d
26. taram as discrimina es seguintes para 102 amostras positivas de HTLV Interpreta o M todo HTLV I HTLV II HTLV I amp Non Total HTLV II typeable HTLV BLOT 45 53 4 0 102 2 4 MPD LI 4 48 51 0 3 102 Ambos HTLV I e HTLV Il marcadores espec ficos apareceram indicando co infec o Incapaz de detectar qualquer tipo de HTLV por causa da aus ncia de marcadores espec ficos Ambos HTLV BLOT 2 4 MPD e LI 1 apresentaram resultados semelhantes Os poucos resultados discordantes apresentados foram devido ao uso de ant genos imobilizados diferentes nos blots e aos m todos diferentes usados HTLV BLOT 2 4 MPD apresentou uma sensibilidade de 97 1 que foi equivalente ao obtido com imunoensaio Linha 1 B Compara o para Imunoensaio Linha 2 A Sociedade Francesa de Transfus o de Sangue Anti HTLV I e Il Painel de Desempenho SFTS 94 que consistem em 26 HTLV 1 e 6 amostras de HTLV II foram estudadas Resultados do HTLV BLOT 2 4 MPD neste painel foram comparados com imunoensaio Linha 2 LI 2 como segue Interpreta o M todo HTLV I HTLV II Non Falso Total typeable NEG HTLV BLOT 26 6 0 0 32 2 4 MPD LI 2 21 6 4 1 32 HTLV BLOT 2 4 MPD identificou corretamente amostras positivas para HTLV apresentando uma sensibilidade de gt 99 9 neste painel Usando o mesmo painel o kit LI2 comparativo apresentou uma sensibilidade de 96 9 E
27. te com velocidade de agita o na faixa de 2 a 16 oscila es por minuto e com capacidade de inclina o entre 5 e 7 para lavagem uniforme das membranas Pipetadores e ponteiras de volumes adequados Sistema de aspira o e conten o em hipoclorito de s dio Banho maria a 56 C opcional Hipoclorito de s dio para descontamina o PREPARA O DOS REAGENTES 1 SOLU O TAMP O DE LAVAGEM DILU DA a A SOLU O TAMP O DE LAVAGEM DILU DA deve ser preparada logo antes do uso b Dilua 1 volume de SOLU O TAMP O DE LAVAGEM CONCENTRADA 20X com 19 volumes de gua de qualidade reagente Misture bem 2 SOLU O TAMP O PARA BLOTTING a Reconstitua cada frasco do TAMP O ESTOQUE LIOFILIZADO com 100 ml de gua de qualidade reagente Misture bem para dissolver Esta SOLU O TAMP O ESTOQUE RECONSTITU DA mant m se est vel durante 6 semanas se conservada entre 2 C e 8 C A SOLU O TAMP O PARA BLOTTING deve ser preparada logo antes do uso Adicione 1 g de P PARA BLOTTING a cada 20 ml da SOLU O TAMP O ESTOQUE RECONSTITU DA preparada na etapa 2 a acima Agite para dissolver completamente o p c Agite novamente antes de aplicar o 3 SOLU O DE CONJUGADO DE TRABALHO Nota Prepare a solu o em um recipiente ou b cher de polipropileno a ASOLU O DE CONJUGADO DE TRABALHO deve ser preparada logo antes do uso b Prepare a SOLU O DE CONJUGADO DE TRABA
28. ung KK Kwok SY Reyes GR Sninsky JJ and Foung SK Significance of human T lymphotropic virus type indeterminant serological findings among healthy individuals Vox Sang 1991 61 171 176 Zrein M Louwagie J Boeykens H Govers L Hendickx G Bosman F Sablon E Demarquilly C Boniface M and Saman E Assessment of a new immunoassay for serological confirmation and discrimination of human T cell lymphotropic virus infections Clin Diag Lab Immunol 1998 5 45 49 Witt DJ Kuramoto K Kemper M and Holland P Utility of prospective study of donors deferred as HTLV indeterminate Vox Sang 2000 78 130 131 Hayes C G Burans JP and Oberst RB Antibodies to Human T Lymphotropic virus Type in a population from the Philippines Evidence for cross reactivity with Plasmodiun falciparum The J Infect Dis 1990 163 257 262 Gallo D Diggs JL and Hanson CV Evaluation of two commercial Human T Cell Lymphotropic Virus Western blot Immunoblot kits with problem specimens J Clin Microbiol 1994 32 2046 2049 Garin B Gosselin S de The G and Gessain A HTLV I II infection in a high viral endemic area of Zaire Central Africa Comparative evaluation of serology PCR and significance of indeterminate Western blot pattern J Med Virol 1994 44 104 109 Fujiyama C Fujiyoshi T Matsumoto D Yashiki S Tamashiro H and Sonoda S Re evaluation of anti HTLV I Western blot assay using HTLV I and H
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