Syva® Cyclosporine Specific Assay
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1. A Tabela 4 apresenta a distribui o de todas as leituras do Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 para os mesmos 26 doentes s o inclu das v rias medi es para cada doente Table 8 Reactividade cruzada do metabolito na presen a 8 8 Metabolito da N vel de metabolito Reactividade cruzada ciclosporina Testado ng ml AM1 M17 500 lt 0 3 AM19 M8 500 3 AMAN M21 500 lt 0 3 AM9 M1 670 7 3 Subst ncias End genas N o foi observada qualquer interfer ncia em amostras s quais foram adicionados 40 mg dl de bilirrubina 20 mg dl de cido rico 3000 mg dl de triglic ridos ou 500 mg dl de colesterol Interac es medicamentosas Informa o apresentada em seguida reportada pela Sandoz Pharmaceuticals foi retirada do Physicians 05 A ciclosporina extensivamente metabolizada pelo f gado Deste modo os n veis circulantes de ciclosporina podem ser influenciados por drogas que afectam as enzimas micross micas hep ticas particularmente o sistema do citocr mio P 450 As subst ncias conhecidas por inibirem estas enzimas diminuir o o metabolismo hep tico e aumentar o os n veis de ciclosporina As subst ncias indutoras da actividade do citocr mio P 450 aumentar o o metabolismo hep tico e reduzir o os n veis de ciclosporina A monitoriza o dos n veis circulantes de ciclosporina 6 o ajuste da dose adequada de Sandimmune ciclosporina s2. 1 Permitir que os reagentes amostras calibradores e controlos sejam deixados em repouso temperatura ambiente 18 25 C antes da utiliza o consultar a Tabela 1 para conhecer os tempos m nimos Se for utilizado um compartimento refrigerado nos sistemas COBAS MIRA S ou COBAS MIRA Plus os reagentes podem ser utilizados directamente depois de retirados do frigor fico Contudo as amostras e todos os outros componentes do ensaio devem ser deixados em repouso temperatura ambiente antes da utiliza o 2 Permitir que o diluente e o metanol atinjam a temperatura ambiente utilizando os a esta temperatura 18 25 C Notar que ambos podem ser armazenados temperatura ambiente 3 Preparar armazenar e utilizar os controlos de acordo com as instru es do fabricante 4 Ligar o sistema COBAS MIRAS Confirmar que o sistema est programado de acordo com o protocolo adequado na Sec o 12 Ap ndice Consultar o manual do operador adequado do sistema COBAS MIRA para obter instru es completas 5 Se utilizar um pipetador diluidor autom tico verificar as defini es e purgar o pipetador diluidor com o Diluente espec fico de ciclosporina Emit 2000 Garantir que n o existem quaisquer bolhas de ar nas linhas 6 Preparar e etiquetar um tubo de microcentr fuga para cada calibrador controlo e amostra a pr tratar 7 Preparar o mesmo n mero de copos de amostra COBAS MIRA no calibrador e ou suporte s de amostra COBAS MI
3. o essenciais quando estas drogas s o utilizadas concomitantemente Drogas que aumentam os n veis de ciclosporina Diltiazem Cetoconazole Nicardipina Fluconazole Verapamil Itraconazole Danazol Eritromicina Bromocriptina Metilprednisolona Metoclopramida Drogas que diminuem os n veis de ciclosporina Rifampina Fenito na Fenobarbital Carbamazepina Precis o A precis o total e a respectiva componente de precis o intra ensaio foram determinadas em tr s locais de ensaio de acordo com a norma experimental do Comit Nacional de Padr es Laboratoriais Cl nicos National Committee of Clinical Laboratory Standards NCCLS para a avalia o da precis o Foram testados em triplicado controlos BioRad de tr s n veis com duas execu es por dia durante 20 dias N 120 A precis o total foi determinada nove vezes utilizando dois analisadores separados cada um dos sistemas de qu mica COBAS MIRAS 6 COBAS MIRA S e tr s lotes de reagente cada um com um lote de calibrador separado A Tabela 9 apresenta o valor m dio normal n 9 para cada n vel do controlo os intervalos do desvio padr o DP e os intervalos da do coeficiente de varia o CV obtidos Tabela 9 Precis o Precis o intra ensaio Precis o total N vel do controlo Intervalo Intervalo Intervalo Intervalo ng ml do DP da CV do DP da CV 72 44 85 6 11 8 7 6 13 8 1 1 178 6 9 11 2 4 6 2 107 16 8 6 10 414 14 8 26 1 3 8 6 1 26 9 35 6 6
4. sem amostras ou controlos Calibrar quando ensaiar amostras e ou controlos com calibradores Garantir que a rotina programada localiza o dos copos de amostra no suporte das amostras nenhum nenhum 6ROO4UL 11SL PASSOS Retirar cuidadosamente 100 pl de sobrenadante com o pipetador diluidor ou com uma pipeta de dispensa o positiva Dispensar 0 sobrenadante com 200 ul de Diluente espec fico da ciclosporina Emit 2000 para o copo da amostra COBAS MIRAS Tapar imediatamente o copo da amostra ap s a dispensa o de cada amostra Agitar os sobrenadantes dilu dos cobrindo os suportes da amostra e ou de calibra o com a tampa do suporte e inverter completamente o s suporte s pelo menos 10 vezes Em seguida aplicar suavemente ligeiras pancadas no s suporte s para libertar quaisquer bolhas de ar que estejam retidas no fundo dos copos Colocar os suportes na plataforma do suporte Agitar suave mas exaustivamente os reagentes e colocar nas posi es adequadas no suporte do Reagente 5 Inserir segmentos de cuvete vazios nas posi es respectivas Purgar as seringas premindo as teclas bolhas lt INFO gt e lt 6 gt SYSTEM CHECKS Premir lt 1 gt PRIME O ecr responder com PRIME Premir lt F1 gt START para purgar Permitir que o sistema escorve 5 ciclos completos Premir novamente lt Fi gt para interromper a escorvagem 7 10 11 12 Procedimento de prepara o
5. 3 8 5 M dia de nove valores determinados para tr s lotes de reagente em tr s analisadores Foram utilizados lotes de calibrador separados para cada lote de reagente A m dia variou de 63 3 a 77 8 ng ml para o n vel 1 do controlo de 166 7 a 187 4 ng ml para o n vel 2 do controlo e de 390 6 a 436 1 ng ml para o n vel 3 do controlo Os estudos internos de precis o demonstraram que a precis o obtida com o sistema de qu mica COBAS MIRA Plus compar vel dos sistemas de qu mica COBAS MIRA e COBAS MIRA 5 Exactid o Os n veis sangu neos de ciclosporina nos doentes come aram a ser monitorizados imediatamente ap s o transplante e durante aproximadamente tr s meses O Local 1 monitorizou n veis de doentes submetidos a transplante de rim e f gado Os Locais 2 3 e 4 monitorizaram n veis de doentes submetidos a transplante de rim f gado e cora o As amostras foram analisadas pelo Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 e por dois m todos de refer ncia um radioimunoensaio RIA empregando um anticorpo monoclonal espec fico e procedimentos de cromatografia l quida de alta resolu o HPLC Na Tabela 10 apresentada uma an lise comparativa dos resultados 6ROO4UL 11SL 11 Desempenho As caracter sticas de desempenho do Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 s o afectadas por todos os par metros de leitura As informa es que seguem representam o desempenho total do sistema e n o devem ser in
6. 9 17 5 4 200 250 ng ml 26 16 7 70 19 6 32 10 2 250 300 ng ml 24 15 4 52 14 5 37 11 8 300 350 ng ml 16 10 3 48 13 4 36 11 5 350 400 ng ml 5 3 2 31 8 7 33 10 5 400 450 ng ml 3 1 9 17 4 7 40 12 7 450 500 ng ml 5 3 2 9 2 5 26 8 3 500 550 ng ml 3 1 9 2 0 6 10 3 2 950 600 ng ml 0 0 0 0 10 3 2 gt 600 ng ml 3 1 9 12 34 34 10 8 Atrav s da inspec o visual dos dados apresentados na Tabela 4 foram identificados intervalos que foram representativos da maioria dos resultados do ensaio n o associados com rejei o nefrotoxicidade ou n veis s ricos de creatinina elevados Nos doentes submetidos a transplante renal 81 das determina es situaram se entre 100 e 350 ng ml De modo similar nos doentes submetidos a transplante hep tico 76 das determina es situaram se entre 100 e 350 ng ml N o foi efectuada qualquer tentativa no sentido de identificar intervalos representativos dos nove doentes submetidos a transplante card aco porque cinco destes doentes todos tratados no mesmo centro m dico apresentavam n veis sangu neos de ciclosporina significativamente superiores aos dos quatro doentes que foram tratados noutros centros m dicos N o dever o ser retiradas quaisquer conclus es aplic veis universalmente a partir dos dados apresentados acima As amostras representativas utilizadas para calcular as percentagens apresentadas na Tabela 5 6 6 foram seleccionadas do seguinte modo Para os doentes que experimentaram qualquer tipo de r
7. de Padr es Laboratoriais Cl nicos National Committee of Clinical Laboratory Standards NCCLS para avalia o da linearidade Verificou se que 0 ensaio foi linear no intervalo de 40 a 500 ng ml A informa o apresentada na Tabela 13 foi determinada atrav s da elabora o de um gr fico do valor alvo x versus resultado anal tico y Tabela 13 Estudo de linearidade Analisador Analisador Analisador COBAS MIRA Plus COBAS MIRA COBAS MIRA 5 N 20 20 20 Declive 0 97 0 98 1 05 Intersec o 4 5 3 9 13 3 valor p 0 82 0 70 0 72 14 Bibliografia Notas 1 Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts Manual Guide Safety Management No CDC 22 Centers for Disease Control Atlanta GA April 30 1976 McMillan MA Clinical pharmacokinetics of cyclosporin Pharmac Ther 1989 42 135 156 Kahan BD Cyclosporine N Engl J Med 1989 321 1725 1738 Schran HF et al Determination of cyclosporine concentrations with monoclonal antibodies Clin Chem 1987 33 2225 2229 Wong PY et al Quality assessment of cyclosporine monitoring Canadian validations Transplant Proc 1990 22 1216 1217 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories JY Richmond RW McKinney eds Atlanta GA US Dept of Health and Human Services Public Health Service Centers for Disease Control and Prevention Bethesda MD National Institutes of Health 1993 Occupational Exposure to Bloodborne Pat
8. de novo o controlo Se ap s a repeti o do teste o controlo se situar dentro dos seus limites de controlo aceitar a execu o e Se ap s a repeti o do teste um controlo se mantiver mesmo assim fora dos limites de controlo contactar um consultor t cnico para obter assist ncia Nota Se de acordo com os procedimentos de funcionamento no seu laborat rio for necess ria uma verifica o dos resultados dos testes mais frequente esses requisitos dever o ser cumpridos Dilui o de amostras com concentra o elevada Se o ensaio de uma amostra de doente pr tratada apresentar um resultado superior a 500 ng ml 416 3 nmol l de ciclosporina ou seja a impress o apresenta OUT OF TEST RANGE utilizar as orienta es seguintes para diluir manualmente um al quota da amostra de doente ensaiada colhido a partir do copo da amostra COBAS MIRA com uma solu o de metanol a 25 em Diluente espec fico da ciclosporina Emit 2000 1 Preparar uma solu o de metanol a 25 em Diluente espec fico de ciclosporina Emit 2000 a Pipetar 2 5 ml de metanol grau de reagente ou superior num frasco volum trico de 10 ml b Preencher o volume de l quido at perfazer 10 ml com Diluente espec fico de ciclosporina Emit 2000 c Agitar exaustivamente a solu o por invers o repetida Minimizar a exposi o da solu o ao ar A solu o pode ser utilizada durante at uma semana ap s a prepara o quando armazenada t
9. em separado SO calibrador negativo adicional fornecido como uma op o para a dilui o de amostras com concentra o elevada consultar a Sec o 7 Procedimento Dilui o de amostras com concentra o elevada Os calibradores cont m as seguintes concentra es de ciclosporina Calibradores 0 50 100 200 350 500 Ciclosporina ng ml 0 50 100 200 350 500 Ciclosporina nmol l 0 41 6 83 3 166 5 291 4 416 3 Syva Emit 2000 Cyclosporine Specific Assay Cuidado A legisla o federal nos Estados Unidos limita a venda e distribui o deste dispositivo por um m dico ou por ordem deste bem como a um laborat rio cl nico A sua utiliza o est restringida ao m dico ou sob ordem deste Informa es actualizadas 9 lt Consultar as 50008065 1 15 6 0 painel final Syva 6ROO4UL 11SL Ensaio espec fico de ciclosporina 1 Fima que se destina lt O Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 destina se utiliza o na an lise quantitativa in vitro da ciclosporina CsA em sangue total humano como um aux lio na gest o dos pacientes de transplantes do cora o f gado 6 rim CONTRA INDICA ES N o existem quaisquer contra indica es para o Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 ADVERT NCIA 1 MANUSEAR TODAS AS AMOSTRAS COMO SE FOSSEM PASS VEIS DE TRANSMITIR INFEC ES 2 N o comer beber fumar nem aplicar cosm ticos em locais onde os reagentes do kit forem manipulados 3 N o pipeta
10. os calibradores n o devem voltar a ser congelados e devem ser armazenados a 2 8 C Os calibradores podem ser utilizados durante um per odo de 8 semanas ou at ao fim do prazo de validade impresso na etiqueta consoante 0 que se verificar primeiro quando armazenados a 2 8 0 Os reagentes diluente e calibradores devem ser deixados em repouso temperatura ambiente 18 25 C antes da utiliza o A Tabela 1 apresenta os tempos m nimos de repouso necess rios para os reagentes diluente e calibradores para al m de informa es resumidas sobre armazenamento e estabilidade Tabela 1 Armazenamento e estabilidade dos componentes do ensaio Tempo m nimo Estabilidad Temp de a 18 25 C antes Frasco Componente Armazenamento da utiliza o n o aberto Frasco aberto Reagente A tampa preta 2 8 C 60 mint Prazo val 12 sem Reagente B tampa branca 2 8 C 60 mint Prazo val 12 sem Diluente Kit n o aberto 2hr Prazo val N A Kit aberto N A Prazo val 6 mes 18 25 C Calibradores N o aberto thr Prazo val N A lt 10 C Aberto 30 min N A 8 sem 2 8 C A estabilidade depende da manipula o dos componentes conforme indicado tSe for utilizado um compartimento refrigerado nos sistemas COBAS MIRA 5 ou COBAS MIRA Plus os reagentes podem ser utilizados directamente depois de retirados do frigor fico 5 Instrumentos O Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 executado nos sistemas de qu mica COBAS MIRAS COB
11. sangu neos ptimos de ciclosporina Os valores individuais de ciclosporina n o devem ser utilizados como nico indicador para efectuar altera es do regime de tratamento Todos os doentes devem ser alvo de uma avalia o cl nica exaustiva antes de se efectuarem quaisquer ajustes no tratamento devendo os utilizadores do ensaio estabelecer os seus pr prios intervalos com base na experi ncia cl nica Estes intervalos variar o de acordo com o teste de diagn stico in vitro comercial utilizado Os intervalos devem ser estabelecidos para cada teste comercial utilizado Uma avalia o cl nica do Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 foi conduzida em doentes submetidos a transplantes de cora o rim e f gado em tr s locais de estudo e num quarto local de estudo em doentes submetidos a transplantes de rim e f gado Em cada local os n veis sangu neos m nimos de ciclosporina foram monitorizados em s rie Foram inclu dos neste estudo cento e trinta e dois 132 doentes 30 doentes submetidos a transplante card aco 65 doentes submetidos a transplante renal e 37 doentes submetidos a transplante hep tico Foram analisadas mais de 4000 amostras de sangue Os doentes foram acompanhados durante uma m dia de 127 dias 4 1 meses com um intervalo de 37 a 312 dias Os regimes de tratamento variaram de acordo com as institui es e com os doentes A Tabela 3 apresenta os resultados do Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 a
12. undecap ptido c clico de origem f ngica e um poderoso agente imunossupressivo Desde a sua produ o em 1983 a ciclosporina melhorou substancialmente a sobreviv ncia de doentes e transplantes em doentes submetidos a transplantes de cora o rim f gado p ncreas ou pulm o Muitos estudos documentaram o efeito da ciclosporina no combate rejei o de rg os Doses e n veis inadequados de ciclosporina podem dar origem rejei o do rg o transplantado N veis t xicos de ciclosporina est o associados a muitos efeitos secund rios graves incluindo a nefrotoxicidade hepatotoxicidade e um conjunto de outras complica es Os m dicos est o particularmente preocupados com os efeitos nefrot xicos da droga quando utilizada em transplantes renais por causa da dificuldade em distinguir entre a rejei o do rg o e a toxicidade da ciclosporina A monitoriza o das concentra es da droga ciclosporina original no sangue total e a interpreta o destas concentra es em conjun o com outros dados cl nicos e considera es cl nicas constituem a forma mais eficaz de garantir a terap utica imunossupressora adequada para receptores de transplantes de rg os s lidos O sangue total ao contr rio do plasma constitui a matriz de elei o para a medi o da ciclosporina uma vez que a droga rapidamente distribu da pelos gl bulos vermelhos Devido ao facto de a contribui o de mais de 30 metabolitos da ciclospori
13. 9 resultados em cada n vel 3 Calcular uma concentra o m dia de controlo para cada controlo com base nas nove determina es geradas para esse n vel 4 Definir limites tempor rios de controlo para cada n vel de controlo utilizando as concentra es m dias de controlo determinadas no Passo 3 e consultando a Tabela 2 Por exemplo se a concentra o m dia de controlo de 100 ng ml os limites de controlo ser o de 70 ng ml 30 e 130 ng ml 30 Tabela 2 Limites do controlo Controlo Concentra o m dia do controlo ng ml Limite Baixo 50 100 m dia 30 101 150 m dia 20 M dio 151 300 m dia 20 Alto 301 400 m dia 20 Utilizar controlos de dois n veis baixo e alto ou de tr s n veis tExecutar apenas um n vel do controlo baixo Se o controlo baixo se situar dentro do intervalo de 50 100 ng ml definir os limites de controlo de acordo com a m dia 30 Se o controlo baixo se situar dentro do intervalo de 101 150 ng ml definir os limites de controlo de acordo com a m dia 20 5 Utilizar os limites tempor rios estabelecidos durante pelo menos 30 dias de calend rio de execu o de amostras de doentes Para estabelecer os limites permanentes reunir um m nimo de 20 determina es em cada n vel de controlo e recalibrar pelo menos de 10 em 10 dias durante o per odo em forem utilizados os limites tempor rios Nota Os limites tempor rios do controlo devem ser correctos ao longo de 30 dia
14. ANER NO 5 350 6 500 ng mL WAVELENGTH 340nm 7 NO 8 NO DECIMAL POSITION 0 REPLICATE DUPL UNIT ng mL DEVIATION NO ANALYSIS CORRECTION STD NO POST DIL FACTOR NO CONTROL CONC FACTOR NO CS1 POS NO SAMPLE CYCLE 1 CS2 POS NO VOLUME 36 0 uL CS3 POS NO DILUTION NAME H20 VOLUME 39 0 uL 1 REAGENT CYCLE VOLUME 155 uL START R1 CYCLE 4 VOLUME 75 0 uL DILUTION NAME H20 VOLUME 20 0 uL CALCULATION SAMPLE LIMIT NO REAC DIRECTION INCREASE CHECK OFF ANTIGEN EXCESS NO CONVERS FACTOR 1 00000 OFFSET 0 00000 TEST RANGE LOW ON HIGH ON NORM RANGE LOW USER DEFINED HIGH USER DEFINED NUMBER OF STEPS mA CALC STEP A KINETIC READINGS FIRST 11 LAST 22 REACTION LIMIT NO Nota a sensibilidade descrita para o Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 de 40 ng ml 13 Risco e seguran a Nocivo Cont m azida de s dio R22 Nocivo por ingest o R32 Em contacto com cidos liberta gases muito t xicos S36 Usar vestu rio de protec o adequado Preparado em conformidade com a Directiva 92 32 EEC do Concelho da UE sobre etiquetas EINECS 247 852 1 Para obter informa es adicionais sobre sa de e seguran a consultar a ficha de material de seguran a Material Safety Data Sheet MSDS dispon vel no site Internet da Dade Behring Inc www dadebehring com ou contactar o seu representante local 6ROO4UL 11SL Tabela 10 An lise comparati
15. AS MIRA S 6 COBAS MIRA Plus Todos estes sistemas possuem um detector de n vel na sonda do reagente que detecta quando o n vel do Reagente A est demasiado baixo para executar o ensaio O sistema de qu mica COBAS MIRA Plus possui tamb m um detector de n vel para o Reagente B Todavia nos sistemas COBAS MIRA e COBAS MIRA S o Reagente B dispensado pela agulha de amostras que n o possui qualquer detector de n vel Deste modo o operador deve confirmar que existe uma quantidade suficiente de Reagente B para executar o ensaio Consultar os manuais do instrumento para a programa o dos sistemas de qu mica COBAS MIRAS COBAS MIRA S 6 COBAS MIRA Plus 6 Colheita de amostras e manipula o e O volume de amostra m nimo necess rio de 100 gil de sangue total e Os factores farmacocin ticos influenciam a hora correcta de recolha da amostra ap s a ltima administra o da droga Estes factores incluem a dose o modo de administra o terap utica medicamentosa concomitante e varia es biol gicas que afectam a disposi o da droga Recomenda se a colheita de uma amostra de n veis m nimos para medi o da ciclosporina O sangue deve ser colhido utilizando tubos contendo anticoagulante EDTA O EDTA recomendado como anticoagulante de elei o para o ensaio de ciclosporina em amostras de sangue total As amostras heparinizadas n o s o recomendadas devido possibilidade de forma o de co gulos durante o armazena
16. DADE BEHRING Os m todos historicamente utilizados para monitorizar as concentra es de ciclosporina no sangue incluem a cromatografia l quida de alta resolu o HPLC o radioimunoensaio RIA e o imunoensaio por fluoresc ncia polarizada FPIA 3 Princ pio O Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 emprega uma t cnica de imunoensaio enzim tico homog neo utilizada para a an lise de ciclosporina no sangue total O ensaio cont m anticorpos monoclonais de rato com uma alta especificidade para a ciclosporina O Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 baseia se na competi o pelos locais de liga o dos anticorpos da ciclosporina A ciclosporina na amostra compete com a ciclosporina no Reagente B Enzima que se encontra marcado com a enzima glicose 6 fosfato desidrogenase G6PDH A enzima activa n o ligada converte o dinucle tido de adenina nicotinamida oxidado NAD no Reagente A Anticorpo para NADH resultando numa varia o cin tica da absorv ncia que pode ser medida espectrofotometricamente A actividade enzim tica diminui ap s a liga o com o anticorpo permitindo que a concentra o de ciclosporina na amostra seja medida em termos da actividade enzim tica A G6PDH s rica end gena n o interfere pois a coenzima NAD funciona apenas com a enzima bacteriana Leuconostoc mesenteroides utilizada no ensaio Antes de efectuar o teste com o Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 as amostras calibrado
17. RAS Procedimento de pr tratamento e de ensaio O procedimento foi separado em duas sec es Passos e Notas t cnicas para uma consulta f cil As notas t cnicas constituem uma parte essencial das instru es e devem ser lidas exaustivamente antes de completar cada passo do procedimento Nota Para minimizar a contamina o manter adequadamente o seu instrumento e amostra manuseando o equipamento de acordo com as instru es do fabricante e seguindo cuidadosamente o procedimento do ensaio tal como salientado nas sec es Passos e Notas t cnicas Consultar a Sec o 8 Avalia o dos resultados para mais explica es A reprodutibilidade e exactid o dos dispositivos de pipetagem da amostra e do metanol s o cruciais para o sucesso do m todo Deve ser efectuada uma calibra o peri dica E tamb m essencial a utiliza o adequada destes dispositivos NOTAS T CNICAS N o agitar no vortex Os l quidos podem ser misturados m o ou num inversor ou agiatador basculante Os calibradores s o um hemolisado de sangue total e podem apresentar uma apar ncia ligeiramente diferente das amostras de sangue total PASSOS 1 Agitar todos os calibradores controlos e amostras suave mas exaustivamente imediatamente antes da utiliza o 2 Transferir 100 ul consultar a primeira Alternativamente podem ser extra dos 13 Para pr calibrar Premir lt ROUTINE gt e em seguida no local
18. Sistema de qu mica COBAS MIRA COBAS MIRA S ou COBAS MIRA Plus Dispon vel a partir da Roche Diagnostic Systems Suportes de reagente 5 Suportes de calibrador Cal CS 30 Suporte de amostra Sample 30 e tampa de suporte Segmentos de cuvete COBAS MIRAS COBAS MIRA S ou COBAS MIRA Plus Copos de amostra Materiais necess rios mas n o fornecidos Controlos multi n vel de sangue total Pipeta de dispensa o positiva de 200 gl ou Repetidor Eppendorf para dispensa o de metanol Pipeta de dispensa o positiva de 100 ul ou 200 gl para dispensa o de amostras Pipetador diluidor com distribuidor de amostras de 100 pl 6 dispensador de diluente de 200 pl para transfer ncia do extracto para o copo de amostra do COBAS MIRAS pode tamb m ser utilizada uma pipeta de dispensa o positiva Combitips Eppendorf 5 ml se for utilizado o Repetidor Eppendorf Tubo de microcentr fuga 1 5 a 2 ml de capacidade Agua destilada ou desionizada em frasco de pl stico para solu o de lavagem Metanol grau de reagente ou melhor Microcentr fuga Suporte para tubos de centr fuga Agitador vortex Panos de laborat rio Inversor ou agiatdor basculante de amostras opcional Especifica es sugeridas para o pipetador diluidor baseadas em ensaios gravim tricos seringa de amostra de precis o 3 seringa de diluente de precis o 2 seringa de amostra e diluente de precis o de 1 CV Instru es gerais de utiliza o do instrument
19. TINE gt lt P gt lt C gt lt TEST KEY gt lt ENTER gt na aus ncia de amostras ou lt C gt lt A gt lt TEST KEY gt lt ENTER gt em conjunto com um ensaio da amostra 6 Para armazenar uma curva de calibra o os resultados da amostra devem ser eliminados atrav s de PATIENT FILE e n o de TEST RESULTS 7 O pedido para o ensaio da amostra programado atrav s de ROUTINE Manuten o di ria Consultar o manual do operador adequado relativamente s instru es de manuten o 6ROO4UL 11SL Os calibradores espec ficos de Ciclosporina Emit 2000 s o preparados em hemolisado de sangue total conservado Prepara se um soluto de ciclosporina para estes calibradores utilizando o procedimento gravim trico padr o e a concentra o do soluto determinada por meio de cromatografia l quida de alta resolu o HPLC Adicionam se al quotas do soluto a quantidades definidas da matriz do calibrador para produzir a concentra o final pretendida Prepara o armazenamento e estabilidade dos componentes do ensaio Os reagentes do Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 e o Diluente espec fico de ciclosporina Emit 2000 s o fornecidos prontos a serem utilizados Fechar os frascos do reagente e do diluente quando n o estiverem a ser utilizados Colocar sempre as tampas de enroscar do reagente nas aberturas originais da cassete de reagente N o congelar nem expor os reagentes a temperaturas superiores a 27 C Os reage
20. as Instru es de Utiliza o Resp T c Nanci A Trindade CRF SP 7 297 2001 12 13 PIA Para obter assist ncia t cnica contactar a Syva Company 1 800 227 8994 nos EUA 1 800 264 0083 no Canad lt Fora dos EUA e Canad contactar o representante local da Syva Company Aviso A adultera o dos reagentes a utiliza o de instrumentos inadequados ou outra falha no cumprimento das instru es definidas neste r tulo podem afectar as caracter sticas do desempenho e as indica es do r tulo expl citas ou impl citas O 65 Syva e Emit s o marcas comerciais registadas da Syva Company nos EUA e noutros pa ses COBAS MIRA COBAS MIRA S e COBAS MIRA Plus s o marcas comerciais registadas da Roche Diagnostics Systems Inc Sandimmune uma marca comercial registada da Sandoz Pharmaceutical Corporation O 1991 Syva Company Dade Behring Limited Regus House Atterbury Milton Keynes MK10 9RG United Kingdom Ce Syva Company Printed in USA 4 Dade Behring Inc Revisto Abril 2003 Cupertino CA 95014 6ROO4UL 11SL 04 21 03 Part No 6RO04UL 11SL Portuguese Layout 8 1 2 x 11 Final size N A Folded to N A e Doc 204 03 22 02 if applicable Colors Black
21. correspondente ao n mero da posi o da amostra digitar PC O ecr responder com PCAL Seleccionar os testes a pr calibrar e em seguida premir lt ENTER gt Prosseguir para o passo 16 Para calibrar Premir lt ROUTINE gt e em seguida no local correspondente ao n mero da posi o da amostra digitar CA O ecr responder com CAL Seleccionar os testes a calibrar e em seguida premir lt ENTER gt Prosseguir para 0 passo 14 14 Para programar a Lista de trabalhos Premir lt ROUTINE gt Digitar a s posi o es da amostra e as teclas de teste apropriadas testes a efectuar para cada uma premindo em seguida lt ENTER gt Se se pretender duplicados premir duas vezes as Teclas de teste apropriadas e em seguida premir lt ENTER gt 15 Para executar controlos ou amostras de doentes a partir de uma curva armazenada programar a lista de trabalho lt ROUTINE gt tal como no passo 14 premir lt ENTER gt e em seguida premir lt START gt 16 Premir lt STATUS gt O ecr STATUS apresentar RACK HANDLING POSSIBLE e SEGMENT HANDLING POSSIBLE Premir lt START gt Se an lise n o for iniciada o instrumento apresentar uma mensagem de sistema no fundo do monitor CRT Consultar o manual do operador para obter informa es mais detalhadas 200 ul de amostra com 400 ul de metanol Estes volumes mais elevados tornam f cil evitar o precipitado durante a remo o de al quotas sob
22. durante a manuten o do instrumento 2 Verificar se o sistema de qu mica se encontra a funcionar correctamente seguindo as instru es do manual do operador do instrumento 3 Pr tratar um conjunto de Calibradores espec ficos da ciclosporina Emit 2000 de acordo com o protocolo de pr tratamento de amostras Os calibradores podem ser pr tratados em conjunto com as amostras e controlos 4 Colocar os calibradores pr tratados no suporte de calibrador COBAS MIRA apropriado e calibrar de acordo com as instru es do manual do operador do instrumento 5 Aceitar a calibra o se cada controlo de dois ou tr s n veis se situar dentro dos limites de controlo consultar em baixo para obter informa es sobre a forma de estabelecer os limites de controlo Controlo da Qualidade Limites tempor rios do controlo 1 Ap s a calibra o inicial ensaiar tr s r plicas de cada um dos controlos multi n vel 2 ou mais numa nica execu o Recomenda se o teste dos controlos por ordem descendente Registar os resultados do controlo N o eliminar qualquer resultado do controlo excepto se tiver sido produzido por erro do operador ou avaria do instrumento ou se o resultado do controlo pode ser rejeitado por um teste estat stico separado 2 Repetir mais duas vezes a calibra o o ensaio dos controlos e o registo dos resultados do controlo tal como foi descrito no Passo 1 A partir das tr s execu es devem ser registados nove
23. ejei o ou nefrotoxicidade foram seleccionadas as amostras recolhidas imediatamente antes no m ximo a uma semana do epis dio Para os doentes que n o experimentaram rejei o e para os doentes que n o experimentaram nefrotoxicidade foram inclu das no c lculo uma amostra por semana durante o primeiro m s e uma amostra por m s nos dois meses seguintes Tabela 5 N mero e percentagens de doentes com amostras nos intervalos de concentra o de ciclosporina descritos e que experimentaram rejei o Concentra o N mero de N mero de doentes Percentagem de Intervalo de de ciclosporina doentes com rejei o doentes com rejei o confian a de 95 Cora o lt 200 ng ml 13 4 30 8 5 7 a 55 9 2200 ng ml 87 8 9 2 3 1 a 15 3 Rim e f gado lt 100 ng ml 20 2 10 3 1 a 23 1 2100 ng ml 314 20 4 6 3 7 a 9 1 Tabela 6 N mero e percentagens de doentes com amostras nos intervalos de concentra o de ciclosporina descritos e que experimentaram nefrotoxicidade Concentra o N mero de N mero de doentes Percentagem de doentes Intervalo de de ciclosporina doentes com nefrotoxicidade com nefrotoxicidade confian a de 95 Cora o lt 500 ng m 115 4 3 5 0 1 a 6 8 2500 ng m 28 3 10 7 0 7 a 22 2 Rim lt 350 ng m 264 7 2 7 0 7 a 4 6 2350 ng m 21 1 4 8 4 3 a 13 9 F gado lt 350 ng m 126 4 3 2 0 1 a 6 2 2350 ng m 35 4 11 4 0 9 a 22 Apesar de as tend ncias indicadas nas Tabelas 5 e 6 serem co
24. em 25 da m dia Depois de terem sido obtidas pelo menos 20 curvas de calibra o os limites permanentes do controlo podem ser redefinidos atrav s do c lculo da m dia 6 multiplicando por 2 o desvio padr o para cada n vel de controlo 4 Estabelecer novos limites permanentes do controlo sempre que for utilizado um novo conjunto de controlos Os novos limites podem ser estabelecidos atrav s do ensaio dos novos controlos em 20 execu es que sejam verificadas utilizando os controlos antigos Controlo Di rio da Qualidade 1 Ensaiar cada um dos controlos de dois ou tr s n veis pelo menos uma vez em cada execu o Se durante uma execu o for adicionado reagente adicional a uma cassete ou forem introduzidos no sistema uma nova cassete ou frasco de reagente efectuar a valida o ensaiando pelo menos um controlo por cada cassete ou frasco adicional Se for exigido o teste de mais do que um n vel do controlo pelos procedimentos de opera o do seu laborat rio esses requisitos dever o ser cumpridos Tabela 4 Distribui o das medi es de ciclosporina em doentes que n o experimentaram rejei o nefrotoxicidade ou n veis s ricos de creatinina elevados Rim F gado Cora o 6 doentes 11 doentes 9 doentes Concentra o N N N de ciclosporina amostras amostras amostras gt 50 ng ml 1 0 6 9 25 6 1 9 50 100 ng ml 10 6 4 5 14 16 5 1 100 150 ng ml 26 16 7 39 10 9 17 5 4 150 200 ng ml 34 21 8 64 17
25. emperatura ambiente num recipiente bem selado 2 Diluir e ensaiar amostras pr tratadas de alta concentra o a Num copo de amostra COBAS MIRA limpo combinar uma parta de amostra de doente ensaiada retirada do copo de amostra COBAS MIRAS original com duas partes de solu o de metanol a 25 em Diluente espec fico de ciclosporina Emit 2000 preparado de acordo com as orienta es apresentadas acima O volume m nimo necess rio para executar duas r plicas de 125 ul para 05 sistemas COBAS MIRA e COBAS MIRAS S e de 175 ul para o sistema COBAS MIRA Plus b Tapar imediatamente a amostra dilu da c Ensaiar a amostra dilu da utilizando os passos 8 a 16 do Procedimento de pr tratamento e ensaio d Multiplicar o resultado do ensaio por 3 para obter uma estimativa da concentra o de ciclosporina Nota Os sobrenadantes dilu dos podem ser utilizados durante 2 horas ap s o ensaio inicial desde que o tempo total decorrido desde a prepara o n o exceda 4 horas Alternativamente as amostras de sangue total com alta concentra o podem ser dilu das com um calibrador de sangue total negativo utilizando as seguintes orienta es 1 Agitar suave mas exaustivamente o calibrador de sangue total negativo e as amostras de sangue total de alta concentra o imediatamente antes da utiliza o 2 Combinar uma parte de amostra de sangue total com duas partes de calibrador de sangue total negativo 3 Agitar exaustiva
26. ginal O sangue total foi contaminado para atingir 85 ng ml e 425 ng ml de ciclosporina Tr s al quotas de cada contamina o foram pr tratadas reunidas 6 ensaiados dez vezes Os resultados do estudo de recupera o s o apresentados na Tabela 11 Tabela 11 Estudo de recupera o 85 425 82 5 90 7 408 4 459 4 97 106 7 96 1 108 1 Valor nominal ng ml Intervalo dos valores m dios medidos ng ml Intervalo da percentagem de recupera o Foi conduzido um estudo separado para determinar o efeito do hemat crito sobre a recupera o de ciclosporina a partir de uma amostra Foram adicionados gl bulos vermelhos a plasma para criar cinco amostras de sangue total com hemat critos que variavam entre 15 e 59 Foram adicionadas concentra es nominais de 75 ng ml e 425 ng ml de ciclosporina para separar al quotas de cada uma das amostras Estes al quotas foram ent o ensaiados Como se pode observar na Tabela 12 a influ ncia do hemat crito sobre a recupera o de ciclosporina foi insignificante Tabela 12 Efeito do hemat crito sobre a recupera o da ciclosporina Hemat crito 15 26 37 46 59 75 ng ml Ciclosporina Recupera o 109 104 111 115 111 CV 5 6 3 4 1 3 3 7 4 425 ng ml Ciclosporina Recupera o 91 3 97 7 97 5 101 101 CV 6 4 5 3 7 5 7 9 8 7 Linearidade A linearidade do Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 foi avaliada de acordo com a directiva proposta pelo Comit Nacional
27. hogens Final Rule Federal Register Part II Department of Labor Occupational Safety and Health Administration 29 CFR Part 1910 1030 Friday December 6 1991 NCCLS Proposed Guideline EP7 P Interference testing for clinical chemistry Villanova PA National Committee for Clinical Laboratory Standards February 1982 Physician s Desk Reference ed 49 Montvale NJ Medical Economics Data Production Company 1995 pp 2184 2185 10 NCCLS Tentative Guideline EP5 T2 Precision performance of clinical chemistry devices second edition Villanova PA National Committee for Clinical Laboratory Standards March 1992 11 NCCLS Proposed Guideline EP6 P Evaluation of the linearity of quantitative analytical methods Villanova PA National Committee for Clinical Laboratory Standards August 1986 Aa O N Sal op N oo Kej lt 15 Chave dos s mbolos Fabricado por Representante Autorizado Dispositivo M dico para Diagn stico In Vitro C digo do Lote EXP A data em Utilizar antes 06 encontra se no YYYY MM DD formato ano m s dia AAAA MM DD 00 0800 170417 imi 3 SAC Servi o de Atendi te Cliente 0 0 Limita o da Temperatura Importado e distribu do por C Marca CE DADE BEHRING LTDA Rua Geraldo Flausino Gomes 61 1 Andar REF N mero de Cat logo Brooklin S o Paulo SP CEP 04575 060 Fone 11 3371 3200 Fax 11 3371 3201 CNPJ 00 897 408 0001 08 Consulte
28. mente a solu o por invers o repetida 4 Pr tratar e ensaiar a amostra de sangue total dilu da utilizando os passos 1 a 16 do Procedimento de pr tratamento e ensaio 5 Multiplicar o resultado do ensaio por 3 para obter uma estimativa da concentra o de ciclosporina 8 Avalia o dos resultados Os resultados s o calculados automaticamente pelo software dos sistemas COBAS MIRAS COBAS MIRA 5 ou COBAS MIRA Plus Consultar o manual do operador para obter instru es completas O efeito de contamina o deve ser considerado durante a avalia o de uma amostra de concentra o baixa testada imediatamente a seguir a uma amostra com uma concentra o de ciclosporina de 500 ng ml ou superior A dimens o da contamina o varia de sistema para sistema os estudos indicaram que a contamina o pode ser de at 4 por ex 2 ng ml a partir de uma amostra de 50 ng ml ou 32 ng ml a partir de uma amostra de 800 ng ml Para minimizar a contamina o manter adequadamente o seu instrumento e amostra manuseando o equipamento de acordo com as instru es do fabricante e seguindo cuidadosamente o procedimento do ensaio tal como salientado nas sec es Passos e Notas t cnicas 6ROO4UL 11SL Calibra o 1 Calibrar sempre que for utilizado um novo lote de reagentes Pode ser necess ria uma recalibra o quando s o efectuadas altera es significativas no instrumento por ex altera es na pipetagem e sistemas fotom tricos
29. mento NOTAS T CNICAS Evitar o precipitado quando remover al quotas do sobrenadante da amostra com o pipetador diluidor O di metro interno da tubagem do pipetador diluidor deve ser inferior a 1 mm para minimizar a contamina o da amostra A ponta do pipetador diluidor deve ser limpa entre as dispensa es de amostra para minimizar a contamina o Para evitar a obten o de um valor de ensaio quando n o est presente qualquer amostra garantir que todos os copos de amostra cont m amostra Os sobrenadantes dilu dos podem permanecer em copos de amostra n o perfurados por per odos n o superiores a 4 horas antes de serem analisados Uma vez perfurados os sobrenadantes dilu dos podem ser reutilizados por um per odo adicional de 2 horas desde que o tempo total decorrido desde a prepara o n o exceda 4 horas O volume de cada sobrenadante dilu do suficiente para seis ensaios de r plicas nenhum N o agitar no vortex Os reagentes podem ser misturados m o ou num inversor ou oscilador Se existir uma bolha a cobrir bocal de qualquer dos frascos de reagente perfurar a bolha com um instrumento limpo nenhum Verificar se as seringas apresentam bolhas Verificar se as correntes de l quido que saem das sondas apresentam um fluxo est vel Se necess rio remover quaisquer bolhas das seringas e ou substituir a s sonda s Pr calibrar quando ensaiar calibradores individualmente
30. na para a imunossupress o ou toxicidade permanecer incerta as concentra es de ciclosporina deveriam ser medidas utilizando um m todo que seja espec fico para a droga original e Utilizar amostras colhidas recentemente Se as amostras se destinarem a ser testadas no prazo de 8 horas ap s a colheita podem ser armazenadas temperatura ambiente de 18 25 C Podem ser armazenadas no frigor fico a 2 8 C durante at uma semana Se for necess rio um armazenamento mais prolongado as amostras devem ser congeladas a uma temperatura de 20 C A ciclosporina demonstrou ser est vel em amostras de sangue total durante pelo menos 3 meses quando armazenadas a 20 C Antes do teste descongelar e agitar exaustivamente as amostras congeladas A repeti o de ciclos de congela o descongela o deve ser evitada Os materiais insol veis que se podem formar quando algumas amostras s o congeladas devem ser evitadas durante a pipetagem e Manusear todas as amostras como se fossem pass veis de transmitir doen as Seguir as precau es padr o para o manuseamento de agentes infecciosos durante todos os procedimentos 7 Procedimento Materiais necess rios Fornecido pela Syva Company Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 Reagente A Anticorpo e Reagente B Enzima Diluente espec fico de ciclosporina Emit 2000 Calibradores espec ficos de ciclosporina Emit 2000 Dispon vel a partir da Syva Company
31. nsistentes com os resultados esperados isto um aumento de incid ncia de rejei o com baixos n veis de ciclosporina e um aumento da incid ncia de nefrotoxicidade com n veis altos de ciclosporina n o podem ser retiradas quaisquer conclus es aplic veis universalmente devido reduzida dimens o da amostra populacional 6ROO4UL 11SL 9 Limita es e O Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 destina se apenas utiliza o em diagn stico in vitro na medi o de ciclosporina em sangue total Este ensaio n o foi concebido para ser utilizado na medi o de ciclosporina no soro ou no plasma Uma potencial fonte de erro a contamina o A dimens o da contamina o varia de sistema para sistema os estudos indicaram que a contamina o pode ser de at 4 e N o utilizar uma solu o de lix via para purgar os sistemas COBAS MIRA COBAS MIRA 5 ou COBAS MIRA Plus A utiliza o de uma solu o de lix via afectar negativamente 0 desempenho do ensaio 10 Valores esperados N o existe qualquer intervalo terap utico s lido para a ciclosporina no sangue total A complexidade do estado cl nico as diferen as individuais na sensibilidade aos efeitos imunossupressivos e nefrot xicos da ciclosporina a co administra o de outros imunossupressores 0 tipo de transplante o tempo decorrido ap s o transplante e um conjunto de factores adicionais contribuem para requisitos diferentes em termos dos n veis
32. ntes n o abertos permanecer o est veis at ao prazo de validade impresso na etiqueta quando armazenados a uma temperatura de 2 8 C Ap s a abertura os reagentes permanecer o est veis durante 12 semanas ou at ao prazo de validade impresso na etiqueta consoante o que se verificar primeiro se armazenados a uma temperatura de 2 8 C na vertical 6 com as tampas bem fechadas Nota Se os reagentes adquirirem uma cor amarela forte encontram se deteriorados e devem ser descartados O diluente pode ser armazenado em frigor fico ou temperatura ambiente de 18 25 C Contudo uma vez aberto o kit o diluente deve ser armazenado e utilizado temperatura ambiente Ap s a abertura o diluente permanecer est vel durante 6 meses ou at ao prazo de validade consoante o que se verificar primeiro se armazenado com as tampas bem fechadas Os calibradores n o abertos devem ser armazenados congelados a uma temperatura de 10 C ou inferior Antes da utiliza o inicial os calibradores devem ser descongelados completamente sem quaisquer cristais de gelo remanescentes Deixar os calibradores descongelarem temperatura ambiente de 18 25 C durante aproximadamente uma hora ou a uma temperatura de refrigera o de 2 8 C de um dia para o outro Antes da utiliza o inverter lentamente os frascos do calibrador pelo menos dez vezes de modo a garantir que os conte dos ficam exaustivamente misturados N o agitar no vortex Uma vez descongelados
33. o 1 Se necess rio regular o instrumento para 37 C e Para programar a temperatura premir lt PROGRAM gt gt 6 lt SYSTEM PARAMETERS e gt 1 lt ANALYTICAL PARAMETERS 2 Para programar o ensaio premir lt PROGRAM gt lt 2 gt TESTS O ecr apresentar a Tabela de atribui es e Seleccionar uma tecla de letra n o definida e Digitar o nome do teste TEST NAME at quatro caracteres e Premir lt ENTER gt O cursor destacador avan ar para COPY FROM COPIAR DE e Premir lt ENTER gt para ultrapassar esta op o e Surgir a primeira p gina de par metros de teste com os valores predefinidos Come ar a introduzir as configura es do instrumento para os sistemas de qu mica COBAS MIRA 5 COBAS MIRA Plus consultar a Sec o 12 Ap ndice Premir lt ENTER gt ou gt 4 lt para avan ar para 0 par metro seguinte 3 Premir lt PRINT gt para obter uma c pia dos par metros de teste para verifica o das defini es 4 Programar o suporte do reagente 5 premindo lt PROGRAM gt gt 5 lt RACKS e gt 1 lt REAGENT 55 Seleccionar o n mero do suporte ao qual o ensaio ser atribu do e premir lt ENTER gt Avan ar o cursor para a posi o do suporte pretendida Premir lt TEST KEY gt 5 A calibra o programada em duplicado para o ensaio a pedido A calibra o ser executada automaticamente na aus ncia de uma curva armazenada ou pode ser solicitada atrav s da introdu o em lt ROU
34. o e expressando o resultado sob a forma de percentagem 12 Ap ndice Defini es do Instrumento COBAS MIRA GENERAL CALIBRATION MEASUREMENT MODE ABSORB CALIB INTERVAL ON REQUEST REACTION MODE R S SR1 STANDARD NONLINEAR CUP POS USER DEFINED CALIBRATION MODE STD NONLIN 1 0 2 50ngmL REAGENT BLANK NO BLANK 3 100 4 200 ng mL CLEANER 5 0 6 500 ng mL WAVELENGTH 840 nm 7 NO 8 NO DECIMAL POSITION 0 REPLICATE DUPL UNIT ng mL DEVIATION NO ANALYSIS CALC MODEL LOGIT LOG4 SAMPLE DIL NAME H20 CORRECTION STD NO POST DIL FACTOR NO CONTROL CONC FACTOR NO 081 POS NO SAMPLE CYCLE 1 082 POS NO VOL 36 0 pL DIL 39 0 pL CS3 POS NO REAGENT CYCLE 1 VOL 155 uL START REAGENT 1 CYCLE 4 VOL 75 0 pL DIL 20 0 pL CALCULATION SAMPLE LIMIT NO REAC DIRECTION INCREASE CHECK OFF ANTIGEN EXCESS NO CONVERS FACTOR 1 00000 OFFSET 0 00000 NORM RANGE LOW USER DEFINED HIGH USER DEFINED NUMBER OF STEPS 1 CALC STEP A KINETIC READINGS FIRST 11 LAST 22 REACTION LIMIT NO Nota a sensibilidade descrita para o Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 de 40 ng ml Defini es dos instrumentos COBAS MIRA 5 e COBAS MIRA Plus GENERAL CALIBRATION MEASUREMENT MODE ABSORB CALIB INTERVAL ON REQUEST REACTION MODE 1 STANDARD POS USER DEFINED CALIBRATION MODE LOGIT LOG4 0 2 5Ong mL REAGENT BLANK NO BLANK 3 100 4 200 ng mL CLE
35. o longo do tempo relativamente a 26 doentes 9 doentes submetidos transplante de cora o 6 de rim e 11 de f gado que n o experimentaram rejei o moderada ou grave nefrotoxicidade ou n veis s ricos de creatinina superiores a 2 mg dl Apesar de o limite superior normal para a creatinina s rica ser de aproximadamente 1 7 mg dl foi seleccionado o n vel de 2 mg dl para contemplar o facto de os doentes submetidos a transplante apresentarem n veis s ricos de creatinina elevados devido a uma combina o de factores incluindo o procedimento cir rgico e os efeitos de v rias drogas nefrot xicas A informa o constante na Tabela 3 resultou de uma medi o de ciclosporina em cada um dos per odos para cada doente testado durante o per odo de tempo Nem todos os doentes foram testados durante cada um dos per odos de tempo Tabela 3 N veis de ciclosporina ao longo do tempo em doentes que n o experimentaram rejei o nefrotoxicidade ou n veis s ricos de creatinina elevados Rim F gado Cora o 6 doentes 11 doentes 9 doentes Per odo N M dia DP N M dia DP N M dia DP de tempo doentes ng ml ng ml doentes ng ml ng ml doentes ng ml ng ml Semana 1 5 123 47 9 330 6 9 279 89 Semana 2 6 240 132 10 254 117 9 402 14 Semana 3 6 359 149 11 288 46 8 527 187 Semana 4 6 289 180 11 250 4111 9 386 2 M s 2 6 270 2 10 230 68 9 337 148 M s 3 6 205 11 276 4 8 343 226 M s 4 5 200 56 10 224 83 8 315 127
36. oga ug ml Droga ug ml Acetaminofeno 200 Cetoconazole 70 Albuterol 0 18 Lidoca na 60 Alopurinol 60 Lovastatina 4 Alprazolam 0 37 Metilprednisolona 12 Amitriptilina 20 Metoclopramida 4 Amfotericina B 20 cido micofen lico 100 Atenolol 40 Glicur nido do cido micofen lico 1000 Azatriopina 10 Misoprostol 0 015 Captopril 50 Sulfato de morfina 6 Carbamazepina 120 Muromonab CD3 1 Cefaclor 230 Naproxeno 1000 Cloranfenicol 250 Nitroglicerina 5 Cimetidina 100 Omeprazole 14 Ciprofloxacina 43 Fenobarbital 150 Ciclofosfamida 250 Fenito na 100 Digoxina 0 02 Piperacilina 8 Dipiridamol 25 Prazosina 3 Disopiramida 30 Prednisolona 12 Encainida 1050 Prednisona 12 Eritromicina 200 Prometazina 10 Etanol 3500 Ranitidina 200 Fluconazole 81 Rapamicina 0 1 Furosemida 20 cido Salic lico 500 Ganciclovir 400 Sulfametoxazol 400 Gentamicina 120 Tacrolimus 0 1 Heparina 8000 U I Teofilina 250 Hidralazina 32 Triantereno 2 8 Hidroclorotiazida 40 Trimetoprim 20 Imunoglobulina 5000 cido Valpr ico 500 Isoniazida 70 Vancomicina 630 Cloridrato de isoproterenol 0 06 A reactividade cruzada com os quatro principais metabolitos da ciclosporina foi avaliada na presen a de 200 ng ml de ciclosporina A percentagem de reactividade cruzada indicada na Tabela 8 foi determinada atrav s da subtrac o da concentra o real de ciclosporina 200 ng ml a partir da concentra o aparente de ciclosporina dividindo este valor pela concentra o de metabolito adicionad
37. omercial utilizado Consultar sec o 10 Valores esperados 4 Reagentes REF Descri o do produto Quantidade Volume 6RO19UL Ensaio espec fico de Ciclosporina Emit 2000 Reagente A Anticorpo 16 ml Anticorpos monoclonais de rato reactivos ciclosporina t nicotinamida adenina dinucle tido glicose 6 fosfato cloreto de s dio agente espessante surfactante e conservantes incluindo azida de s dio a 0 1 e sulfato de estreptomicina a 0 005 Reagente B Enzima 8ml Ciclosporina marcada com glicose 6 fosfato desidrogenase bacteriana Leuconostoc mesenteroides Tamp o Tris agentes espessantes estabilizadores e conservantes incluindo azida de s dio 0 1 e sulfato de estreptomicina 0 005 Diluente espec fico de ciclosporina Emit 2000 100 ml Tamp o Tris surfactante e conservantes incluindo azida de s dio 0 1 e sulfato de estreptomicina 0 005 6R119UL Calibradores espec ficos de ciclosporina Emit 2000 um frasco de consultar em baixo as concentra es 2 5 ml8 Ciclosporina sangue total humano e conservantes cinco frascos de incluindo azida de s dio 0 1 2ml Os reagentes e o diluente s o fornecidos como um conjunto correspondente N o devem ser trocados com componentes de kits com n meros de lote diferentes tA titula o do anticorpo e a actividade do conjugado enzim tico podem variar de lote para lote tNecess rio para utiliza o com o Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 Fornecido
38. r com a boca 4 Utilizar luvas descart veis e equipamento laboratorial de protec o adequado durante a manipula o das amostras e reagentes do kit Lavar abundantemente as m os ap s a utiliza o 5 Manipular sempre os materiais derivados humanos como se fossem potencialmente infecciosos Os calibradores e controlos deste kit cont m componentes do sangue humano Todos os lotes s o testados e s o negativos para anticorpos do v rus da imunodefici ncia adquirida humano HIV e Antig nio de Superf cie da Hepatite B HBsAg 6 O metanol que um material necess rio mas n o fornecido com o Ensaio espec fico da ciclosporina Emit 2000 e utilizado para extrair a ciclosporina das amostras inflam vel N o ingerir Evitar o contacto com a pele 7 Os componentes do ensaio cont m azida de s dio que pode reagir com as canaliza es de chumbo ou cobre formando azidas met licas altamente explosivas Depois de as solu es que cont m azida de s dio terem sido eliminados atrav s dos esgotos do laborat rio enxaguar com um grande volume de gua para prevenir a forma o de azidas 8 Este kit cont m sulfato de estreptomicina Eliminar de forma adequada Para utiliza o em diagn stico in vitro PRECAU ES Para a elimina o de quaisquer reagentes ou amostras remanescentes do kit consultar a regulamenta o local para a elimina o adequada de res duos m dicos 2 Fundamentos A ciclosporina um
39. renadante da amostra com o pipetador diluidor consultar o passo 7 Pode ser utilizado um nico tubo de capilaridade para dispensar todas as amostras calibradores e controlos desde que o exterior do cilindro de capilaridade e a ponta do mbolo sejam exaustivamente limpos entre a dispensa o de cada amostra com um pano de laborat rio humedecido apar ncia ligeiramente amarelada ou esverdeada mas n o deve apresentar se turvo Se o sobrenadante apresentar um aspecto turvo em repouso deve ser centrifugado novamente for a g x minutos gt 25 000 g min nota t cnica relativa ao passo 2 de cada calibrador controlo e ou amostra para 0 tubo de microcentr fuga etiquetado adequadamente utilizando uma pipeta de dispensa o positiva numa microcentrifugadora durante pelo menos dois minutos 3 Adicionar 200 ul consultar a primeira nota Deve ser utilizada uma pipeta de t cnica relativa ao passo 2 de metanol a dispensa o positiva ou um Repetidor cada um dos tubos de microcentr fuga Eppendorf para a dispensa o de metanol com uma pipeta de dispensa o positiva devido ao facto de a viscosidade do Tapar imediatamente todos os tubos metanol ser baixa em rela o da gua 4 Agitar no vortex cada uma dos tubos de e A agita o vortex pouco depois da microcentr fuga durante pelo menos dez adi o do metanol minimizar o tempo segundos necess rio para fracturar quaisquer part culas que se pos
40. res e controlos s o pr tratados com metanol O metanol efectua a lise das c lulas solubiliza a ciclosporina e precipita a maioria das prote nas do sangue As amostras s o centrifugadas sendo ent o dilu do um al quota do sobrenadante resultante contendo ciclosporina utilizando o Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 Esta solu o 6 ent o ensaiada utilizando os Reagentes A e B nos sistemas qu micos COBAS MIRAS COBAS MIRA 5 COBAS MIRA Plus N o existe qualquer intervalo terap utico s lido para a ciclosporina no sangue total A complexidade do estado cl nico as diferen as individuais na sensibilidade aos efeitos imunossupressivos e nefrot xicos da ciclosporina a co administra o de outros imunossupressores 0 tipo de transplante o tempo decorrido ap s o transplante e um conjunto de factores adicionais contribuem para requisitos diferentes em termos dos n veis sangu neos ptimos de ciclosporina Os valores individuais de ciclosporina n o devem ser utilizados como nico indicador para efectuar altera es do regime de tratamento Todos os doentes devem ser alvo de uma avalia o cl nica exaustiva antes de se efectuarem quaisquer ajustes no tratamento devendo os utilizadores do ensaio estabelecer os seus pr prios intervalos com base na experi ncia cl nica Estes intervalos variar o de acordo com o teste de diagn stico in vitro comercial utilizado Os intervalos devem ser estabelecidos para cada teste c
41. s Todavia se qualquer controlo apresentar um desvio consistente do ensaio em rela o aos seus limites tempor rios estabelecer novamente limites tempor rios de controlo repetindo os passos 1 a 5 referidos acima Se os desvios do controlo persistirem contactar um consultor t cnico para obter assist ncia Limites permanentes do controlo 1 Recolher resultados de controlo durante os 30 dias de calend rio um m nimo de 20 leituras em cada n vel em que os limites tempor rios do controlo estiverem a ser utilizados Recomenda se o teste dos controlos por ordem descendente N o eliminar qualquer resultado do controlo excepto se tiver sido produzido por erro do operador ou avaria do instrumento ou se o resultado do controlo pode ser rejeitado por um teste estat stico separado 2 Recalcular a m dia e o desvio padr o das concentra es do controlo para cada n vel incluindo todos os resultados recolhidos no Passo 1 e os nove resultados obtidos durante o estabelecimento dos limites tempor rios 3 Os limites permanentes do controlo devem ser estabelecidos em 2 25 DP da m dia conquanto estes limites n o sejam inferiores a 12 da m dia e n o sejam superiores a 25 em rela o m dia Se o DP de 2 25 em rela o m dia for inferior a 12 da m dia definir os limites permanentes do controlo em 12 da m dia Se o DP de 2 25 em rela o m dia for superior a 25 da m dia definir os limites permanentes do controlo
42. sam formar A mistura da amostra com o metanol deve apresentar se completamente homog nea imediatamente ap s a agita o no vortex 5 Incubar o conte do dos tubos de e Os tubos de microcentr fuga podem microcentr fuga temperatura ambiente incubar durante at uma hora ap s a 18 25 C durante pelo menos um agita o no vortex e antes da minuto ap s a conclus o agita o da centrifuga o ltima amostra no vortex 6 Centrifugar os tubos de microcentr fuga O sobrenadante pode apresentar uma 2 Verificar cada uma das execu es utilizando as seguintes instru es e Se os controlos se situarem dentro dos seus limites de controlo aceitar a execu o e Se qualquer dos controlos n o se situar dentro dos seus limites de controlo examinar todos os materiais confirmar que n o existe qualquer erro do operador ou avaria do instrumento e executar de novo esse controlo Se ap s a repeti o do teste o controlo se situar dentro dos seus limites de controlo aceitar a execu o e Seo controlo continuar a n o se situar dentro dos seus limites de controlo recalibrar Se ap s a recalibra o os controlos se situarem dentro dos seus limites de controlo aceitar a execu o e Se ap s a recalibra o qualquer dos controlos n o se situar dentro dos seus limites de controlo examinar todos os materiais confirmar que n o existe qualquer erro do operador ou avaria do instrumento e executar
43. terpretadas como pertinentes apenas para os reagentes e calibradores Intervalo de refer ncia O Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 quantifica as concentra es de ciclosporina em sangue total humano contendo 40 500 ng ml de ciclosporina Resultados quantitativos de at 1500 ng ml podem ser estimados por dilui o e nova execu o do ensaio com amostras de concentra o elevada e multiplicando depois os resultados pelo factor de dilui o consultar a Sec o 7 Procedimento Dilui o de amostras com concentra o elevada Sensibilidade A sensibilidade do Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 de 40 ng ml Este n vel representa a menor concentra o de ciclosporina que pode ser distinguida a partir dos O ng ml com um intervalo de confian a de 95 Especificidade Os compostos cuja estrutura qu mica ou uso terap utico concomitante possam sugerir uma poss vel interfer ncia foram testados Os compostos apresentados na Tabela 7 n o interferem com o Ensaio espec fico de ciclosporina Emit 2000 quando s o testados na presen a de 200 ng ml de ciclosporina Os n veis testados foram determinados de acordo com a directiva proposta pelo Comit Nacional de Padr es Laboratoriais Cl nicos National Committee of Clinical Laboratory Standards NCCLS relativa a estudos de interfer ncia Tabela 7 Drogas co administradas e metabolitos da droga que n o interferem N vel de ensaio N vel de ensaio Dr
44. va N de N de Local Declive Inter R SEE amostras doentes Xm d Ym d RIA vs Ensaio Emit Local 1 0 82 24 0 968 26 78 593 21 2699 2451 Local 2 0 91 4 0 934 4 1113 37 2651 6 Local 3 0 79 8 0 929 35 69 786 38 309 7 252 5 Local 4 0 84 13 0 981 24 56 1650 40 311 3 275 9 HPLC vs Ensaio Emit Local 1 1 02 24 0 965 25 39 595 21 2175 2449 Local 2 1 14 3 0917 39 71 1113 37 2057 231 9 Local 3 0 92 9 0 828 50 68 1030 38 277 7 2631 Local 4 1 05 12 0 975 25 33 1645 40 2526 277 HPLC vs RIA Local 1 1 24 0 0 976 23 66 595 21 220 1 272 7 Local 2 1 29 3 0912 4317 1045 37 207 9 265 3 Local 3 1 12 1 0 818 9 663 38 2795 3122 Local 4 1 24 1 0 977 26 38 1648 40 2526 5 Os dados de correla o apresentados na Tabela 10 representam os resultados de estudos efectuados num conjunto de laborat rios As diferen as nos dados estat sticos de correla o s o t picas das diferen as de laborat rio para laborat rio que podem ser observadas quando utilizado qualquer dos ensaios isolados ou uma combina o dos ensaios descritos Para converter valores entre m todos n o dever o ser utilizados estes dados de correla o nem quaisquer outros factores de correc o Qualquer compara o dos m todos dever ser efectuada apenas depois de ser atingida uma padroniza o cuidadosa dos m todos Recupera o A recupera o de ciclosporina foi avaliada utilizando sangue total isento de ciclosporina ao qual se adicionou ciclosporina ori
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