Simplexa™ EBV - Focus Diagnostics
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1. 6 controles positivos 7 N o misture os reagentes de lotes diferentes de kits ADVERT NCIAS E PRECAU ES 1 2 Para uso diagn stico in vitro Todo material de origem humana deve ser considerado potencialmente infeccioso Os materiais fonte incluindo os controles dos quais deriva este produto foram testados usando m todos aprovados pelo FDA para ant geno de superf cie de Focus Simplexa EBV P gina 3 o 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0 hepatite B anticorpo contra hepatite C e HIV 1 2 AIDS Embora esses testes tenham sido negativos nenhum m todo 100 eficaz em descartar a possibilidade de transmiss o desses ou de outros agentes infecciosos por produtos derivados de sangue humano Portanto todos os controles amostras de soro e equipamentos que entrarem em contato com as amostras devem ser considerados potencialmente infectantes e descontaminados ou descartados de acordo com procedimentos adequados para risco biol gico O CDC e os National Institutes of Health recomendam que os agentes potencialmente infecciosos sejam manuseados sob condi es de biosseguran a de n vel gler Ao lidar com os reagentes do kit use equipamentos de prote o pessoal tais como mas n o limitados a luvas e aventais de laborat rio Ao terminar os testes lave cuidadosamente as m os N o pipete com a boca N o fume n o beba n o coma n o manipule lentes de contato nem se maquil2. HTLV 1 JCW Parvovirus Toxoplasma gondii VZV CMV e BKV Al m disso os bancos de dados da sequ ncia de cido nucleico indicaram que os primers foram espec ficos para EBV e que n o apresentaram homologia significativa com outros pat genos ou com DNA humano INTERFER NCIAS O desempenho deste ensaio n o foi avaliado com subst ncias potencialmente interferentes O processo de extra o automatizado de cido nucleico com sistema MagNA Pure ou com NucliSENS easyMAG remove eficazmente as impurezas da amostra j que isola e lava os cidos nucleicos durante o processo de extra o Os controles internos alertam o usu rio final quanto potencial inibi o de PCR se todos os alvos e controle interno n o forem detectados o ensaio n o v lido CONTAMINA O POR CARREA O O transporte de amplifica o foi avaliado para o equipamento e para o Universal Disc usando outros testes Os estudos procuraram a presen a de contamina o em amostras negativas altas O estudo foi concebido colocando alternadamente uma amostra positiva forte e uma amostra negativa forte em cada disco A contamina o por carrea o foi avaliada comparando se a taxa de resultados negativos obtidos com a amostra negativa alta com a taxa esperada sob condi es de reprodutibilidade normais Em testes pr vios n o foi observado nenhum efeito de contamina o por carrea o REFER NCIAS 1 Zur Hausen H Schulte Holthausen H Klein G et al EBV DNA in
3. span gt em diagn stico humano in vitro contemplada por uma licen a concedida Focus Diagnostics Inc pela DxS Ltd Black Hole Quencher M CAL Fluor e Quasar M dyes s o marcas registradas da Biosearch Technologies Inc BTI As tecnologias Black Hole Quencher CAL Fluor e Quasar dye est o licenciadas gra as a um acordo com a BTI e estes produtos s o vendidos exclusivamente para fins de cl nica diagn stico ou pesquisa e desenvolvimento Focus REPRESENTANTE AUTORIZADO mdi Europa GmbH Langenhagener Str 71 30855 Langenhagen Hannover Alemanha INFORMA ES SOBRE PEDIDOS Telefone 800 838 4548 EUA 562 240 6500 Internacional Fax 562 240 6510 ASSIST NCIA T CNICA Telefone 800 838 4548 EUA 562 240 6500 Internacional Fax 562 240 6526 Visite nossa p gina na web www focusdx com Simplexa EBV P gina 11 Ce PI MOL2400 0US PT Rev FData da edi o 13 de dezembro de 2012 Focus Diagnostics Cypress Calif rnia 90630 EUA
4. 10 c pias mL N o se aplica EBV detectado acima do ULoQ Upper Limit of Quantitation N o detectado N o detectado Resultado inv lido realizar nova extra o e repetir o ensaio 3 Resultado da valida o de amostras Uma amostra ser considerada validada se atender aos tr s crit rios abaixo 1 EBV n o detectado e IC detectado 2 EBV detectado Um resultado positivo para EBV n o requer detec o de IC 3 As curvas de amplifica o devem ser analisadas para cada resultado sobretudo se houver uma mensagem Data Quality qualidade dos dados Uma curva de amplifica o v lida exibe um crescimento exponencial progressivo Consulte o manual do operador sobre as a es recomendadas LIMITA ES ii 2 Os analistas devem ser treinados e ficarem familiarizados com os procedimentos do teste e a interpreta o dos resultados antes de executarem o teste O aplicativo Integrated Cycler Studio armazena o ltimo arquivo de calibra o v lido usado para quantificar amostras de pacientes Os padr es de quantifica o e as amostras de pacientes devem ser extra das usando se a mesma metodologia de extra o ou o ensaio pode produzir resultados incorretos Ao se monitorar um paciente o m todo de extra o usado para preparar a determina o inicial da amostra deve ser usado para todas as determina es subsequentes Todos os resultados deste e de outros testes devem ser correlacionados com o quadro c
5. biopsies of Burkitt s tumors and anaplastic carcinomas of the nasopharynx Nature 1970 228 1056 8 2 Weiss LM Movahed LA Warnke RA et al Detection of Epstein Barr virus genomes in Reed Sternberg cells of Hodgkin s disease N Engl J Med 1989 320 502 6 3 Herbert H Steinbecher E Niedobitek G et al Distribution and phenotype of Epstein Barr virus harboring cells in Hodgkin s disease Blood 1992 80 484 91 4 KhanG Norton AJ Slavin G Epstein Barr virus in Hodgkin s disease Relation to age and subtype Cancer 1993 1 3124 9 5 Young LS Dawson CW Clark D et al Epstein Barr virus gene expression in nasopharyngeal carcinoma J Gen Virol 1988 69 1051 65 6 Hanto DW Frizzera G Gajl Peczalska KJ et al The Epstein Barr virus in the pathogenesis of post transplant lymphoma Transplant Proc 1981 13 756 60 7 Hanto DW Frizzera G Gajl Peczalska KJ et al Epstein Barr virus induced B cell lymphoma after renal transplantation Acyclovir therapy and transition from polyclonal to monoclonal B cell proliferation N Engl J Med 1982 306 913 8 8 Borisch B Gatter KC Tobler A et al Epstein Barr virus associated anaplastic large cell lymphoma in renal transplant recipients Am J Clin Pathol 1992 98 312 8 9 Cinque P Brytting M Vago L et al Epstein Barr virus DNA in cerebrospinal fluid from patients with AIDS related primary lymphoma of the central nervous system Lancet 1993 342 398 401 10 Arribas JR Clifford DB Fichtenbaum C
6. o de polipropileno e de tamanho adequado Volumes da mistura reativa Volumes de mistura Volumes de mistura Reagente reativa reativa para 1 rea o para 10 rea es SimplexaTM Master Mix 4 0 ul 40 ul Simplexa EBV Primer Mix 1 0 ul 10 ul Volume Total 5 0 ul 50 ul Misture suavemente a mistura reativa por invers es ou por 8 a 10 pipetagens Centrifugue brevemente para decantar o conte do na parte inferior do tubo Configure a PCR Ap s o preparo da mistura reativa use a em at uma hora Armazene a mistura reativa entre 2 e 8 C se o PCR n o for preparado imediatamente ap s a prepara o da mistura reativa E REA DE AMPLIFICA O POR PCR EM TEMPO REAL Prepare o disco universal de 96 cavidades para o teste Simplexa M EBV em uma rea separada Consulte o exemplo de disposi o do disco na Se o C ao executar a seguinte configura o Adicione 5 0 ul da mistura reativa em cada cavidade Adicione 5 0 ul dos controles positivos extra dos cavidade HPC e LPO Adicione 5 0 ul da amostra extra da do paciente cavidade S apropriada Adicione 5 0 ul do No Template Control cavidade NTC Cubra o disco com a Universal Disc Cover Tape Fita de Cobertura de Disco Universal Abra a tampa do Integrated Cycler Coloque o Universal Disc selado sobre a plataforma Feche a tampa com cuidado Clique em Run Efetuar corrida 10 Clique em Start Iniciar F AN LIS
7. E DE DADOS 1 Ao t rmino da sequ ncia clique em Analyze Analisar 2 Escolha os dyes corantes um de cada vez ou selecione todos os corantes canais marcando a caixa de sele o ao lado de cada corante 3 Pressione o bot o Print Preview Visualizar impress o na parte inferior direita para rever um resumo dos valores preditivos Marque a caixa de sele o Include Graphs Incluir gr ficos para visualizar os gr ficos de amplifica o Marque a caixa de sele o Include Calibration Result Incluir resultado de calibra o para incluir o relat rio de O5 ON 03 O 00 N D ge ON Simplexa EBV P gina 6 calibra o associado sequ ncia de previs o Role p gina por p gina utilizando os bot es de setas existentes no canto esquerdo superior da janela Print preview Visualizar impress o 4 Imprima ou Salve o relat rio conforme necessitar 5 Exporte os valores preditivos se necess rio CONTROLE DE QUALIDADE Cada laborat rio deve estabelecer suas pr prias faixas de controle de qualidade e a frequ ncia de execu o dos testes de controle de qualidade tendo como base as leis e regulamentos locais aplic veis bem como as boas pr ticas padr o de laborat rio COMO RELATAR OS RESULTADOS 1 Teste de validade Para verificar se a sequ ncia foi v lida observe os resultados de EBV e Internal Control IC do Low Positive Control LPC High Positive Control HPC e No Template Control NTC Uma sequ ncia s
8. Extra o Sample ID ID da Digitar nome da amostra amostra Request Solicita o Generic 2 0 1 ou equivalente Volume ml 0 100 Eluate Elu do ul 25 Type Tipo Primary Prim ria Priority Prioridade Normal Matrix Matriz Other Outros Crie a sequ ncia de extra o no NucliSENS easyMAG conforme descrito no Manual do Usu rio Agite em v rtex as amostras LPC e HPC por 2 a 4 segundos e centrifugue rapidamente para depositar o conte do na parte inferior do tubo Pipete 100 ul da amostra LPC HPC ou NTC no s recipiente s de amostra Agite a IC no v rtex brevemente duas vezes e centrifugue rapidamente para depositar o conte do na parte inferior do tubo Pipete 5 ul de IC nas cavidades com amostras e nas cavidades de controle usando uma ponteira separada para cada amostra Coloque o s recipiente s com amostra s o material descart vel usado para aspira o e os reagentes no easyMAG de acordo com as instru es no Manual do Usu rio Inicie a lise no equipamento e incube as amostras lisadas por dez minutos antes de adicionar a mistura com s lica magn tica Durante o per odo de incuba o e lise prepare e mistura de s lica magn tica Misture a s lica e dilua em gua sem nuclease misturando 1 parte de s lica magn tica para cada 1 partes de gua sem nuclease p ex 540 ul de s lica magn tica 540 ul de gua sem nuclease Prepare pelo menos 135 ul de mistura de s lica magn tica po
9. J et al Detection of Epstein Barr virus DNA in cerebrospinal fluid for diagnosis of AIDS related central nervous system lymphoma J Clin Microbiol 1995 33 1580 1588 11 Gaillard F Mechinaud Lacroix F Papin S et al Primary Epstein Barr virus infection with clonal T cell Iymphoproliferation Am J Clin Pathol 1992 98 324 33 12 Jones JF Shurin S Abramowsky C et al T cell lymphomas containing Epstein Barr viral DNA in patients with chronic Epstein Barr virus infections N Engl J Med 1988 318 733 41 13 Telenti A Epstein Barr virus and lymphoproliferative disorders basic concepts and diagnostic approach Clin Immunol Newsl 1991 11 81 88 14 Au W Y et al Quantification of circulating Epstein Barr virus EBV DNA in the diagnosis and monitoring of natural killer cell and EBV positive lymphomas in immunocompetent patients Blood 1 July 2004 _ Volume 104 Number 1 243 249 15 Cornelissen J Molecular monitoring of EBV positive lymphoma Blood 1 July 2004 _ Volume 104 Number 1 9 16 NCCLS H18 A2 Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens Approved Guideline 2nd Ed 17 CDC NIH Manual 1999 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4th ed And National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of Laboratory Workers from Instruments Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue NCCLS M29 A A utiliza o de sondas Scorpions lt span gt B lt
10. O volume de dilui o deve ser zero para todas as amostras Gu Go Focus Simplexa EBV P gina 4 No 11 12 13 14 Verifique se o Post Elution Protocol est em None Verifique se as amostras e os controles est o posicionados corretamente no cartucho de amostra Agite em v rtex as amostras LPC e HPC por 2 a 4 segundos e centrifugue rapidamente para depositar o conte do na parte inferior do tubo Pipete 200 ul de cada amostra LPC HPC e NTC na posi o correspondente no cartucho de amostra Inspecione visualmente o n vel de amostra e dos controles no cartucho de amostra para verificar se a s amostra s foram adicionadas Agite brevemente o DNA de controle para extra o e quantifica o IC no v rtex duas vezes e centrifugue rapidamente para depositar o conte do na parte inferior do tubo Para cada conjunto de 16 amostras amostras 1 a 16 pipete 100 ul da IC em 6 ml de tamp o de lise em um tubo c nico Agite brevemente em v rtex para misturar Coloque o na bandeja apropriada do equipamento de extra o MagNA Pure o Por exemplo se forem extra das mais de 16 amostras 17 32 amostras pipete 200 ul de IC em 12 ml de tamp o de lise em um tubo c nico Agite brevemente em v rtex para misturar Coloque o na bandeja apropriada do equipamento de extra o MagNA Pure Coloque o cartucho de amostra no extrator MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid e inicie a sequ ncia de extra o Ao final d
11. Simplexa EBV MOL2400 Rev F Um ensaio de PCR em tempo real para a quantifica o in O l S vitro do v rus de Epstein Barr EBV Diagnostics Para uso diagn stico in vitro APLICA O O ensaio Simplexa EBV da Focus Diagnostics destina se quantifica o in vitro de cidos nucleicos do v rus de Epstein Barr EBV em amostras de sangue total usando o ciclador 3M Integrated Cycler O ensaio foi concebido para uso em conjunto com a avalia o do quadro cl nico e de outros marcadores laboratoriais da doen a visando ao tratamento cl nico de pacientes infectados com EBV O ensaio n o foi concebido para triagem de doadores RESUMO E EXPLICA O O v rus de Epstein Barr EBV um herpesv rus humano de ampla dissemina o com tropismo por linf citos B o agente causador da mononucleose infecciosa e fortemente associado v rias malignidades humanas A infec o por EBV comum e geralmente subcl nica ou se apresenta como uma doen a autolimitante com dura o de 2 a 3 semanas Como um membro da fam lia de herpes o EBV pode permanecer latente por longo per odos e voltar ser ativado em um est gio posterior Embora a infec o inicial possa resultar em uma s ndrome relativamente benigna a reativa o em uma pessoa imunocomprometida pode causar resultados mais graves EBV nucleic acids or proteins have been identified in tissues affected by Burkitt s lymphoma Hodgkin s disease nasopharyngeal carcinom
12. a transplantation related ac disorders AIDS related primary central nervous system lymphoma and other B and T cell lymphomas Os m todos de diagn stico convencionais raramente s o teis na avalia o dos dist rbios relacionados ao EBV em pacientes imunossuprimidos A cultura n o pr tica nem til para fins cl nicos e a sorologia dif cil de interpretar em uma situa o de imunossupress o13 Os m todos de diagn stico baseados na rea o em cadeia da polimerase PCR oferecem a possibilidade de uma detec o apropriada do EBV a partir de amostras O monitoramento da carga viral de EBV pode ajudar a identificar os dist rbios linfoproliferativos p s transplantes bem como linfomas em pacientes com s ndrome da imunodefici ncia adquirida PRINC PIOS DO PROCEDIMENTO O teste consiste um sistema de amplifica o e detec o por PCR em tempo real com um primer sonda fluorescente bifuncional que detecta o DNA do v rus de Epstein Barr no sangue total O teste realizado em duas etapas principais 1 extra o de DNA de amostras do paciente e 2 aplica o de um primer sonda fluorescente bifuncional e um primer reverso para amplificar um segmento espec fico para an lise tanto no analito como em um controle interno O ensaio fornece um resultado uma regi o bem conservada do gene Lmp2A do genoma do EBV que permite identificar DNA viral na amostra O processo de extra o monitorado por um controle interno qu
13. a extra o de cidos nucleicos o cartucho com os controles extra dos e as amostras do paciente podem ser extra das do MagNA Pure e seladas Armazene o DNA extra do entre 2 C e 8 C antes de us lo Recomenda se n o armazenar amostras a esta temperatura por per odos prolongados Mantenha as amostras de DNA extra do em um bloco de refrigera o enquanto carregar o disco Extra o pelo m todo bioM rieux NucliSENSO easyMAG 1 2 10 11 O Manual de Instru es NucliSENSO easyMAG cont m instru es sobre como usar o equipamento e o software Selecione o template Generic no software NucliSENS easyMAG com as seguintes configura es Default Request Generic 2 0 1 ou equivalente Solicita o padr o Run Name Prefix Prefixo conforme apropriado do nome da sequ ncia Sample ID prefix Prefixo conforme apropriado da ID da sequ ncia Sample Type Tipo de Prim ria amostra Workflow Defaults On board lysis Incubation Incuba o de lise on board Padr es da sequ ncia On board Silica Incubation Incuba o de s lica on board Sample Addition Guidance Off Instru o para Adi o de Amostra Desligado Reagent Tracking Lysis Silica Internal Control reagent tracking disabled Rastreamento de reagente de Rastreamento de lise s lica controle interno desabilitado reagentes Digite as seguintes informa es sobre amostras individuais na tela Extraction Request Solicita o de
14. de detec o LoD um agregado m dio aproximadamente 8 a 10 vezes o LoD e um agregado elevado limite superior do ensaio Al m disso cada n vel do padr o de quantifica o extra do de um lote do conjunto de Padr es de Focus Simplexa EBV P gina 8 Quantifica o QS n 5 foi inclu do no painel Os resultados de reprodutibilidade para cada amostra do painel est o apresentados na tabela abaixo Reprodutibilidade do Simplexa M EBV Desvio Padr o No de Concentra o M dia M dia dos Resultados Entre Nome da Esperada geom trica logaritmos Mensur vei Equipamen Entre sequ nc amostra c pias ml c pias ml c pias ml s tos Dias ia 3 N o NTC 0 N o detectado d testado HPC 2 13 x 10 1 97 x 10 5 29 80 0 17 0 03 0 02 LPC 4 66 x 10 5 67 x 10 3 75 80 0 19 0 02 0 03 QS 1 3 61 x 10 3 66 x 10 8 56 80 0 21 0 07 0 00 QS 2 3 91 x 10 4 55 x 10 6 66 80 0 18 0 05 0 01 QS 3 4 02 x 10 5 01 x 10 4 70 80 0 21 0 03 0 01 QS 4 4 72 x 10 5 85 x 10 3 77 80 0 20 0 03 0 02 QS 5 1 03 x 10 1 42 X 10 3 15 49 0 12 0 00 0 01 Agregado 1 0x 107 1 55 x 10 8 19 67 0 25 0 13 0 13 elevado Agregado m dio RR 3 6x 10 4 23 x 10 0 35 0 13 alxo Agregado E N o negativo Mag oetectaco detectado 0 N o se aplica 9 0 x 10 9 41 x 10 80 0 26 0 17 N o se aplica SENSIBILIDADE ANAL TICA E LIMITE DE DETEC O O limite d
15. e detec o LoD foi calculado com amostras criadas artificialmente de uma solu o de estoque com uma cepa quantificada de EBV usada para inocular matriz clinicamente negativa de sangue total O painel incluiu uma amostra negativa matriz n o semeada e amostras com concentra es variadas com dilui es seriadas em torno do LoD aproximado Vinte e quatro 24 replica es de tr s 3 diferentes extra es e sequ ncias de PCR para cada n vel foram analisadas por an lise de probitos para determinar a menor concentra o detect vel com exatid o com 95 de probabilidade O protocolo do LoD foi executado para cada um dos dois m todos de extra o Os valores individuais de LoD s o apresentados na tabela abaixo O LoD para o ensaio EBV baseado no LoD mais elevado para ambos os m todos de extra o foi determinado como 900 c pias ml Sangue Total MagNA Pure easyMag M O E LINEARIDADE A linearidade foi determinada a partir de amostras obtidas de uma solu o de estoque contendo uma cepa quantificada de EBV usada para inocular matriz clinicamente negativa de sangue total O painel consistia em pelo menos 10 agregados de c pias conhecidas em todo o intervalo onde se esperava desempenho linear Nos agregados pelo menos tr s concentra es estavam pr ximas do limite inferior de quantifica o LLOQ duas estavam pr ximas do limite superior de quantifica o ULOQ e as restantes apresentaram distribui o aproximadamente
16. e em reas em que s o usados os reagentes do kit e ou amostras de seres humanos Descarte todos os reagentes do kit e as amostras provenientes de seres humanos que n o foram utilizados de acordo com as normas locais estaduais e federais O fluxo de trabalho no laborat rio deve ser realizado de forma unidirecional come ando pelas reas de pr amplifica o e chegando at rea de amplifica o detec o A sequ ncia de eventos entre a extra o da amostra e a amplifica o por PCR em tempo real a seguinte e Extra o da amostra configura o do equipamento de PCR em tempo real preparo dos reagentes e amplifica o por PCR em tempo real e N o utilize suprimentos e equipamentos nas reas dedicadas a extra o e ao preparo de amostras N o recomend vel nenhum movimento cruzado entre as diferentes reas e Os suprimentos e equipamentos utilizados para o preparo de amostras n o devem ser usados para atividades de prepara o de reagentes nem para o processamento de DNA amplificado ou de outras fontes de cido nucleico alvo e Todos os suprimentos e equipamentos de amplifica o devem ser mantidos na rea reservada ao equipamento de PCR em tempo real e Os equipamentos de prote o pessoal tais como aventais de laborat rio e luvas descart veis devem ser espec ficos de cada rea A contamina o de amostras de pacientes ou de reagentes pode originar resultados errados Empregue t cnicas ass pticas P
17. e tamb m detecta eventuais inibi es da rea o de PCR Os sinais de amplifica o obtidos das amostras s o comparados a uma curva de calibra o e quantificados MATERIAIS FORNECIDOS O kit Simplexa EBV da Focus Diagnostics cont m quantidades de reagentes suficientes para 100 rea es Descri o do Kit Nome do Componente S mbolo da CE Abrevia o Cor da N mero Rea es poi Volume no R tulo do Nome tampa de rasco ou ki por frascos Frasco Simplexa EBV Primer Mix A PM _ Marom 2 50100 sou Simplexa Master Mix MOL2000 B MM Verde 2 50100 2004 Simplexa Extraction amp Amplification Control DNA Simplexa EBV Low Positive Control Simplexa M EBV High Positive Control MOL2403 Descri o do componente Simplexa EBV P gina 2 Componente Descri o Primers fluorescentes marcados com corante para quantifica o de EBV e controle interno Fluor foro da Alvo sonda Excita o Emiss o Gene alvo Simplexa M EBV Primer Mix PM Mistura de Corante primers EBV FAM 495 nm 520 nm Gene Lmp2A a Gene de A Controle interno Q670 644 nm 670 nm thaliana Simplexa Master Mix MM Mistura de reagentes DNA polimerase tamp o e desoxinucleot deos trifosfato ANTPs Simplexa Extraction amp Amplification Control DNA IC DNA de controle para extra o e amplifica o Fragmento de DNA com 577 pares de bases derivado do gene que codif
18. entes com amostra do instrumento Se n o for usar imediatamente as amostras coloque as em tubos separados para reduzir as chances de a s lica magn tica cair de volta na amostra Armazene o DNA extra do entre 2 C e 8 C antes de usar Recomenda se n o armazenar amostras a esta temperatura por per odos prolongados Mantenha o DNA extra do em um bloco de refrigera o ao carregar o disco C CONFIGURA O DO EQUIPAMENTO DE PCR EM TEMPO REAL 1 O Manual do Operador do Integrated Cycler cont m instru es sobre como configurar o programa Integrated Cycler Studio e incluir defini es de ensaios programar e analisar sequ ncias no equipamento Nota Antes de iniciar corridas de previs o deve se obter uma curva padr o v lida sequ ncia de calibra o D REA DE PREPARO DOS REAGENTES rea dedicada ao preparo da mistura de reagente do ensaio Simplexa EBV 1 Descongele a mistura de primers e a mistura de reagentes em temperatura ambiente entre 18 e 25 C aproximadamente Cada frasco de componente do kit cont m quantidade suficiente de reagentes para 50 rea es Antes de cada uso misture suavemente por meio de 6 a 8 invers es os componentes da mistura de primers e da mistura de reagentes e centrifugue rapidamente para precipitar os conte dos no fundo do tubo 2 Pipete o volume de cada componente conforme indicado na tabela a seguir para preparar o volume necess rio da mistura reativa em um tubo de microcentrifuga
19. ica a unidade maior da ribulose 1 5 bisfosfato carboxilase oxigenase N metiltransferase da planta Arabidopsis thaliana Simplexa M EBV Low Positive Control LPC Controle positivo baixo EBV inativado em matriz de base humana Simplexa EBV High Positive Control HPC Controle positivo alto EBV inativado em matriz de base humana Simplexa M EBV Barcode Card Cart o de c digo de barras Par metros espec ficos do teste MATERIAIS NECESS RIOS MAS N O FORNECIDOS 1 Padr es de Quantifica o SimplexaTM EBV REF MOL2410 2 Ciclador 3M Integrated Cycler com o aplicativo Integrated Cycler Studio vers o 3 0 ou superior 3 Universal Discs para uso com o ciclador integrado 4 Fita de cobertura de disco universal 5 Sistema Roche MagNA Pure LC e material de consumo associado 6 Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit Roche Cat N 03038505001 7 Equipamento bioM rieux NucliSENSO easyMAG e material de consumo e reagentes associados 8 Pipeta multicanal Biohit bioM rieux 9 Placa em tira para ELISA 10 Micropipeta s individual is do tipo multicanal e ou de repeti o com exatid es entre 1 10 ul 10 100 ul e 100 1 000 ul 11 Freezer degelo manual a temperaturas entre 10 e 30 C para o armazenamento dos componentes congelados do kit 12 Refrigerador a temperaturas entre 2 C e 8 C para amostras e componentes descongelados do kit 13 Capela de biossegura
20. ipete e manuseie cuidadosamente os reagentes para evitar misturar amostras entre cavidades adjacentes Empregue t cnicas de pipetagem apropriadas e mantenha sempre o mesmo padr o de pipetagem ao longo de todo o procedimento para garantir valores exatos e reprodut veis N o substitua nem misture reagentes de diferentes lotes do kit e nem com os de outros fabricantes N o troque as tampas dos tubos de reagentes Isso pode causar contamina o e comprometer os resultados do teste Utilize exclusivamente o protocolo descrito neste folheto Digress es do protocolo ou o uso de intervalos de tempo ou de temperaturas que n o os especificados podem originar resultados errados A configura o do teste deve ser realizada temperatura ambiente entre 18 a 25 C aproximadamente Enquanto estiver misturando os reagentes mantenha as enzimas resfriadas atrav s do uso de um bloco de resfriamento N o reutilize Discos universais j expostos a reagentes ou a amostras de pacientes Descarte os discos usados sem destacar a fita de cobertura Se diferentes kits ou lotes de SimplexaTM forem usados no mesmo disco necess rio testar os controles positivos e o controle sem DNA de cada kit A mistura de reagentes cont m mais que 1 de glicerol o que pode causar irrita o quando inalada ou em contato com a pele Se ocorrer inala o ou contato com a pele deve se tomar medidas de primeiros socorros A armazenagem prolongada de amostras extra da
21. l nico dados epidemiol gicos e outras informa es dispon veis ao cl nico respons vel pelo paciente A preval ncia da infec o afeta o valor preditivo do teste Focus Simplexa EBV P gina 7 Q Como em outros testes os resultados negativos n o descartam a infec o por EBV 7 Os resultados falsos negativos podem ocorrer quando o organismo infectante apresenta muta es inser es dele es rearranjos gen micos ou quando o teste for realizado em fases muito precoces da doen a 8 Os resultados falsos negativos podem ocorrer se o n mero de microorganismos presentes na amostra for inadequado em virtude de coleta transporte ou manuseio inadequados 9 Como acontece com outros testes podem ocorrer resultados falsos positivos Em algumas circunst ncias poder ser indicada a repeti o do teste ou a execu o do teste com outro dispositivo 10 O desempenho desse teste n o foi estabelecido para uso em triagem de doadores 11 O desempenho deste teste n o foi estabelecido com medica es potencialmente interferentes no tratamento da mononucleose infecciosa 12 Este teste n o exclui a presen a de doen as causadas por outros pat genos bacterianos ou virais CARACTER STICAS DE DESEMPENHO COMPARA O ENTRE M TODOS Um local interno de testes participou do Estudo de Concord ncia Cl nica Foram gerados resultados de refer ncia usando um teste desenvolvido em laborat rio LDT Laboratory Developed Test de a
22. lto desempenho Um total de 56 amostras de sangue total foi obtido de uma combina o de amostras coletadas prospectivamente que foram testadas no local de coleta para detec o ou quantifica o de EBV As amostras foram extra das com o m todo de extra o MagNA Pure As amostras inclu das na an lise estavam de acordo com o intervalo de resultado combinado do LDT e ensaio Simplexa EBV A regress o de Passing Bablok obteve uma inclina o de 0 82 e um vi s consistente de 0 44 M todo de compara o Simplexa EBV Regress o de Passing Bablok Linha Reg P B 0 44 0 82 X IC 95 para Intercep o 0 1250 0 7401 IC 95 para Inclina o 0 7507 0 8920 n 56 Coeficiente de Correla o R 0 96 E o o SA 5 D gt m Lu o x o Q E D o c o O 4 5 Conc LDT EBV Log10 C pias ml Conc Simplexa EBV Log10 C pias ml Adequa o Ref Linha Identidade Test P B REPRODUTIBILIDADE O estudo de reprodutibilidade foi realizado em dois sistemas um operador por sistema quatro repeti es de cada amostra do painel por sequ ncia duas sequ ncias por dia durante cinco dias As amostras do painel de reprodutibilidade consistem em amostras de sangue total semeadas com concentra es vari veis de uma cepa de EBV O painel cont m controles NTC HPC e LPC um agregado negativo sangue total n o semeado um agregado baixo semeado na concentra o de aproximadamente 2 a 4 vezes o limite
23. n a fluxo laminar para processamento de amostras 14 Microcentr fuga 15 Misturador de v rtex 16 Ponteiras para micropipetadores est reis descart veis que n o contenham RNase DNase com prote o contra aeross is 17 Suportes e tubos de polipropileno de 1 5 ml para microcentr fuga tubos sem RNase Dnase s o recomendados mas n o obrigat rios 18 Luvas descart veis sem talco 19 gua sem nuclease para extra o e como Controle sem molde NTC No Template Control 20 Suportes de resfriamento para tubos de microcentr fugas de 1 5 ml Para uso com o m todo de extra o Roche MagNA Pure LC Para uso com o m todo de extra o bioM rieux easyMAG VALIDADE E MANUSEIO Ap s adicionar a mistura de reagentes use a mistura dentro de uma hora Armazene a mistura reativa entre 2 e 8 C at Ap s descongelar armazene a mistura de primers a mistura de reagentes e o DNA de controle para extra o e amplifica o N o recongele a mistura de primers a mistura de reagentes o DNA de controle para extra o e amplifica o e nem os 1 Armazene os reagentes a temperaturas entre 10 e 30 C n o utilize congeladores do tipo frost free 2 Antes do uso deixe os reagentes descongelarem temperatura ambiente entre 18 e 25 C aproximadamente 3 N o utilize os kits nem os reagentes fora das datas de validade 4 estar pronto para preparar o PCR 5 e o controle sem DNA entre 2 e 8 C por um prazo m ximo de 30 dias
24. r amostra Focus Simplexa EBV P gina 5 12 Para transferir a mistura de s lica para as cavidades na tira de ELISA misture a s lica magn tica utilizando uma ponteira no modo de opera o P2 da pipeta Biohit Pressione Start para aspirar 1050 ul da mistura de s lica magn tica e Start novamente para dispensar a primeira parte de volta no tubo de mistura de s lica Pressione Start para dispensar 125 ul da mistura de s lica magn tica em 8 cavidades individuais da tira de ELISA Repita conforme necess rio para novas placas ELISA 13 Ap s incuba o de lise por 10 minutos use a pipeta Biohit com 8 ponteiras para uma tira de ELISA e no modo de opera o P3 para transferir 100 ul da mistura de s lica magn tica a cada amostra do recipiente de amostras Coloque as ponteiras nas cavidades da tira de ELISA e pressione Start para misturar e aspirar a mistura de s lica magn tica 14 Coloque a mistura de s lica magn tica nos recipientes apropriados e posicione a s ponta s da s pipeta s nas amostras abaixo do n vel do l quido Pressione Start para aspirar dispensar e misturar 3 vezes a s lica magn tica e as amostras Mantenha as pontas das pipetas abaixo do n vel do l quido para garantir a mistura correta 15 Repita as etapas 13 e 14 para os outros recipientes com amostras 16 Ap s adicionar s lica magn tica a todos os recipientes com amostra inicie a sequ ncia de extra o 17 Ao final da sequ ncia retire os recipi
25. s entre 2 C e 8 C n o recomendada pois n o se sabe quais s o os efeitos desse procedimento no desempenho do teste N o utilize o kit se a embalagem ou o conte do estiver quebrado ou danificado e entre em contato com a Focus Diagnostics As informa es para contato est o na ltima p gina deste documento INSTRU ES DE USO A COLETA DE AMOSTRAS O tipo de amostra aceit vel o sangue total colhido por pun o venosa N o use tubos de coleta com o anticoagulante heparina pois a heparina inibe a PCR REA DE EXTRA O DE AMOSTRAS O DNA deve ser extra do das amostras e controle em uma rea separada A amostra deve ser preparada para extra o em uma capela de biosseguran a Extra o pelo m todo Roche MagNA Pure LC 1 O DNA de amostras de pacientes e de controles do ensaio deve ser extra do com o kit Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid Kit usando o extrator Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor Para obter informa es sobre como utilizar o kit consulte as instru es fornecidas pelo fabricante 2 No menu suspenso Protocol Protocolo do MagNA Pure LC System selecione Total NA e depois Total NA Variable elution volume bIk na lista As configura es apropriadas para a sequ ncia ser o carregadas O protocolo de amostra deve ser Total NA Variable elution volume O volume da amostra Sample Volume deve ser de 200 ul e o volume de elui o deve ser de 50 ul
26. ser v lida se os tr s controles atenderem aos crit rios de aceita o Se uma sequ ncia for considerada inv lida todas as amostras dever o ser retestadas Crit rios de aceita o Extraction amp Amplification Control DNA IC No Template Control NTC N o detectado Detectado Low Positive Control LPC Dentro da toler ncia indicada na N o aplic vel documenta o do lote High Positive Control HPC Dentro da toler ncia indicada na no e Parao NTC ser considerado aceit vel os resultados devem ser EBV Not Detected e IC Detected A detec o de EBV no NTC significa que as amostras podem ter sido contaminadas durante o processamento e Para o LPC ser considerado aceit vel os resultados devem ser EBV Detected e LPC dentro dos limites de toler ncia indicados na documenta o do lote O resultado do IC pode ser Detected mas isto n o obrigat rio e Para o HPC ser considerado aceit vel os resultados devem ser EBV detected e HPC dentro dos limites de toler ncia indicados na documenta o do lote O resultado do IC pode ser Detected mas isto n o obrigat rio 2 Interpreta o dos Resultados Interpreta o dos Resultados Exemplo Valor de EBV Valor de IC Interpreta o N o detectado Detectado EBV n o detectado lt 900 c pias ml N o se aplica EBV detectado abaixo do LLoQ Lower Limit of Quantitation X c pias ml N o se aplica EBV detectado a uma concentra o espec fica gt 8 07 x
27. uniforme entre o LLOQ e o ULOQ Cada amostra foi testada aleatoriamente em pelo menos tr s replica es O protocolo do linearidade foi executado em cada um dos dois m todos de extra o Os valores individuais da faixa report vel s o apresentados na tabela abaixo Sangue Total MagNA Pure easyMag Simplexa EBV P gina 9 Concentra o Simplexa EBV Log1 O C pias m l 10 30 0 so 60 70 Concentra o Esperada Simplexa EBV Log10 C pias ml Equa o de Regress o Log Simplexa EBV 0 370351 0 965335 Log Expected EBV 5 Ro s a S E 3 o w o x v o E 99 g m Q e o S 30 0 so 60 70 Concentra o Esperada Simplexa EBV Log10 C pias ml Equa o de Regress o Log Simplexa EBV 0 216626 0 969417 Log Expected EBV INTERVALO DE RESULTADO Os dois m todos de extra o foram lineares at 8 07 x 1088 c pias ml A faixa report vel do ensaio foi baseada no m todo de extra o com o valor mais elevado para o limite inferior de quantifica o da faixa linear Amostras abaixo da faixa linear ser o descritas como lt 900 c pias ml e as amostras acima da faixa linear ser o descritas como gt 8 07 x 1088 c pias ml REATIVIDADE ANAL TICA REATIVIDADE CRUZADA Focus Simplexa EBV P gina 10 Os estudos indicaram que os primers s o espec ficos para EBV e n o apresentaram rea o cruzada com outros v rus ou bact rias HBV HCV HIV 1 HIV 2 HSV 1 HSV 2 HHV 6 HHV 7 HHV 8
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