Guida per l`utente di HiSeq 1500
Contents
1. 0 0000 28 Caricamento di una cella a flusso 0 000000000000000 aaa aoaaa adoa a aonana 38 MONITO Tella corsa 2 lica nie ei AAA ice 44 etica nn all gni rra reia Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 7 9 g oJoydeo Esecuzione di una corsa HiSeq v4 Introduzione Per eseguire una corsa HiSeq v4 su HiSeq 1500 preparare tutti i reagenti per la corsa e attenersi ai suggerimenti del software per impostare la corsa La procedura per l impostazione della corsa include l inserimento dei parametri della corsa il caricamento e il priming dei reagenti il caricamento della cella a flusso e una verifica della fluidica Per informazioni relative alla durata della corsa e altre specifiche delle prestazioni visitare la pagina delle specifiche di HiSeq 1500 sul sito Web Illumina Materiali diconsumo per il sequenziamento HiSeq v4 Nome kit HiSeq v4 Descrizione Kit HiSeq SBS v4 Contiene i reagenti SBS usati su HiSeq 1500 HiSeq PE Cluster Kit v4 Contiene ireagenti per la generazione di cluster usati su cBot e i reagenti di indicizzazione usati su HiSeq 1500 o HiSeq SR Cluster Kit v4 La versione PE del kit per la generazione di cluster include i reagenti paired end usati su HiSeq 1500 Ciascun kit per la generazione di cluster include un kit di accessori contenente le guarnizioni sostitutive della cella a flusso e i tappi a imbuto per i flaconi di reagente SBS Procedura per la preparazione dei reagenti2. 0 00 123 Spegnimento dello strumento 0 124 Capitolo 6 Software Real Time Analysis 125 introduzione ar de nO o ld peo ia ron e RSA 126 Panoramica sul software Real Time Analysis 127 Monitoraggio delle metriche della corsa 130 Flusso di lavoro Real Time Analysis 132 File di output del sequenziamento 137 Struttura della cartella di output 139 Numerazione delle tile 000 ea a ddae Ea UE RAG 141 Immagini in miniatura thumbnail 0000000000000000 142 Capitolo 7 Risoluzione dei problemi 143 Introduzione vue da careta Des rea or ARA o re dea 144 Possibili problemi d impostazione della corsa 145 Esecuzione di una verifica della fluidica 000 0 147 BaseSpace non disponibile 0001002202222221 148 Arresto e ripresa di una corsa 00 iii 149 Messa in pausa di una corsa 00000000000 a 001o r arrana 152 Reibridazione primer 00000000000 00000000000000 annoa cnn 154 A i Ie 157 Assistenzatecnice iu lei ii e 161 XI N codice 15035788 Rev EITA Descrizione generale INTFOAUZIONE A 2 Componenti di HiSeq 1500 00 0 3 To AAA ea 6 Software HiSeq 1900 coturrsoet daran I dirt 8 Spazio disponibile su d
3. Phasing i file per la determinazione delle fasi phasing empirica un file per tile a ciascun ciclo gt LOO X i file di posizioni cluster aggregate per ciascuna corsia TT Offsets due file di offset per la corsa El RTAConfiguration xml Images Focus LO0 X le immagini di messa a fuoco per ciascuna corsia TT InterOp i file binari utilizzati dal Sequencing Analysis Viewer SAV Logs i file di registro che descrivono gli eventi operativi TT Recipe il file della ricetta specifico per la corsa denominato con l ID della cartuccia di reagenti RTALogs i file di registro che descrivono gli eventi del software Real Time Analysis 2 Thumbnail_Images le immagini in miniatura di 9 posizioni da ciascuna tile generate per ciascun ciclo e base RunInfo xml E RunParameters xml Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q 3 9 indino Ip ejjaueo ejjep ermyn119 Software Real Time Analysis Nome e percorso della cartella della corsa 140 La cartella della corsa e la cartella al livello base per gli output generati da una corsa di sequenziamento Durante l impostazione della corsa il software chiede all utente di inserire il percorso della cartella della corsa Per impostazione predefinita alla cartella viene assegnato un nome nel seguente formato AAMMGG_ lt Nome computer gt _ lt Numero corsa gt _ lt ID cella a flusso gt Esempio 110114_SN106_0716_A90095ACXX Il numero della corsa viene incrementat
4. Dual Index Doppio indice esegue una corsa unidirezionale oppure paired end con due letture di indicizzazione Custom Personalizzata esegue una corsa unidirezionale oppure paired end con un numero di cicli personalizzato per le letture indici 2 Se stata specificata l opzione Dual Index Doppio indice o Custom Personalizzato selezionare un Flow Cell Format Formato cella a flusso Single Read Singola lettura o Paired End Paired end 3 Immettere il numero di cicli per Lettura 1 e Lettura 2 se applicabile L NOTA Il numero di cicli eseguiti in una lettura pari a un ciclo in pi rispetto al numero di cicli analizzati Ad esempio per eseguire 125 cicli per la Lettura 1 immettere 126 Per l opzione di indicizzazione Custom Personalizzato immettere il numero di cicli per le letture indici Le lunghezze delle letture non devono essere identiche 4 Confermare le impostazioni predefinite seguenti per la chimica Questi campi sono popolati automaticamente in base all opzione di tipo indice selezionata a SBS HiSeq SBS v4 Kit b Index Indice HiSeq v4 Single Index o HiSeq v4 Dual Index c PE turnaround Inversione PE HiSeq PE Cluster Kit v4 5 Opzionale Selezionare la casella di controllo Use Existing Recipe Usa ricetta esistente per usare una ricetta personalizzata Altrimenti permettere al software di creare la ricetta in base ai parametri della corsa inseriti Schermata Sample Sheet Foglio campioni I fogli
5. I file filtro specificano se un cluster ha attraversato i filtri I file filtro sono generati al ciclo 26 usando 25 cicli di dati Data Intensities BaseCalls L00 X i file sono archiviati in una cartella per ciascuna corsia e tile s_ corsia _ tile filter File report binari usati per il software Sequencing Analysis Viewer SAV I file InterOp sono aggiornati durante tutta la corsa Cartella InterOp Registrano gli eventi e sono aggiornati per tutta la durata della corsa Data RTALogs Per ciascuna corsa sono creati due file offset e offsets txt contiene gli offset delle tile per ciascun ciclo e canale relativo alla griglia e SubTileOffsets txt contiene lo spostamento misurato per ciascun quadrante di ciascuna immagine relativo all inquadratura di riferimento Data Intensities Offsets 137 ojuawreizuanbas ep indino Ip l4 Software Real Time Analysis Tipo di file File determinazione delle fasi phasing File di configurazione del software Real Time Analysis File statistiche File informazioni corsa File di immagini in miniatura thumbnail Descrizione posizione e nome del file Contiene informazioni empiriche per la determinazione delle fasi phasing per tile I file determinazione delle fasi phasing sono creati alla prima identificazione delle basi del ciclo e aggiornati dopo ogni identificazione delle basi del ciclo Data Intensities BaseCalls Phasing EmpiricalPhasing_ corsi
6. Prima di impostare la corsa preparare i reagenti SBS i reagenti di indicizzazione e i reagenti PE se applicabile Per la preparazione dei reagenti SBS consultare la Guida di riferimento per HiSeg SBS Kit v4 n codice 15050108 Per la preparazione dei reagenti di indicizzazione e PE consultare la Guida di riferimento per HiSeq Cluster Kit v4 n codice 15050104 Preparare tutti i reagenti prima di impostare la corsa Quando suggerito dal software di controllo caricare tutti i reagenti Quando si usa la chimica HiSeq v4 non necessario tornare allo strumento durante la corsa per caricare i reagenti D O N codice 15035788 Rev E ITA Flusso di lavoro per il sequenziamento HiSeq v4 Preparare i reagenti per la corsa Dopo la preparazione pesare i reagenti Per informazioni sulla preparazione dei reagenti vedere Procedura per la preparazione dei reagenti a pagina 20 Utilizzando il software di controllo immettere i parametri della corsa Quando suggerito caricare tutti i reagenti per la corsa e Caricare i reagenti SBS per la Lettura 1 e per la Lettura 2 e Per le corse indicizzate caricare i reagenti di indicizzazione e Per le corse paired end caricare i reagenti paired end Con una cella a flusso usata sullo strumento confermare il flusso corretto Eseguire il priming dei reagenti SBS e misurare lo scarto del priming Caricare la cella a flusso con cluster per il sequenziamento Confermare il flusso corrett
7. A Barra di avanzamento utilizzare la barra di avanzamento per monitorare quanti cicli sono stati completati B Grafico della fluidica allargare la sezione della fluidica per monitorare le fasi della chimica C Configurazione della corsa per rivedere i parametri per la corsa attuale D Grafico dell analisi utilizzare il grafico dell analisi per monitorare i punteggi qualitativi secondo il ciclo E Grafico delle immagini utilizzare il grafico delle immagini per monitorare le intensit secondo il ciclo Report sulla prima base Se durante la procedura di impostazione stata selezionata l opzione Confirm First Base Conferma prima base viene visualizzata automaticamente la finestra di dialogo di conferma relativa all incorporazione della prima base al termine dell imaging del primo ciclo In questa fase la corsa si mette in pausa Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida 1 Dalla finestra di dialogo di conferma rivedere First Base Report Report sulla prima base 2 Sei risultati sono soddisfacenti selezionare Continue Continua 1 08 N codice 15035788 Rev EITA Procedure post corsa Al termine della corsa rimuovere e pesare i reagenti ed eseguire un lavaggio dello strumento Per maggiori informazioni vedere Procedure post corsa a pagina 111 es109 Ejjap cib BEJONUOIN Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q O 9 1 1 O N codice 15035788 Rev EITA Procequre post corsa Introduzione nro 112 Rimozione
8. Pulizia del vano portacella 1 Indossare un nuovo paio di guanti in lattice privi di polvere 2 Usando una salvietta imbevuta di alcol o un panno che non lascia residui imbevuto di etanolo o isopropanolo pulire la superficie del vano portacella fino a quando non pulita x ATTENZIONE Non far sgocciolare l alcol nei fori della pompa a vuoto o intorno ai collettori Se necessario utilizzare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per asciugare il piano Figura 18 Ispezione dei fori della pompa a vuoto 3 Ispezionare visivamente il vano portacella per assicurarsi che sia privo di fibre e che i fori della pompa a vuoto siano privi di ostruzioni Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 3 9 ossn e e j99 eun IP OJUALUEILEI Esecuzione di una corsa HiSeq v4 Pulizia della cella a flusso 1 Rimuovere la cella a flusso dal contenitore della cella a flusso usando un paio di pinze 2 Sciacquare la cella a flusso con acqua da laboratorio e asciugarla con un panno pulente per lenti 3 Piegare una salvietta imbevuta di alcol fino approssimativamente alle dimensioni della cella a flusso 4 Tenere i bordi della cella a flusso con cluster con due dita Assicurarsi che le porte di ingresso e di uscita siano rivolte verso l alto 5 Pulire ogni lato della cella a flusso con un unico movimento Ripetere ripiegando il panno a ogni passaggio fino a quando la cella a flusso non pulita 6 Asciugare la cella a fluss
9. stato terminato i dati della corsa vengono salvati ed possibile riprendere l elaborazione Input per il software Real Time Analysis Real Time Analysis richiede i file di input seguenti I file delle intensit dei cluster che contengono i risultati dell analisi delle immagini RunInfo xml che il software di controllo genera automaticamente all inizio della corsa Da questo file Real Time Analysis legge il nome della corsa il numero di cicli se una lettura indicizzata e il numero di tile sulla cella a flusso HiSeq Configuration xml che un file di configurazione dello strumento in formato XML RTA exe config che un file di configurazione software in formato XML Real Time Analysis utilizza i parametri della corsa immessi durante l impostazione della corsa e riceve i comandi dal software di controllo che comprendono le informazioni su quando avviare la corsa e sulla posizione di RunInfo xml Output del software Real Time Analysis Le tile sono piccole aree di imaging sulla cella a flusso definite come un campo visivo della videocamera Per ciascuna tile analizzata il software Real Time Analysis crea un set di file di identificazione delle basi qualitativamente valutate e file filtro come output primari Altri file supportano la generazione di file di output primari File di identificazione delle basi per ciascuna tile analizzata viene generato un file compresso di identificazione delle basi bcl per ciascuna tile per cic
10. dello strumento e lo stato di componenti specifici in base ai sensori dello strumento N codice 15035788 Rev E ITA Figura 7 Indicatori di attivit 50000068 Da sinistra a destra gli indicatori di attivit rappresentano i motori X Y e Z la funzionalit dell elettronica la videocamera il sistema di fluidica e le funzioni di elaborazione Figura 8 Indicatori dei sensori Da sinistra a destra gli indicatori dei sensori rappresentano la temperatura della cella a flusso A la temperatura del vano refrigerato per i reagenti lo stato del cloud computing BaseSpace e la temperatura della cella a flusso B Icone di stato Un icona di stato posta nell angolo superiore destro di ciascuna schermata e segnala cambiamenti nelle condizioni operative durante la procedura di impostazione della corsa e durante la corsa Icona di Nome dello stato Descrizione stato Stato OK Nessun cambiamento Le condizioni del sistema sono normali Informazione Solo a fini informativi Non si richiede alcun intervento Attenzione Informazione che richiama l attenzione dell utente Avvertenza Le avvertenze non provocano l arresto della corsa ma possono subordinarne il proseguimento a un intervento dell utente Errore In genere gli errori provocano l arresto della corsa che potr continuare solo dopo un intervento dell utente Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 1 q 00S S H s4eMmyYos Descrizione generale Quando si verifica u
11. lt 209 1 singola indicizzazione 82 lt 2102 Paired end lt 101 8 7 83 lt 101 lt 225 doppia indicizzazione Esecuzione di una corsa TruSeq v3 1 Numero di cicli per librerie con singola indicizzazione Numero di cicli per librerie con doppia indicizzazione 3 La Lettura Indice 2 di una corsa paired end con doppia indicizzazione include sette cicli addizionali di sola chimica 5 P N codice 15035788 Rev E ITA Inserimento dei parametri della corsa Dalla schermata Welcome Benvenuto del software selezionare Sequence New Run Sequenzia Nuova corsa L interfaccia del software di controllo guida l utente lungo l intera procedura di impostazione della corsa Il processo di impostazione della corsa organizzato in tre schede Run Configuration Pre Run Setup e Initiate Run Configurazione corsa Impostazioni pre corsa e Avvio corsa Le schermate di configurazione della corsa contengono elenchi a tendina caselle di controllo o campi di testo per i parametri della corsa Usare lo scanner portatile per codici a barre per scansionare l ID della cella a flusso o del kit di reagenti oppure inserire l ID utilizzando la tastiera di tipo touch screen L icona della tastiera si trova a destra dei campi per il testo Selezionare Next Avanti per passare alla schermata successiva o selezionare Back Indietro per tornare alla schermata precedente In qualunque momento durante la procedura di impostazione della corsa possibile selezion
12. ottica La cella a flusso posizionata nel vano portacella con le porte di ingresso e di uscita rivolte verso il basso ed tenuta in posizione da una pompa a vuoto La leva della cella a flusso illuminata di fronte al vano portacella controlla la pompa a vuoto La leva della cella a flusso diventa verde quando la tenuta del vuoto corretta Figura 3 Piano portacelle A Cella a flusso B Leva della cella a flusso Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 5 005 basiH IP usuodwop Descrizione generale Avvio di HiSeq 1500 Avviare il computer di controllo dello strumento Accedere al sistema operativo usando il nome utente e la password predefiniti Nome utente sbsuser Password sbs123 Attendere che il caricamento giunga a termine Se i valori predefiniti non funzionano consultare l amministratore della struttura per individuare il nome utente e la password specifici per la struttura Portare l interruttore principale in posizione ON Se si sta di fronte allo strumento l interruttore si trova sul lato sinistro Attendere almeno 1 minuto per la configurazione corretta dei dispositivi dello strumento e per l inizializzazione dell unit dello strumento denominata DoNotEject Non espellere Alla conclusione dell inizializzazione dell unit si apre una finestra Chiudere la finestra Se la finestra non si apre usare MyComputer per controllare l unit DoNotEject Non espellere NOTA Non espellere mai l unit di tipo f
13. 15023333 Guida di preparazione dei reagenti di TruSeq SBS Kit v3 50 cicli n codice 15023334 Per la preparazione dei reagenti di indicizzazione e PE consultare la guida appropriata Guida di preparazione dei reagenti di TruSeq PE Cluster Kit v3 n codice 15023336 Guida di preparazione dei reagenti di TruSeq SR Cluster Kit v3 n codice 15023335 Queste guide includono le istruzioni per la preparazione dei primer di sequenziamento forniti nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 A 9 auoIZznpoJ u Flusso di lavoro per il sequenziamento TruSeq v3 Preparare i reagenti SBS per la Lettura 1 e i reagenti di indicizzazione Dopo T Mar la preparazione pesare i reagenti 33 Per informazioni sulla preparazione dei reagenti vedere Procedura per la preparazione dei reagenti a pagina 49 Utilizzando il software di controllo immettere i parametri della corsa Quando suggerito caricare tutti i reagenti SBS per la Lettura 1 Caricare i reagenti SBS per la Lettura 2 fatta eccezione per ICB Caricare i reagenti di indicizzazione Con una cella a flusso usata sullo strumento confermare il flusso corretto Eseguire il priming dei reagenti SBS e misurare lo scarto del priming Esecuzione di una corsa TruSeq v3 Caricare la cella a flusso con cluster per il sequenziamento Confermare il flusso corretto Avviare la corsa di sequenziamento Opzionale Dopo il ciclo 1 is
14. 2 2 N codice 15035788 Rev E ITA Inserimento dei parametri della corsa Dalla schermata Welcome Benvenuto del software selezionare Sequence New Run Sequenzia Nuova corsa L interfaccia del software di controllo guida l utente lungo l intera procedura di impostazione della corsa Il processo di impostazione della corsa organizzato in tre schede Run Configuration Pre Run Setup e Initiate Run Configurazione corsa Impostazioni pre corsa e Avvio corsa Le schermate di configurazione della corsa contengono elenchi a tendina caselle di controllo o campi di testo per i parametri della corsa Usare lo scanner portatile per codici a barre per scansionare l ID della cella a flusso o del kit di reagenti oppure inserire l ID utilizzando la tastiera di tipo touch screen L icona della tastiera si trova a destra dei campi per il testo Selezionare Next Avanti per passare alla schermata successiva o selezionare Back Indietro per tornare alla schermata precedente In qualunque momento durante la procedura di impostazione della corsa possibile selezionare Cancel Annulla per uscire dall impostazione della corsa e tornare alla schermata Welcome Benvenuto Schermata Integration Integrazione La schermata Integration Integrazione fornisce l opzione di collegare la corsa a BaseSpace Per collegarsi a BaseSpace attenersi a quanto segue 1 Selezionare BaseSpace 2 Selezionare da una delle seguenti opzioni BaseSpace Storage and Anal
15. AACGTACTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGITI GITCIGITAAGCLIAAGALIACUIGAlCCALI GAL CARGO CU AA CGA CGA CRA LIGA GACIAACGACGI GGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGS een en e Z ZSL7Y SC AGIAACACA rro mts ao ina CTGATTCAAC ACCATTAAGAGCTACCGTGCAACTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAG GATTACTTGAT GCTACCGTGCAACGAAAATAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACTTCTGTTAACCTIAAGA TACT CAICCAS IGAAAAGAATGA AAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTETETTAACCTTAAGATTACTTGATECACTGATTCEAACGTACCGTAAAGATTACTTGATO ITIAAGAGCTACC GGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTIAAGATTACT GATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACG ATCAATTGAGACT Mo ACCATTAAGAGCTACCGTGCAACAGTAACACACTICTGTIAACCITAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAA RAAGAATGAT GGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACT CTEATTCAACO GTACCGTAACGAACGTATCATTAAGATTACTIGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGIATCAATTGAGACTAAATATTAA TCTGTTAACCTT CTTGATCCACTGATTCAACGTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGIAACGAACGTATCAATTGAGCTICTGTTAAG TAGCAACGAC GAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATO ITTAAGAGCTAC SOLO A USO DI RICERCA DI PROPRIET DI ILLUMINA N codice 15035788 Rev E ITA Novembre 2014 A Questo documento e il suo contenuto sono di propriet di Illumina Inc e delle aziende ad essa affiliate Illumina e sono destinati esclusivamente all uso conforme a contratto da par
16. Descrizione generale Software HiSeq 1500 Sul computer dello strumento sono installate tre applicazioni software HiSeq 1500 Control Software l interfaccia HiSeq Control Software HCS guida l utente lungo l intera procedura di impostazione di una corsa di sequenziamento Durante la corsa il software di controllo agisce sull hardware dello strumento verifica la fluidica imposta le temperature e fornisce un riepilogo visivo delle statistiche qualitative Software Real Time Analysis integrato con il software di controllo Real Time Analysis RTA esegue l identificazione delle basi e assegna un punteggio qualitativo a ciascuna base per ciascun ciclo Per maggiori informazioni vedere Software Real Time Analysis a pagina 125 Software Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV fornisce statistiche dettagliate sulla qualit Interfaccia di HiSeq 1500 Control Software La schermata Mode Select Selezione modalit fornisce le opzioni per le modalit della corsa Le modalit della corsa includono TruSeq v3 HiSeq v4 e Rapid Run Corsa rapida Selezionare una modalit per procedere alla schermata Welcome Benvenuto La schermata Welcome Benvenuto fornisce i comandi per avviare una corsa di sequenziamento il lavaggio dello strumento l esecuzione di una verifica del sistema e il passaggio di modalit La modalit attuale viene visualizzata nella parte superiore della schermata Una volta
17. N N codice 15035788 Rev E ITA Cluster che attraversano il filtro Durante il primi 25 cicli di Lettura 1 il filtro Chastity rimuove i cluster meno affidabili dai risultati dell analisi I cluster attraversano il filtro se non pi di due identificazioni delle basi presentano un valore Chastity inferiore a 0 6 durante i primi 25 cicli Il valore Chastity rappresenta il rapporto dell intensit pi luminosa delle basi divisa per la somma dell intensit pi luminosa delle basi e l intensit pi luminosa della seconda base La percentuale di cluster che attraversano il filtro rappresentata nei report dell analisi come PF I cluster si generano in un array casuale e sono individuati durante la generazione della griglia per l identificazione dei cluster I cluster di bassa qualit sono rimossi dal conteggio dei cluster non elaborati durante la generazione della griglia questo porta a una percentuale relativamente elevata di cluster che attraversano il filtro Punteggio qualitativo Un punteggio qualitativo Q score una previsione della probabilit di un identificazione delle basi errata Un punteggio qualitativo superiore implica che un identificazione delle basi pi affidabile e pi probabile che sia corretta Il punteggio qualitativo permette di comunicare velocemente la probabilit di piccoli errori I punteggi qualitativi sono rappresentati come Q X dove X il punteggio La tabella seguente illustra la relazione f
18. Next Avanti per procedere o selezionare Back Indietro per modificare i parametri Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 9 es109 E jap 11jauesed lep 0 USLULIOSU Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida Caricamento e priming dei reagenti Dopo aver immesso i parametri della corsa caricare i reagenti SBS per la generazione di cluster di indicizzazione e paired end per la corsa e quindi eseguire il priming dei reagenti nel sistema di fluidica Il software guida l utente in questo processo tramite una serie di schermate sulla scheda Pre Run Setup Impostazioni pre corsa Materiali di consumo forniti da Illumina Otto tappi a imbuto Materiali di consumo forniti dall utente Flacone da 250 ml Corning n di catalogo 430776 Provette coniche da 15 ml Corning n di catalogo 430052 Acqua da laboratorio x NOTA Per preparare il risciacquo post corsa al termine di una corsa di sequenziamento caricare 25 ml di PWI o di acqua da laboratorio nella posizione 2 Il risciacquo post corsa non sostituisce il lavaggio post corsa dello strumento Preparazione dei reagenti SBS e per la generazione di cluster Assicurarsi che i reagenti SBS siano pronti per essere caricamenti sullo strumento Materiali di consumo forniti da Illumina Otto tappi a imbuto Materiali di consumo forniti dall utente Un flacone da 250 ml Corning n di catalogo 430776 Una provetta Eppendorf con tappo flip top per ogni cella a flusso da 1 5 ml
19. altri 250 ul di acqua nella cella a flusso Se il problema persiste rimuovere la cella a flusso ripetere le fasi di pulizia e ricaricare la cella a flusso Posizionamento dei tubi e priming dei reagenti 1 a A dA N Allentare e rimuovere i tubi di scarico per la cella a flusso appropriata dal contenitore per gli scarti Non includere i tubi per la pompa di scarico condensa Posizionare i tubi 4 e 5 in provette separate da 15 ml Posizionare i tubi 1 2 3 6 7 e 8 in un flacone contenente acqua da laboratorio Selezionare Next Avanti Selezionare Start Prime Avvia priming per avviare il priming possibile monitorare l avanzamento della fase di priming dalla schermata Prime Priming AI completamento della fase di priming misurare gli scarti di priming raccolti e confermare che il volume sia 2 5 ml 10 che rappresenta 500 ul per reagente per corsia Registrare i risultati sul modulo di monitoraggio del laboratorio Prima di procedere riportare i tubi 4 e 5 nel contenitore per gli scarti Lasciare i tubi di scarico 1 2 3 6 7 e 8 nel flacone contenente acqua da laboratorio Selezionare Next Avanti Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 1 01 11usbea rap Bulud a ozu swesep Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida Caricamento di una cella a flusso La fase successiva consiste nel rimuovere la cella a flusso usata e nel caricare la cella a flusso che si desidera sequenziare J 7 NOTA y Se cBot
20. canale C e qualche intensit anche nel canale A Usando una matrice colore 4 x 4 il software Real Time Analysis genera intensit corrette in base alla matrice con ridotta o nessuna visualizzazione contemporanea e bilancia le differenze nell intensit complessiva tra i canali colore Correzione empirica della determinazione delle fasi phasing Durante la reazione di sequenziamento ciascun filamento di DNA in un cluster si estende di una base per ciclo La determinazione delle fasi phasing e la predeterminazione delle fasi prephasing si verificano quando un filamento fuoriesce dalla fase con il ciclo di incorporazione attuale La determinazione delle fasi phasing si verifica quando una base rimane indietro La predeterminazione delle fasi prephasing si verifica quando una base salta in avanti Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 7 3 3 SIS eUy aUI PSY OJOAB IP OSSN y Software Real Time Analysis Figura 50 Determinazione delle fasi phasing e predeterminazione delle fasi prephasing A Lettura con una base nella determinazione delle fasi phasing B Lettura con una base nella predeterminazione delle fasi prephasing Real Time Analysis corregge gli effetti della determinazione delle fasi phasing e della predeterminazione delle fasi prephasing usando un algoritmo empirico per la correzione della determinazione delle fasi phasing che massimizza la qualit dei dati a ciascun ciclo per tutta la corsa I r
21. che i materiali di consumo personalizzati saranno prodotti e testati in conformit con i processi standard di controllo qualit e produzione di Illumina Illumina non garantisce che i materiali consumabili personalizzati funzioneranno come previsto dall acquirente o per gli usi da lui previsti b Garanzia sull hardware Illumina garantisce che l hardware diverso dai componenti aggiornati sar conforme alle relative specifiche per un periodo di 12 mesi dalla data di spedizione da parte di Illumina a meno che non includa l installazione a opera di Illumina in tal caso il periodo di garanzia decorrer dalla data di installazione o dal 30 giorno successivo alla data di consegna se precedente di seguito la Garanzia hardware base Per componenti aggiornati si intendono componenti modifiche o miglioramenti apportati da Illumina all hardware precedentemente acquisito dall acquirente Illumina garantisce che i componenti aggiornati saranno conformi alle relative specifiche per un periodo di 90 giorni dalla data di installazione I componenti aggiornati non estendono la garanzia dell hardware a meno che l aggiornamento non sia stato eseguito da illumina presso i propri stabilimenti nel qual caso all hardware aggiornato spedito all acquirente si applicher la garanzia hardware di base c Esclusioni dalla garanzia Le garanzie di cui sopra non si applicano qualora la mancata conformit sia dovuta a i abuso uso improprio negligenza colpa incid
22. completata una corsa il software chiede di lavare lo strumento Dopo il lavaggio il software torna alla schermata Welcome Benvenuto 8 N codice 15035788 Rev E ITA Figura 4 Schermata Welcome Benvenuto Rapid Run ES sr MODE SELECT A Pulsante del menu della schermata Welcome Benvenuto B Riquadro interfaccia principale C Indicatori di attivit Comandi della schermata Welcome Benvenuto I comandi della schermata Welcome Benvenuto includono Sequence Sequenziamento Wash Lavaggio Check Verifica e Mode Select Selezione modalit Sequence Sequenziamento selezionare Sequence Sequenziamento per avviare la procedura di impostazione di una nuova corsa di sequenziamento o per riprendere una corsa esistente Figura 5 Opzioni del comando Sequence Sequenziamento New Run Resume Run Rehyb Run New Run Nuova corsa il software guida l utente lungo l intera procedura di impostazione dei parametri della corsa caricamento e priming dei reagenti caricamento della cella a flusso esecuzione delle verifiche della fluidica e avvio della corsa Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 9 00S DaSIH s1eMmyYos Descrizione generale Resume Run Ripresa corsa il software guida l utente lungo la procedura di scelta della cartella della corsa esistente e di impostazione dei parametri per la ripresa della corsa Rehyb Run Corsa reibridazione il software guida l utente nella procedura di reibridaz
23. condizioni degli obblighi di indennizzo sezione 9 d di seguito Illumina sar tenuto i a difendere manlevare e tenere l acquirente indenne da ogni pretesa o azione di terzi basata sulla presunta violazione di diritti di propriet intellettuale validi e applicabili di terzi da parte di questo prodotto quando utilizzato a scopi di ricerca in conformit con i presenti termini e condizioni e in conformit con la documentazione e le specifiche relative e ii a sostenere i costi di qualsivoglia transazione sentenza definitiva e spesa comprese le ragionevoli spese legali che l acquirente debba sostenere in relazione a tale pretesa violazione Qualora questo prodotto o parte di esso divenga o possa diventare secondo l opinione di Illumina oggetto di azione per violazione di diritti di terzi sar facolt di Illumina a sua discrezione A di procurare all acquirente il diritto di continuare a utilizzare questo prodotto B di modificare o sostituire questo prodotto con un sostituto sostanzialmente equivalente che non configuri violazione o C di richiedere la restituzione di questo prodotto e porre fine ai diritti alla licenza e a ogni altra autorizzazione fornita all acquirente in relazione a esso nonch a rimborsare all acquirente il valore come indicato nei documenti ufficiali dell acquirente del prodotto restituito tenendo conto dell ammortamento maturato al momento della restituzione considerando che nessun rimborso verr effettuato pe
24. correttamente nell alloggiamento Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti usando la maniglia del rack Rimuovere i tappi da ciascuna provetta di reagente e posizionare la provetta sul rack nella posizione numerata associata o facendo corrispondere il colore dell etichetta Tabella 2 Celle a flusso unidirezionale Posizione Reagente Descrizione 15 FDR Fast Denaturation Reagent contiene formammide 16 HP9 Index Sequencing Primer i5 17 HP12 Index Sequencing Primer i7 HP9 non richiesto solo per le corse a doppia indicizzazione Se HP9 non viene usato caricare una provetta conica da 15 ml con 10 ml di acqua da laboratorio nella posizione n 16 Tabella 3 Celle a flusso paired end Posizione Reagente Descrizione 10 FRM Fast Resynthesis Mix 15 FDR Fast Denaturation Reagent contiene formammide 17 HP12 Index Sequencing Primer i7 Caricare FRM nella posizione 10 per corse a doppia indicizzazione su una cella a flusso paired end FRM richiesto nella posizione 10 per tutte le corse paired end indipendentemente dalle opzioni di indicizzazione Se si sta eseguendo una corsa unidirezionale passare alla procedura seguente per riportare il rack nello scomparto reagenti In caso contrario procedere con il caricamento dei reagenti paired end Collocare provette coniche da 15 ml riempite con 10 ml di acqua da laboratorio nelle posizioni non usate sul rack dei reagenti PE Far scorrere il rack reagenti nello
25. corsa Rapid Run Corsa rapida 100 Figura 41 Leva della cella a flusso in posizione 2 7 Immettere TTD della cella a flusso E NOTA e Per il priming e possibile utilizzare una cella a flusso TruSeq Rapid o una cella a flusso HiSeq Rapid v2 8 Assicurarsi che la casella di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva sia selezionata sulla schermata caricamento cella a flusso per il priming e poi selezionare Next Avanti Conferma del flusso corretto Dopo aver caricato la cella a flusso usata verificare il flusso corretto La verifica del flusso corretto conferma che la cella a flusso e le guarnizioni sono installate correttamente e che il collettore posizionato correttamente 1 Selezionare la soluzione 2 acqua da laboratorio dall elenco a tendina ATTENZIONE Usare acqua per confermare il flusso corretto solo su una cella a flusso usata Non usare mai acqua per confermare il flusso corretto su una cella a flusso con cluster 2 Confermare i valori predefiniti seguenti Volume Volume 250 Aspirate Rate Velocit di aspirazione 1500 Dispense Rate Velocit di erogazione 2000 3 Selezionare Pump Pompa 4 Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori N codice 15035788 Rev E ITA Se sono presenti bolle eccessive verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni ridurre la velocit di aspirazione a 1000 e pompare
26. di qualsiasi software di terzi Il software che venga fornito separatamente installato o incorporato in un prodotto viene concesso in licenza all acquirente e non venduto A eccezione di quanto espressamente indicato nella presente sezione nessun diritto o licenza sui diritti di propriet intellettuale di Illumina viene concessa espressamente implicitamente o in base al principio di inopponibilit esclusiva responsabilit dell acquirente assicurarsi di disporre di tutti i diritti di propriet intellettuale necessari per gli usi che intende fare di questo prodotto compresi a titolo esemplificativo ma non esaustivo diritti da terzi o diritti sulla PI per applicazioni specifiche Illumina non garantisce in alcun modo che gli usi specifici previsti dall acquirente non violino i diritti di propriet intellettuale di terzi o la PI per applicazioni specifiche 3 Disposizioni normative Questo prodotto non stato autorizzato o approvato da parte della FDA statunitense o di qualsiasi altro ente normativo nazionale o estero per qualsiasi uso specifico di ricerca commerciale diagnostico o diverso Questo prodotto etichettato Solo per l utilizzo a scopo di ricerca L acquirente deve assicurarsi di disporre delle eventuali autorizzazioni di legge necessarie per gli usi previsti di questo prodotto 4 Utilizzi non autorizzati L acquirente accetta quanto segue a di utilizzare ogni materiale di consumo solo una volta e b di utilizzare esc
27. di conformit e gli aspetti relativi alla sicurezza Fornisce una descrizione dei contenuti dei kit cluster e le istruzioni per preparare i materiali di consumo prima di una corsa di sequenziamento Fornisce una descrizione dei contenuti dei kit cluster e le istruzioni per preparare i materiali di consumo prima di una corsa di sequenziamento rapida Fornisce una descrizione dei contenuti dei kit SBS e le istruzioni per preparare i materiali di consumo prima di una corsa di sequenziamento Fornisce una descrizione dei contenuti dei kit SBS e le istruzioni per preparare i materiali di consumo prima di una corsa di sequenziamento rapida Fornisce istruzioni per denaturare e diluire le librerie preparate per una corsa di sequenziamento e per preparare un campione di controllo PhiX Questa fase si applica alla maggior parte dei tipi di librerie Consultare la pagina di supporto di HiSeq 1500 sul sito Web Illumina sul sito Web Illumina per accedere alla documentazione ai download del software ai training online e alle domande frequenti FAQ N codice 15035788 Rev E ITA Esecuzione di una corsa HiSeq v4 Introduzione i 20 Flusso di lavoro per il sequenziamento HiSeq v4 a0 0a00a00a00202202221n 21 Tipi di corse per la chimica HiSeq v4 00 cnc nn cnnnnnn cnn n nn nnnnnnnnnnnnes 22 Inserimento dei parametri della corsa 00 23 Caricamento e priming dei reagenti
28. di lettura Cicli Cicli Lettura 1 Indice 1 17 Indice 2 15 Lettura 2 totali Unidirezionale non indicizzata Unidirezionale singola indicizzazione Unidirezionale doppia indicizzazione Paired end non indicizzata Paired end singola indicizzazione Paired end doppia indicizzazione Tipo di corsa Cicli Cicli di lettura Cicli di lettura Cicli Cicli Lettura 1 Indice 1 17 Indice 2 15 Lettura 2 totali Unidirezionale non indicizzata Unidirezionale singola indicizzazione Unidirezionale doppia indicizzazione Paired end non indicizzata Paired end singola indicizzazione Paired end doppia indicizzazione Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 3 3 epide es1o uny pidey eoluyo e 13d es109 Ip Idi Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida 34 1 Numero di cicli per librerie con singola indicizzazione 2 Numero di cicli per librerie con doppia indicizzazione 3 La Lettura Indice 2 di una corsa paired end con doppia indicizzazione include sette cicli addizionali di sola chimica N codice 15035788 Rev E ITA Verifica del volume pre corsa Dalla schermata Welcome Benvenuto del software selezionare Sequence New Run Sequenzia Nuova corsa Si apre la schermata Volume Check Verifica volume Schermata Volume Check Verifica volume 1 2 10 11 12 13 Quando il software suggerisce di eseguire una verifica del volume selezionare Yes S Posizionare i tubi
29. e pesatura dei reagenti oooocccccccccccccccccccccccccccccccccncnnncncnnnnnnnnnnnnns 113 Esecuzione di un lavaggio di manutenzione 00001 1ina1n 114 Esecuzione di un lavaggio con acqua 00000000001 a iraa a inaari nanan 119 Cambio della modalit di sequenziamento 121 Porre lo strumento nello stato inattivo idling 0 0 123 Spegnimento dello strumento 0000000000000000 aaoo adoa a adoa a aoaaa aani 124 gt pe ali p na Lon gr ne e nie Ana 07 gi Ena f 4 Li pri ra Darren pr AAA sr esili o JA nor Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q q q G ojoydeo Procedure post corsa Introduzione 112 Le procedure post corsa includono la rimozione e la pesatura dei reagenti e un lavaggio dello strumento Un lavaggio con acqua richiesto dopo ciascuna corsa con l opzione di eseguire un lavaggio di manutenzione al posto di un lavaggio con acqua dopo una corsa ad output elevato Illumina raccomanda un lavaggio di manutenzione I lavaggi eseguiti regolarmente assicurano la continuit della resa prestazionale dello strumento per i seguenti motivi Eliminano gli eventuali residui di reagenti e campione dai tubi della fluidica e dai pescanti Impediscono l accumulo e la cristallizzazione dei sali nei tubi della fluidica e nei pescanti Previene la contaminazione incrociata dalla corsa precedente inclusa la contaminazione
30. i valori predefiniti seguenti Volume Volume 125 Aspirate Rate Velocit di aspirazione 250 Dispense Rate Velocit di erogazione 2000 3 Selezionare Pump Pompa 4 Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori Se sono presenti bolle eccessive verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni ridurre la velocit di aspirazione a 100 e pompare altri 125 ul di acqua nella cella a flusso Se il problema persiste rimuovere la cella a flusso ripetere le fasi di pulizia e ricaricare la cella a flusso Posizionamento dei tubi e avvio del priming 1 Rimuovere gli otto tubi di scarico dal contenitore per gli scarti Non includere i tubi per la pompa di scarico condensa Figura 15 Posizione dei tubi A Tubi di scarico della cella a flusso per le posizioni 1 8 dei reagenti B Tubo della pompa di scarico condensa non rimuovere 3 6 N codice 15035788 Rev E ITA Collocare i tubi di scarico in una provetta da 15 ml vuota un provetta per gli scarti per una provetta da 15 ml Gli scarti del priming vengono raccolti e misurati dopo la fase di priming Selezionare Start Prime Avvia priming Si apre la schermata di priming e si avvia la fase di priming Monitorare l avanzamento della fase di priming dall apposita schermata AI completamento della fase di priming misurare gli scarti raccolti e confermare che il volume in ciascuna provet
31. in esecuzione 4 Inserire un nome utente 5 Selezionare Next Avanti Schermata Advanced Avanzato 1 Opzionale Selezionare la casella di controllo Confirm First Base Conferma incorporazione prima base Un report sulla prima base viene generato automaticamente per ciascuna corsa La selezione di questa opzione apre il report sulla prima base prima di procedere con la corsa 2 Opzionale Dalle caselle di controllo Align to PhiX Allineamento con PhiX deselezionare la casella di controllo per le corsie che non contengono PhiX Come impostazione predefinita tutte le corsie sono selezionate per l allineamento tramite il software Real Time Analysis RTA In alternativa selezionare le corsie sull immagine della cella a flusso per aggiungere o rimuovere le corsie per l allineamento PhiX y NOTA Con HCS v2 2 e RTA v1 18 non richiesta una corsia di controllo dedicata Quindi l opzione per assegnare una corsia di controllo non disponibile con questa configurazione software 3 Selezionare Next Avanti Schermata Recipe Ricetta 1 Selezionare dalle seguenti opzioni per Index Type Tipo indice No Index Nessun indice esegue una corsa non indicizzata unidirezionale oppure paired end Single Index Singolo indice esegue una corsa unidirezionale oppure paired end con una lettura di indicizzazione Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 D 5 es109 E jap 11jauesed lep ojuauwJesu Esecuzione di una corsa HiSeq v4
32. incrociata dopo il passaggio di modalit J NOTA Un lavaggio con acqua eseguito al termine di ciascuna corsa lava il sistema e verifica la fluidica Quando si imposta una corsa il software conferma che stato eseguito un lavaggio con acqua o un lavaggio di manutenzione entro le ultime 24 ore Un lavaggio di manutenzione richiesto ogni 10 giorni Quando sono passati 10 giorni dall ultimo lavaggio di manutenzione il software chiede di eseguire un lavaggio di manutenzione N codice 15035788 Rev E ITA Rimozione e pesatura dei reagenti 1 Aprire lo sportello dello scomparto reagenti 2 Sollevare i pescanti per il rack SBS e il rack dei reagenti PE appropriato procedendo come segue a Tirare la maniglia del pettine di aspirazione verso l esterno b Sollevare la maniglia del pettine di aspirazione mentre si tira verso l esterno c Rilasciare la maniglia del pettine di aspirazione nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Assicurarsi che la maniglia del pettine di aspirazione sia posizionata correttamente nell alloggiamento 3 Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti usando la maniglia del rack 4 Rimuovere ogni flacone dal rack reagenti e registrare il peso sul modulo di monitoraggio del laboratorio Consultare la pagina di supporto HiSeq 1500 sul sito Web Illumina e scaricare un modulo di monitoraggio del laboratorio 5 Perla modalit Rapid Run Corsa rapida rimuovere le provette dalla stazion
33. quindi spostare lentamente la leva della cella a flusso nella posizione 2 Quando la leva della cella a flusso e verde fisso i collettori sono in posizione e la cella pronta per l uso Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 41 ossn e Ejjeo eun IP OJUALUEILEI 1 2 Esecuzione di una corsa HiSeq v4 42 Figura 21 Leva della cella a flusso in posizione 2 Assicurarsi che la casella di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva sia selezionata sulla schermata Load Sequencing Flow Cell Caricamento della cella a flusso di sequenziamento Conferma del flusso corretto La verifica del flusso corretto conferma che la cella a flusso e le guarnizioni sono installate correttamente e che il collettore posizionato correttamente Selezionare la soluzione 5 dall elenco a tendina Inserire i valori predefiniti seguenti Volume Volume 250 Aspirate Rate Velocit di aspirazione 250 Dispense Rate Velocit di erogazione 2000 Selezionare Pump Pompa Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie o di perdite vicino ai collettori Se sono presenti bolle verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni dei collettori e ripetere il processo usando la soluzione 6 per evitare di esaurire la posizione 5 Ridurre la velocit di aspirazione a 100 e pompare altri 250 ul verso la cella a flusso Selezionare Next Avanti Assicurarsi che la leva della c
34. schermata Reagents Reagenti 27 57 9 Real Time Analysis 8 con corsa arrestata 149 correzione matrice colore 133 corsa arrestata ripresa automatica 128 determinazione delle fasi phasing 133 file di output 127 Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 file input 127 file output 137 file registro 137 metriche della corsa 130 punteggio qualitativo 135 raggruppamento punteggi alitativi 136 risultati 137 registrazione posizioni cluster 132 report incorporazione prima base 25 44 55 74 88 108 report prima base 44 74 108 revisione schermata impostazione corsa 85 risoluzione dei problemi 145 caricamento della cella a flusso 145 fluidica 147 registrazione 132 RTA exe config file 127 RunInfo xml 137 138 S salute dello strumento 12 scala Phred 135 schema di indicizzazione 26 57 schermata Flow Cell Setup Impostazione cella a flusso 24 54 87 schermata Reagents Reagenti 27 57 90 schermata Recipe Ricetta 85 schermata Scan Scansione 85 schermata Welcome Benvenuto comandi 9 menu 12 scomparto della cella a flusso 3 5 scomparto della fluidica 3 scomparto reagenti 3 4 senza identificazione 134 Sequencing Analysis Viewer SAV 8 file InterOp 127 panoramica 131 sequenziamento indicizzato reagenti caricamento 60 sequenziamento paired end reagenti caricamento 29 31 9OIPUI 159 Indice 160 sequenziamento paired end reagenti caricamento 77 server LIMS 12 software Experiment Manager 15
35. senza incidere su accuratezza o prestazioni 3 Selezionare dalle opzioni Save Auxiliary Files Salva file ausiliari seguenti Save All Thumbnails Salva tutte le miniatura salva tutte le immagini in miniatura Un immagine in miniatura una campionatura di immagini da diverse tile in ciascuna colonna di tile o striscia combinata in un immagine in miniatura Save Tile Thumbnails Salva miniature delle tile salva le immagini in miniatura delle tile Le immagini in miniatura delle tile rappresentano una singola tile piuttosto che un campionamento di tile in una striscia 4 Selezionare Next Avanti Schermata Flow Cell Setup Impostazione cella a flusso La schermata Flow Cell Setup Impostazione cella a flusso registra le informazioni relative alla cella a flusso utilizzata per la corsa Sono richiesti tutti i campi 1 Eseguire la scansione del codice a barre della cella a flusso o inserire l ID numero del codice a barre della cella a flusso da sottoporre a sequenziamento L ID della cella a flusso usata per determinare il tipo di cella a flusso e la compatibilit dei reagenti 2 4 N codice 15035788 Rev E ITA 2 Confermare che il tipo di cella a flusso sia HiSeq Flow Cell v4 Cella a flusso HiSeq v4 Il tipo di cella a flusso viene selezionato automaticamente in base all ID della cella a flusso 3 Inserire un nome per l esperimento Il nome dell esperimento appare su ciascuna schermata per permettere di identificare la corsa
36. sorgente deve contenere le informazioni sul copyright riportate sopra il presente elenco di condizioni e le limitazioni di responsabilit riportate di seguito 2 La ridistribuzione in formato binario deve contenere le informazioni sul copyright riportate sopra il presente elenco di condizioni e le limitazioni di responsabilit riportate di seguito nella documentazione e o in altro materiale fornito con la distribuzione 3 I nomi FU Berlin e Knut Reinert non devono essere utilizzati per appoggiare o promuovere prodotti derivati da questo software senza previa ed esplicita autorizzazione scritta QUESTO SOFTWARE VIENE FORNITO DAI TITOLARI DEI DIRITTI D AUTORE E DAI LORO COLLABORATORI NELLO STATO IN CUI SI TROVA SENZA ALCUNA GARANZIA ESPRESSA O IMPLICITA INCLUSE IN VIA ESEMPLIFICATIVA LE GARANZIE DI COMMERCIABILIT O IDONEIT A UNO SCOPO SPECIFICO IN NESSUN CASO I TITOLARI DEI DIRITTI D AUTORE E I LORO COLLABORATORI POTRANNO ESSERE RITENUTI RESPONSABILI DI EVENTUALI DANNI DIRETTI INDIRETTI INCIDENTALI SPECIALI ESEMPLARI O CONSEQUENZIALI INCLUSI A MERO TITOLO ESEMPLIFICATIVO I COSTI DI APPROVVIGIONAMENTO DI BENI O SERVIZI SOSTITUTIVI I DANNI RISULTANTI DA INDISPONIBILIT PERDITE DI DATI PERDITE DI RICAVI O DA INTERRUZIONE DELL ATTIVIT COMMERCIALE INDIPENDENTEMENTE DALLA CAUSA E A PRESCINDERE DALLA INTERPRETAZIONE GIURIDICA N codice 15035788 Rev E ITA CHE INVOCHI INADEMPIMENTO CONTRATTUALE EXTRACONTRATTUALE O LA RESPON
37. strumento fornisce varie opzioni per l impostazione della corsa e per il funzionamento dello strumento utilizzando il monitor touch screen o la tastiera integrata Identificazione delle basi in tempo reale il software dello strumento estrae le intensit dalle immagini ed esegue l identificazione delle basi qualitativamente valutate sul computer dello strumento il che permette di monitorare le metriche di qualit durante la corsa e di risparmiare tempo prezioso durante la successiva analisi dei dati L analisi a valle dei dati di sequenziamento pu essere eseguita con il software di analisi Illumina o software di terze parti su IlluminaCompute su BaseSpace Illumina o una infrastruttura personalizzata Connettivit BaseSpace HiSeq 1500 dispone di un opzione per inviare i dati relativi al sequenziamento e alla salute dello strumento tramite la soluzione genomica sul cloud di BaseSpace in tempo reale per semplificare il controllo della qualit e l analisi dello strumento D N codice 15035788 Rev E ITA Componenti di HiSeq 1500 Il sistema HiSeq 1500 include lo strumento un monitor un computer di controllo dello strumento e accessori quali una tastiera un mouse e uno scanner per codici a barre Lo strumento include quattro scomparti principali modulo ottica scomparto della cella a flusso scomparto della fluidica e scomparto reagenti Lo stato operativo dello strumento indicato da una barra di stato illuminata Figura 1 Componenti est
38. to Illumina to aid technical support Illumina Invia informazioni sulla salute del sistema per aiutare il supporto tecnico Illumina permette allo strumento di inviare informazioni a BaseSpace per ogni corsa Tutte le informazioni rimangono confidenziali Illumina raccomanda di attivare questa funzione Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q 3 00S basiH aJemyos Descrizione generale Spazio disponibile su disco 14 Il computer dello strumento HiSeq dispone di una capacit di memorizzazione di pi di 2 7 TB per ciascuna cella a flusso AI completamento di ciascun ciclo di imaging per ciascuna corsia il software verifica lo spazio disponibile sul disco locale D ed E Durante la corsa il software non controlla la posizione della rete Se lo spazio sul disco scende al di sotto di una soglia di sicurezza il software mette in pausa la corsa e pone la cella a flusso in uno stato sicuro Se lo spazio su disco diventa troppo scarso per continuare la corsa rendere disponibile dello spazio Quando diventa disponibile sufficiente spazio su disco la corsa riprende automaticamente N codice 15035788 Rev E ITA Panoramica sul foglio campioni Il foglio campioni un file generato dall utente in formato csv comma separated values valori separati da virgola che contiene informazioni relative alla corsa di sequenziamento Quando la corsa viene avviata il software copia il foglio campioni nella cartella della corsa dove vi
39. una lettura pari a un ciclo in pi rispetto al numero di cicli analizzati Ad esempio per eseguire 125 cicli per la Lettura 1 immettere 126 Per l opzione di indicizzazione Custom Personalizzato immettere il numero di cicli per le letture indici Le lunghezze delle letture non devono essere identiche Confermare le impostazioni predefinite seguenti per la chimica Questi campi sono popolati automaticamente in base all opzione di tipo indice selezionata a SBS TruSeq SBS Kit v3 b Index Indice TruSeq Multiplex Sequencing Primer Box o TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box c PE turnaround Inversione PE TruSeq PE Cluster Kit v3 Opzionale Selezionare Use Existing Recipe Usa ricetta esistente per usare una ricetta personalizzata Altrimenti permettere al software di creare la ricetta in base ai parametri della corsa inseriti N codice 15035788 Rev E ITA Schermata Sample Sheet Foglio campioni I fogli campioni sono opzionali a meno che non si usi BaseSpace per eseguire l analisi dei dati o eseguire una corsa con indicizzazione 1 Selezionare Browse Sfoglia per andare alla posizione del foglio campioni 2 Selezionare Next Avanti NOTA HiSeq Control Software v2 2 permette uno schema di indicizzazione diverso per ciascuna corsia Schermata Reagents Reagenti La schermata Reagents Reagenti registra informazioni sui kit di reagenti utilizzati per la corsa L ID del kit di reagenti numero del codice a barre
40. 0 0000002022 22222222 148 Arresto e ripresa di una corsa 00 iii iii 149 Messa in pausa di una corsa 00 iii 152 Reibridazione primer nes 154 pra Fal pro As A 1 s SN i hi RA NE gt A ti p set x Tn i e gt AS A A Tror y ps l a E rra cm ini nn i Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 1 A 3 Z OJoydey Risoluzione dei problemi Introduzione Questa sezione descrive le possibili soluzioni in caso di problemi durante una corsa di sequenziamento e come eseguire una verifica della fluidica dalla schermata Welcome Benvenuto q 44 N codice 15035788 Rev E ITA Problema Il software non ha eseguito l inizializzazione La leva della cella a flusso arancione La leva della cella a flusso lampeggia arancione La leva della cella a flusso lampeggia verde Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 Possibile causa Il software non stato in grado di inizializzare i dispositivi hardware interni La cella a flusso non collocata correttamente Si persa la chiusura a vuoto I collettori non si sono sollevati Il vuoto fornito ma non adeguato La pressione del vuoto buona Possibili problemi d impostazione della corsa Intervento Chiudere il messaggio d errore e poi lanciare nuovamente il software dello strumento Se il problema persiste riavviare il computer dello strumento Se si riavvia il computer prima speg
41. 0 giorni vedere Spegnimento dello strumento a pagina 124 1 Eseguire un lavaggio di manutenzione completo per lavare completamente il sistema Per maggiori informazioni vedere Esecuzione di un lavaggio di manutenzione a pagina 114 Lasciare la cella a flusso sul piano portacelle con la leva della cella in posizione 2 I collettori rimangono nella posizione sollevata Per le modalit ad output elevato caricare 10 ml di acqua da laboratorio in ciascuna posizione dei reagenti nei rack reagenti Quindi abbassare i pescanti Per la modalit Rapid Run Corsa rapida caricare 10 ml di acqua da laboratorio in ciascuna posizione dei reagenti e 1 ml di acqua da laboratorio nella posizione della stazione di caricamento dei campioni nei rack reagenti Quindi abbassare i pescanti Non spegnere lo strumento Prima di utilizzare di nuovo lo strumento eseguire un lavaggio con acqua Per maggiori informazioni vedere Esecuzione di un lavaggio con acqua a pagina 119 Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q D 3 Gui jpi on111eul 0484S o 9u 0 USLUNA S O 91104 Procedure post corsa Spegnimento dello strumento Spegnere lo strumento solo se non si prevede di utilizzarlo entro i successivi 10 giorni o pi Se si prevede di utilizzare lo strumento entro i successivi 10 giorni vedere Porre lo strumento nello stato inattivo idling a pagina 123 Attenersi alla procedura seguente per porre la fluidica in uno stato di sicurezza e per spe
42. 5039627 1595 Jawa SUOIZepIIQIay 1 5 6 N codice 15035788 Rev EITA Indice PF 135 A arresto di una corsa 149 arresto normale 149 assistenza tecnica 161 B BaseSpace fogli campioni 15 foglio campioni 26 57 C cambio modalit 121 caricamento cella a flusso bolle perdite 35 42 65 72 cella a flusso per priming 33 63 sequenziamento cella a flusso 40 70 caricamento dei reagenti 92 caricamento reagenti 29 31 77 materiali di consumo 28 pesatura 28 fi SBS 28 WI in posizione 2 28 ar a imbuto 28 cartella di output posizione predefinita 12 cella a flusso array casuale 135 caricamento 38 68 102 cluster che attraversano il filtro 135 ID cella a flusso 24 54 85 87 leva 33 40 63 70 98 104 posizioni cluster 132 pulizia 40 70 104 risoluzione dei problemi 145 vano portacella 32 62 97 Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 Ipul cella flusso numerazione delle tile 141 cicli monitoraggio 44 74 108 cluster che attraversano il filtro 135 componenti modulo ottica 3 scomparto della cella a flusso 3 5 scomparto della fluidica 3 scomparto reagenti 3 4 compressione dei dati 136 conferma flusso corretto valori predefiniti 35 42 65 72 correzione matrice colore 133 D determinazione delle fasi phasing predeterminazione delle fasi prephasing 133 documentazione 18 161 doppia indicizzazione impostazioni sulla schermata Recipe Ricetta 25 56 89 su cella a flusso
43. 800 180 8994 Svizzera 0800 563118 Irlanda 1 800 812949 Altri paesi 44 1799 534000 Schede di sicurezza sui materiali MSDS Le schede di sicurezza SDS sono disponibili sul sito Web Illumina all indirizzo support illumina com sds html Documentazione dei prodotti La documentazione dei prodotti in formato PDF pu essere scaricata dal sito web di Illumina Andare al sito support illumina com e selezionare un prodotto quindi fare clic su Documentation amp Literature Documentazione e letteratura Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q 61 291499 EZUA SISSY AAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACC SATAACAGTAACACACTTCTGTIAACCTTAAGATTACTTGT TGATCCACTGATTCAACGTACCGTATCAAT TGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTIAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGT ATOA TAE TAE CANGATTAR AR TA OT A ARA A CAROGTACCGIRACGA AAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACC SATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTIGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTIGATCCACTGATTCAACG TGAGACTAAATATTAACGTTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATA TTAACGTACCATTAAGAGCT TCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTA ATCAATTGAGACTAAATAT TAACGTACTTAACCTIAAGATTACT TGATC
44. A NON ESAUSTIVO GARANZIE IMPLICITE DI COMMERCIABILIT IDONEIT PER UN SCOPO SPECIFICO NON VIOLAZIONE DI DIRITTI ALTRUI O DERIVANTI DA ADEMPIMENTO RAPPORTI COMMERCIALI UTILIZZO O ATTIVIT COMMERCIALE SENZA LIMITAZIONE DELLA GENERALIT DI QUANTO SOPRA ILLUMINA ESCLUDE QUALSIASI DICHIARAZIONE O GARANZIA DI IV N codice 15035788 Rev E ITA QUALSIVOGLIA TIPO IN RELAZIONE ALL UTILIT DI QUESTO PRODOTTO PER L IMPIEGO DA PARTE DELL ACQUIRENTE 8 Garanzia sul prodotto Tutte le garanzie sono personali per l acquirente e non possono essere trasferite o cedute a terzi inclusi affiliati dell acquirente medesimo Tutte le garanzie sono relative a impianti specifici e non vengono trasferite in caso di spostamento del prodotto ad altro impianto dell acquirente a meno che non sia Illumina a predisporre tale spostamento a Garanzia sui materiali di consumo Illumina garantisce che i materiali di consumo diversi da quelli personalizzati saranno conformi alle relative specifiche fino a i 3 mesi dalla data di spedizione da parte di Illumina o ii fino alla data di scadenza o al termine del periodo di validit indicato sul materiale di consumo da Illumina se successivo ma in ogni caso non oltre 12 mesi dalla data di spedizione Per quanto riguarda i materiali di consumo personalizzati vale a dire confezionati in base a specifiche o indicazioni dell acquirente o forniti a Illumina da o per conto dell acquirente Illumina garantisce esclusivamente
45. A RESPONSABILIT DERIVANTE DALL USO IMPROPRIO DEI PRODOTTI QUI DESCRITTI COMPONENTI E SOFTWARE INCLUSI O DA QUALSIASI USO DI TALI PRODOTTI NON ESPLICITAMENTE CONTEMPLATO NELLE LICENZE SCRITTE O NELLE AUTORIZZAZIONI CONCESSE DA ILLUMINA IN OCCASIONE DELL ACQUISIZIONE DEI PRODOTTI STESSI DA PARTE DEL CLIENTE SOLO A USO DI RICERCA 2014 Illumina Inc Tutti i diritti riservati Illumina 24sure BaseSpace BeadArray BlueFish BlueFuse BlueGnome cBot CSPro CytoChip DesignStudio Epicentre GAIIx Genetic Energy Genome Analyzer GenomeStudio GoldenGate HiScan HiSeq HiSeq X Infinium iScan iSelect ForenSeq MiSeq MiSeqDx MiSeq FGx NeoPrep Nextera NextBio NextSeq Powered by Illumina SeqMonitor SureMDA TruGenome TruSeq TruSight Understand Your Genome UYG VeraCode verifi VeriSeq il colore arancione zucca e il design a basi streaming Genetic Energy sono marchi o marchi registrati di Illumina Inc negli Stati uniti e o in altri paesi Tutti gli altri nomi loghi e marchi qui contenuti sono di propriet dei rispettivi titolari Questo software contiene la libreria SegAn concessa in licenza a Illumina e distribuita conformemente alle condizioni della seguente licenza Copyright 2010 Knut Reinert FU Berlin Tutti i diritti riservati Sono consentiti la ridistribuzione e l uso nei formati sorgente e binario con o senza modifiche purch siano rispettate le condizioni di seguito riportate 1 La ridistribuzione del codice
46. AACGAACGTA TTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACC GATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTIAAGATTACTT PARTO CACICALTCAAGG FACCGTAACGAAI ACTA TCAAT TGAGACTAAATATTAACGT ACA MAA CACCTACCGTOCAA ACGA OINA TCA TAACAGTAACACACTTCTGTI COA TRAGAGCIACOGTCAACAGIAACACATICIGIIRAGCITANGATIACI TGRI GCACIGATTGAACGIACCGTAACGAACGTATONATIGAGACTAANIATTAACGIACCAT TAAGAGCTACCETGORACGACGAMAAGNA GATA SATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTICT MTAAGATTI POLI GAI ERAGTRATI CARLO GTACCGT AACOMACOT ATCATTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGA CORARACAA SAT TAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTI TERI CCAGIGRI TORACGITAAGATTAGITGAICCACTGATTORAGGIACCGIAACGAROGTATCARITGAGOTTCTGTIAAGOTTRAGATTAGITGATCCAGIGALTERAGGIAGCE TRACGARCGTATOAATTGAGAGIACCANOGROGI AAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACC Illumina San Diego California 92122 U S A 1 800 809 ILMN 4566 1 858 202 4566 fuori dal Nord America techsupport illumina com www ilumina com
47. ARGAGG TACCO TETTO TAITANCO TARGATI ACTTGATCORCI GATTARA SITGES A RO e MU ell E ACCGTAACGAACGTATCAATTGAGCTICTGTTAACCTTAA A dde GATTCAACGTY POATA A ECAA GGA CTAGCAACGACG TGA AAATATTAACGTACCATTAAGAGTC AACCTT TTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGAAAAGAATGATAACAGT GTACCTAAGGAAOGTATCATTARGATTACITGATGCACTGATTCAACGTA CCG TAACGAAGGIATCAATI GAGACTARATAT TARCGIAGCATTRAGAGETACORI SCAACGROGAAAAGAAI GATRACAGIAAGAGACTIIGITANGCI I Al Cas CGTTAAGATTACTTGATCCACTI A EA RO CA O GCTICTGTTAACCTTAAGATTACTT Til GATTCAACGTACCGTAACGAACGTA TEAT TORRA TONIC GCG GAAAAGAA AACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTG AACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAAC CGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACC GATAACAGIAACACAGI LO TOT TAACOT IRAGAN IACIT TIGRIGCACIGATI CAACGIACCOTATCARI FGAGAC IAAATAI ERACGTACOATIAAGAGOTACOGIOTIOTGTIAACO TIAAGATIAC EGAICGAC TSAI TCAA TAGOS O TEOT AE SOTIA TAO AGD DACARA CGTATCAA eA GACT A TAREE TROCA TAAGAGCTA CCGTCTTCTGTT GARNI GATTACTTGATCCACTI a ACCGTAACGA SAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATT ATCCACTGATTCAACGTACCGIAAAGATTACTTGATCCACTGAT TCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATAT TAACGTACCATTAAGAGCTACC ia EN AAA CO IAEA TACTIGATOCACTOA TOMACOTACCGIAACOAACOTATOMATIGAGACT RAATAI TAAGGIAGCAT IAAGAGCIACOGTOTICI GI TAACCI IARGAI TACTIGATOCACIGRI TOMACI TTGAGACTAAATATTAACGITGTTAACCTTAAGA INCI GATCCACTGATTCAACGTA A E A nO AAGAGCTTCTGITAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTOAACGTACCGIA TATCAATTGAGA CTARATATT
48. ATGA GAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGT TAACCTIAAGATTACTIGATCCACTGATTCAACGT ACC AAA CTTSA CCA TGATICAACCT ACCGTAACGAA CE DATCRATIGAGACTARNATIAACGH ACCATTAAGAGCTACC O o ro RATA AACO TAGGA IRAGAGOTACOGTCRACGAOGAANAGARI GATAACAGTAACACAC CIO ACCATTAAGAGCTACCGTGCAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTI RA A REGINA CO CRI CARIOCA CTAAATATTAACGT ARCHI IRASAGCIA COGI ERA CGAAAAGAATGAT GATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCA AGA TACCGTCTTCTGITAACCTTAAGATTI CONECTATI CAA ACC TAACOAACO TA CAT AAGA TIACTTGATCCACTON TCRACATACCGTAACGAACGTAT CRA SAGACTARATAT TRACGIAGOATIRAGAGCTACOGI GORACGACGRAAAGARI GATAACAGAAGAGAGHICIETTARGCU CTTGATCCACTGATTEAACGTTAAGATTACITGATOCACTGATTOAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGCTTCTETTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTI A A FATCAATTGAGACTAGCAACGACG ATAACAGTAACACACTTCTGTIAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACT TGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGIACCAT TAAGAGCTACC AC CTGITAACCTTAAGA T AACGTA GACTAAATATTAACGTACCA CTA T AAGATTAC CCGT AACGTAT CT TTAAC C Ci AACGACGAAAMAG A ACTTCTGTTAAC AACAGTAACACACTITCTGTITAACCTTAAGATT TI GATEGALICATEARRET ACCGTAAAGATTACT TGATCCACTGATTCAACGT a GAGARIARSL ATTAACGT ACCATTAAGAGLTAC ATACA TACO TECARCAGINACACACITET GTT ANETT AAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAAA TACCAT TAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAA GATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTIAAGATTACT TGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACT RARTATTAACGTAOCATT
49. CACTGATTCAACGITACCGTAACGAACGTCTICTGTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAACGACGA 3ACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGATAACAGTAACACA GATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTICTGTTAACCTTAAGATTACT TGATCCACTGATTCAACG CCATTAAGAGCTACCGTGCAACTTAACCTTAAGATTACTTGATECACTGATTEAACGIACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGAT CTACCGTGCAACGAAAATAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACTICTGTTAACCTIAAGATTACTIGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGAT ARTA A O A tt TTEA BAGA TAAT TAE TEA So GATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTI a a a TCAATTGAGACT e Dee NS CM ala CGACGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTICTGTI CCAT TAAGAGCTACCGTGCAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGATAA SATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACG GTACCGT a ATCAATTG O e r a TTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTICTGTTAACCTTA E A CA CGTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGCTICTGTIAACCTTY A A ORTA TADA TCAATTGAGACTAGCAACGACG NN AA CATA CACACICTGTIRAC Tp AAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGIAAAGATTACTT CTRAAIAI TANC
50. Corsa rapida 1 04 N codice 15035788 Rev E ITA Figura 45 Cella a flusso posizionata sui perni guida superiore e destro A Perno guida superiore B Perni guida destri E y NOTA y Rimuovere la mano dalla cella a flusso prima di attivare l interruttore della pompa a vuoto per prevenire possibili perdite di allineamento nel tempo 3 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per attivare la pompa a vuoto e assicurare la cella a flusso in posizione Quando la leva della cella a flusso verde la pompa a vuoto posizionata correttamente Figura 46 Leva della cella a flusso in posizione 1 4 Attendere circa cinque secondi quindi spostare lentamente la leva della cella a flusso nella posizione 2 Quando la leva della cella a flusso verde fisso i collettori sono in posizione e la cella pronta per l uso Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q O 5 ossn e elja eun IP OJUALUEILEI Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida Figura 47 Leva della cella a flusso in posizione 2 Assicurarsi che la casella di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva sia selezionata sulla schermata Load Sequencing Flow Cell Caricamento della cella a flusso di sequenziamento Conferma del flusso corretto 106 Selezionare la soluzione 5 USB dall elenco a tendina Assicurarsi che vengano inseriti i seguenti valori predefiniti Volume Volume 250 Aspirate Rate Velocit di aspirazione 1500 Dispe
51. GTAGCAL GTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACCG SATAA AQTRACACAC TTCTGTTAACCTTAAGAT TACTTGATCCACTGATICAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAAC ATAAGAGO TACCGTCTTCTGTTAACCTIAAGATTACTIGA ar STACCETAACEMACGIA TCATTAAGATTACTTGATECACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTETTAACCTTI AAAAAGAATGATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTA CACATCCASTOATT CARGO TACCO TARAGATTACITOATOCACIGATTCAACGTAGOCTRACGMACGIATCAATTEAGACIARATATIRACGIACGATTARGAGCIACO CCATTAAGAGCTACCGTGCAACAGTAACACACTTETETTAACCTTAAGATTACTTGATECACTGATTCAACGIACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGATAA GATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACCGTCTICTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACG TTGATCCACTGATTCAACGTIAAGATTACTIGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGCTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAGCAACGACG A A TO AT GTACCGTAACGAACGTATCATTAAGATTACT GATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGA I Ne ai ACCGTGCAACGACGAAAAGAATGATAACAGTAACACACTICTGT TAACCTTA 3 TTGATCCACTGATTCAACGTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGCTICTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAGCAACGACG AAAAGAATGATAACAGTAACACACTICTGTIAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACT TGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACC 3ATAACAGTAACACACTTCTGTIAACC
52. Hib g Control Software 8 info su versione 12 inizializzazione 6 mostrare file di registro 12 Real Time Analysis 8 risoluzione dei problemi 145 Sequencing Analysis Viewer SAV 8 Software di controllo HiSeq 14 visualizzare a schermo intero 12 software bcl2fastq 127 Software di controllo HiSeq HCS 14 soluzione lavaggio di manutenzione conservazione 114 soluzione lavaggio manutenzione preparazione 115 smaltimento 114 spazio su disco verifica 14 spegnimento dello strumento 124 spegnimento strumento 124 statistiche file 127 striscia 24 54 87 T training online 18 U unit DoNotEject Non espellere 6 V vano portacella perni guida 33 40 63 70 posizioni fori vuoto 32 62 97 verifica sistema 9 visualizzazione contemporanea tra canali 133 N codice 15035788 Rev E ITA Assistenza tecnica Per assistenza tecnica contattare l Assistenza tecnica Illumina Tabella 16 Dati di contatto generali Illumina Indirizzo 5200 Illumina Way San Diego CA 92122 U S A Sito Web www illumina com E mail techsupport illumina com Tabella 17 Numeri di telefono Assistenza clienti Illumina Area geografica Numero di contatto Area geografica Numero di contatto Nord America 1 800 809 4566 Italia 800 874909 Austria 0800 296575 Norvegia 800 16836 Belgio 0800 81102 Paesi Bassi 0800 0223859 Danimarca 80882346 Regno Unito 0800 917 0041 Finlandia 0800 918363 Spagna 900 812168 Francia 0800 911850 Svezia 020790181 Germania 0
53. PE Cluster Kit v2 o HiSeq Rapid SR Cluster Kit v2 5 Opzionale Selezionare la casella di controllo Use Existing Recipe Usa ricetta esistente per usare una ricetta personalizzata Altrimenti permettere al software di Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 8 Q es109 ejjap 11jauesed lep ojuawJesu creare la ricetta in base ai parametri della corsa inseriti Schermata Sample Sheet Foglio campioni I fogli campioni sono opzionali a meno che non si usi BaseSpace per eseguire l analisi dei dati eseguire una corsa di indicizzazione o pianificare il monitoraggio delle prestazioni per il de multiplexing utilizzando il software Sequencing Analysis Viewer SAV Per ulteriori informazioni vedere Guida per l utente del software Sequencing Analysis Viewer SAV n codice 15020619 1 Selezionare dalle opzioni seguenti per specificare il metodo di generazione di cluster Selezionare On Board Cluster Generation Generazione di cluster sullo strumento per eseguire la generazione di cluster integrata sullo strumento Se la generazione di cluster stata avviata su cBot selezionare Template Hybridization on cBot Ibridazione templato su cBot 2 Selezionare Next Avanti 3 Nel campo Sample Sheet Foglio campioni selezionare Browse Sfoglia per andare alla posizione del foglio campioni 4 Selezionare Next Avanti Schermata Reagents Reagenti La schermata Reagents Reagenti registra informazioni sui kit di reagenti utilizzati p
54. Quando il numero di cicli comincia a essere basso il software chiede all utente di caricare reagenti freschi 4 Selezionare Prime SBS Reagents Priming reagenti SBS per eseguire il priming dei reagenti prima di avviare una corsa Eseguire sempre il priming dei reagenti prima di caricare una cella a flusso nuova 5 Selezionare Next Avanti Schermata Review Revisione 1 Rivedere i parametri della corsa dalla schermata Review Revisione 2 Selezionare Next Avanti per procedere o selezionare Back Indietro per modificare i parametri Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 gt T es109 ejjap 11jaeuesed lep ojuauJesu Esecuzione di una corsa HiSeq v4 Caricamento e priming dei reagenti Dopo aver immesso i parametri della corsa caricare i reagenti SBS di indicizzazione e paired end per la corsa e quindi eseguire il priming dei reagenti nel sistema di fluidica Il software guida l utente in questo processo tramite una serie di schermate sulla scheda Pre Run Setup Impostazioni pre corsa Materiali di consumo forniti da Illumina 8 tappi a imbuto Materiali di consumo forniti dall utente Flacone da 250 ml Corning n di catalogo 430776 Provette coniche da 15 ml Corning n di catalogo 430052 Acqua da laboratorio NOTA Per preparare il risciacquo post corsa al termine di una corsa di sequenziamento caricare 25 ml di PWI o di acqua da laboratorio nella posizione 2 Il risciacquo post corsa non sostituisce il lavaggio p
55. SABILIT OGGETTIVA INCLUSI I CASI DI NEGLIGENZA O ALTRO DERIVANTI DALL UTILIZZO DEL PRESENTE SOFTWARE ANCHE NEL CASO IN CUI SIANO STATI INFORMATI DELLA POSSIBILIT DEL VERIFICARSI DI TALI DANNI Leggere prima di usare questo prodotto Questo prodotto il suo utilizzo e disposizione sono soggetti ai seguenti termini e condizioni Se l acquirente non concorda con questi termini e condizioni l acquirente non autorizzato da Illumina ad utilizzare questo prodotto e l acquirente non deve utilizzare questo prodotto 1 Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 Definizioni PI per applicazioni specifiche indica diritti di propriet intellettuale controllati o di propriet di Illumina che riguardano questo prodotto e il suo utilizzo solo in relazione ad ambito i o applicazione i specifiche La PI per applicazioni specifiche esclude ogni propriet intellettuale controllata o di propriet di Illumina relativa a elementi o caratteristiche di questo prodotto o del suo utilizzo che siano comuni a tutte le possibili applicazioni e a tutti i possibili ambiti di utilizzo di questo prodotto di seguito la PI base La PI per applicazioni specifiche e la PI base sono sottoinsiemi separati e non coincidenti nemmeno in parte di tutti i diritti di propriet intellettuale posseduti o controllati da Illumina A titolo esemplificativo ma non esaustivo i diritti di propriet intellettuale di Illumina per metodi diagnostici specifici per metodi foren
56. TERZI PER COSTI DI ACQUISIZIONE DI PRODOTTI O SERVIZI SOSTITUTIVI LUCRO CESSANTE PERDITA DI DATI O OPPORTUNIT COMMERCIALI O PER DANNI INDIRETTI SPECIALI ACCIDENTALI ESEMPLARI CONSEGUENTI O PUNITIVI DI QUALSIASI TIPO DERIVANTI O COLLEGATI A TITOLO ESEMPLIFICATIVO MA NON ESAUSTIVO CON LA VENDITA DI QUESTO PRODOTTO IL SUO UTILIZZO L ADEMPIMENTO DI ILLUMINA AI SENSI DELLA PRESENTE O CON UNO O PI DEI PRESENTI TERMINI E CONDIZIONI QUALUNQUE NE SIA LA DERIVAZIONE O LA CAUSA E INDIPENDENTEMENTE DAL TITOLO DI RESPONSABILIT CONTRATTUALE PER ILLECITO INCLUSA LA NEGLIGENZA RESPONSABILIT OGGETTIVA O ALTRO 6 LA RESPONSABILIT TOTALE E COMPLESSIVA DI ILLUMINA NEI CONFRONTI DELL ACQUIRENTE O DI TERZI DERIVANTE O IN CONNESSIONE CON I PRESENTI TERMINI E CONDIZIONI INCLUSI A TITOLO ESEMPLIFICATIVO MA NON ESAUSTIVO QUESTO PRODOTTO E IL SUO UTILIZZO E L ADEMPIMENTO DI ILLUMINA AI SENSI DELLA PRESENTE A TITOLO DI RESPONSABILIT CONTRATTUALE ILLECITO INCLUSA LA NEGLIGENZA RESPONSABILIT OGGETTIVA O ALTRO IN NESSUN CASO POTR SUPERARE L IMPORTO CORRISPOSTO A ILLUMINA PER QUESTO PRODOTTO 7 Limitazioni sulle garanzie fornite da Illumina NEI LIMITI CONSENTITI DALLA LEGGE E IN CONFORMIT CON LA GARANZIA ESPLICITA DEL PRODOTTO PREVISTA DAI PRESENTI TERMINI E CONDIZIONI ILLUMINA NON FORNISCE ED ESCLUDE ESPRESSAMENTE QUALSIASI GARANZIA ESPLICITA IMPLICITA O DI LEGGE IN RELAZIONE A QUESTO PRODOTTO COMPRESE A TITOLO ESEMPLIFICATIVO M
57. TTAAGATTA E E OE KALE I a AE ea E i SS Ai Si ERI A E ATTACTT A n ACTGATTCAACGTACCAAGATTACTIGATCCACTGAT TCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACCGTCTICTGTTAACCTTAAGATTACT TGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGA S ARRAGAATGATAAOAGIAAGACACTICIGT TAACCITRAGAI TACI TERICCRCIGATTGARCGTACOGIRAAGATIACI FAI COACTGATICAAOGTACOGIAACGAACGIATCARI IGAGACIARATATIAACGIAGCAI TARGAGGIAGO PO a E GTTAACCTTAAGATTACTIGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAA a a GATTACTTGATCCACTGATTCAACG TGAGACTAAATATTAACGTTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAAATA MESE Sal GCTTCTGITAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTOAACGTACCGTA ATCAATTGAGA CTARATATTI FAACGTACTTAACCTTAAGATTACTTGATCECACTGATTCEAACGTACCGTAACGAACGTCTTCETGTTAACCTTAAGATT AENEMECACIGATICAACGI ACCGIAACGAACGTATCAATTGAGACTAACGACGA SATAACAGTAACACACTTCTGTIAACCI TRAGNI PASTI GATOCACTOAT TOMOS TACOO TARO GAACO IRTOAATTGAGACIAANIAT TAACGIAGOAIIRAGAGOIACOGICI ICTGT ARCO ITANGNITACITBATCOACIGATICRACG GATAACAGTAACACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACT TGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTA TTCTG CCTTAAGATTACT TGATCCACTGA ICCATTAAGAGCTACCGTGCAACTTAACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACCGTGCAACGACGAACTICTGTTAACCTTAAGATTACTTGAT SO TACOS GCMACGARAAIRACCTTARGRI TACTTGRI CCATGATICAACGIACIICIGITAROOTIAAGATIACI GATOCACTOA CAACGIACO ein AAAAGAATGA e ETOT AACCTIAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGT
58. a _ lettura _ tile txt la tile rappresentata da un numero a quattro cifre che indica superficie striscia e tile Creati all inizio della corsa i file di configurazione del software Real Time Analysis elencano le impostazioni per la corsa Data Intensities RTAConfiguration xml Le statistiche create all identificazione delle basi per ciascun ciclo Data Intensities Basecalls L00 X C X 1 i file sono archiviati in una cartella per ciascuna corsia e una sottocartella per ciascuna tile Elenca il nome della corsa il numero di cicli in ciascuna lettura se la lettura una lettura indicizzata e il numero di strisce e tile sulla cella a flusso Il file informazioni corsa viene creato all inizio della corsa Cartella della corsa livello base RunInfo xml Un immagine in miniatura per ciascun canale e tile in ciascuna striscia a ogni ciclo durante l imaging Thumbnail Images L00 X C X 1 i file sono archiviati in una cartella per ciascuna corsia e una sotto cartella per ciascun ciclo s_ corsia _ tile _ canale jpg la tile rappresentata da un numero a quattro cifre che indica superficie striscia e tile Vedere Numerazione delle tile a pagina 141 N codice 15035788 Rev E ITA Struttura della cartella di output Config le impostazioni di configurazione per la corsa Dati F Intensities BaseCalls LOO X i file di identificazione delle basi per ciascuna corsia aggregate in un file per ciclo
59. a all incorporazione della prima base al termine dell imaging del primo ciclo In questa fase la corsa si mette in pausa 1 Dalla finestra di dialogo di conferma rivedere First Base Report Report sulla prima base 2 Sei risultati sono soddisfacenti selezionare Continue Continua N codice 15035788 Rev E ITA Procedure post corsa Al termine della corsa rimuovere e pesare i reagenti ed eseguire un lavaggio dello strumento Per maggiori informazioni vedere Procedure post corsa a pagina 111 es109 Ejjap cib BEJONUOIN Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 A 5 46 N codice 15035788 Rev E ITA Esecuzione di una corsa Truseq v3 Introduzione nd 48 Flusso di lavoro per il sequenziamento TruSeQ V3 000 50 Tipi di corsa per la chimica TruSeq V3 0 0 0 52 Inserimento dei parametri della corsa 000 53 Caricamento e priming dei reagenti 000 59 Caricamento di una cella a flusso 00000 a000 0000o anaa anaoa anona an naaa 68 Monitoraggio della cotfsa iia 74 Preparazione dei reagenti per la Lettura 2 ooccccccccccccccccccccccccccccccccccccccncnnncnnnns 76 Caricamento dei reagenti per la Lettura 2 17 A yr sa Carro Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 47 e oJoydey Esecuzione di una corsa TruSeq v3 Introduzione Per eseguire una corsa TruSeq v3 su HiSeq 1500 preparare i reagenti SBS per Lettura 1 e i reagenti d
60. a del vano portacella 1 Aprire lo sportello dello scomparto della cella a flusso y ATTENZIONE Non porre liquidi sullo sportello dello scomparto della cella a flusso o sul piano portacelle quando lo sportello aperto Fuoriuscite di liquido in quest area possono danneggiare lo strumento 2 Assicurarsi che la leva della cella a flusso sia in posizione OFF Figura 23 Leva della cella a flusso in posizione 0 3 Indossare un nuovo paio di guanti in lattice privi di polvere 4 Se presente una cella a flusso usata in una corsa precedente rimuoverla e metterla da parte in una provetta di tampone di conservazione o acqua da laboratorio per evitare che si asciughi La si pu utilizzare per verificare il corretto flusso prima di caricare la cella a flusso con cluster 6 2 N codice 15035788 Rev E ITA 5 Usando una salvietta imbevuta di alcol o un panno che non lascia residui imbevuto di etanolo o isopropanolo pulire la superficie del vano portacella fino a quando non pulita Y ATTENZIONE Non far sgocciolare l alcol nei fori della pompa a vuoto o intorno ai collettori Se necessario utilizzare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per asciugare il piano 6 Ispezionare visivamente il vano portacella per assicurarsi che sia privo di fibre e che i fori della pompa a vuoto siano privi di ostruzioni Figura 24 Posizioni dei fori della pompa a vuoto Caricamento di una cella a flusso per il priming Dal
61. a procedura di impostazione stata selezionata l opzione Confirm First Base Conferma prima base viene visualizzata automaticamente la finestra di dialogo di conferma relativa all incorporazione della prima base al termine dell imaging del primo ciclo In questa fase la corsa si mette in pausa 1 Dalla finestra di dialogo di conferma rivedere First Base Report Report sulla prima base 2 Sei risultati sono soddisfacenti selezionare Continue Continua N codice 15035788 Rev E ITA Procedure post corsa Al termine della corsa rimuovere e pesare i reagenti ed eseguire un lavaggio dello strumento Per maggiori informazioni vedere Procedure post corsa a pagina 111 es109 Ejjap cib BEJONUOIN Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 v 5 Preparazione dei reagenti per la Lettura 2 Prima della conclusione della Lettura 1 e di ogni eventuale Lettura Indici preparare i reagenti per la risintesi Lettura 2 e ICB fresco per la Lettura 2 Per le istruzioni sulla preparazione dei reagenti vedere la Guida di preparazione dei reagenti di TruSeq PE Cluster Kit v3 n codice 15023336 Questa guida include le istruzioni per la preparazione dei reagenti di sequenziamento forniti nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box NOTA Per prestazioni ottimali Illumina raccomanda di preparare ICB Incorporation Mix fresco per la Lettura 2 Esecuzione di una corsa TruSeq v3 6 N codice 15035788 Rev E ITA Caricamento dei re
62. agenti per la Lettura 2 Dopo il completamento della Lettura 1 e di tutte le eventuali Letture Indici caricare i reagenti paired end per la risintesi Lettura 2 e ICB da una preparazione fresca per la Lettura 2 Caricamento dei reagenti PE 1 2 6 Registrare il peso di ciascun reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio Sollevare i pescanti per il rack dei reagenti PE effettuando i seguenti movimenti a Tirare la maniglia verso di s e sollevare la maniglia b Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Assicurarsi che la maniglia sia posizionata correttamente nell alloggiamento Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti usando la maniglia del rack Rimuovere i tappi da ogni provetta di reagente Posizionare ciascuna provetta di reagente sul rack nelle posizioni numerate associate Tabella 9 Posizioni dei reagenti PE Posizione 10 11 12 13 14 15 16 18 19 NOTA Reagente RMR LMX2 BMX AMX2 APM2 AT2 HP7 o HP11 HP3 HT2 Descrizione Resynthesis Mix Linearization Mix 2 Blocking Mix Amplification Mix 2 AMX2 Premix 100 Formammide Primer sequenziamento Lettura 2 Soluzione di denaturazione Tampone di lavaggio Per le corse paired end a doppia indicizzazione RMR viene caricato con i reagenti di indicizzazione prima dell avvio della corsa Per le corse a singola indicizzazione o non indicizzate RMR viene caricato con i reagenti pai
63. ante una corsa 152 Se la corsa stata avviata con un volume di reagenti solo parziale utilizzare la funzione Change Reagents Cambia reagenti per mettere in pausa la corsa e riempire i reagenti 1 Dalla schermata Run Overview Panoramica corsa selezionare Pause Pausa Si apre il menu Pause Pausa 2 Selezionare Change Reagents Cambia reagenti 3 Selezionare Yes S per confermare il comando pausa Il software completa il comando corrente per la chimica o per l imaging pone la cella a flusso in uno stato sicuro e apre la schermata Reagents Reagenti 4 Sulla schermata Reagents Reagenti inserire i seguenti parametri del reagente L ID del kit di reagenti per i nuovi reagenti Il numero di cicli per i quali si prevede che i reagenti dureranno N codice 15035788 Rev E ITA NOTA f Sulla schermata Change Reagents Cambia reagenti la casella di spunta per il priming disabilitata Il priming non necessario 5 Selezionare Next Avanti per passare al caricamento dei reagenti Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 1 5 3 esoo eun IP esned ul essa Risoluzione dei problemi Reibridazione primer Una corsa di reibridazione ripete la fase di sequenziamento di ibridazione dei primer Se le metriche della corsa indicano un numero basso di cluster intensit basse di cluster o altri problemi eseguire una reibridazione primer per salvare la cella a flusso La reibridazione primer non danneggia i cluster sulla
64. are Cancel Annulla per uscire dall impostazione della corsa e tornare alla schermata Welcome Benvenuto Schermata Integration Integrazione La schermata Integration Integrazione fornisce l opzione di collegare la corsa a BaseSpace Per collegarsi a BaseSpace attenersi a quanto segue 1 Selezionare BaseSpace 2 Selezionare da una delle seguenti opzioni BaseSpace Storage and Analysis Archiviazione e analisi invia i dati della corsa a BaseSpace per il monitoraggio remoto e l analisi dei dati Con questa opzione richiesto un foglio campioni Run Monitoring Only Solo monitoraggio corsa invia solo i file InterOp a BaseSpace che permettono di monitorare la corsa in remoto 3 Accedere a BaseSpace utilizzando l e mail e la password dell account Mylllumina 4 Selezionare Next Avanti Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 5 3 es109 E jap 11jauesed lep ojuauwJesu Esecuzione di una corsa TruSeq v3 Per proseguire senza collegarsi a BaseSpace attenersi a quanto segue 1 2 Selezionare None Nessuno Selezionare Next Avanti Schermata Storage Archiviazione 1 4 Selezionare la casella di controllo Save to an output folder Salva in una cartella di output e selezionare Browse Sfoglia per andare a una posizione della rete preferita Se per l archiviazione e l analisi la corsa collegata a BaseSpace questo campo facoltativo Selezionare Zip BCL files Comprimi file BCL per ridurre lo spazio di a
65. avaggio dello strumento 114 lavaggio di manutenzione 9 114 lavaggio manutenzione durata 121 122 leva cella a flusso posizione 0 32 62 97 posizione 1 33 40 63 70 posizione 2 33 40 63 70 M materiali di consumo forniti dall utente 16 kit di sequenziamento Illumina 20 48 80 materiali di consumo forniti dall utente 16 materiali di consumo per il sequenziamento 20 48 80 modalit cambio 121 modalit sequenziamento cambio 121 modulo ottica 3 O corsa 44 74 108 mostrare file di registro 12 N nome esperimento 24 numerazione delle tile 141 P pagina stato 44 74 108 pesatura dei reagenti dopo una corsa 113 N codice 15035788 Rev E ITA pesatura reagenti prima della corsa 28 porre lo strumento nello stato inattivo idling 123 posizione cluster file 127 137 generazione griglia per identificazione cluster 132 posizioni cartelle impostazioni predefinite 12 posizioni dei reagenti paired end 7 posizioni reagenti indicizzazione 60 A 29 31 BS 28 posizioni reagenti SBS 28 predeterminazione delle fasi prephasing empirica 133 priming preparazione 37 67 101 volume degli scarti 37 67 101 probabilit errore 135 punteggi qualitativi 135 generazione 130 raggruppamento 136 punteggi qualitativi Q scores 135 R reagenti caricamento 29 31 60 77 caricamento ICB 78 caricamento SBS 92 paired end 29 31 paired end 77 priming 37 67 101 registrazione ID kit 27 57 90 scaricamento 113
66. bnails Salva miniature delle tile salva le immagini in miniatura delle tile Le immagini in miniatura delle tile rappresentano una singola tile piuttosto che un campionamento di tile in una striscia 4 Selezionare Next Avanti Schermata Flow Cell Setup Impostazione cella a flusso La schermata Flow Cell Setup Impostazione cella a flusso registra le informazioni sulla cella a flusso utilizzata per la corsa 1 Selezionare un tipo di kit di reagenti TruSeq Rapid v1 o HiSeq Rapid v2 Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 87 es109 ejjap 11jauesed lep ojuauwJesu Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida Eseguire la scansione del codice a barre della cella a flusso o inserire l ID numero del codice a barre della cella a flusso da sottoporre a sequenziamento L ID della cella a flusso usata per determinare il tipo di cella a flusso e la compatibilit dei reagenti Confermare che il tipo di cella a flusso sia corretta TruSeq Rapid Flow Cell v1 o HiSeq Rapid Flow Cell v2 Il tipo di cella a flusso viene selezionato automaticamente in base all ID della cella a flusso Inserire un nome per l esperimento Il nome dell esperimento appare su ciascuna schermata per permettere di identificare la corsa in esecuzione Inserire un nome utente Selezionare Next Avanti Schermata Advanced Avanzato 38 Opzionale Selezionare la casella di controllo Confirm First Base Conferma incorporazione prima base Un repo
67. campioni sono opzionali a meno che non si usi BaseSpace per eseguire l analisi dei dati o eseguire una corsa con indicizzazione 1 Selezionare Browse Sfoglia per andare alla posizione del foglio campioni 2 Selezionare Next Avanti 2 NOTA f HiSeq Control Software v2 2 permette uno schema di indicizzazione diverso per ciascuna corsia D 6 N codice 15035788 Rev E ITA Schermata Reagents Reagenti La schermata Reagents Reagenti registra informazioni sui kit di reagenti utilizzati per la corsa L ID del kit di reagenti numero del codice a barre che inizia con RGT viene utilizzato per determinare il tipo di kit di reagenti e la compatibilit con la modalit della corsa 1 Eseguire la scansione o immettere l ID del kit di reagenti SBS 2 Perle corse paired end scansionare o inserire l ID del kit di reagenti per il kit cluster paired end 3 Selezionare il kit di reagenti SBS per la corsa Selezionare 250 Cycles 250 cicli per un kit da 250 cicli I cicli rimanenti si fermano al valore preimpostato di 275 Selezionare 50 Cycles 50 cicli per un kit da 50 cicli I cicli rimanenti si fermano al valore preimpostato di 74 Selezionare Custom Personalizza per un kit parziale o kit multipli da 50 cicli Nel campo Cycles Remaining Cicli rimanenti inserire il numero di cicli SBS per i quali si prevede che i reagenti dureranno y NOTA Per i kit parziali il software esegue un conteggio alla rovescia sul numero di cicli inserito
68. canti per il rack reagenti per il sequenziamento effettuando i seguenti movimenti a Tirare la maniglia verso di s e quindi sollevare la maniglia b Rilasciare la maniglia del pettine di aspirazione nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Assicurarsi che la maniglia del pettine di aspirazione Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 5 9 11usbea rap Bulud a OJUSLUBoLIeo Esecuzione di una corsa TruSeq v3 sia posizionata correttamente nell alloggiamento 5 Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti 6 Posizionare ogni flacone di reagente sul rack nelle posizioni numerate associate Assicurarsi che l estremit conica del flacone sia posizionata nella tacca alla base del rack Tabella 5 Posizioni dei reagenti SBS Posizione 1 SINA Ta A O N Reagente ICB PWI 25 ml SRE Tampone SBS 1 SB1 Tampone SBS 2 SB2 Tampone SBS 2 SB2 CMR Tampone SBS 3 SB3 Descrizione Incorporation Mix Tampone di lavaggio Scan Mix Reagent High Salt Buffer Incorporation Wash Buffer Incorporation Wash Buffer Cleavage Mix Reagent Cleavage Buffer 7 Aggiungere 25 ml di PWI o di acqua da laboratorio al flacone nella posizione 2 8 Far scorrere il rack reagenti nello scomparto reagenti allineando il rack con la guida sulla parte inferiore dello scomparto 9 Abbassare i pescanti nei flaconi di reagente per il sequenziamento come segue a Tirare la maniglia del pettine di aspirazione ver
69. ccccono 127 Monitoraggio delle metriche della corsa 130 Flusso di lavoro Real Time Analysis 00010 oaa ora orrira 132 File di output del sequenziamento cnn 137 Struttura della cartella di output aaao 222a 2222222221 139 Numerazione delle tile 00 00 141 Immagini in miniatura thumbnail 0000 00 142 gt at telai a at MT o pr A ica na Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 1 D 5 9 oJoydey Software Real Time Analysis Introduzione Durante una corsa di sequenziamento su HiSeq 1500 il software Real Time Analysis esegue l analisi delle immagini e l identificazione delle basi integrate sullo strumento il che permette di risparmiare tempo prezioso durante la successiva analisi dei dati 1 D 6 N codice 15035788 Rev E ITA Panoramica sul software Real Time Analysis Real Time Analysis viene eseguito sul computer dello strumento esegue l identificazione delle basi e assegna un punteggio qualitativo a ciascuna identificazione delle basi Il software monitora lo stato di ciascuna tile e determina quando passarla alla fase successiva del processo Quando una tile passa alla fase successiva il software Real Time Analysis crea un file per la fase completata e avvia la fase successiva Cos il software pu determinare lo stato di ciascuna tile in base a quale file stato creato Se il software Real Time Analysis
70. cella a flusso Cella a flusso HiSeq v4 Tutte le fasi di reibridazione sono eseguite su HiSeq 1500 Il kit include primer per Lettura 1 Lettura Indice 1 Lettura Indice 2 per celle a flusso unidirezionali e Lettura 2 Nome kit per reibridazione Istruzioni per il flusso di lavoro HiSeq Multi Primer Rehyb Kit v4 Guida per la reibridazione primer HiSeq n di N di catalogo GD 403 4001 catalogo 15050105 Cella a flusso HiSeq v3 La reibridazione primer per Lettura 1 viene eseguita su cBot Il kit include una piastra dei reagenti cBot contenente il primer di sequenziamento HP6 per Lettura 1 Per le librerie Nextera usare HP10 contenuto nella confezione TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box Nome kit per reibridazione Istruzioni per il flusso di lavoro TruSeq v2 cBot Multi Primer Rehyb Kit Read 1 Primer Rehybridization on the cBot n N di catalogo GD 304 2001 codice 15018149 Cella a flusso Rapid Tutte le fasi di reibridazione sono eseguite su HiSeq 1500 Il kit include primer per Lettura 1 Lettura Indice 1 Lettura Indice 2 per celle a flusso unidirezionali e Lettura 2 q 5 A N codice 15035788 Rev E ITA Nome kit per reibridazione HiSeq Rapid Rehyb Kit N di catalogo GD 404 1001 TruSeq Rapid Rehyb Kit N di catalogo GD 402 2001 Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 Istruzioni per il flusso di lavoro HiSeg Rapid Run Primer Rehybridization n codice 15059379 TruSeq Rapid Run Primer Rehybridization n codice 1
71. cessivamente o l elaborazione personalizzata Come impostazione predefinita questa opzione non selezionata Il salvataggio dei file delle intensit non necessario per le analisi integrate sullo strumento L attivazione di questa opzione aumenta significativamente la dimensione della cartella di output dei dati Selezionare Next Avanti Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 5 5 es109 E jap 11jauesed lep ojuauwJesu Esecuzione di una corsa TruSeq v3 Schermata Recipe Ricetta 96 In base alle informazioni inserite nella schermata Recipe Ricetta viene generata automaticamente una ricetta Selezionare una delle seguenti opzioni per Index Type Tipo indice No Index Nessun indice esegue una corsa non indicizzata unidirezionale oppure paired end Single Index Singolo indice esegue una corsa unidirezionale oppure paired end con una lettura di indicizzazione Dual Index Doppio indice esegue una corsa unidirezionale oppure paired end con due letture di indicizzazione Custom Personalizzata esegue una corsa unidirezionale oppure paired end con un numero di cicli personalizzato per le letture indici Se e stata specificata l opzione Dual Index Doppio indice o Custom Personalizzato selezionare un Flow Cell Format Formato cella a flusso Single Read Singola lettura o Paired End Paired end Immettere il numero di cicli per Lettura 1 e Lettura 2 se applicabile L NOTA f Il numero di cicli eseguiti in
72. che inizia con RGT viene utilizzato per determinare il tipo di kit di reagenti e la compatibilit con la modalit della corsa 1 Eseguire la scansione o immettere l ID del kit di reagenti SBS 2 Perle corse paired end scansionare o inserire l ID del kit di reagenti per il kit cluster paired end 3 Selezionare il kit di reagenti SBS per la corsa Selezionare 200 Cycles 200 cicli per un kit da 200 cicli I cicli rimanenti si fermano al valore preimpostato di 209 Selezionare 50 Cycles 50 cicli per un kit da 50 cicli I cicli rimanenti si fermano al valore preimpostato di 59 Selezionare Custom Personalizza per un kit parziale o kit multipli da 50 cicli Nel campo Cycles Remaining Cicli rimanenti inserire il numero di cicli SBS per i quali si prevede che i reagenti dureranno NOTA Per i kit parziali il software esegue un conteggio alla rovescia sul numero di cicli inserito Quando il numero di cicli comincia a essere basso il software chiede all utente di caricare reagenti freschi 4 Selezionare Prime SBS Reagents Priming reagenti SBS per eseguire il priming dei reagenti prima di avviare una corsa Eseguire sempre il priming dei reagenti prima di caricare una cella a flusso nuova Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 5 T es109 ejjap 11jauesed lep ojuauwJesu Esecuzione di una corsa TruSeq v3 5 Selezionare Next Avanti Schermata Review Revisione 1 Rivedere i parametri della corsa dalla schermata Review Rev
73. cit di aspirazione a 100 e pompare altri 250 ul di acqua nella cella a flusso Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 1 47 eoIpIn y elep eoun eun Ip auolznoas3 Risoluzione dei problemi BaseSpace non disponibile Se BaseSpace non disponibile aprire Servizi di Windows per assicurarsi che BaseSpace Broker sia avviato In caso contrario riavviarlo Se i servizi sono in esecuzione e BaseSpace non ancora disponibile contattare l Assistenza tecnica Illumina q A 8 N codice 15035788 Rev E ITA Arresto e ripresa di una corsa Potrebbe essere necessario arrestare una corsa in caso di errata impostazione se la qualit dei dati insoddisfacente o se si verifica un errore hardware Per riprendere una corsa arrestata assicurarsi di aver selezionare le opzioni di arresto normale che permettono la corsa da riprendere Opzione di arresto Opzione Real Time In grado di riprendere Analysis Normal Stop Keep As Is S La corsa riprende al prossimo comando End of Lane Chemistry Mantenere come si della chimica o di imaging Arresto normale fine trova corsia chimica Complete For Run No Non possibile riprendere la corsa Completare per corsa Complete For Read S La corsa riprende all inizio della lettura Completare per successiva lettura Normal Stop Keep As Is S La corsa riprende al ciclo successivo End of Cycle Arresto Mantenere come si normale fine del ciclo trova Complete For Run No Non pos
74. cqua per confermare il flusso corretto solo su una cella a flusso usata Non usare mai acqua per confermare il flusso corretto su una cella a flusso con cluster Confermare i valori predefiniti seguenti Volume Volume 125 Aspirate Rate Velocit di aspirazione 250 Dispense Rate Velocit di erogazione 2000 Selezionare Pump Pompa Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori Se sono presenti bolle eccessive verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni ridurre la velocit di aspirazione a 100 e pompare altri 125 ul di acqua nella cella a flusso Se il problema persiste rimuovere la cella a flusso ripetere le fasi di pulizia e ricaricare la cella a flusso Posizionamento dei tubi e avvio del priming 1 Rimuovere gli otto tubi di scarico dal contenitore per gli scarti Non includere i tubi per la pompa di scarico condensa Figura 28 Posizione dei tubi A Tubi di scarico della cella a flusso per le posizioni 1 8 dei reagenti B Tubo della pompa di scarico condensa non rimuovere N codice 15035788 Rev E ITA Collocare i tubi di scarico in una provetta da 15 ml vuota un provetta per gli scarti per una provetta da 15 ml Gli scarti del priming vengono raccolti e misurati dopo la fase di priming Selezionare Start Prime Avvia priming Si apre la schermata di priming e si avvia la fase di priming Monitorare l avanzame
75. di caricamento Y NOTA Il liquido che rimane nella provetta dopo la corsa altamente diluito e non adatto per uso futuro d Chiudere lentamente lo sportello della stazione di caricamento assicurarsi che i pescanti siano allineati correttamente con le provette Eppendorf quando il coperchio chiuso 3 Selezionare la casella di controllo Template loaded and template loading station closed Templato caricato e stazione di caricamento del templato chiusa 4 Selezionare Next Avanti Priming dei reagenti y NOTA Eseguire il priming dei reagenti solo se stato usato HiSeq o TruSeq Rapid Duo Sample Loading Kit per eseguire l ibridazione del templato su cBot In caso contrario saltare il priming dei reagenti e passare a Caricamento di una cella a flusso a pagina 102 La procedura per il priming dei reagenti include la pulizia del vano portacella il caricamento di una cella a flusso usata la conferma del flusso corretto e l avvio del priming 9 6 N codice 15035788 Rev E ITA Pulizia del vano portacella 1 Aprire lo sportello dello scomparto della cella a flusso Y ATTENZIONE Non porre liquidi sullo sportello dello scomparto della cella a flusso o sul piano portacelle quando lo sportello aperto Fuoriuscite di liquido in quest area possono danneggiare lo strumento 2 Assicurarsi che la leva della cella a flusso sia in posizione OFF Figura 37 Leva della cella a flusso in posizione 0 3 Indossare un nuo
76. di controllo Menu della finestra Options Opzioni Il menu della finestra Options Opzioni fornisce le impostazioni per definire il modello del nome della corsa le posizioni delle cartelle predefinite un server LIMS un nome utente e password e se inviare le informazioni sulla salute dello strumento a Illumina N codice 15035788 Rev E ITA Figura 9 Menu della finestra Options Opzioni el Run ID Template Modello nome cartella corsa la convenzione utilizzata per assegnare il nome e generare i nomi delle cartelle della corsa Default Output Folder Cartella di output predefinita la posizione di output predefinita per le corse sulla cella a flusso A Questa posizione pu essere cambiata corsa per corsa Default Output Folder2 Cartella di output predefinita 2 la posizione di output predefinita per le corse sulla cella a flusso B Questa posizione pu essere cambiata corsa per corsa Default Temp Folder1 Cartella temporanea predefinita 1 la posizione in cui sono scritti i file temporanei durante una corsa Run Setup Folder Cartella impostazione corsa la posizione dei moduli campioni LIMS LIMS Server Server LIMS il nome del server per l interazione con i file LIMS supportati da Illumina LIMS User Name Nome utente LIMS il nome utente usato per l autenticazione dei file LIMS Illumina LIMS Password Password LIMS la password usata per l autenticazione dei file LIMS Illumina Send instrument health information
77. di scarico 1 2 3 6 7 e 8 per la cella a flusso in uso in un flacone da 1 litro riempito con acqua deionizzata Mettere i tubi in acqua deionizzata impedisce di danneggiare le pompe dei reagenti Caricare acqua da laboratorio in tutte le otto posizioni SBS 10 posizioni sul rack dei reagenti PE e la posizione della libreria per la cella a flusso in uso Chiudere la stazione di caricamento Selezionare la casella di controllo Water loaded and template loading station closed Acqua caricata e stazione di caricamento del templato chiusa Selezionare Next Avanti Accertarsi che sullo strumento sia caricata una cella a flusso per corsa rapida usata Immettere l ID della cella a flusso in uso Selezionare Next Avanti Selezionare Pump Pompa per confermare il flusso Posizionare i tubi 4 e 5 in provette coniche vuote da 15 ml separate Selezionare Next Avanti Ha inizio la verifica del volume Al termine della verifica il volume previsto di 9 5 ml 10 per ciascun tubo Rimettere tutti i tubi nel flacone degli scarti Selezionare Next Avanti Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 8 5 es109 1d SUNJOA 9P LIUA Inserimento dei parametri della corsa Dalla schermata Welcome Benvenuto del software selezionare Sequence New Run Sequenzia Nuova corsa L interfaccia del software di controllo guida l utente lungo l intera procedura di impostazione della corsa Il processo di impostazione della corsa organizzat
78. e vedere Possibili problemi d impostazione della corsa a pagina 145 Figura 33 Leva della cella a flusso in posizione 1 J ipi 1 Attendere circa cinque secondi quindi spostare lentamente la leva della cella a flusso nella posizione 2 Quando la leva della cella a flusso e verde fisso i collettori sono in posizione e la cella pronta per l uso Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 71 OSSN elja eun IP OJUALUEILEI 1 2 Esecuzione di una corsa TruSeq v3 fe Figura 34 Leva della cella a flusso in posizione 2 7 Assicurarsi che la casella di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva sia selezionata sulla schermata Load Sequencing Flow Cell Caricamento della cella a flusso di sequenziamento Conferma del flusso corretto La verifica del flusso corretto conferma che la cella a flusso e le guarnizioni sono installate correttamente e che il collettore posizionato correttamente Selezionare la soluzione 5 dall elenco a tendina Inserire i valori predefiniti seguenti Volume Volume 250 Aspirate Rate Velocit di aspirazione 250 Dispense Rate Velocit di erogazione 2000 Selezionare Pump Pompa Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie o di perdite vicino ai collettori Se sono presenti bolle verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni dei collettori e ripetere il processo usando la soluzione 6 per evitare di esa
79. e di caricamento della libreria x AVVERTENZA y Questo set di reagenti contiene formammide una ammide alifatica che una probabile tossina riproduttiva L inalazione l ingestione il contatto con la pelle o con gli occhi possono causare lesioni personali Smaltire i contenitori e i contenuti non utilizzati in conformit alle norme locali di sicurezza vigenti Per maggiori informazioni vedere le SDS per questo kit all indirizzo support illumina com sds html Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q 1 3 1 usBea lap enmyjesed a suorzowIy Procedure post corsa Esecuzione di un lavaggio di manutenzione Un lavaggio di manutenzione richiesto ogni 10 giorni o quando si passa dalla modalit ad output elevato alla modalit a corsa rapida e viceversa ed un opzione dopo una corsa ad output elevato Illumina raccomanda di eseguire un lavaggio di manutenzione dopo una corsa ad output elevato La schermata Load Gasket Caricamento guarnizioni si apre con un lavaggio di manutenzione ogni 10 giorni o quando si passa dalla modalit a corsa rapida alla modalit ad output elevato e viceversa Prima di procedere con il lavaggio sostituire la guarnizione a 10 porte nel collettore anteriore e la guarnizione a 8 porte nel collettore posteriore anche se la schermata non viene visualizzata Un lavaggio di manutenzione consiste di un lavaggio del sistema con Tween 20 e ProClin 300 Materiali di consumo forniti dall utente Salviette imbevu
80. e viene generato per ciascuna lettura e un file viene generato per l intera corsa Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q D 9 SISA EU y WI eaY SJEMPYOS NS PINUBIOUE 4 Dati Analisi delle immagini Identificazioni delle basi Stima della determinazione delle fasi phasing Software Real Time Analysis Punteggi qualitativi Percentuali di errore Controlli in linea Conteggio indici 130 Monitoraggio delle metriche della corsa Il software Real Time Analysis genera automaticamente metriche di qualit quando inizia l analisi delle immagini Tuttavia non tutte le metriche sono disponibili durante i primi cicli poich per generare i dati alcuni processi richiedono cicli multipli Ciclo Dopo il ciclo 5 Durante i primi 5 cicli della corsa il software genera una griglia con le posizioni dei cluster Dopo il ciclo 12 L identificazione delle basi inizia dopo che la matrice colore viene stimata al ciclo 12 Dopo il ciclo 25 La correzione della determinazione delle fasi phasing per i primi 25 cicli determina la stima della determinazione delle fasi phasing Dopo il ciclo 25 Un punteggio qualitativo viene generato per le letture che attraversano il filtro qualitativo Poich i punteggi qualitativi richiedono intensit corrette dai cicli successivi il punteggio qualitativo segue sempre l identificazione delle basi Dopo il ciclo 25 Le percentuali di errore vengono generate solo quando
81. eamento nel tempo Figura 25 Cella a flusso posizionata sui perni guida superiore e destro A Perno guida superiore B Perni guida destri Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per attivare la pompa a vuoto e assicurare la cella a flusso in posizione Quando la leva della cella a flusso lampeggia verde la pompa a vuoto posizionata correttamente Se la leva non verde vedere Possibili problemi d impostazione della corsa a pagina 145 N codice 15035788 Rev E ITA Figura 26 Leva della cella a flusso in posizione 1 6 Attendere circa cinque secondi quindi spostare lentamente la leva della cella a flusso nella posizione 2 tutto a destra Quando la leva della cella a flusso verde fisso i collettori sono in posizione e la cella pronta per l uso Figura 27 Leva della cella a flusso in posizione 2 7 Assicurarsi che la casella di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva sia selezionata sulla schermata caricamento cella a flusso per il priming e poi selezionare Next Avanti Conferma del flusso corretto La verifica del flusso corretto conferma che la cella a flusso e le guarnizioni sono installate correttamente e che il collettore posizionato correttamente 1 Selezionare la soluzione 2 acqua da laboratorio dall elenco a tendina Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 6 5 1 usbes lap Bulud a OJUSuIe91Ieo Esecuzione di una corsa TruSeq v3 66 Yy ATTENZIONE 2 Usare a
82. ella a flusso o sul piano portacelle quando lo sportello aperto Fuoriuscite di liquido in quest area possono danneggiare lo strumento 2 Assicurarsi che la leva della cella a flusso sia in posizione OFF Figura 10 Leva della cella a flusso in posizione 0 3 Indossare un nuovo paio di guanti in lattice privi di polvere 4 Se presente una cella a flusso usata in una corsa precedente rimuoverla e metterla da parte in una provetta di tampone di conservazione o acqua da laboratorio per evitare che si asciughi La si pu utilizzare per verificare il corretto flusso prima di caricare la cella a flusso con cluster N codice 15035788 Rev E ITA 5 Usando una salvietta imbevuta di alcol o un panno che non lascia residui imbevuto di etanolo o isopropanolo pulire la superficie del vano portacella fino a quando non pulita y ATTENZIONE Non far sgocciolare l alcol nei fori della pompa a vuoto o intorno ai collettori Se necessario utilizzare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per asciugare il piano 6 Ispezionare visivamente il vano portacella per assicurarsi che sia privo di fibre e che i fori della pompa a vuoto siano privi di ostruzioni Figura 11 Posizioni dei fori della pompa a vuoto Caricamento di una cella a flusso per il priming Dalla schermata Load Priming Flow Cell Caricamento cella a flusso per il priming caricare una cella a flusso usata per eseguire la fase di priming Dopo il carica
83. ella a flusso sia verde e chiudere lo sportello dello scomparto della cella a flusso N codice 15035788 Rev E ITA 6 Confermare che le caselle di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva e Door Closed Sportello chiuso siano selezionate e poi selezionare Next Avanti 7 Selezionare Start Avvio per avviare la corsa di sequenziamento Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 A 3 ossn e ejja eun IP 0JUaue91eo Esecuzione di una corsa HiSeq v4 Monitoraggio della corsa Monitorare le metriche della corsa la fluidica e l imaging sulla schermata di panoramica della corsa Figura 22 Schermata di panoramica della corsa Cycle 1 of 101 Analysis pusin b hi A Terne n HELP stop A Barra di avanzamento utilizzare la barra di avanzamento per monitorare quanti cicli sono stati completati B Grafico della fluidica allargare la sezione della fluidica per monitorare le fasi della chimica C Configurazione della corsa per rivedere i parametri per la corsa attuale D Grafico dell analisi utilizzare il grafico dell analisi per monitorare i punteggi qualitativi secondo il ciclo E Grafico delle immagini utilizzare il grafico delle immagini per monitorare le intensit secondo il ciclo Report sulla prima base 44 Se durante la procedura di impostazione e stata selezionata l opzione Confirm First Base Conferma prima base viene visualizzata automaticamente la finestra di dialogo di conferma relativ
84. ene usato per l analisi I fogli campioni sono opzionali a meno che non si usi BaseSpace per eseguire l analisi dei dati eseguire una corsa di indicizzazione o pianificare il monitoraggio delle prestazioni per il de multiplexing utilizzando il software Visualizzatore analisi di sequenziamento SAV Usare Illumina Experiment Manager IEM per creare un foglio campioni prima di avviare la corsa Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q 5 JuOIdueo o1 Bo INS BOWeJOUB y Descrizione generale Materiali di consumo per il sequenziamento Il sequenziamento sul HiSeq 1500 richiede reagenti e altri materiali di consumo forniti nei kit Ilumina I kit richiesti dipendono dal tipo di corsa che si desidera eseguire Per le corse ad output elevato HiSeq v4 vedere Materiali di consumo per il sequenziamento HiSeg v4 a pagina 20 Per le corse ad output elevato TruSeq v3 vedere Materiali di consumo per il sequenziamento TruSeg v3 a pagina 48 Per le corse Rapid Run Corsa rapida vedere Materiali di consumo per il sequenziamento Rapid Run Corsa rapida a pagina 80 Materiali di consumo forniti dall utente 16 Materiale di consumo Tween 20 liquido viscoso 100 ml ProClin 300 50 ml Salviettine imbevute di alcol isopropilico al 70 oppure di etanolo al 70 Provette per centrifuga 250 ml Provette coniche 15 ml Provette coniche 50 ml con base d appoggio facoltative Damigiana da almeno 6 litri Guanti monouso pr
85. ente conservazione inadeguata o uso contrario alla documentazione o alle specifiche ii movimentazione installazione manutenzione o riparazione impropria a meno che eseguita da personale Illumina iii modifiche non autorizzate iv eventi di forza maggiore o v utilizzo con un articolo di terzi non fornito da Illumina a meno che la documentazione o le specifiche del prodotto indichino espressamente tale articolo come adatto per l utilizzo con il prodotto d Procedure per l applicazione della garanzia A scopo di idoneit in relazione alla riparazione o alla sostituzione in garanzia l acquirente deve i rivolgersi prontamente al Servizio assistenza Illumina per segnalare la non conformit ii fornire la propria collaborazione a Illumina allo scopo di confermare o diagnosticare la non conformit e iii restituire questo prodotto a Illumina anticipando le spese di trasporto in base alle istruzioni di Illumina o se concordato tra le parti consentire al riparatore autorizzato di Illumina di accedere al prodotto al fine di confermare la non conformit e procedere alla riparazione e Esclusivit della tutela in garanzia Illumina provveder a sua discrezione a riparare o a sostituire il prodotto non conforme del quale abbia confermato la copertura in garanzia Ai materiali di consumo riparati o sostituiti si applica una garanzia di 30 giorni L hardware pu essere riparato o sostituito con hardware o componenti funzionalmente equivalen
86. ente la leva della cella a flusso in posizione 1 per attivare la pompa a vuoto e assicurare la cella a flusso in posizione Quando la leva della cella a flusso lampeggia verde la pompa a vuoto posizionata correttamente Se la leva non verde vedere Possibili problemi d impostazione della corsa a pagina 145 N codice 15035788 Rev E ITA Figura 13 Leva della cella a flusso in posizione 1 6 Attendere circa cinque secondi quindi spostare lentamente la leva della cella a flusso nella posizione 2 tutto a destra Quando la leva della cella a flusso verde fisso i collettori sono in posizione e la cella pronta per l uso Figura 14 Leva della cella a flusso in posizione 2 7 Assicurarsi che la casella di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva sia selezionata sulla schermata caricamento cella a flusso per il priming e poi selezionare Next Avanti Conferma del flusso corretto La verifica del flusso corretto conferma che la cella a flusso e le guarnizioni sono installate correttamente e che il collettore posizionato correttamente 1 Selezionare la soluzione 2 acqua da laboratorio dall elenco a tendina Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 3 5 1 usbes lap Bulud a OJUSuIe91Ieo Esecuzione di una corsa HiSeq v4 Yy ATTENZIONE Usare acqua per confermare il flusso corretto solo su una cella a flusso usata Non usare mai acqua per confermare il flusso corretto su una cella a flusso con cluster 2 Confermare
87. er la corsa L ID del kit di reagenti numero del codice a barre che inizia con RGT viene utilizzato per determinare il tipo di kit di reagenti e la compatibilit con la modalit della corsa 1 Eseguire la scansione o immettere l ID del kit di reagenti SBS 2 Perle corse paired end scansionare o inserire l ID del kit di reagenti per il kit cluster Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida 3 Selezionare il kit di reagenti SBS per la corsa Per HiSeq Rapid SBS Kit v2 Selezionare 500 Cycles 500 cicli per un kit da 500 cicli I cicli rimanenti si fermano al valore preimpostato di 525 cicli rimanenti Selezionare 200 Cycles 200 cicli per un kit da 200 cicli I cicli rimanenti si fermano al valore preimpostato di 225 Selezionare 50 Cycles 50 cicli per un kit da 50 cicli I cicli rimanenti si fermano al valore preimpostato di 74 9 O N codice 15035788 Rev E ITA Selezionare Custom Personalizza per un kit parziale o kit multipli da 50 cicli Nel campo Cycles Remaining Cicli rimanenti inserire il numero di cicli SBS per i quali si prevede che i reagenti dureranno J NOTA Per i kit parziali il software esegue un conteggio alla rovescia sul numero di cicli inserito Quando il numero di cicli comincia a essere basso il software chiede all utente di caricare reagenti freschi 4 Selezionare Next Avanti Schermata Review Revisione 1 Rivedere i parametri della corsa dalla schermata Review Revisione 2 Selezionare
88. era stato utilizzato per la generazione di cluster caricare una cella a flusso con cluster Per la generazione di cluster integrata sullo strumento caricare una nuova cella a flusso Rimozione della cella a flusso usata 1 Aprire lo sportello dello scomparto della cella a flusso Figura 42 Leva della cella a flusso in posizione 1 2 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per sbloccare i collettori 3 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 0 per sbloccare la tenuta del vuoto e rilasciare la cella a flusso 1 02 N codice 15035788 Rev E ITA Figura 43 Leva della cella a flusso in posizione 0 4 Sollevare la cella a flusso usata dal vano portacella Pulizia del vano portacella 1 Indossare un nuovo paio di guanti in lattice privi di polvere 2 Usando una salvietta imbevuta di alcol o un panno che non lascia residui imbevuto di etanolo o isopropanolo pulire la superficie del vano portacella fino a quando non pulita x ATTENZIONE Non far sgocciolare l alcol nei fori della pompa a vuoto o intorno ai collettori Se necessario utilizzare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per asciugare il piano Figura 44 Ispezione dei fori della pompa a vuoto 3 Ispezionare visivamente il vano portacella per assicurarsi che sia privo di fibre e che i fori della pompa a vuoto siano privi di ostruzioni Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 7 O 3 ossn e e j99 eu
89. erni A Modulo ottico contiene i componenti ottici che consentono l imaging a doppia superficie della cella a flusso per l acquisizione contemporanea di A C G e T mediante epifluorescenza Il fascio laser di eccitazione passa attraverso l obiettivo e la fluorescenza viene raccolta attraverso lo stesso obiettivo B Scomparto della cella a flusso e stazione di caricamento della libreria contiene il piano portacelle a depressione che tiene in posizione la cella a flusso durante le corse di sequenziamento Usando la modalit Rapid Run Corsa rapida la stazione di caricamento trasferisce le librerie alla cella a flusso per la generazione dei cluster integrata sullo strumento C Scomparto della fluidica contiene le pompe della fluidica che erogano i reagenti alla cella a flusso e poi al contenitore per gli scarti D Barra di stato utilizza tre colori per indicare lo stato dello strumento Il blu indica che lo strumento in esecuzione l arancione indica che lo strumento necessita attenzione e il verde indica che lo strumento pronto a iniziare la corsa successiva Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 3 0051 basiH Ip uauodwop Descrizione generale E Scomparto reagenti contiene i rack reagenti con i reagenti per le corse di sequenziamento e la soluzione di lavaggio per i lavaggi dello strumento Scomparto reagenti Lo scomparto reagenti un ampio vano refrigerato per i reagenti che contiene tre rack reagenti due per i rea
90. esimo da parte di Illumina Diritti per l utilizzo a solo scopo di ricerca In conformit con i presenti termini e condizioni e se non altrimenti concordato per iscritto da un funzionario Illumina all acquirente viene concesso esclusivamente un diritto non esclusivo non trasferibile personale che non pu essere fatto oggetto di sublicenza ai sensi della PI base Illumina esistente alla data di spedizione di questo prodotto da parte di Illumina a utilizzare unicamente questo prodotto presso l impianto dell acquirente a scopo di ricerca interna il che comprende i servizi di ricerca forniti a terzi e unicamente in conformit con la documentazione di questo prodotto ma escludendo espressamente qualsiasi uso che a richiederebbe diritti o una licenza da parte di Illumina per PI per applicazioni specifiche b costituisca riutilizzo di un materiale di consumo utilizzato in precedenza c costituisca disassemblaggio reverse engineering reverse compiling o reverse assembling di questo prodotto d costituisca separazione estrazione o isolamento dei componenti di questo prodotto o altra analisi non autorizzata del medesimo e determini l accesso o individui le modalit di funzionamento di questo prodotto f costituisca utilizzo di reagenti materiali di consumo non forniti da Illumina con l hardware del medesimo non applicabile se le specifiche o la documentazione indicano altrimenti o g costituisce cessione a terzi o sublicenza del software o
91. gent contiene formammide 16 HP11 Primer sequenziamento Lettura 2 Se sono stati caricati reagenti di indicizzazione per una corsa unidirezionale FDR gi caricato nella posizione 10 Se sono stati caricati reagenti di indicizzazione per una corsa a doppia indicizzazione FRM e FDR sono gi caricati nelle posizioni 10 e 15 rispettivamente Collocare provette coniche da 15 ml riempite con 10 ml di acqua da laboratorio nelle posizioni non usate sul rack dei reagenti PE Far scorrere il rack reagenti nello scomparto reagenti allineando il rack con la guida sulla parte inferiore dello scomparto Abbassare i pescanti nei flaconi di reagente PE come segue Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 31 11usbea rap Bulud a OJUSLUBoLIeo Esecuzione di una corsa HiSeq v4 a Tirare la maniglia verso di s e quindi abbassare la maniglia b Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nelle provette c Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura 8 Selezionare Next Avanti Priming dei reagenti 32 La procedura per il priming dei reagenti include la pulizia del vano portacella il caricamento di una cella a flusso per il priming la conferma del flusso corretto e l avvio del priming Pulizia del vano portacella 1 Aprire lo sportello dello scomparto della cella a flusso a ATTENZIONE Non porre liquidi sullo sportello dello scomparto della c
92. gente per il sequenziamento come segue a b Tirare la maniglia del pettine di aspirazione verso di s e abbassare la maniglia Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nei tappi a imbuto Rilasciare la maniglia del pettine di aspirazione nell alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura Caricamento dei templati Caricare il templato della libreria per la generazione di cluster sullo strumento Per istruzioni sulla preparazione della libreria vedere Denaturazione e diluizione delle librerie per HiSeq e GAllx n codice 15050107 A NOTA Se cBot e stato utilizzato per la generazione di cluster collocare una provetta Eppendorf riempita con 1 ml di acqua deionizzata nella stazione di caricamento invece di attenersi alle istruzioni seguenti Aggiungere 420 ul di templato della libreria preparato in una provetta Eppendorf da 1 5 ml o 1 7 ml Caricare il templato nella stazione di caricamento come qui di seguito indicato Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 9 5 11usbea rap Bulud a OJUSLUBoLIeo Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida a Sollevare lo sportello della stazione di caricamento b Rimuovere la provetta Eppendorf contenente acqua e sostituirla con una provetta Eppendorf contenente 420 ul di templato di libreria preparato c Fissare i coperchi sotto la barra dietro le provette per evitare di interferire con i pescanti Figura 36 Stazione
93. genti SBS e uno per i reagenti per la generazione di cluster di indicizzazione e PE Le maniglie del pettine di aspirazione abbassano i pescanti nei flaconi di reagente Rack reagenti SBS contengono flaconi conici da 250 ml Il rack reagenti per la cella a flusso A si trova nella posizione centrale e il rack reagenti per la cella a flusso B si trova nella posizione all estrema destra Ciascun rack reagenti dispone di posizioni numerate che corrispondono ai collegamenti a una valvola selettore dei reagenti interna Rack reagenti per la generazione di cluster PE e di indicizzazione il rack reagenti posizionato alla sinistra dei rack A e B Presenta una riga di posizioni numerate che contengono provette coniche da 15 ml contenenti i reagenti per la generazione di cluster e PE e i reagenti di indicizzazione Vano refrigerato per i reagenti il vano refrigerato per i reagenti alloggia i rack reagenti e mantiene una temperatura interna compresa tra 2 C e 8 C Figura 2 Scomparto reagenti A N codice 15035788 Rev EITA A Maniglie del pettine di aspirazione B Rack reagenti per la generazione di cluster PE di indicizzazione C Rack reagenti per i reagenti SBS Scomparto della cella a flusso Lo scomparto della cella a flusso contiene il piano portacelle la stazione termica il sistema del vuoto e le connessioni della fluidica alla cella a flusso La cella a flusso posizionata sul piano portacelle che si sposta dentro e fuori il modulo
94. gnere il sistema 1 Eseguire un lavaggio di manutenzione per pulire il sistema Per maggiori informazioni vedere Esecuzione di un lavaggio di manutenzione a pagina 114 Rimuovere la cella a flusso dal piano portacelle Usando una salvietta imbevuta di alcol o un panno che non lascia residui imbevuto di etanolo o isopropanolo pulire la superficie del vano portacella fino a quando non pulita Y ATTENZIONE 124 Non far sgocciolare l alcol nei fori della pompa a vuoto o intorno ai collettori Se necessario utilizzare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per asciugare il piano Per le modalit ad output elevato caricare 10 ml di acqua da laboratorio in ciascuna posizione dei reagenti nei rack reagenti Quindi abbassare i pescanti Per la modalit Rapid Run Corsa rapida caricare 10 ml di acqua da laboratorio in ciascuna posizione dei reagenti e 1 ml di acqua da laboratorio nella posizione della stazione di caricamento dei campioni nei rack reagenti Quindi abbassare i pescanti Spegnere lo strumento Per riavviare lo strumento caricare l acqua in tutte le posizioni dei reagenti accendere lo strumento ed eseguire un lavaggio con acqua Per maggiori informazioni vedere Esecuzione di un lavaggio con acqua a pagina 119 N codice 15035788 Rev E ITA Software Real Time Analysis INTO UZIONE 1 cuooionca iia arroba 126 Panoramica sul software Real Time Analysis o ooccccccccccccccccccccccccccccccccccc
95. i reagenti N codice 15035788 Rev E ITA Confermare che il tipo di cella a flusso sia HiSeq Flow Cell v3 Cella a flusso HiSeq v3 che viene selezionato automaticamente in base all ID della cella Inserire un nome per l esperimento Il nome dell esperimento appare su ciascuna schermata per permettere di identificare la corsa in esecuzione Inserire un nome utente Selezionare Next Avanti Schermata Advanced Avanzato 1 Opzionale Selezionare la casella di controllo Confirm First Base Conferma incorporazione prima base Un report sulla prima base viene generato automaticamente per ciascuna corsa La selezione di questa opzione apre il report sulla prima base prima di procedere con la corsa Opzionale Dalle caselle di controllo Align to PhiX Allineamento con PhiX deselezionare la casella di controllo per le corsie che non contengono PhiX Come impostazione predefinita tutte le corsie sono selezionate per l allineamento tramite il software Real Time Analysis In alternativa selezionare le corsie sull immagine della cella a flusso per aggiungere o rimuovere le corsie per l allineamento PhiX NOTA Con HCS v2 2 e RTA v1 18 non richiesta una corsia di controllo dedicata Quindi l opzione per assegnare una corsia di controllo non disponibile con questa configurazione software Opzionale Per TruSeq Rapid v1 Selezionare Keep Intensity Files Mantieni i file intensit per la ripetizione dell analisi suc
96. i a valle Il raggruppamento dei punteggi qualitativi contribuisce all efficienza dei processi dell analisi e ai requisiti di trasferimento dei dati associati con l elevata produttivit di HiSeq 1500 Il file bcl ottenuto pi piccolo perch gli algoritmi di compressione sono in grado di comprimere i file in modo pi efficiente La copia dei file pi veloce grazie alla minor quantit di dati archiviati sul computer dello strumento e trasferiti a una posizione di rete N codice 15035788 Rev E ITA File di output del sequenziamento Tipo di file File di identificazione delle basi File posizione cluster File filtro File InterOp File di registro File offset Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 Descrizione posizione e nome del file Ciascuna tile analizzata e inclusa in un file di identificazione delle basi che contiene l identificazione delle basi e il punteggio qualitativo codificato Data Intensities BaseCalls L00 X i file sono archiviati nelle cartelle per il ciclo per ciascuna corsia s_ Corsia _ Tile bcl gz dove la corsia il numero a una sola cifra della corsia e la tile il numero a quattro cifre della tile I file di identificazione delle basi sono compressi usando gzip Per ciascuna tile un file posizione cluster contiene le coordinate XY per ciascun cluster I file posizione cluster sono il risultato della generazione della griglia per lidentificazione dei cluster Data Intensities
97. i indicizzazione prima di impostare la corsa Attenersi ai suggerimenti del software per impostare la corsa che includono l immissione dei parametri della corsa il caricamento e il priming dei reagenti il caricamento della cella a flusso e l esecuzione della verifica della fluidica Preparare e caricare i reagenti paired end e i reagenti SBS per Lettura 2 dopo il completamento di Lettura 1 e qualsiasi lettura indice Per informazioni relative alla durata della corsa e altre specifiche delle prestazioni visitare la pagina delle specifiche di HiSeq 1500 sul sito Web Illumina Materiali di consumo per il sequenziamento TruSeq v3 Nome kit TruSeq v3 Descrizione TruSeq SBS Kit v3 200 Cycles Contiene i reagenti SBS usati su HiSeq 1500 o TruSeq SBS Kit v3 50 Cycles TruSeq PE Cluster Kit v3 Contiene i reagenti per la generazione di cluster usati su cBot e i o reagenti di indicizzazione usati su HiSeq 1500 TruSeq SR Cluster Kit v3 La versione PE delkit per la generazione di cluster include i reagenti paired end usati su HiSeq 1500 Ciascun kit per la generazione di cluster include un kit di accessori contenente le guarnizioni sostitutive della cella a flusso e i tappi a imbuto per i flaconi di reagente SBS 4 8 N codice 15035788 Rev E ITA Procedura per la preparazione dei reagenti Per la preparazione dei reagenti SBS consultare la guida appropriata Guida di preparazione dei reagenti di TruSeq SBS Kit v3 200 cicli n codice
98. ichiede una lavaggio di manutenzione per la modalit rapida Specifica Lavaggio di manutenzione rapido Tipo di cella a flusso Cella a flusso rapida due corsie Guarnizione cella a flusso Guarnizione a 10 porte o a 8 porte Reagenti Tween 20 e ProClin 300 Volumi previsti ml 60 2 ml Tempo minuti 60 minuti Passaggio dalla modalit Rapid Run Corsa rapida alla modalit High Output Output elevato Il passaggio dalla modalit Rapid Run Corsa rapida a una modalit High Output Output elevato HiSeq v4 o TruSeq v3 richiede un lavaggio di manutenzione per la modalit a corsa rapida seguito da un lavaggio di manutenzione per la modalit ad output elevato Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q 2 1 ojuawelzuanbes Ip eujepou ejjap oque Procedure post corsa 122 Specifica Tipo di cella a flusso Guarnizione cella a flusso Volumi previsti ml Tempo minuti Tempo totale per cambio di modalit Lavaggio di manutenzione rapido Cella a flusso rapida due corsie Lavaggio di manutenzione ad output elevato Cella a flusso ad output elevato otto corsie Guarnizione a 10 porte Guarnizione a 10 porte o o a 8 porte 60 2 ml 60 minuti a 8 porte 158 ml 130 minuti circa 3 ore N codice 15035788 Rev E ITA Porre lo strumento nello stato inattivo idling Usare le istruzioni seguenti per preparare lo strumento e porlo nello stato inattivo fino a 10 giorni Per durate pi lunghe di 1
99. ifesa della pretesa o azione a condizione che la parte indennizzata venga rimborsata dalla controparte per le ragionevoli spese effettivamente sostenute per fornire tale assistenza N codice 15035788 Rev E ITA e Articoli di terzi e indennizzo Illumina non ha alcun obbligo di indennizzo in relazione a qualsiasi articolo proveniente da terzi e fornito all acquirente Sono articoli di terzi quelli riportanti marchio o etichetta con il nome di un terzo Gli eventuali diritti di indennizzo dell acquirente in relazione ad articoli di terzi saranno quelli previsti ai sensi degli obblighi di indennizzo del produttore o del licenziante originale Previa richiesta scritta Illumina tenter di passare eventuali garanzie di tale tipo all acquirente Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 VI N codice 15035788 Rev EITA N codice 15035788_ITA 15035788_ITA 15035788_ITA Cronologia revisioni Revisione E Data Novembre 2014 Aprile 2014 Novembre 2013 Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 Descrizione della modifica Aggiornate le descrizioni del software a HiSeq Control Software v2 2 54 che includono il lavaggio di manutenzione con Tween 20 e ProClin 300 e la compatibilit della modalit Rapid Run Corsa rapida con la chimica HiSeq Rapid v2 Aggiornate le descrizioni del lavaggio di manutenzione e del lavaggio con acqua per specificare che richiesto un lavaggio con acqua dopo una corsa Aggiunte le descrizio
100. illumina Guida per l utente del sistema HiSeg 1500 cfceereerrc0rrrrotltloio a GGATAACAGTAACACACTTCTGT1 TTACTTGTTGATCCAC CGTATCAAT TGAGACTAAATAT l TACCATTAAGAGCTACCGTCTT AACCTTAAGATTACTIGATCCACTGATTCAACGTACCGI CACTGATTCAACG ACA TACTICATCCACIGATICAACOTACOO PALEMA AACGIA ATCARTIGAGA CTAAATATTAACGT ACA E AAGAGCTACCGTCTICTGTT PALS AAGA ACT GATCGROTI GATTCAACGTACCGTAACGA A Da A ARAE E E E a a a s citi E NAA E aA CTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAA RECATA GARE TACCGTCTTCTG ATTRA GATTACTTGATCCACTGATTCAAC TTGAGACTAAATAT TAACGTTGTTAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGT ACCRIAAGGAACGTA TE AATTEAGACTAAATALTAAGGI ACCATTAAGAGCTTCTGTTAACCTTI AGA AAC TON TOAACGTACCOTA TATGAAI FGAGACTAMATA TRAOGTAGI IRACCTTARGATIACI IGATCCACTAATICARCGIACCGIARCGARCGIONCTEANCCTIAAGALIACITSAICORCIGATICAROGTACOGTARCGAACGIAT e GGACTAAATATTAACGTACCATTAAGAGCTACAACCTTAAGATTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTATCAAT TGAGACTAAATATTAACGTACCAT TAAGAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGAATGATAACAGTAACAC GATRACAGIAA CACACTTCTGTTAACCTTAAGATTACTTGATECACTGATTEAACGIACCGTAACGAACGTATCAATTGAGACTAAATATTAACGITI ACCATTAAG GAGCTACCGTCTTCTI SARCA T PAA GA OMA PTGATCCACTOAITORACI CCTACCETGOAAGGAAAATRAOG TIMAGATTACTIGAICCACTGATTCARCGTACI TTG TAAGO TTAAGATTAOTTGATOCACTGAT TCAACOTAOCOTAACGAACGTATOAAT EGAGAC IMAGE TACOOTOOAACGACGAMA CANTOS GCTACCGTGCAACGAAAATAACCTTI US SCA GATTCAACGT viti CTGTTAACCTT TTACTTGATCCACTGATTCAACGTACCGTAACGAACGTA TTGAGACTAAGCTACCGTGCAACGACGAAAAGA
101. imbevuti di alcol e salviette per la pulizia delle lenti a NOTA Non rimuovere o sostituire le guarnizioni del collettore 3 Collocare la cella a flusso sul vano portacella con le porte di ingresso e uscita rivolte verso il basso e il codice a barre a destra Assicurarsi che la freccia sul bordo sinistro della cella a flusso che indica la direzione del flusso punti verso lo strumento 4 Far scorrere delicatamente la cella a flusso verso i perni guida superiore e destro fino a quando non si blocca 9 3 N codice 15035788 Rev E ITA Figura 39 Cella a flusso posizionata sui perni guida superiore e destro A Perno guida superiore B Perni guida destri 4 y NOTA y Rimuovere la mano dalla cella a flusso prima di attivare l interruttore della pompa a vuoto per prevenire possibili perdite di allineamento nel tempo 5 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per attivare la pompa a vuoto e assicurare la cella a flusso in posizione Quando la leva della cella a flusso verde la pompa a vuoto posizionata correttamente Figura 40 Leva della cella a flusso in posizione 1 6 Attendere circa cinque secondi quindi spostare lentamente la leva della cella a flusso nella posizione 2 tutto a destra Quando la leva della cella a flusso verde fisso i collettori sono in posizione e la cella pronta per l uso Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 9 9 1 usbes lap Bulud a OJUSuIe91Ieo Esecuzione di una
102. inghe 9 Selezionare Next Avanti per avviare il lavaggio con NaOH Posizioni Tempo di esecuzione approssimativo Otto posizioni SBS 20 minuti Otto posizioni SBS e dieci posizioni paired end 60 minuti Modalit Rapid Run Corsa rapida otto posizioni SBS dieci posizioni 10 minuti paired end e una posizione di caricamento della libreria 10 Al termine del lavaggio misurare il volume di erogazione e registrarlo sul modulo di monitoraggio del laboratorio Posizioni Volume erogato Otto posizioni SBS 32 ml Otto posizioni SBS e dieci posizioni paired end 72 ml Modalit Rapid Run Corsa rapida otto posizioni SBS dieci posizioni paired end e 9 5 ml per una posizione di caricamento della libreria corsia 11 Liberare i tubi di scarico e riposizionarli nel flacone degli scarti 7 2 O N codice 15035788 Rev EITA Cambio della modalita di sequenziamento Usare il comando Mode Select Selezione modalit dalla schermata Welcome Benvenuto per passare tra le modalit ad output elevato e la modalit Rapid Run Corsa rapida Quando si cambia modalit richiesto un lavaggio di manutenzione e un cambio delle guarnizioni Per maggiori informazioni vedere Esecuzione di un lavaggio di manutenzione a pagina 114 Passaggio dalla modalit High Output Output elevato alla modalit Rapid Run Corsa rapida Il passaggio da una modalit High Output Output elevato HiSeq v4 o TruSeq v3 a una modalit Rapid Run Corsa rapida r
103. ione di una corsa Rapid Run Corsa rapida Introduzione La modalit Rapid Run Corsa rapida fornisce due opzioni per la fase di generazione di cluster su cBot o su HiSeq 1500 La generazione di cluster su cBot consente due librerie una per ciascuna corsia su una cella a flusso rapida a due corsie Dopo l ibridazione del templato e la prima estensione su cBot il restante processo di generazione di cluster viene eseguito su HiSeq Dopo la preparazione dei reagenti la procedura di impostazione della corsa include l immissione dei parametri della corsa il caricamento e il priming dei reagenti il caricamento della cella a flusso e l esecuzione della verifica della fluidica Se la generazione di cluster eseguita su HiSeq 1500 la fase di priming dei reagenti omessa dalla procedura di impostazione della corsa Per informazioni relative alla durata della corsa e altre specifiche delle prestazioni visitare la pagina delle specifiche di HiSeq 1500 sul sito Web Illumina Materiali di consumo per il sequenziamento Rapid Run Corsa rapida Nome del kit per Rapid Run Descrizione Corsa rapida HiSeq Rapid SBS Kit v2 Contiene i reagenti SBS usati su HiSeq 1500 e i tappi a o imbuto per i flaconi di reagente TruSeq Rapid SBS Kit v1 HiSeq Rapid PE Cluster Kit v2 Contiene i reagenti per la generazione di cluster e per or l indicizzazione utilizzati su HiSeq 1500 e un set di HiSeq Rapid SR Cluster Kit v2 guarnizioni della cella a flusso
104. ione primer integrata sullo strumento Questa funzione disponibile solo in HiSeq v4 e Rapida Run Corsa rapida Wash Lavaggio selezionare Wash Lavaggio per avviare un lavaggio dello strumento o un lavaggio di manutenzione Figura 6 Opzioni del comando Wash Lavaggio ia Water Wash Lavaggio con acqua il lavaggio con acqua fa scorrere acqua nel sistema Questo lavaggio richiesto dopo una corsa di sequenziamento o dopo che uno strumento rimasto nello stato inattivo per uno o pi giorni Vedere Esecuzione di un lavaggio con acqua a pagina 119 Maintenance Wash Lavaggio di manutenzione il lavaggio di manutenzione fa scorrere nel sistema Tween 20 e ProClin 300 Questo lavaggio richiesto prima del passaggio di modalit od ogni 10 giorni ed un opzione raccomandata dopo una corsa ad output elevato Vedere Esecuzione di un lavaggio di manutenzione a pagina 114 Check Verifica selezionare Check Verifica per aprire la schermata di verifica della fluidica e per confermare il flusso corretto durante l installazione dello strumento o la risoluzione dei problemi della fluidica Mode Select Selezione modalit selezionare Mode Select Selezione modalit per passare da una modalit all altra Le modalit della corsa includono TruSeq v3 HiSeq v4 e Rapid Run Corsa rapida Indicatori di attivit e sensori La schermata Welcome Benvenuto contiene nell angolo inferiore destro una serie di icone che indicano l attivit
105. isco 0000000000000000 onno onno a nr onor ororo anonn nrnna 14 Panoramica surtoglio GAmpioni cocos alle essi rt tit 15 Materiali di consumo per il sequenziamento n0000 naaa oono ara naa22221n 16 Risorse addizionali str ride nia 18 gt rai n PP 2 Ak aa 07 a sil re m Maa Tarro Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 1 L oJoydey Descrizione generale Introduzione Il sistema HiSeq unisce una progettazione innovativa con la tecnologia SBS consolidata per definire nuovi standard di output semplicit ed efficacia dei costi HiSeq 1500 comprende le caratteristiche seguenti Imaging a doppia superficie HiSeq 1500 utilizza un sistema a epifluorescenza a quattro videocamere con tecnologia di scansione all avanguardia per consentire l imaging a doppia superficie Generazione dei cluster integrata sullo strumento HiSeq 1500 fornisce l opzione della modalit Rapid Run Corsa rapida che comprende la generazione dei cluster integrata sullo strumento Ampio vano refrigerato per i reagenti lo scomparto reagenti un ampio vano refrigerato che contiene reagenti sufficienti per l intera corsa di sequenziamento Fluidica integrata per corse paired end la fluidica integrata paired end fornisce i reagenti dallo scomparto reagenti alla cella a flusso per la risintesi Lettura 2 e per il sequenziamento indicizzato Opzioni dei controlli dell interfaccia l interfaccia software dello
106. isione 2 Selezionare Next Avanti per procedere o selezionare Back Indietro per modificare i parametri 5 3 N codice 15035788 Rev EITA Caricamento e priming dei reagenti Dopo aver immesso i parametri della corsa caricare i reagenti SBS e di indicizzazione per la corsa e quindi eseguire il priming dei reagenti nel sistema di fluidica Il software guida l utente in questo processo tramite una serie di schermate sulla scheda Pre Run Setup Impostazioni pre corsa Materiali di consumo forniti da Illumina Otto tappi a imbuto Materiali di consumo forniti dall utente Flacone da 250 ml Corning n di catalogo 430776 Provette coniche da 15 ml Corning n di catalogo 430052 Acqua da laboratorio J NOTA Per preparare il risciacquo post corsa al termine di una corsa di sequenziamento caricare 25 ml di PW1 o di acqua da laboratorio nella posizione 2 Il risciacquo post corsa non sostituisce il lavaggio post corsa dello strumento Caricamento dei reagenti SBS 1 Rimuovere il tappo da ciascun flacone di reagente e sostituirlo con un tappo a imbuto x ATTENZIONE Dopo aver manipolato il flacone di CMR smaltire i guanti e sostituirli con un nuovo paio 2 Registrare il peso di ciascun reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio NOTA La pesatura dei reagenti prima e dopo la corsa di sequenziamento conferma l erogazione appropriata dei reagenti 3 Aprire lo sportello dello scomparto reagenti 4 Sollevare i pes
107. isultati della determinazione delle fasi phasing e della predeterminazione delle fasi prephasing sono registrati nel file denominato EmpiricalPhasing_ corsia _ lettura _ tile txt che si trova nella cartella Data Intensities BaseCalls Phasing Identificazione delle basi 134 Dopo che le intensit non elaborate sono state corrette in base al colore e corrette in base al calcolo della determinazione delle fasi phasing e della predeterminazione delle fasi prephasing il canale colore con l intensit pi luminosa rappresenta l identificazione delle basi per quel cluster in quel ciclo L identificazione delle basi su HiSeq 1500 utilizzando il software Real Time Analysis inizia dopo il ciclo 12 L identificazione delle basi determina una base A C G o T per ciascun cluster di una data tile a un ciclo specifico Le identificazioni delle basi sono salvate nei file di identificazione delle basi bcl che sono file binari con 1 byte per identificazione e punteggio qualitativo Ciascuno di questi file contiene l identificazione delle basi e il punteggio qualitativo associato Per eseguire una identificazione delle basi i cluster devono prima attraversare il filtro Chastity I cluster che non attraversano il filtro o che non possono essere identificati perch fuori dall immagine o perch non si verificata la registrazione dell immagine sono etichettati come senza identificazione I cluster senza identificazione sono rappresentati da
108. ivi di polvere lubrificante Fornitore Sigma Aldrich n di catalogo P7949 Sigma Aldrich n di catalogo 48912 U VWR n di catalogo 95041 714 Fornitore generico Corning n di catalogo 430776 Corning n di catalogo 430052 Corning n di catalogo 430921 Fornitore generico Fornitore generico Scopo Lavaggio di manutenzione dello strumento Lavaggio di manutenzione dello strumento Pulizia della cella a flusso e del piano portacelle Lavaggio di manutenzione e lavaggio con acqua dello strumento Raccolta e misura del volume degli scarti Lavaggio di manutenzione e lavaggio con acqua dello strumento Conservazione delle celle a flusso Soluzione di lavaggio di manutenzione Uso generale N codice 15035788 Rev E ITA Materiale di consumo Panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle Carta pulente per lenti 10x15 cm ca Punte per pipette da 200 ul Punte per pipette da 1000 ul Pinzette di plastica con punta quadrata Acqua da laboratorio 18 M Ohm Fornitore VWR n di catalogo 21905 026 VWR n di catalogo 52846 001 Fornitore generico Fornitore generico McMaster Carr n di catalogo 7003422 Millipore Scopo Pulizia del vano portacella Pulizia della cella a flusso Separazione dei volumi dei kit di reagenti Separazione dei volumi dei kit di reagenti Rimozione delle guarnizioni della cella a flusso Rack reagenti SBS posizione 2 Lavaggio dello strumen
109. la schermata Load Priming Flow Cell Caricamento cella a flusso per il priming caricare una cella a flusso usata per eseguire la fase di priming Dopo il caricamento di una cella a flusso usata confermare che la pompa a vuoto sia posizionata correttamente NOTA Illumina consiglia di usare la cella a flusso proveniente da una corsa precedente per il priming dei reagenti su una corsa successiva o per un lavaggio dello strumento post corsa 1 Sciacquare con acqua da laboratorio la cella a flusso usata Asciugare la cella a flusso con una salvietta per la pulizia delle lenti o con un panno che non lascia residui 2 Pulire la cella a flusso usando panni imbevuti di alcol e salviette per la pulizia delle lenti NOTA Durante questa fase non rimuovere o sostituire le guarnizioni della cella a flusso Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 6 3 nuobesi lap Bulud a OUELUEILIEI Esecuzione di una corsa TruSeq v3 3 64 Collocare la cella a flusso usata sul vano portacella con le porte di ingresso e uscita rivolte verso il basso e il codice a barre a destra Assicurarsi che la freccia sul bordo sinistro della cella a flusso che indica la direzione del flusso punti verso lo strumento Far scorrere delicatamente la cella a flusso verso i perni guida superiore e destro fino a quando non si blocca NOTA Rimuovere la mano dalla cella a flusso prima di attivare l interruttore della pompa a vuoto per prevenire possibili perdite di allin
110. lash denominata DoNotEject Non espellere posta all interno del telaio dello strumento ed evitare di modificare i file su tale unit Questa unit contiene file della configurazione hardware e si inizializza ogni volta che lo strumento viene acceso Per garantire uno spazio su disco adeguato archiviare in rete i dati che si trovano sul computer dello strumento e provengono dalle analisi precedenti Aprire HiSeq Control Software HCS utilizzando l icona del collegamento sul desktop del computer Per l inizializzazione del software di controllo sono necessari alcuni minuti Una volta inizializzato il software si apre la schermata Mode Select Selezione modalit e nella parte inferiore destra della schermata appare l icona di inizializzazione N codice 15035788 Rev E ITA Pratiche migliori per gestire lo strumento e il computer di controllo Non accendere il computer quando lo strumento in funzione Accendere sempre il computer prima di accendere lo strumento Non spegnere lo strumento quando il software di controllo dello strumento in esecuzione Dopo aver spento lo strumento attendere un minuto prima di accenderlo di nuovo Prima di accendere il computer collegare i cavi USB per lo strumento il monitor e la tastiera alla parte posteriore del computer Collegare lo scanner per codici a barre e il mouse alle porte USB sulla parte anteriore del computer Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 T 0051 PSSIH IP OMAY
111. lo Questo file contiene l identificazione delle basi e il punteggio qualitativo associato Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 1 2 F sIs jeuy au JE Y SJEMPYOS NS LIWLIOULd Software Real Time Analysis File filtro ciascuna tile produce informazioni sul filtro che sono incluse in un file filtro filter per ciascuna tile per l intera corsa Questo file specifica se un cluster ha attraversato i filtri File posizione cluster un file posizione cluster locs contiene le coordinate X Y per ciascun cluster sulla cella a flusso File statistiche per ciascun ciclo viene creato un file statistiche stats Il file statistiche contiene statistiche aggregate per il ciclo I file di output primari sono usati per l analisi dei dati successiva Utilizzare bcl2fastq per eseguire il de multiplexing e la conversione dei file bcl in file FASTO che possono essere utilizzati come input per l allineamento Per convertire i dati da HiSegq utilizzare bcl2fastq 1 8 4 o versione successiva Real Time Analysis fornisce metriche in tempo reale sulla qualit della corsa archiviate come file InterOp I file InterOp sono file binari che contengono tile ciclo e metriche a livello di lettura e sono richiesti per visualizzare le metriche nel software Sequencing Analysis Viewer SAV Per visualizzare le metriche generate dal software Real Time Analysis utilizzare il software Sequencing Analysis Viewer SAV v1 8 20 o versione successiva Per maggi
112. lusivamente materiali di consumo reagenti Illumina in combinazione con l hardware Illumina Le limitazioni di cui ai punti a b non si applicano se la documentazione o le specifiche di questo prodotto indicano altrimenti L acquirente concorda di non intraprendere alcuna delle seguenti attivit e di non autorizzare terzi a farlo i disassemblare eseguire il reverse engineering il reverse compiling o il reverse assembling di questo prodotto ii Separare estrarre o isolare componenti di questo prodotto o sottoporre questo prodotto o suoi componenti a qualsiasi analisi non espressamente autorizzata nella documentazione di questo prodotto iii ottenere l accesso o tentare di determinare le modalit di funzionamento di questo prodotto o iv trasferire a terzi o concedere in sublicenza qualsiasi software come sopra definito o qualsiasi software di terze parti L acquirente accetta inoltre che il contenuto e le modalit di funzionamento di questo prodotto sono di propriet di Illumina e che questo prodotto include o incorpora segreti commerciali di Illumina Le condizioni e le limitazioni incluse nei presenti termini e condizioni sono condizioni di vendita negoziate e conseguentemente controllano la vendita e l utilizzo di questo prodotti da parte dell acquirente 5 Limitazione di responsabilit NEI LIMITI CONSENTITI DALLA LEGGE IN NESSUN CASO ILLUMINA O I SUOI FORNITORI POTRANNO ESSERE RITENUTI RESPONSABILI NEI CONFRONTI DELL ACQUIRENTE O DI
113. mento di una cella a flusso usata confermare che la pompa a vuoto sia posizionata correttamente NOTA Illumina consiglia di usare la cella a flusso proveniente da una corsa precedente per il priming dei reagenti su una corsa successiva o per un lavaggio dello strumento post corsa 1 Sciacquare con acqua da laboratorio la cella a flusso usata Asciugare la cella a flusso con una salvietta per la pulizia delle lenti o con un panno che non lascia residui 2 Pulire la cella a flusso usando panni imbevuti di alcol e salviette per la pulizia delle lenti NOTA Durante questa fase non rimuovere o sostituire le guarnizioni della cella a flusso Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 3 3 nuobesi lap Bulud a OUELUEILIEI Esecuzione di una corsa HiSeq v4 3 34 Collocare la cella a flusso usata sul vano portacella con le porte di ingresso e uscita rivolte verso il basso e il codice a barre a destra Assicurarsi che la freccia sul bordo sinistro della cella a flusso che indica la direzione del flusso punti verso lo strumento Far scorrere delicatamente la cella a flusso verso i perni guida superiore e destro fino a quando non si blocca NOTA Rimuovere la mano dalla cella a flusso prima di attivare l interruttore della pompa a vuoto per prevenire possibili perdite di allineamento nel tempo Figura 12 Cella a flusso posizionata sui perni guida superiore e destro A Perno guida superiore B Perni guida destri Spostare lentam
114. n IP OJUALUEILEI Pulizia della cella a flusso 1 Rimuovere la cella a flusso dal contenitore della cella a flusso usando un paio di pinze 2 Sciacquare la cella a flusso con acqua da laboratorio e asciugarla con un panno pulente per lenti 3 Piegare una salvietta imbevuta di alcol fino approssimativamente alle dimensioni della cella a flusso 4 Tenere i bordi della cella a flusso con cluster con due dita Assicurarsi che le porte di ingresso e di uscita siano rivolte verso l alto 5 Pulire ogni lato della cella a flusso con un unico movimento Ripetere ripiegando il panno a ogni passaggio fino a quando la cella a flusso non pulita 6 Asciugare la cella a flusso con un panno pulente per lenti 7 Proteggere la cella a flusso dalla polvere fino a quando la si carica sullo strumento Caricamento della cella a flusso per il sequenziamento y NOTA Non sostituire le guarnizioni dei collettori Sostituire le guarnizioni dei collettori dopo il completamento della corsa di sequenziamento e prima del lavaggio di manutenzione 1 Collocare la cella a flusso sul vano portacella con le porte di ingresso e uscita rivolte verso il basso e il codice a barre a destra Assicurarsi che la freccia sul bordo sinistro della cella a flusso che indica la direzione del flusso punti verso lo strumento 2 Far scorrere delicatamente la cella a flusso verso i perni guida superiore e destro fino a quando non si blocca Esecuzione di una corsa Rapid Run
115. n cambiamento nelle condizioni operative l icona associata lampeggia per avvertire l utente Per risolvere questo avviso selezionare l icona per aprire la finestra di dialogo dello stato contenente una descrizione generale della condizione segnalata Selezionare Acknowledge Accetta per confermare di aver letto il messaggio e Close Chiudi per chiudere la finestra di dialogo Menu della schermata Welcome Benvenuto Il pulsante del menu della schermata Welcome Benvenuto posto nell angolo superiore sinistro della schermata Welcome fornisce le seguenti opzioni View Visualizza fornisce opzioni per visualizzare l interfaccia a schermo intero o in una finestra o per minimizzare l interfaccia Tools Strumenti fornisce l accesso alla finestra Options Opzioni e al file Show Log Options Opzioni dalla finestra Options Opzioni definire le impostazioni predefinite per la corsa Vedere Menu della finestra Options Opzioni a pagina 12 Show Log File File Show Log elenca qualsiasi errore verificatosi nel software di controllo Il file vuoto a meno che non si sia verificato un errore Utilizzare questo file di registro per la risoluzione dei problemi Scanner Scanner attiva il comando per inizializzare il software manualmente About Info su fornisce informazioni sull hardware dello strumento sulle versioni del software e su come mettersi in contatto con l Assistenza tecnica Exit Esci chiude l interfaccia del software
116. nere lo strumento per assicurarsi che il drive DoNotEject sia riconosciuto correttamente Se il problema persiste dopo il riavvio del computer dello strumento spegnere lo strumento attendere almeno 60 secondi e poi riavviare lo strumento Rimuovere la cella a flusso e ripetere le fasi di pulizia Verificare che le guarnizioni siano presenti e posizionate correttamente Riposizionare la cella a flusso Se la procedura descritta non risolve il problema cercare di sostituire le guarnizione e quindi caricare nuovamente la cella a flusso Rimuovere la cella a flusso e ripetere le fasi di pulizia Verificare che le guarnizioni siano presenti e posizionate correttamente Riposizionare la cella a flusso Se la procedura descritta non risolve il problema cercare di sostituire le guarnizione e quindi caricare nuovamente la cella a flusso Portare la leva della cella a flusso in posizione 2 145 esJO9 e jep suorze3soduul p ILUa qoJd I IGISSO Risoluzione dei problemi 146 Problema Erogazione fluido scadente Possibile causa Bolle potenziali nel sistema Intervento Riposizionare la cella a flusso e confermare che i fori siano rivolti verso il basso Osservare se presente del precipitato bianco attorno alle guarnizioni Se presente del precipitato sostituire le guarnizioni Prima del lavaggio di manutenzione dello strumento sostituire sempre le guarnizioni Confermare che i gruppi dei pescanti siano c
117. ni per flusso di lavoro file di input e di output gestione degli errori e punteggi qualitativi nel capitolo Software Real Time Analysis Aggiornato il n di catalogo VWR per le salviettine imbevute di alcol a 95041 714 Aggiornato l URL per le schede di sicurezza SDS all indirizzo support illumina com sds html Aggiornate le descrizioni software a HCS v2 2 che includono la modalit ad output elevato HiSeq v4 la rimozione dell opzione di controllo della corsia il raggruppamento predefinito dei punteggi qualitativi e l opzione per usare diversi schemi di indicizzazione in ciascuna corsia Aggiunto il flusso di lavoro HiSeq v4 da usare con la chimica HiSeq v4 Aggiunto il calcolo per il volume SBS totale per il priming Contenuto riorganizzato Sostituiti i reagenti seguenti e RMR per RMX N codice Revisione Data Descrizione della modifica 15035788_ITA B Marzo Rimossa la sezione Caricamento dei reagenti di indicizzazione 2013 erroneamente posta nel flusso di lavoro TruSeq Rapid Corrette le tabelle Caricamento dei reagenti di indicizzazione nel flusso di lavoro TruSeq v3 Correzione di errori minori compresa la conferma del volume del flusso appropriato nella fase di caricamento di una cella a flusso del flusso di lavoro TruSeq v3 15035788_ITA A Ottobre Versione iniziale 2012 X N codice 15035788 Rev EITA Sommario Cronologia revisioni ie ix SOMMAFO A A elit OIL LI sodo Li Iso una otis succo sla lo
118. nse Rate Velocit di erogazione 2000 Assicurarsi che i tubi di scarico di uscita 1 2 3 6 7 e 8 siano in un flacone di acqua pulita e che i tubi 4 e 5 siano nel contenitore per gli scarti Selezionare Pump Pompa Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori Se sono presenti bolle eccessive verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni dei collettori e ripetere il processo a Selezionare la soluzione 6 USB per evitare di esaurire l USB dalla posizione 5 b Ridurre la velocit dell aspirato a 1000 e pompare altri 250 ul di USB verso la cella a flusso Dopo aver confermato il flusso corretto selezionare Next Avanti per procedere N codice 15035788 Rev E ITA 7 Assicurarsi che la leva della cella a flusso sia verde e chiudere lo sportello dello scomparto della cella a flusso 8 Confermare che le caselle di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva e Door Closed Sportello chiuso siano selezionate e poi selezionare Next Avanti 9 Selezionare Start Avvio per avviare la corsa di sequenziamento Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q O7 ossn e ejja eun IP 0JUaue91eo Monitoraggio della corsa Monitorare le metriche della corsa la fluidica e l imaging sulla schermata di panoramica della corsa Figura 48 Schermata di panoramica della corsa Cycle 1 of 101 Analysis cea a
119. nto della fase di priming dall apposita schermata AI completamento della fase di priming misurare gli scarti raccolti e confermare che il volume in ciascuna provetta sia 1 75 ml per un totale di 14 ml Il totale viene calcolato come segue 250 ul per ciascuna posizione SBS fatta eccezione per la posizione 2 250 x 7 1 75 ml 1 75 ml per ciascuna corsia 1 75 x 8 14 ml Registrare i risultati sul modulo di monitoraggio del laboratorio Riposizionare i tubi di scarico nel contenitore per gli scarti prima di procedere Selezionare Next Avanti Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 67 11usbea rap Bulud a OJUSLUBoLIeo Caricamento di una cella a flusso Le fasi per il caricamento di una cella a flusso con cluster include la rimozione della cella a flusso per il priming la pulizia del vano portacella il caricamento della cella a flusso e la conferma del flusso corretto Materiali di consumo forniti dall utente gt Panno per la pulizia delle lenti gt Salviette con alcol o etanolo al 70 Panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle Un paio di pinze Rimozione della cella a flusso usata 1 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per sbloccare i collettori Figura 29 Leva della cella a flusso in posizione 1 Esecuzione di una corsa TruSeq v3 2 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 0 per sbloccare la tenuta del vuoto e rilasciare la cella a fluss
120. o 6 8 N codice 15035788 Rev E ITA Figura 30 Leva della cella a flusso in posizione 0 0 1 2 E 3 Sollevare la cella a flusso usata dal vano portacella Pulizia del vano portacella 1 Indossare un nuovo paio di guanti in lattice privi di polvere 2 Usando una salvietta imbevuta di alcol o un panno che non lascia residui imbevuto di etanolo o isopropanolo pulire la superficie del vano portacella fino a quando non pulita a ATTENZIONE Non far sgocciolare l alcol nei fori della pompa a vuoto o intorno ai collettori Se necessario utilizzare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per asciugare il piano Figura 31 Ispezione dei fori della pompa a vuoto 3 Ispezionare visivamente il vano portacella per assicurarsi che sia privo di fibre e che i fori della pompa a vuoto siano privi di ostruzioni Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 6 9 ossn e Ejjeo eun IP OJUALUEILEI Esecuzione di una corsa TruSeq v3 Pulizia della cella a flusso 1 Rimuovere la cella a flusso dal contenitore della cella a flusso usando un paio di pinze 2 Sciacquare la cella a flusso con acqua da laboratorio e asciugarla con un panno pulente per lenti 3 Piegare una salvietta imbevuta di alcol fino approssimativamente alle dimensioni della cella a flusso 4 Tenere i bordi della cella a flusso con cluster con due dita Assicurarsi che le porte di ingresso e di uscita siano rivolte verso l alto 5 Pulire ogni lat
121. o Avviare la corsa di sequenziamento Opzionale Dopo il ciclo 1 ispezionare il report sulla prima base e poi proseguire la Lettura 1 La corsa prosegue come indicato nei parametri della corsa Al termine della corsa rimuovere e pesare i reagenti Eseguire un lavaggio dello strumento Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 D q yA basi ozuaweizuanbaes 1ad OJOAB IP OSSNJH Tipi dicorse per la chimica HiSeq v4 La tabella seguente mostra i tipi di corse di sequenziamento e il numero di cicli possibili per ciascuna lettura usando la chimica HiSeq v4 Utilizzare queste informazioni come riferimento quando si imposta la corsa Tipo di corsa Cicli Cicli di lettura Cicli di lettura Cicli Cicli Lettura 1 Indice 1 17 Indice 2 15 Lettura 2 totali Unidirezionale lt 126 lt 126 non indicizzata Unidirezionale lt 126 6071 lt 1331 singola indicizzazione 82 lt 1342 Unidirezionale lt 126 8 8 lt 142 doppia indicizzazione Paired end lt 126 lt 126 lt 252 non indicizzata Paired end lt 126 Va lt 126 lt 2591 singola indicizzazione 82 lt 2602 Paired end lt 126 8 7 83 lt 126 lt 275 doppia indicizzazione Esecuzione di una corsa HiSeq v4 1 Numero di cicli per librerie con singola indicizzazione 2 Numero di cicli per librerie con doppia indicizzazione 3 La Lettura Indice 2 di una corsa paired end con doppia indicizzazione include sette cicli addizionali di sola chimica
122. o 1 7 ml Non utilizzare provette con tappi a vite Procedura 1 Registrare il peso di ciascun reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio 2 Aprire lo sportello dello scomparto reagenti 9 2 N codice 15035788 Rev E ITA 3 Sollevare i pescanti per il rack reagenti per il sequenziamento effettuando i seguenti movimenti a Tirare la maniglia verso di s e quindi sollevare la maniglia b Rilasciare la maniglia del pettine di aspirazione nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Assicurarsi che la maniglia del pettine di aspirazione sia posizionata correttamente nell alloggiamento 4 Far scorrere il rack reagenti SBS fuori dallo scomparto reagenti 5 Rimuovere il tappo da ciascun flacone di reagente e sostituirlo con un tappo a imbuto Sostituire il tappo del flacone CRM per ultimo e poi sostituire i guanti 6 Posizionare ciascun flacone di reagente SBS sul rack nelle posizioni numerate associate Assicurarsi che l estremit conica del flacone sia posizionata nella tacca alla base del rack Tabella 12 Posizioni del reagente HiSeq Rapid v2 SBS Posizione SNIA A eA GO N e Reagente IMT PW1 USM PW1 USB USB CRM CWM Descrizione Incorporation Master Mix 25 ml di PW1 o acqua da laboratorio Universal Scan Mix 25 ml di PW1 o acqua da laboratorio Tampone di sequenziamento universale Tampone di sequenziamento universale Cleavage Reagent Master Mix Cleavage Wash Mix Tabella 13 Posizi
123. o con un panno pulente per lenti 7 Proteggere la cella a flusso dalla polvere fino a quando la si carica sullo strumento Caricamento della cella a flusso per il sequenziamento y NOTA Non sostituire le guarnizioni dei collettori Sostituire le guarnizioni dei collettori dopo il completamento della corsa di sequenziamento e prima del lavaggio di manutenzione 1 Collocare la cella a flusso sul vano portacella con le porte di ingresso e uscita rivolte verso il basso e il codice a barre a destra Assicurarsi che la freccia sul bordo sinistro della cella a flusso punti verso lo strumento 2 Far scorrere delicatamente la cella a flusso verso i perni guida superiore e destro fino a quando non si blocca A O N codice 15035788 Rev E ITA 4 Figura 19 Cella a flusso posizionata sui perni guida superiore e destro A Perno guida superiore B Perni guida destri NOTA Rimuovere la mano dalla cella a flusso prima di attivare l interruttore della pompa a vuoto per prevenire possibili perdite di allineamento nel tempo Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per attivare la pompa a vuoto e assicurare la cella a flusso in posizione Quando la leva della cella a flusso lampeggia verde la pompa a vuoto posizionata correttamente Se la leva non verde vedere Possibili problemi d impostazione della corsa a pagina 145 Figura 20 Leva della cella a flusso in posizione 1 J ipi 1 Attendere circa cinque secondi
124. o della cella a flusso con un unico movimento Ripetere ripiegando il panno a ogni passaggio fino a quando la cella a flusso non pulita 6 Asciugare la cella a flusso con un panno pulente per lenti 7 Proteggere la cella a flusso dalla polvere fino a quando la si carica sullo strumento Caricamento della cella a flusso per il sequenziamento y NOTA Non sostituire le guarnizioni dei collettori Sostituire le guarnizioni dei collettori dopo il completamento della corsa di sequenziamento e prima del lavaggio di manutenzione 1 Collocare la cella a flusso sul vano portacella con le porte di ingresso e uscita rivolte verso il basso e il codice a barre a destra Assicurarsi che la freccia sul bordo sinistro della cella a flusso punti verso lo strumento 2 Far scorrere delicatamente la cella a flusso verso i perni guida superiore e destro fino a quando non si blocca T O N codice 15035788 Rev E ITA 4 Figura 32 Cella a flusso posizionata sui perni guida superiore e destro A Perno guida superiore B Perni guida destri NOTA Rimuovere la mano dalla cella a flusso prima di attivare l interruttore della pompa a vuoto per prevenire possibili perdite di allineamento nel tempo Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per attivare la pompa a vuoto e assicurare la cella a flusso in posizione Quando la leva della cella a flusso lampeggia verde la pompa a vuoto posizionata correttamente Se la leva non verd
125. o di circa Tween 20 0 5 e ProClin 300 0 03 Continuare ad agitare fino a quando la soluzione completamente miscelata Mettere da parte in un contenitore chiuso a temperatura ambiente fino a quando si pronti a riempire o rabboccare i flaconi e le provette di reagente con la soluzione di lavaggio Lavaggio con Tween 20 e ProClin 300 1 Dalla schermata Welcome Benvenuto selezionare Wash Maintenance Lavaggio Manutenzione Per le modalit ad output elevato selezionare Yes per lavare le posizioni dei reagenti paired end quando la corsa di sequenziamento includeva una lettura di indicizzazione o paired end Altrimenti selezionare No No Selezionare Next Avanti per procedere Se si utilizza una soluzione di lavaggio fresca preparare i componenti di lavaggio nel modo seguente a Riempire otto flaconi SBS con 250 ml di soluzione di lavaggio b Riempire dieci provette paired end con 12 ml di soluzione di lavaggio c Perla modalit Rapid Run Corsa rapida riempire le provette Eppendorf con 1 6 ml di soluzione di lavaggio e caricarle nella stazione di caricamento Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 1 7 5 auoIzuamueu Ip o BBenej un Ip suolzndasy Procedure post corsa 116 10 11 12 Se viene utilizzata la soluzione di lavaggio rabboccare i flaconi e le provette salvati dal lavaggio precedente Per una soluzione di lavaggio fresca assegnare ciascun flacone e provetta a una posizione sul rack reagen
126. o di uno ogni volta che si esegue una corsa sullo strumento L ID della cella a flusso inserito durante le fasi d impostazione della corsa viene aggiunto alla fine del nome della cartella della corsa La cartella della corsa e scritta secondo il percorso di output specificato nella schermata Scan Scansione durante l impostazione della corsa La cartella temporanea della corsa per la cella a flusso A e scritta nell unita D e la cartella temporanea della corsa per la cella a flusso B scritta nell unit E N codice 15035788 Rev E ITA Numerazione delle tile La cella a flusso ad output elevato HiSeq viene sottoposta a imaging in 96 tile su ciascuna corsia nella parte superiore e nella parte inferiore per ciascun ciclo Ciascuna corsia dispone di tre strisce con 16 tile per striscia La cella a flusso per corsa rapida viene sottoposta a imaging in 64 tile Ciascuna corsia dispone di due strisce con 16 tile per striscia Il nome della tile un numero di quattro cifre che rappresenta la posizione sulla cella a flusso La prima cifra rappresenta la superficie 1 e per la superficie superiore 2 e per la superficie inferiore La seconda cifra rappresenta la striscia 1 e per la prima striscia 2 e per la seconda striscia 3 e per la terza striscia se applicabile NOTA Una striscia una colonna di tile all interno di una corsia di una cella a flusso Le ultime due cifre rappresentano la tile da 01 a 16 La numerazione delle tile par
127. o in tre schede Run Configuration Pre Run Setup e Initiate Run Configurazione corsa Impostazioni pre corsa e Avvio corsa Le schermate di configurazione della corsa contengono elenchi a tendina caselle di controllo o campi di testo per i parametri della corsa Usare lo scanner portatile per codici a barre per scansionare l ID della cella a flusso o del kit di reagenti oppure inserire l ID utilizzando la tastiera di tipo touch screen L icona della tastiera I si trova a destra dei campi per il testo Selezionare Next Avanti per passare alla schermata successiva o selezionare Back Indietro per tornare alla schermata precedente In qualunque momento durante la procedura di impostazione della corsa possibile selezionare Cancel Annulla per uscire dall impostazione della corsa e tornare alla schermata Welcome Benvenuto Schermata Integration Integrazione La schermata Integration Integrazione fornisce l opzione di collegare la corsa a BaseSpace Per collegarsi a BaseSpace attenersi a quanto segue 1 Selezionare BaseSpace 2 Selezionare da una delle seguenti opzioni BaseSpace Storage and Analysis Archiviazione e analisi invia i dati della corsa a BaseSpace per il monitoraggio remoto e l analisi dei dati Con questa opzione richiesto un foglio campioni Run Monitoring Only Solo monitoraggio corsa invia solo i file InterOp a BaseSpace che permettono di monitorare la corsa in remoto Esecuzione di una corsa Rapid Run C
128. odotto nonch i rispettivi funzionari dirigenti rappresentanti e dipendenti da qualsiasi pretesa responsabilit danno multa penale azione legale e perdita di ogni e qualsivoglia tipo comprese a titolo esemplificativo ma non esaustivo azioni per danni a persone o decesso e violazioni di diritti di propriet intellettuale di terzi derivanti relativi o che siano originati da i violazione da parte dell acquirente di uno dei presenti termini e condizioni ii utilizzo di questo prodotto da parte dell acquirente al di fuori dell ambito di utilizzo per scopi di ricerca iii qualsiasi utilizzo di questo prodotto non conforme alle specifiche o alla documentazione relativa o iv qualsiasi pretesa oggetto di esclusione Condizioni degli obblighi di indennizzo Gli obblighi di indennizzo delle parti sono condizionali al fatto che la parte che richiede l indennizzo i informi tempestivamente la controparte in forma scritta della pretesa o dell azione relativa ii conferisca alla controparte controllo e autorit esclusivi in relazione alla difesa e alla transazione di tale pretesa o azione iii non ammetta la violazione di qualsivoglia diritto di propriet intellettuale altrui senza il preventivo consenso scritto della controparte iv non concluda alcuna transazione o compromesso relativo a qualsivoglia pretesa o azione senza il preventivo consenso scritto della controparte e infine v fornisca ragionevole assistenza alla controparte nella d
129. ompletamente abbassati e che ciascun pescante sia a contatto con i reagenti N codice 15035788 Rev E ITA Esecuzione di una verifica della fluidica Il pulsante Check Verifica sulla schermata Welcome Benvenuto esegue la verifica della fluidica Utilizzare questa opzione durante l installazione dello strumento e quando si risolvono problemi alla fluidica 1 2 Caricare sullo strumento una cella a flusso usata Caricare otto flaconi SBS con PW1 o con acqua da laboratorio e caricare i flaconi sul corrispondente rack reagenti Caricare il rack sullo strumento Selezionare Check Verifica sulla schermata Welcome Benvenuto Selezionare la soluzione 5 SB2 dall elenco a tendina Se si sta eseguendo una verifica della fluidica con una cella a flusso usata selezionare la soluzione 2 che acqua Inserire i valori predefiniti seguenti Volume Volume 250 Per le modalit HiSeq v4 e TruSeq v3 Aspirate Rate Velocit di aspirazione 250 Per la modalit Rapid Run Corsa rapida Aspirate Rate Velocit di aspirazione 1500 Dispense Rate Velocit di erogazione 2000 Selezionare Pump Pompa Per mettere in pausa la verifica della fluidica selezionare Pause Pausa Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori Se sono presenti bolle eccessive verificare la presenza di ostruzioni nelle guarnizioni del collettore ridurre la velo
130. one SBS 3 SB3 Descrizione Incorporation Reagent Master Mix 25 ml di PW1 o acqua da laboratorio Universal Scan Mix High Salt Buffer Incorporation Wash Buffer Incorporation Wash Buffer Cleavage Reagent Mix Cleavage Buffer 8 Aggiungere 25 ml di PW1 o di acqua da laboratorio al flacone nella posizione 2 9 Far scorrere il rack reagenti nello scomparto reagenti allineando il rack con la guida sulla parte inferiore dello scomparto 10 Abbassare i pescanti nei flaconi di reagente per il sequenziamento come segue a Tirare la maniglia del pettine di aspirazione verso di s e abbassare la maniglia b Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nei tappi a imbuto c Rilasciare la maniglia del pettine di aspirazione nell alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura 11 Selezionare la casella di controllo PW1 25 ml loaded PWI 25 ml caricato Caricamento dei reagenti di indicizzazione 1 Registrare il peso di ciascun reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio 2 Sollevare i pescanti per il rack dei reagenti PE effettuando i seguenti movimenti Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 29 11usbea rap Bulud a ozu swesep Esecuzione di una corsa HiSeq v4 30 a Tirare la maniglia verso di s e quindi sollevare la maniglia b Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Assicurarsi che la maniglia sia posizionata
131. oni del reagente TruSeq Rapid v1 SBS Posizione S NIA A A wN e Reagente IMM PW1 SRM PW1 USB USB CRM PW1 Descrizione Incorporation Master Mix 25 ml di PW1 o acqua da laboratorio Scan Reagent Master Mix 25 ml di PW1 o acqua da laboratorio Tampone di sequenziamento universale Tampone di sequenziamento universale Cleavage Reagent Master Mix 25 ml di PW1 o acqua da laboratorio 7 Caricare 25 ml di PW1 o acqua da laboratorio nelle posizioni seguenti Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 93 11usbea rap Bulud a ozu swesep Per HiSeq Rapid SBS Kit v2 posizioni 2 e 4 Per TruSeq Rapid SBS Kit posizioni 2 4 e 8 8 Far scorrere il rack SBS nello scomparto reagenti allineando il rack con la guida sulla parte inferiore dello scomparto 9 Selezionare la casella di controllo PW1 25 ml loaded PW1 25 ml caricato 10 Far scorrere il rack dei reagenti PE fuori dallo scomparto reagenti 11 Rimuovere i tappi da ogni provetta di reagente e posizionare la provetta sul rack nella posizione numerata associata Tabella 14 Cella a flusso unidirezionale Posizione Reagente Descrizione 10 PWI 10 ml di PW1 o acqua da laboratorio 11 Pw1 10 ml di PW1 o acqua da laboratorio 12 Pw1 10 ml di PW1 o acqua da laboratorio 13 AMS Fast Amplification Mix 14 FPM Fast Premix 15 FDR Fast Denaturation Reagent contiene formammide 16 HP9 Primer indice i5 17 HP12 Primer indice i7 18 HP10 Primer Lettura 1 19 FLS Fast Lineari
132. oppure Le versioni PE dei kit per la generazione di cluster TruSeq Rapid PE Cluster Kit v1 includono i reagenti paired end usati su HiSeq 1500 o TruSeq Rapid SR Cluster Kit v1 8 O N codice 15035788 Rev EITA Procedura per la preparazione dei reagenti Prima di impostare la corsa preparare i reagenti SBS i reagenti di indicizzazione e i reagenti PE Per la preparazione dei reagenti SBS consultare la guida appropriata Guida di preparazione dei reagenti di HiSeq Rapid SBS Kit v2 n codice 15058772 Guida di preparazione dei reagenti di TruSeq Rapid SBS Kit 200 cicli n codice 15036501 Guida di preparazione dei reagenti di TruSeq Rapid SBS Kit 50 cicli n codice 15036502 Per la preparazione dei reagenti di indicizzazione e PE consultare la guida appropriata Guida di preparazione dei reagenti di HiSeq Rapid Cluster Kit v2 n codice 15059131 Guida di preparazione dei reagenti di TruSeq Rapid PE Cluster Kit n codice 15038861 Guida di preparazione dei reagenti di TruSeq Rapid SR Cluster Kit n codice 15038860 Preparare tutti i reagenti prima di impostare la corsa Quando suggerito dal software di controllo caricare tutti i reagenti Quando si usa la chimica per la corsa rapida non necessario tornare allo strumento durante la corsa per caricare i reagenti Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 81 auoIZznpoJ u Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida Flusso di lavoro del sequenziamento Rapid Run Co
133. ori informazioni vedere File di output del sequenziamento a pagina 137 Gestione degli errori del software Real Time Analysis Il software Real Time Analysis tiene i file di registro nella cartella RTALogs Se si verifica un errore questo viene registrato in un file di registro errori denominato Error txt y NOTA Il software crea il file di registro errori solo se si verifica un errore Trasferimento dei dati 128 Durante la corsa il software Real Time Analysis copia automaticamente i dati generati dai file immagine non elaborati nella cartella di output specificata Se l analisi delle immagini accumula ritardo il software Real Time Analysis arresta l elaborazione e pone la cella a flusso in uno stato sicuro L elaborazione riprende quando sono disponibili i dati delle immagini y NOTA Se per qualsiasi motivo il software Real Time Analysis smette di funzionare l elaborazione riprende automaticamente durante il ciclo successivo nel punto appropriato sulla cella a flusso Non riavviare il software Real Time Analysis manualmente N codice 15035788 Rev E ITA Se si utilizza BaseSpace Illumina raccomanda una connettivit di rete minima di non meno di 10 Mbps Per maggiori informazioni vedere Guida alla preparazione della sede di installazione per HiSeq 2500 1500 e 2000 n codice 15006407 Il trasferimento dei dati completo quando viene generato un file dei marker denominato Basecalling_Netcopy_complete txt Uno di questi fil
134. orsa rapida 3 Accedere a BaseSpace utilizzando l e mail e la password dell account Mylllumina 4 Selezionare Next Avanti 8 6 N codice 15035788 Rev E ITA Per proseguire senza collegarsi a BaseSpace attenersi a quanto segue 1 Selezionare None Nessuno 2 Selezionare Next Avanti Schermata Storage Archiviazione 1 Selezionare la casella di controllo Save to an output folder Salva in una cartella di output e selezionare Browse Sfoglia per andare a una posizione della rete preferita Se per l archiviazione e l analisi la corsa collegata a BaseSpace questo campo facoltativo 2 Selezionare Zip BCL files Comprimi file BCL per ridurre lo spazio di archiviazione richiesto Se la corsa collegata a BaseSpace l opzione Zip BCL files Comprimere file BCL selezionata per impostazione predefinita NOTA L impostazione Bin Q Scores Raggruppa punteggi qualitativi attivata per impostazione predefinita per ridurre lo spazio di archiviazione richiesto Questa impostazione raggruppa i punteggi qualitativi su un intervallo di valori pi ampio senza incidere su accuratezza o prestazioni 3 Selezionare dalle opzioni Save Auxiliary Files Salva file ausiliari seguenti Save AIl Thumbnails Salva tutte le miniatura salva tutte le immagini in miniatura Un immagine in miniatura una campionatura di immagini da diverse tile in ciascuna colonna di tile o striscia combinata in un immagine in miniatura Save Tile Thum
135. ost corsa dello strumento Caricamento dei reagenti SBS 1 Capovolgere ciascun flacone diverse volte per assicurarsi che i reagenti siano miscelati completamente 2 Rimuovere il tappo da ciascun flacone di reagente e sostituirlo con un tappo a imbuto x ATTENZIONE Dopo aver manipolato il flacone di CRM smaltire i guanti e sostituirli con un nuovo paio 3 Registrare il peso di ciascun reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio S NOTA La pesatura dei reagenti prima e dopo la corsa di sequenziamento conferma l erogazione appropriata dei reagenti 4 Aprire lo sportello dello scomparto reagenti 5 Sollevare i pescanti per il rack reagenti per il sequenziamento effettuando i seguenti movimenti D 8 N codice 15035788 Rev E ITA a Tirare la maniglia verso di s e quindi sollevare la maniglia b Rilasciare la maniglia del pettine di aspirazione nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Assicurarsi che la maniglia del pettine di aspirazione sia posizionata correttamente nell alloggiamento 6 Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti 7 Posizionare ogni flacone di reagente sul rack nelle posizioni numerate associate Assicurarsi che l estremit conica del flacone sia posizionata nella tacca alla base del rack Tabella 1 Posizioni dei reagenti Posizione 1 o NIA G A O N Reagente IRM PW1 USM Tampone SBS 1 SB1 Tampone SBS 2 SB2 Tampone SBS 2 SB2 CRM Tamp
136. oune xi Capitolo 1 Descrizione generale 1 Introduzione scri e i I EE ai aoea aiiai 2 Componenti di HiSeq 1500 0 0000 3 Avvio di HiSeq 1500 00000000000200 o oaao aonar ar22 6 Software HiSeq 1500 0000 8 Spazio disponibile su disco 0000an aoaaa anann naonna 14 Panoramica sul foglio campioni 0 0L000 Lecce 15 Materiali di consumo per il sequenziamento 000 16 Risorse addizionali 000000 Eiir aea aeRO ERE ieo iin 18 Capitolo 2 Esecuzione di una corsa HiSeq V coo 19 Introduzione 0000000 0000an 000a 00a aa aaao naan 20 Flusso di lavoro per il sequenziamento HiSeq v4 o oooccccccccccccccccccccccoo 21 Tipi di corse per la chimica HiSeq v4 o ooooococccccccccccccccccccccccccccnncnccccooo 22 Inserimento dei parametri della corsa o ooooooocccccccccccccccccccccccccccccccno 23 Caricamento e priming dei reagenti 28 Caricamento di una cella a flusso 0 0000000 aaa 000n0nan 38 Monitoraggio della corsa 0 aoaaa oaan aaan n anonra nrnna 44 Capitolo 3 Esecuzione di una corsa TruSeq V3 cc 47 Introduzione 0 48 Flusso di lavoro per il sequenziamento TruSeq v3 50 Tipi di corsa perla chimica TruSeq V3 52 Inserimento dei parametri della corsa 00 53 Caricamento e
137. paired end 25 56 89 errori e avvertenza icone di stato 11 estrazione intensit 132 F fasi della chimica monitoraggio 44 74 file configurazione Real Time Analysis 127 138 file di output identificazioni delle basi 127 posizioni cluster 127 Tar Indice 158 file filtro 127 137 file identificazione delle basi 127 137 file La 127 138 file locs 137 file output 137 file registro Real Time Analysis 137 file statistiche 127 filtro Chastity 135 fluidica risoluzione dei problemi 145 147 foglio campioni BaseSpace 26 57 panoramica 15 G generazione griglia per identificazione cluster 132 ida documentazione 18 guida tecnica 161 H HiSeq Control Software 8 icona avviso stato 11 icone avviso stato 11 errori e avvertenze 11 identificazione delle basi ciclo 12 134 _ punteggi qualitativi 134 immagini immagini in miniatura thumbnail 24 54 87 miniature thumbnail 138 monitoraggio 44 74 108 salvataggio immagini campioni 24 54 87 impostazione corsa caricamento cella a flusso 40 70 conferma flusso corretto 35 42 65 incorporazione prima base conferma 25 44 55 74 88 108 posizione report 25 55 88 indicatori di attivita 10 indicatori sensori 10 intensit cluster 44 74 108 133 L lavaggi lavaggio con acqua 119 lavaggio di manutenzione 114 soluzione lavaggio manutenzione preparazione 115 lavaggio con acqua 9 durata 119 materiali di consumo 119 volumi previsti 119 l
138. per Index Type Tipo indice No Index Nessun indice esegue una corsa non indicizzata unidirezionale oppure paired end Single Index Singolo indice esegue una corsa unidirezionale oppure paired end con una lettura di indicizzazione Dual Index Doppio indice esegue una corsa unidirezionale oppure paired end con due letture di indicizzazione Custom Personalizzata esegue una corsa unidirezionale oppure paired end con un numero di cicli personalizzato per le letture indici 2 Se stata specificata l opzione Dual Index Doppio indice o Custom Personalizzato selezionare un Flow Cell Format Formato cella a flusso Single Read Singola lettura o Paired End Paired end 3 Immettere il numero di cicli per Lettura 1 e Lettura 2 se applicabile x NOTA f Il numero di cicli eseguiti in una lettura pari a un ciclo in pi rispetto al numero di cicli analizzati Ad esempio per eseguire 100 cicli per la Lettura 1 inserire 101 Per l opzione di indicizzazione Custom Personalizzato immettere il numero di cicli per le letture indici Le lunghezze delle letture non devono essere identiche 4 Confermare le impostazioni della chimica seguenti Questi campi sono popolati automaticamente in base al tipo di kit di reagenti e all opzione del formato della cella a flusso selezionati a SBS TruSeq Rapid SBS Kit v1 o HiSeq Rapid SBS Kit v2 b Cluster Kit Kit Cluster TruSeq Rapid PE Cluster Kit v1 TruSeq Rapid SR Cluster Kit v1 HiSeq Rapid
139. pezionare il report sulla prima base e poi proseguire la Lettura 1 La corsa prosegue come indicato nei parametri della corsa Preparare i reagenti paired end e ICB fresco per la Lettura 2 Dopo la preparazione pesare i reagenti Per informazioni sulla preparazione dei reagenti vedere Procedura per la preparazione dei reagenti a pagina 49 5 O N codice 15035788 Rev EITA Caricare i reagenti paired end e ICB fresco per la Lettura 2 Continuare la corsa Il software esegue automaticamente il priming dei reagenti paired end la risintesi Lettura 2 e la Lettura 2 Al termine della corsa rimuovere e pesare i reagenti Eseguire un lavaggio dello strumento Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 5 ea basn ojueuleizuanbes 1ad OJOAB IP OSSNJH Tipi di corsa per la chimica TruSeq v3 La tabella seguente mostra i tipi di corse di sequenziamento e il numero di cicli possibili per ciascuna lettura usando la chimica TruSeq v3 Utilizzare queste informazioni come riferimento quando si imposta la corsa Tipo di corsa Cicli Cicli di lettura Cicli di lettura Cicli Cicli Lettura 1 Indice 1 i7 Indice 2 15 Lettura 2 totali Unidirezionale lt 101 lt 101 non indicizzata Unidirezionale lt 101 6071 lt 108 singola indicizzazione 82 lt 1092 Unidirezionale lt 101 8 8 lt 117 doppia indicizzazione Paired end lt 101 lt 101 lt 202 non indicizzata Paired end lt 101 Z1 lt 101
140. priming dei reagenti L Lecce cei eee cieca 59 Caricamento di una cella a flusso 0 68 Monitoraggio della corsa 00 00a aa aoaaa anaana arannana 74 Preparazione dei reagenti perla Lettura 2 0 00 76 Caricamento dei reagenti perla Lettura 2 00000000000000 TI Capitolo 4 Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida 79 Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 XI Intreduzione 2 A e e ai 80 Flusso di lavoro del sequenziamento Rapid Run Corsa rapida 82 Tipi di corsa per la chimica Rapid Run Corsa rapida 83 Verifica del volume pre corsa 00 0 85 Inserimento dei parametri della corsa 00 86 Caricamento e priming dei reagenti 000000000 92 Caricamento di una cella a flusso 000000000000 102 Monitoraggio della corsa 000 anaana raain a ann nnnnnnan 108 Capitolo 5 Procedure post corsa 111 INTFOCUZIONE code tcica rei i aio alt o da 112 Rimozione e pesatura dei reagenti ceci eee eee eee 113 Esecuzione di un lavaggio di manutenzione 000 0 114 Esecuzione di un lavaggio COMACQUA sa niet iatale aado 119 Cambio della modalit di sequenziamento 0 121 Porre lo strumento nello stato inattivo idling
141. r i materiali di consumo usati o scaduti La presente sezione esaurisce la responsabilit di Illumina per qualsiasi violazione di diritti di propriet intellettuale di terzi Esclusioni agli obblighi di indennizzo di Illumina Illumina ha l obbligo di difendere indennizzare e tenere indenne l acquirente da qualsiasi pretesa violazione di diritti di terzi da parte di Illumina nella misura in cui essa derivi da i l utilizzo di questo prodotto in qualsiasi modo o per qualsiasi scopo non compreso nell ambito dell utilizzo per scopi di ricerca ii l utilizzo di questo prodotto in modo non conforme alle sue caratteristiche tecniche alla documentazione ai diritti espressamente concessi all acquirente nell ambito della presente o in violazione da parte dell acquirente dei presenti termini e condizioni iii l utilizzo di questo prodotto in combinazione con altri prodotti materiali o servizi non forniti da Illumina iv l utilizzo di questo prodotto per eseguire saggi o altri processi non forniti da Illumina o v la conformit di Illumina con specifiche o istruzioni per questo prodotto fornite da o per conto dell acquirente ciascuno dei punti da i a v viene di seguito definito come una Pretesa oggetto di esclusione Indennizzo da parte dell acquirente L acquirente dovr difendere manlevare e tenere indenne Illumina i suoi affiliati i loro collaboratori non affiliati e partner di sviluppo che abbiano contribuito allo sviluppo di questo pr
142. ra il punteggio qualitativo e la probabilit di errore Punteggio qualitativo Q X Probabilit di errore Q40 0 0001 1 su 10 000 Q30 0 001 1 su 1 000 Q20 0 01 1 su 100 Q10 0 1 1 su 10 y NOTA Il punteggio qualitativo si basa su una versione modificata dell algoritmo Phred Per maggiori informazioni vedere en wikipedia org wiki Phred_quality_score Il punteggio qualitativo calcola un set valori per ciascuna identificazione delle basi e quindi usa questi valori per individuare il punteggio qualitativo in una tabella qualitativa Le tabelle qualitative sono create per fornire previsioni di qualit accurate e ottimali per le corse generate da una specifica configurazione di una piattaforma di sequenziamento e versione della chimica Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q 3 5 SISAJEU y aUI PSY OJOAB IP OSSN Software Real Time Analysis 136 Dopo la determinazione del punteggio qualitativo i risultati sono registrati nei file per l identificazione delle basi bcl Per maggiori informazioni vedere File di output del sequenziamento a pagina 137 Raggruppamento dei punteggi qualitativi Il software Real Time Analysis raggruppa i punteggi qualitativi in base a intervalli o raggruppamenti specifici ed assegna un valore a ciascun intervallo Il raggruppamento dei punteggi qualitativi riduce significativamente i requisiti di spazio di archiviazione senza incidere sull accuratezza e sulle prestazioni delle applicazion
143. rchiviazione richiesto Se la corsa collegata a BaseSpace l opzione Zip BCL files Comprimere file BCL selezionata per impostazione predefinita NOTA L impostazione Bin Q Scores Raggruppa punteggi qualitativi attivata per impostazione predefinita per ridurre lo spazio di archiviazione richiesto Questa impostazione raggruppa i punteggi qualitativi su un intervallo di valori pi ampio senza incidere su accuratezza o prestazioni Selezionare dalle opzioni Save Auxiliary Files Salva file ausiliari seguenti Save All Thumbnails Salva tutte le miniatura salva tutte le immagini in miniatura Un immagine in miniatura una campionatura di immagini da diverse tile in ciascuna colonna di tile o striscia combinata in un immagine in miniatura Save Tile Thumbnails Salva miniature delle tile salva le immagini in miniatura delle tile Le immagini in miniatura delle tile rappresentano una singola tile piuttosto che un campionamento di tile in una striscia Selezionare Next Avanti Schermata Flow Cell Setup Impostazione cella a flusso La schermata Flow Cell Setup Impostazione cella a flusso registra le informazioni sulla cella a flusso utilizzata per la corsa 54 1 Eseguire la scansione del codice a barre della cella a flusso o immettere l ID numero del codice a barre della cella a flusso da sottoporre a sequenziamento L ID della cella a flusso utilizzata per determinare il tipo di cella a flusso e la compatibilit de
144. red end Far scorrere il rack reagenti nello scomparto reagenti allineando il rack con la guida sulla parte inferiore dello scomparto Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 II Z eny97 e sad 1juebeea lep OQUELUEILEI Esecuzione di una corsa TruSeq v3 Abbassare i pescanti nei flaconi di reagente PE come segue a Tirare la maniglia verso di s e abbassare la maniglia b Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nelle provette c Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura Caricamento di ICB per la Lettura 2 18 1 2 Registrare il peso del reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio Sollevare i pescanti per il rack reagenti per il sequenziamento effettuando i seguenti movimenti a Tirare la maniglia del pettine di aspirazione verso di s e quindi sollevare la maniglia b Rilasciare la maniglia del pettine di aspirazione nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Assicurarsi che la maniglia del pettine di aspirazione sia posizionata correttamente nell alloggiamento Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti Rimuovere il flacone di reagente ICB esistente dalla posizione 1 del rack reagenti e rimuovere il tappo a imbuto dal flacone Collocare il tappo a imbuto sul nuovo flacone di ICB e caricare il flacone nella posizione 1 Assicurarsi che l estremit conica del flacone sia posi
145. rsa rapida 82 Preparare tutti i reagenti per la corsa e preparare il templato della libreria Per informazioni sulla preparazione dei reagenti vedere Procedura per la preparazione dei reagenti a pagina 81 Utilizzando il software di controllo eseguire una verifica del volume e immettere i parametri della corsa Per la generazione di cluster integrata sullo strumento caricare tutti i reagenti per la corsa e preparare il templato della libreria Per la generazione di cluster su cBot caricare tutti i reagenti per la corsa Con una cella a flusso usata sullo strumento confermare il flusso corretto Per la generazione di cluster su cBot eseguire il priming dei reagenti SBS e misurare lo scarto del priming Avviare la corsa di sequenziamento Dopo il ciclo 1 ispezionare il report sulla prima base impostazione opzionale e poi proseguire la Lettura 1 La corsa di sequenziamento continua su PE e Lettura 2 senza alcun intervento Al termine della corsa rimuovere e pesare i reagenti Eseguire un lavaggio post corsa con acqua N codice 15035788 Rev E ITA Tipi di corsa per la chimica Rapid Run Corsa rapida Le tabelle seguente mostrano i tipi di corse di sequenziamento e il numero di cicli possibili per ciascuna lettura utilizzando la chimica per la corsa rapida Utilizzare queste informazioni come riferimento quando si imposta la corsa Tabella 10 HiSeq Rapid SBS Kit v2 Tipo di corsa Cicli Cicli di lettura Cicli
146. rt sulla prima base viene generato automaticamente per ciascuna corsa La selezione di questa opzione apre il report sulla prima base prima di procedere con la corsa Opzionale Dalle caselle di controllo Align to PhiX Allineamento con PhiX deselezionare la casella di controllo per le corsie che non contengono PhiX Come impostazione predefinita tutte le corsie sono selezionate per l allineamento tramite il software Real Time Analysis In alternativa selezionare le corsie sull immagine della cella a flusso per aggiungere o rimuovere le corsie per l allineamento PhiX y NOTA Con HCS v2 2 e RTA v1 18 non richiesta una corsia di controllo dedicata Quindi l opzione per assegnare una corsia di controllo non disponibile con questa configurazione software Opzionale Per TruSeq Rapid v1 Selezionare Keep Intensity Files Mantieni i file intensit per la ripetizione dell analisi successivamente o l elaborazione personalizzata Come impostazione predefinita questa opzione non selezionata Il salvataggio dei file delle intensit non necessario per le analisi integrate sullo strumento L attivazione di N codice 15035788 Rev E ITA questa opzione aumenta significativamente la dimensione della cartella di output dei dati 4 Selezionare Next Avanti Schermata Recipe Ricetta In base alle informazioni inserite nella schermata Recipe Ricetta viene generata automaticamente una ricetta 1 Selezionare dalle seguenti opzioni
147. scomparto reagenti allineando il rack con la guida sulla parte inferiore dello scomparto Se si sta eseguendo una corsa unidirezionale abbassare i pescanti nelle provette di reagenti PE nel modo seguente N codice 15035788 Rev E ITA 9 a Tirare la maniglia verso di s e quindi abbassare la maniglia b Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nelle provette c Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura Selezionare Next Avanti Caricamento dei reagenti PE 1 2 Registrare il peso di ciascun reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio Sollevare i pescanti per il rack dei reagenti PE effettuando i seguenti movimenti a Tirare la maniglia verso di s e quindi sollevare la maniglia b Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Assicurarsi che la maniglia sia posizionata correttamente nell alloggiamento Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti usando la maniglia del rack Rimuovere i tappi da ciascuna provetta di reagente e posizionare la provetta sul rack nella posizione numerata associata o facendo corrispondere il colore dell etichetta Tabella 4 Celle a flusso paired end Posizione Reagente Descrizione 10 FRM Fast Resynthesis Mix 11 FLM2 Fast Linearization Mix 2 13 AMS Fast Amplification Mix 14 FPM Fast Amplification Premix 15 FDR Fast Denaturation Rea
148. scrizione 16 HP9 Miscela primer sequenziamento SR Indice 2 i5 17 HP8 o HP12 Miscela primer sequenziamento Indice 1 i7 18 HP3 Soluzione di denaturazione 19 HT2 Tampone di lavaggio Tabella 8 Corsa a doppia indicizzazione su una cella a flusso paired end Posizione Reagente Descrizione 10 RMR Resynthesis Mix 17 HP8 o HP12 Miscela primer sequenziamento Indice 1 i7 18 HP3 Soluzione di denaturazione 19 HT2 Tampone di lavaggio Collocare provette coniche da 15 ml riempite con 10 ml di acqua da laboratorio nelle posizioni non usate del rack Far scorrere il rack reagenti nello scomparto reagenti allineando il rack con la guida sulla parte inferiore dello scomparto Abbassare i pescanti nelle provette sul rack dei reagenti PE come segue a Tirare la maniglia verso di s e quindi abbassare la maniglia tirandola verso di s b Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nelle provette Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 61 11usbea rap Bulud a OJUSLUBoLIeo Esecuzione di una corsa TruSeq v3 c Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura 8 Chiudere lo sportello dello scomparto reagenti 9 Selezionare Next Avanti Priming dei reagenti La procedura per il priming dei reagenti include la pulizia del vano portacella il caricamento di una cella a flusso per il priming la conferma del flusso corretto e l avvio del priming Pulizi
149. si specifici o per biomarcatori del DNA sequenze o combinazioni di biomarcatori o sequenze specifiche sono esempi di PI per applicazioni specifiche Materiali di consumo indica i reagenti e i materiali di consumo a marchio Illumina destinati a essere utilizzati insieme e in combinazione con l hardware Documentazione indica il manuale per l utente Illumina per questo prodotto inclusi senza limitazioni foglietti illustrativi e altra documentazione di accompagnamento per questo prodotto o a cui il prodotto fa riferimento o nella confezione del prodotto in vigore alla data di spedizione del prodotto da Illumina La documentazione include questo documento Hardware indica strumenti accessori o periferiche Illumina Illumina indica Illumina Inc o un affiliata Illumina come applicabile Prodotto indica il prodotto che accompagna questo documento ad esempio hardware materiali di consumo o software Acquirente la persona o l entit che acquisisce legittimamente e legalmente questo prodotto da Illumina o da un rivenditore autorizzato Illumina Software indica il software con marchio Illumina ad esempio software operativo per l hardware o software di analisi dei dati Il software viene concesso in licenza e non venduto e pu essere soggetto a condizioni ulteriori indicate nel contratto di licenza per l utente finale Specifiche indica le specifiche scritte da Illumina per questo prodotto in vigore alla data di spedizione del prodotto med
150. sibile riprendere la corsa Completare per corsa Complete For Read S La corsa riprende all inizio della lettura Completare per successiva lettura Immediate Stop Arresto No option Nessuna No immediato opzione 1 Dalla schermata Run Overview Panoramica corsa selezionare Stop Arresto Si apre il menu Stop Arresto Figura 53 Arresto della corsa Norn St End of V immed 2 Selezionare una delle seguenti opzioni di arresto 3 Selezionare una opzione di arresto Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 1 A 9 esoo eun Ip esardi a 0159 11 y Risoluzione dei problemi Normal Stop End of Lane Chemistry Arresto normale fine corsia chimica arresta la corsa solo dopo il completamento del comando corrente per la chimica o per l imaging e poi pone la cella a flusso in uno stato sicuro Normal Stop End of Cycle Arresto normale fine del ciclo arresta la corsa dopo il completamento del ciclo corrente e poi pone la cella a flusso in uno stato sicuro Immediate Stop Arresto immediato arresta la corsa senza completare l operazione corrente e non pone la cella a flusso in uno stato sicuro Non possibile riprendere una corsa arrestata usando il comando Immediate Stop Arresto immediato Selezionare dalle opzioni Real Time Analysis seguenti Keep As Is Mantenere come si trova la corsa arrestata senza alcun cambiamento su Real Time Analysis La corsa pu riprendere se era stata arrestata Comple
151. sizioni dei reagenti SBS Selezionare Next Avanti per procedere 3 Caricare lo strumento con acqua da laboratorio come segue a Riempire otto flaconi con 20 ml di acqua da laboratorio b Riempire dieci provette PE con 10 ml di acqua da laboratorio c Perla modalit Rapid Run Corsa rapida riempire la provetta Eppendorf con 1 ml di acqua da laboratorio 4 Accertarsi che sia caricata una cella a flusso usata Se necessario caricare una cella a flusso usata Selezionare Next Avanti 5 Eseguire una verifica della fluidica Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q q 9 enboe uo cibbene un ip suorznoasy Procedure post corsa a Selezionare la soluzione 2 dall elenco a tendina Accettare i valori predefiniti della pompa b Selezionare Pump Pompa c Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori 6 Rimuovere i tubi di scarico dal contenitore per gli scarti Non includere i tubi dalla pompa di scarico condensa 7 Perle modalit ad output elevato fissare insieme i tubi con parafilm assicurandosi di tenere tutti i tubi allo stesso livello Collocare le estremit dei tubi legati a un flacone da 250 ml 8 Perla modalit Rapid Run Corsa rapida posizionare le estremit dei tubi 4 e 5 in un contenitore vuoto Posizionare le estremit di tutti gli altri tubi in un flacone di acqua pulita per impedire che entri aria nelle pompe delle sir
152. so di s e abbassare la maniglia b Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nei tappi a imbuto c Rilasciare la maniglia del pettine di aspirazione nell alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura 10 Selezionare la casella di controllo PW1 25 ml loaded PW1 25 ml caricato Caricamento dei reagenti di indicizzazione 1 Registrare il peso di ciascun reagente sul modulo di monitoraggio del laboratorio 2 Sollevare i pescanti per il rack dei reagenti PE effettuando i seguenti movimenti 60 N codice 15035788 Rev E ITA a Tirare la maniglia verso di s e quindi sollevare la maniglia b Rilasciare la maniglia nell alloggiamento nella parte superiore della scanalatura Assicurarsi che la maniglia sia posizionata correttamente nell alloggiamento Far scorrere il rack reagenti fuori dallo scomparto reagenti usando la maniglia del rack Rimuovere i tappi da ciascuna provetta di reagente e posizionare la provetta sul rack nella posizione numerata associata o facendo corrispondere il colore dell etichetta Tabella 6 Corsa a singola indicizzazione su una cella a flusso unidirezionale o cella a flusso paired end Posizione Reagente Descrizione 17 HP8 o HP12 Miscela primer sequenziamento Indice 1 i7 18 HP3 Soluzione di denaturazione 19 HT2 Tampone di lavaggio Tabella 7 Corsa a doppia indicizzazione su una cella a flusso unidirezionale Posizione Reagente De
153. software di controllo eseguono il flusso di lavoro Real Time Analysis Il flusso di lavoro comprende le fasi seguenti Generazione della griglia per l identificazione dei cluster mappa le posizioni dei cluster Registrazione ed estrazione dell intensit registra la posizione di ciascuna immagine sulla cella a flusso e determina un valore di intensit per ciascun cluster Correzione della matrice colore corregge la visualizzazione contemporanea tra i canali Correzione empirica della determinazione delle fasi phasing corregge gli effetti della determinazione delle fasi phasing e della predeterminazione delle fasi prephasing Identificazione delle basi determina una identificazione delle basi per ogni cluster Punteggio qualitativo assegna un punteggio qualitativo per ogni identificazione delle basi Software Real Time Analysis Generazione della griglia per l identificazione dei cluster Il primo passaggio del flusso di lavoro la generazione della griglia per l identificazione dei cluster che definisce la posizione di ciascun cluster in una tile usando le coordinate X e Y La griglia viene usata come riferimento per i passaggi successivi di registrazione ed estrazione dell intensit A causa dell array casuale dei cluster sulla cella a flusso la generazione della griglia per l identificazione dei cluster richiede i dati dell immagine dai primi cinque cicli della corsa Dopo che l ultimo ciclo della griglia per una tile stato so
154. sono presenti cluster del campione di controllo PhiX e l opzione Align to PhiX Allineamento con PhiX viene selezionata durante l impostazione della corsa Al ciclo 52 di ciascuna lettura o al termine della corsa per le corse con meno di 52 cicli I controlli in linea sono generati solo per i metodi di preparazione della libreria TruSeq Dopo il completamento delle letture indici Il conteggio indici per corsia viene generato solo quando fornito un foglio campioni N codice 15035788 Rev E ITA Il software Sequencing Analysis Viewer SAV v1 8 44 e versione successiva non comprende pi la scheda TruSeq Controls Controlli TruSeg dove SAV riporta i risultati dell analisi dei controlli in linea Sequencing Analysis Viewer SAV Il software Sequencing Analysis Viewer SAV mostra le metriche generate durante la corsa di sequenziamento Le metriche vengono visualizzate sotto forma di grafici diagrammi e tabelle Il software Sequencing Analysis Viewer SAV si apre automaticamente quando sono disponibili le metriche della corsa Selezionare Refresh Aggiorna in qualsiasi momento durante la corsa per visualizzare le metriche aggiornate Per ulteriori informazioni vedere Guida per l utente del software Sequencing Analysis Viewer SAV n codice 15020619 Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q 31 es109 B J9p ay911 9uu ajjap 01Bbe1O VUOI Flusso di lavoro Real Time Analysis Il software Real Time Analysis e il
155. sume Ripresa N codice 15035788 Rev E ITA 2 Selezionare la cartella della corsa appropriata dall elenco a tendina NOTA f Il software riprende la corsa dal punto in cui la stessa era stata interrotta preimpostando la corretta impostazione sulla schermata Resume Ripresa 3 Confermare le impostazioni sulla schermata Resume Ripresa o selezionare il punto appropriato della corsa per riprenderla Resume At Riprendi a presenta un elenco con la lettura o il punto della corsa da cui riprendere Start At Cycle Inizia dal ciclo presenta un elenco con il ciclo da cui riprendere y ATTENZIONE Illumina non consiglia di riprendere una corsa al punto d inversione turnaround paired end salvo che per la re ibridazione primer Lettura 2 4 Confermare le impostazioni sulla schermata Resume Ripresa o selezionare i comandi di imaging e della chimica per la ripresa Per maggiori informazioni vedere Esempio di impostazioni per la ripresa di una corsa a pagina 151 5 Selezionare Next Avanti per procedere Il software guida l utente attraverso le fasi rimanenti di impostazione della corsa Esempio di impostazioni per la ripresa di una corsa Se la corsa stata arrestata dopo l imaging della corsia 1 al ciclo 23 il software stabilisce automaticamente le impostazioni per la ripresa per Read 1 Lettura 1 at cycle al ciclo 23 Il sistema mostra le impostazioni seguenti sulla schermata Resume Ripresa Resume At Riprendi a Read 1 Le
156. ta sia 1 75 ml per un totale di 14 ml Il totale viene calcolato come segue 250 ul per ciascuna posizione SBS fatta eccezione per la posizione 2 250 x 7 1 75 ml 1 75 ml per ciascuna corsia 1 75 x 8 14 ml Registrare i risultati sul modulo di monitoraggio del laboratorio Riposizionare i tubi di scarico nel contenitore per gli scarti prima di procedere Selezionare Next Avanti Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 37 11usbea rap Bulud a OJUSLUBoLIeo Caricamento di una cella a flusso Le fasi per il caricamento di una cella a flusso con cluster include la rimozione della cella a flusso per il priming la pulizia del vano portacella il caricamento della cella a flusso e la conferma del flusso corretto Materiali di consumo forniti dall utente gt Panno per la pulizia delle lenti gt Salviette con alcol o etanolo al 70 Panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle Un paio di pinze Rimozione della cella a flusso usata 1 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 1 per sbloccare i collettori Figura 16 Leva della cella a flusso in posizione 1 Esecuzione di una corsa HiSeq v4 2 Spostare lentamente la leva della cella a flusso in posizione 0 per sbloccare la tenuta del vuoto e rilasciare la cella a flusso 3 8 N codice 15035788 Rev E ITA Figura 17 Leva della cella a flusso in posizione 0 0 1 2 E 3 Sollevare la cella a flusso usata dal vano portacella
157. te For Run Completare per corsa si arresta il software Real Time Analysis Le informazioni sulla corsa i parametri della corsa e i file ricetta vengono aggiornati in modo da far corrispondere i cicli totali secondo l ultimo ciclo completato Poi il software Real Time Analysis riprende per completare l identificazione della basi per la corsa fino al punto in cui la corsa era stata arrestata Non possibile riprendere la corsa Complete For Read Completare per lettura si arresta il software Real Time Analysis Le informazioni sulla corsa i parametri della corsa e i file ricetta vengono aggiornati in modo da regolare e ridurre trim la lunghezza della lettura corrente secondo l ultimo ciclo completato Le letture seguenti non ne sono influenzate Poi il software Real Time Analysis riprende per completare l analisi della lettura corrente La corsa riprende all inizio della lettura successiva 5 Dopo l arresto della corsa selezionare Return to Start Ritornare all avvio sulla schermata Run Overview Panoramica corsa Si apre la schermata Welcome Benvenuto Ripresa di una corsa arrestata 150 Si pu riprendere una corsa solo quando la corsa era stata arrestata in sicurezza utilizzando un opzione di arresto normale con un opzioni del software Real Time Analysis che permette di riprendere la corsa Dalla schermata Welcome Benvenuto selezionare Sequence Sequenzia e poi selezionare Resume Run Ripresa corsa Si apre la schermata Re
158. te da 01 sul lato di output della cella a flusso fino a 16 sul lato di input Figura 51 Numerazione delle tile Nome tile Superficie 1 2 07 gt Tile 1 superiore da 01 a 16 2 inferiore y Striscia 1 prima 2 seconda 3 terza L esempio indica una tile sulla superficie superiore della cella a flusso nella seconda striscia settima tile Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 1 41 9 11 9 j p SUOIZEeJSUUNN Software Real Time Analysis IMmagini in miniatura thumbnail 142 Il software di controllo pu essere configurato per generare immagini in miniatura thumbnail in formato file jpg Si generano immagini in miniatura per ciascun ciclo e base Il software di controllo raccoglie le immagini da 9 sezioni di una tile Le nove immagini sono combinate in un unica immagine in miniatura e questa pu essere utilizzata per la risoluzione di eventuali problemi di una corsa Le immagini in miniatura non sono adatte per l analisi delle immagini ma possono essere utilizzate per la risoluzione dei problemi Figura 52 Immagine in miniatura thumbnail 0 O oO N codice 15035788 Rev E ITA Risoluzione del problemi idolo AAA RA A RR i gi an piniitiss i 144 Possibili problemi d impostazione della corsa 00 145 Esecuzione di una verifica della fluidica 0 0 aaao aaoo a oaaao aaan oaan 147 BaseSpace non disponibile 000000000000000
159. te dei clienti Illumina in correlazione con l utilizzo dei prodotti qui descritti con esclusione di qualsiasi altro scopo Questo documento e il suo contenuto non possono essere usati o distribuiti per altri scopi e o in altro modo diffusi resi pubblici o riprodotti con alcun mezzo senza previa approvazione scritta da parte della Illumina Mediante questo documento Illumina non cede alcuna licenza protetta dai suoi diritti di brevetto di propriet dei marchi di propriet intellettuale o riconosciuti dal diritto consuetudinario n diritti simili di terzi Il Software viene concesso in licenza conformemente alle condizioni del contratto Illumina Sequencing Software License Agreement fornito in un documento separato Se l utente non accetta le condizioni specificate in tale contratto Illumina non concede la licenza d uso del Software e l utente deve astenersi dall installare o utilizzare il Software Al fine di assicurare un uso sicuro e corretto dei prodotti qui descritti le istruzioni riportate in questo documento devono essere scrupolosamente ed esplicitamente seguite da personale qualificato e adeguatamente formato Leggere e comprendere a fondo tutto il contenuto di questo documento prima di usare tali prodotti LA LETTURA INCOMPLETA DEL CONTENUTO DEL PRESENTE DOCUMENTO E IL MANCATO RISPETTO DI TUTTE LE ISTRUZIONI IVI CONTENUTE PU CAUSARE DANNI AL PRODOTTO LESIONI PERSONALI A UTENTI E TERZI E DANNI MATERIALI ILLUMINA NON SI ASSUME ALCUN
160. te di etanolo Otto flaconi da 250 ml Corning n di catalogo 430776 10 provette da 15 ml Corning n di catalogo 430052 Per le corse Rapid Run Corsa rapida 1 provetta Eppendorf per cella a flusso per il lavaggio della stazione di caricamento Acqua da laboratorio Tween 20 Sigma Aldrich n di catalogo P7949 ProClin 300 Sigma Aldrich n di catalogo 48912 U Preparazione della soluzione di lavaggio 114 Preparare 5 litri di soluzione di lavaggio di manutenzione da utilizzare con uno strumento La soluzione pu essere utilizzata per un massimo di tre volte e conservata per un massimo di 30 giorni a temperatura ambiente z NOTA i Smaltire la soluzione di lavaggio in conformit alle norme di sicurezza in vigore localmente N codice 15035788 Rev E ITA Preparare 250 ml di 10 Tween 20 combinando i volumi seguenti aggiungendo per prima l acqua Acqua da laboratorio 225 ml Tween 20 25 ml Collocare una barra di agitazione in una damigiana da almeno 6 litri Combinare i volumi seguenti nella damigiana aggiungendo per prima l acqua Acqua da laboratorio 750 ml 10 Tween 20 250 ml ProClin 300 1 5 ml Con questi volumi si otterr una soluzione di lavaggio di circa Tween 20 2 5 e ProClin 300 0 15 Posizionare la damigiana su un agitatore e agitare fino a quando la soluzione completamente miscelata Aggiungere alla soluzione 4 litri di acqua da laboratorio Con questi volumi si otterr una soluzione di lavaggi
161. ti ricondizionati o nuovi anche se solo un solo componente dell hardware sia non conforme Qualora l hardware venga sostituito interamente il periodo di garanzia per la sostituzione il periodo pi breve tra i 90 giorni successivi alla data di spedizione e la durata restante della garanzia hardware originale Qualora venga sostituito o riparato unicamente un componente il periodo di garanzia per il suddetto componente il periodo che termini pi tardi tra i 90 giorni successivi alla data di spedizione e la durata restante della garanzia hardware originale Quanto sopra esaurisce i mezzi di tutela a disposizione dell acquirente e gli obblighi di Illumina ai sensi della garanzia qui prevista f Articoli di terzi e garanzia Illumina non ha alcun obbligo di garanzia in relazione a qualsiasi articolo proveniente da terzi e fornito all acquirente ai sensi della presente Sono articoli di terzi quelli riportanti marchio o etichetta con il Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 V nome di un terzo L eventuale garanzia per gli articoli di terzi e fornita dal produttore originale Previa richiesta scritta Illumina tenter di passare eventuali garanzie di tale tipo all acquirente 9 Indennizzo a Indennizzo per violazione di diritti di terzi da parte di Illumina In conformit ai presenti termini e condizioni comprese a titolo esemplificato ma non esaustivo le esclusioni agli obblighi di indennizzo di Illumina sezione 9 b di seguito e le
162. ti e mantenere queste posizioni per ciascun lavaggio successivo Altrimenti la soluzione di lavaggio potrebbe contaminarsi con i reagenti presenti nei pescanti Caricare i flaconi e le provette sullo strumento nella posizione del rack reagenti appropriata Selezionare la casella di controllo Wash solution loaded and template loading station closed Soluzione di lavaggio caricata e stazione di caricamento del templato chiusa Selezionare Next Avanti Rimuovere la cella a flusso dal piano portacelle e metterla da parte fino a quando si pronti a caricare nuovamente la stessa cella a flusso prima di avviare il lavaggio Indossare un paio di guanti nuovi premere leggermente su un lato della guarnizione anteriore fino a quando l altro lato si solleva Utilizzare delle pinzette per afferrare e rimuovere la guarnizione Ripetere per rimuovere la guarnizione posteriore Figura 49 Rimozione delle guarnizioni dei collettori usate Collocare una nuova guarnizione a 10 porte nella parte anteriore del collettore e una nuova guarnizione a 8 porte nella parte posteriore del collettore Riposizionare la cella a flusso Assicurarsi che la casella di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva sia selezionata sulla schermata Load Wash Flow Cell Caricamento della cella a flusso per il lavaggio N codice 15035788 Rev E ITA 13 14 15 16 17 18 19 20 Selezionare Next Avanti Eseguire una verifica della fluidica a Sele
163. to Provette per microcentrifuga per la modalit Rapid Run Corsa rapida Materiale di consumo Provetta per microcentrifuga da 1 5 ml Provetta per microcentrifuga da 1 7 ml Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 Fornitore VWR n di catalogo 20170 038 n di catalogo 20170 650 o n di catalogo 89000 028 Axygen n di catalogo MCT 150 C VWR n di catalogo 20170 575 Axygen n di catalogo MCT 175 C Sorenson BioScience n di catalogo 16070 17 ojuawreizuanbaes j 1ad ounNsuos Ip enaze N Descrizione generale Risorse addizionali possibile scaricare la documentazione seguente dal sito Web Illumina Risorsa Guida alla preparazione della sede di installazione per HiSeq 2500 1500 e 2000 n codice 15006407 Guida sulla sicurezza e conformit dello strumento HiSeg n codice 15012614 Guida di preparazione dei reagenti HiSeq Cluster Kit v4 n codice 15050104 Guida per la preparazione dei reagenti del kit HiSeq Rapid Cluster Kit v2 n codice 15059131 Guida di preparazione dei reagenti HiSeq SBS Kit v4 n codice 15050108 Guida per la preparazione dei reagenti del kit HiSeq Rapid SBS Kit v2 n codice 15058772 Denaturazione e diluizione delle librerie per HiSeq e GAIIx n codice 15050107 Descrizione Fornisce le specifiche relative ai locali del laboratorio i requisiti elettrici e ambientali Fornisce informazioni sulla etichettatura dello strumento le certificazioni
164. ttoposto a imaging viene generata la griglia Le posizioni cluster sono scritte su un file di posizioni cluster locs e un file di posizioni cluster clocs compresso per ciascuna tile Per maggiori informazioni vedere File di output del sequenziamento a pagina 137 Registrazione ed estrazione dell intensit La registrazione e l estrazione dell intensit iniziano dopo la generazione della griglia delle posizioni dei cluster 1 3 D N codice 15035788 Rev E ITA La registrazione allinea le immagini prodotte su ogni ciclo successivo alla generazione della griglia rispetto alla griglia L estrazione dell intensita determina un valore di intensita per ciascun cluster nella griglia per una data immagine Se la registrazione non riesce per una qualsiasi immagine in un ciclo non viene generata alcuna identificazione delle basi per quella tile in quel ciclo Usare il software Sequencing Analysis Viewer SAV per esaminare le immagini in miniatura e identificare le immagine la cui registrazione non riuscita Usare i file offset per risolvere i problemi relativi alla registrazione Per maggiori informazioni vedere File di output del sequenziamento a pagina 137 Correzione della matrice colore Dopo la registrazione e l estrazione dell intensit il software Real Time Analysis corregge la visualizzazione contemporanea tra i canali La visualizzazione contemporanea si verifica quando ad esempio un cluster mostra qualche intensit nel
165. ttura 1 Start At Cycle Inizia al ciclo 23 Figura 54 Esempio di ripresa al ciclo 23 Resume At Read 1 Start At Cycle 23 Dato che in questo esempio la corsa era stata arrestata durante una fase di imaging Imaging no chemistry Imaging nessuna chimica viene selezionato automaticamente Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 q 5 esoo eun Ip esardi a 0159 11 y Risoluzione dei problemi Messa in pausa di una corsa y ATTENZIONE Non interrompere una corsa durante la fase di imaging Utilizzare la funzione di interruzione Normal Normale a fine ciclo o a fine corsia per interrompere e riprendere una corsa Dalla schermata Run Overview Panoramica corsa e possibile mettere in pausa una corsa La messa in pausa di una corsa potrebbe essere necessaria per verificare i componenti della corsa ad esempio i volumi dei reagenti prima di procedere con la corsa In condizioni di funzionamento normale non necessario mettere in pausa una corsa 1 Dalla schermata Run Overview Panoramica corsa selezionare Pause Pausa Si apre il menu Pause Pausa Figura 55 Opzioni Pausa rma har R nt l ange Reage 5 2 Selezionare Normal Pause Pausa normale 3 Selezionare Yes S per confermare il comando pausa Il software completa il comando corrente per la chimica o per l imaging e pone la cella a flusso in uno stato sicuro 4 Selezionare Resume Riprendi per riprendere la corsa Sostituzione dei reagenti dur
166. urire la posizione 5 Ridurre la velocit di aspirazione a 100 e pompare altri 250 ul verso la cella a flusso Selezionare Next Avanti Assicurarsi che la leva della cella a flusso sia verde e chiudere lo sportello dello scomparto della cella a flusso N codice 15035788 Rev E ITA 6 Confermare che le caselle di spunta Vacuum Engaged Pompa a vuoto attiva e Door Closed Sportello chiuso siano selezionate e poi selezionare Next Avanti 7 Selezionare Start Avvio per avviare la corsa di sequenziamento Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 F 3 ossn e ejja eun IP 0JUaue91eo Esecuzione di una corsa TruSeq v3 Monitoraggio della corsa Monitorare le metriche della corsa la fluidica e l imaging sulla schermata di panoramica della corsa Figura 35 Schermata di panoramica della corsa Cycle 1 of 101 Analysis cea hi A Terne n HELP stop A Barra di avanzamento utilizzare la barra di avanzamento per monitorare quanti cicli sono stati completati B Grafico della fluidica allargare la sezione della fluidica per monitorare le fasi della chimica C Configurazione della corsa per rivedere i parametri per la corsa attuale D Grafico dell analisi utilizzare il grafico dell analisi per monitorare i punteggi qualitativi secondo il ciclo E Grafico delle immagini utilizzare il grafico delle immagini per monitorare le intensit secondo il ciclo Report sulla prima base 14 Se durante l
167. usso Volume erogato per la cella High Output Output elevato a flusso Rapid Rapida Otto posizioni SBS 82 ml 29 ml Dieci posizioni 76 ml 30 ml paried end Una posizione 1 2 ml libreria Tutte le posizioni 19 75 ml per corsia 30 1 ml per corsia Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 1 1 T auoIzuamueu Ip o BBenej un Ip uoiznoasy Procedure post corsa 118 21 Liberare i tubi di scarico e riposizionarli nel contenitore per gli scarti N codice 15035788 Rev E ITA Esecuzione di un lavaggio con acqua Questo lavaggio con acqua richiesto dopo ciascuna corsa di sequenziamento Dopo una corsa ad output elevato possibile eseguire un lavaggio di manutenzione al posto di un lavaggio con acqua Se lo strumento rimasto inattivo per uno o pi giorni eseguire un lavaggio con acqua prima di avviare una nuova corsa di sequenziamento Materiali di consumo forniti da Illumina Acqua da laboratorio Materiali di consumo forniti dall utente Otto flaconi da 250 ml Corning n di catalogo 430776 Dieci provette da 15 ml Corning n di catalogo 430052 Acqua da laboratorio Per la modalit Rapid Run Corsa rapida una provetta Eppendorf con tappo flip top per ciascuna cella a flusso Procedura 1 Dalla schermata Welcome Benvenuto selezionare Wash Water Lavaggio Acqua 2 Selezionare Yes Si se si sta eseguendo il lavaggio delle posizioni di reagenti PE In caso contrario selezionare No No per lavare solo le po
168. vo paio di guanti in lattice privi di polvere 4 Se presente una cella a flusso usata in una corsa precedente rimuoverla e metterla da parte in una provetta di tampone di conservazione o acqua da laboratorio per evitare che si asciughi La si pu utilizzare per verificare il corretto flusso prima di caricare la cella a flusso con cluster 5 Usando una salvietta imbevuta di alcol o un panno che non lascia residui imbevuto di etanolo o isopropanolo pulire la superficie del vano portacella fino a quando non pulita ATTENZIONE Non far sgocciolare l alcol nei fori della pompa a vuoto o intorno ai collettori Se necessario utilizzare un panno da laboratorio a bassissimo rilascio di particelle per asciugare il piano 6 Ispezionare visivamente il vano portacella per assicurarsi che sia privo di fibre e che i fori della pompa a vuoto siano privi di ostruzioni Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 97 nuobesi lap Bulud a OUELUEILIEI Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida Figura 38 Posizioni dei fori della pompa a vuoto Caricamento di una cella a flusso per il priming E NOTA Per il priming dei reagenti utilizzare una cella a flusso usata Non utilizzare la cella a flusso che si desidera sottoporre a sequenziamento 1 Sciacquare con acqua da laboratorio una cella a flusso usata Asciugarla con salviette per la pulizia delle lenti o con un panno che non lascia residui 2 Pulire la cella a flusso usando panni
169. ysis Archiviazione e analisi invia i dati della corsa a BaseSpace per il monitoraggio remoto e l analisi dei dati Con questa opzione richiesto un foglio campioni Run Monitoring Only Solo monitoraggio corsa invia solo i file InterOp a BaseSpace che permettono di monitorare la corsa in remoto 3 Accedere a BaseSpace utilizzando l e mail e la password dell account Mylllumina 4 Selezionare Next Avanti Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 D 3 es109 E jap 11jauesed lep 0 USLULIOSU Esecuzione di una corsa HiSeq v4 Per proseguire senza collegarsi a BaseSpace attenersi a quanto segue 1 Selezionare None Nessuno 2 Selezionare Next Avanti Schermata Storage Archiviazione 1 Selezionare la casella di controllo Save to an output folder Salva in una cartella di output e selezionare Browse Sfoglia per andare a una posizione della rete preferita Se per l archiviazione e l analisi la corsa collegata a BaseSpace questo campo facoltativo 2 Selezionare Zip BCL files Comprimi file BCL per ridurre lo spazio di archiviazione richiesto Se la corsa collegata a BaseSpace l opzione Zip BCL files Comprimere file BCL selezionata per impostazione predefinita J NOTA L impostazione Bin Q Scores Raggruppa punteggi qualitativi attivata per impostazione predefinita per ridurre lo spazio di archiviazione richiesto Questa impostazione raggruppa i punteggi qualitativi su un intervallo di valori pi ampio
170. zation Solution HP9 richiesto solo per le corse a doppia indicizzazione HP12 richiesto per tutte le opzioni di indicizzazione Se HP9 e HP12 non sono utilizzati caricare una provetta conica da 15 ml con 10 ml di PW1 o acqua da laboratorio nella posizione 16 per HP9 e nella posizione 17 per HP12 Tabella 15 Cella a flusso paired end Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida Posizione Reagente Descrizione 10 FRM Fast Resynthesis Mix 11 FLM2 Fast Linearization Mix 2 Lettura 2 12 FLM1 Fast Linearization Mix 1 Lettura 1 13 AMS Fast Amplification Mix 14 FPM Fast Premix 15 FDR Fast Denaturation Reagent contiene formammide 16 HP11 Primer Lettura 2 17 HP12 Primer indice i7 9 A N codice 15035788 Rev EITA 12 13 14 Posizione Reagente Descrizione 18 HP10 Primer Lettura 1 19 Pw1 10 ml di PW1 o acqua da laboratorio HP12 e richiesto solo per le corse indicizzate Se HP12 non viene usato caricare una provetta conica da 15 ml riempita con 10 ml di PW1 o acqua da laboratorio nella posizione 17 Aggiungere 10 ml di PW1 o acqua da laboratorio alle provette coniche da 15 ml nelle posizioni seguenti Corsa paired end posizione 19 Non indicizzata posizione 17 Corsa unidirezionale posizioni 10 11 e 12 Non indicizzata posizione 16 e 17 Far scorrere i rack dei reagenti PE nello scomparto reagenti allineando i rack con la guida sulla parte inferiore dello scomparto Abbassare i pescanti nei flaconi di rea
171. zionare la soluzione 2 dall elenco a tendina Accettare i valori predefiniti della pompa b Selezionare Pump Pompa c Ispezionare visivamente la cella a flusso per escludere la presenza di bolle che attraversino le corsie e di perdite vicino ai collettori Un eccesso di bolle normale per la soluzione di lavaggio Tween 20 e ProClin 300 e non incide sul volume erogato Rimuovere gli otto tubi di scarico per la cella a flusso appropriata dal contenitore per gli scarti Non includere gli otto tubi per la cella a flusso opposta o i tubi dalla pompa di scarico condensa Per le modalit ad output elevato fissare insieme gli otto tubi con parafilm assicurandosi di tenere tutti i tubi allo stesso livello Collocare le estremit dei tubi legati a un flacone da 250 ml Per la modalit Rapid Run Corsa rapida posizionare le estremit dei tubi 4 e 5 in un contenitore vuoto Posizionare le estremit di tutti gli altri tubi in un flacone di acqua pulita per impedire che entri aria nelle pompe delle siringhe Selezionare Next Avanti per avviare il lavaggio Al termine della corsa selezionare Return to Start Torna all avvio Misurare il volume erogato NOTA Tutti i flaconi e le provette sono riempite del tutto per assicurarsi che i pescanti siano sciacquati Tuttavia il volume erogato per ciascuna posizione varia cos i flaconi e le provette contengono volumi diversi al termine del lavaggio Posizioni Volume erogato per la cella a fl
172. zionata nella tacca alla base del rack Far scorrere il rack reagenti nello scomparto reagenti allineando il rack con la guida sulla parte inferiore dello scomparto Abbassare i pescanti nei flaconi di reagente per il sequenziamento come segue a Tirare la maniglia del pettine di aspirazione verso di s e quindi abbassare la maniglia b Ispezionare visivamente i pescanti per assicurarsi che non si pieghino mentre si abbassano nei tappi a imbuto c Rilasciare la maniglia del pettine di aspirazione nell alloggiamento nella parte inferiore della scanalatura Chiudere lo sportello dello scomparto reagenti e poi selezionare Next Avanti per riprendere la corsa N codice 15035788 Rev E ITA Esecuzione di una corsa Rapid Run Corsa rapida Introduzione a000 a000 aoaaa a000 aooaa a000 A DALALDALA Lanon nana 80 Flusso di lavoro del sequenziamento Rapid Run Corsa rapida 82 Tipi di corsa per la chimica Rapid Run Corsa rapida 0 00000 83 Verifica del volume pre corsa cnc nc 85 Inserimento dei parametri della corsa 00 86 Caricamento e priming dei reagenti 0 92 Caricamento di una cella a flusso iii 102 Monitoraggio della corsa 00000000000 aa adiado aaora naana arrarir 108 is T r ari 6 mo A na Guida per l utente del sistema HiSeq 1500 T Q y OJoydep Esecuz
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