Home

III Congresso Nazionale "Le Micotossine nella filiera agro

1. Campioni di ARACHIDI a Campioni di NOCCIOLE b 200 50 a 40 5 150 6 a n E E 30 vj g 100 ti 20 10 25 22 10 13 1 Po i 6 8 8 4 5 N mi o mi c tel c nc c nc c nc c nel c nel c nel cl nc e hcl cl hel c nel c rel e hcl cl hel e ncl cl Nc 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 35 25 F Bi Campioni di PISTACCHI c Campioni di FICHI d 30 Hi Da 20 25 _ 74 E TURCHIA n c GIRAN 15 2 201 2 Qa Qa o 15 o 10 i J 23 10 78 20 55 sy 100 67 a 50 A Fy 33 7 14 7 0 Prelit eter cl arals Sade Re c ncl c wo c nel c wo c nc c wo c nc cl nc c Ne c Ne c vc c vc c Ne c vc c nc c nc 2007 2008 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Figura 1 Campioni conformi C e non conformi NC di arachidi a nocciole b pistacchi c e fichi d analizzati nel periodo 2001 2008 Per approfondire le criticit legate all eterogeneit della contaminazione da Aflatossine sono stati raccolti i dati della concentrazione di Aflatossina Bj nei campioni non conformi per il consumo umano diretto limite di legge 2 ug kg 9 a
2. Concentrazione media C Inon maltati W maltati Figura 5 Variazione dei livelli delle forme acetilate del DON in seguito a maltazione di campioni di frumento naturalmente contaminato In questo caso i due fenomeni possono essere correlati dall ipotesi per la quale le forme acetilate derivino dalla conversione enzimatica del loro precursore sempre ad opera di enzimi che vengono ad attivarsi nel corso della maltazione 31 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Conclusioni Dall analisi di campioni di frumento maltato e della corrispondente materia prima non maltata emerge una forte diminuizione della contaminazione da DON e parallelamente un significativo incremento delle forme acetilate del DON o di ZEA durante il processo Questo lascia supporre che gli enzimi che vengono ad attivarsi possano da un lato trasformare la micotossina nei suoi derivati o in metaboliti non rivelabili mentre nel caso dello ZEA questi riescano a distruggere le interazioni tra l analita e i componenti della matrice ai quali questo si trova associato Dai risultati ottenuti non ci dato sapere quali siano gli enzimi principalmente coinvolti nella metabolizzazione delle micotossine libere o delle loro forme nascoste e pertanto non si in grado di capire con certezza quali siano le macrocomponenti delle cariossidi che interagiscono con le micotossine e il tipo di interazione La principale conclusione che da qui emerge tuttavia
3. OMOGENEIZZAZIONE ad umido RIPARTIZIONE in fiale LIOFILIZZAZIONE RE ACER FRANTUMAZIONE del liofilizzato sasaannaasanarannnnenannannaTannanannanneannnnnnanaanannnnana z IDENTIFICAZIONE e CATALOGAZIONE OMOGENEIZZAZIONE a secco IMBOTTIGLIAMENTO preparazio ASTICCHE DEIDRATAZIONE sotto vuoto e chiusura in Azoto Imbottigliamento in atmosfera inerte IDENTIFICAZIONE e CATALOGAZIONE Ri Figura 3 Diagramma a blocchi della linea di preparazione di liofilizzati dell impianto Materiali di Riferimento ENEA con esempio di realizzazione di un RM di fragole liofilizzate Detto evaporatore equipaggiato con una sonda di temperatura interna al pallone e un gruppo refrigerante ausiliario fino a 40 C viene impiegato per effettuare una prima estrazione dell acqua e o degli alcoli eventualmente presenti a bassa pressione e bassa temperatura prima della fase di liofilizzazione Ci rappresenta una novit assoluta nelle procedure di preparazione di Materiali di Riferimento e consente di ridurre il numero dei cicli di liofilizzazione con conseguente abbattimento dei consumi energetici e dei tempi esecutivi migliorare l efficacia del processo di liofilizzazione di condurre una omogeneizzazione ad umido del materiale recuperare l estratto contenente oltre l acqua o miscele idroalcoliche le eventuali sostanze volatili condensate L omogeneizzazione a secco pu essere effettuata attra
4. Unione Europea Regolamento CE n 1126 2007 della Commissione del 28 settembre 2007 che modifica il regolamento CE n 1881 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari per quanto riguarda le Fusarium tossine nel granoturco e nei prodotti a base di granoturco GUCE L 255 29 settembre 2007 Schneider E Curtui V Seidler C Dietrich R Usleber E M rtlbauer E Rapid methods for deoxynivalenol and other trichotecenes Toxicology Letters 2004 153 113 21 Volpe G Compagnone D Draisci R Palleschi G 3 3 5 5 Tetramethylbenzidine as electrochemical substrate for horseradish peroxidase based enzyme immunoassays A comparative study Analyst 1998 123 1303 7 158 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev IMMUNOSENSORE ELETTROCHIMICO PER LA DETERMINAZIONE DEI TRICOTECENI DI TIPO A IN CEREALI DA COLAZIONE E ALIMENTI DESTINATI ALL INFANZIA A BASE DI CEREALI Silvia Vesco Daniela Romanazzo Giulia Volpe Francesco Ricci Danila Moscone Giuseppe Palleschi Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche Universita di Roma Tor Vergata Roma Introduzione Le Tossine T 2 ed H T2 appartengono ai Tricoteceni un gruppo di metaboliti secondari di specie fungine appartenenti per lo piu al genere Fusarium Queste muffe infettano diverse specie vegetali in particolare cereali contaminando i relativi prodotti agricoli con i loro metaboliti 1 L infezione pu avvenire nel campo prima della ra
5. utilizzare 150 uL pozzetto del diluito in ELISA Cioccolato con contenuto in cacao gt 35 estrarre 5 g di campione con 50 mL del tampone di estrazione 3 0 1 NaHCO PEG 0 3 pH 7 7 7 8 agitare in shaker per 30 minuti filtrare o centrifugare per 10 minuti a 10000 x g diluire 2 mL di estratto con 10 mL di acqua deionizzata 240 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev purificare su colonna di immunoaffinit IAC E Sycol OTA EUROCLONE equipaggiata di pre colonna secondo le istruzioni d uso eluire con 2 mL di metanolo evaporare l estratto risospendere il campione in 1 mL del seguente tampone 1 parte di 0 1 NaHCO PEG 0 3 pH 7 7 7 8 1 parte di PBS utilizzare 150 uL pozzetto in ELISA Risultati e discussione Una comparazione tra le curve standard di riferimento viene riportata in Figura 1 B Bo 100 oo L HIME i Sef oat oe e WI o H 0 01 0 1 OTA ng mL Ii s new ELISA gg ref ELISA Figura 1 Comparazione fra le curve standard di riferimento del ref ELISA rispetto al new ELISA high sensitive Come si vede dalla Figura 1 modificando il design del saggio si ottiene un netto miglioramento della capacit di rilevazione del sistema Successivamente sono state effettuate prove di ripetibilit tramite l analisi di 10 replicati di uno stesso campione di cioccolato a cui sono stati aggiunti due diversi livelli di contaminazione artificiale
6. ug kg ug kg FB 2 9 1 2 0 32 0 02 0 9955 12 37 FB2 1 6 0 9 0 19 0 02 0 9929 15 46 y il segnale in unit di luminescenza LU x valore della concentrazione in ug L Coefficiente di correlazione 4 Valori di concentrazione in ug kg Una serie di parametri sperimentali sono stati attentamente studiati al fine di definire le migliori condizioni di separazione cromatografica e di rivelazione L influenza del tipo di colonna separativa caratteristiche della fase stazionaria diametro interno e dimensioni delle particelle di impaccamento della composizione e del flusso di fase mobile stata valutata su miscele standard di FB e FB e successivamente stata verificata su matrici alimentari a base di mais di vario tipo fiocchi di mais biscotti gallette farine e polenta Sono state ottimizzate inoltre le condizioni di rivelazione fluorimetrica variando la velocit di flusso di agente derivatizzante in funzione del flusso di fase mobile e sono state definite le lunghezze d onda di eccitazione e di emissione associate ad una maggiore intensit del segnale In Figura 1 riportato il profilo cromatografico ottenuto nelle condizioni ottimali di separazione e rivelazione di una miscela standard delle Fumonisine B e B2 e di un campione di polenta naturalmente contaminato 225 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Segnale L U tempo min Figura 1 Cromatogrammi di una soluzione standard
7. T1 0 74 0 60 0 89 0 68 0 57 0 79 T2 1 27 1 08 1 45 1 04 0 86 1 26 T3 2 23 1 67 3 40 1 71 1 33 2 58 OTA in pancetta salame coppa e prosciutto crudo I risultati Tabelle 2 e 3 relativi ai diversi prodotti stagionati permettono diverse considerazioni Per i gruppi T1 T2 e T3 i campioni di salame di coppa e di pancetta mostrano un aumento di concentrazione di OTA rispetto ai valori del tessuto muscolare e del tessuto adiposo con i quali sono stati preparati mentre per i campioni interni di prosciutto i valori sono rimasti simili Tabella 2 Valori medi di OTA g kg nei campioni di pancetta salame e coppa Gruppo Pancetta Salame Coppa media min max media min max media min max TO lt LOD 0 54 0 41 0 76 0 18 lt 0 03 0 72 T1 0 65 0 56 0 85 1 62 0 87 2 88 1 53 0 66 3 20 T2 1 33 0 99 1 69 2 41 1 65 3 67 2 93 2 38 4 48 T3 2 30 1 95 2 59 3 60 2 76 5 62 3 72 2 74 5 38 Tabella 3 Valori medi di OTA pg kg nei campioni di prosciutto crudo Gruppo Prosciutto interno Prosciutto esterno media min max media min max TO lt 0 03 21 44 lt 0 03 104 68 T1 1 04 0 58 1 59 69 39 1 25 314 09 T2 1 21 1 10 1 35 1 85 1 22 2 36 T3 2 46 2 13 2 91 73 12 3 27 258 77 L aumento di concentrazione rivelato nei campioni di coppa salame e pancetta in parte dovuto alla perdita di acqua dei prodotti stagionati con conseguente concentrazione dell OTA ma anche ad una possibile contaminazione diretta dovuta alla presenza di mu
8. o addizionato media SD n 9 media SD n 9 Intra Inter g kg Saggio Saggio Materiali di riferimento T0481 1 27 0 71 1 83 1 9 0 3 149 22 5 6 1 5 13 1 T0497 3 91 2 19 5 63 4 3 0 2 109 6 3 7 3 5 2 8 T0473 4 66 2 61 6 71 5 8 0 8 125 17 6 8 5 3 8 2 T04105 5 21 2 92 7 50 5 8 0 5 112 9 3 5 0 7 15 3 Recupero media SD n 36 124 22 Materiali fortificati Mais pool 5 1 12 0 1 123 14 10 0 1 1 16 0 2 1 77 0 1 86 5 4 5 1 1 3 7 5 3 9 0 5 79411 4141 2 8 2 10 7 7 0 7 7747 4 142 5 2 7 Recupero media SD n 36 91 21 CV intrasaggio 3 determinazioni per ogni campione media CV SD di 3 sedute analitiche CV intersaggio 1 determinazione per ogni campione in 3 sedute analitiche 200 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 5 Accuratezza e precisione del saggio Celer AFLA B nel dosaggio di diverse matrici naturalmente contaminate fortificate o di riferimento FAPAS Campioni Valore assegnato Dosaggio Recupero CV range di accettabilit g kg o addizionato media SD n 9 media SD n 9 Intra Inter g kg Saggio Saggio Germe di mais naturalmente contaminato Germe 1 9 93 10 4 2 7 105 27 6 3 3 6 26 5 Germe 2 22 97 20 7 2 1 90 9 5 1 2 9 10 9 Recupero germe di mais media SD n 18 97 21 Mangimi di riferimento T0478 7 28 4 08 10 48 9 6 0 8 123 11 3 8 2 3 9 0 T0491 11 30 6 40 16 30 11 9 1 8 105 16 5 2 1
9. 407 20 0 Ciccio Simeto Duilio Iride Claudio Creso Variet Figura 3 Incidenza n positivi n totale x 100 della contaminazione da DON nelle sei variet di frumento durante il biennio 2007 2008 Inoltre osservando pi nel dettaglio Figura 4 il comportamento delle variet nei due areali di coltivazione Centro e Sud sono risultati evidenti livelli di incidenza percentuale nettamente pi elevati nelle zone del Centro dove Simeto e Duilio hanno raggiunto il 100 nel convenzionale rispetto a quelle del Sud dove il valore massimo stato pari al 50 per la variet Iride in entrambi i tipi di coltivazione e per Ciccio solo in convenzionale 100 biologico convenzionale 80 lineare convenzionale x lineare biologico S 60 o 3 40 al Ciccio Simeto Duilio Iride ClaudioCreso Ciccio Simeto Duilio Iride ClaudioCreso Centro Variet Sud Figura 4 Incidenza n positivi n totale x 100 della contaminazione da DON nelle sei variet di frumento durante il biennio 2007 2008 negli areali Centro e Sud 120 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Oltre all andamento meteorologico dell annata anche le caratteristiche ambientali relative alle zone di coltivazione rappresentano un fattore di rilievo nell influenzare sia l incidenza sia il grado di contaminazione da DON del frumento duro Infatti come illustrato nella Figura 5 relativamente ai campioni po
10. 80 60 40 20 b campioni Figura 5 Concentrazione di Ota nei budelli spazzolati e non spazzolati La variabilit del risultato dipende da diversi fattori forma del salame i salami sottoposti a spazzolatura avevano dimensioni e forme diverse e la presenza di scanalature profonde pu rendere pi difficile la rimozione fisica dell OTA da parte della delle spazzole livello di contaminazione di partenza manutenzione e pulizia delle spazzole Conclusioni La spazzolatura a secco studiata in questa indagine del tutto preliminare ha fornito per i motivi di cui sopra risultati discontinui e meno efficaci della spazzolatura che utilizza anche un sistema di lavaggio ad acqua e aspirazione oggetto di precedenti studi Essa rappresenta comunque un economico metodo di decontaminazione da OTA ma soltanto un accurato screening iniziale della contaminazione nei prodotti dell azienda e la verifica dell efficacia della spazzolatura nonch la pianificazione di cicli di lavaggio della macchina spazzolatrice possono garantire un elevato grado di abbattimento dell OTA laddove non si possa prevenire agendo sulle condizioni di umidit e temperatura nella fase di stagionatura Bibliografia 1 Ochratoxin A In JARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans Vol 56 Some naturally occurring substances food items and constituents heterociclyc aromatic amines and mycotoxin
11. Esempio applicativo Risultati di 6 misure dell Aflatossina M nel latte valore medio 46 0 pg g ng kg scarto tipo s 7 0 pg g Applicando le equazioni descritte in precedenza RSDr riproducibilit raccomandato 71 9 115 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev RSD raccomandato 0 66 x RSDr 0 66 x 71 9 47 5 Scarto tipo di ripetibilita raccomandato s RSD x valore medio 100 0 4745 x 46 21 8 pg g da confrontare con 7 0 pg g I valori di RSDr massimo e RSD massimo calcolati sono non realistici e inapplicabili In alternativa il laboratorio pu utilizzare l approccio di Thompson utilizzando per concentrazioni lt 0 12 mg kg l equazione RSDr riproducibilit 23 0 Esempio applicativo RSDr riproducibilit massimo 2 x 23 0 46 0 RSD ripetibilit massimo 2 x 0 66 x RSDR 2 x 0 66 x 23 0 30 4 Scarto tipo di ripetibilit massimo s RSD valoremegio 100 0 304 x 46 14 0 pg g da confrontare con il valore 7 0 pg g ottenuto sperimentalmente Conclusioni La linea guida degli IZS consente un approccio armonizzato alla validazione e alla definizione delle prestazioni analitiche dei metodi prova per l analisi delle micotossine Questo approccio rende anche pi facile la trasferibilit dei metodi tra diversi laboratori Sono stati integrati i requisiti previsti dal Reg CE 882 2004 norma orizzontale con quelli del Reg CE 401 2006 norma verticale indicando criteri ben
12. Marilena Muscarella Marco Iammarino Donatella Nardiello Sonia Lo Magro Carmen Palermo Diego Centonze i Analisi dell Aflatossina B1 in alimenti zootecnici contenenti sequestranti Amedeo Pietri Antonio Gallo Terenzio Bertuzzi Silvia Rastelli Francesco Masoero Gianfranco Piva ii Sviluppo e applicazione di un nuovo sistema ELISA per l analisi di screening dell Ocratossina A nel cioccolato Chiara Tarantino Emanuela Iafrate Erica Bastiani Maria Giovanna Perrotta Francesca Gombac Valentina Pellis Carlo Brera i Precoce rilevamento di Penicillium expansum produttore di Patulina su pomacee mediante PCR Real Time Valentina Tolaini Patrizia De Rossi Antonella Del Fiore Massimo Reverberi Anna Adele Fabbri Corrado Fanelli cccccccccccccccccscccceescceevsscecessccecesscececssesecsesueeecseseececsisseeeenaes Determinazione simultanea di Aflatossine Ocratossina a e tossine di Fusarium in cereali mediante purificazione su colonnine a immunoaffinit multianticorpo e LC MS MS Veronica M T Lattanzio Michele Solfrizzo Stefania Della Gatta Stephen P Powers Angelo Visconti ccccccccssccesseessceseceseececseeesseeseeeseeesceeeeseeeseeuaeeesecneeeneeeseeass Rapporti ISTISAN 10 32 Rev PREMESSA La terza edizione del Congresso Nazionale sulle micotossine nella filiera agro alimentare ha avuto al pari delle precedenti un largo consenso da parte dei partecipan
13. r Sg Temperatura C Linea di tendenza g Sarai AA0 C 9 a OO J aa g 20 0 7803x 30712 8 86 S X 25 C 5 _ ae E 10d R 0 97 0 750 15 C 0 0 700 r r i 17 7 27 7 6 8 16 8 26 8 5 9 159 25 9 17 7 27 7 6 8 16 8 26 8 5 9 15 9 25 9 anno 2007 anno 2007 a b Figura 1 Evoluzione del contenuto di umidita a e della water activity misurata a 15 25 e 40 C b durante la maturazione nel campo 1 della sperimentazione 1 000 SES BARA Pap _ 0 950 E Temperatura C Xx 015 C S 0 9004 Ayy bo x 25 C Kg A40 C 0 850 gi o oe 0 800 g Direzione del processo di maturazione 10 20 30 40 50 60 70 Umidit della granella Figura 2 Isoterme di sorbimento a 15 25 40 C per la granella di mais durante la maturazione 41 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Gli altri modelli infatti hanno mostrato R inferiori e P maggiore compreso il noto GAB model gi utilizzato per prodotti a base di mais 4 5 Questa differenza spiegabile prendendo in considerazione che questo il primo lavoro in cui si calcolano le isoterme per granella di mais durante la maturazione e quindi con valori alti di umidit e acqua libera Inoltre per questo lavoro prelevando granella di mais durante la maturazione e quindi alla sua naturale umidit non c stata la necessit di effettuare una reidratazione per portare il substrato all umidit desiderata evitando quindi il problema dell isteresi c
14. significativo p lt 0 001 significativo p lt 0 05 ns non significativo 88 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Al fine di avere un riscontro dei risultati ottenuti dall elaborazione dei dati complessivi di tutto il triennio indipendentemente dal tipo di campionamento e relativo a tutte le varieta considerate stato effettuato uno studio statistico circoscritto alle sei variet scelte Ciccio Simeto Duilio Iride Claudio e Creso le quali fra l altro rappresentano un gruppo omogeneo in merito alla numerosit dei campioni esaminati sia nel monitoraggio aziendale che nella Rete nazionale Anche in questo caso i fattori cultivar anno regione e provincia considerati sia singolarmente che nelle loro interazioni sono risultati tutti altamente significativi p lt 0 0001 Nella Tabella 4 sono riportati i livelli di significativit degli effetti delle variabili considerate nelle singole regioni evidenziando in grigio i fattori maggiormente significativi nel determinare il contenuto in micotossina Tutti e tre i fattori semplici cultivar anno provincia sono risultati significativi mentre le interazioni sono risultate significative soprattutto per il Nord e per il Centro Il fattore che maggiormente influisce sul livello di DON l anno per il Centro Nord la provincia per il Centro e la variet per il Sud Tabella 4 Monitoraggio aziendale e Rete nazionale livelli di significativit degli effetti dei fattori singoli e
15. stata trasferita in un vial da 2 mL La separazione dei TCT stata effettuata mediante GC MS Gas Chromatography Mass Spectrometry con colonna capillare Zebron 5MS1 30 m x 0 25 mm i d e gas di trasporto He con pressione di 55 Kpa impostando il seguente programma di temperatura 125 C per 1 min 125 240 C a 10 C min isoterma per 6 min 240 285 C a 10 C min isoterma per 1 minuto 285 300 C a 30 C min isoterma per 1 minuto Sono stati iniettati 2 uL con rapporto di partizione split 1 30 e tecnica PTV Programmed Temperature Vaporizer solvent split La rivelazione dei TCT stata effettuata mediante spettrometro di massa a trappola ionica con un energia di ionizzazione di 70 eV e con tecnica SIM Selected Ion Monitoring 3 I frammenti usati per la quantificazione sono stati 393 407 per il DON 377 392 per il 3 Ac DON 290 378 per il DAS 392 407 per il 15 Ac DON 377 392 per il NIV 287 466 per la HT 2 290 436 per la T 2 Risultati e discussione Percentuali di recupero e limiti di rivelazione Sono state valutate le percentuali di recupero dei metodi utilizzati aggiungendo ad aliquote di un campione risultato esente da contaminazione da micotossine un volume misurato di standard delle micotossine considerate in modo da avere una contaminazione da OTA pari a 1 ug kg e da TCT pari a 1000 ug kg I metodi hanno dato percentuali di recupero tra il 90 e il 95 con una buona ripetibilit indicata da una deviazione stan
16. Alcune indagini effettuate su prodotti a base di carne suina acquistati al dettaglio hanno mostrato un incidenza di OTA non trascurabile 3 4 Scopo di questo lavoro stato quello di valutare l entit delle due differenti modalit di contaminazione Inizialmente stata determinata dopo la macellazione la concentrazione di OTA nel tessuto muscolare e adiposo di suini pesanti alimentati con mangimi naturalmente contaminati a diversi livelli successivamente OTA stata ricercata in alcuni prodotti preparati dai medesimi tessuti stagionati in impianti industriali salame pancetta coppa e prosciutto crudo Materiali e metodi Prova su animali carni fresche e stagionate La prova stata condotta utilizzando 24 suini adulti Large White suddivisi in 4 gruppi di 6 soggetti ciascuno 3 femmine e 3 castrati All inizio della prova l et era di circa 200 giorni e il peso vivo di circa 140 150 kg Dopo un periodo di adattamento seguito un periodo sperimentale della durata di 14 giorni durante il quale ogni gruppo stato alimentato in modo differente Al gruppo TO stato somministrato un mangime non contaminato da OTA agli altri gruppi uno naturalmente contaminato a diversi livelli 42 mg kg per il gruppo T1 83 mg kg per il T2 e 171 mg kg per il T3 La quantit di mangime somministrato circa 3 6 kg al giorno stata calcolata in base al peso corporeo di ogni animale Al termine del periodo sperimentale gli animali s
17. ISTISAN 10 32 Rev 3 Congresso nazionale Le micotossine nella filiera agro alimentare e zootecnica ISSN 1123 3117 Istituto Superiore di Sanit Roma 28 30 settembre 2009 ATTI a cura di C Brera E Gregori B De Santis e M Miraglia ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA 3 Congresso nazionale Le micotossine nella filiera agro alimentare e zootecnica Istituto Superiore di Sanita Roma 28 30 settembre 2009 ATTI A cura di Carlo Brera Emanuela Gregori Barbara De Santis e Marina Miraglia Dipartimento di Sanit Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare ISSN 1123 3117 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Istituto Superiore di Sanita 3 Congresso nazionale Le micotossine nella filiera agro alimentare e zootecnica Istituto Superiore di Sanita Roma 28 30 settembre 2009 Atti A cura di Carlo Brera Emanuela Gregori Barbara De Santis e Marina Miraglia 2010 v 251 p Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Il Congresso si propone di evidenziare sia i principali aspetti correlati alle ricadute di carattere sanitario agronomico industriale e diagnostico derivanti dalla contaminazione da micotossine nei prodotti della filiera agro alimentare sia i principali risultati ottenuti in ambito scientifico derivanti dai progetti di ricerca nazionali e transnazionali L evento si rivolge pertanto a tutti i ricercatori e agli operatori del sistema alimentare e mangimistico con l auspicio di fornire attraverso le propri
18. Simeto risultata la pi sensibile sostanzialmente in tutto il territorio nazionale la variet Claudio risulta essere la meno suscettibile nel Nord e una delle meno sensibili nel Centro Sud con l eccezione di Marche Toscana e Molise mentre al Centro la variet Creso e al Sud e la variet Ciccio Nell insieme i dati relativi al comportamento varietale indicano che la suscettibilit all accumulo del DON pu essere legata oltre che alle caratteristiche proprie della cultivar anche all ambiente nel quale la stessa viene coltivata es minore suscettibilit di Creso nell Italia centrale oppure pu risentire meno della localizzazione geografica e manifestare in modo tendenzialmente costante le caratteristiche di maggiore o minore resistenza alla contaminazione come ad esempio le variet Claudio e Simeto rispettivamente Quest ultima cultivar in particolare probabilmente non ha avuto modo di sviluppare forme di resistenza alla fusariosi essendo stata selezionata in Sicilia dove la diffusione di tale fitopatia e quindi la contaminazione da DON sono pressoch irrilevanti I risultati ottenuti nel presente lavoro evidenziano in linea generale una relazione fra il grado di resistenza varietale all accumulo di micotossina e le caratteristiche genetiche delle cultivar le quali evidentemente hanno un ruolo importante nel determinare il tipo di risposta della cultivar stessa alle condizioni dei diversi ambienti di coltivazi
19. amido si raggiunge un valore dell 86 La granella e l insilato di mais sono la fonte energetica per eccellenza nell alimentazione dei ruminanti per cui la presenza di Aflatossine AF rappresenta un serio problema L impiego del mais come pianta intera trinciato e insilato e delle diverse parti botaniche pastone di pannocchia largamente diffuso in quanto costituisce un alimento di grande interesse nutrizionale per le sue caratteristiche di elevata appetibilit versatilit e buona digeribilit dei principi nutritivi oltre ad essere caratterizzato da un basso costo di acquisto e produzione La granella di mais in diverse forme fisiche intera sfarinata fioccata estrusa ecc rappresenta invece la fonte energetica per eccellenza nell alimentazione sia dei monogastrici suini avicoli ecc che dei grandi e piccoli ruminanti Le problematiche relative alla presenza delle micotossine nel mais destinato all alimentazione degli animali ad interesse zootecnico rappresentano un serio problema e possono essere riassunte in due grossi capitoli salute e benessere degli animali in quanto possono influire sulle attivit metaboliche e quindi sulle funzioni fisiologiche che garantiscono lo stato di salute dell animale stesso tutela del consumatore in quanto ingerisce alimenti di origine animale che potrebbero essere contaminati in seguito ad ingestione da parte dell animale stesso delle micotossine es insilato con
20. non c stato alcun isolamento del micete I due campioni di mosto 7 8 Figura 1 e i due campioni di vino 9 10 sono risultati positivi alla PCR per A carbonarius ma non stato possibile isolare il micete K L 1 2 3 4 5 6 K Banda di 141 bp A carbonarius Figura 1 Corsa elettroforetica su gel di agarosio dei prodotti di PCR dei due campioni di mosto I risultati dimostrano come l analisi molecolare PCR specie specifica risulti una tecnica che per la sua elevata sensibilit e specificit permette di rilevare piccole tracce del micete anche quando non possibile isolarlo su piastra perch non vitale inoltre per la sua velocit di esecuzione permette una rapida identificazione di A carbonarius fornendo indicazioni utili alla 36 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev gestione del vigneto In Tabella 3 vengono riportati i risultati per ciascun campione relativamente sia all isolamento su piastra che alla identificazione molecolare PCR di A carbonarius Tabella 3 Risultati ottenuti dall isolamento e dall analisi molecolare di A carbonarius Epoca di Campione Tesi Matrice PCR Isolamento PCR campionamento specie specie specifica specifica da matrice Mea MEAB dacolonie Inizio invaiatura 1 A Acini POS POS POS POS 2 B Acini POS POS POS POS Intermedio 3 A Acini POS POS NEG NEG di maturazione 4 B Acini POS NEG NEG NEG Raccolta 5 A Acini NEG POS NEG NEG 6 B Acini NEG POS NEG NE
21. 110 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev LINEA GUIDA DEGLI ISTITUTI ZOOPROFILATTICI SPERIMENTALI PER LA VALIDAZIONE INTRA LABORATORIO DEI METODI DI PROVA DI CONFERMA DELLE MICOTOSSINE NEGLI ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE Loredana Annunziata a Alberto Biancardi b Giancarlo Biancotto c Giannina Chessa d Pasquale Gallo e Marilena Muscarella f Ivan Pecorelli g Alessandro Rosso h Rosanna Spatola i Alessandro Ubaldi 1 a Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell Abruzzo e del Molise Teramo b Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia Romagna Brescia c Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie Padova d Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna Sassari e Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno Portici Napoli f Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Foggia g Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell Umbria e delle Marche Perugia h Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte della Liguria e della Valle d Aosta Asti i Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia Palermo 1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e della Toscana Roma Introduzione I Laboratori di Chimica degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali IZS hanno redatto una linea guida per la validazione dei metodi di prova di conferma delle micotossine negli alimenti di origine animale 1 per definire un approcc
22. Criteri generali per la valutazione dei laboratori di prova UNI CEI EN 45003 su Sistemi di accreditamento dei laboratori di taratura e di prova requisiti generali per il funzionamento e il riconoscimento 167 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev L LNR Micotossine al fine di fornire prestazioni e risultati analitici qualificati e riconosciuti in ambito nazionale e internazionale opera in base allo sviluppo di una politica della qualit conforme alla suddetta norma per l accreditamento dei laboratori di prova UNI CEI EN ISO IEC 17025 implementata gi dal 2006 e oggi I LNR Micotossine risulta nella lista dei laboratori accreditati del Dipartimento di Sanit Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare con numero n 0779 da parte del SINAL Sistema Nazionale Accreditamento Laboratori oggi Sistema Italiano di Accreditamento ACCREDIA I metodi analitici applicati dall LNR Micotossine ricadono tutti sotto il Sistema Gestione Qualit fra questi alcuni sono accreditati mentre altri sono in fase di accreditamento Sono riportati in elenco le prove accreditate che esegue l LNR Micotossine Nella tabella 1 sono riportati la matrice la micotossina determinata i documenti di riferimento e le informazioni sullo stato di accreditamento Tabella 1 Metodi accreditati in uso nell LNR per la determinazione delle micotossine Materiale prodotto matrice Denominazione Norma metodo di riferimento della prova Mais e mangim
23. Figura 4 Strutture chimiche di FB e del suo analogo idrolizzato HFB Ogni campione stato analizzato in doppio e le concentrazioni degli analiti sono state calcolate sulla base di rette di taratura costruite in matrice utilizzate per Fumonisine libere estratte con la procedura di routine e per HFB e rette di taratura costruite su standard esterno impiegate per Fumonisine libere rivelate in seguito a digestione n vitro In Figura 5 sono riportati i risultati conseguiti e il confronto tra i livelli di Fumonisine libere estraibili con la procedura di estrazione adottata nel presente lavoro Fumonisine totali rivelate dopo idrolisi alcalina e Fumonisine totali riscontrate in seguito a digestione in vitro dei campioni 40000 30000 20000 10000 Concentrazione ng g Z totali libere L totali dopo idrolisi totali dopo digestione Figura 5 Confronto tra Fumonisine totali somma di FB4 FB2 e FB3 libere estraibili totali rivelate dopo idrolisi quantificate come HFB ed espresse come somma di FB4 FB2 e FB equivalenti e totali riscontrate dopo digestione somma di FB4 FB2 e FB3 22 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Come si puo notare i livelli di Fumonisine totali dopo digestione in tre casi su quattro sono maggiori rispetto a quelli riscontrati mediante una tecnica di estrazione convenzionale Si nota inoltre un buon accordo coi dati ottenuti per idrolisi basica con la differenza che in seguito a digestione sono
24. In Barug D van Egmond H Lopez Garcia van Osenbruggen T Visconti A Ed Meeting the mycotoxin menace Wageningem The Nederlands Wageningen Academic Publishers 2004 p165 81 Shephard GS Impact of mycotoxins on human health in developing countries Food Additives amp Contaminants 2008 25 2 146 51 Phillips TD Afriyie Gyawu E Williams J Huebner H Ankrah N A Ofori Adjei D Jolly P Johnson N Taylor J Marroquin Cardona A Xu L Tang L Wang J S Reducing human exposure to aflatoxin through the use of a clay a review Food Additives amp Contaminants 2008 25 2 134 45 Eaton DL Gallagher EP Mechanism of aflatoxin carcinogenesis Annual Review of Pharmacology and Toxicology 1994 34 135 172 World Health Organizatiopn International Agency for Research on Cancer JARC monograph on the evaluaion of carcinogenic risk to humans Volume 82 Some tradiiotnal herbal medicines some mycotoxins naphthalene and styrene Lyon France IARC Press 2002 World Health Organisation Safety evaluation of certain mycotoxins in food Fifty six report of the Joint FAO WHO Expert Committee on Food Additives Geneva WHO 2002 WHO Technical Report Series 906 Food and Agriculture Organization of the United Nations FAO Worldwide regulation for mycotoxins in food and feed in 2003 Rome FAO 2004 FAO Food and Nutrition paper 81 Unione Europea Regolamento della Commissione Europea CE 19 dicembre 2006 n 188
25. Italia sono 63 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Ufficio di sanita marittima aerea e di frontiera USMAF Bari Unita territoriale UT Bari USMAF Bologna UT Ravenna USMAF Brindisi UT Brindisi USMAF Catania UT Reggio Calabria USMAF Genova UT Genova USMAF Genova UT La Spezia USMAF Genova UT Savona USMAF Livorno UT Livorno USMAF Napoli UT Cagliari USMAF Napoli UT Napoli USMAF Napoli UT Salerno USMAF Pescara UT Ancona USMAF Venezia UT Trieste compresa dogana di Fernetti interporto Monrupino USMAF Venezia UT Venezia Per l importazione dei prodotti alimentati oggetto della decisione le condizioni particolari da adottare per l importazione possono cos riassumersi la partita deve essere accompagnata dai risultati del campionamento e delle analisi e dal certificato sanitario conforme al modello fornito in Allegato I della decisione debitamente compilato e firmato da un rappresentante autorizzato dell autorit competente del Paese di provenienza necessario un Documento Comune di Entrata CED conforme al modello fornito in Allegato III della decisione attestante il completamento dei controlli ufficiali effettuati sui prodotti alimentari coperti dalla decisione stabilita una accresciuta frequenza dei controlli fisici dal 5 al 100 La Decisione 2006 504 CE stata recentemente modificata dal nuovo Reg CE 669 2009 del 24 luglio 2009 relativo al livello accresci
26. analita negli altri casi Iniettare per tre volte almeno 4 soluzioni a diversa concentrazione nella fase di elaborazione della retta si pu aggiungere inoltre il punto 0 0 I punti sono scelti tenendo conto dei livelli di validazione scelti e del campo di applicazione del metodo Rivelazione mediante MS per il calcolo delle curve di taratura utilizzare lo ione o transizione che d il miglior rapporto segnale rumore S N Per descrivere la formula matematica della curva di taratura calcolata utilizzare il metodo dei minimi quadrati e riportare il valore del coefficiente di correlazione 1 Il laboratorio stabilisce il criterio di accettabilit del valore di r Specificit Per definizione la specificit equivalente alla selettivit ed la capacit del metodo di non risentire delle presenza di interferenti o di altri componenti diversi dall analita in esame La specificit del metodo valutata analizzando in modo indipendente almeno 20 bianchi campione che siano rappresentativi delle matrici previste dal Piano Nazionale Residui e dalla legislazione vigente per gli alimenti di origine animale suggerito lo schema seguente Latte 20 campioni di latte a scelta tra le specie animali di maggiore interesse del laboratorio ai fini dei controlli ufficiali eseguiti con maggior frequenza Latte per lattanti e latte di proseguimento 20 campioni a scelta tra le varie tipologie disponibili Alimenti per lattan
27. astringina cis resveratrolo glicoside cis resveratrolo pterostilbene 3 idrossipterostilbene e i flavonoidi quercetina kaempferolo tramite analisi HPLC High Perfomance Liquid Chromatography con rivelatore DAD Diode Array Detector Determinazione di OTA La determinazione del contenuto di OTA stata effettuata mediante strumentazione HPLC utilizzando un adattamento del metodo Automated HPLC method for the determination of Ochratoxin A in samples wine 6 L estratto ottenuto dai campioni di uve stato dapprima purificato mediante colonnine di immuno affinit Ochraprep quindi iniettato in sistema HPLC che sfrutta una colonna a fase inversa Symmetry C18 termostatata a 38 C e utilizza come eluente una miscela acetonitrile acqua acido acetico 50 49 1 in volumi L OTA rivelata mediante spettrofluorimetro settato alle lunghezze d onda di 333 nm eccitazione e di 460 nm emissione L identificazione del picco cromatografico avvenuta iniettando una soluzione standard di OTA a concentrazione di 1 ng mL e registrando il tempo di ritenzione 34 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev La retta di taratura stata costruita tramite sette standard a concentrazione crescente di OTA con un intervallo di concentrazione che varia da 0 02 a 2 5 ng mL e con un coefficiente di correlazione maggiore di 0 99 Isolamento di Aspergillus carbonarius L isolamento del micete sia da grappoli che da mosto stata eseguita utilizzando
28. cio su ogni partita presentata per l importazione secondo regole comunitarie Nel secondo caso si tratta invece di un controllo documentale e di un controllo fisico a destino non discriminatorio effettuato su merci provenienti dagli altri Paesi dell Unione Controllo ufficiale alle importazioni di prodotti di origine non animale Gli USMAF coordinati dal Ministero della Salute DGSAN Ufficio II rappresentano i punti di entrata dei prodotti di origine non animale nel territorio nazionale I controlli ufficiali comprendono almeno un controllo documentale sistematico esame dei documenti commerciali e se del caso dei documenti che in base alla normativa devono accompagnare la partita un controllo di identit a campione ispezione visuale per assicurare che i certificati o altri documenti di accompagnamento della partita coincidano con l etichettatura e il contenuto della partita stessa e se del caso un controllo materiale o fisico controlli dell alimento sui mezzi di trasporto sugli imballaggi sull etichettatura e sulla temperatura il campionamento a fini di analisi e prove di laboratorio ecc Ove non sussistano motivi di sospetto o altre ragioni cautelari il campionamento effettuato a sondaggio nella misura del 5 delle partite presentate o di cui si prevede l arrivo nella settimana DPR 14 luglio 1995 Quando sia manifesto che alimenti importati da un Paese terzo possono comportare un grave rischio per la
29. del latte di caldaia sono risultate molto simili a quelle del latte intero la distribuzione media percentuale calcolata come rapporto fra le quantita di AFM stata del 90 9 nel latte scremato e solo dell 1 6 0 6 nella panna con un bilancio di massa pari a 92 9 Nel processo di caseificazione la resa media stata pari al 7 5 20 kg di latte gt 1 5 kg di cagliata le cagliate hanno evidenziato concentrazioni di AFM tra 0 082 e 1 699 ug kg con un fattore di arricchimento medio pari a 3 6 0 5 Con un bilancio di massa medio vicino al 90 la distribuzione percentuale media di AFM stata pari al 27 3 nella cagliata e al 60 4 nel siero cotto Nei campioni di siero innesto non stata rilevata AFM Il siero cotto stato quindi utilizzato per la produzione della ricotta il fattore di arricchimento medio in questa trasformazione risultato pari a 2 1 0 9 La distribuzione 53 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev percentuale nella ricotta pari a 543 risultata piuttosto bassa evidenziando come la tossina presente nel siero rimanga prevalentemente nella scotta Infine l ultima parte del processo ha previsto l impiego della panna per la preparazione del burro Le concentrazioni di AFM nel burro sono state superiori al limite di rivelazione solo nelle ultime 4 caseificazioni con le concentrazioni nel latte di partenza pi elevate sia il fattore di arricchimento che la distribuzione percentuale sono ri
30. dell 1 dei chicchi oltre il 90 delle tossine prodotte da Aspergillus flavus si concentrano in essi valutare con attenzione le partite con percentuali di granella rotta elevate eseguire la vagliatura e la spazzolatura della granella in questo modo si allontanano le parti che contengono la quasi totalit della AFB mantenere la partita a temperatura inferiore a 15 C evitare che nel luogo di essiccazione silo e capannone si formino punti a elevata umidit per stillicidio frequenti in vicinanza delle aperture trattare l alimento contro gli insetti con prodotti specifici controllare con attenzione lo stato di pulizia dei locali e dei silos in cui vengono stoccate le materie prime utilizzate nella razione Eseguire una pulizia accurata e se necessario effettuare delle fumigazioni degli ambienti e dei silos Se AFM nel latte supera i 0 05 pg kg bisogna togliere l alimento contaminante dalla razione ricorrendo a un esperto in alimentazione per sostituirla Per garantire la corretta alimentazione necessario riformulare la razione e non sostituire semplicemente il mais con un altra materia prima Dopo 2 3 giorni dall eliminazione va ricontrollata AFM nel latte se il livello sceso a valori di sicurezza il problema risolto altrimenti bisogna controllare gli altri componenti della razione Se il livello di AFM nel latte non troppo oltre i 0 05 ug kg pu essere opportuno utilizzare dei se
31. determination of a deoxynivalenol glucoside in artificially and naturally contaminated wheat by liquid chromatography tandem mass spectrometry Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005 53 3421 5 Liu Y Walker F Hoeglinger B Buchenauer H solvolysis procedures for the determination of bound residues of the mycotoxin deoxynivalenol in fusarium species infected grain of two winter wheat cultivars preinfected with barley yellow dwarf virus Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003 53 6864 9 10 Falavigna C Analisi multiresiduale di Tricoteceni e Zearalenone in frumento Tesi di Laurea Specialistica AA 2007 2008 Corso di Laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Facolt di Agraria Universit degli Studi di Parma oo O 32 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev INFLUENZA DEL SUOLO SULLA PRODUZIONE DI OCRATOSSINA A LUNGO LA FILIERA VITIVINICOLA Nicola Gebbia Maria Monte Gioacchino Aiello Alessio Calderone Francesco Cannizzaro Alice Curione Aurelia Lo Giudice Maria Montalbano Francesca Oliveri Lucia Crosta Co Ri Bi A Consorzio di Ricerca sul Rischio Biologico in Agricoltura Palermo Introduzione Nella filiera vitivinicola i generi responsabili della produzione di Ocratossina A OTA sono Aspergillus e Penicillium Tra il genere Aspergillus la specie A carbonarius il principale agente di contaminazione da OTA al sud e nelle isole dove le condizioni pedo climatiche ne favoriscono lo sviluppo In tema di sicu
32. esposizione a FB stato registrato un effetto pi evidente nei test d esposizione a breve termine 2 giorni L esposizione ai Tricoteceni T 2 e DON non ha esitato in variazioni significative dei tioli intracellulari p gt 0 05 rispetto alle colture di controllo 0 60 7 1 40 5 FINA E 2 giorni E 2 giorni 7 giorni 1 30 4 7 giorni 1 20 4 0 55 7 1 10 1 00 0 90 4 0 50 4 0 80 4 0 70 4 0 45 0 60 4 a 0 50 4 Concentrazione ROM mg H 0 dL o Concentrazione ROM mg H 0 dL 0 40 4 0 40 T T 1 0 30 T T 1 0 5 20 0 35 70 AFB ug mL FB pg mL Figura 1 Concentrazione dei ROM in linfociti bovini esposti a differenti livelli di AFB e FB per 2 0 7 giorni a e b indicano p lt 0 05 tra livelli d esposizione per ogni tempo d incubazione L inattivazione dei radicali liberi uno dei meccanismi primari che la cellula animale pu mettere in campo per contrastare i danni dovuti a fenomeni ossidativi Alcune specie chimiche dalla spiccata attitudine anti ossidante selenio Vitamina A Vitamina C Vitamina E coenzima Qio ecc esercitano una certa azione di scavenging nei confronti dell anione superossido 02 considerato un ROM primario 26 proteggendo pertanto le membrane cellulari dal danno ossidativo Altre molecole tuttavia come i tioli intracelulari che rappresentano una buona stima del contenuto cellulare di glutathione GSH 27 sono implicate
33. estensione del metodo a frumento e orzo Sono inoltre discussi i risultati di uno studio dettagliato dell effetto matrice per tutte le undici tossine nei cereali in oggetto Risultati e discussione Per ottenere una elevata efficienza di estrazione per tutte le 11 micotossine aventi differente polarit e struttura chimica stato sviluppato un nuovo approccio basato su una doppia estrazione con tampone fosfato a pH 7 4 e una miscela metanolo tampone fosfato 70 30 v v Per la purificazione degli estratti sono state utilizzate nuove colonnine ad immunoaffinita Myco6in1 VICAM contenti 6 diversi anticorpi per Aflatossine Ocratossina A Fumonisine Deossinivalenolo Tossine T 2 e HT 2 e Zearalenone La separazione e rivelazione di queste micotossine sono state stata effettuate mediante cromatografia liquida spettrometria di massa massa LC ESI MS MS Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry Per l analisi cromatografica stata utilizzata una colonna Gemini C18 150 mm x 2 mm 5 um Phenomenex Torrance CA USA con una fase mobile binaria composta da metanolo e acqua contenenti acetato di ammonio 1 mM e acido acetico 0 5 Per la rivelazione stato usato uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo QTrap MS MS system Applied Biosystems Foster City CA USA operante in modalit MRM Multiple Reaction Monitoring In Figura 1 riportato un cromatogramma di un estratto di mais fortificato con le
34. la birra ecc e delle Aflatossine totali per gli alimenti per l infanzia e le piante infusionali o loro parti Sempre nelle more della emanazione di una normativa comunitaria i tenori massimi ammissibili di OTA nel cacao indicati nella Circolare n 10 sono stati successivamente sostituiti 59 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev dai tenori riportati nella Circolare del Ministero della Salute n 6 del 28 novembre 2003 Valori massimi ammissibili di OTA nel cacao Nella circolare sono stati indicati i seguenti limiti massimi ammissibili di OTA nel cacao e prodotti a base di cacao cacao in polvere magro zuccherato e cioccolato in polvere gt 2 pg kg cioccolato e cioccolatino al latte bianco ripieno gt 0 5 ug kg A livello comunitario in vigore il Reg CE 1881 2006 e s m che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari Nell Allegato al Regolamento sono riportati i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari Nel caso specifico la Parte 2 dell Allegato definisce i limiti delle micotossine per le diverse matrici alimentari Il campionamento e i metodi di analisi vengono fissati per le micotossine nel Reg CE 401 2006 Fissazione dei metodi di prelevamento e di analisi di campioni e dei metodi di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari L Allegato I del Regolamento fissa i metodi di campionamento ossia le disposizioni generali e
35. portato ad 1 mL con una miscela CH3CN soluzione acquosa al 2 di CH COOH 35 65 v v 43 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev agitando in bagno ad ultrasuoni e su vortex infine il campione stato filtrato 0 45 um L OTA stata quindi determinata mediante analisi HPLC High Performance Liquid Chromatography la separazione stata effettuata con colonna Luna Phenyl Hexyl Phenomenex utilizzando come fase mobile un gradiente CH3CN soluzione acquosa al 2 di CH COOH da 35 a 67 di CH3CN in 9 minuti a flusso di 1 0 mL min La rivelazione stata effettuata mediante fluorimetro impostato a Aeccitazione 333 nm e Acmissione 470 nm Analisi dei TCT Dopo aver pesato 25 g di campione macinato i TCT sono stati estratti con 100 mL di miscela CH CN H 0 84 16 v v agitando per 90 minuti Dopo filtrazione su filtro a pieghe l estratto stato purificato mediante colonna Mycosep 227 2 quindi un aliquota di 2 mL dell estratto purificato stata sottoposta a derivatizzazione formazione dei trimetilsilileteri con trimetilsililimidazolo TMSIM nel seguente modo dopo aggiunta di 100 uL di standard interno diacetossiscirpenolo DAS a concentrazione di 10 mg kg ed evaporazione completa sotto flusso di N2 sono stati aggiunti 200 uL di derivatizzante TMSIM trimetilclorosilano 1 0 2 v v lasciando reagire al buio per 15 minuti Successivamente sono stati aggiunti 800 uL di esano e 1 mL di H O dopo centrifugazione la fase superiore in esano
36. sono stati preparati utilizzando due farine di mais naturalmente contaminate 10 21 e 32 9 ug kg di AFB una crusca di frumento 1 4 ug kg e una farina di soia 1 11 ug kg gli altri ingredienti sono stati farine d orzo e di girasole non contaminate minerali e vitamine Entrambi i mangimi dopo accurata miscelazione sono stati divisi in 54 sottocampioni Ognuno di questi stato miscelato con uno dei nove sequestranti considerati 4 argille sodio bentonite calcio bentonite zeolite e caolinite 1 a base di pareti di lievito 1 carbone attivo e 3 prodotti commerciali Atox Myco AD AZ e Nova plus L aggiunta ai mangimi stata effettuata a due diversi livelli 1 e 2 Per ogni livello e ogni sequestrante sono stati preparati 3 replicati Inoltre un altro mangime e un campione di mais naturalmente contaminati sono stati miscelati dopo omogeneizzazione con ATOX al 2 235 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Analisi delle Aflatossine Le AF sono state estratte agitando per 45 minuti da 25 g di campione con 250 mL delle seguenti miscele CH30H H 0 80 20 v v acetone H O 85 15 v v acetone H O 70 30 v v acetone H O 60 40 v v acetone H20 50 50 v v L estratto stato filtrato su filtro di carta quindi 5 mL di filtrato sono stati diluiti con 50 mL di H2O distillata e fatti passare su colonna di immunoaffinit La colonna stata lavata con 5 mL di H 0 distillata quindi le AF sono state eluite in provetta graduata con 2
37. van Loon W KP van Straten G Sorption isotherms GAB parameters and isosteric heat of sorption Journal of the Science of Food and Agriculture 2005 85 11 1805 14 42 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev CONTAMINAZIONE DA OCRATOSSINA A E TRICOTECENI DI BISCOTTI PRELEVATI AL DETTAGLIO Amedeo Pietri a Terenzio Bertuzzi a Barbara Agosti a Gianluca Donadini b a Istituto di Scienze degli Alimenti e della Nutrizione Facolta di Agraria Universita Cattolica del Sacro Cuore Piacenza b AIDASA c o Istituto di Entomologia e Patologia Vegetale Facolta di Agraria Universita Cattolica del Sacro Cuore Piacenza Introduzione Nell attuale situazione europea i due principali rischi da micotossine per il frumento e derivati riguardano la presenza di Ocratossina A OTA prodotta principalmente da Penicillium verrucosum e da Aspergillus ochraceus e di fusariotossine quali i Tricoteceni TCT soprattutto di tipo B prodotti da Fusarium culmorum e Fusarium graminearum L OTA una micotossina cancerogena teratogena e immunodepressiva pu provocare nefriti ed epatiti ed classificata dallo IARC International Agency for Research on Cancer nel gruppo 2B cio come possibile sostanza ad azione cancerogena nei confronti dell uomo Nella Unione Europea UE per POTA stato fissato un limite di 3 ug kg per i prodotti destinati al consumo derivati dai cereali I TCT hanno un elevato potere immunosoppressore quello che riveste la maggio
38. 1 in tampone fosfato 0 2 M a pH 7 5 160 mL di NaH PO H O 0 2 M 840 mL di NaHPO 0 2 M il campione stato quindi posto in stufa termostato a 37 C per 3 ore sotto continua agitazione Al termine della digestione dopo centrifugazione a 8000 g a 4 C per 15 minuti un aliquota di 5 mL di surnatante diluita con 5 mL di PBS Phosphate Buffered Saline stata purificata mediante colonna ad immunoaffinit Ochratest Vicam Dopo lavaggio della colonna con 2 5 mL di PBS POTA stata eluita in provetta graduata con 3 mL di CH CN L estratto stato concentrato sotto flusso di No quindi riportato ad 1 mL con la miscela CH3CN H 0 35 65 v v agitando in bagno ad ultrasuoni e su vortex infine il campione stato filtrato 0 45 um L OTA stata quindi determinata mediante analisi HPLC la separazione stata effettuata con colonna Luna Phenyl Hexyl Phenomenex e come fase mobile con un gradiente CH3CN soluzione acquosa al 2 di CH COOH a flusso di 1 0 mL min da 35 a 67 di CH CN in 9 minuti La rivelazione stata effettuata mediante fluorimetro impostato a Aeccitazione 333 nm Agmissione 470 nm Risultati e discussione Percentuali di recupero limiti di rivelazione e quantificazione dell OTA Le percentuali di recupero sono state calcolate aggiungendo a campioni non contaminati di tessuto muscolare adiposo e di prosciutto crudo volumi noti di una soluzione standard di OTA in modo da avere un livello di contaminazione p
39. 11 micotossine considerate in questo studio ZEA 100 DON FB 63 CH30H 40 CH30H 20 CH30H 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Time min Figura 1 Cromatogramma TIC di un estratto di mais artificialmente contaminato con 500 pg kg DON 2 pg kg AFG2 AFB2 6 pg kg AFG 10 pg kg AFB 500 pg kg FB4 250 pg kg FB2 100 pg kg HT 2 T 2 ZEA 20 pg kg OTA le linee verticali indicano i periodi di inversione della polarita della sorgente ESI la linea tratteggiata illustra i cambiamenti nella composizione della fase mobile 248 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Le caratteristiche del metodo in termini di recuperi ripetibilita e linearita sono state valutate in mais frumento e orzo a livelli di contaminazione intorno ai limiti di legge per ogni micotossina considerata Le percentuali di recupero valutate a tre livelli di contaminazione variano da 64 a 103 in mais da 60 a 91 in frumento e da 64 a 103 in orzo con deviazioni standard relative n 3 inferiori al 13 I limiti di rivelabilit LOD Limit of Detection calcolati ad un rapporto segnale rumore pari a 3 sono compresi tra 0 1 a 5 8 ug kg in mais 0 2 e 5 1 ug kg in frumento e 0 1 e 2 4 ug kg in orzo I valori di recupero e di ripetibilit del metodo sono conformi ai criteri stabiliti dal CEN European Committee for Standardization e riportati nel Reg CE 401 2006 12 per l accettazione di metodi analitici per la determinazione delle varie
40. 1378 37 4 0 3 Frutta secca a guscio rigido spuntini 2080 159 145 7 Prodotti destinati ad una alimentazione particolare 1332 24 1 0 07 Totale 166916 3494 185 0 11 60 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev I campioni risultati irregolari per riscontro di micotossine sono invece 185 pari allo 0 11 sul totale dei campioni analizzati La distribuzione per le diverse classi di prodotti alimentari riportata in Tabella e in Figura 1 160 145 140 120 100 80 60 40 20 TO A 7 7 8 1 1 2 0 a cl Zuppe brodi e Prodotti destinati Cacao e Dolciumi Pesci Erbe spezie Prodotti Cereali e Frutta secca a salse ad alimentazione preparazioni a crostacei e caff e t lattiero caseari prodotti della guscio rigido particolare base di cacao molluschi panetteria spuntini Figura 1 irregolarit per classi di prodotti alimentari per riscontro di micotossine Il maggior riscontro del contaminante si avuto nella frutta secca a guscio rigido 145 irregolarit seguita dai cereali e prodotti della panetteria e da pesci crostacei e molluschi riferiti a lesioni e neoplasie attribuibili a mangimi contaminati da micotossine con 7 campioni irregolari Questi dati ricavati dai modelli B di rilevazione riportati nell Appendice 2 del DPR 14 luglio 1995 modificata dal DM 8 ottobre 1998 da una parte permettono di avere una conoscenza dell incidenza percentuale sulle varie classi di aliment
41. 3 rende il metodo adatto anche all analisi dei baby food Valutazione della tossicit acuta e della risposta trascrizionale su V fischeri L ecotossicologia si avvale di test in vitro anche su batteri come strumento di screening per monitorare la pericolosit di contaminanti chimici Tra i pi utilizzati il Microtox toxicity test system utilizza V fischeri ceppo NRRL B11177 un batterio marino naturalmente luminescente e 145 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev determina gli effetti tossici come calo della luminescenza fenomeno quantificabile con precisione grazie all utilizzo di un luminometro possibile perci in maniera veloce ed economica tracciare una curva dose risposta da cui ricavare il dato della Median Effective Concentration ECs la dose che produce il 50 dell effetto misurabile a cui inversamente correlata la tossicit acuta della matrice testata Oltre la buona sensibilit mostrata dal sistema nei confronti di differenti classi di contaminati idrocarburi PCB insetticidi erbicidi ecc i vantaggi dei test effettuati al Microtox sono l economicit la rapidit e la standardizzazione tanto che il test ormai abitualmente inserito nelle batterie di test ecotossicologici che valutano la tossicit acuta di matrici ambientali come acque di superficie e sedimenti L idea di base che si sviluppata nell ambito del progetto MITICA quella di applicare gli stessi protocolli testati e validati in
42. 32 Rev come l aptoglobina r 0 44 p lt 0 05 Tra gli enzimi epatici sono stati osservati significativi aumenti della GPT e della GGT nel quartile di maggior concentrazione dell OTA rispetto al primo Se l aumento della GGT potrebbe essere mediato dalla nota azione epatotossica dell alcool l aumento della GPT potrebbe indicare una tossicit epatica diretta della tossina da notare che la concentrazione della GPT risultata di poco superiore al valore fisiologico 45 3 vs 43 U L Non sono risultate correlazioni tra la tossina e i livelli di urea e creatinina indicatori della funzionalit renale Conclusioni Dall indagine emerso che POTA presente nella quasi totalit dei campioni con un valore medio non trascurabile alcuni autori hanno dimostrato che a livelli superiori a 500 ng L possono manifestarsi problemi per la funzionalit epatica e renale 3 4 5 da verificare l ipotesi di una possibile tossicit epatica della tossina Sono state confermate correlazioni con il consumo di cereali e carne suina il consumo di frutta potrebbe ridurre l assorbimento o favorire l eliminazione di OTA Bibliografia 1 Breitholtz A Olsen M Dahlback A Hult K Plasma ochratoxin A levels in three Swedish populations surveyed using an ion pair HPLC technique Food Additives and Contaminants 1991 8 183 92 2 Palli D Miraglia M Saieva C Masala G Cava E Colatosti M Corsi AM Russo A Brera C Serum levels of ochrat
43. 34 0 68 0 30 0 74 7 ottobre 2007 0 27 lt 0 02 0 47 0 42 0 23 8 novembre 2007 0 05 lt 0 02 lt 0 02 lt 0 02 0 17 9 dicembre 2007 lt 0 02 lt 0 02 lt 0 02 0 16 0 38 10 gennaio 2008 lt 0 02 lt 0 02 0 35 lt 0 02 0 26 11 febbraio 2008 0 22 lt 0 02 0 11 0 34 lt 0 02 12 marzo 2008 0 16 lt 0 02 0 26 0 35 lt 0 02 media 0 14 0 16 0 07 0 13 0 22 0 23 0 16 0 16 0 19 0 22 Contaminazione da DON dei biscotti Tra i TCT il DON risultato presente nel 93 3 dei campioni mentre gli altri TCT non sono mai stati rilevati Tabella 2 Nessun campione risultato avere una concentrazione di DON superiore al limite di legge di 500 ug kg per i prodotti da forno Il valore pi elevato stato pari a 278 ug kg mentre livelli di DON superiori a 200 ug kg limite per il baby food sono stati riscontrati solo in 2 campioni 3 3 Il valore medio globale stato pari a 39 49 ug kg Come per l OTA non sono state osservate differenze statisticamente significative tra le diverse marche considerate anche se i tre valori pi alti sono relativi alla stessa marca C periodo dicembre 2007 febbraio 2008 Tabella 2 Contaminazione da DON pg kg dei biscotti prelevati a cadenza mensile Data Marca biscotti A B c D E hard discount 1 aprile 2007 9 46 21 6 13 2 maggio 2007 38 66 38 10 12 3 giugno 2007 10 49 23 8 8 4 luglio 2007 48 lt 2 37 10 8 5 agosto 2007 9 lt 2 26 50 19 6 settembre 2007 20 47 15 39 2 7 ottobre 2007 25 80 lt 2 47 7 8
44. 4 Fenaille F Mottier P Turesky RJ Ali S Guy PA Comparison of analytical techniques to quantify malondialdehyde in milk powder The Journal of Chromatography A 2001 921 237 45 Bernabucci U Ronchi B Basific L Pirazzi D Rueca F Lacetera N Nardone A Abundance of mRNA of apolipoprotein B100 apolipoprotein E and microsomal triglyceride transfer protein in liver from periparturient dairy cows Journal of Dairy Science 2004 87 288 1 8 Klaunig EJ Kamendulis LM Role of oxidative stress in chemical carcinogenesis In Fuchs J Packer L Ed Environmental Stressors in health and disease Roudledge USA 2001 p 81 102 Rizzo A Atroshi F Hirvi T Saloniemi H The hemolytic activity of deoxynivalenol and T 2 toxin Natural Toxins 1992 1 106 10 Liu J Yang CF Lee BL Shen HM Ang SG Ong CN Effect of Salvia miltiorrhiza on aflatoxin B1 induced oxidative stress in cultured rat hepatocytes Free Radical Research 1999 31 559 68 Valko M Leibfritz D Moncol J Cronin MTD Mazur M Telser J Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease The International Journal of Biochemistry amp Cell Biology 2007 39 44 84 Lakritz J Leonard MJ Eichen PA Rottinghaus GE Johnson GC Spiers DE Whole blood concentrations of glutathione in cattle exposed to heat stress or a combination of heat stress and endophyte infected tall fescue toxins in controlled environmental conditions American Journal of Vet
45. 4 riportato il primo esperimento in cui tre dosi di FB scelte nell intervallo di linearit di risposta sono state combinate con un unica dose di FB 22 mg L che non ha effetto tossico evidente che soprattutto alle basse concentrazioni le due micotossine sinergizzano in quanto l effetto combinato maggiore della somma dei singoli effetti Questo effetto maggiormente evidente nell esperimento riportato in Figura 5 dove si ottenuta una risposta superiore al 50 combinando dosi che singolarmente non davano alcuna risposta quantificabile 147 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 100 E FB a L FB FB 22 mg L o 5 oa x FB 22 5 mg L FB 45 mg L FB 90 mg L Figura 4 Confronto fra la tossicit acuta al test Microtox di FB e differenti combinazioni di FB e FB2 22 mg L mre FB FB 11 2 mg L 50 4 40 4 2 30 4 o x 20 4 10 4 0 FB 5 6 mg L FB 11 2 mg L FB 22 5 mg L Figura 5 Confronto fra la tossicit acuta al test Microtox di FB e differenti combinazioni di FB e FB2 11 2 mg L Nell intento di comprendere i possibili meccanismi coinvolti nella risposta a trattamenti combinati di FB e FB su FV fischeri abbiamo disegnato una microarray slide contenente tutto il genoma del V fischeri ES114 specificamene dedicata allo studio delle variazioni nell espressione genica 148 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev La tecnologia s
46. 54 SECONDA SESSIONE Gestione del rischio da micotossine Rapporti ISTISAN 10 32 Rev CONTROLLO UFFICIALE DELLE MICOTOSSINE IN ITALIA Silvio Borrello Dipartimento per la Sanita Pubblica Veterinaria la Nutrizione e Sicurezza degli Alimenti Direzione Generale della della Sicurezza degli alimenti e della Nutrizione Ministero della Salute Roma Introduzione Il 1 gennaio 2006 segna l entrata in vigore di una serie di norme comunitarie Regolamenti CE 852 2004 853 2004 854 2004 882 2004 e Direttiva 2004 41 CE conosciute come Pacchetto Igiene che rappresentano la normativa di riferimento riguardo l igiene della produzione degli alimenti e dei controlli a cui essi devono essere sottoposti Lo scopo garantire un livello elevato di tutela della salute umana assicurando l immissione sul mercato europeo di alimenti sicuri e sani Ai fini dell attuazione concreta del cosiddetto pacchetto igiene ogni Stato individua le autorit competenti sanitarie per l attivit di controllo ufficiale Il controllo ufficiale si effettua in modo regolare e o nei casi in cui si sospetti la non conformit dei prodotti Le competenti Autorit degli Stati Membri devono elaborare programmi che definiscono la natura e la frequenza dei controlli che devono essere effettuati regolarmente durante un determinato periodo L art 2 del Reg CE 882 2004 fornisce le seguenti definizioni Controllo ufficiale qualsiasi forma di controllo
47. Aflatossine AF numerosi studi sono stati condotti per valutare l efficienza di estrazione di alcuni solventi come metanolo acetone e acetonitrile in particolare sono stati considerati i rapporti solvente acqua volume solvente volume acqua miscela campione volume miscela pesata campione e le interferenze dovute alla natura del campione effetto matrice I metodi pi comunemente usati dai laboratori specializzati prevedono un estrazione con metanolo acqua 80 20 v v 0 seguendo il metodo AOAC con acetone acqua 85 15 v v 1 2 Entrambi effettuano la successiva determinazione mediante High Performance Liquid Chromatography HPLC dopo purificazione attraverso colonna di immunoaffinit Alcuni autori hanno osservato che la presenza di alcuni sequestranti aggiunti agli alimenti zootecnici contaminati per ridurre l escrezione di Aflatossina M AFM nel latte pu ridurre il recupero percentuale nell analisi delle AF Questi additivi al momento non sono autorizzati a livello europeo per questo scopo essi sono per abitualmente aggiunti ai mangimi come ingredienti o antiagglomeranti per aumentare l efficienza della pellettatura L obiettivo del lavoro stato quello di esaminare se l aggiunta di alcuni dei pi comuni sequestranti pu influenzare l efficienza delle miscele di estrazione pi usate Materiali e metodi Preparazione dei mangimi Due mangimi contaminati da Aflatossina Bj AFB a due diversi livelli
48. Aziende Sanitarie Locali ASL A livello periferico le Regioni Province autonome indirizzano e coordinano le attivit territoriali delle ASL vigilano sull attivit di queste ultime ed elaborano e adottano i piani regionali di controllo A livello locale i Dipartimenti di prevenzione delle ASL Servizi Igiene degli Alimenti e Nutrizione SIAN e Servizi Veterinari SV pianificano programmano ed eseguono i controlli ufficiali sugli operatori del settore alimentare OSA Controlli ufficiali sul territorio Il controllo ufficiale delle micotossine rientra nell ambito delle operazioni di vigilanza e di controllo degli alimenti e delle bevande in Italia dirette e coordinate dal Ministero della Salute Direzione Generale della Sicurezza degli Alimenti e della Nutrizione del DSPVNSA Ogni anno vengono raccolte le informazioni e i numeri delle operazioni che riguardano l indagine pi completa sul controllo della qualit dei prodotti alimentari lungo tutta la filiera produttiva Ne scaturisce alla fine una relazione annuale che contiene le notizie sulle attivit di vigilanza e di controllo analitico sugli alimenti e le bevande svolte in Italia da tutte le Amministrazioni centrali e territoriali deputate a tale attivit Il rapporto viene annualmente pubblicato on line sul sito ufficiale del Ministero della Salute quindi a disposizione degli operatori e dei cittadini La vigilanza e il controllo ufficiale degli alimenti e delle bevande
49. Chromatography A 1999 864 89 101 2 Berndt WO Hayes AW n vivo and in vitro changes in renal function caused by ochratoxin A in the rat Toxicology 1979 12 5 17 3 Ochratoxin A In IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans Vol 56 Some naturally occurring substances food items and constituents heterociclyc aromatic amines and mycotoxin Lyon France International Agency for Research on Cancer 1993 p 489 521 4 Bavaresco L Vezzulli S Civardi S Gatti M Pietri A Ferrari F Battilani P Clorosi ferrica da calcare e risposta della vite all attacco di Aspergillus carbonarius In Atti del II Convegno Nazionale di Viticoltura Marsala 14 19 luglio 2008 Firenze SOI Edizioni 2008 5 Smart R Robinson M Sunlight into wine a handbook for winegrape canopy management Adelaide AUS Winetitles 1991 6 Brera C Grossi S De Santis B Miraglia M Automated HPLC Method for the Determination of Ochratoxin A in Wine Samples Journal of Liquid Chromatography amp related technologies 2003 26 119 33 7 Pollastro S De Miccolis Angelini RM Faretra F A semi selective medium for the ochratoxigenic fungus Aspergillus carbonarius Journal of plant pathology 2006 88 1 107 12 8 Atoui A Mathieu F Lebrihi A Targeting a polyketide synthase gene for Aspergillus carbonarius quantification and ochratoxin A assessment in grapes using real time PCR International Journal of Food Microbiology 2007 115 313 8 38
50. Dev std 0 04 0 23 0 10 0 10 0 20 Questo studio preliminare conferma le eccellenti prestazioni del kit RIDA QUICK DON Qualidon quando utilizzato con il nuovo lettore RIDA QUICK SCAN sviluppato dal gruppo R Biopharm 218 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev ANALISI MEDIANTE AFLAOCHRA PREP IN ASSOCIAZIONE ALL HPLC IN FLUORESCENZA PER LA DETERMINAZIONE DELLE AFLATOSSINE TOTALI E DELL OCRATOSSINA A David Leeman Elaine C Marley R Biopharm Rhone Ltd Glasgow Scozia Regno Unito Introduzione Le Aflatossine AF e l Ocratossina A OTA sono metaboliti tossici prodotti da muffe del genere Aspergillus Questi funghi sono presenti quasi ovunque e si sviluppano in condizioni di caldo e umido Gli alimenti e i mangimi sono suscettibili alla contaminazione di tali funghi durante la crescita la raccolta o la conservazione Le AF sono cancerogene mentre l OTA nefrotossica Entrambi i gruppi di micotossine possono svilupparsi in una vasta gamma di alimenti inclusi i cereali la frutta secca e le spezie Per tutti questi gruppi alimentari sono stati introdotti limiti legislativi europei relativi alle AF totali 4 10 ug kg all Aflatossina B AFB 2 5 ug kg e al OTA 3 10 pg kg Lo scopo di questo lavoro stato quello di sviluppare colonne ad immmunoaffinit AFLAOCHRA PREP che consentano l isolamento e la concentrazione di AFB Aflatossina G AFG Aflatossina B2 AFB Aflatossina G2 AFG e OTA Inoltre
51. E30 x E50 E75 E100 Potenza E 100 SS URE ID A Bit SBS abet E TS ert O0 Rolenza 1100 a b Figura 3 Pattern di variazione del CV per campioni globali ottenuti da sub partite a diverso grado di EL con 4 8 20 e 40 prelievi di campioni elementari dalla sub partita In a simulazioni con grado di Er 70 contaminazioni presenti nel 70 delle SU generate in b stesse simulazioni effettuate su sub partite a basso livello d eterogeneit Er 100 108 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Conclusioni Il modello sviluppato consente di operare simulazioni che tengono conto di diverse componenti della variabilit nella distribuzione delle Aflatossine nelle partite di materie prime ad alimenti zootecnici alla rinfusa attraverso le quali valutare l efficacia di differenti piani o strategie campionarie Posta la condizione che siano disponibili conoscenze pi approfondite sul tipo di distribuzione statistica delle contaminazioni da Aflatossine nelle partite alla rinfusa di granella di mais o altra materia prima ad uso zootecnico tali da poter essere integrate nel modello sviluppato la sua versatilit pu consentire di effettuare simulazioni aderenti alla fattispecie reale assumendo un potenziale ruolo di strumento efficace per la standardizzazione e valutazione per le strategie di campionamento degli alimenti zootecnici in grado di supportare ad esempio efficaci piani d autocontrollo aziendale Bibliografia ER Whitaker TB
52. Figura 2 si evidenzia la differenza di contaminazione fra i due anni di prova dovuta probabilmente alle caratteristiche climatiche dell annata 2008 pi favorevoli allo sviluppo della fusariosi della spiga La risposta varietale in merito all accumulo di DON stata piuttosto differenziata in particolare la variet Creso si distinta come la meno suscettibile anche nelle condizioni pi difficili e cio nell annata 2008 e in coltura convenzionale valore limite 1750 1894 1000 r 2007 media E 2008 media N 800 a 600 z O a 400 200 i Ai q EEEF 0 r 1 Ciccio Simeto Duilio Iride Claudio Creso Ciccio Simeto Duilio Iride Claudio Creso Biologico Variet Convenzionale Figura 2 Valori medi massimi e minimi della concentrazione di DON nei campioni positivi delle sei variet comuni di frumento coltivate con metodo biologico e convenzionale 2007 2008 119 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Anche per quanto riguarda l incidenza percentuale di contaminazione da DON Figura 3 le sei variet hanno evidenziato un comportamento differenziato con una minore incidenza in biologico Le variet Claudio e Creso hanno fatto registrare una minore percentuale di contaminazione con entrambi i metodi di coltivazione 100 biologico biennio IMI convenzionale biennio 80 x Ki J N 60 Ss
53. Food Chemistry 2004 52 20 6347 52 2 Italia Circolare del 28 novembre 2003 n 6 Valori massimi ammissibili di Ocratossina A nel cacao Gazzetta Ufficiale Serie Generale n 286 10 dicembre 2003 3 Brera C Grossi S De Santis B Miraglia M High Performance Liquid Chromatographic method for the determination of Ochratoxin A in cocoa powder Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies 2003 26 4 585 98 243 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev PRECOCE RILEVAMENTO DI PENICILLIUM EXPANSUM PRODUTTORE DI PATULINA SU POMACEE MEDIANTE PCR REAL TIME Valentina Tolaini a Patrizia De Rossi b Antonella Del Fiore b Massimo Reverberi a Anna Adele Fabbri a Corrado Fanelli a a Dipartimento di Biologia Vegetale Universita degli Studi Sapienza Roma b Dipartimento di Biotecnologie Agroindustria e Protezione della Salute Agenzia nazionale per le nuove tecnologie l energia e lo sviluppo economico sostenibile ENEA Centro Ricerche Casaccia Roma Introduzione Penicillium expansum l agente eziologico del marciume verde azzurro delle pomacee in post raccolta e la sua infezione associata con la produzione di Patulina una micotossina con effetti tossici a livello immunologico neurologico e gastrointestinale in modelli animali 1 L utilizzo di frutti colpiti da tale patogeno anche nelle fasi iniziali di infezione incrementa il rischio di contaminazione da Patulina in succhi di frutta e altri prod
54. Francia b R Biopharm AG Germania c R Biopharm France Francia Introduzione Le micotossine sono metaboliti secondari che si sviluppano verso la fine della fase di crescita esponenziale delle muffe in base a diversi fattori ambientali Le micotossine possono essere presenti in prodotti agricoli quali ad esempio cereali a seconda dell influenza dei singoli fattori ambientali e possono trovarsi anche in associazione agli alimenti carne e prodotti lattiero caseari di origine animale Il Deossinivalenolo DON appartiene al gruppo dei Tricoteceni ed prodotto da funghi del genere Fusarium Il DON si trova spesso in prodotti di origine vegetale in particolare nei cereali Tra i Tricoteceni DON 3 acetil e 15 acetil Deossinivalenolo sono le tossine maggiormente presenti in Europa e nel nord America Le concentrazioni di tossine trovate nel frumento nel mais e nel riso solitamente sono espresse in valori di mg kg A causa delle loro propriet citotossiche e immunosoppressive queste tossine rappresentano un rischio per la salute dell uomo e degli animali Il nuovo lettore RIDA QUICK SCAN sviluppato da R Biopharm AG stato valutato in Francia in uno studio di collaborazione tra R Biopharm Francia e la divisione Agrochimica della BASF Il lettore stato valutato utilizzando il kit RIDA QUICK DON di R Biopharm AG Questo kit commercializzato in Francia da R Biopharm Francia con il nome di RIDA QUICK DON e dalla divisione Agroc
55. Introduzione L Ocratossina A OTA prodotta principalmente da Aspergillus ochraceus e Penicillium verrucosum pu essere presente in numerosi alimenti della nostra dieta l esposizione dell uomo all OTA pu verificarsi attraverso il consumo di alimenti sia di origine vegetale cereali e derivati frutta secca caff cacao spezie vino che animale carne suina e derivati L OTA ha evidenziato una potente attivit immunodepressiva e nefrotossica ed stata classificata dallo IARC International Agency for Research on Cancer nel gruppo 2B come sostanza potenzialmente cancerogena per l uomo L escrezione della tossina dall organismo umano risulta particolarmente lenta studi hanno indicato un tempo di emivita di OTA nel sangue di 35 5 giorni dovuto al riassorbimento della tossina durante la circolazione enteroepatica al riassorbimento che avviene nel rene dopo la secrezione tubulare e al forte legame con le proteine plasmatiche in particolar modo con l albumina L escrezione renale sembra essere il principale meccanismo d eliminazione tuttavia studi realizzati su campioni di latte umano prelevato da donne di diversi paesi europei hanno evidenziato come l eliminazione dell OTA avvenga anche se in piccola quantit anche attraverso questa via In Italia ad esempio stata rilevata una elevata presenza di OTA sia nel siero 100 di positivit che nel latte materno circa 80 1 2 Per la sua prolungata persist
56. JD The toxicology of aflatoxins San Diego CA Academic Press 1994 Unione Europea Direttiva 96 23 CE del Consiglio del 29 aprile 1996 concernente le misure di controllo su talune sostanze e sui loro residui negli animali vivi e nei loro prodotti e che abroga le direttive 85 358 CEE e 86 469 CEE e le decisioni 89 187 CEE e 91 1664 CEE GUCE L 125 23 maggio 1996 Unione Europea Regolamento CE N 1881 2006 della Commissione del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari GUCE L364 5 20 dicembre 2006 aggiornato il 23 luglio 2008 Italia Decreto legislativo 10 maggio 2004 n 149 Attuazione delle direttive 2001 102 CE 2002 32 CE 2003 57 CE e 2003 100 CE relative alle sostanze ed ai prodotti indesiderabili nell alimentazione degli animali Gazzetta Ufficiale Serie Generale n 139 16 giugno 2004 Unione Europea Direttiva 2003 100 CE della commissione del 31 ottobre 2003 che modifica l allegato I della direttiva 2002 32 CE del Parlamento europeo e del Consiglio relativa alle sostanze indesiderabili nell alimentazione degli animali GUCE L285 1 novembre 2003 Muscarella M Iammarino M Nardiello D Lo Magro S Palermo C Centonze D Palermo D Validation of a confirmatory analytical method for the determination of aflatoxins B B2 G and G2 in foods and feed materials by HPLC with on line photochemical derivatization and fluorescence detection Food Additives
57. Le Aflatossine sono responsabili della contaminazione di vari alimenti di origine vegetale fra i quali cereali semi oleaginosi frutta a guscio frutta secca alimenti per l infanzia e mangimi 4 Le AF appartengono alla categoria B dell allegato 1 della Direttiva 23 1996 CE 5 e come prescritto dal Reg CE 1881 2006 6 per tali sostanze stato fissato un valore di livello massimo consentito nei prodotti alimentari destinati al consumo umano diretto pari a 2 pg kg per l Aflatossina B e 4 pg kg per le Aflatossine totali AFB YAFB AFG AFG Per l alimentazione animale il DL vo n 149 2004 7 in conformit con la Direttiva 100 2003 CE 8 stabilisce per AFB un contenuto massimo nelle materie prime per i mangimi di 0 02 mg kg e limiti variabili nell intervallo 0 005 0 02 mg kg per i prodotti destinati all alimentazione degli animali Tra i numerosi metodi riportati in letteratura per la determinazione delle AF nei prodotti alimentari metodi immunoenzimatici metodi cromatografici con derivatizzazione chimica pre o post colonna o derivatizzazione elettrochimica online la separazione a fase inversa abbinata alla rivelazione fluorimetrica con derivatizzazione fotochimica post colonna risulta economica e di semplice utilizzo e garantisce un elevata riproducibilit di analisi senza necessit di controllo della reazione di derivatizzazione Inoltre tale metodo analitico risulta rapido e altamente sensibile e consente di quantifica
58. Lyon France International Agency for Research on Cancer 1993 p 489 521 2 Italia Circolare del Ministero della Sanit 9 giugno 1999 n 10 Direttive in materia di controllo ufficiale sui prodotti alimentari valori massimi ammissibili di micotossine nelle derrate alimentari di 132 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 3 Chiavaro E Lepiani A Colla F Bettoni P Pari E Spotti E Ochratoxin A determination in ham by immunoaffinity clean up and a quick fluorometric method Food additives and contaminants 2002 19 6 575 81 Ringraziamenti Questo lavoro condotto all interno del progetto dal titolo Innovazione per il Miglioramento dei Processi nell Agroalimentare Trasferimento Tecnologico e Organizzativo stato finanziato da Regione Lombardia e Unione Camere nell ambito della convenzione artigianato Si ringrazia il Dr Merlo Alessandro Agrimercati Si ringraziano inoltre la Fondazione Banca del Monte di Lombardia nella persona del Presidente il dott Aldo Poli e la ditta Safe Food nelle persona del dott Matteo Luppi 133 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 1999 2009 AFLATOSSINA M NEL LATTE UN PROBLEMA RISOLTO Luca Sillari Enzo Casarini Alberto Zaniboni Kalinka Grozeva Newlat SpA Stabilimento Giglio di Reggio Emilia Cronologia dell analisi dell Aflatossina M4 nel latte Nel 1999 Newlat inizio ad elaborare un piano aziendale di gestione del rischio Aflatossine mediante analisi di ruotine sul latte
59. OTA determina preoccupanti concentrazioni della tossina nei tessuti e nei prodotti carnei stagionati solo a concentrazioni nei mangimi molto elevate superiori a 50 ug kg limite massimo proposto dalla CE Una presenza di muffe ocratossigene negli impianti di stagionatura pu invece aumentare sensibilmente la concentrazione di OTA nei prodotti stagionati in modo molto pi rilevante rispetto alla contaminazione indiretta Particolarmente a rischio possono essere i prosciutti crudi che subiscono una stagionatura molto lunga Oltre ad effettuare un costante monitoraggio della contaminazione da OTA nei mangimi per suini quindi importante prevenire la proliferazione di muffe ocratossigene negli impianti di stagionatura Bibliografia 1 Battilani P Pietri A Giorni P Formenti S Bertuzzi T Toscani T Virgili R Kozakiewicz Z Penicillium populations in dry cured ham manufacturing plants Journal of Food Protection 2007 70 4 975 80 2 Spotti E Chiavaro E Lepiani A Colla F Mould and ochratoxin A contamination of pre ripened anf fully ripened hams Industria Conserve 2001 76 341 3 Pietri A Bertuzzi T Gualla A Piva G Occurrence of ochratoxin A in raw ham muscle and pork products from Northern Italy Italian Journal of Food Science 2006 1 18 1 8 4 Zannotti M Malagutti L Sciaraffa F Corti M Indagine preliminare sul contenuto di Ocratossina in salumi provenienti dalla grande distribuzione In Greppi GF Enne G Ed Atti 36
60. Simposio Internazionale di Zootecnia Ancona 27 aprile 2001 p 78 84 5 Pietri A Bertuzzi T Gualla A Piva G Determinazione dell Ocratossina in prodotti carnei nuovo metodo enzimatico di estrazione In Miraglia M Brera C Ed Congresso nazionale Le micotossine nella filiera agro alimentare Istituto Superiore di Sanit Roma 29 30 novembre 2004 Atti Roma Istituto Superiore di Sanit 2005 Rapporti ISTISAN 05 42 p 322 5 50 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev AFLATOSSINA M NEL LATTE DISTRIBUZIONE TRA PRODOTTI DELLA TRASFORMAZIONE CASEARIA TIPO GRANA Amedeo Pietri a Terenzio Bertuzzi b Annalisa Mulazzi a Gianfranco Piva a Alberto Pecorari b Gianluca Gambini b Marco Nocetti b a Istituto di Scienze degli Alimenti e della Nutrizione Facolt di Agraria Universit Cattolica del Sacro Cuore Piacenza b Consorzio del Formaggio Parmigiano Reggiano Reggio Emilia Introduzione L Aflatossina M AFM il 4 idrossi derivato dell Aflatossina Bj AFB e pu essere presente nel latte di animali in lattazione che hanno consumato mangimi contaminati da AFB Se il latte contaminato viene usato nella produzione di formaggi questi presentano una concentrazione di AFM maggiore di quella del latte di partenza questo fattore di arricchimento dovuto ad un interazione idrofobica che si viene a formare tra AFM e la caseina nel corso della caseificazione Il Reg CE 1881 2006 che stabilisce i
61. Standardisation of mycotoxin sampling procedures an urgent necessity Food Control 2003 14 233 7 Brera C Miraglia M Problematiche legate alla fase analitica nella determinazione delle micotossine nei prodotti alimentari In Miraglia M Brera C Ed 1 Congresso nazionale Le micotossine nella filiera agro alimentare Istituto Superiore di Sanit Roma 29 30 novembre 2004 Atti Roma Istituto Superiore di Sanit 2005 Rapporti ISTISAN 05 42 p 267 72 Cheli F Campagnoli A Pinotti L Fusi E Dell Orto V Sampling feed for mycotoxins acquiring knowledge from food Italian Journal of Animal Science 2008 8 5 22 Johansson AS Whitaker TB Hagler Jr WM Giesbrecht FG Young JH Bowman DT Testing shelled corn for aflatoxin Part I estimation of variance components Journal Of Association Of Analytical Chemists International 2000 83 1264 9 Whitaker TB Dickens JW Monroe RJ Variability of aflatoxin test results Journal of American Oil Chemists Society 1974 51 5 214 8 Paoletti C Donatelli M Kay S Van den Eeden G Simulating kernel lot sampling the effect of heterogrnrity on the detection of GMO contaminations Seed Science and Technology 2003 31 3 629 38 Unione Europea Regolamento CE n 152 2009 ella Commissione del 27 gennaio 2009 che fissa i metodi di campionamento e d analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali GUCE L 54 26 febbraio 2009 Peterson S Richmond B 1994 ST
62. Studio dell effetto matrice All ottimizzazione del saggio ELIME in tampone segue lo studio delle possibili interferenze dovute alla matrice alimentare a tale scopo si mostreranno i risultati ottenuti con campioni di cereali da colazione e con campioni di alimenti per l infanzia a base di cereali Al fine di ottenere risultati ottimali sono state valutate diverse procedure estrattive che sfruttano le caratteristiche di polarit del DON estrazione con acqua acetonitrile 84 16 estrazione con acqua acetonitrile 84 16 e purificazione con Mycosep estrazione con acqua acetonitrile 84 16 e purificazione con Bondelut estrazione con acqua metanolo 80 20 estrazione con acqua metanolo 80 20 e purificazione con Bondelut Alla fine di ogni processo di estrazione il campione stato seccato e risolubilizzato in un adatto volume di tampone al fine di far corrispondere il limite di tollerabilit in esame 200 per gli alimenti destinati all infanzia e 500 per i cereali da colazione all interno dell intervallo lineare della curva di riferimento Alla matrice cos trattata sono state addizionate soluzioni standard di DON al fine di valutare l effetto matrice mediante confronto con la curva di taratura in tampone Tris A seguito dei test eseguiti sui campioni di alimenti non contaminati la procedura di estrazione che offre il miglior compromesso tra semplicit di esecuzione e interferenza nell analisi risultata la seguente un al
63. a Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Foggia b Dipartimento di Scienze Agro Ambientali Chimica e Difesa Vegetale Universit degli Studi Foggia Introduzione Le Fumonisine sono micotossine prodotte dal metabolismo di funghi appartenenti al genere Fusarium in particolare F moniliforme e F proliferatum contaminanti diffusi del mais e altri cereali tra cui sorgo e riso 1 3 Tra le numerose forme di Fumonisine finora identificate negli alimenti contaminati vengono generalmente rinvenute quelle di tipo B FB FB e FB3 Nel 2002 l Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro International Agency for Research on Cancer IARC ha classificato la FB nel gruppo 2B quale potenziale agente cancerogeno per l uomo 4 La maggiore diffusione e tossicit della FB e la minore concentrazione della FB consentono di semplificare le indicazioni legislative riferendo i valori soglia fissati nel Reg CE 1126 2007 5 per il granoturco e i prodotti da esso derivati alla sola somma di FB e FB2 Poich le Fumonisine possono essere presenti sia nella granella sintomatica che in quella sana asintomatica il controllo della contaminazione da Fumonisine nel mais diventato un argomento prioritario nelle ricerche inerenti la sicurezza alimentare in linea con le direttive indicanti i livelli massimi di Fumonisine negli alimenti per l uomo 5 e per quelli destinati al settore zootecnico 6 La tecnica pi adopera
64. a causa dall eterogeneit dei campioni analizzati si osserva un effetto matrice superiore e una maggiore dispersione dei dati Sy x 2 071 nonostante la buona correlazione ottenuta R 0 9355 107 32 y 0 728x 0 385 y 0 901x 2 022 9 R2 0 9739 A 28 R2 0 9355 3 8 Sy x 0 437 zi Sy x 2 071 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Valore assegnato ug kg A B Figura 2 Correlazione tra valore di Aflatossina B1 addizionato in campioni di mais A o assegnato in campioni di mangimi B e determinazione nel saggio Celer AFLA B1 202 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Conclusioni I risultati ottenuti indicano che Celer AFLA Bj unico kit rapido specifico per AFB attualmente sul mercato permette un analisi accurata e precisa su diversi tipi di matrici Il suo intervallo di misura in linea con i limiti di legge unito a semplicit e rapidit nell esecuzione dell analisi rendono questo kit un metodo di screening adatto all analisi di materiali destinati sia all alimentazione umana che animale Bibliografia N A Nn an N 10 11 12 13 Council for Agricultural Science and Technology Mycotoxins risks in Plant Animal and Human Systems Ames IA CAST 2003 Task force report 139 Dorner JW Management and prevention of mycotoxins in peanuts Food Additives amp Contaminants 2008 25 2 203 8 Scudamore KA Banks JN The fate of mycotoxins during cereal processing
65. bianchi campione Limite di quantificazione Il LOQ la capacit del metodo di eseguire una misurazione quantitativa verificato sperimentalmente durante lo sviluppo del metodo eseguendo 6 prove di recupero dell analita ad una concentrazione uguale o superiore a LOQ 5 xs b oppure LOQ 5 x og b 114 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Incertezza L incertezza di misura standard dei metodi idonei ai fini del controllo ufficiale deve essere inferiore alla massima incertezza di misura standard calcolata mediante la formula Uf LOD 2 aC dove Uf incertezza massima di misura standard pg kg LOD limite di rivelazione del metodo pg kg C concentrazione di interesse g kg a fattore numerico funzione di C secondo lo schema riportato in Tabella 1 Tabella 1 Fattore numerico a in funzione della concentrazione C da utilizzare nel calcolo di Uf C ug kg a lt 50 0 20 51 500 0 18 501 1000 0 15 1001 10 000 0 12 10 000 0 10 Limiti del Reg CE 401 2006 I valori di precisione raccomandati Tabella 2 dal Regolamento n 401 2006 CE sono calcolati mediante l equazione di Horwitz RSDr 20251080 sp valore medio x 100 dove C frazione di massa espressa come potenza adimensionata di 10 Tabella 2 Esempi di RSDR Concentrazione RSDr raccomandato RSD raccomandato 0 66xRSDr 0 025 ug kg 78 8 52 0 0 050 pg kg 71 0 46 9 0 100 ug kg 64 0 42 2 0 450 ug kg 51 0 33 7
66. calcolo dell incertezza di misura solo il 33 valuta tale contributo secondo l equazione di Horwitz Studi interlaboratorio L interesse maggiore espresso per gli studi interlaboratorio riguarda studi per Aflatossina M in latte Fumonisine in mangimi cereali Aflatossina B in baby food frutta secca Ocratossina A in caff Deossinivalenolo in mangimi cereali Studi di validazione e studi interlaboratorio Il Reparto Organismi Geneticamente Modificati e Xenobiotici di Origine Fungina da tempo organizza nell ambito di progetti di ricerca studi di validazione di metodi per l analisi di micotossine A tal proposito si ricordano i lo studio di validazione per la determinazione della Ocratossina A in campioni di cacao in polvere 2004 2005 3 ii lo studio di validazione per la determinazione della Aflatossina B nel mais 2006 4 iii lo studio interlaboratorio per la validazione di un metodo immunoenzimatico per la determinazione del Deossinivalenolo DON in campioni di grano tenero 2006 2007 e 2008 2009 5 e infine iv lo studio interlaboratorio per la validazione di un metodo immunoenzimatico per la determinazione delle Fumonisine B e B2 in campioni di mais 2007 2008 5 Non potendo contare su risorse economiche dedicate LNR Micotossine ha sfruttato l espletamento di attivit legate a progetti di ricerca dell anno 2009 per coinvolgere i laboratori del Servizio Sanitario Nazionale e laboratori privati nazionali e
67. clorotici e sulle foglie sono state effettuate le analisi chimiche per determinare le diverse concentrazioni di elementi minerali Metodo ufficiale 985 01 AOAC official Method Metals and other elements in plants Sulle piante non clorotiche per annullare l effetto della luce manualmente si proceduto alla creazione di uguali livelli di esposizione dei grappoli a tal fine sono stati effettuati rilievi di caratterizzazione della chioma Tabella 1 attraverso il metodo dei contatti o del Point Quadrat 5 Tabella 1 Percentuale di foglie grappoli esterni e percentuale di vuoti Rilievi effettuati con il metodo del Point Quadrat Parametro Valore rilevato Foglie esterne 55 7 Foglie interne 53 2 Vuoti 6 7 Altezza vegetazione cm 95 Spessore chioma cm 50 Grappoli esposti 40 9 Il campionamento dei grappoli distinto per tesi stato condotto a partire dall invaiatura in maniera casuale su tutto il vigneto Alla raccolta sono state effettuate le micro vinificazioni su cento chilogrammi di uva per replica e ciascun campione di mosto e vino stato destinato insieme ai campioni di uva all indagine quali quantitativa dell eventuale contenuto di OTA e a quella microbiologica volta all isolamento dei miceti presenti e all identificazione molecolare di A carbonarius Inoltre nelle bacche e nel vino sono stati determinati gli stilbeni trans resveratrolo piceatannolo glicoside trans resveratrolo
68. dati espressi in unit di assorbanza apparente log 1 R I valori di assorbanza sono normalizzati rispetto alla media e alla deviazione standard Per l acquisizione spettrale le cariossidi sono state poste in piastre Petri 9 cm diametro 183 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Acquisizione delle immagini spettrali di specie fungine contaminanti del mais L analisi spettrale eseguita su colonie di diverse specie fungine Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Aspergillus niger Fusarium graminearum e Fusarium verticilloides sia commerciali che isolate da mais derivanti da colture pure su terreno sintetico agarizzato ha evidenziato caratteristiche spettrali differenti tra le specie testate che hanno consentito di attribuire a ciascuna di esse un caratteristico profilo spettrale firma spettrale In Figura 2 viene mostrato per ciascuna delle specie testate lo spettro ottenuto dopo 7 giorni di crescita a 30 C 3 0 Penicillium sp A parasiticus Fusarium g 5357 e Fusarium sp Fusarium v 4040 log 1 R 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 lunghezza d onda nm Figura 2 Spettri di riflettanza da inoculi su Potato Dextrose Agar Plate PDA di specie fungine naturali contaminanti del mais Analisi delle variazioni spettrali determinate dallo sviluppo fungino sulla superficie del mais Al fine di valutare le variazioni delle propriet di riflettanza spettrale d
69. degli standard di AF Aflatoxin Mix AFB e AFG 1 ug mL AFB e AFG 0 3 ug mL in metanolo OTA 50 ug mL in benzene acido acetico 99 1 DON 200 ug mL in etilacetato metanolo 95 5 e ZEA 50 ug mL in acetonitrile sono fornite da Supelco Gli standard di T2 e HT 2 sono forniti da R Biopharm Rh ne LTD in forma cristallina sono stati ricostituiti in acetonitrile come indicato sul certificato di accompagnamento ad una concentrazione di 100 ug mL e conservati a 20 C 204 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev L acqua ultrapura prodotta con un impianto Milli Q Micropore Corporation Billerica MA USA Tutti i reagenti sono forniti da Carlo Erba Reagenti Milano Italia l acetonitrile e il metanolo sono di grado HPLC il fosfato bibasico di sodio il fosfato monobasico di potassio e il cloruro di sodio utilizzati per la preparazione del tampone fosfato Phosphate Buffered Saline PBS cos come acetato di ammonio il bromuro di potassio l acido acetico glaciale l acido nitrico sono di grado tecnico Le colonnine di immunoaffinit AlfaOchra HPLC sono fornite da Vicam le colonnine DZT sono della ditta R Biopharm Rh ne LTD I filtri di carta sono di Carlo Erba Reagenti quelli in fibra di vetro sono di Munktell Barenstein Germany Preparazione del campione AflaOchra 50 g di campione finemente macinato a cui sono aggiunti 5 g di sodio cloruro sono estratti con 100 mL di metanolo H 0 80 20 v v agitando per 30 minuti Dopo
70. dei prodotti alimentari individuazione delle fonti e applicazione delle procedure di calcolo In Atti del V Congresso Metrologia amp Qualit Torino 14 16 marzo 2007 Adriani A Amico A Carconi P Gatti R Palazzo S Portaro N Sangiorgio P Troisi L Zappa G Preparazione di materiali di riferimento agroalimentari Primi risultati e valutazioni Roma ENEA 2004 RT 2004 22 BIOTEC ISO REMCO Guide 34 2000 General requirements for the competence of reference material producers Geneva International Organization for Standardization Second edition 2000 Cor 1 2003 Gatti R Zappa G Zoani C Preparazione di un materiale di riferimento da utilizzare per misure del contenuto di sostanze nutriceutiche in prodotti alimentari In Atti del V Congresso Metrologia amp Qualit Torino 14 16 marzo 2007 180 25 26 27 28 29 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Diletti G Scortichini G Gatti R Zappa G Zoani C Preparazione di un materiale di riferimento per l analisi di PCDDs e PCDFs negli alimenti zootecnici In Atti del V Congresso Metrologia amp Qualit Torino 14 16 marzo 2007 Senofonte O Giordano R Ciaralli L Ciprotti M Pino A D Amato M di Gregorio M Costantini S Carconi P Gatti R Palazzo S Zappa G Zoani C Preparazione di materiali di riferimento e loro utilit nei circuiti interlaboratorio per i Laboratori Nazionali di Riferimento della UE In Atti del V Congresso Metrologia
71. della quantit di latte prodotto Su ogni campione dopo aver registrato la quantit di latte prodotto sono state effettuate le seguenti determinazioni grasso Metodo Gerber proteine grezze Metodo Kjeldhal AFM Determinazione delle AFM Il campione di latte stato sgrassato per centrifugazione a 3000 g per 15 minuti Sono stati prelevati circa 30 mL di latte Attraverso una colonna di immunoaffinit Easy extract si fatto passare il latte a una velocit di circa 2 3 mL al minuto e la colonna stata poi lavata con 10 mL di acqua Circa 2 mL di eluato sono stati trasferiti in fiala e portati a secco sotto flusso di azoto e poi ricostituiti con acqua acetonitrile 80 20 v v fino a un volume di circa 300 uL La soluzione stata filtrata con filtro per siringa con porosit pari a 0 2 um L analisi in HPLC stata effettuata in isocratica con le seguenti condizioni 95 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev colonna Supelcosil C18 column termostata a 35 C fase mobile acqua acetonitrile metanolo 68 24 8 v v v flusso 1 mL min volume di iniezione 10 uL detector fluorimetro Aeccitazione a 363 nm ed Aemissione a 433 nm Analisi campioni di sangue per la determinazione del profilo metabolico Urea glucosio creatinina ALT e AST sono stati determinati sui campioni del siero raccolti una volta alla settimana da ogni bufalo dalla vena giugulare con il metodo Vacutainer I paramet
72. di AFB tra quelle testate p lt 0 05 Figura la e alla media e alta concentrazione di FB p lt 0 05 senza effetti significativi dovuti alla durata d esposizione Figura 1b Rispetto ai controlli l esposizione alla Tossina T 2 sembra avere esplicato un Rapporti ISTISAN 10 32 Rev debole effetto sulla presenza di ROM per tempi lunghi d esposizione 7 giorni Nessun effetto significativo stato invece osservato a seguito d esposizione linfocitaria al DON Il carico cellulare di ROM pu aumentare in seguito a diverse condizioni come ad esempio il metabolismo degli xenobiotici con possibile induzione dello stress ossidativo 23 Diversi autori 10 24 25 hanno evidenziato come le micotossine possano essere causa di danno alle membrane cellulari attraverso l aumento dei tassi di lipo perossidazione indicando chiaramente il ruolo importante della produzione di ROM nell esplicarsi dell azione citotossica e o genotossico delle micotossine I dati ottenuti sebbene in maniera non univoca per quanto riguarda i Tricoteceni mostrano come per AFB e FB vi sia una relazione dose dipendente diretta con la concentrazione dei ROM intracellulari a denotare un forte sbilanciamento tra produzione e neutralizzazione dei ROM da parte del linfocita bovino Il livello di tioli intracellulari risultato inferiore rispetto al controllo nelle colture esposte a 20 ugAFB mL con effetti pi marcati dopo 7 giorni d incubazione mentre nel caso dell
73. di origine brasiliana o vietnamita ed entrano in Italia attraverso importatori con sede a Genova solo in un caso stata verificata l importazione diretta dal Vietnam Le risultanze del monitoraggio sulla gestione del rischio Aflatossine hanno evidenziato generalmente salvo in alcuni casi una limitata conoscenza da parte delle aziende della problematica correlata al rischio di contaminazione del prodotto legata agli anacardi e all altra frutta a secca a guscio utilizzata e quindi un approccio non sistematico alla gestione del rischio stesso in generale nella valutazione del rischio da parte delle aziende visitate il rischio chimico proveniente anche da altre fonti comunque meno considerato rispetto a quello microbiologico Inoltre in pi occasioni stato evidenziato sia presso le aziende sia sulla documentazione ad essi rilasciata dai laboratori di analisi esterni che la mancata individuazione nel Reg CE 1881 2006 di un limite specifico per i prodotti composti contenenti fra gli ingredienti la frutta secca o a guscio stata erroneamente intesa come un assenza di limite per i prodotti stessi senza considerare il rimando al limite tollerabile derivato previsto all art 2 Conclusioni Il monitoraggio delle aziende conserviere a carattere prevalentemente artigianale e piccolo industriale della provincia di Imperia intrapreso in questi ultimi due anni dal nostro servizio ha evidenziato come gli anacardi utilizzati nella prepar
74. disponibilit di RM Estremamente utili si sono rivelate le tecniche Polymerase Chain Reaction PCR e Real Time PCR per l individuazione precoce e la quantificazione di specie fungine 9 Solo da pochi anni si stanno affrontando le problematiche 172 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev per questo settore e recentemente sono state pubblicate dall EU JRC IRMM guide specifiche sull impiego di RM nei test genetici 10 e sull incertezza di misura nei test per OGM 11 Produzione attuale di RM per la determinazione di micotossine Per esaminare la produzione mondiale di RM sono state prese in considerazione la banca dati internazionale COMAR COde d Indexation des MAt riaux de R f rence 12 realizzata in cooperazione tra alcuni Istituti Metrologici Nazionali e sostenuta da ISO REMCO e la banca dati recentemente realizzata dal VIRM Virtual Institute for Reference Materials 13 La ricerca di specifici RM in queste banche dati risulta spesso non agevole Le difficolt derivano principalmente dal carattere generale di questi dataBase in quanto considerando la produzione globale di RM CRM per qualsiasi settore di attivit non prevedono l utilizzo di criteri di ricerca ottimizzati per ciascun specifico settore La banca dati COMAR consente una ricerca rigorosa delle sostanze chimiche certificate mediante nome o numero CAS ma non permette ricerche per classi di sostanze chimiche n consente ricerche incrociate analita matrice In consid
75. e prospettato il loro rilevante impegno su questo delicato tema di salute pubblica d obbligo pertanto formularvi un sincero ringraziamento per l interesse mostrato nel partecipare con competenza collaborazione ed entusiasmo ai lavori del Congresso Nell augurare a tutti voi un sincero buon lavoro vi invitiamo alla quarta edizione che si terr nel 2011 I temi che caratterizzeranno la quarta edizione riguarderanno in particolar modo le realt produttive di tutto il comparto agricolo ed alimentare Sar obiettivo del IV Congresso presentare le attivit di ricerca e di controllo messe in atto sia dalle aziende medio piccole sia dai grandi gruppi industriali per fornire un quadro quanto pi completo di come i settori della produzione della trasformazione e della distribuzione affrontano il problema delle micotossine a tutela della salute del consumatore e del benessere degli animali PRIMA SESSIONE Valutazione del rischio da micotossine Rapporti ISTISAN 10 32 Rev LIVELLI DI OCRATOSSINA A NEL SIERO DI UN CAMPIONE DI POPOLAZIONE MOLISANA Amedeo Pietri a Terenzio Bertuzzi a Filippo Rossi a Gianfranco Piva a Silvia Rastelli a Annalisa Mulazzi a Romina di Giuseppe b Licia Iacoviello b a Istituto di Scienze degli Alimenti e della Nutrizione Facolt di Agraria Universit Cattolica del Sacro Cuore Piacenza b Centro di Ricerca Giovanni Paolo II Universit Cattolica del Sacro Cuore Campobasso
76. eseguita dall autorit competente o dalla Comunit per la verifica della conformit alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali Autorit competente l autorit centrale di uno Stato Membro competente per l organizzazione di controlli ufficiali o qualsiasi altra autorit cui conferita tale competenza In relazione all autorit competente l art 4 del Reg CE 882 2004 afferma che gli Stati membri designano le autorit competenti responsabili dei controlli ufficiali e per far s che i controlli possano essere espletati in modo efficace ed efficiente le autorit competenti dispongono di un adeguata capacit di laboratorio di un numero sufficiente di personale adeguatamente qualificato e di strutture e attrezzature appropriate Pertanto sono legittimati ad effettuare i controlli gli Enti che dispongono di un apparato non comune in termini di adeguata competenza tecnica professionalit specifica e complesso di attrezzature e strumenti L art 2 del DL vo n 193 2007 attuazione della Direttiva 2004 41 CE relativa ai controlli in materia di sicurezza alimentare e applicazione dei regolamenti comunitari nel medesimo settore chiarisce quanto segue Ai fini dell applicazione dei regolamenti CE 852 2004 853 2004 854 2004 e 882 2004 e successive modificazioni per le materie riguardanti la sicurezza alimentare le Autorit competenti sono il M
77. fasi di omogeneizzazione sia a umido che a secco e alla fase di macinazione condotta sul materiale liofilizzato La possibilit di effettuare un deidratazione sotto vuoto finale del materiale gi imbottigliato consente di ottenere RM con bassi valori di acqua libera ay lt 0 2 a vantaggio della stabilit dei prodotti Considerando l alta igroscopicit dei liofilizzati tutte le operazioni da effettuare su materiali anidri omogeneizzazione a secco setacciatura macinazione imbottigliamento sono raggruppate in aree dedicate ed possibile anche utilizzare una cabina mobile da posizionare sulle specifiche apparecchiature per operare sotto gas inerte L impianto dotato di un liofilizzatore a ripiani con programmazione dei cicli termici e controllo della pressione accessoriato con sistema di stoppering automatico che consente la chiusura dei flaconi sottovuoto o in atmosfera inerte L omogeneizzazione dei materiali umidi viene effettuata mediante l impiego di un miscelatore a pale e pu essere conseguita anche attraverso l impiego dell evaporatore rotante industriale V 100 L di cui dotato l impianto 177 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev PREPARAZIONE lavaggio eliminaane di parti non commestibili etc TRITURAZIONE EVAPORAZIONE sotto vuoto trainare RECUPERO del solvente i Evaporatore rotante i sersersesezezioneeenificeonicszeorionezesieseeezioneeeoioneneo wet homogenizatio
78. filtrazione su carta 10 mL di estratto sono diluiti con 40 mL di H 0 per i baby food 20 mL di filtrato sono diluiti con 50 mL di H20 e nuovamente filtrati su fibra di vetro 25 mL 50 mL per i baby food della soluzione cos ottenuta sono caricati sulla colonnina di immunoaffinit AlfaOchra HPLC Vicam 3 La colonnina lavata con 10 mL di H O e portata a secco facendo flussare aria le tossine sono eluite con 2 mL di metanolo in un matraccio tarato da 5 mL si porta a volume con H20 Nel caso dei baby food l estratto ottenuto viene portato a secco sotto vuoto con evaporatore rotante con bagnomaria a 35 C Il residuo disciolto in 1 mL di metanolo H O 2 3 v v Il campione finale iniettato in HPLC fluorimetro Analisi HPLC Fluorimetro Per la determinazione di AF e OTA stato utilizzato un cromatografo liquido ad alta prestazione Perkin Elmer Serie 200 Vengono effettuate 2 corse cromatografiche distinte In entrambi i casi si utilizza una colonna Discovery C18 25 cm x 4 6 mm 5 um con pre colonna C18 Supelco Milano Italia Colonna e pre colonna sono termostaste a 25 C per AF Fase mobile H2O acetonitrile metanolo 6 2 3 v v v ad ogni litro di fase mobile si aggiungono 350 uL di HNO 4 0 mol L e 120 mg di potassio bromuro Flusso 0 9 mL min Lunghezza d onda di eccitazione 360 nm lunghezza d onda di emissione 435 nm Volume di iniezione 200 uL Tempo di analisi 15 min Cella elettrochimica Kobra per derivatizz
79. frazione durante i processi digestivi che hanno luogo dopo il consumo dell alimento rendendo quindi la frazione nascosta effettivamente bioaccessibile Emerge di conseguenza non solo una problematica analitica legata al fatto che le metodiche di routine comportano una chiara sottostima della reale contaminazione da Fumonisine di materie prime e prodotti finiti ma anche un problema legato alla tutela della salute dei consumatori il cui livello di esposizione al fattore di rischio concretamente maggiore di quello stimato sulla base dei normali controlli Bibliografia 1 Bennett JW Klich M Mycotoxins Clinica Microbiology Reviews 2003 497 516 2 Sweeney MJ Dobson ADW Mycotoxin production by Aspergillus Fusarium and Penicillium International Journal of Food Microbiology 1998 43 141 58 3 Carrat MR Cassano T Coluccia A Borracci P Cuomo V Antinutritional effects of Fumonisin B1 and pathophysiological consequences Toxicology Letters 2003 140 141 459 63 4 Unione Europea Regolamento della Commissione Europea del 28 settembre 2007 n 1126 Livelli massimi dei contaminanti nei generi alimentari GUCE L255 29 settembre 2007 5 Galaverna G Dall Asta C Mangia M Dossena A Marchelli R Masked mycotoxins an emerging issue for food safety Czech Journal of Food Science 2009 27 S89 S92 24 N oo O 10 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Kim E K Scott PM Lau B P Y Hidden Fumonisins in corn flakes Food Additive
80. glucosio 99 5 acido D glucuronico e glucosammina 99 sono stati forniti da Sigma Stoccarda Germania Idrossido di potassio e acido cloridrico 37 sono stati ottenuti da Carlo Erba Milano Italia Tutti gli enzimi e i costituenti dei succhi digestivi artificiali mucina di tipo III di stomaco suino acido urico a amilasi di tipo VIII A da malto d orzo sieroalbumina bovina pepsina da mucosa gastrica suina pancreatina da pancreas suino lipasi di tipo III da pancreas suino e bile bovina e ovina sono stati forniti da Sigma Stoccarda Germania Estrazione di Fumonisine libere da mais grezzo e prodotti a base di mais 5 g di mais grezzo macinato vengono estratti con 40 mL di miscela estraente composta da acqua metanolo 30 70 v v e omogeneizzati Ultraturrax T50 Basic Ika Laborator Technik Stauffen Germania per 3 minuti a 6000 rpm Dopo filtrazione con filtro a pieghe 1 mL viene prelevato per l analisi in LC ESI MS MS Liquid Chromatography Electron Spray Ionization Tandem Mass Spectrometry Nel caso dei prodotti alimentari generalmente meno contaminati l estrazione avviene sempre secondo le stesse modalit ma partendo da 10 g di matrice Dopo filtrazione 4 mL di estratto vengono portati a secco sotto flusso di N e il residuo secco viene ripreso con 1 mL di acqua metanolo 30 70 v v prima dell analisi in LC ESI MS MS Modello di digestione in vitro Il modello di digestione riproduce in modo semplificato le condizion
81. i due tre campioni di laboratorio che formano il campione globale sono caratterizzati da concentrazioni di Aflatossine molto diverse tra loro Queste osservazioni sono in accordo con quanto riportato da Spanjer et al 3 Pertanto nonostante l applicazione delle procedure di campionamento stabilite dalla normativa comunitaria contribuisca a ridurre la variabilit derivante dal tipo di contaminazione a macchia di leopardo tale criticit permane Conclusioni Il controllo di prodotti all importazione strettamente legato ad aspetti economici Nel corso degli anni stato osservato un calo dei quantitativi di merci alimentari soprattutto frutta secca e cereali in ingresso dal porto di Ravenna e conseguentemente del numero di campioni analizzati In particolare la recente crisi mondiale ha avuto pesanti ripercussioni su queste attivit In questo lavoro sono stati presi in esame i risultati ottenuti durante otto anni di attivit di controllo delle micotossine in prodotti all importazione Sono stati analizzati 1758 campioni per la ricerca di Aflatossine di cui 1016 arachidi 141 pistacchi 221 nocciole e 91 fichi secchi e 252 per la ricerca di Ocratossina A La contaminazione da Aflatossine si presenta con una maggiore incidenza quasi il 10 di campioni non conformi rispetto a quella da Ocratossina A meno dell 1 Tali percentuali sono decisamente superiori rispetto a quelle riscontrate per la ricerca di fitofarmaci in p
82. i metodi di campionamento specifici per matrici alimentari cereali e prodotti derivati frutta secca arachidi e frutta a guscio spezie latte e prodotti lattiero caseari alimenti e latte per lattanti e di proseguimento caff e prodotti a base di caff L allegato II stabilisce i criteri da applicare alla preparazione dei campioni e ai metodi di analisi Risultati del controllo ufficiale in Italia delle micotossine anno 2008 Al fine di fornire un quadro d insieme dei risultati conseguiti si riporta un riepilogo nazionale delle attivit analitiche svolte nell ambito dei controlli ufficiali in Italia nel corso dell anno 2008 I campioni di prodotti alimentari analizzati sia di origine animale che vegetale Tabella 1 sono stati complessivamente 166 916 di cui 3 494 sono risultati non regolamentari facendo registrare una percentuale di non conformit pari al 2 09 inferiore di quella avutasi nel 2008 2 7 Tabella 1 Attivit analitica ARPA e IZS svolta nel corso dell anno 2008 in riferimento ai campioni irregolari per micotossine Classe alimenti Campioni analizzati Campioni irregolari per micotossine totali irregolari n sul totale Prodotti lattiero caseari 31251 949 8 0 02 Pesci crostacei e molluschi 14105 392 7 0 05 Zuppe brodi e salse 2322 45 1 0 04 Cereali e prodotti della panetteria 9607 333 10 0 1 Erbe spezie caff e t 1773 22 7 0 4 Cacao e preparazioni a base di cacao 392 8 2 0 5 Dolciumi
83. in forno a ventilazione forzata a 75 C per 40 ore Preparazione dei campioni 10 g di campione di frumento macinato vengono estratti con una miscela estraente composta da acqua acetonitrile 20 80 v v e omogeneizzati per 3 minuti a 6000 rpm Dopo filtrazione su filtro a pieghe 5 mL dell estratto vengono sottoposti a clean up tramite colonnine Mycosep 227 Trich Multifunctional Columns per Tricoteceni o Mycosep 226 AflaZon Multifunctional Columns per ZEA RomerLabs 2 mL di estratto purificato vengono quindi portati a secco sotto flusso di N e il residuo viene ripreso con 500 uL di metanolo prima dell analisi in LC ESI MS MS Liquid Chromatography Electron Spray Ionization Tandem Mass Spectrometry Analisi LC ESI MS MS Le analisi LC ESI MS MS sono state effettuate utilizzando un HPLC Alliance 2695 Waters Co Milford MA USA accoppiato con uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo Quattro Micro API con sorgente Electrospray Micromass Waters Manchester UK Le condizioni cromatografiche impiegate sono le seguenti colonna Phenomenex Synergi 2 5 um Fusion RP 100 50 x 2 00 mm dotata di precolonna C18 flusso 0 25 mL min temperatura della colonna 30 C volume di iniezione 5 uL il gradiente di eluizione stato ottenuto utilizzando acqua acidificata allo 0 01 con acido acetico eluente A e metanolo eluente B condizioni iniziali al 95 di A 0 9 minuti al 70 di B 9 20 minuti in condizioni isocratiche 21 minut
84. interazioni sulla contaminazione da DON nelle sei variet Ciccio Simeto Duilio Iride Claudio e Creso in grigio i fattori maggiormente significativi nel determinare il contenuto in micotossina Regione CV P A CVxP CVxA PxA Piemonte ns pesi a ns ns ns Lombardia kkk kkk kkk kkk kkk kkk Veneto kkk kk kkk kkk kkk kkk Emilia Romagna kkk kkk kkk kkk kkk kk Marche kkk kkk kkk kkk kkk kkk Abruzzo ns pes ns ns ns ns Toscana kkk kkk kkk kkk kkk kkk Umbria kkk kkk kkk ns kkk ns Lazio kk kkk kkk kkk kk kkk Molise si lak Basilicata kkk kkk kkk kkk kkk Calabria ipa ns ns Campania ns ns ns ns ns ns Puglia ns fa ao ns ns et Sardegna ns ESS vico ns ns ns Sicilia iz ns ns ns ns ns CV variet C campione A anno P province significativo p lt 0 0001 significativo p lt 0 001 significativo p lt 0 05 ns non significativo L uso dei GLM nell elaborazione statistica ha permesso anche di analizzare il grado di suscettibilit al DON per le sei variet in esame Nella Tabella 5 le singole cultivar sono state classificate in scala crescente in base alla sensibilit al DON per ogni Regione e per macro area Le sei variet indicate con il carattere in grassetto relativamente ad una stessa regione risultano al loro interno non significativamente differenti pertanto l ordine di suscettibilit al DON non rilevante Ci vale anche per le variet in corsivo I due gruppi contraddistinti in gra
85. l infanzia trattati secondo diverse procedure di estrazione Per entrambe le matrici la procedura di estrazione che offre il miglior compromesso tra semplicit di esecuzione e interferenza nell analisi quella che usa come solvente la miscela acetonitrile acqua in un rapporto 84 16 Affinch l immunosensore ELIME ottimizzato possa rivelare il DON nei limiti pubblicati sulla Gazzetta Ufficiale dell Unione europea l estratto deve essere seccato e risolubilizzato in un volume di acqua pari alla met di quello della miscela estraente per i cereali da colazione e in volume minore di dieci volte rispetto a quello della miscela estraente per gli alimenti per l infanzia prima della procedura di essiccazione con questo metodo non necessario alcun passaggio di purificazione Gli ottimi risultati acquisiti nei test eseguiti su campioni di cereali da colazione naturalmente contaminati dimostrano l elevata efficienza di 157 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev questo immunosensore ulteriori test sono attualmente in esecuzione allo scopo di dimostrare l effettiva trasferibilita del sistema Bibliografia N U A Nn Krska R Baumgartner S Josephs R The state of the art in the analysis of type A and type B trichothecene mycotoxins in cereals Journal of Analytical Chemistry 2001 371 285 9 Hsueh C Liu Y Freund M Indirect electrochemical detection of type B trichotecene mycotoxins Analytical Chemistry 1999 71 4075 80
86. la conferma dell esistenza di derivati mascherati non rivelabili con le tecniche analitiche comunemente impiegate che costituiscono una problematica in prodotti alimentari finiti e semilavorati nei quali il processo produttivo pu portare alla liberazione delle micotossine Bibliografia Hussein HS Brasel JM Toxicity metabolism and impact of mycotoxyns on humans and animals Toxicology 2001 167 101 34 Krska R Welzig E Boudra H Analysis of Fusarium toxins in feed Animal Feed Science and Technology 2007 137 241 64 Sudakin DL Trichothecenes in the enviroment relevance to human health Toxicology Letters 2003 143 97 107 Bennett JW Klich M Mycotoxins Clinical Microbiology Reviews 2003 497 5 16 FAO Mycotoxins of growing interest Zearalenone Proceedings of the Third Joint FAO WHO UNEP International Conference on Mycotoxins Tunis Tunisia 3 6 March 1999 MYC CONF 99 5d 1999 Unione Europea Regolamento della Commissione Europea del 28 settembre 2007 n 1126 Livelli massimi dei contaminanti nei generi alimentari GUCE L255 29 settembre 2007 N U A Nn an N Zhou B Li Y Gillespie J He G Horsley R Schwarz P Matrix design for optimization of the determination of bound deoxynivalenol in barley grain with trifluoroacetic acid TFA Journal of Agricultural and Food Chemistry 2007 55 10141 9 Berthiller F Dall Asta C Schuhmacher R Lemmens M Adam G Krska R Masked mycotoxins
87. livelli massimi di alcuni contaminanti negli alimenti fissa un limite massimo per AFM di 0 050 ug kg per il latte e di 0 025 ug kg per il latte destinato ai lattanti mentre per 1 prodotti lattiero caseari 1 valori massimi ammissibili vanno calcolati tenendo conto della concentrazione provocata dall essiccazione o dalla trasformazione In questo studio sono state condotte alcune mini caseificazioni per la produzione di formaggio tipo grana con l obiettivo di valutare il fattore di arricchimento nella cagliata e la distribuzione dell AFM nei prodotti derivanti dal processo di caseificazione Materiali e metodi Caseificazioni Lo studio ha previsto per 5 giorni non consecutivi la raccolta di latte ottenuto da alcune vacche alimentate il giorno precedente con mais naturalmente contaminato da AFB Il latte di ogni mungitura stato quindi utilizzato per due differenti processi di trasformazione casearia tipo grana per un totale di 10 caseificazioni queste sono state eseguite su scala ridotta utilizzando 20 25 L di latte L analisi per la determinazione di AFM stata eseguita nel latte intero nella crema di affioramento panna nel latte di caldaia nel siero innesto nella cagliata nel siero cotto nella ricotta nella scotta siero residuo della produzione della ricotta nel burro e nel latticello Figura 1 Un aliquota di 200 mL per i campioni liquidi e di 50 200 g per quelli solidi stata conservata a 20 C fin
88. micotossine in esame In Figura 2 sono infine riportati due esempi di cromatogrammi ottenuti dall analisi di campioni di mais A e frumento B naturalmente contaminati 100 Me Hig ZEA DON OTA 0 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Time min Time min A B Figura 2 Cromatogrammi TIC di un estratto di mais naturalmente contaminato da 5 ug kg DON 72 pg kg FB4 16 pg kg FB2 0 5 pg kg ZEA e 0 3 pg kg OTA A e un estratto di frumento naturalmente contaminato da 2 4 pg kg DON 55 2 ug kg HT 2 7 4 pg kg ZEA e 1 6 pg kg OTA B Nell ambito di questo lavoro stato inoltre valutato l effetto matrice sulla ionizzazione degli analiti con un test statistico Student t test che determina la significativit della differenza di pendenza tra le rette di calibrazione ottenute con soluzioni standard preparate in fase mobile e in estratti di cereali purificati su colonnina ad immunoaffinit I risultati di questo studio hanno mostrato un effetto matrice statisticamente significativo in soli 4 casi su 29 ovvero per Aflatossine e Ocratossina A in estratti di mais e Zearalenone in estratti di orzo In tutti gli altri casi invece l effetto matrice era trascurabile La calibrazione in matrice rimane pertanto necessaria per un analisi quantitativa accurata Considerando i limiti di rivelabilit sopra riportati si evince come la purificazione e la concentrazione del campione mediante colonnine ad immunoaffin
89. ogni analita sono 0 5 1 1 5 x limite massimo LM Sono eseguite almeno 2 sessioni analitiche ad almeno due settimane di distanza l una dall altra per la stima della precisione e del recupero del metodo secondo lo schema per ogni seduta analitica 6 ripetizioni per livello Variare se possibile alcuni fattori es operatore lotti di reagenti strumento in modo che la variabilit dei risultati sia influenzata dal maggior numero di fattori possibile a parit di procedura analitica I dati ottenuti usando lo Standard Interno SI portano a risultati gi corretti per il recupero Il recupero effettivo del metodo pu essere calcolato soltanto mediante l utilizzo di una standardizzazione esterna eventualmente con rette in matrice per i metodi con rivelazione in spettrometria di massa oppure mediante materiale di riferimento certificato Certified Reference Material CRM Criteri di rendimento I criteri di rendimento comuni per i metodi di conferma sono conferma mediante co cromatografia larghezza del picco cromatografico a met dell altezza massima entro il 90 110 tempo di ritenzione 2 5 per cromatografia liquida LC 0 5 per gas cromatografia GC uso se disponibile di un SI Cromatografia liquida fluorimetria e cromatografia liquida Diode Array Detector Per i metodi di cromatografia liquida High Performance Liquid Chromatography HPLC con rivelatore fluorimetrico o con rivelato
90. relativo alla percentuale di anacardi utilizzata nelle preparazioni che di solito non viene dichiarata in etichetta in quanto nelle preparazioni esaminate gli anacardi non costituiscono ingrediente caratterizzante Sono stati prelevati 28 campioni di prodotti finiti dei quali n 22 pesti di basilico e n 6 salse di noci tutti contenenti fra gli ingredienti gli anacardi utilizzati da soli n 5 campioni o con altra frutta a guscio pinoli o noci variet Juglans regia la percentuale di utilizzo degli anacardi da parte delle diverse aziende risultata variabile dal 4 al 35 circa mentre i pinoli 125 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev presenti in 17 dei 22 pesti sono risultati utilizzati in percentuale generalmente molto esigua valore medio 1 3 e le noci utilizzate nella sola salsa di noci in percentuale fra il 17 e il 56 Il campione globale stato effettuato presso ogni azienda facendo riferimento alla dimensione della partita prodotta I campioni sono stati analizzati dal laboratorio del Dipartimento di Genova dell Agenzia Regionale Protezione Ambiente Liguria ARPAL in cromatografia liquida ad alta risoluzione con rilevazione fluorimetrica previa derivatizzazione post colonna e purificazione in colonna di immunoaffinit Risultati Sono risultati positivi per Aflatossine n 24 dei 28 campioni analizzati con una incidenza di contaminazione pari all 86 limite di rivelazione 0 015 ug kg i valori massimi riscontrati sono st
91. ripetibilit r 2 8 x s deviazione standard relativa Relative Standard Deviation RSD s valore medio x 100 in condizioni di riproducibilit Spr scarto tipo o deviazione standard calcolata riproducibilit R 2 8 x sp deviazione standard relativa RSDr sg valore medio x 100 riproducibilit intra laboratorio S misurata all interno dello stesso laboratorio con lo stesso metodo sullo stesso materiale da saggio da differenti operatori strumenti ad intervalli di tempo relativamente lunghi Per il calcolo eseguire l analisi quantitativa per ogni sessione analitica poi verificare la normalit dei dati ottenuti ed escludere eventuali outliers Per ogni sessione di lavoro e ogni livello di fortificazione calcolare il valore medio lo scarto tipo s e PRSD Effettuare per ciascun livello un analisi della varianza ANOVA tra le sedute di validazione Calcolare quindi lo scarto tipo di ripetibilit s e di riproducibilit intra laboratorio S Verificare che i valori di RSD soddisfino i criteri riportati nella legislazione in funzione del livello di fortificazione effettuato Limite di rivelazione Il LOD la minima quantit rivelabile in base al rapporto segnale rumore S N LOD 3 3 x sa b oppure LOD 3 3 x og b dove a intercetta retta media dei recuperi b coefficiente angolare retta media dei recuperi Sa scarto tipo dell intercetta Gg scarto tipo del segnale dei
92. rivelabili solo Fumonisine nella loro forma nativa Cio dimostra che gli enzimi coinvolti nei processi digestivi a amilasi nella saliva pepsina nel succo gastrico pancreatina e lipasi nel succo duodenale sono in grado di distruggere l interazione Fumonisina matrice portando cos alla liberazione della frazione nascosta altrimenti non rivelabile senza l applicazione di uno step di idrolisi chimica Digestione in vitro di campioni di mais e prodotti a base di mais Al fine di valutare la biodisponibilit delle Fumonisine nel piccolo intestino nella seconda parte del presente studio il protocollo di digestione stato impiegato nell analisi di campioni di granella di mais e di prodotti a base di mais I livelli di Fumonisine riscontrati dopo digestione sono stati confrontati con quelli riferiti alle Fumonisine libere estraibili I risultati sono riassunti in Figura 6 relativa all analisi di campioni di granelle di mais e in Figura 7 che invece riporta il confronto tra Fumonisine totali libere e Fumonisine totali rivelate dopo digestione relativamente ai prodotti a base di mais 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 T7 10000 5000 a Concentrazione ng g SISSI AISI IAN M05 M09 M14 M28 M31 M33 M34 M37 M38 M40 M42 M43 M44 M45 M46 M47 M48 M49 M52 M54 M55 M57 M60 Z totali libere ZA totali
93. salute umana la Commissione adotta condizioni particolari per l alimento proveniente da tutto il Paese terzo o da parte del suo territorio art 53 comma 1 lettera b del Reg CE 178 2002 Nel caso di micotossine il Comitato Scientifico dell Alimentazione Umana ha constatato che I Aflatossina B una potente sostanza cancerogena genotossica che anche a livelli minimi accresce il rischio di cancro al fegato Rappresentando l Aflatossina B una minaccia per la salute pubblica nella Comunit sono state adottate condizioni particolari a livello comunitario per l importazione di particolari prodotti alimentari a rischio contaminazione da questa micotossina La Commissione europea ha quindi adottato la Decisione n 2006 504 CE e s m che stabilisce condizioni particolari per l importazione di determinati prodotti alimentari da alcuni Paesi terzi a rischio contaminazione da Aflatossine Brasile Cina Egitto Iran Turchia In sintesi sono oggetto della decisione le noci brasiliane dal Brasile le arachidi da Cina e Egitto i pistacchi dall Iran i fichi secchi le nocciole e i pistacchi dalla Turchia le mandorle dagli USA nonch i relativi prodotti trasformati composti o contenenti una quantit rilevante degli stessi gt 10 L importazione di questi prodotti nella Comunit deve avvenire solo attraverso uno dei punti di entrata designati PED elencati nell Allegato II della decisione I punti di entrata designati in
94. tali metaboliti dovuta all elevata somiglianza strutturale con la sfingosina che ne determina la capacit di inibire l enzima ceramide sintasi portando ad un accumulo intracellulare di sfingoidi con un conseguente aumento del rapporto sfinganina sfingosina 3 Le Fumonisine del gruppo B sono pertanto responsabili di diverse tossicosi sugli animali tra cui leucoencefalomalacia equina ELEM ed edema polmonare suino PPE Sull uomo esiste invece una correlazione statistica tra l esposizione ad FB e l incidenza di cancro esofageo 1 Per queste ragioni le Fumonisine sono state inserite dalla ARC International Agency of Research on Cancer all interno della classe 2 B della quale fanno parte le sostanze potenzialmente cancerogene per l uomo Con il Regolamento 1126 2007 l Unione Europea ha definito i limiti massimi di Fumonisine totali accettabili nelle materie prime semilavorati e prodotti finiti adibiti ad uso umano 4000 pg kg per mais non processato 1000 ug kg per mais destinato al consumo umano 800 ug kg per cereali per la prima colazione e snack a base di mais e 200 ug kg per gli alimenti destinati all infanzia 4 Recentemente emerso che nelle materie prime e negli alimenti contaminati da micotossine possono essere presenti oltre alle forme native diversi derivati coniugati con gruppi maggiormente polari o associati covalentemente o non covalentemente con i macrocostituenti della matrice noti come micotossine coniu
95. terreni solidi agarizzati di cui uno semiselettivo ossia il MEA Malt Extract Agar contenente antibiotici cloramfenicolo e clorotetraciclina e l altro MEA B Malt Extract Boscalid Agar reso selettivo per l aggiunta del fungicida Boscalid alla concentrazione di 5 mg L Cantus che inibisce la crescita delle specie appartenenti al genere Aspergillus ma favorisce lo sviluppo di A carbonarius 7 La lettura delle piastre poste in incubazione a 25 C stata effettuata dopo circa 3 giorni Identificazione molecolare di Aspergillus carbonarius Le indagini molecolari hanno previsto una prima fase di estrazione del DNA dai campioni di mosto e dalle piastre dove sono cresciute le colonie Queste ad un esame macroscopico hanno mostrato le tipiche caratteristiche del micelio di Aspergillus Successivamente stata applicata la tecnica di PCR Polymerase Chain Reaction Per l estrazione del DNA il protocollo si basato sull applicazione di un kit commerciale che unisce l efficacia della cromatografia con la velocit della centrifugazione Il kit utilizza colonnine che sfruttano il principio di affinit del DNA ad una membrana di silice che lo cattura e successivamente viene eluito mediante un opportuno buffer Dopo avere estratto il DNA si proceduto con l amplificazione Il target scelto un frammento interno al dominio AT del gene PKS che codifica per l enzima polichetido sintetasi di A carbonarius stata quindi messa a p
96. titolo noto La presenza di MDA nel lisato stata rilevata mediante RP HPLC Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography dopo derivatizzazione con dinitrofenilidrazina DNPH Sigma Chemical Co St Louis MO USA a 25 C 21 L analisi HPLC stata condotta con un sistema SpectraSystem Thermo Separation Product Riviera Beach FL USA equipaggiato con colonna Ultrasphere ODS 250 x 4 6 mm I D 5 um Beckman Instruments Inc Fullerton CA USA I campioni e gli standard sono stati iniettati manualmente 100 uL mediante una valvola a sei vie Rheodyne L P Rohnert Park CA USA L eluizione isocratica 1 mL min stata effettuata a temperatura ambiente usando una fase mobile acetonitrile acetato d ammonio 50 mM 45 55 In tali condizioni il complesso MDA DNPH ha fatto registrate tempi d eluizione di circa 8 2 minuti e il picco d assorbanza stato determinato a 307 nm mediante DAD UV6000 Diode Array Detector Thermo Separation Product Riviera Beach FL USA La curva di taratura stata sviluppata come indicato da Fenaille et al 21 al fine di quantificare la MDA nel range 0 0 3 0 nmol mL R 0 9989 L integrazione dell area del picco cromatografico e la stima della concentrazione della MDA sono stati effettuate mediante il software ChromQuest 3 0 ThermoQuest Inc San Jose CA USA L RNA RiboNucleic Acid messaggero per gli enzimi superossido dismutasi SOD e Rapporti ISTISAN 10 32 Rev glu
97. validazione del test ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay secondo quanto previsto dalla norma UNI CEI EN ISO IEC 17025 2005 1 e dalla normativa comunitaria Per le micotossine il Reg CE 401 2006 2 ha indicato i requisiti di prestazione solo dei metodi di prova quantitativi il Reg CE 882 2004 3 in allegato III prevede i parametri analitici da valutare nella validazione di tutti i metodi di prova esattezza applicabilit LOD Limit of Detection LOQ Limit of Quantification ripetibilit riproducibilit intra laboratorio recupero specificit selettivit linearit della risposta incertezza di misura ed eventualmente altri parametri analitici a scelta del laboratorio In questo lavoro descritto uno schema generale per la valutazione delle prestazioni di un kit ELISA per la rivelazione dell Aflatossina M AFM nel latte di massa e termicamente trattato La Commissione Europea ha fissato il limite massimo di AFM a 0 050 ug kg nel latte di massa e termicamente trattato 4 Il metodo stato validato intra laboratorio per l analisi di screening qualitativo secondo i criteri descritti dalla linea guida dei settori chimici degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali 5 e applicato al latte bovino bufalino ovi caprino sia di massa che termicamente trattato In conformit a quanto previsto dal Reg CE 882 2004 sono stati valutati l applicabilit del kit la specificit l intervallo della risposta lineare il
98. valore F Gruppo dei campioni bianchi Gruppo dei campioni fortificati F calculato 1 31 3 04 F tabulato 3 18 3 18 I campioni bianchi sono stati fortificati a 0 004 ng g il LOQ e analizzati contestualmente ai bianchi durante 2 sessioni analitiche Anche in questo caso stata verificata l omoschedasticit dei dati dei due gruppi Tabella 3 A questo punto sono state comparate le due serie di risultati mediante un t test ad una coda per dati appaiati p 0 05 Tabella 4 il valore di t critico 1 734 gt t calcolato 1 64 x 108 dimostra che le medie dei due gruppi sono statisticamente differenti Il semi intervallo di confidenza del segnale dei bianchi campione stato calcolato con la formula S 2 9617 Gee 94 63 n dove So il segnale medio dei 20 bianchi campione t il t Student tabulato per 19 gradi di libert per il test a 1 coda e p 0 05 n il numero di prova 20 so la radice quadrata della varianza del segnale dei 20 bianchi campione Nessun campione fortificato ha mostrato un segnale B Bo gt 94 63 pertanto tutti sono individuate come positivi In questo modo si dimostra che l errore B del saggio lt 5 a 0 004 ng g questa concentrazione rappresenta anche la capacit di rivelazione il CCB del metodo 214 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev ovvero il livello al di sopra del quale la presenza di AFM nel campione rivelata con una probabilit gt 95 Il risultato del t test ad una c
99. whole genome oligoarrays validated for genomotyping deletion mapping and gene expression analysis on Staphylococcus aureus BMC Genomics 2005 6 95 108 Leiske DL Karimpour fard A Hume PS Fairbanks BD Gill RT A comparison of alternative 60 mer probe designs in an in situ synthesized oligonucleotide microarray BMC genomics 2006 7 72 81 Ruby EG Urbanowski M Campbell J Dunn A Faini M Gunsalus R Lostroh P Lupp C McCann J Millikan D Schaefer A Stabb E Stevens A Visick K Whistler C Greenberg EP Complete genome sequence of Vibrio fischeri a symbiotic bacterium with pathogenic congeners Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2005 102 3004 9 152 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev SVILUPPO DI UN NUOVO SISTEMA IMMUNOELETTROCHIMICO PER LA DETERMINAZIONE DEL DEOSSINIVALENOLO Daniela Romanazzo Silvia Vesco Giulia Volpe Francesco Ricci Danila Moscone Giuseppe Palleschi Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche Universit di Roma Tor Vergata Roma Introduzione Il Deossinivalenolo o DON appartiene alla famiglia dei sesquiterpenoidi detti Tricoteceni metaboliti secondari prodotti da funghi del genere Fusarium La maggior parte delle materie prime vegetali suscettibile di contaminazione da parte di queste tossine e la loro presenza nei prodotti agricoli continua ad essere un problema mondiale a causa dell azione tossica esercitata sull uomo e sugli animali I numerosi T
100. 0 1 Mais 2 4 1 0 1 4 7 0 2 4 7 0 1 4 2 0 1 3 6 0 1 Mais 3 2 4 0 1 2 7 0 1 2 5 0 1 24 0 1 2 2 0 1 Conclusioni Dai risultati ottenuti risulta evidente come il metodo che prevede l utilizzo di metanolo per estrarre AFB in mangimi contenenti sequestranti pu dare risultati errati e portare a decisioni manageriali scorrette negli allevamenti Prove su campioni naturalmente contaminati con e senza aggiunta di sequestranti hanno dimostrato inoltre come le miscele acetone acqua nei rapporti 70 30 e 60 40 v v risultino avere la pi alta efficienza di estrazione Bibliografia 1 Stroka J Petz M Joerissen U Anklam E Investigations of various extractant for the analysis of aflatoxin BI in different food and feed matrices Food Additives and Contaminants 1999 16 331 8 2 Aflatoxin B1 in cattle feed In Horwitz W Ed Official methods of analysis of the AOAC International 2006 18 ed vol I Chapter 49 Maryland USA AOAC International 2006 Method 2003 02 p 38 238 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev SVILUPPO E APPLICAZIONE DI UN NUOVO SISTEMA ELISA PER L ANALISI DI SCREENING DELL OCRATOSSINA A NEL CIOCCOLATO Chiara Tarantino a Emanuela Iafrate b Erica Bastiani a Maria Giovanna Perrotta a Francesca Gombac a Valentina Pellis a Carlo Brera b a Euroclone SpA Life Science Division Milano b Dipartimento Sanita Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Istituto Superiore di Sanita Roma Introduzio
101. 0 34 2 2 335 2 59 2 08 2 79 2 34 2 58 3 1 285 1 44 1 13 1 65 1 29 1 19 4 1 830 1 97 1 69 2 71 1 83 1 83 5 1 115 1 17 1 06 1 31 1 12 1 13 6 0 947 1 05 0 84 0 92 0 95 0 99 I campioni con livelli di DON superiore a 2 mg kg mostrano la pi alta variazione dei risultati con ciascun test mentre nell intervallo 0 5 2 mg kg la variabilit significativamente pi bassa Questo indica che la maggiore variabilit dei risultati con il sistema a flusso laterale nei confronti dell analisi HPLC dipende in misura importante dalla variazione della contaminazione di micotossina nei campioni La mediana dei metodi messi a confronto presenta una sorprendente elevata conformit Tabella 2 La ripetibilit delle misure e la conferma con altri metodi garantisce statisticamente il risultato in caso di incertezza 217 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 2 Risultati del ring test con metodo RIDA QUICK DON RIDA QUICK SCAN per l analisi di DON in campioni di grano Laboratori Campioni grano 1 2 3 4 5 6 Lab 1 lt 0 5 1 78 1 08 1 44 1 15 1 02 Lab 2 lt 0 5 1 67 lt 0 5 1 95 1 28 0 78 Lab 3 lt 0 5 2 41 1 35 2 43 1 39 1 20 Lab 3 repet lt 0 5 2 91 1 59 1 32 Lab 4 lt 0 5 2 21 1 13 1 8 1 42 1 09 Lab 4 repet lt 0 5 1 97 1 23 2 06 1 29 1 02 Lab 5 lt 0 5 2 54 1 75 2 35 1 29 1 40 Lab 6 lt 0 5 2 52 1 62 2 04 lt 0 5 0 92 Lab 6 repet lt 0 5 1 32 1 28 0 89 Mediana 2 34 1 32 2 00 1 29 1 02 Media 2 26 1 37 1 99 1 28 1 06
102. 0 43 0 84 0 02 7 25 0 49 0 60 0 06 Myco AD AZ 6 68 0 53 4 91 0 70 6 37 0 12 2 85 0 14 NovasilTM plus 7 41 0 63 0 83 0 04 5 58 0 14 0 60 0 08 Dal confronto tra i diversi sequestranti si osserva come i mangimi addizionati con carbone ed estratti con la miscela acetone acqua 85 15 v v evidenziano percentuali di recupero significativamente inferiori la percentuale di recupero stata pari al 54 e al 38 rispettivamente per i mangimi con aggiunta di sequestrante al 1 e al 2 Successivamente da campioni naturalmente contaminati alcuni addizionati con uno dei sequestranti considerati ATOX al 2 stata effettuata in quadruplo l estrazione delle AF usando diverse miscele acetone H O Tabella 3 I risultati indicano che le miscele acetone acqua nei rapporti 70 30 v v e 60 40 v v hanno una efficienza di estrazione riguardo all AFB leggermente superiore rispetto alla miscela 85 15 v v usata nel metodo AOAC 237 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 3 Contenuto medio di AFB ug kg in alcuni prodotti usando diverse miscele estraenti Campione Acetone H20 Acetone H20 Acetone H20 Acetone H20 Metanolo H20 85 15 70 30 60 40 50 50 80 20 Mangime 1 145 8 1 3 166 2 5 7 164 8 3 6 153 8 3 9 124 7 6 Mangime 1 ATOX 118 0 3 2 129 0 3 5 129 7 4 7 121 6 4 0 19 8 0 9 2 Mais 1 21 3 0 4 22 5 0 5 24 5 0 8 21 2 0 8 18 5 0 7 Mais 1 ATOX 2 21 5 0 6 23 4 0 5 23 0 0 9 21 3 1 2 1 6
103. 0 6 00 8 00 10 00 12 00 14 00 16 00 18 00 2000 2200 2400 26 00 28 00 30 00 Figura 2 Cromatogrammi delle transizioni di quantificazione per DON ZEA T2 e HT 2 in un campione di cereali contaminato a livelli prossimi ai limiti di legge I recuperi delle IAC multimicotossine DZT sono stati confrontati con i recuperi medi ottenuti dai controlli di qualit interni effettuati con le IAC singole Donprep e Easy Extract Zearalenone R Biopharm Rh6ne LTD durante gli ultimi 3 anni di lavoro Per entrambi i livelli di contaminazione le prestazioni delle IAC multi micotossine sono inferiori a quelle delle IAC singole pur rientrando nei criteri di rendimento stabiliti dal Reg CE 401 2006 2 Il valore di recupero pi critico quello del DON al livello di contaminazione del limite di legge dei baby food Controllo di campioni commerciali Il metodo stato utilizzato per l analisi di 37 campioni 11 cereali per la prima colazione e 16 baby food prelevati nel 2009 nell ambito del piano regionale per il controllo delle micotossine della Regione Emilia Romagna I risultati sono riportati in Tabella 5 Nessuno dei campioni presenta livelli di contaminazione superiori ai limiti di legge AFLA e OTA risultano sempre inferiori al limite di rivelazione La met dei campioni di cereali per la prima colazione contaminata da DON la presenza di ZEA stata trovata in 3 campioni Le Tossine T2 e HT 2 sono state rilevate in 4 campioni 2 di cereali e 2 di
104. 00 kV temperatura della sorgente ESI 80 C temperatura di desolvatazione 160 C flusso del gas di desolvatazione 250 L h il gas azoto ed prodotto dal generatore High Purity Nitrogen Generetor Peak Scientific Scozia L ottimizzazione dei parametri del metodo HPLC MS MS si ottenuta con una scansione in modalit MS scan in un range di valori di massa su carica m z di 600 800 che ha evidenziato la presenza dello ione M H m z 722 4 per 1 FB e lo ione M H m z 706 4 per 1 FB Si quindi eseguita una scansione in MS MS per determinare gli ioni frammento per entrambe le tossine Per FB il frammento m z 334 6 risultato il pi abbondante stato utilizzato per la quantificazione e il 352 4 per la conferma per l FB il 336 7 stato individuato per la quantificazione e il 318 6 per la conferma La Tabella 1 riassume i parametri di tuning dello ione precursore e dei frammenti selezionati per entrambe le Fumonisine 142 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 1 FB e FB2 parametri di tuning dello ione precursore e dei frammenti selezionati Analiti Tr Voltaggio Transizione di Energia di Transizione Energia di cono V quantificazione collisione eV di conferma collisione eV FB 16 6 45 0 722 4 gt 334 6 40 00 722 4 gt 352 4 40 00 FB2 17 6 45 0 706 4 gt 336 7 40 00 706 4 gt 318 6 40 00 La separazione avviene con una colonna Discovery C18 15 cm x 2 1 mm 5 um Supelco Milano Italia alla temp
105. 01 2006 2 Determinazione simultanea di DON ZEA e tossine T2 e HT2 DZT Quattro rette di taratura sono state ottenute partendo da una soluzione standard di lavoro in metanolo acqua 1 4 v v 5mM di ammonio acetato contenente le quattro micotossine in miscela alle seguenti concentrazioni DON 12 ug mL ZEA 1 5 ug mL T2 e HT 2 2 ug mL 207 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Sono stati analizzati 4 livelli di concentrazione negli intervalli DON 60 480 ng mL ZEA 7 5 60 ng mL T2 e HT 2 10 80 ng mL Il coefficiente di correlazione sempre maggiore di 0 99 Il limite di rivelazione di 60 ug kg per DON e 10 ug kg per ZEA T2 e HT 2 sia peri baby food sia per i cereali Le prestazioni delle IAC DZT R Biopharm Rh6ne LTD sono state valutate con 6 prove ripetute a due livelli di contaminazione prossimi ai limiti di legge 1 per i cereali adulti e i baby food Un campione bianco di cereali per la prima colazione e uno di farina per l alimentazione destinata alla prima infanzia sono stati contaminati mediante aggiunta della soluzione standard di lavoro utilizzata per la retta di taratura ai livelli indicati in Tabella 4 I cromatogrammi delle transizioni per i campioni contaminati ai due livelli baby e adulti sono riportati nelle Figure 1 e 2 Tabella 4 Recuperi delle colonnine DZT confrontati con quelli delle IAC singole Analita Livello di Contaminazione ug kg R AC DZT R IAC Singole DON cereali 480 75 9g 0 baby food
106. 1 20 0 1 0 0 0 22 12 2004 C 100 2 28 15 37 23 15 220 NC 6 7 0 0 0 0 0 13 6 2005 C 125 0 48 10 6 1 0 190 NC 11 4 2 0 0 0 0 17 9 2006 C 63 1 51 13 20 2 0 150 NC 21 1 6 1 0 0 0 29 19 2007 C 94 4 37 4 20 11 4 174 NC 8 2 2 5 0 0 0 17 10 2008 C 60 2 27 3 12 8 3 115 NC 17 4 4 3 1 0 0 29 25 Sono compresi campioni di cereali destinati ad uso zootecnico I campioni sui quali stata effettuata la ricerca di Aflatossine Tabella 3 sono pi numerosi rispetto a quelli sui quali stato determinato il contenuto di Ocratossina A Tabella 4 Le altre micotossine Deossinivalenolo Zearalenone Patulina sono state ricercate solo su alcuni campioni di cereali e prodotti derivati dalle mele 78 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 4 Numero di campioni conformi analizzati negli anni 2001 2008 per la ricerca di Ocratossina A Campione 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Uva sultanina 30 39 16 18 20 13 9 9 Vino birra 0 0 13 15 0 0 2 0 Frutta secca 0 0 7 0 6 5 1 1 Cacao caff e derivati 1 4 5 7 3 5 1 1 Cereali 1 1 0 1 0 0 9 7 Totale 32 44 41 41 29 23 22 18 2NC Arachidi pistacchi e nocciole sono le matrici pi frequentemente analizzate rappresentano infatti il 60 80 dei campioni sui quali sono state ricercate le Aflatossine In generale il maggior numero di non conformit stato riscontrato in campioni di arachidi nocciole pistacchi e fichi secchi in percentuali variabili nell arco degli anni esaminati inolt
107. 1 2006 Giornale Ufficiale dell Unione Europea L364 5 24 Unione Europea Direttiva della Commissione Europea 31 ottobre 2003 n 2003 100 CE Giornale Ufficiale dell Unione Europea L285 33 37 United States Department of Agriculture Grain Inspection Packers and Stockyards Administation Federal Grain Inspection Service Performance evaluation criteria for aflatoxin test kits Program Notice FGIS PN 04 15 del 16 giugno 2004 Unione Europea Direttiva della Commissione Europea 16 luglio 1998 n 98 53 CE Giornale Ufficiale dell Unione Europea L201 93 101 203 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev ANALISI MULTIRESIDUO DI MICOTOSSINE IN CEREALI PER LA PRIMA COLAZIONE E BABY FOOD CON TECNICA HPLC FLUORIMETRO E HPLC MS MS Maria Ferrari Barbara Romagnoli Cecilia Bergamini Riferimento Analitico Regionale RAR Alimenti OGM e Biosicurezza Agenzia Regionale Protezione Ambiente dell Emilia Romagna Sezione Provinciale di Bologna Bologna Introduzione La normativa europea prevede limiti per diverse classi di micotossine nei cereali destinati all alimentazione umana al momento sono fissati i livelli massimi per Aflatossine AF Ocratossina A OTA Deossinivalenolo DON e Zearalenone ZEA mentre si stanno valutando i limiti per le Tossine T2 e HT 2 1 Al fine di realizzare un attivit di controllo efficace ed efficiente che consenta di monitorare tutte le micotossine normate in un elevato numero di campioni ottimizzando i te
108. 1 89e4 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00 14 00 16 00 18 00 20 00 22 00 24 00 Fapas T2255 MRM of 4 Channels ES ae 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00 14 00 16 00 18 00 20 00 22 00 24 00 MRM of 4 Channels ES 706 4 gt 336 65 17 88 FB2 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00 14 00 16 00 18 00 20 00 22 00 24 00 Fapas T2255 MRM of 4 Channels ES 47 54 706 4 gt 318 62 4 FB 1 69e4 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00 14 00 16 00 18 00 20 00 22 00 24 00 Fapas T2255 a MRM of 4 Channels ES 1 TIC sci a 2224 9864 Time 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00 14 00 16 00 18 00 20 00 22 00 24 00 Figura 1 Cromatogrammi delle due transizioni delle Fumonisine del ring test del FAPAS T2255 FB 389 ug kg FB2 228 pg kg Valutazione della ripetibilit del sistema HPLC MS MS Mediante 10 iniezioni successive di una miscela dei due standard FB e FB si valutata la performance dello strumento calcolando la deviazione standard percentuale dei tempi di ritenzione e dei picchi come indicato in Tabella 3 Tabella 3 Deviazione Standard DS percentuale dei tempi di ritenzione Tr e delle aree dei picchi cromatografici ottenuti iniettando 10 volte uno standard di FB e FB per la valutazione della ripetibilit Analita DS Tr DS Area FB 9 8 0 08 FB2 9 3 0 11 144 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev I valori ottenuti confermano il buon funzionamento della strumentazione in uso e l adeguata scelta ef
109. 150 E130 E115 E10 E 5 100 75 50 30 15 10 5 Er MONTECARLO E 100 Ep90 E80 Ep70 100 90 80 70 1 Tutte le SU generate presentano la stessa probabilit di essere contaminate entro il range definito da due valori MINC SU e MAXC SU Figura 1 simmetrici rispetto al valore nominale della sub partita 5 g kg La cantaminazione dell intera sub partita associata in maniera casuale ad una percentuale variabile del totale delle SU create nella simulazione mediante generatore stocastico di Monte Carlo 3 Per la serie E 100 E 5 le copie di valori MINC SU MAXC SU hanno assunto i seguenti valori 10 0 8 75 1 25 7 5 2 5 6 5 3 5 5 75 4 25 5 5 4 5 5 25 4 75 Per la sesie E 100 E 70 la percentuale di SU non contaminate assunta pari rispettivamente a 0 10 20 e 30 Il campionamento effettuato dal sub modello GENERATORE CAMPIONI GLOBALI vedi Figura 1 che sistematicamente estrae i campioni elementari e ne effettua il pooling La frequenza di campionamento viene stabilita sulla base del numero di campioni elementari che devono essere estratti dalla sub partita e il numero totale delle unit di campionamento FREQUENZA CAMPIONARIA N IS N MAX SU Le simulazioni sono state effettuare considerando la possibilit di operare estraendo 4 8 20 e 40 campioni incrementali N IS per ogni sub partita costituita da 27645 SU Per ogni combinazione di Er Ex e numero di campioni elementari N IS sono stat
110. 190 60 ZEA cereali 60 70 1080 baby food 20 70 T2 cereali 80 90 baby food 30 95 Non testato HT 2 cereali 80 90 baby food 30 95 Non testato Donprep R Biopharm Rh ne LTD Easy Extract Zearalenone R Biopharm Rh6ne LTD 1 MRM of 4 Channels ES 19 02 317 gt 160 i y 9 54e3 qura sga mi JEg aama li pensaan 8 00 26 00 28 00 30 00 2 MRM of 4 Channels ES 484 gt 305 57e5 22 00 24 00 6 00 10 00 12 00 14 00 20 00 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 2 MRM of 4 Channels ES 442 gt 263 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 1200 1400 16 00 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 8 00 10 00 12 00 1400 16 00 Figura 1 Cromatogrammi delle transizioni di quantificazione per DON ZEA T2 e HT 2 in un campione di baby food contaminato a livelli prossimi ai limiti di legge 208 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 1 MRM of 4 Channels ES 49 03 a 317 gt 160 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00 14 00 16 00 18 00 20 00 22 00 24 00 26 00 28 00 30 00 2 MRM of 4 Channels ES 18 15 _ 484 gt 305 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00 14 00 16 00 18 00 20 00 22 00 24 00 26 00 28 00 30 00 2 MRM of 4 Channels ES 17 49 442 gt 263 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00 14 00 16 00 18 00 20 iia 27 ia wey 00 26 00 28 00 30 00 1 MRM of 4 Channels ES 355 gt 295 i 7 10e3 qui 250 10 aiar AGG ms 2606 2138 72 1 I i H i i i Time 2 00 4 0
111. 197 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev pozzetti della micropiastra Segue la fase di lavaggio della micropiastra per eliminare tutto cid che non si legato in maniera specifica alla fase solida Il legame dell enzima all anticorpo si rileva mediante l aggiunta di una soluzione di substrato cromogeno incolore il quale viene convertito dall enzima in un prodotto di reazione colorato Dopo aver bloccato la reazione enzimatica l assorbanza viene misurata con un lettore colorimetrico di micropiastre a 450 nm I segnali di assorbanza ottenuti vengono trasformati in segnale di assorbanza relativo OD OD dello standard zero x 100 B B0 I risultati sono stati elaborati con il software Magellan Tecan Per la curva standard possono essere impiegate l elaborazione punto a punto la retta di regressione lineare o la cubic spline senza significative differenze nei dosaggi Campioni Sono stati analizzati campioni di cereali mais germe di mais mangimi nocciole noci arachidi pistacchi uvetta fichi secchi Sono stati impiegati campioni di riferimento FAPAS campioni fortificati e campioni naturalmente contaminati I campioni sono stati estratti per 3 minuti con soluzioni metanoliche e successiva filtrazione Whatman n 1 secondo quanto riportato per ciascuna matrice nel libretto di istruzioni del kit Celer AFLA B Risultati Caratteristiche del saggio Il kit Celer AFLA B un ELISA specifico per la determinazione quantitativa d
112. 2003 I Manuali di ARPA 3 Unione Europea Regolamento CE n 1126 2007 della Commissione del 28 settembre 2007 che modifica il reg CE n 1881 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari per quanto riguarda le Fusarium tossine nel granoturco e nei prodotti a base di granoturco GUCE L 255 29 settembre 2007 151 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 4 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Unione Europea Regolamento CE n 401 2006 della Commissione del 26 febbraio 2006 Metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari GUCE L 70 9 marzo 2006 Joint FAO WHO Expert Committee on Food Additives Evaluation of certain mycotoxins in food Fifty sixth report of the Joint FAO WHO Expert Committee on Food Additives Geneva WHO 2002 WHO Technical Report Series No 906 16 26 Scientific Committee on Food Opinion of the Scientific Committee on Food on Fusarium toxins Part 3 Fumonisin B1 FB1 Expressed on 17 October 2000 Brussels European Commision 2000 SCF CS CNTM MYC 24 Final Scientific Committee on Food Updated opinion of the Scientific Committee on Food on Fumonisin Bl B2 and B3 Expressed on 4 April 2003 Brussels European Commision 2003 SCF CS CNTM MYC 28 Final Gelderblom WCA Cawood ME Snyman SD Vleggaar R Marasas WFO Structure activity relationships of fumonisins in short ter
113. 3 1 data da 11 2 mg L FB 5 6 mg L FB2 I dati sono stati sottoposti ad analisi statistica utilizzando il software Gene Spring GX L analisi della varianza 1 way ANOVA con correzione per confronti multipli FDR p lt 0 05 ha evidenziato che il profilo trascrizionale indotto da FB FB significativamente differente rispetto a quello associato alle molecole singole che invece differiscono per pochissimi geni La Figura 6 riporta l andamento dei segnali di intensit normalizzati e i risultati della Principal Component Analysis I risultati preliminari ottenuti sono incoraggianti e confidiamo nel fatto che l interpretazione biologica delle liste geniche ottenute contribuisca a delucidare i meccanismi d azione che la combinazione delle molecole esercita su V fischeri 150 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev FB1 FB2 Normalized Intensity Values 16COMB fb1 fb2 TREATMENT Figura 4 Effetto su V fischeri dovuto a trattamento con FB e FB2 e loro combinazioni andamento delle intensit di segnale normalizzate A e Principal Component Analysis B Bibliografia 1 R Biopharm Rhone LTD Instruction for use for detection of fumonisins BI B2 and B3 using HPLC Version P31 V5 26 01 05 2 Tenaglia H Venturini E Raffaelli R Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dell incertezza di misura Accreditamento e certificazione Bologna Agenzia Regionale Prevenzione e Ambiente dell Emilia Romagna
114. 5 16 17 18 19 20 2 22 23 24 25 26 AR 28 29 30 Bodine AB Fisher SF Gangjee S Effect of Aflatoxin Bl and major metabolites on phytohemeagglutinin stimulated lymphoblastogenesis of bovine lymphocytes Journal of Dairy Science 1984 67 1 110 4 Neldon Ortiz DL Qureshi MA The effects of direct and microsomal activated aflatoxin B1 on chicken peritoneal macrophages in vitro Veterinary Immunology and Immunopathology 1992 31 61 76 Lee MG Li S Jarvis BB Pestka JJ Effects of satratoxins and other macrocyclic trichothecenes on IL 2 production and viability of EL 4 thymoma cells Journal of Toxicology and Environmental Health 1999 57 459 474 Berek L Petri IB Mesterhazy A T ren J Molnar J Effects of mycotoxins on human immune functions in vitro Toxicology in Vitro 2001 15 25 30 Bernabucci U Ronchi B Lacetera N Nardone A Influence of body condition score on relationships between metabolic status and oxidative stress in periparturient dairy cows Journal of Dairy Science 2005 88 2017 26 Bernabucci U Ronchi B Lacetera N Nardone A Markers of oxidative status in plasma and erythrocytes of transition dairy cows during hot season Journal of Dairy Science 2002 85 2173 9 Kusmic C Picano E Busceti CL Petersen C Barsacchi R The antioxidant drug dipyridamole spares the vitamin E and thiols in red blood cells after oxidative stress Cardiovascular Research 2000 17 510
115. 5 mL di metanolo Dopo concentrazione con flusso di No l estratto purificato stato portato a 2 mL con la miscela acetonitrile H 0 25 75 v v utilizzando un bagno ad ultrasuoni la soluzione stata miscelata filtrata 0 45 um e sottoposta ad analisi mediante HPLC Per la separazione delle AF stata utilizzata una colonna RP 18 Superspher Merck con fase mobile H 0 metanolo acetonitrile 64 23 13 v v a flusso 0 5 mL min la rivelazione fluorimetrica stata effettuata Acccitazione 305 nm e Aecmissione 440 nm dopo derivatizzazione fotochimica post colonna Risultati e discussione Le percentuali di recupero per le diverse miscele di estrazione sono state valutate aggiungendo 0 5 mL di una soluzione standard di AFB 250 pg L a 25 g di un mangime non contaminato da AF e senza aggiunta di sequestranti in modo da avere una contaminazione di 5 0 ug kg Per ogni miscela estraente sono stati effettuati tre replicati Le percentuali di recupero medie sono state superiori al 95 per tutte le miscele di estrazione stato analizzato anche un campione di mais di riferimento certificato r Biopharm Rh ne con una contaminazione dichiarata di 4 1 ug kg i risultati medi tre replicati per estrazione sono stati 4 2 ug kg per la miscela con metanolo e 4 3 per quelle con acetone I limiti di rivelazione Limit of Detection LOD e di quantificazione Limit of Quantification LOQ sono stati rispettivamente di 0 02 e 0 05 ug kg Considerando
116. 700 g a 4 C per 10 min infine filtrata su filtro di carta Un aliquota di 30 mL del filtrato stata purificata mediante colonna di immunoaffinit R Biopharm dopo lavaggio della colonna con 5 mL di acqua distillata 1 AFM stata eluita in provetta graduata con 2 5 mL di CH30H L estratto stato quindi evaporato sotto flusso di N e ripreso con 1 mL di miscela CH3 CN H 0 25 75 agitando in bagno ad ultrasuoni e su vortex infine stato filtrato 0 45 um prima dell analisi HPLC Analisi HPLC La separazione cromatografica stata effettuata mediante colonna RP 18 125x4 0 mm Merck e fase mobile CH3CN H 0 25 75 a flusso 1 mL min AFM stata determinata con rivelazione fluorimetrica Aeccitazione 305 Aemissione 440 nm 52 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Risultati e discussione Percentuale di recupero e limiti di rivelazione Nel caso dei campioni di latte siero cotto scotta e latticello il limite di rivelazione e di quantificazione sono stati rispettivamente di 0 001 e 0 003 pg kg Per verificare l accuratezza del metodo di analisi AFM stata estratta da un campione di latte in polvere certificato con un valore di AFM pari a 0 260 ug kg FAPAS l analisi effettuata in triplo ha dato un valore medio di 0 254 0 005 ug kg Nel caso di campioni di formaggio panna burro e ricotta il limite di rivelazione e di quantificazione sono stati di 0 010 e 0 030 ug kg Per il formaggio tipo grana sono state e
117. 86 0 29 5 9 4 86 0 27 5 4 4 96 0 20 4 1 4 96 0 18 3 5 15 4 88 0 35 7 1 4 87 0 31 6 3 4 94 0 27 5 6 4 88 0 26 5 4 30 5 00 0 50 10 0 5 00 0 35 7 1 4 99 0 30 6 4 5 00 0 31 6 2 50 4 99 0 83 16 6 5 01 0 61 12 1 4 98 0 38 7 5 5 00 0 37 74 75 5 01 1 24 24 8 4 96 0 89 18 0 4 96 0 58 11 6 4 99 0 41 8 2 100 5 01 1 65 33 0 5 02 1 21 24 0 5 00 0 79 15 9 4 99 0 54 10 9 Lo sforzo di campionamento infatti produce un notevole decremento del CV per partite generate con il pi elevato grado di Ep testato Er70 CV da 20 6 a 6 7 passando da campioni globali di ca 1 5 kg a 15 kg e di E E 100 CV da 33 con 4 campioni elementari a 10 9 prelevandone 40 Figura 2 Nelle condizioni di maggiore eterogeneit della sub partita quindi un notevole sforzo di campionamento produce effetti consistenti nell ottenimento di un campione globale maggiormente rappresentativo della sub partita Figura 2a Nella casistica relativa alle condizioni di minore eterogeneit nella distribuzione del carico contaminante l aumento del numero di campioni incrementali non contribuisce altrettanto alla riduzione della variabilit del livello per i campioni globali riduzione del CV del 50 o meno Figura 2b E 100 E 70 E 30 E 100 N a m a a N o o Li o a Contaminazione da AF ug kg N a Contaminazione da AF g kg N oa 4 8 20 40 4 8 20 40 N di c
118. 9 12 1 T04102 18 10 1 20 26 10 15 4 0 9 85 5 2 8 1 6 3 9 T0486 22 97 12 86 33 08 24 8 2 5 108 11 6 1 3 3 2 0 Recupero mangimi media SD n 36 108 20 Frutta a guscio fortificata e di riferimento Nocciola 1 20 00 172414 86 7 3 9 5 1 ND Nocciola 2 11 67 117426 100 22 45405 ND Pistacchio 1 8 00 7 841 2 97 15 ND ND Pistacchio 2 116 1640 1 13447 ND ND Pistacchio 3 170 21 0 2 121411 ND ND Arachide 1 54 0 86 2 22 1 4 0 1 93 6 6 1 3 8 ND T0484 194 0 96 2 CE t 13 Noce T04117 4 35 2 44 6 27 6 83 157 ND ND Recupero frutta a guscio media SD n 25 98 18 Frutta secca fortificata e di riferimento Fico 1 2 1 9 0 2 95 11 10 8 ND Fico 2 2 1 2 9 0 2 133 8 6 1 ND Fico T0483 4 36 2 44 6 28 4 9 0 0 11441 0 3 ND Recupero frutta secca media SD n 6 113 18 ND non determinato media di 3 analisi in HPLC in tre diversi laboratori media di due determinazioni Complessivamente i recuperi per il mais addizionato nel range 2 10 ug kg il germe di mais e la maggior parte dei mangimi e della frutta a guscio rientrano nell intervallo 70 110 come richiesto nella direttiva 98 53 CE per i metodi di analisi per il controllo ufficiale 13 Tutti i valori di recupero ottenuti per i campioni contaminati con quantit di AFB pari o superiore a 5 ug kg rientrano nei requisiti del United States Department of Agriculture s USDA Grain Inspection Packers and Stockyards Administration G
119. A Media Campione Globale Figura 2 Concentrazione ng g di Aflatossina B nei tre campioni di laboratorio anno 2008 e concentrazione media del campione globale A arachidi N nocciole P pistacchi F fichi Nel 2008 sono stati trovati 27 campioni globali non conformi nei quali almeno uno dei tre campioni di laboratorio presenta una concentrazione di Aflatossina B superiore tenuto conto dell incertezza di misura 3 6 1 6 pg kg all attuale limite di legge 2 ug kg 9 per la frutta a guscio e la frutta secca destinata al consumo umano diretto Di questi 27 campioni 16 sono di arachidi 4 di nocciole 4 di pistacchi e 3 di fichi secchi 14 campioni cio la met dei 27 campioni non conformi presentano solo 1 campione di laboratorio positivo con concentrazioni di Aflatossina B comprese tra 4 5 e 31 ug kg In 7 di questi 14 campioni la concentrazione di Aflatossina B inferiore a 10 ug kg in 5 compresa tra 10 e 20 pg kg solo in 2 superiore a 20 ug kg La concentrazione di Aflatossina B nel campione globale calcolata come media dei tre campioni di laboratorio risulta inferiore a 5 ug kg in 10 casi compresa tra 5 e 10 ug kg in 3 e superiore a 10 ug kg in uno solo Per 7 campioni globali 2 di fichi 2 di pistacchi e 3 di arachidi stata trovata una concentrazione di Aflatossina B superiore a 2 ug kg in 2 campioni di laboratorio si ricorda che nel caso dei fichi il campione globale costituito
120. Analisi trascrizionale mediante microarray 200 ng di RNA totale vengono amplificati e marcati con Cy3CTP attraverso fasi successive L RNA viene poliadenilato quindi retrotrascritto a cDNA a doppio filamento e in ultimo amplificato linearmente e marcato attraverso una reazione di trascrizione in vitro durante la quale il cDNA viene trascritto a cRNA ad opera della T7RNApolimerasi con la contemporanea incorporazione dei nucleotidi marcati Per le prime due fasi ci si avvale del Kit Ambion MessageAmp M II Bacteria e per la trascrizione in vitro invece si utilizza il Kit Agilent low amount RNA imput fluorescent linear amplification kit Con questo protocollo si ottengono in media dai 3 ai 9 microgrammi di cRNA con una ottima frequenza di incorporazione foi del nucleotide marcato che supera in molti casi anche le 20 pmoli per microgrammo di cRNA amplificato valore soglia di accettabilit 9 Dopo aver frammentato il cRNA tramite digestione chimica a 60 C per 30 min si procede all ibridazione per 17 ore alla temperatura di 65 C La slide viene lavata quindi scansionata utilizzando il sistema Agilent Microarray Scanner 146 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev L immagine viene analizzata mediante il software di Feature Extraction 9 1 in dotazione allo scanner Agilent che restituisce un valore di intensita di segnale associato ad un errore Risultati e discussione Le matrici alimentari contaminate da FB presentano una co contaminazione da FB in
121. Biopure RomerLabs Biopure Austria Per quanto riguarda i Matrix CRM IRMM e RomerLabs Biopure producono CRM per la determinazione di micotossine in cereali 10 CRM legumi 3 CRM prodotti lattiero caseari 3 CRM oli e grassi animali e vegetali 3 CRM mangimi 2 CRM In particolare sono disponibili CRM di mais certificati per Deossinivalenolo DON Zearalenoni ZEA Fumonisine Bj e B FB FB2 frumento certificato Ocratossina A OTA e DON arachidi certificate per Aflatossine B4 B2 e G AFB AFB AFG latte certificato per Aflatossina M AFM burro di arachidi certificato per AFB1 AFB2 AFG e AFG mangime composto certificato per AFB AFB AFG In Tabella 3 si riporta un incrocio tra i valori soglia per il contenuto di micotossine stabiliti dalla normativa vigente per alimenti 16 alimenti per l infanzia 17 e mangimi 18 19 e la disponiblit di CRM In particolare si evidenzia che mentre la disponibilit attuale di sostanze 174 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev per taratura copre pressoch tutte le esigenze previste dalla normativa sussiste una generale carenza di Matrix CRM in considerazione delle specifiche esigenze di combinazione analita matrice Tabella 3 Tabella di confronto tra la disponibilit di CRM in matrice o sostanze pure e l esigenza normativa Aflatossine Tricoteceni Matrice AF mie AFB AFM T 2 HT 2 Alimenti per lattanti le prima infanzia 3 Burro di arachidi 1 F
122. ELLA II Technical Documentation High Performance Systems Hanover NH USA Consiglio Europeo Direttiva 71 347 CEE del Consiglio del 12 ottobre 1971 per il ravvicinamento delle legislazioni degli Stati Membri relative alle misurazioni del peso ettolitrico dei cereali GUCE L 239 25 ottobre 1971 10 Corticelli C Verderio A Indagine poliennale sulle caratteristiche qualitative e igienico sanitarie delle granelle commericiali di mais In Miraglia M Brera C Ed Congresso nazionale Le micotossine nella filiera agro alimentare Istituto Superiore di Sanit Roma 29 30 novembre 2004 Atti Roma Istituto Superiore di Sanit 2005 Rapporti ISTISAN 05 42 p 103 7 Unione Europea Direttiva 2003 100 CE della Commissione del 31 Ottobre 2003 che modifica l allegato I della direttiva 2002 32 CE del Parlamento europeo e del Consiglio relativa alle sostanze indesiderabili nell alimentazione degli animali GUCE L 285 01 novembre 2003 N U amp Nn an N oo O 1 109 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 12 Hart LP Variability of vomitoxin in truckloads of wheat in a wheat scab epidemic year Plant Disease 1998 82 6 625 30 13 Whitaker TB Dickens JW Wiser EH Monte Carlo technique to simulate aflatoxin testing programs for peanuts Journal of American Oil Chemists Society 1976 53 545 7 14 Box GEP Jenkins GM Time series analysis forecasting and control San Francisco CA Holden Day 1976
123. ETTA E DIRETTA DA OCRATOSSINA A DI CARNI E SALUMI TIPICI Amedeo Pietri Terenzio Bertuzzi Alessia Gualla Mauro Morlacchini Gianfranco Piva Istituto di Scienze degli Alimenti e della Nutrizione Facolt di Agraria Universit Cattolica del Sacro Cuore Piacenza Introduzione L Ocratossina A OTA una micotossina prodotta principalmente da Aspergillus ochraceus Penicillium verrucosum e P nordicum cancerogena teratogena e immunodepressiva pu provocare nefriti ed epatiti ed classificata dallo IARC International Agency for Research on Cancer nel gruppo 2B possibile sostanza ad azione cancerogena nei confronti dell uomo Possono essere contaminati sia alimenti di origine vegetale specialmente cereali vino e spezie sia di origine animale in particolare carni suine e salumi La presenza di OTA nei prodotti carnei pu essere conseguenza o di una contaminazione indiretta dovuta ad una dieta contaminata somministrata agli animali 0 nel caso di prodotti stagionati di una contaminazione diretta causata principalmente da alcuni ceppi di Aspergilli e Penicillia presenti negli impianti di stagionatura 1 2 In Italia in vigore un limite massimo di contaminazione da OTA nei prodotti carnei pari a 1 pg kg Circolare del Ministero della Sanit n 10 del 09 06 1999 la necessit di fissare un limite stata espressa anche dalla Comunit Europea che ha incluso questi prodotti tra quelli da regolamentare Reg UE 1881 2006
124. G Prodotto lavorato 7 A Mosto POS NEG NEG NEG 8 B Mosto POS NEG NEG NEG 9 A Vino non filtrato POS 10 B Vino non filtrato POS I campioni di uva e di mosto distinto per tesi sono stati destinati all indagine quantitativa del contenuto di OTA e a quella molecolare volta all identificazione dell Aspergillus carbonarius Dalle analisi effettuate sulle uve si evince che la concentrazione di OTA risulta maggiore nelle uve provenienti dal vigneto con una dotazione di calcare del suolo superiore Tabella 4 Tabella 4 Contenuto di OTA nelle uve Campione Tesi Epoca campionamento UVE Contenuto di OTA g kg 1 2 AeB Inizio Invaiatura lt LOQ 3 4 AeB Intermedio di maturazione lt LOQ 5 A 0 14 0 04 6 B Raccolta 0 06 0 01 LOQ Limit of Quantification 0 05 ug kg I risultati sul mosto prima e sul vino dopo hanno evidenziato la presenza di OTA in concentrazioni al di sotto del limite di legge 2 ng g non rilevando alcuna differenza statisticamente significativa nelle due tesi Tabella 5 Tabella 5 Contenuto di OTA nel prodotto delle micro vinificazioni Campione vinificato Tesi Contenuto di OTA ug L 7 A 0 28 0 08 8 B 0 29 0 04 9 A 0 12 0 02 10 B 0 16 0 01 37 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Discussioni e conclusioni Dai dati emerge che esiste una correlazione positiva alla contaminazione funginea e il contenuto di calcare attivo sul suolo nell uva principale causa di stress abiotico sulla pian
125. HO OH DON 3 0 glucoside ZEA 4 0 glucoside Figura 1 Strutture chimiche dei principali metaboliti glicosilati di DON e ZEA Questi derivati hanno caratteristiche chimiche piuttosto diverse da quelle delle forme libere pertanto non sono rivelabili con le metodiche di analisi di routine ma possono comunque contribuire alla tossicit globale come tali o dopo idrolisi durante i trattamenti tecnologici o i processi di digestione liberando i rispettivi agliconi e causando nel consumatore un esposizione effettiva maggiore rispetto a quella stimata mediante le metodiche analitiche comunemente impiegate 8 In questo lavoro si scelto di prendere in considerazione la maltazione del frumento al fine di valutare la possibile variazione dei livelli di contaminazione da Tricoteceni e ZEA per effetto delle modificazioni di natura enzimatica delle cariossidi Durante la fase di germinazione infatti viene attivato il complesso enzimatico noto come diastasi nel quale rientrano enzimi come a e B amilasi fosforilasi e a glucosidasi assieme a proteasi cellulasi xilobiasi e f glucanasi Si ottiene di conseguenza l idrolisi delle macrocomponenti del seme in particolare di amido e proteine con la probabile liberazione delle forme nascoste associate ai costituenti della matrice Materiali e metodi Reagenti Le soluzioni standard di Tricoteceni in miscela NIV DON 3 Ac DON e 15 Ac DON 101 7 ug mL Deossinivalenolo 3 glucoside 49 9 ug
126. IPSA 12 Per quanto riguarda la precisione i valori di CV intra e inter saggio sono risultati conformi per tutti i campioni considerati a quanto richiesto nella medesima direttiva CE 13 e ai criteri USDA GIPSA 12 Nella Tabella 6 sono riportati i risultati della partecipazione con il kit Celer AFLA B a due studi interlaboratorio organizzati dall Associazione Italiana Allevatori nel corso del 2008 e del 2009 I bassi valori di z score ottenuti sono indice di elevata accuratezza dei dosaggi nella matrice mais 201 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 6 Risultati della partecipazione di Tecna con Celer AFLA B a due ring test organizzati dall Associazione Italiana Allevatori Identificativo Campioni AFB g kg z score ring test di mais Valore Valore Dosaggio con addizionato assegnato Celer AFLA B 1 0 0 03 lt 1 2 40 36 85 43 67 0 63 Ottobre 2008 3 20 19 36 22 99 0 73 4 12 11 41 13 39 0 62 1 8 10 81 9 9 0 30 2 40 36 97 37 29 0 02 Marzo 2009 3 20 20 78 20 18 0 09 4 0 0 10 lt 1 valore assegnato come media dei risultati di rispettivamente 18 e 12 partecipanti con metodo HPLC La Figura 1 mostra i grafici di correlazione ottenuti rispettivamente per i campioni di mais fortificati Figura 1 A e per i mangimi di riferimento FAPAS Figura 1 B Per il mais una buona correlazione R 0 9739 si accompagna ad un basso effetto matrice e ad una limitata dispersione dei dati Sy x 0 437 Per i mangimi
127. LOQ la capacit di rivelazione CCB la robustezza per cambiamenti lievi La capacit di rivelazione CCB la minore quantit dell analita che pu essere rivelata identificata e o quantificata in un campione con una probabilit di errore B lt 5 L applicabilit e la robustezza per cambiamenti lievi analista e la temperatura ambientale sono relative all osservazione delle conseguenze sui risultati di leggere variazioni sperimentali introdotte nel metodo La specificit indica la capacit del metodo di distinguere tra l analita da misurare e altre sostanze con particolare riferimento agli interferenti di matrice Alcune modifiche della procedura di preparazione del campione sono state introdotte per ridurre il rumore di fondo bias Lo studio di validazione si basa sull analisi statistica dei risultati mediante un test F per verificare l omoschedasticit dei dati e un paired t test per valutare la significativit del segnale medio dei campioni fortificati rispetto a quello dei campioni non contaminati Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Materiali e metodi Metodo di prova ELISA stato usato il kit ELISA Aflatoxin M EuroClone Life Sciences Siziano PV Italia per l analisi quantitativa in latte latte in polvere ricostituito e formaggio mediante saggio immunochimici competitivo Il campione di latte di massa tenuto 2 h a 4 6 C oppure per una notte in frigorifero poi centrifugato 5 min a 2000 g per separare
128. La rivelazione stata effettuata mediante fluorimetro impostato a Aeccitazione 333 nm e Aemissione 470 nm Analisi ematiche Le analisi per la determinazione dei parametri ematici sono state effettuate con auto analizzatore ILAB 600 Instrumentation Laboratory MA USA La Proteina C reattiva stata determinata sulla totalit dei campioni i dati riguardanti gli enzimi epatici e l aptoglobina si riferiscono invece ad un primo gruppo di 73 campioni Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software SAS 9 1 3 per Windows mentre quelle di correlazione tramite stima dell indice di correlazione di Pearson La regressione lineare multivariata aggiustata per et sesso e intake totale di calorie giornaliere SAS PROC REG stata utilizzata per stimare la relazione tra i terzili di consumo dei vari alimenti trattati come variabili lineari e le concentrazioni di OTA nel plasma Ulteriori analisi sono state condotte dividendo l intera popolazione per sesso In quest ultimo caso le analisi sono state aggiustate per et e intake totale di calorie Risultati e discussione Sono state valutate le percentuali di recupero del metodo utilizzato per la determinazione dell OTA aggiungendo ad aliquote di un campione di siero esente da contaminazione un volume misurato di una soluzione standard di OTA in modo da avere una contaminazione pari a 50 e 400 ng L La percentuale media di recupero stata pari a 93 3 3 6 I limiti di r
129. M1 M2 come indicatore di efficienza dell analisi HPLC In Miraglia M Brera C Ed 2 congresso nazionale Le micotossine nella filiera agro alimentare Roma Istituto Superiore di Sanit 16 18 ottobre 2006 Atti Roma Istituto Superiore di Sanit 2007 Rapporti ISTISAN 07 37 p 243 8 U 137 TERZA SESSIONE Diagnostica delle micotossine Rapporti ISTISAN 10 32 Rev ANALISI DI FUMONISINE B E B2 IN FARINE DI MAIS MEDIANTE TECNICA HPLC MS MS E VALUTAZIONE DELLA LORO TOSSICITA SU VIBRIO FISCHERI Barbara Romagnoli a Maria Ferrari a Cecilia Bergamini a Paola Silingardi b Elena Morandi b Annamaria Colacci b a Riferimento Analitico Regionale Alimenti OGM e Biosicurezza Agenzia Regionale Prevenzione e Ambiente dell Emilia Romagna Sezione Provinciale di Bologna Bologna b Centro Tematico Regionale Cancerogenesi Ambientale Agenzia Regionale Prevenzione e Ambiente dell Emilia Romagna Sezione Provinciale di Bologna Bologna Introduzione Il progetto MITICA Microarray e Proteomica Tecnologie per l Identificazione di Contaminanti negli Alimenti si focalizza sullo sviluppo di strumenti diagnostici innovativi per la rapida identificazione di classi di contaminanti chimici in matrici alimentari e si avvale del contributo scientifico di 5 unit operative tra cui il Centro Tematico Regionale CTR Cancerogenesi Ambientale che coordina il progetto e il Riferimento Analitico Regionale RAR Alimenti Organi
130. Matrix CRM 5 Matrix CRM 21 Matrix CRM 80 Matrix RM QC ST sostanze di taratura QC Quality Control vengono riportati anche RM fuori produzione In Tabella 2 viene riportata la produzione di sostanze pure distinguendo tra le diverse classi di micotossine Sostanze per taratura sono disponibili prevalentemente per Aflatossine Zearalenoni e Tricoteceni in forma di soluzioni soluzioni marcate e sostanze pure Il NARL produce unicamente sostanze pure per la determinazione di Zearalenoni 5 CRM l IRMM produce soluzioni di sostanze pure per la determinazione di Aflatossine 7 CRM Zearalenoni 1 CRM e Tricoteceni 2 CRM la RomerLabs Biopure produce una grande variet di sostanze per taratura nelle diverse forme per tutte le classi di micotossine comprendendo anche gli Alcaloidi dell Ergot 12 CRM Alternarioli 3 CRM e micotossine minori 20 CRM Tabella 2 Produzione di sostanze per taratura RM per le diverse classi di micotossine RM AF FUM OCRA PAT ZEA TRI ERGOT ALT MICOm Sostanze pure 4BI0 1BIO 1BIO 1BIO SNARL 7BIO 1 BIO 1 BIO Soluzioni di sostanze pure semplici 7 IRMM 4 BIO 3BIO 1BIO 1IRMM 2IRMM 9 BIO 5 BIO 8 BIO 15 BIO dried down 1BIO 12BIO 3BIO 6BI0 marcate 4BIO 3 BIO 1BIO 1BI0 1BI0 SBIO 4 BIO AF Aflatossine FUM Fumonisine OCRA Ocratossine PAT Patulina ZEA Zearalenoni TRI Tricoteceni ERGOT alcaloidi dell Ergot ALT Alternarioli MICOm Micotossine minori BIO
131. NTAZIONE ANIMALE SOSTANZE INDESIDERABILI E ALTRI CONTAMINANTI MICOTOSSINE Gaetana Ferri Dipartimento per la Sanit Pubblica Veterinaria la Nutrizione e Sicurezza degli Alimenti Direzione Generale della Sanit Animale e del Farmaco Veterinario Ministero della Salute Roma Introduzione Il Ministero del Lavoro della Salute e delle Politiche Sociali e nello specifico la Direzione Generale della Sanit Animale e del Farmaco Veterinario DGSA ha emesso annualmente fino all anno 2008 il Piano Nazionale sull Alimentazione degli Animali PNAA che a partire dall anno 2009 diventa un piano nazionale di sorveglianza e vigilanza sanitaria sull alimentazione degli animali 1 con valenza triennale al fine di adeguarsi alle disposizioni di cui all art 42 del Reg CE 882 2004 2 sui controlli ufficiali per la verifica della conformit alle leggi degli alimenti e dei mangimi e alle disposizioni sulla salute e sul benessere animale che prevede invece la stesura di piani di controllo nazionali pluriennali In particolare il Reg CE 882 2004 stabilisce che i controlli ufficiali siano effettuati periodicamente con frequenza appropriata prendendo in considerazione i rischi identificati associati agli animali agli stabilimenti e a tutte le attivit di produzione del settore mangimi nonch all uso dei mangimi che potrebbero incidere sulla sicurezza del mangime sulla salute e benessere degli animali e inoltre considerando i risul
132. P Magnete Figura 1 Schema di un saggio competitivo indiretto con l uso di particelle immunomagnetiche Saggio ELIME preliminare Il saggio competitivo definitivo di cui in Figura 2 si riporta la curva di taratura in presenza dell antigene da dosare presente negli standard stato eseguito in funzione dei risultati acquisiti nelle prove di ottimizzazione prove di binding antigene anticorpo hanno permesso di controllare e confermare l attivit dell anticorpo anti DON e di scegliere la migliore diluizione di anticorpo da impiegare nel saggio competitivo risultata di 1 10000 v v da una soluzione madre di 1 mg mL La concentrazione di DON HSA legato sulle micropalline magnetiche minore di quella suggerita nel protocollo generale della ditta che le commercializza e corrisponde a 375 ug mL dato che il legame tra anticorpo e antigene libero da dosare risulta ovviamente ostacolato da alte concentrazioni di antigene legato che compete 5 Current uA 100 1000 10000 DON ng ml Figura 2 Curva di taratura del saggio competitivo indiretto ELIME 155 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev I parametri analitici dell immunosensore elettrochimico per il DON ottenuti dall equazione logistica a quattro parametri riferiti alla curva mostrata in Figura 2 sono LOD 63 ng mL Median Effective Concentration ECs 380 ng mL intervallo di lavoro 100 4500 ng mL tempo totale di analisi circa ora e 30 minuti
133. Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Ringraziamenti Si ringrazia il Centro per l Innovazione Viti vinicola Ernesto Del Giudice di Marsala TP per la collaborazione tecnica offerta fornendo i vigneti sperimentali su cui stata condotta la prova ed effettuando le micro vinificazioni delle uve in studio 39 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev FATTORI INFLUENTI SULLO SVILUPPO FUNGINO NELLA GRANELLA DI MAIS EFFETTO DELLA TEMPERATURA SU UMIDITA E WATER ACTIVITY DURANTE LA MATURAZIONE Andrea Maiorano Mattia Ciro Mancini Amedeo Reyneri Dipartimento di Agronomia Selvicoltura e Gestione del Territorio Universita degli Studi Torino Introduzione Normalmente durante la fase di campo il parametro pi comunemente utilizzato per descrivere la presenza di acqua nella granella l umidit Questo parametro per non descrive sufficientemente la disponibilit di acqua ad esempio per lo sviluppo di funghi tossigeni tale disponibilit determinata dall interazione tra le molecole d acqua la temperatura e le caratteristiche chimiche e fisiche del substrato 1 Si preferisce quindi utilizzare il parametro water activity ay che la misura dello stato energetico dell acqua di un sistema 2 La relazione che lega l umidit di un substrato e la ay a temperatura e pressione costanti si chiama isoterma di sorbimento e dipende dalle caratteristiche del substrato 3 Gli obbiettivi di questo lavoro sono stati i osservare l evoluzione del dr
134. SAN 10 32 Rev CELER AFLA B UN ELISA VELOCE E PRATICO PER LA DETERMINAZIONE DELL AFLATOSSINA B NELLE DERRATE ALIMENTARI Francesca Diana Vanessa Bacer Barbara Puppini Lidija Persic Maurizio Paleologo Tecna srl Trieste Introduzione Le Aflatossine B B2 Gi e G2 AFB AFB2 AFG e AFG sono metaboliti tossici e cancerogeni prodotti principalmente dalle muffe Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus che possono contaminare svariate derrate alimentari e mangimi Questi funghi si sviluppano sia in campo che durante lo stoccaggio qualora si creino le condizioni ideali di temperatura 25 C e di umidit dell aria pari o superiore all 85 1 2 Di conseguenza la contaminazione da Aflatossine pu verificarsi sia prima che dopo la raccolta 3 La tossicit causata da tali tossine detta aflatossicosi pu essere sia di tipo acuto che cronico 1 4 e si manifesta principalmente a livello del fegato causando necrosi cirrosi e carcinomi 5 6 Le Aflatossine sono state classificate dallo IARC International Agency for Research on Cancer tra i carcinogeni del gruppo I 7 Tra le quattro molecole AFB la pi abbondante e la pi tossica A causa di questi severi effetti sulla salute la Comunit Europea cos come la US Food and Drug Administration l Organizzazione Mondiale per la Sanit 8 e la Food and Agriculture Organisation FAO 9 hanno fissato dei tenori massimi per le Aflatossine B e G La necessit del
135. Spettri medi di riflettanza di mais ibrido Cecilia inoculato con sospensioni conidiche di colture pure di differenti specie fungine spettri registrati a 3 giorni dall inoculo delle sospensioni conidiche su mais umidificato al 30 L analisi della varianza ANOVA Q1 Fisher LSD operata su due lunghezze d onda 410 nm e 470 nm selezionate attraverso analisi delle componenti principali e analisi discriminante sui dati spettrali globali ha permesso di verificare che il sistema analitico testato presenta capacit discriminante statisticamente significativa ad un livello di confidenza del 95 tra il mais non contaminato e il mais contaminato con Aspergillus flavus a partire dalle 48 h di incubazione Tabelle 1 2 quando la contaminazione fungina non ancora percepibile ad osservazione visiva 186 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 1 ANOVA Q1 Fisher LSD mais inoculato con una sospensione conidica di Aspergillus flavus 3357 e incubato in termostato a 30 C per 10 giorni Lunghezza d onda 410 nm Contrasto Differenza Differenza Critical value p gt Diff Significativo standardizzata non inoculato vs 1giorno 0 083 1 464 2 014 0 150 NO non inoculato vs 2 giorni 0 161 2 844 2 014 0 007 S non inoculato vs 3 giorni 0 168 2 962 2 014 0 005 S non inoculato vs 4 giorni 0 154 2 719 2 014 0 009 S non inoculato vs 10 giorni 0 213 3 755 2 014 0 000 S Tabella 2 ANOVA Q1 Fisher LSD mais inoculato con una sospensione
136. T T T T T T T t 1 5 00 10 00 15 00 20 00 25 00 30 00 35 00 40 00 45 00 50 00 sp_std_5ppm_dig1 3 MRM of 2 Channels ES 100 22 39 1192 722 4 gt 334 4 8 26e3 Area as loin iii nn iii 0 T T T T T T T T T T T T T T T T T T Time 5 00 10 00 15 00 20 00 25 00 30 00 35 00 40 00 45 00 50 00 Figura 3 Confronto tra le aree di FB nella soluzione di controllo sopra e di FB in seguito a digestione sotto I risultati conseguiti da questa ulteriore prova preliminare hanno permesso di evidenziare che le Fumonisine non vengono degradate o idrolizzate nel corso della digestione Confronto tra digestione in vitro e idrolisi alcalina Il modello di digestione stato inizialmente applicato a quattro campioni di mais naturalmente contaminati I risultati ottenuti espressi come somma di FB FB e FB3 sono stati confrontati con quelli conseguiti impiegando una procedura di estrazione di routine descritta precedentemente e coi livelli di Fumonisine totali rivelati in seguito ad idrolisi basica 10 Quest ultimo metodo consiste in un idrolisi chimica effettuata impiegando KOH 2 N allo 21 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev scopo di scindere dalle Fumonisine allo stato nativo le unita tricarballiliche con il conseguente rilascio delle forme idrolizzate rivelate come HFB ed espresse come somma di FB FB e FB3 equivalenti dalla matrice In Figura 4 sono riportate le strutture chimiche di FB e della corrispondente forma idrolizzata HFB
137. TSrev1 per 30 secondi e 72 C per 20 secondi Risultati Le condizioni di PCR Real Time messe a punto con entrambe le coppie di primer hanno mostrato un elevata sensibilit permettendo di amplificare quantit di DNA fungino rispettivamente di 1 pg Acpksfor Acpksrev e 0 01 pg AcITSfor2 AcITSrev1 migliorando le prestazioni di 100 o di 1000 volte rispetto alla PCR classica dati non mostrati I dati Figura 1 mostrano come mediante la PCR Real Time possibile rilevare e quantificare il DNA fungino estratto da matrice inoculata artificialmente con 1 5 conidi gr di bacca d uva dopo solo 6 h dall inoculo tempo in cui sono presenti circa 20 conidi per grammo di bacca d uva Figura 2 Inoltre i primer hanno permesso di rilevare il DNA di A carbonarius su bacche prelevate da due stazioni italiane del centro e sud Italia Velletri e Bari Figura 3 I campioni che risultano avere la pi alta concentrazione di DNA di fungo avevano al momento della raccolta evidenti segni di marciume ad una ispezione visiva mentre gli altri campioni risultati positivi allo screening della PCR Real Time pur non mostrando evidenti segni di marciume al momento della raccolta hanno sviluppato il micelio fungino quando le bacche provenienti dallo stesso grappolo dei campioni erano poste ad incubare per 7 giorni a 30 C 194 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 841 49 1000 100 10 pg DNA mg matrice 0 47 0 1 ore di incub
138. UCE L364 5 20 dicembre 2006 Unione Europea Regolamento CE n 1126 2007 della Commissione del 28 settembre 2007 che modifica il regolamento CE n 1881 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari per quanto riguarda le Fusarium tossine nel granoturco e nei prodotti a base di granoturco GUCE L 255 29 settembre 2007 Unione Europea Regolamento CE n 178 2002 del Parlamento europeo e del Consiglio del 28 gennaio 2002 che stabilisce i principi e i requisiti generali della legislazione alimentare istituisce P Autorit europea per la sicurezza alimentare e fissa procedure nel campo della sicurezza alimentare GUCE L 31 1 febbraio 2002 Italia Legge 15 febbraio 1963 n 281 Disciplina della preparazione e del commercio dei mangimi Gazzetta Ufficiale Serie Generale n 82 26 marzo 1963 75 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev CONTROLLO UFFICIALE DI MICOTOSSINE IN DERRATE ALIMENTARI DI PROVENIENZA EXTRA EUROPEA IN INGRESSO DAL PORTO DI RAVENNA Maria Ferrari a Angela Guerrini b Davide Verna b Ivan Scaroni b Valerio Strocchi b Luciano Calo c Michele Buonaiuto c Giuseppe Marrali c Raffaella Patricelli c Raffaella Perfetti c a Agenzia regionale per la prevenzione e l ambiente ARPA Emilia Romagna Sezione Provinciale di Bologna Bologna b Agenzia regionale per la prevenzione e l ambiente ARPA Emilia Romagna Sezione Provinciale di Ravenna Ravenna c Ufficio di San
139. a dell analisi Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Prima di caricarvi il campione le cartucce vengono precondizionate con 2 mL di metanolo e con 2 mL di acqua bidistillata Dopo aver caricato ed eluito 2 mL di chimo le cartucce vengono lavate con altri 2 mL di acqua bidistillata e gli analiti vengono quindi eluiti con 2 mL di una miscela acqua acetonitrile 1 1 1 mL viene quindi portato a secco sotto flusso di N3 e il residuo viene ripreso con lo stesso volume di acqua metanolo 30 70 prima dell analisi in LC ESI MS MS Data la minore contaminazione del campione di partenza nel caso dei prodotti alimentari il volume di chimo sottoposto a purificazione pari a 4 mL Dopo eluizione dei composti in esame 3 5 mL vengono portati a secco e il residuo viene ripreso con 1 mL della miscela acqua metanolo 30 70 al fine di ottenere una certa riconcentrazione degli analiti Analisi LC ESI MS MS Le analisi LC ESI MS MS sono state effettuate utilizzando un HPLC Alliance 2695 Waters Co Milford MA USA accoppiato con uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo Quattro MicroTM API con sorgente Electrospray Micromass Waters Manchester UK Le condizioni cromatografiche impiegate sono le seguenti Colonna C18 XTerra 250 mm x 2 1 mm 5 um flusso 0 2 mL min temperatura della colonna 30 C volume di iniezione 10 uL il gradiente di eluizione stato ottenuto utilizzando acqua eluente A e metanolo eluente B acidificati entrambi allo 0 2 c
140. a i criteri di rendimento fissati dal Reg CE 401 2006 2 Periodicamente sono effettuate prove di recupero Il valore di recupero medio utilizzato per la correzione del dato analitico come richiesto dal Reg CE 401 2006 Il dato corredato dall incertezza estesa di misura ottenuta moltiplicando per un fattore 2 il valore dell incertezza composta a sua volta calcolata con il metodo di Horwitz L incertezza estesa indispensabile ai fini della valutazione di conformit del dato analitico rispetto ai limiti fissati dal Reg CE 1881 2006 9 Infine almeno una volta all anno per ogni tipologia di matrice di interesse il laboratorio partecipa a circuiti interlaboratoriali organizzati da FAPAS Risultati e discussione In Tabella 2 si riportano i quantitativi delle principali categorie di merce in ingresso dal Porto di Ravenna per le quali previsto il controllo di micotossine espressi in tonnellate per gli anni 2006 2008 e per i primi otto mesi del 2009 L importazione di queste derrate legata alle attivit produttive dell industria alimentare pertanto si registrano flussi di ingresso pi intensi nel periodo invernale in ragione del maggiore consumo di frutta a guscio e frutta secca Nel corso degli anni stato notato un calo dei quantitativi di merce probabilmente dovuto a 77 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev fattori economici In particolare negli ultimi 12 mesi la recente crisi mondiale ha avuto pesanti ripercu
141. a parit di condizioni agronomiche applicate 90 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev I risultati ottenuti hanno evidenziato il diverso grado di accumulo e di incidenza di DON procedendo dalle zone del Nord verso quelle del Sud dove i valori di DON sono risultati pressoch trascurabili Tali risultati possono contribuire fra l altro ad una pi mirata valutazione del rischio di contaminazione che tenga conto dell ambiente inteso come micro areale e cio delle caratteristiche pedo climatiche proprie delle singole zone di coltivazione L elaborazione statistica dei dati relativi al totale dei campioni ha messo in evidenza il ruolo fondamentale svolto dall annata sia come fattore singolo che nella sua interazione con le altre variabili soprattutto nelle province del Nord e del Centro Il fattore geografico localizzazione sul territorio riveste un ruolo primario soprattutto nel Centro per quanto riguarda le zone del Sud il fattore di gran lunga pi significativo la variet in quanto non risultano significativamente influenti n il fattore anno n quello geografico confermando cos la vocazionalit del territorio per la coltura del frumento duro Il confronto dei dati di contaminazione relativi alle sei cultivar fra le pi diffuse sul territorio nazionale ha permesso di rilevare significative differenze fra le variet in merito alla suscettibilit al DON anche in relazione alle diverse zone di coltivazione In particolare la variet
142. a vengono incubate con un complesso molecolare avidina n biotina HRP allo scopo di legare il Fab biotina non ad una ma a numerose molecole di enzima perossidasi HRP Al termine di tutti gli step immunologici le particelle immunomagnetiche vengono concentrate sulla superficie dell elettrodo di lavoro di un elettrodo screen printed SPE usa e getta grazie all aiuto di un piccolo magnete fissato sotto la sua superficie Instaurato il contatto elettrico tra l SPE e il rivelatore di segnale potenziostato da banco o portatile tipo PalmSens si misura con tecnica cronoamperometrica la corrente generata potenziale applicato costante di 0 1 V dalla riduzione all elettrodo di lavoro del prodotto della reazione enzimatica tra HRP e 3 3 5 5 tetrametilbenzidina TMB ridotta in presenza di H202 5 L intensit di tale corrente inversamente proporzionale alla concentrazione di antigene Il saggio ELIME sfrutta la selettivit degli anticorpi la sensibilit della rivelazione elettrochimica la maneggevolezza degli elettrodi screen printed e la possibilit di concentrare le particelle magnetiche sulla superficie di un elettrodo di lavoro Lo schema che descrive l immunosensore riportato in Figura 1 154 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev TMB ad HO tee H 0 Particella magnetica con catena immunologica TMB adh Nee screen printed potenziostato Yves Fab Biotna e DON DSC cHSA EA viona 27 Enzima HR
143. aboratory study for ochratoxin a determination in cocoa powder samples The Journal of Liquid Chromatography amp Related Technologies 2005 28 1 35 62 169 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev A Nn a N Brera C Debegnach F Minardi V Pannunzi E De Santis B Miraglia M Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography for determination of aflatoxin Bl in corn samples interlaboratory study Journal of AOAC International 2007 90 3 765 72 Brera C Debegnach F De Santis B Pannunzi E Berdini C Prantera E Miraglia M Validazione di metodi immunoenzimatici per la determinazione delle micotossine in campioni di cereali In Micotossine nei cereali Risultati del progetto interregionale MICOCER Firenze Accademia dei Georgolfili 2009 Quaderni 2008 IV Stroka J von Holst C Anklam E Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post column bromination for determination of Aflatoxin B1 in cattle feed collaborative study Journal of AOAC International 2003 86 1179 86 MacDonald SJ Chan D Brereton P Determination of Deoxynivalenol in cereals and cereal products by immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography interlaboratory study Journal of AOAC International 2005 88 1197 204 170 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev MATERIALI DI RIFERIMENTO PER LA DETERMINAZIONE DI MICOTOSSINE E LA VALUTAZIONE DI CONTAMINAZIONI FUNGINE IN PRODOTTI ALIMENTARI Rosanna Gatti Ilaria Lamb
144. accresciuto alle importazioni su alcuni mangimi e prodotti di origine non animale I prodotti alimentari inseriti nell Allegato I di tale regolamento sono stati identificati in base a criteri ben definite n allerte ispezioni FVO ecc La lista dinamica e viene aggiornata ogni tre sei mesi Il controllo effettuato nell anno 2008 per la ricerca delle micotossine sui prodotti alimentari individuati stato reso possibile grazie alla piattaforma informatica NSIS USMAF Tale sistema informativo sanitario un sistema informatizzato e su web con il quale gli Uffici acquisiscono i dati dell importazione e rilasciano l atto finale con il quale si consente la nazionalizzazione della merce NOS o il respingimento Non ammissione Tale sistema consente agli uffici centrali di avere in tempo reale moltissimi dati relativi alle importazioni utili anche ai fini della rintracciabilit Il sistema N SIS ci consente inoltre di verificare in tempo reale tutte le merci di interesse sanitario in entrata in Italia effettuare ricognizioni su periodi temporali matrici di merci produttori esteri importatori destinatari punti di ingresso effettuare statistiche e studi in risposta a richieste della Commissione europea evidenziare criticit operative per una migliore organizzazione del servizio Piano Nazionale Integrato L attivit di controllo delle micotossine come tutte le attivit di controllo ufficiale in
145. acque di imbibizione ma anche alla sua trasformazione in metaboliti non rivelabili mediante la metodica di estrazione e analisi impiegata nel presente lavoro 29 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 50 1 o De le RT M2 5 415 12 415 4 415 5 425 10 433 5 DM 3 DM 7 DS 3 DON ng g d Concentrazione media non maltati Hl maltati Figura 2 Variazione dei livelli di DON in seguito a maltazione Parallelamente alla diminuzione di DON nel caso dello ZEA stata riscontrata la tendenza opposta ovvero un significativo incremento del grado di contaminazione durante la maltazione dovuto molto probabilmente alla rottura delle interazioni tra la tossina e le macrocomponenti a cui si trova legata nella materia prima ad opera dell azione degli enzimi idrolitici attivati nel corso della germinazione In Figura 3 mostrata la differenza tra la concentrazione di ZEA rivelata prima e dopo il processo in esame i ca 412 5 415 12 415 4 433 5 DM 6 DM 7 DS 3 DS 6 Q a N O A o Q Concentrazione media di ZEA ng g 3 non maltati mi maltati Figura 3 Variazione dei livelli di ZEA in seguito a maltazione Maltazione di grano duro naturalmente contaminato Nella seconda fase dello studio stata effettuata la maltazione su una serie di camp
146. aggiore contaminazione contenenti sequestranti all 1 e 2 usando le miscele estraenti acetone H20 85 15 v v e metanolo H20 80 20 v v Sequestrante Dose 1 2 acetone H20 metanolo H20 acetone H20 metanolo H20 Sodio bentonite 11 72 1 75 0 84 0 11 9 74 1 13 0 54 0 11 Calcio bentonite 12 56 0 12 1 65 0 05 11 50 1 13 0 95 0 52 Zeolite 11 96 1 43 2 86 0 12 12 59 1 07 2 79 0 29 Caolinite 12 83 0 53 3 14 0 13 12 54 037 3 59 1 18 Parete di cellule di lieviti 12 21 1 90 2 71 0 02 10 70 1 00 2 86 0 21 Carbone attivo 7 99 1 01 1 36 0 03 5 73 0 16 1 03 0 02 Atox 13 16 2 56 1 34 0 26 12 43 1 87 0 64 0 27 Myco AD AZ 12 58 1 75 4 22 0 18 11 63 1 99 0 55 0 04 NovasilTM plus 11 53 1 66 1 05 0 15 13 59 1 94 0 84 0 13 Tabella 2 Contenuto medio di AFB pg kg nei mangimi a minore contaminazione contenenti sequestranti all 1 e 2 usando le miscele estraenti acetone H20 85 15 v v e metanolo H20 80 20 v v Sequestrante Dose 1 2 acetone H20 metanolo H20 acetone H O0 metanolo H20 Sodio bentonite 5 42 0 46 0 53 0 02 5 60 1 04 0 45 0 03 Calcio bentonite 7 58 0 63 1 94 0 31 7 15 0 55 1 37 0 06 Zeolite 7 56 0 64 2 43 0 32 6 72 0 34 2 48 0 11 Caolinite 6 50 0 73 2 27 0 09 6 27 0 30 2 07 0 09 Parete di cellule di lieviti 6 81 0 13 2 26 0 20 6 49 0 28 2 44 0 11 Carbone attivo 4 17 0 18 1 30 0 10 2 98 0 09 0 86 0 17 Atox 7 25
147. al punto di vista analitico ci sono stai dei grossi passi avanti per quanto riguarda PHPLC si passati da un tempo di analisi di 90 minuti per campione agli attuali 40 minuti per campione e si stanno affermando sul mercato dei metodi di screening rapido realmente affidabili Visto il miglioramento netto e l affidabilit a cui sono arrivati alcuni di questi metodi d indagine veloce anche Newlat ha adottato un sistema di questo tipo da affiancare all HPLC che serve come conferma di positivit e taratura avendo cos la possibilit di implementare il monitoraggio sulle cisterne in arrivo aumentando la possibilit di prevenire l innalzarsi del contenuto di micotossine nel latte La prevenzione infatti fondamentale poich alimentando le bovine con mangime contaminato da AFB si ha un picco di AFM nel latte gi dopo 24 ore che pu impiegare fino a 72 ore per tornare al livelli accettabili Analisi dei dati in autocontrollo Newlat ha sempre adottato una politica molto restrittiva per quanto riguarda il controllo dell AFM nel latte imponendo ai suoi fornitori un limite massimo di 20 ng kg di concentrazione contro i 50 ng kg previsti per legge Il superamento di tale limite porta all attivazione di una procedura di controllo dei lotti di mangime presenti in stalla con individuazione e sostituzione di quello a rischio Questa manovra ha permesso di avere sempre livelli di contaminazione molto bassi un ampio margine di interv
148. ale fosse la minor concentrazione di 199 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev AFB rilevabile dal saggio con una probabilit del 95 Il LOQ stato determinato per le matrici mais fichi secchi uvetta nocciole pistacchi e i valori ottenuti sono riportati nella Tabella 3 Tabella 3 LOQ del saggio Celer AFLA B su 20 campioni addizionati Matrice LOQ pg kg Mais Fichi secchi Uvetta Nocciole Pistacchi 3 POND Accuratezza e precisione del saggio Il kit Celer AFLA B stato validato sulle matrici mais germe di mais mangimi frutta secca e frutta a guscio Nelle Tabelle 4 e 5 sono riportati i risultati di accuratezza in termini di valori di recupero e di precisione dei dosaggi in condizioni di ripetibilit e di riproducibilit espressa in termini di deviazione standard relativa coefficiente di variazione CV Il recupero medio per il mais risultato essere del 124 22 e del 91 21 rispettivamente per i campioni di riferimento FAPAS e per i campioni fortificati I recuperi ottenuti per le altre matrici sono 91421 per i campioni di germe di mais naturalmente contaminati 108 20 per i mangimi di riferimento FAPAS 98 18 per la frutta a guscio e 113 18 per la frutta secca Tabella 4 Accuratezza e precisione CV del saggio Celer AFLA B nel dosaggio di campioni di mais di riferimento FAPAS e fortificati Campioni Valore assegnato Dosaggio Recupero CV di mais range di accettabilit g kg
149. all altro sull espressione linfocitaria di SOD e GSH Px Infatti l esposizione a bassi livelli di DON e Tossina T 2 sembra incrementare la sintesi di mRNA per entrambi gli enzimi Precedenti studi in vivo e in vitro hanno peraltro dimostrato come il DON e altri Tricoteceni possano modulare le funzioni immunologiche in vario modo e come a bassi dosaggi possono potenziare o deprimere l espressione genica di cellule del sistema immunitario 4 A titolo di conferma stato verificato che il DON alla concentrazione di 250 ug mL in vitro sia capace d incrementare il legame del fattore di trascrizione NF xB and AP 1 nei linfociti T 40 e nei macrofagi 41 Per tali fattori di trascrizione nota la capacit sotto l effetto di moderate condizioni di stress cellulare di indurre l espressione di geni relativi alla sopravvivenza al differenziamento e alla crescita delle cellule 26 42 La riduzione nel livello d espressione genica manifestato come caso generale e pi specificamente solo ad alti livelli di T 2 e DON pu essere considerato come risultato del ben noto effetto inibitorio esplicato da alcune micotossine sulla sintesi proteica o sui processi apoptotici 43 In considerazione di tali evidenze lo stato di stress ossidativo delle PBMC bovine osservato nel corso dello studio pu essere interpretato come conseguenza anzich come causa di tossicit cellulare indotta dalle micotossine In accordo con tale visione stato spe
150. ambito ambientale per analizzare la tossicit di composti chimici che sono stati individuati come contaminanti di matrici alimentari A tale analisi prettamente tossicologica si affiancare in parallelo l analisi tramite la tecnica del microarray degli effetti che tali molecole producono a livello di alterazione nell espressione genica Materiali e metodi Microtox toxicity test system I batteri liofilizzati 10 unit formanti colonia cfu vengono rivitalizzanti in 1 mL di HO per 30 min a 4 C quindi equilibrati alla temperatura operativa del test pari a 16 per 15min 10 cfu vegono poi risospesi in soluzione salina 2 NaCl in presenza del composto in esame diluito in modo da coprire un range ampio di dosi che poi viene ristretto in modo da misurare in modo piu preciso la dose ECs La quantificazione della luminescenza viene effettuata dopo 5 e 15 minuti metodo APAT CNR IRSA 8030 Estrazione dell RNA totale I batteri sono raccolti per centrifugazione e lisati con lisozima 400 mg mL in TE incubando 5 minuti a temperatura ambiente Dopo la lisi si procede alla purificazione del RNA seguendo il protocollo delle colonnine a scambio ionico RNAesy mini kit della Qiagen Da 10 cfu abbiamo ottenuto una resa media di 3 5 ug di RNA totale che stato quantificato allo spettrofometro e di cui si valutata la qualit mediante sistema automatizzato Bioanalyzer 2100 Agilent utilizzando I RNA 6000 Nano LabChip Agilent
151. amento riferiti a particolari sostanze da ricercare nei mangimi e raggruppate in sei diversi capitoli Piani di sorveglianza e vigilanza sulla BSE sugli additivi sulle sostanze indesiderabili sulla contaminazione da salmonella sui prodotti contenenti Organismi Geneticamente Modificati OGM sui controlli relativi ai mangimi di importazione una terza parte che raccoglie la modulistica di diverso tipo ad es moduli dei verbali di campionamento moduli dei verbali per i sopralluoghi ispettivi moduli dei provvedimenti intrapresi in caso di non conformit presso gli OSM indicazioni per la classificazione del rischio degli stabilimenti per la buona pratica di campionamento e per la stesura della relazione annuale da trasmettere da parte delle Regioni al Ministero Nello specifico alla stesura dei programmi di campionamento di cui nella parte tecnica del piano collaborano gli Istituti Zooprofilattici Sperimentali IZS in qualit di Centri di Referenza Nazionale per i vari argomenti pertinenti e ovviamente l Istituto Superiore di Sanit per quanto di competenza nel settore dei contaminanti e quindi per le micotossine di cui il Laboratorio Nazionale di Riferimento In particolare al capitolo 3 intitolato Piano di sorveglianza e di vigilanza della presenza delle sostanze indesiderabili e dei contaminanti negli alimenti per animali la sezione 3 b quella dedicata alle micotossine 68 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev So
152. aminants in the food chain on a request from the commission related to the potential increase of consumer health risk by a possible increase of the existing maximum levels for aflatoxins in almonds hazelnuts and pistachios and derived products Question N EFSA Q 2006 174 The EFSA Journal 2007 446 1 127 ARPA Emilia Romagna Residui di prodotti fitosanitari su ortofrutticoli freschi ed in altre matrici alimentari campionati in Emilia Romagna nell anno 2008 Ferrara ARPA Emilia Romagna 2009 Disponibile all indirizzo http www arpa emr it cms3 documenti ferrara dt ef relazione alimenti _ 2008 pdf ultima consultazione settembre 2009 83 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev PROGETTO MICOCER MONITORAGGIO DEI LIVELLI DI DEOSSINIVALENOLO NELLA GRANELLA DI FRUMENTO DURO TRITICUM DURUM DESF Gabriella Aureli a Andreina Belocchi a Michelangelo Pascale b Tiziana Amoriello c Maria Grazia D Egidio a Ersilio Desiderio a a Unita di Ricerca per la Valorizzazione Qualitativa dei Cereali Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura Roma b Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari Consiglio Nazionale delle Ricerche Bari c Direzione Centrale Attivita Scientifica Servizio Trasferimento e Innovazione Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura Roma Introduzione I cereali costituiscono una fonte privilegiata di nutrienti che sta alla base dell alimentazione dell uomo e degli ani
153. aminati verso le specie animali meno sensibili es ruminanti alle relative micotossine 72 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev In particolare sara necessario disporre di un maggior numero di campioni di materie prime in cui ricercare Aflatossina B e di campioni di mais e grano per la ricerca del DON mentre negli allevamenti di suini essendo la specie animale pi sensibile dovr essere incrementato il numero di campioni per la ricerca dell Ocratossina A negli stabilimenti adibiti alla produzione di mangimi per equini e bovini sar necessario prelevare un maggior numero di campioni per la ricerca rispettivamente delle Fumonisine e dello Zearalenone In funzione di quanto definito negli obiettivi si definisce il criterio di ripartizione dei campioni in ambito regionale Tabella 3 considerando per le motivazioni sopra riportate un campionamento mirato presso i seguenti impianti mangimifici a scopo commerciale depositi e aree di commercio all ingrosso di granaglie e mangimi da privilegiare essiccatoi importatori da privilegiare aziende zootecniche e per le seguenti tipologie di matrici materie prime mais e relativi sottoprodotti grano altri cereali semi frutti oleaginosi o loro prodotti e sottoprodotti materie prime per mangimi immagazzinate per lunghi periodi o importate via mare per lunghi periodi lunghe distanze mangimi per bovini da latte mangimi per bestiame da l
154. amp Contaminants 2009 26 1402 10 Unione Europea Regolamento CE 882 2004 del Parlamento Europeo e del Consiglio del 29 aprile 2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformita alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali GUCE L 191 30 aprile 2004 Unione Europea Regolamento CE N 401 2006 della Commissione del 23 febbraio 2006 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari GUCE L70 12 9 marzo 2006 Unione Europea Decisione 2002 657 CEE della Commissione del 12 Agosto 2002 che attua la Direttiva 96 23 CEE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e all interpretazione dei risultati GUCE L221 17 agosto 2002 Ringraziamenti Lavoro eseguito con i fondi di ricerca corrente del Ministero della Salute Progetto RC IZS PB 005 06 Si ringraziano G Battafarano e P D Antini Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Foggia per la collaborazione tecnica 234 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev ANALISI DELL AFLATOSSINA B IN ALIMENTI ZOOTECNICI CONTENENTI SEQUESTRANTI Amedeo Pietri Antonio Gallo Terenzio Bertuzzi Silvia Rastelli Francesco Masoero Gianfranco Piva Istituto di Scienze degli Alimenti e della Nutrizione Facolt di Agraria Universit Cattolica del Sacro Cuore Piacenza Introduzione Per l analisi delle
155. amp Qualit Torino 14 16 marzo 2007 Carconi P Gatti R Zappa G Zoani C Costantini S Senofonte O ENEA resources for Reference Materials production to support food quality and safety Co operation with the Community Reference Laboratory for chemical elements in food of animal origin CRL ISS In Proceedings of the Scientific Symposium EFSA University of Parma Food Safety and Quality Nutrition and Nano Technology Parma 4 ottobre 2007 Ciaralli L Giordano R Senofonte O Colabucci A D Amato M D Ilio S Zappa G Palazzo S Di Gregorio M Costantini S Experiences of the Community Reference Laboratory for chemical elements in food of animal origin in the preparation of test materials for proficiency testing In Brookman B Menditto A Patriarca M Ed 6th Workshop Proficiency Testing in Analytical Chemistry Microbiology and Laboratory Medicine Current Practice and Future Directions Rome Italy October 5 7 2008 Abstract book Roma Istiuto Superiore di Sanita 2008 ISTISAN Congressi 08 C8 p 29 30 Zappa G Carconi P D Alessio A Di Bonito R Gatti R Mosiello L Zoani C Feasibility study for the development of a toner Reference Material Measurement 2009 42 1491 6 181 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev RAPIDO RILEVAMENTO DI FUNGHI TOSSIGENI IN CARIOSSIDI DI ZEA MAYS ATTRAVERSO LA SPETTROSCOPIA DI IMMAGINE Antonella Del Fiore a Massimo Reverberi b Patrizia De Rossi a Valentina Tolaini b Alessandra R
156. ampioni incrementali N di campioni incrementali a b Figura 2 Stima del livello di contaminazione del campione globale 250 reiterazioni del processo di simulazione In a simulazioni con 4 8 20 e 40 campioni elementari su sub partite generate con livelli E 100 ed Er 70 elevato grado d eterogeneita della sub partita in b stesse simulazioni effettuate su sub partite a basso livello d eterogeneit EL 30 Er 100 107 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev La possibilit di incorrere nella designazione erronea di campioni globali conformit o non conformit del lotto rispetto al valore di riferimento 5 ug kg varia considerevolmente per i piani di campionamento meno intensivi al variare del grado d eterogeneit con cui sono generate le sub partite 4 8 campioni incrementali Figura 3a b Diversamente l aumento a 20 o meglio a 40 incrementi consente di mantenere la variabilit della contaminazione dei campioni globali entro limiti pi contenuti CV compreso tra 10 e 20 a svantaggio tuttavia della praticit operativa delle fasi a valle soprattutto la preparazione del campione Infatti le difficolt di manipolazione di campioni globali cospicui nello specifico da 7 5 a 15 kg che nella pratica corrente tendono ad essere ridotti prima della macinazione vanificando almeno in parte il beneficio derivante da un elevato sforzo di campionamento Tuttavia i dati ottenuti indicano chiaramente che il prelievo di soli 8 campi
157. angimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali sempre dinamico sono specificati all articolo 33 del Reg CE 882 2004 Innanzitutto la collaborazione con il CRL Mycotoxin che organizza nella sua sede di Geel periodicamente ogni anno riunioni plenarie con i laboratori nazionali degli altri Stati Membri Europei In tale occasione possibile confrontarsi con tutta la rete di laboratori nazionali europei unitamente ad una consistente partecipazione di un numero di laboratori nazionali non europei che ha in questa sede la possibilit di rapportarsi con le realt europee 165 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Oggetto di tali riunioni sono un puntuale aggiornamento sulle metodiche la presentazione dei rapporti sui proficiency test organizzati ma soprattutto scambi su le pi diverse problematiche analitiche che caratterizzano l analisi delle micotossine Durante i passati incontri al JRC di Geel con il CRL Mycotoxins e tutta la rete dei laboratori nazionali sono stati discussi i risultati dei vari proficiency testing organizzati sono state discusse le modalit di calcolo dei limiti di quantificazione e rivelazione analitico Sono anche state presentate metodiche analitiche e strumentali specifiche in uso presso alcuni laboratori come l analisi di micotossine con la tecnica di cromatografia liquida con spettrometria di massa e l analisi di Tricoteceni con tecniche elettrochimiche Un altro compito degli LNR il co
158. ano duro 6 campioni di grano tenero 4 di avena e 4 di orzo La procedura di preparazione del campione prevede le seguenti fasi macinare finemente il campione da testare pesare 5 g del campione macinato in una falcon da 50 mL addizionare 25 mL di metanolo al 70 in acqua deionizzata estrarre per 3 minuti agitando manualmente filtrare il campione con carta Whatman 1 e raccogliere il filtrato diluire il filtrato 1 2 1 1 con metanolo al 70 diluire la soluzione precedente 1 7 1 6 con il tampone di diluizione e procedere all esecuzione del kit Procedura analitica Le analisi sono state effettuate in doppio per ogni singolo campione utilizzando un metodo immunoenzimatico ELISA e nello specifico un kit dell R biopharm con le seguenti specifiche limite di quantificazione Limit of Quantification LOQ 50 ng kg cross reattivit ZEA 100 a ZEA 41 6 soluzioni standard 0 50 150 450 1350 4050 ng kg Il recupero medio ottenuto durante le prove di validazione stato del 86 Per il kit sono state studiate le seguenti prestazioni specificit verifica dell errore 8 robustezza precisione Risultati Le prove per la verifica della specificit e dell errore B lt 5 sono state condotte parallelamente infatti a ciascun bianco campione stato associato il suo fortificato al livello di interesse nella stessa seduta analitica Pertanto sono stati testati 20 bianchi campione rappresentativi e i
159. ari a 1 0 e 2 0 mg kg I valori ottenuti sono risultati compresi tra 83 2 e 92 0 I limiti di rivelazione Limit of Detection LOD e di quantificazione Limit of Quantification LOQ sono stati rispettivamente di 0 03 e 0 08 mg kg OTA in tessuto muscolare e adiposo Dai valori di OTA relativi al tessuto muscolare e adiposo Tabella 1 si pu osservare per i gruppi T2 e T3 una contaminazione media di poco superiore a 1 00 ug kg limite massimo per le carni fissato dalla legislazione italiana Come riportato in precedenti lavori il tessuto muscolare risultato pi contaminato di quello adiposo Il rapporto percentuale tra la 48 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev concentrazione nel tessuto e quella nel mangime diminuisce dal gruppo T1 al T3 da 1 76 a 1 30 per il tessuto muscolare da 1 62 a 1 00 per quello adiposo Questi risultati indicano che nel caso di una somministrazione non molto prolungata nel tempo il passaggio di OTA dalla dieta ai tessuti basso e diventa non trascurabile solo ad alte concentrazioni nel mangime Con una contaminazione di 50 ug kg valore di riferimento per i mangimi per suini proposto dalla Commissione Europea nella Raccomandazione 2006 576 si possono avere concentrazioni di OTA nelle carni ad un livello vicino ad 1 ug kg Tabella1 Media dei livelli di OTA nei campioni di tessuto muscolare e adiposo Gruppo Tessuto muscolare ug kg Tessuto adiposo g kg media min max media min max TO lt LOD lt LOD
160. arina di arachidi DD 2 Farina di es Farina di mais 3 Latte Latte intero in polvere 1 Mangime composto 1 Mangime composto Succhi composte di frutta ecc Fruttasecca __ __Ll LL cate _ I Vino TT ET TC Sostanze di taratura Soluzioni di sostanze pure dried down Soluzioni di sostanze pure Soluzioni di sostanze 1 pure MIX 1 Soluzioni di sostanze pure marcate Sostanze pure 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 5 Reg CE 683 2004 Reg CE 1881 2006 s m i J DL vo 149 2004 Racc CE 17 08 2006 175 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Impiego di RM nella determinazione di micotossine Al fine di individuare le tipologie di RM da impiegare nelle diverse fasi del procedimento analitico in Figura 2 si riporta una schematizzazione della procedura analitica considerando sia le tecniche cromatografiche che quelle immunochimiche e campioni sia solidi es cereali frutta secca mangimi che liquidi es latte vino birra Campionamento 7 CAMPIONETQ CAMPIONE TQ latte vino birra cereali frutta secca mangimi eae Trasporto e conservazione Omogeneizzazione Campione solido anidro ___ Estrazione con solvente CHOH Campione in soluzione z p C H O Purificazione Preconcentrazione Test Solution Je Calibrant S solution T Ab N TECNICHE Blank traccianti CROMATOGRAFICHE
161. asi della procedura analitica 5 6 La fase pi critica rappresentata dalla ottimizzazione delle condizioni di estrazione che deve garantire recuperi accettabili per tutti gli analiti in esame In particolare la principale difficolt costituita dalla coestrazione delle Fumonisine insieme alle altre micotossine Per questo motivo la maggior parte dei metodi multi residuali ad oggi pubblicati non include le fumonisine o riporta recuperi non accettabili per queste tossine 7 9 Per la purificazione degli estratti sono state testate differenti colonnine per estrazione in fase solida con differenti livelli di successo 8 10 Alcuni autori optano invece per l analisi degli estratti mediante iniezione diretta 7 9 Tuttavia omettere completamente la purificazione del campione si traduce generalmente in un consistente effetto matrice sulla ionizzazione degli analiti che si ripercuote negativamente sulla sensibilit e sulla robustezza del metodo Tali metodiche pertanto sono da considerarsi metodiche di screening 247 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Presso i laboratori dell Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari ISPA CNR di Bari stato recentemente sviluppato un metodo accurato e riproducibile per l analisi simultanea di Aflatossine AFB AFB AFG AFG Ocratossina A OTA Fumonisine FB FB Tricoteceni Deossinivalenolo DON Tossina T 2 Tossina HT 2 e Zearalenone ZEA in mais 11 Il presente lavoro descrive l
162. ati rispettivamente 1 6 ug kg per AFB e 2 5 ug kg per le Aflatossine totali somma di B B G e G2 n 11 campioni 39 presentano un range di contaminazione per AFB compreso fra 0 1 e 0 5 g kg e n 4 campioni 14 valori superiori a 1 0 ug kg Figura 1 lt LOD 0 015 0 1 ug kg 0 1 0 5 g kg 0 6 1 ug kg 1 2 ug kg 7 26 DODOGE 11 41 Figura 1 Distribuzione della contaminazione di AFB Le prove di recupero condotte sulla matrice pesto hanno fornito valori compresi tra il 75 e 1 85 per ciascuna Aflatossina Per n 3 campioni i Limiti Massimi Tollerabili per 1 AFB e per le Aflatossine totali calcolati sulla base della percentuale complessiva di frutta a guscio presente anacardi e pinoli sono stati superati in tutti i tre casi l apporto preponderante di contaminazione stata ricondotta agli anacardi dichiarati presenti in percentuale rispettivamente del 10 e del 20 contro una percentuale di pinoli di valore inferiore ad 1 In due dei tre casi di cui sopra le partite di origine brasiliana sono risultate accompagnate esclusivamente da documentazione analitica attestante l assenza di Aflatossine rilasciate da laboratori del Paese di origine come del resto stato frequentemente riscontrato durante il monitoraggio un analisi della validit di tali certificazioni non stato l oggetto del nostro controllo comunque si riterrebbe auspicabile un controllo dei lotti in entrata adottando le tecniche
163. ato ogni 2 ore con cartina tornasole Il pH finale del chimo deve trovarsi in un range compreso tra 6 5 7 0 Al termine del processo il campione viene trasferito in falcon e centrifugato a 3500 rpm per 15 minuti Si ottiene cos la separazione del chimo il surnatante dalla matrice digerita il pellet La concentrazione delle micotossine viene determinata nel chimo previo desalting e clean up del campione mediante cartucce Sep Pak C18 Waters Co Milford MA USA Clean up dei campioni mediante cartucce Sep Pak C18 Allo scopo di rimuovere i sali e gli enzimi dai campioni sottoposti a digestione prima dell analisi questi vengono sottoposti a clean up mediante colonnine Sep Pak dotate di fase stazionaria C18 La rappresentazione schematica del modello di digestione in vitro e delle fasi di preparazione del campione che ne seguono riportata in Figura 1 6 mL succo gastrico pH 2 3 Desalting mediante 2 g di campione macinato Lavaggio con 2 mL di metanolo pH 68 7 5 min Condizionamento con 2 mL di acqua Caricamento del di chimo 2 ore cartucce Sep Pak ay Lavaggio tag aes con acqua duodenale 3 mL bile 1 mL Na CO Analisi LC ESI MS MS 2 ore j Centrifuga pH 6 5 7 Eluizione con acqua acetonitrile 1 1 Figura 1 Rappresentazione schematica del modello di digestione in vitro qui applicato e del desalting del chimo grezzo prim
164. atologico micotossicosi sia dell uomo che degli animali 1 Tra le diverse micotossine oggi note la Fumonisina B FB l Aflatossina Bj AFB la Tossina T 2 e il Deossinivalenolo DON per la loro ampia diffusione soprattutto come contaminanti dei cereali sono oggetto di estremo interesse medico e tossicologico 2 4 Tra i diversi effetti che possono seguire l esposizione a queste molecole l immunosoppressione probabilmente quello che suscita maggiore interesse per i possibili risvolti negativi sulla salute umana e animale 4 In molti animali da laboratorio e d allevamento ad esempio l esposizione alle Aflatossine induce riduzione della risposta immunitaria umorale e o cellulo mediata 5 L immuno soppressione negli animali un effetto noto anche per molte Fusarium tossine come le Fumonisine e i Tricoteceni es Tossina T 2 DON e Nivalenolo 6 8 L immuno soppressione un effetto con implicazioni rilevanti per gli animali da reddito in quanto per tale via l esposizione alle micotossine pu predisporli alle infezioni con importanti cali della performance e un incremento dei rischi di trasmissione all uomo di patogeni quali Salmonella e Listeria 9 Attualmente i meccanismi secondo cui le micotossine possono indurre l immuno soppressione non sono ancora completamente chiariti tuttavia l induzione dello stress ossidativo appare tra i pi plausibili Infatti ben documentato come alcune micotossine po
165. atte diverso dai bovini mangimi per suini mangimi complementari o completi Tabella 3 Numero di campioni per il piano di vigilanza sulla contaminazione da micotossine Aflatossina B4 Ocratossina A Zearalenone Deossinivalenolo Fumonisine Regione N campioni per Regione Abruzzo 30 Basilicata 15 Bolzano 40 Calabria 20 Campania 30 Emilia Romagna 80 Friuli Venezia Giulia 80 Lazio 40 Liguria 15 Lombardia 80 Marche 20 Molise 10 Piemonte 80 Puglia 40 Sardegna 10 Sicilia 20 Toscana 30 Trento 40 Umbria 10 Valle d aosta 10 Veneto 80 Totale 780 73 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Provvedimenti da adottare in caso di non conformita Nel caso di riscontro di valori non conformi sui campioni prelevati si procedera nel modo seguente a se i valori non conformi si riferiscono all Aflatossina B PIZS comunica il risultato alla Azienda Unit Sanitaria Locale competente che provvede ad un nuovo campionamento ufficiale delle materie prime costituenti la razione alimentare e dispone l esecuzione dei controlli sulla produzione di latte e ogni altro adempimento previsto dalla normativa vigente L eventuale analisi di revisione sar effettuata dall Istituto Superiore di Sanit b se i valori non conformi si riferiscono all Ocratossina A PIZS comunica il risultato alla AUSL competente che provvede al campionamento delle materie prime costituenti la razione alimentare Il servizio veterinario della AUSL se
166. atterizzare un campione sia rispetto alle sue propriet spettrali che a quelle superficiali producendo una completa informazione spettrale in termini di riflettanza trasmittanza o assorbanza per ciascun punto dell immagine acquisita da esso ad una specifica lunghezza d onda Materiali e metodi Le prove di analisi spettroscopica sono stati condotte con differenti ceppi fungini tossigeni e differenti ibridi commerciali di mais Ceppi fungini e condizioni colturali Per le prove sono stati impiegati ceppi fungini commerciali della collezione del Prof C Fanelli dell Universit Sapienza di Roma Aspergillus parasiticus NRRL 2999 Aspergillus parasiticus NRRL 11096 Aspergillus niger Penicillium expansum ceppi cortesemente forniti dalla North Carolina State University Raleigh USA Aspergillus flavus NRRL 3357 e dall Universit di Sassari Fusarium verticilloides e Fusarium graminearum Sono stati utilizzati anche ceppi fungini isolati dai campioni di mais analizzati durante lo svolgimento della attivit di ricerca in oggetto 182 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Ibridi di mais Gli ibridi di mais Zea mays L utilizzati nelle prove sperimentali DK 537 Latina Cecilia Arsano DKC 6843 Costanza sono stati cortesemente forniti dall Istituto Sperimentale di Cerealicoltura di Roma Le analisi spettrali su mais contaminato artificialmente con le specie fungine di interesse analitico sono state eseguite sulla cultiva
167. atura sia per la contaminazione dei campioni Bibliografia 1 Unione Europea Regolamento CE n 1881 2006 della Commissione del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari GUCE L364 20 dicembre 2006 aggiornato il 23 luglio 2008 2 Unione Europea Regolamento CE n 401 2006 della Commissione del 23 febbraio 2006 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari GUCE L70 9 marzo 2006 AlfaOchra HPLC Instruction Manual GN MC9521 1 VICAM Science Technology 03 08 1999 AOAC Official method 999 07 Aflatoxin B1 and total Aflatoxins in peanuts butter pistacchio paste fig paste and paprika powder AOAC International 2000 AOAC Official method 2000 03 Ochratoxin A in barley AOAC International 2002 R Biopharm Rh6ne LTD Application note for DZT Multi Myco IACs for LCMS determination Ref N A1 P73 V2 Aug 2007 Do Ww non WN 210 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev VALIDAZIONE INTRA LABORATORIO DI UN METODO ELISA PER LA RIVELAZIONE DELL AFLATOSSINA M IN LATTE Pasquale Gallo a Grazia Guadagnuolo a Valentina Pellis b Chiara Tarantino b Carmela Rossini a Luigi Serpe a a Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno Portici b EuroClone SpA Pero Milano Introduzione In generale nel laboratorio di controllo ufficiale necessario eseguire uno studio di
168. azione Figura 1 Quantificazione di DNA di A carbonarius in campioni di uva inoculata 1 5 conidi gr di bacca d uva e incubati per 6h 12h 24h a 30 C Il DNA stato quantificato usando la SYBR Green PCR real time con i primer pks Acpksfor Acpksrev2 I valori sono il risultato di tre repliche in tre esperimenti indipendenti 100000 100 N conidi g matrice 10 0 6 24 40 48 ore di incubazione Figura 2 Numero di conidi presenti su grammo di bacca d uva dopo 0 6 24 40 48 ore di incubazione a 30 C Ciascuna bacca d uva stata inoculata con 1 5 conidi 10 uL I valori sono il risultato di tre repliche in tre esperimenti indipendenti 195 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Nero d Avola 0 29 Montepulciano S 0 30 Negro Amaro a 1 41 Merlot 0 39 Negro amaro 0 47 Figura 3 Quantificazione di DNA di A carbonarius per tipologia di cultivar su campioni di uva raccolta che ad una ispezione visiva mostravano evidenti segni di marciume Il DNA stato quantificato usando la PCR Real Time con i primer Acpksfor Acpksrev2 e SYBR Green I valori sono il risultato di tre repliche in tre esperimenti indipendenti Conclusioni La possibilit di controllare efficacemente le contaminazioni fungine in particolare quelle da funghi micotossigeni rappresenta uno dei principali obiettivi da perseguire in campo alimentare per ottenere alimenti di alta qualit In tale contesto rientra questo stud
169. azione del DNA Le bacche d uva sono state sottoposte ad estrazione del DNA utilizzando il metodo TRIS SDS Lysis Buffer E stato inoltre estratto il DNA da sei differenti cultivar d uva prelevate in due differenti stazioni italiane zone di Velletri e di Bari Polymerase Chain Reaction Real Time Due set di primer specie specifici sono stati disegnati usando il software Primer Express Una coppia stata disegnata sulla base di regioni ITS Internal Transcribed Spacer note per il loro utilizzo negli studi filogenetici Tali primer AcITSfor2 AcITSrevl 5 GTGAAGTCTGAGTCGATTGTT 3 5 GGAAAAAAAGGTTGGAGTT 3 amplificano un frammento di 239 bp L altra coppia di primer stata disegnata sulla base di sequenze parziali del gene codificante per la polichetide sintasi Gene Bank AY540952 enzima responsabile della biosintesi dell OTA in questo caso i primer Acpksfor Acpksrev2 5 GCAGCGGGAGTCAATGTAAT 3 5 GCGTCGTACAAAGCCTCTT 3 amplificano un frammento di 330 bp Diluizioni note di DNA plasmidico 0 01 pg 1 ug contenente il frammento d interesse sono state preliminarmente amplificate e quantizzate per ottenere la curva di taratura R 0 99 il segnale di fluorescenza stato messo in relazione al quantitativo di DNA nei campioni Le condizioni ottimali di amplificazione sono stete 95 C per 10 min 45 cicli a 95 C per 15 secondi 67 1 C per la coppia di primer Acpksfor Acpksrev2 oppure 66 C per la coppia AcITSfor2 AcI
170. azione di conserve alimentari tipo il pesto alla genovese e la salsa di noci siano in grado di apportare al prodotto finito contaminazione dosabile da AFB e totali anche se a livelli relativamente contenuti inferiore ai valori di 2 ug kg di AFB e 4 ug kg di Aflatossine totali indicati nell allegato al Reg CE 1881 2006 quali tenori massimi specifici per la frutta secca o a guscio pronti al consumo o utilizzati come ingredienti di prodotti alimentari su tre dei 24 campioni positivi stato verificato il superamento del limite massimo tollerabile calcolato come previsto dall articolo 2 del Reg CE 1881 2006 sulla base 127 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev della percentuale complessiva d ingredienti a rischio utilizzata nel prodotto Le aziende alimentari che utilizzano tale ingrediente devono adottare delle procedure permanenti basate sul sistema HACCP che tengano conto del rischio di contaminazione da Aflatossine in particolare a livello della selezione dei fornitori e dei controlli analitici antecedenti all introduzione in produzione tenendo presente quanto previsto agli articoli 2 e 3 del Reg CE 1881 2006 Come autorit di controllo il nostro servizio intervenuto sulle aziende che non risultavano aver predisposto le procedure di cui sopra chiedendo i correttivi necessari e le azioni preventive il pi possibile commisurate all entit delle aziende stesse Auspichiamo che la maggiore attenzione alle caratteristiche di sicurezza
171. azione positiva tra il livello di OTA ematico e il consumo di pasta uova burro e salumi si osservata anche una correlazione negativa con il consumo di olive e di frutta a testimonianza della loro probabile azione antiossidante favorendo l escrezione della tossina attraverso le urine Riferendosi solo ai dati relativi alle donne stata invece rilevata una correlazione positiva con il consumo di formaggi stagionati Nella Tabella 1 sono evidenziati i dati significativi p lt 0 05 con i relativi coefficienti di regressione lineare B SEM Standard Error of Mean positivi correlazione diretta con l OTA o negativi correlazione inversa con OTA in considerazione del campione globale Tabella 1 Coefficienti di regressione lineare B SEM tra il livello ematico di OTA e il consumo di alcuni alimenti campione globale n 341 Alimenti B SEM P Frutta 0 097 0 024 Olive 0 108 0 045 Pasta 0 087 0 040 Salumi 0 107 0 020 Uova 0 089 0 040 Burro 0 093 0 051 OTA e parametri ematici L ingestione di OTA stata correlata con diversi parametri ematici ed emersa una significativa correlazione con la proteina C reattiva ad indicare come l ingestione di OTA determini uno stato infiammatorio nell organismo Ulteriore conferma dell azione pro infiammatoria dell OTA data dalla correlazione positiva tra il livello ematico della tossina e quello di una proteina marker dell infiammazione Rapporti ISTISAN 10
172. azione post colonna 4 per OTA Fase mobile acetonitrile H O acido acetico 51 47 2 v v v Flusso 1 0 mL min Lunghezza d onda di eccitazione 333 nm lunghezza d onda di emissione 443 nm Volume di iniezione 200 uL Tempo di analisi 12 min 5 Preparazione del campione DZT 25 g di campione finemente macinato sono estratti con 100 mL di metanolo acqua 75 25 v v dopo 30 minuti di agitazione l estratto viene passato su filtro di carta Per i campioni di cereali 2 mL di filtrato sono diluiti con 48 mL di PBS per i baby food 5 mL di filtrato sono diluiti con 120 mL di PBS L estratto diluito filtrato su fibra di vetro e passato su colonnina di immunoaffinit DZT R Biopharm Rh6ne LTD 25 mL per i cereali 100 mL per i baby food 205 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev alla velocit di 1 2 gocce al secondo 6 La colonnina lavata con 10 mL di H20 Le tossine sono eluite con 2 mL di metanolo e la colonnina asciugata facendo flussare aria Il campione viene portato a secco sotto vuoto con evaporatore rotante con bagnomaria a 35 C Il residuo disciolto in 1 mL di metanolo H 0 20 80 v v SmM acetato di ammonio e analizzato in LC MS MS Analisi in LC MS MS Lo strumento utilizzato per l identificazione e la quantificazione di DON ZEA T2 e HT 2 un HPLC Alliance 2695 combinato con uno spettrometro di massa Tandem Quattro Micro TM API Waters Milliford MA USA Lo spettrometro opera in modalit MRM Multiple Rea
173. baby food 209 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 5 Monitoraggio dei 37 campioni commerciali di creali e baby food analizzati nel 2009 Micotossina Cereali 1 colazione Baby food pg kg n campioni pg kg n campioni AFB lt 0 5 11 lt 0 05 16 0 5 2 0 0 05 0 10 OTA lt 0 8 11 lt 0 08 16 0 5 3 0 0 08 0 50 DON lt 60 5 lt 60 16 60 500 6 60 200 ZEA lt 10 8 lt 10 16 10 50 3 10 20 T2 lt 10 11 lt 10 15 gt 10 gt 10 1 HT 2 lt 10 9 lt 10 15 gt 10 2 gt 10 1 Conclusioni In questo lavoro sono stati messi a punto due metodi il primo per la determinazione simultanea di AFLA e OTA con quantificazione mediante HPLC Fluorimetro il secondo per DON ZEA T2 e HT 2 con analisi in LC MS MS I metodi sono entrambi accurati selettivi e sensibili I bassi limiti di rivelazione ne consentono l applicazione per il controllo ufficiale di cereali e alimenti destinati alla prima infanzia baby food I recuperi ottenuti tutti compresi tra 60 e 100 soddisfano i criteri di rendimento indicati dal Reg CE 401 2006 I due metodi presentano alcuni vantaggi in termini di riduzione dei tempi e dei costi di analisi con due sole colonnine di immunoffinit possibile controllare sullo stesso campione 9 micotossine Inoltre il metodo per DON ZEA T2 e HT 2 necessita di una sola corsa cromatografica e fa uso di un unica soluzione di lavoro contente le 4 tossine in miscela sia per la preparazione della retta di tar
174. boliti nella filiera dei cereali Claudia Falavigna Chiara Dall Asta Gianni Galaverna Arnaldo Dossena Rosangela Marchelli ii Influenza del suolo sulla produzione di Ocratossina A lungo la filiera vitivinicola Nicola Gebbia Maria Monte Gioacchino Aiello Alessio Calderone Francesco Cannizzaro Alice Curione Aurelia Lo Giudice Maria Montalbano Francesca Oliveri Lucia Crosta iii Fattori influenti sullo sviluppo fungino nella granella di mais effetto della temperatura su umidit e water activity durante la maturazione Andrea Maiorano Mattia Ciro Mancini Amedeo Reyneri iii Contaminazione da Ocratossina A e Tricoteceni di biscotti prelevati al dettaglio Amedeo Pietri Terenzio Bertuzzi Barbara Agosti Gianluca Donadini este eteeees Contaminazione indiretta e diretta da Ocratossina A di carni e salumi tipici Amedeo Pietri Terenzio Bertuzzi Alessia Gualla Mauro Morlacchini Gianfranco Piva Aflatossina M nel latte distribuzione tra i prodotti della trasformazione casearia tipo grana Amedeo Pietri Terenzio Bertuzzi Annalisa Mulazzi Gianfranco Piva Alberto Pecorari Gianluca Gambini Marco Nocetti iii SECONDA SESSIONE Gestione del rischio da micotossine Controllo ufficiale delle micotossine in Italia SUVIO Borrello Spesa iero BI oi dai iaia al ts Dinan I es de Piano pluriennale di vigilanza e sorveglianza sull alimentazio
175. ccolta ma anche dopo la raccolta nel caso in cui la derrata non venga adeguatamente conservata La contaminazione da T 2 ed HT 2 si manifesta di frequente a concentrazioni pi basse nelle derrate di frumento orzo granturco segale e a livelli pi elevati nell avena 2 La presenza dei Tricoteceni nelle derrate alimentari rappresenta un rischio per la salute degli uomini e degli animali essa causa di intossicazioni acute e croniche provocando vomito infiammazioni emorragie mancanza di appetito diarrea alterazioni ematiche disordini del sistema nervoso distruzione del midollo osseo Il meccanismo secondo cui vengono causati i danni alla salute implica l interazione delle tossine con DNA RNA inibendo la sintesi delle proteine e impedendo la proliferazione dei tessuti in particolare midollo osseo sistema immunitario e cellule epiteliali Le caratteristiche tossicologiche variano a seconda del tricotecene ingerito e della specie animale o umana che lo ha assunto in generale T 2 ed HT 2 sono tra i Tricoteceni con pi alto effetto tossico 3 La tossicit di questi due metaboliti interconnessa e esse non possono essere valutate singolarmente in quanto la Tossina T 2 in vivo rapidamente trasformata in HT 2 all interno del tratto intestinale Questo implica che la contaminazione da T 2 ed HT 2 va valutata considerando la presenza complessiva delle due I tenori massimi di tossina nelle varie matrici alimentari non sono ancora
176. celta per la fabbricazione del vetrino microarray la sure print inkjet technology messa a punto da Agilent in cui gli oligonucleotidi vengono sintetizzati in situ cio base per base direttamente sul vetro chimicamente attivato utilizzando la chimica standard delle fosforammiditi www agilent chem dnamicroaary I vantaggi offerti da questa tecnologia derivano non solo dal livello molto alto della qualit del vetrino e del singolo spot a garanzia di un ottima riproducibilit del dato ma anche dalla flessibilit della piattaforma facilmente adattabile alle esigenze specifiche del cliente In tutti i microarray dedicati allo studio dell espressione genica presenti nel catalogo Agilent gli oligonucleotidi hanno una lunghezza di 60 bp 60 mer Molti studi hanno infatti dimostrato che gli oligonucleotidi 60 mer raggiungono in ibridazione il giusto compromesso tra specificit e sensibilit 15 La piattaforma Agilent gi stata utilizzata per il disegno di microarray specificatamente dedicati a batteri con risultati in generale di buona qualit in termini di riproducibilit e accuratezza 16 Il punto pi critico di tutto il processo di progettazione e produzione di un vetrino microarray sta principalmente nella selezione degli oligonucleotidi sonda da utilizzare ossie nel probe design La temperatura di melting Tm il parametro principale per selezionare il set di oligonucleotidi su cui eventualmente applicare ulteriori filtri Con
177. clusa nel Piano Nazionale Integrato PNI o MANCP previsto dagli art 41 44 del Reg CE 882 2004 al fine di garantire l effettiva attuazione dell art 17 2 del Reg CE 178 2002 e delle norme sulla salute e sul benessere degli animali 65 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Il Piano Nazionale Integrato deve rispondere ad alcuni requisiti di riferimento e in particolare deve essere unico cio deve descrivere la struttura generale del sistema nazionale di sicurezza e prevenzione gli obiettivi strategici i criteri delle azioni le risorse umane coerente completo e integrato al fine di migliorare il sistema incrociato di analisi tra 1 controlli ufficiali effettuati dalle differenti autorita competenti in tutti i settori e a tutti i livelli della catena alimentare e dei mangimi identificare le eventuali sovrapposizioni o l assenza di controlli assicurare l efficacia e l efficienza del sistema di controllo uficiale basato sulla valutazione e categorizzazione del rischio al fine di assicurare il coordinamento sulla valutazione del rischio sono state nominate la Commissione Strategica Nazionale e la Commissione Nazionale per la Sicurezza alimentare Decreto del 26 10 2007 Organizzazione delle funzioni di cui al Reg CE 178 2002 pluriennale attualmente in vigore un Piano quadriennale PNI 2007 2010 aggiornato annualmente 66 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev PIANO PLURIENNALE DI VIGILANZA E SORVEGLIANZA SULL ALIME
178. co per la determinazione dell Aflatossina B nelle derrate alimentari Francesca Diana Vanessa Bacer Barbara Puppini Lidija Persic Maurizio Paleologo 197 Analisi multiresiduo di micotossine in cereali per la prima colazione e baby food con tecnica HPLC fluorimetro e HPLC MS MS Maria Ferrari Barbara Romagnoli Cecilia Bergamini 204 Validazione intra laboratorio di un metodo ELISA per la rivelazione dell Aflatossina M in latte Pasquale Gallo Grazia Guadagnuolo Valentina Pellis Chiara Tarantino Carmela Rossini Luigi Serpe iii Analisi di Deossinivalenolo valutazione inter laboratorio del lettore RIDA QUICK SCAN Dominique Jonville Bernhard Reck Marcel Bony iiiii Analisi mediante Aflaochra prep in associazione all HPLC in fluorescenza per la determinazione delle Aflatossine totali e dell Ocratossina A David Leeman Elaine C Marley o A EAN E EEO R Fumonisine B e B in prodotti alimentari a base di mais ottimizzazione e validazione del metodo analitico mediante HPLC FLD con derivatizzazione chimica post colonna e monitoraggio su campioni reali Sonia Lo Magro Donatella Nardiello Maria Campaniello Marco lammarino Carmen Palermo Marilena Muscarella ii Aflatossine B B2 G e G in prodotti alimentari e alimenti per uso zootecnico validazione del metodo di conferma HPLC con derivatizzazione fotochimica online e rivelazione fluorimetrica
179. come un aggravio dei costi di produzione ma una volta spiegata la situazione e l importanza di tale strategia si instaurato un rapporto di fiducia e collaborazione Porre questa soglia limite ha significato infatti due risultati immediati poter prevenire l insorgere di contaminazioni gravi avendo sempre un margine d intervento nel rispetto del limite di legge poter stabilire con certezza quale alimento presente in stalla fosse contaminato con AFB e quindi non idoneo all alimentazione delle vacche La riprova che tale strategia era vincente si avuta durante l autunno del 2003 quando in seguito ad un annata particolare il mais per uso zootecnico si rivelato particolarmente contaminato mettendo in allarme tutto il settore crisi che stato possibile gestire avendo gi una buona conoscenza del problema Questo periodo cruciale ha fatto da spartiacque per il controllo delle micotossine nel latte dando il via ad un grande impegno da parte di tutti gli operatori della filiera e soprattutto dei produttori di mangimi che hanno fatto da volano per il netto miglioramento che si avuto negli anni successivi A titolo d esempio sempre citando l esperienza di Newlat si pu dire che a differenza di alcuni anni addietro attualmente gli episodi pi significativi di contaminazione da AFB nel mais si riscontrano prevalentemente in partite prodotte in proprio dagli allevatori e non pi su mangimi acquistati sul mercato Anche d
180. concentrazione 160 ug L di FB e FB2 A e di un campione di polenta naturalmente contaminato B Il metodo ottimizzato stato validato integrando il Reg CE 401 2006 11 con i protocolli europei in materia di validazione 10 12 e seguendo le indicazioni riportate nella linea guida degli IZS per la validazione intra laboratorio dei metodi di conferma per la determinazione di micotossine Sono state valutate le performance analitiche quali specificit linearit ripetibilit recupero limite di rivelazione Limit of Detection LOD e quantificazione Limit of Quantification LOQ stata verificata la rispondenza dei requisiti analitici Tabella 3 ai criteri previsti dal Reg CE 401 2006 11 confermando l applicabilit del metodo alla determinazione del tenore di Fumonisine nei prodotti alimentari Tabella 3 Parametri di validazione valutati recuperi e Relative Standard Deviation RSD su campioni di cornflakes additivati Fumonisina Livello di Recupero RSD contaminazione valore medio Intra day n 6 Inter day n 12 g kg SD By 100 94 2 6 8 3 4 7 2 200 89 3 6 9 3 7 7 7 300 87 0 2 4 1 9 2 7 400 76 5 8 4 4 1 11 Bo 100 71 4 6 5 4 7 9 1 200 74 8 6 2 4 5 8 3 300 69 9 3 3 2 3 4 6 400 66 8 4 9 3 6 7 0 Il contenuto di Fumonisine determinato in 100 prodotti alimentari a base di mais ed espresso come somma di FB FB riportato nelle Figure 2 e 3 in funzione delle diverse tipologie di camp
181. conidica di Aspergillus flavus 3357 e incubato in termostato a 30 C per 10 giorni Lunghezza d onda 470 nm Contrasto Differenza Differenza Critical value p gt Diff Significativo standardizzata 1 giorno vs non inoculato 0 026 1 137 2 014 0 261 NO 2 giorni vs non inoculato 0 077 3 427 2 014 0 001 S 3 giorni vs non inoculato 0 068 3 049 2 014 0 004 S 4 giorni vs non inoculato 0 079 3 504 2 014 0 001 S 10 giorni vs non inoculato 0 063 2 789 2 014 0 008 S Conclusioni I risultati ottenuti indicano che la spettroscopia di immagine permette in primo luogo di discriminare tra differenti specie fungine producendo per ciascuna di esse uno specifico profilo spettrale la cosiddetta firma spettrale Questa importante propriet pu essere sfruttata per effettuare il riconoscimento di diverse specie fungine attraverso il confronto con standard spettrali di funghi noti La metodica analitica basata sulla spettroscopia d immagine presentata in questo studio stata sviluppata su mais contaminati in laboratorio con specie fungine commerciali e con specie fungine isolate dal mais stesso e poi verificata su campioni naturalmente contaminati Essa ha consentito una precoce rilevazione dei contaminanti fungini sul mais riuscendo a discriminare precocemente i campioni di mais non contaminati da quelli contaminati sulla base delle variazioni prodotte dalla contaminazione fungina nel profilo spettrale del mais La variabilit dei dat
182. ction Monitoring con ionizzazione elettrospray ESI in modalit alternata negativa positiva negativa I parametri di massa sono stati ottimizzati mediante infusione diretta a un flusso di 10 uL min di 4 soluzioni contenenti le singole tossine a una concentrazione di 2 ug mL per ZEA T2 e HT 2 la soluzione di infusione stata preparata in metanolo per DON in metanolo acqua 20 80 v v SmM di ammonio acetato In Tabella 1 sono indicati i parametri di tuning dello ione precursore e dei frammenti selezionati per i quattro composti I parametri operativi ottimali sono voltaggio del capillare 4 0 kV temperatura della sorgente ESI 120 C temperatura di desolvatazione 400 C flusso del gas di desolvatazione 300 L h azoto prodotto dal generatore High Purity Nitrogen Generetor Peak Scientific Scozia Per la separazione cromatografia stata utilizzata una colonna Discovery C18 25 cm x 2 1 mm 5 um termostatata a 25 C L eluizione condotta in gradiente come indicato in Tabella 2 Il flusso della fase mobile 0 3 mL min e il tempo di analisi di 30 minuti Per l acquisizione e l elaborazione dei dati si utilizzato il software MassLynx 4 0 Waters Milliford MA USA Tabella 1 Parametri di tuning degli ioni precursori e dei frammenti selezionati Analita Tr lon Voltaggio Transizione di Energia di Transizione Dwell min mode Cono V quantificazione collisione di conferma s eV DON 11 30 ESI 15 0 355
183. culato come l esposizione a FB sia responsabile della perturbazione di delicati equilibri tra integrit strutturale delle membrane e suscettibilit della cellula o suoi componenti al danno ossidativo 44 La compromissione chimico strutturale delle membrane dovuto a lipoperossidazione pu inoltre contribuire al verificarsi di danno ossidativo a carico del DNA con possibili effetti genotossici come dimostrato su linfociti caprini esposti ad AFB 45 Conclusioni Il modello sperimentale utilizzato per studiare il potenziale ossidativo e citotossico di alcune micotossine risultato di pratica applicabilit sensibile e non invasivo Il linfocita bovino risulta influenzato dall esposizione in vitro alle micotossine spesso in maniera tempo e o dose dipendente con effetti riconducibili allo stress ossidativo Il presente studio contribuisce a 12 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev chiarire 1 meccanismi attraverso cui le micotossine inducono stress ossidativo nei sistemi cellulari animali Le risultanze sperimentali e la letteratura consultata suggeriscono l ipotesi che lo stress ossidativo sia da considerare quale risultato finale dell azione tossica delle micotossine e che la conseguente riduzione della sintesi e della disponibilit di difese antiossidanti intensificherebbe il verificarsi del danno cellulare L alterazione delle popolazioni linfocitarie pu essere responsabile della depressione della risposta immunitaria in animali
184. da 2 soli campioni di laboratorio Infine in 6 casi 4 di arachidi e 2 di pistacchi tutti e tre i campioni di laboratorio sono risultati contaminati a concentrazioni superiori a 2 ug kg Nei campioni che presentano 2 o 3 campioni di laboratorio contaminati i livelli di concentrazione sono mediamente superiori rispetto a quelli con 1 solo campione contaminato 81 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev tranne nel caso di un campione di fichi stato sempre trovato almeno un campione di laboratorio con valori di Aflatossina Bj maggiori di 10 pg kg fino ad arrivare a contaminazioni molto elevate di 50 100 ug kg Di conseguenza anche i valori di contaminazione media del campione globale sono spesso superiori a 10 ug kg Considerando in generale i livelli di contaminazione trovati si osserva che solo in 16 dei 27 campioni con almeno 1 campione di laboratorio non conforme rispetto all attuale limite di legge di 2 ug kg sono state trovate concentrazioni superiori a 14 2 ug kg Questo valore tenuto conto dell incertezza di misura 6 2 ug kg risulterebbe compatibile con un limite di 8 pg kg Attualmente un comitato scientifico incaricato dalla commissione europea sta valutando 1 rischi sulla salute umana potenzialmente legati ad un innalzamento a 8 ug kg per l Aflatossina B e a 15 ug kg per le Aflatossine totali dei livelli massimi consentiti in arachidi e pistacchi 10 Dall analisi di questi risultati emerge che nella maggior parte dei casi
185. dard inferiore al 6 3 I limiti di rivelazione Limit of Detection LOD rapporto segnale rumore 3 1 e di quantificazione Limit of Quantification LOQ rapporto segnale rumore 10 1 sono risultati rispettivamente di 0 02 e 0 05 ug kg per POTA 2 e 5 ug kg per i TCT di tipo B e di 10 e 20 g kg per quelli di tipo A Contaminazione da OTA dei biscotti La contaminazione da OTA nei biscotti risultata bassa Tabella 1 sempre molto inferiore ai limiti di legge La percentuale di campioni positivi stata del 53 3 e il valore pi elevato 44 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev risultato pari a 0 74 ug kg Solo in 3 campioni 5 0 stata riscontrata una contaminazione da OTA superiore a 0 50 ug kg limite per il baby food il valore medio globale stato pari a 0 15 0 18 ug kg Non stata rivelata nessuna differenza statisticamente significativa tra le marche considerate stata invece osservata una maggiore anche se limitata contaminazione per i campioni di ogni marca relativi al quinto e sesto prelievo agosto settembre 2008 Tabella 1 Contaminazione da OTA pg kg dei biscotti prelevati a cadenza mensile Data Marca biscotti A B c D E hard discount 1 aprile 2007 lt 0 02 lt 0 02 lt 0 02 lt 0 02 lt 0 02 2 maggio 2007 0 08 lt 0 02 0 08 lt 0 02 lt 0 02 3 giugno 2007 lt 0 02 lt 0 02 lt 0 02 lt 0 02 lt 0 02 4 luglio 2007 lt 0 02 0 08 0 13 0 13 0 24 5 agosto 2007 0 37 0 35 0 51 0 12 0 18 6 settembre2007 0 48 0
186. definiti per la valutazione della specificit della precisione del calcolo di LOD e LOQ della linearit della risposta strumentale La linea guida parte integrante delle procedure del sistema qualit aziendale degli IZS e in alcuni Istituti stata estesa anche alla validazione dei metodi di prova per l analisi delle micotossine negli alimenti ad uso umano e ad uso zootecnico Bibliografia i Gruppo di lavoro dei Laboratori di Chimica degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali Linea guida per la validazione intra laboratorio dei metodi di prova di conferma per la determinazione delle Sostanze di Categoria B SEZIONE 4 MICOTOSSINE 2007 Unione Europea Regolamento 401 2006 CE of 23 Febraury 2006 laying down the methods of sampling and analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs Official Journal L 70 9 marzo 2006 3 Unione Europea Regolamento 1881 2006 CE of 19 December 2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs Official Journal L 364 20 dicembre 2006 4 Unione Europea Regolamento 882 2004 CE of 29 April 2004 on official controls performed to ensure the verification of compliance with feed and food law animal health and animal welfare rules Official Journal L 191 28 maggio 2004 5 Unione Europea Decisione 2002 657 CE of 12 August 2002 implementing Council Directive 96 23 EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of re
187. del ceppo In Tabella 4 sono elencate alcune caratteristiche generali del genoma di V fischeri ES114 e tutte le sequenze sono state scaricate in formato FASTA dal sito dal database CMR Comprehensive Microbial Resource del TIGR The Institute of Genomic Research Tabella 4 Genoma completo di V fischeri ES114 18 Nome Riferimento GenBank Lunghezza Contenuto Proteine RNA sequenza Mbp in GC Cromosoma NC_006840 CP000020 2 9 39 0 2586 150 Cromosoma Il NC_006841 CP000021 1 3 37 0 1175 15 Plasmide pES100 NC_006842 CP000021 0 046 38 4 57 149 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Abbiamo utilizzato il metodo best probe con una Tm di 80 C per disegnare il microarray di V fischeri preferendo una sola probe per gene replicata pi volte rispetto a pi probe distribuite lungo il gene forti anche del fatto che molti studi sostengono che per oligonucleotidi della lunghezza di 60 basi una sola probe scelta accuratamente sia pi che sufficiente Per tutte le 3747 probe disegnate dal GE probe design tool di e array stata anche valutata la potenzialit di ibridare con un altro gene appartenete al V fischeri cio di cross ibridare mediante l applicazione software Olicheck Il formato di microarray scelto per il V fischeri un 8X15K dove nello stesso vetrino sono contemporaneamente presenti 8 array da 15000 feature circa Per ciascun array il probe set del V fischeri stato replicato 3 volte e in pi sono state aggiunte
188. dell inquinamento da micotossine sugli aspetti produttivi Le differenze riscontrabili tra le aziende sono risultate essere legate pi alla diversa fase di lattazione in cui si trovavano le bufale al momento del prelievo che ad inquinamento da Aflatossine Determinazione del contenuto in AFM In considerazione del fatto che la variabilit del passaggio di AFB nel latte sottoforma di M legata ai seguenti fattori stadio di lattazione passaggio superiore a inizio lattazione produzione di latte lattazione stato clinico della mammella presenza di mastiti variabilit individuale ed et dei soggetti Sono stati scelti animali quanto pi omogenei tra di loro in modo da ridurre al minimo la possibilit che differenti quantit di M fossero legata alle variabili indicate Nelle aziende esaminate i valori riscontrati sono stati i seguenti Tabella 3 Tabella 3 Percentuale di positivit all AFM Azienda campioni positivi all AFM A 2 B 3 C 5 D 4 E 2 F 5 G 4 H 3 Tenendo conto del fatto che AFM una molecola semipolare che nel latte si lega principalmente alla caseina possiamo dedurre che nella produzione del formaggio circa il 50 della tossina iniziale si ritrover nella cagliata e pertanto le concentrazioni nel formaggio potranno essere sensibilmente pi alte di quelle del latte con cui stato prodotto 98 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Considerando che la lavorazione del f
189. delle materie prime relativamente al rischio di contaminazione da Aflatossine da noi imposta alle aziende conserviere locali determini l instaurarsi di un meccanismo virtuoso che partendo dalla selezione dei fornitori operata a livello di aziende utilizzatrici si riverberi positivamente anche a livello dell importazione Bibliografia 1 Freire FCO Kozakiewicz Z Russell R Paterson M Mycoflora and mycotoxins of Brazilian cashew kernels Mycopathologia 1999 45 95 103 2 Leszezynska J Kucharska U Zegota H Aflatoxins in nuts assayed by immunological methods European Food Research and Technology 2000 210 213 5 3 Unione Europea Regolamento CE n 1881 2006 della Commissione del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari GUCE L 364 20 dicembre 2006 4 Opinion of the Scientific Panel on Contaminants in the Food chain on a request from the European Commission related to the potential increase of consumer health risk by a possible of the existing maximum levels for aflatoxins in almonds hazelnuts and pistachios and derived products The EFSA Journal 2007 446 1 127 5 Statement of the Scientific Panel on Contaminants in the Food Chain on a request from the European Commission on the effects on public health of an increase of the levels for aflatoxin total from 4 ug kg to 10 ug kg for tree nuts other than almonds hazelnuts and pistachios The EFSA Journal 2009 1168 1 11 6 Uni
190. denza di alcuni fattori cultivar anno provincia tipologia di campionamento e delle loro interazioni sui livelli di contaminazione Materiali e metodi Il monitoraggio per la determinazione del Deossinivalenolo nel frumento duro nazionale si svolto nell arco di un triennio 2006 2008 ed ha previsto un programma di campionamento rappresentativo di diversi aspetti della realt produttiva nazionale quali aziende agricole e centri di stoccaggio monitoraggio aziendale e campi sperimentali Rete nazionale di confronto varietale frumento duro I campioni provenienti dal monitoraggio aziendale hanno fornito un quadro aderente alla realt agricola nazionale mentre quelli provenienti dai campi sperimentali della Rete di confronto varietale hanno permesso di studiare a parit di condizioni agronomiche applicate l andamento della contaminazione da DON in relazione ai fattori considerati Le procedure di campionamento della granella di frumento duro ai fini della determinazione analitica del Deossinivalenolo sono state eseguite secondo lo schema descritto nel Reg CE 401 2006 ed hanno interessato complessivamente le seguenti regioni Piemonte Lombardia Veneto Emilia Romagna Toscana Umbria Marche Lazio Abruzzo Molise Campania Puglia Basilicata Calabria Sardegna e Sicilia Nel complesso l insieme dei 2730 campioni di frumento duro oggetto dell indagine condotta nelle tre annate agrarie considerate ha riguardato 1087 campi
191. di MDA p lt 0 01 rispetto ai controlli Figura 2b La MDA un prodotto terminale dei processi cellulari di lipoperossidazione e come tale considerato un bio marker tardivo del danno cellulare 33 Alla MDA riconosciuto un ruolo importante nel determinare l alterazione della fluidit 34 e la fragilit delle membrane cellulari che sovente accompagnano la morte cellulare 35 Inoltre la MDA in grado di inibire la funzionalit di vari enzimi e di esercitare un forte effetto inibitorio nella sintesi degli acidi nucleici e delle proteine 36 Attraverso l interazione MDA DNA si forma un addotto che ritenuto avere un ruolo nei processi di cancerogenesi 37 Wang amp Liehr 38 fornirono evidenze circa l esistenza di tale addotto nei linfociti e in cellule della ghiandola mammaria Nel caso delle micotossine Baudrimont et al 39 hanno dimostrato essere presente una relazione diretta per cellule animali cellule Vero tra livello d esposizione in vitro 11 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev all Ocratossina A e il contenuto di MDA come indicatore di lipoperossidazione Stockmann Juvala et al 30 inoltre osservarono un incremento concomitante di MDA e GSH in tre linee cellulari di roditori e umane esposte a FB4 La distruzione della struttura di membrana l aumento di endocitosi e della permeabilit di membrana causate dalla FB in popolazioni di macrofagi forniscono ulteriori indicazioni circa i potenziali meccanismi at
192. di campionamento previste dal Reg CE 401 2006 e l utilizzo di laboratori che operino secondo quanto previsto dal Reg CE 882 2004 nel terzo caso presso l azienda non stata rilevata nessuna documentazione analitica a supporto della regolarit del lotto utilizzato 126 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev A ulteriore supporto dell ipotesi di una contaminazione prevalentemente legata agli anacardi si rileva che nei 24 campioni positivi possibile evidenziare la tendenza all aumento della contaminazione da Aflatossine in particolare B nel prodotto finito in rapporto alla percentuale di anacardi impiegata nella ricetta Tabella 1 Tabella 1 Contaminazione in pg kg di AFB vs percentuale di anacardi presenti in ricetta anacardi in ricetta Valore medio AFB e intervallo di confidenza al 95 3 9 0 12 0 04 10 14 0 29 0 17 15 20 0 66 0 55 30 35 0 81 0 45 Inoltre in tutti i 5 campioni di pesto non contenenti altra frutta secca oltre agli anacardi stata rilevata contaminazione con un valore medio di AFB pari a 0 68 0 51 pg kg Una migliore definizione del contributo ad una possibile contaminazione dei prodotti finiti apportata anche dall altra frutta secca nella maggior parte dei casi di origine cinese potr derivare dal prosieguo dei controlli e dal prelievo delle singole materie prime Sulla base della documentazione visionata in loco gli anacardi utilizzati dalle aziende presenti nella provincia di Imperia risultano
193. di cromatografici della maggior parte dei Matrix RM esistenti cos come possono utilizzare per la taratura le stesse sostanze pure Questo settore necessit per di ulteriori RM per controllare alcuni specifici parametri influenti sulla qualit delle misure e in primo luogo sull accuratezza dei risultati quali ad esempio purezza specificit e grado di affinit degli immunoreagenti o purezza e attivit dei traccianti enzimatici Facilities ENEA per la preparazione di nuovi RM Nell ambito di diversi progetti nazionali e comunitari sono stati realizzati presso 1 centri di ricerca Trisaia e Casaccia del ENEA impianti dedicati alla preparazione di Materiali di Riferimento 22 realizzati in accordo alle indicazioni ISO REMCO 23 L impianto del C R Trisaia specificatamente dedicato al settore agroalimentare esso risulta costituito da tre linee per la preparazione di Materiali di Riferimento liofilizzati di Materiali di Riferimento liquidi e di suoli agricoli ed dimensionato per lotti di 1000 unit L impianto della Casaccia stato progettato per studi su scala pilota per effettuare studi di fattibilit o per realizzare piccole produzioni lotti fino a 100 unit o custom RM In Figura 3 si riporta il diagramma a blocchi della linea liofilizzati con un esempio applicativo relativo alla preparazione di un RM di fragole liofilizzate possibile ottenere RM con un elevatissimo grado di omogeneit grazie all impiego di pi
194. di filtrato con 9 mL di Tween 20 al 10 in PBS 219 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 5 6 7 8 9 mescolare bene e lasciare riposare per 5 minuti far passare il filtrato diluito attraverso un filtro Whatman GF A far passare 10 mL 0 25 g equivalenti di filtrato diluito attraverso la colonna AFLAOCHRA PREP lavare la colonna con 20 mL di PBS eluire le tossine con 1 mL di metanolo seguito da 1 mL di acqua 10 iniettare 100 uL di campione in un sistema per HPLC Le condizioni cromatografiche sono Rilevazione AF eccitazione 302 nm Aemissione 442 nm OTA Aeccitazione 333 NM Aemissione 463 nm Colonna analitica Inertsil ODS 3V Sum 150 mm x 4 6 mm Cartuccia di guardia Inertsil ODS 3V Sum 4 0 mm x 10 mm Termostato colonne 40 C Fase mobile soluzione A 1 litro preparata con 550 mL H20 450 mL metanolo 350 uL di acido nitrico 4M 119 mg KBr soluzione B 1 litro preparato con 200 mL H O 800 mL metanolo 350 uL di acido nitrico 4M 119 mg KBr Parametri gradiente il valore di A B v v a 0 min 100 0 a 14 min 100 0 a 16 min 35 65 a 30 min 35 65 a 31 min 100 0 e a 40 min 100 0 Velocit di flusso 0 8 mL min Derivatizzazione AFB e AFG sono derivatizzate tramite Kobra Cell impostata a 100 uA Capacit 200 ng di Aflatossine totali e 500 ng di OTA recupero gt 70 LOD Limit of Detection 0 001ng di campione iniettato per ciascuna delle 4 AF e 0 008 ng per OTA LOQ Limit of Quanti
195. dopo digestione Figura 6 Digestione in vitro di campioni si mais confronto tra i livelli di Fumonisine totali rivelati mediante una metodica di estrazione comune e in seguito a digestione amp 16000 14000 12000 e 10000 N cS 8000 6000 8 4000 WY e o 2000 a A 77 A Biscotti Farina gialla Farina per biscotti Polenta Polenta B Polenta C totali libere EZ totali dopo digestione Figura 7 Digestione in vitro di prodotti alimentari a base di mais confronto tra i livelli di Fumonisine totali determinate mediante estrazione convenzionale e in seguito a digestione 23 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Il fatto che nella maggior parte dei casi dopo digestione si assista ad un incremento di Fumonisine totali dimostra che la quantita di contaminante disponibile per l assorbimento intestinale generalmente pi elevata rispetto a quella stimata con le comuni metodiche di analisi Osservando i dati relativi all analisi dei campioni di mais grezzo inoltre si nota una certa correlazione tra l entit di micotossine nascoste e il grado di contaminazione da Fumonisine libere per campioni che mostrano gi in partenza un elevata concentrazione di Fumonisine libere estraibili si rivela in seguito a digestione un quantitativo di Fumonisine molto pi elevato mentre in campioni dove la concentrazione di Fumonisine libere pi bassa non si nota una differenza signif
196. e 29 L utilizzo di questa nuova tipologia di RM potrebbe apportare notevoli vantaggi anche per il settore della sicurezza alimentare con particolare riguardo alla specifica problematica delle micotossine e pertanto sono in via di definizione studi di fattibilit anche per questo settore Bibliografia En ISO REMCO GUIDE 30 1992 Amd 2008 Terms and definitions used in connection with reference materials Geneva International Organization for Standardization 1992 2008 2 JCGM 200 2008 International vocabulary of metrology Basic and general concepts and associated terms VIM 3 ed S vres Cedex Bureau International des Poids et Measures 2008 3 Emons H The RM family Identification of all its members Accreditation and Quality Assurance 2006 10 690 1 4 Gatti R Sangiorgio P Zappa G Zoani C Scelta e utilizzo dei materiali di riferimento per la qualita delle misure chimiche In Atti del VI Mostra Congresso Metrologia amp Qualit Torino 7 9 aprile 2009 5 European Co operation for Accreditation The selection and use of reference materials Paris European Co operation for Accreditation 2003 EA Guide 04 14 2003 6 ISO REMCO GUIDE 31 2000 E Reference materials Contents of certificates and labels Geneva International Organization for Standardization Second edition 2000 7 Emons H The use of reference materials in international reference measurement systems and for comparison of analyt
197. e Molise al Centro la variet Creso la meno suscettibile le variet Iride Duilio e Ciccio mostrano con alcune eccezioni un grado moderato di sensibilit Simeto la variet che mostra la maggiore sensibilit alla contaminazione sostanzialmente in tutto il territorio nazionale Se si considera solo il set di dati relativi alle sei variet suddette ma limitatamente alla sperimentazione della Rete nazionale si conferma quanto detto Tabella 5 sia in merito alla significativit degli effetti dei fattori considerati sia alla suscettibilit alla contaminazione con piccoli scostamenti come ad esempio la minore sensibilit della variet Ciccio in tutte le regioni meridionali ad eccezione della Calabria Conclusioni Il monitoraggio della contaminazione da DON svolto nell ambito progetto MICOCER nel triennio 2006 2008 ha fornito un quadro d insieme sul grado di diffusione e sull entit dei livelli di contaminazione da Deossinivalenolo dei campioni provenienti sia da zone tipicamente interessate dalla coltura del frumento duro sia da alcune aree del Nord dove tale coltura meno diffusa In particolare il campionamento effettuato presso le aziende agricole e i centri di stoccaggio monitoraggio aziendale ha fornito un quadro aderente alla realt agricola nazionale mentre quello relativo ai campi sperimentali appartenenti alla Rete di confronto varietale ha permesso di effettuare un confronto dei dati
198. e effettuate 250 reiterazioni del processo di simulazione per ognuna delle quali sono stati ottenuti valori della concentrazione di AFB della sub partita generata CONTAM VERA SOTTOPARTITA e dei campioni globali CONTAM CAMPIONE GLOBALE Per l elaborazione dei dati sono stati impiegati il pacchetto software STATISTICA 7 StatSoft Inc Tulsa OK USA e il foglio di calcolo di Microsoft Excell 2007 Risultati e discussione I dati ottenuti nel corso delle simulazioni sono presentati in Tabella 2 In termini generali riscontrabile un tendenziale decremento della dispersione dei valori di contaminazione del campione globale attorno al valore medio per ogni condizione combinazione di Er ed Er all aumentare del numero dei campioni incrementali estratti dalla sub partita 106 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 2 Valori medi deviazione standard e CV della contaminazione dei campioni globali ottenuti con 4 8 20 e 40 campioni incrementali da sub partite generate con diverso grado di eterogeneit EL Er Grado N campioni elementari 4 8 20 40 MediatDS CV Media DS CV MediatDS CV MediatDS CV Er 70 5 00 1 03 20 6 5 00 0 76 15 2 4 99 0 49 9 8 5 00 0 34 6 7 80 5 00 0 89 17 8 5 00 0 65 12 9 4 99 0 43 8 6 5 00 0 29 5 9 90 5 01 0 85 16 9 4 96 0 58 11 7 4 84 0 34 7 0 4 94 0 25 5 1 100 5 00 0 73 14 5 5 01 0 52 10 3 4 99 0 34 6 8 5 00 0 24 4 8 EL 5 5 00 0 08 1 7 5 00 0 06 1 2 5 00 0 04 0 8 5 00 0 03 0 6 10 4
199. e esperienze e i propri contributi relativi allo svolgimento delle attivit operative e gestionali uno scenario quanto pi rappresentativo del problema delle micotossine nel nostro Paese Ci al fine di valutare le attivit correttive da effettuarsi in via preventiva per limitare l impatto sanitario di questi contaminanti sulle produzioni sugli animali e infine sulla salute pubblica Infine gli argomenti trattati in questo Congresso saranno orientati sia alla diffusione di informazioni scientifiche in grado di tutelare il consumatore italiano sia alla individuazione di eventuali e urgenti necessit di informazioni ancora mancanti da acquisire nell ambito dei futuri progetti di ricerca sia infine all acquisizione degli strumenti operativi in grado di garantire una maggiore competitivit sul mercato europeo e internazionale Parole chiave Micotossine Analisi del rischio Progetti di ricerca Alimenti Istituto Superiore di Sanit 3 National Congress Mycotoxins in agri food chain Istituto Superiore di Sanit Rome September 28 30 2009 Proceedings Edited by di Carlo Brera Emanuela Gregori Barbara De Santis and Marina Miraglia 2010 v 251 p Rapporti ISTISAN 10 32 Rev in Italian The Congress is aimed at focusing on the main aspects related to the different outputs derived from sanitary agronomic industrial and diagnostic implication regarding mycotoxin contamination in agri food chain products and from the existing researc
200. e il lavoro svolto da Newlat in 10 anni di gestione del rischio micotossine nel latte ha portato a dei risultati reali che si possono cos riassumere abbassamento e stabilizzazione dei livelli di AFM nel latte creazione di un controllo di filiera coinvolgendo anche gli allevatori e sensibilizzando i produttori di mangimi Un attivit molto intensa e onerosa che ha permesso di incrementare la qualita del prodotto fornito al consumatore contribuendo a rendere migliore un alimento fondamentale dal punto di vista nutrizionale ed economico L adozione e il consolidamento di tali buone tecniche produttive sembra essere sufficiente a garantire la massima qualit del prodotto anche in situazione impreviste ed eccezionali che dovessero verificarsi e si pu quindi dire che il rischio AFM nel latte sembra oggi realmente sotto controllo Bibliografia 1 Albertini A Casarini E Menguzzato G Sillari L Zaniboni A Il controllo delle Aflatossine nel latte Alimentare un esperienza di monitoraggio aziendale Igiene alimenti 2002 3 N Sillari L Casarini E Zaniboni A Grozeva K Aflatossina M1 nel latte un problema risolvibile In Miraglia M Brera C Ed Congresso Nazionale Le micotossine nella filiera agro alimentare Roma Istituto Superiore di Sanit 29 30 novembre 2004 Atti Roma Istituto Superiore di Sanit 2005 Rapporti ISTISAN 05 42 p 165 71 Sillari L Casarini E Zaniboni A Grozeva K Rapporto Aflatossina
201. e nel frumento L Informatore Agrario 2005 1 39 47 Unione Europea Regolamento EC n 1881 del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari Gazzetta Ufficiale dell Unione europea Serie L 364 5 20 dicembre 2006 Lancova K Hajslova J Kostelanska M Kohoutkova J Nedelnik J Moravcova H Vaniva M Fate of trichothecene mycotoxins during the processing Milling and baking Food Additives and Contaminants 2008 25 5 650 9 Bullerman LB Bianchini A Stability of mycotoxins durino food processing International Journal of Food microbiology 2007 119 140 6 Pascale M Bottalico A Pancaldi D Perrone G Visconti A Occurrence of deoxynivalenol in cereals from esperimental fields in various Italian regions Petria 2002 12 123 9 92 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev EFFETTI DELLE AFLATOSSINE SUGLI ASPETTI PRODUTTIVI NELLA BUFALA MEDITERRANEA ITALIANA Giuseppe Auriemma Giuseppe Grazioli Rodolfo Baculo Fiorella Sarubbi Istituto per il Sistema Produzione Animale in Ambiente Mediterraneo Consiglio Nazionale delle Ricerche Napoli Introduzione Il mais Zea mays un cereale che ha assunto a livello mondiale una diffusione e un importanza crescenti Gran parte del mais coltivato in Italia 82 destinato all alimentazione degli animali ad interesse zootecnico se a questa percentuale si aggiunge la quota del 3 7 di mais utilizzato come sottoprodotto dell industria dell
202. e pi alti rispetto alle altre aziende da sottolineare che i valori riscontrati sono stati in tutti i casi analizzati superiori a quelli considerati fisiologici anche se in linea con altri dati riportati in letteratura 8 Questi parametri non ritrovano riscontro con i valori di AF rilevati precedentemente Conclusioni La pericolosit e gli effetti tossici delle micotossine a carico di uomini e degli animali hanno addirittura preceduto l individuazione delle micotossine stesse come colpevoli L interesse della ricerca scientifica costantemente in via di evoluzione ed finalizzato alla comprensione degli effetti negativi a carico delle produzioni zootecniche alla comprensione dei meccanismi patogenetici a carico dell uomo e alla prevenzione della contaminazione Nelle prove sperimentali oggetto del presente lavoro scarsi sono stati i livelli di micotossine nelle diete somministrate ai bufali sottoposti ad indagine sperimentale e la dove presenti anche se all interno del limite di legge non hanno causato cambiamenti nei parametri zootecnici considerati Le differenze significative riscontrate tra le aziende sono risultate essere imputabili pi a condizioni manageriali diverse che ad inquinamento da micotossine Per ci che concerne le Aflatossine possiamo considerare che le modalit e le variabili che condizionano il carry over cio la percentuale di passaggio dell AFB nel latte sotto forma di Mj possono essere le se
203. edere l utilizzo di tecnologie onerose per la 176 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev conservazione e il trasporto e considerando la ridotta omogeneita implicano una considerevole dimensione in termini di massa o volume della singola unit di RM Nella fase analitica propriamente detta vengono per lo pi impiegate sostanze pure per motivi di disponibilit e di minor contributo all incertezza finale anche se non sempre questa scelta viene preceduta da un controllo dell occorrenza di interferenze e quasi mai viene considerato il contributo all incertezza derivante da questo controllo 21 Per valutare verificare le prestazioni di alcune fasi intermedie sarebbe utile disporre di RM appositamente sviluppati quali ad esempio estratti preparati a partire da prodotti agroalimentari in condizioni analoghe a quelle impiegate nella procedura analitica ripartiti in aliquote omogenee e certificati per il i contenuto i di micotossine da impiegare per la taratura e per il controllo delle interferenze prodotti agroalimentari con certificata assenza di contaminazione prodotti naturali o opportunamente purificati da utilizzare per controlli di processo e per la realizzazione di spiked RM con contenuto di micotossine certificato attraverso il processo di preparazione da impiegare per la taratura e la verifica di interferenze Per quanto riguarda i metodi immunochimici questi possono avvalersi per le fasi procedurali in comune con i meto
204. ee meridionali e insulari la percentuale di campioni positivi non ha mai superato il 35 ad eccezione del dato relativo alla Rete nel 2007 57 forse attribuibile alle specifiche condizioni dei campi considerati in quella medesima annata La percentuale di incidenza pi elevata stata rilevata sempre nell areale Nord con un livello massimo del 100 registrato nel 2008 L analisi statistica dei dati relativa al totale dei campioni ha consentito di valutare l influenza dei fattori cultivar CV tipologia di campionamento monitoraggio aziendale o Rete anno e provincia sul livello di contaminazione da Deossinivalenolo I singoli fattori e le loro interazioni sono risultati tutti altamente significativi p lt 0 0001 87 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 100 90 80 70 5 60 50 4 40 5 30 4 20 7 10 BI Nord BM Centro CI Sud Isole Incidenza SS ee ea ee SO Monit Rete Monit Rete Monit Rete 2006 2007 2008 Figura 2 Incidenza percentuale n positivi n totale x 100 dei campioni di frumento duro positivi al DON nel triennio 2006 2008 Nella Tabella 3 sono riportati i livelli di significativit degli effetti delle variabili considerate in relazione al grado di contaminazione da DON nelle singole regioni Sono stati evidenziati in grigio i fattori che hanno avuto un peso maggiore nel determinare il contenuto in micotossina L anno senza dubbio il fattore pi rilevante per tutto il te
205. ell AFB Punico presente sul mercato La Tabella 1 mostra i valori di cross reattivit nei confronti delle altre Aflatossine B e G Con questo saggio possibile analizzare campioni di cereali frutta a guscio e frutta secca nonch matrici complesse come germe di mais e mangimi un saggio di facile e rapido utilizzo i campioni vengono estratti con soluzioni metanoliche senza necessit di purificazioni l esecuzione del test semplice le determinazioni vengono eseguite in singolo e sono richiesti in totale per l analisi solo quindici minuti Tabella 1 Cross reattivit del kit Celer AFLA B14 provata su 3 sedute analitiche Composto Cross reattivit AFB 100 AFB2 5 1 AFG 19 1 AFG2 lt 1 La Figura 1 riporta la curva di taratura media del kit Celer AFLA B n 38 sedute analitiche che dimostra l elevata riproducibilit del saggio nonostante l impiego di soluzioni standard ad elevato contenuto di metanolo L intervallo di misura del saggio da 1 a 40 ug kg si adatta all analisi di tutti i prodotti destinati all alimentazione umana in quanto i tenori massimi di contaminazione di AFB previsti 10 sono compresi tra 2 e 8 ug kg fatta eccezione per gli alimenti per l infanzia per i quali il limite stato posto a 0 1 ug kg In maniera analoga il kit 198 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Celer AFLA B si dimostra particolarmente adatto come metodo di screening per i mangimi per i quali i limiti di
206. ella superficie del mais determinate dallo sviluppo fungino sono state eseguite prove di acquisizione di spettri di mais contaminato artificialmente in condizioni di inoculo controllato con le specie fungine di interesse analitico Sospensioni conidiche dei singoli funghi Aspergillus niger Fusarium graminearum Aspergillus flavus 3357 Aspergillus parasiticus 2999 sono state a tale scopo inoculate su mais umidificato al 30 10 conidi g mais L acquisizione spettrale dei campioni stata realizzata giornalmente in un intervallo temporale di 7 giorni nelle medesime condizioni operative per tutti i campioni seguendo l evoluzione dello sviluppo del micelio fungino sul mais Figura 3 184 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev b Mais inoculato con Aspergillus flavus 3357 a Maisinoculato con Aspergillus flavus 3357 525 550 575 600 625 650 675 700 lunghezza d onda nm Mais non inoculato i c Mais inoculato con Aspergillus parasiticus 2999 log 1 R log 1 R 0 8 500 525 550 575 600 625 650 675 700 875 900 925 lunghezza d onda nm lunghezza d onda nm Mais non inoculato gt giorni 7 900 925 lunghezza d onda nm Mais non inoculato i 500 525 550 575 600 625 650 675 700 lunghezza d onda nm Mais non inoculato i 500 525 550 575 600 625 650 675 700 900 925 lunghezza d onda nm lunghezza d onda nm psi iii ay 2 I Figura 3 Spettri medi di riflettanza di cariossidi di mais ibrido Cecilia
207. ente Triton X 100 allo 0 5 Sigma Chemical Co St Louis MO USA e fenilmetanosulfonil fluoruro 1 mM Sigma Chemical Co St Louis MO USA per 15 minuti a 4 C Sul lisato cellulare sono stati determinati il contenuto di metaboliti reattivi all ossigeno Reactive Oxigen Metabolites ROM i tioli totali SH e la concentrazione della malondialdeide MDA La concentrazione dei ROM intracellulari stata determinata impiegando un kit commerciale d ROMs test Diacron Grosseto Italy secondo le modalit indicate dal produttore del kit stesso I valori sono stati espressi in mg dL di perossido d idrogeno 18 La concentrazione dei tioli intracellulari stata determinata mediante kit commerciale SHp Test Diacron Italy ed espressa in umol L 19 20 In sintesi dopo precipitazione della frazione proteica con soluzione d acido meta fosforico 1 67 g di acido meta fosforico 0 2 g EDTA sale disodico 30 g di NaCI in 100 mL d acqua ASTM Type 1 il surnatante stato separato per filtrazione Puradisk 25AS 0 2 um Whatman plc Maidstone Kent UK Un aliquota del filtrato 0 5 mL stata combinata con 0 5 mL di Na HPO4 300 mM e quindi stato aggiunto l acido 5 5 ditiobis 2 nitrobenzoico DTNB Il DTNB reagisce con i tioli liberi del campione formando un composto colorato leggibile per spettrofotometria a 405 nm La concentrazione degli SH stata stimata estrapolando i dati da una curva di taratura ottenuta mediante standard a
208. enti e di fibra di vetro Munktell Barenstein Germany Preparazione del campione 25 g di campione di mais sono estratti con 2 5 g di sodio cloruro e 100 mL di acetonitrile metanolo H O 25 25 50 v v v e messi ad agitare per 30 minuti su agitatore orizzontale Dopo filtrazione su carta 10 mL dell estratto sono diluiti con 40 mL di PBS e filtrati nuovamente su fibra di vetro 10 mL della soluzione cos ottenuta sono applicati alla colonnina di immunoaffinit che contiene anticorpi specifici per le FB e FB 1 La colonnina lavata con 10 mL di PBS e le tossine eluite con 2 mL di metanolo in un pallone da 50 mL L estratto ottenuto viene portato a secchezza sotto vuoto mediante evaporatore rotante con bagnomaria alla temperatura di 35 C Il contenuto del pallone viene disciolto in 1 mL di acetonitrile H 0 Milli Q 1 1 v v e iniettato all HPLC MS MS Analisi in HPLC MS MS Lo strumento utilizzato per l identificazione e la quantificazione delle Fumonisine 1 HPLC Alliance 2695 Waters Milliford MA USA e lo spettrometro di massa Tandem Quattro MicroTM API Waters Milliford MA USA con ionizzazione elettrospray ESI in modalit positiva I parametri di massa sono stati ricercati tramite infusione diretta di uno standard di una miscela di FB e FB alla concentrazione di 2 5 ug mL ciascuna e a un flusso di 10 uL min Le condizioni di lavoro ottimali trovate sono voltaggio del capillare 4 50 kV voltaggio del cono 45
209. ento sul rispetto del limite legale ma soprattutto una notevole possibilit di prevenzione riuscendo a bloccare in tempo l incremento di AFM nel latte in seguito all assunzione di mangime contaminato Per capire meglio la reale portata del lavoro svolto in questi anni si riporta una statistica relativa ai dati raccolti in autocontrollo sul latte crudo in arrivo presso lo stabilimento Giglio di Reggio Emilia Tabella 1 I dati di relativi alla concentrazione di AFM nel latte crudo di raccolta suddivisi per anno sono organizzati in classi di valori di concentrazione che idealmente corrispondono ad un rischio crescente 135 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 1 Percentuali di campioni di latte crudo in arrivo presso lo stabilimento Giglio di Reggio Emilia per classi di concentrazione di AFM per anno Annate A B Cc D E lt 10 ng kg lt 20 ng kg lt 30 ng kg lt 40 ng kg gt 40 ng kg 1999 19 50 45 10 17 00 8 80 9 60 2000 29 40 40 25 14 55 6 20 9 60 2001 25 80 40 15 21 42 7 40 5 23 2002 40 20 38 00 13 30 4 90 3 60 2003 26 32 26 32 19 21 11 15 7 00 2004 20 11 24 13 25 11 15 25 15 40 2005 38 86 41 29 13 90 4 30 2 40 2006 5 50 45 80 33 19 8 75 6 76 2007 10 71 63 46 21 86 3 10 0 87 2008 29 27 54 14 13 50 1 80 1 29 La suddivisione in classi avviene secondo la percentuale sul numero totale di campioni e va da valori A lt 10 ng kg rischio minimo B lt 20 ng kg il limite adottato come standard interno C lt 30 ng k
210. entre i rimanenti 116 CRM sono sostanze per taratura in forma di sostanze pure 21 CRM soluzioni di sostanze pure in acetonitrile 48 CRM acetonitrile acqua 5 CRM e cloroformio 1 CRM soluzioni di sostanze pure dried down 22 CRM soluzioni di sostanze pure marcate con isotopi stabili in acetonitrile 16 CRM e acetonitrile acqua 3 CRM 1 EU JRC IRMM Institute for Reference Materials and Measurements http irmm jrc ec europa eu LGC Laboratory of the Gorvernment Chemist UK www lgc co uk 3 NIST National Institute of Standards and Technology USA www nist gov 4 IAEA International Atomic Energy Agency Austria www iaea org MUVA Kempten Germany www muva de NRC CNRC National Research Council Canada www ntc cnre gc ca 7 RomerLabs Biopure Austria www romerlabs com 8 NMI NARL Australian National Measurement Institute www measurement gov au FAPAS UK The food and environment research agency programma di controllo delle prestazioni sulle analisi degli alimenti www fapas com 173 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 1 Produzione di RM per micotossine riportata da diversi database Database IRMM NARL RomerLabs FAPAS Totale Biopure COMAR 8 ST 2 ST 10 ST 16 Matrix CRM 16 Matrix CRM VIRM 2 Sost Taratura 33 ST 100 Matrix RM QC 35 ST 13 Matrix CRM 13 Matrix CRM 100Matrix RM QC ENEA 8 ST 5 ST 103 ST 80 Matrix RM QC 116 Sost Taratura 16
211. enza nell organismo e per la diffusione in diversi tipi di alimenti la determinazione dell OTA nel sangue rappresenta un parametro di valutazione del livello di esposizione per ogni individuo o per una determinata popolazione Il livello di OTA pu essere quindi correlato con alcuni alimenti della dieta e anche essere indicatore di patologie specifiche soprattutto a carico del parenchima renale Materiali e metodi In collaborazione con l Universit Cattolica di Campobasso stata condotta un indagine sulla popolazione della regione Molise Sono stati prelevati campioni di siero ematico da 341 individui 154 uomini e 187 donne di et compresa tra 38 e 48 anni ai quali stato chiesto di compilare il questionario sulle abitudini alimentari EPIC consegnato da personale qualificato I dati raccolti sono stati elaborati con software NAF Analysis of Food Frequency Questionarie capace di quantificare in frequenze il questionario Sono stati quindi determinati il livello di contaminazione da OTA e alcuni parametri ematici indicatori della funzionalit epatica e renale con lo scopo di studiare eventuali correlazioni con il comportamento alimentare In particolare sono stati determinati i livelli di proteina C reattiva creatinina urea aptoglobina GOT GGT GPT Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Analisi di Ocratossina A In una provetta di vetro a 2 mL di siero sono stati aggiunti 2 mL di H 0 bidistillata 0 3 mL di soluzione acquosa d
212. er la validazione dei saggi ELISA qualitativi per l analisi delle micotossine Bibliografia 1 UNI CEI EN ISO IEC 17025 2005 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories Milano UNICHIM 2005 2 Unione Europea Regolamento CE N 401 2006 della Commissione del 23 febbraio 2006 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari GUCE L70 12 9 marzo 2006 3 Unione Europea Regolamento CE 882 2004 del Parlamento Europeo e del Consiglio del 29 aprile 2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformit alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali GUCE L 191 30 aprile 2004 4 Unione Europea Regolamento CE N 1881 2006 della Commissione del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari GUCE L364 5 20 dicembre 2006 aggiornato il 23 luglio 2008 5 Gruppo di lavoro dei Laboratori di Chimica degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali Linea guida per la validazione intra laboratorio di metodi di prova immunochimici di screening in accordo con la Decisione 2002 657 CE Italia 2004 215 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev ANALISI DI DEOSSINIVALENOLO VALUTAZIONE INTER LABORATORIO DEL LETTORE RIDA QUICK SCAN Dominique Jonville a Bernhard Reck b Marcel Bony c a BASF Agrochemical Division
213. eratura di 30 C L eluizione condotta in gradiente con due fasi mobili H2O Milli Q 0 1 acido formico e acetonitrile 0 1 acido formico come indicato in Tabella 2 Il flusso di lavoro di 0 2 mL min e il volume di iniezione 10 uL Il tempo di analisi 30 minuti Per l acquisizione e l elaborazione dei dati si utilizzato il software MassLynx 4 0 Waters Milliford MA USA Tabella 2 Gradiente di eluizione il solvente A H20 Milli Q 0 1 acido formico e il solvente B acetonitrile 0 1 acido formico Tempo min Solvente A Solvente B 0 0 100 0 0 0 2 0 100 0 0 0 11 0 5 0 95 0 21 0 5 0 95 0 22 0 100 0 0 0 30 0 100 0 0 0 Risultati e discussione La validazione del metodo si ottenuta attraverso l elaborazione statistica indicata dalle Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dell incertezza di misura di ARPA Emilia Romagna 2 I parametri di validazione sono limite di rivelazione Limit of Detection LOD limite di quantificazione Limit of Quantification LOQ precisione recupero e ripetibilit strumentale Curve di taratura e calcolo LOD e LOQ Le curve di taratura si sono ottenute partendo dalla soluzione di lavoro della miscela di FB e FB alla concentrazione di 2 5 ug mL ciascuna usata anche per il tuning Si sono ottenuti sei livelli di taratura con un range di linearit di 35 500 ng mL e un coefficiente di correlazione r di 0 999 per entra
214. erazione delle difficolt emerse nell utilizzo di dataBase generali per gli RM nel 2001 14 stata realizzata una banca dati specifica per il settore agroalimentare che viene periodicamente aggiornata 15 consultando direttamente i cataloghi dei singoli produttori IRMM LGC NIST IAEA MUVA NRC CNRC RomerLabs Biopure NMI NARL FAPAS oltre che le seguenti banche dati disponibili online COMAR IAEA Japanese RMs search VIRM Pertanto per esaminare la produzione attuale di RM per la determinazione di micotossine stata utilizzata la banca dati sviluppata del ENEA aggiornata al settembre 2009 Da un esame comparato degli RM per micotossine risultanti nelle banche dati COMAR VIRM ed ENEA Tabella 1 possibile effettuare le seguenti osservazioni la banca dati COMAR non prende in considerazione oltre ai produttori di RM Quality Control come il FAPAS il produttore di CRM RomerLabs Biopure la banca dati del VIRM non prende in considerazione il produttore NARL e classifica come non certificati i CRM RomerLabs Biopure Si evidenziano inoltre problematiche generali di aggiornamento a carico di COMAR e VIRM La produzione attuale di RM per la determinazione di micotossine nella filiera agroalimentare e zootecnica di 137 CRM prodotti da IRMM 24 CRM NARL 5 CRM e RomerLabs Biopure 108 CRM pi 80 RM Quality Control prodotti dal FAPAS Di questi 137 CRM soltanto 21 sono Matrix CRM m
215. erinary Research 202 63 799 803 Rizzo AF Atroshi F Ahoputa M Sankari S Elovaara E Protective effect of antioxidants against free radical mediated lipid peroxidation induced by DON or T 2 toxin Journal of Veterinary Medicine Series A 1994 41 81 90 Klaric AS Pepelinjac D Domijan AM Petril J Lipid peroxidation and glutathione levels in Porcine Kidney PK15 cells after individual and combined treatment with fumonisn B1 beauvericin and Ochratoxin A Basic amp Clinical Pharmacology amp Toxicology 2006 100 157 64 Stockmann Juvala H Mikkola J Naarala J Loikkanen J Elovaara E Savolainen K Oxidative stress induced by Fumonisin B1 in continuous human and rodent neural cell cultures Free Radical Research 2004 38 9 933 42 14 3 32 33 34 35 36 3T 38 39 40 4 ea 42 43 44 45 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev McLean M Dutton MF Cellular interactions and metabolism of Aflatoxin an update Pharmacology amp Therapeutics 1995 65 163 92 Jefferies H Coster J Khalil A Bot J McCauley RD Hall JC Glutathione ANZ Journal of Surgery 2003 73 517 22 Vaca CE Wilhelm J Hartwig A Harms Ringdahl M Interaction of lipid peroxidation products with DNA A review Mutation Research 1988 195 137 49 Chen JJ Yu BP Alteration in mitocondrial membrane fluidity by lipid peroxidation products Free Radical Biology and Medicine 1994 17 411 8 Halliwell B Chirico S Lipid p
216. eroxidation its mechanism measurement and significance The American Journal of Clinical Nutrition 1993 57 715S 25S Esterbauer H Cheeseman KH Dianzani MU Poli G Slater TF Separation and characterization of the aldehydic products of lipid peroxidation stimulated by ADP Fe2 in rat liver microsomes Biochemical Journal 1982 208 129 40 Marnett LJ Lipid peroxidation DNA damage by malondialdehyde Mutation Research 1999 424 83 95 Wang MY Liehr JG Lipid hydroperoxide induced endogenous DNA adducts in hamsters possible mechanism of lipid hydroperoxide mediated carcinogenesis Archives of Biochemistry and Biophysics 1995 316 38 46 Baudrimont I Ahouandjivo R Creppy EE Prevention of lipid peroxidation induced by ochratoxin A in Vero cells in culture by several agents Chemico Biological Interactions 1997 104 29 40 Li S Ouyang Y Yang G H Pestka JJ Modulation of Transcription Factor AP 1 Activity in Murine EL 4 Thymoma Cells by Vomitoxin Deoxynivalenol Toxicology and Applied Pharmacology 2000 163 17 25 Wong S S Zhou H R Pestka JJ Effects of vomitoxin deoxynivalenol on the binding of transcription factors AP 1 NF xB and NF IL6 in raw 264 7 macrophage cells Journal of Toxicology and Environmental Health A 2002 65 16 1161 80 Sablina AA Budanov AV Ilyinskaya GV Agapova LS Kravchenko JE Chumakov PM The antioxidant function of the p53 tumor suppressor Nature Medicine 2005 11 12 1306 13 Eriksen GS Petter
217. erti Lucia Mosiello Giovanna Zappa Claudia Zoani Dipartimento Biotecnologie Agroindustria e protezione della Salute Agenzia nazionale per le nuove tecnologie l energia e lo sviluppo economico sostenibile ENEA Centro Ricerca Casaccia Roma Introduzione Le nuove definizioni approvate dalla International Organization for Standardization Committee on Reference Materials ISO REMCO 1 e quelle riportate nella nuova edizione del Vocabolario Internazionale di Metrologia VIM 2 ampliano e chiariscono il campo di applicazione dei materiali di riferimento Reference Material RM e dei materiali di riferimento certificati Certified Reference Material CRM In particolare al fine di ampliare il campo di applicazione dei RM alle indagini di tipo qualitativo nella nuova definizione non compare pi il concetto di valore attribuito alle specifiche propriet del RM Viene inoltre chiarito che RM un termine generale riferito a materiali da impiegare per diversi scopi taratura valutazione di un metodo di misurazione assegnazione di valori a materiali controllo di qualit e viene sottolineata la stretta correlazione tra idoneit del RM e specifico scopo Nella definizione di CRM il termine value viene mantenuto in associazione alle propriet certificate ma anche in questo caso previsto un impiego nelle indagini qualitative allargando il concetto di valore a caratteristiche come l identit e la sequenza I
218. esposti alle micotossine rendendoli maggiormente suscettibili alle malattie Bibliografia 1 10 11 12 13 Betina V Structure activity relationships among mycotoxins Chemico Biological Interactions 1989 71 105 146 Ueno Y Ishii K Sakai K Kanaeda S Tsunoda H Tanaka T Enomoto M Toxicological approaches to metabolites of Fusaria IV Microbial survay bean hulls poisoning of horses with the isolation of toxic trichothecenes neosolaniol and T 2 toxin of Fusarium solani M 1 1 Japan J Exper Med 1972 42 210 8 Gelderblom WCA Abel S Smuts CM Marnewick J Marasas WFO Lemmer ER Ramljak D Fumonisins induced hepatocarcinogenesis mechanisms related to cancer initiation and promotion Environmental Health Perspectives 2001 109 291 300 Bondy GS Pestka JJ Immunomodulation by fungal toxins Journal of Toxicology and Environmental Health Part B Critical Reviews 2000 3 2 109 43 Pugh GW Richard JL Kpecky KE McDonald TJ Effect of aflatoxin ingestion on the development of Moraxella bovis infectious bovine keratoconjunctivitis The Cornell Veterinarian 1984 74 96 110 Mann DD Buening GM Osweiler GD Hook BS Effect of subclinical levels of T 2 toxin on the bovine cellular immune system Canadian Journal of Comparative Medicine 1984 48 308 12 Charoenpornsook K Fitzpatrick JL Smith JE The effects of four mycotoxins on the mitogen stimulated proliferation of bovine peripheral blood mo
219. ettrochimico per la determinazione dei Tricoteceni di tipo A in cereali da colazione e alimenti destinati all infanzia a base di cereali Silvia Vesco Daniela Romanazzo Giulia Volpe Francesco Ricci Danila Moscone Giuseppe Palleschi iii 159 Laboratorio nazionale di riferimento per le micotossine un anno di attivit 2008 2009 Carlo Brera Barbara De Santis Emanuela Gregori Clara Berdini Francesca Debegnach Elena Pannunzi Marina Miraglia ossee 165 Materiali di riferimento per la determinazione di micotossine e la valutazione di contaminazioni fungine in prodotti alimentari Rosanna Gatti Ilaria Lamberti Lucia Mosiello Giovanna Zappa Claudia Zoani 171 Rapido rilevamento di funghi tossigeni in cariossidi di Zea mays attraverso la spettroscopia di immagine Antonella Del Fiore Massimo Reverberi Patrizia De Rossi Valentina Tolaini Alessandra Ricelli Anna Adele Fabbri Corrado Fanelli i 182 Validazione secondo la Decisione 657 2002 CE di un metodo di screening in immunoenzimatica per la determinazione di Zearalenone nell alimentazione umana Rita De Pace Valeria Vita ai 189 Metodologie diagnostiche molecolari ai fini del rapido rilevamento in bacca d uva del fungo tossigeno A carbonarius Patrizia De Rossi Massimo Reverberi Antonella Del Fiore Valentina Tolaini Anna Adele Fabbri Corrado Fanelli 193 Celer AFLA B un ELISA veloce e prati
220. ettuata la determinazione del DON con metodo cromatografico HPLC High Performance Liquid Chromatography 10 a cura dell Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari ISPA del Consiglio Nazionale delle Ricerche di Bari L analisi statistica dei dati stata effettuata utilizzando i modelli lineari generalizzati Generalized Linear Models GLM basati sulla distribuzione di Poisson della variabile risposta DON e funzione di link data dal logaritmo Log DON variet anno provincia campionamento variet x anno variet x provincia variet x campionamento anno x provincia anno x campionamento provincia x campionamento 85 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev ba i Figura 1 Dislocazione geografica e numerosit per regione dei campioni di frumento duro nel triennio 2006 2008 Il contributo dei fattori considerati e delle loro interazioni alla devianza statistica stato stimato attraverso il metodo della massima verosimiglianza e la loro significativit attraverso la distribuzione asintotica y Il modello considerato stato applicato sia sulla totalit dei 2730 campioni di frumento duro sia su un set ridotto di dati comprendenti i campioni relativi alle due diverse provenienze monitoraggio aziendale e Rete nazionale delle sei cultivar Ciccio Claudio Creso Duilio Iride e Simeto indicate in seguito come CV Risultati e discussione Nella Tabella 1 sono riportati i dati del triennio 2006 2008 relativ
221. ev METODOLOGIE DIAGNOSTICHE MOLECOLARI Al FINI DEL RAPIDO RILEVAMENTO IN BACCA D UVA DEL FUNGO TOSSIGENO A CARBONARIUS Patrizia De Rossi a Massimo Reverberi b Antonella Del Fiore a Valentina Tolaini b Anna Adele Fabbri b Corrado Fanelli b a Dipartimento Biotecnologie Agroindustria e Protezione della Salute Agenzia nazionale per le nuove tecnologie l energia e lo sviluppo economico sostenibile ENEA Centro Ricerche Casaccia Roma b Dipartimento di Biologia Vegetale Universit Sapienza Roma Introduzione L Ocratossina A OTA risulta la principale micotossina segnalata nell uva e nei suoi derivati essa ha propriet nefrotossiche carcinogene teratogene e immunodepressive Responsabili della presenza di questo metabolita nelle uve sono principalmente funghi appartenenti al genere Aspergillus sezione Nigri aspergilli neri la cui presenza provoca marciume nelle bacche di Vitis vinifera Tra le specie appartenenti a questo genere Aspergillus carbonarius mostra il pi alto potenziale ocratossigenico in uva 1 Lo scopo di questo studio quello di individuare un sistema che consenta il rilevamento il pi possibile tempestivo della presenza di A carbonarius direttamente dalla bacca d uva al fine di contribuire a realizzare un rapido ed efficace controllo della contaminazione da fungo A tal fine in questo lavoro stata messa a punto una tecnologia che utilizza la tecnica di Real Time Polymerase C
222. fettuata delle condizioni di ionizzazione delle tossine che garantisce una buona ripetibilit nella formazione dello ione molecolare nella sorgente Ricerca di Fumonisine in campioni di farine di mais Il metodo studiato stato applicato all analisi di 70 campioni di farine di mais prelevati nel biennio 2007 2009 dalle Azienda Unit Sanitaria Locale AUSL della Regione Emilia Romagna secondo la procedura del Reg CE 401 2006 4 Il 90 delle farine risultato contaminato da Fumonisine totali anche ad alti livelli 110 con valori compresi tra 1000 e 2000 ug kg e il 9 con valori superiori a 2000 ug kg con un massimo di 5900 ug kg Figura 2 I campioni di farine di mais analizzati sono stati messi a disposizione dell Unit Operativa 1 per le prove tossicologiche in V fischeri 100 90 80 704 60 504 40 30 20 71 si 10 10 9 ol E lt LDR lt 1000 1000 2000 gt 2000 g kg Figura 2 Percentuale di contaminazione di 70 campioni di farine di mais analizzati tra il 2007 e il 2009 Conclusioni Il metodo HPLC MS MS sviluppato in questo studio per l analisi delle FB e FB in mais risultato essere preciso selettivo ripetibile e soddisfa i criteri di rendimento richiesti dal Reg CE 401 2006 4 in termini di recupero percentuale Il basso limite di rivelazione ottenuto LOD 20 ug kg essendo 10 volte inferiore al limite di legge stabilito per gli alimenti destinati alla prima infanzia
223. ffe ocratossigene negli stabilimenti di stagionatura Invece il non riscontrato aumento per i campioni interni di prosciutto potrebbe essere dovuto ad una possibile idrolisi del legame peptidico dell OTA ad 49 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev opera di enzimi proteolitici avvenuta durante il lungo tempo di stagionatura 14 mesi Come conseguenza di questi fattori si pu osservare che all interno di ogni gruppo i prodotti contenenti concentrazioni pi elevate di OTA sono la coppa e il salame La distribuzione della tossina nei diversi prodotti non quindi in accordo con il fatto che POTA molecola abbastanza polare si accumula maggiormente nel tessuto muscolare rispetto a quello adiposo poich il prosciutto crudo che ha un tenore lipidico normalmente inferiore al salame e alla coppa mostra livelli di contaminazione inferiori Oltre all attesa contaminazione indiretta si pu osservare dalla presenza di OTA in alcuni prodotti del gruppo TO tutti i campioni di salame due di coppa e 5 esterni di prosciutto crudo e soprattutto dai valori molto alti riscontrati nei campioni esterni di prosciutto 10 campioni con una contaminazione superiore a 10 ug kg massimo 314 1 ug kg che si verificata una elevata contaminazione diretta in due dei tre impianti di stagionatura confermando 1 risultati di alcuni precedenti lavori 1 5 Conclusioni Da questo studio si pu osservare come la somministrazione ai suini di una dieta contaminata da
224. ffettuate prove di recupero a due livelli 0 250 e 0 500 ug kg in triplo aggiungendo ad un campione non contaminato maturazione 3 mesi un volume noto di una soluzione standard di AFM i valori ottenuti sono risultati compresi tra 94 8 e il 98 2 La deviazione standard risultata sempre inferiore al 2 5 Caseificazioni Le concentrazioni di AFM nei campioni di latte intero utilizzati per le caseificazioni erano comprese tra 0 027 e 0 460 ug kg Nella Tabella 1 sono riportate le concentrazioni di AFM nei vari prodotti Tabella 1 Valori di AFM g kg nel latte intero e nei prodotti della caseificazione Caseificaz Latte Panna Latte Cagliata Siero Scotta Ricotta Burro Latticello intero caldaia cotto 1 0 040 lt 0 010 0 039 0 122 0 022 0 019 0 040 lt 0 010 0 008 2 0 027 0 019 0 021 0 082 0 013 0 012 0 046 lt 0 010 0 013 3 0 081 0 044 0 083 0 343 0 056 0 049 0 115 lt 0 010 0 026 4 0 063 0 040 0 062 0 178 0 040 0 029 0 180 lt 0 010 0 019 5 0 043 0 017 0 035 0 154 0 021 0 016 0 046 lt 0 010 0 009 6 0 038 0 020 0 038 0 136 0 025 0 017 0 043 lt 0 010 0 009 7 0 270 0 113 0 273 0 966 0 168 0 128 0 280 0 017 0 047 8 0 335 0 154 0 333 1 202 0 217 0 184 0 374 0 107 0 094 9 0 386 0 171 0 365 1 234 0 213 0 128 0 280 0 050 0 062 10 0 460 0 223 0 480 1 699 0 298 0 184 0 374 0 110 0 091 Considerando separatamente i diversi passaggi delle caseificazioni si pu osservare che dopo il processo di scrematura le concentrazioni di AFM
225. fication 3 volte LOD Risultati Valori di recupero ottenuti dall estratto arricchito di 6 prodotti alimentari diversi I risultati Tabella 1 dimostrano l efficienza di cattura delle 5 micotossine da parte della colonna ad immunoaffinit mentre sono esposte all effetto matrice di campioni selezionati di cereali spezie e frutta secca La ripetibilit delle prestazioni della colonna lt 3 per tutti i prodotti analizzati e I HPLC si dimostrata adatta per una quantificazione accurata di tutte e 5 le micotossine Tabella 1 Recuperi medi n 6 su campioni di estratti di matrici reali Tipo di Livello di Recupero medio RSD matrice arricchimento g kg AF OTA AFB AFB2 AFG AFG2 OTA Mais 10 3 102 6 107 5 100 8 100 8 98 3 0 6 2 4 Grano 4 3 106 9 108 3 104 4 104 3 99 8 1 8 3 2 Pepe nero 10 15 95 6 95 8 90 3 86 2 87 7 1 2 2 9 Paprika 40 50 106 6 102 9 97 7 89 2 92 8 0 8 1 7 Uva sultanina 10 10 96 5 97 4 91 9 89 0 94 5 0 7 1 5 Fichi secchi 10 10 96 3 95 5 91 9 87 0 87 3 0 5 1 7 Relative Standard Deviation 220 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Valori di recupero ottenuti dalle matrici arricchite di 6 prodotti alimentari diversi I risultati e i valori di ripetibilit ottenuti per i 6 prodotti alimentari testati sono in linea con le raccomandazioni europee relative ai valori di recupero gt 70 e lt 110 e al RSD lt 30 per l analisi delle AF totali e dell OTA I risultati dimostrano l efficienza del
226. ficato come micoestrogeno 5 L Unione Europea con il Reg CE 1881 2006 ha fissato i livelli massimi di DON e ZEA accettabili sia nelle materie prime che nei prodotti finiti destinati all alimentazione umana 1750 ug kg di DON e 100 ug kg di ZEA per grano duro non processato 750 ug kg di DON e 75 ug kg di ZEA per i cereali adibiti ad uso umano 500 ug kg di DON e 50 ug kg di ZEA per i prodotti finiti 6 Negli ultimi anni emerso chiaramente che nelle materie prime e nei prodotti alimentari contaminati da micotossine possono essere presenti oltre alle forme native diversi composti correlati generati dal metabolismo della pianta o formatisi durante i trattamenti tecnologici noti come micotossine nascoste o mascherate Nel caso specifico di Tricoteceni e ZEA le forme nascoste sono rappresentate dai relativi derivati glicosilati composti nei quali la tossina legata ad una molecola pi polare allo scopo di essere stoccata nel vacuolo della pianta 7 Deossinivalenolo 3 O glucoside D3G e Zearalenone 4 O glucoside Z4G sono stati ritrovati in campioni naturalmente contaminati da F graminearum Analizzando campioni di frumento naturalmente contaminato e artificialmente inoculato con ceppi di Fusarium stata rilevata una concentrazione di D3G pari al 30 di quella del suo precursore 8 9 Le strutture chimiche dei derivati glicosilati di DON e ZEA sono mostrate in Figura 1 26 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev OH O CH OH TA j HO
227. ficializzati per queste due matrici 25 ng g e 200 ng g rispettivamente Quantitativo di campione da sottoporre ad analisi Il quantitativo di campione da sottoporre ad analisi deve essere sufficientemente ampio in modo tale da minimizzare l eterogeneit della contaminazione da Tricoteceni su un campione solido di cereali Per questo motivo l estrazione viene eseguita su un campione di 25g come suggerito in letteratura 6 Trattamento del campione Il trattamento del campione prevede una fase di estrazione e una eventuale fase di purificazione dell estratto Sono state studiate diverse combinazioni tra solvente di estrazione e strategia di purificazione estrazione con acetonitrile acqua 84 16 o con metanolo acqua 80 20 e purificazione con colonnina Mycosep o colonnina Bond Elut I valori di recupero su estratti non purificati mostrano una sovrastima dovuta all effetto matrice che indica la necessit del passaggio di purificazione I valori di recupero ottenuti da estratti purificati hanno invece riportato un recupero intorno al 100 per entrambi i tipi di colonna esaminati nel caso in cui l estrazione sia stata eseguita con la miscela acetonitrile acqua A parit di prestazioni in termini di valori di recupero stato selezionato per il protocollo l impiego della colonnina Mycosep in quanto di pi rapido e facile utilizzo e quindi pi idonea ad un analisi di screening 6 Fattore di diluizione Il fattore di diluizi
228. g D lt 40 ng kg E gt 40 ng kg rischio massimo Le classi pi significative sono A lt 10 ng kg B lt 20 ng kg ed E gt 40 ng kg vedi Tabella 1 Anche per la classe di concentrazione B lt 20 ng kg lo standard interno i valori hanno subito un incremento dal 45 del 1999 al 54 del 2008 Questo trend decisamente positivo si mantenuto costante nonostante alcune annate particolari come ad esempio il 2003 e 2004 Risulta evidente come la gestione integrata del rischio Aflatossina nel latte ne abbia notevolmente ridotto il contenuto considerando che in Italia probabilmente per ragioni climatiche la contaminazione da considerarsi fisiologica La Figura 1 mostra l andamento sopra descritto ed evidenzia quanto la stagione 2003 2004 abbia costituito un evento eccezionale e di come per si sia riusciti a fare tesoro di quest esperienza negativa per arrivare ad ulteriori margini di miglioramento Classe A Classe B Classe E 70 60 er 50 40 30 di concentrazione 20 campioni in ogni classe 10 0 T T T T T T T T e 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Figura 1 Andamento annuale del rischio di AFM nel latte crudo in arrivo presso lo stabilimento Giglio di Reggio Emilia secondo la suddivisione in classi di concentrazione 136 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Conclusioni A conclusione di questa breve indagine storico tecnologica si pu dire ch
229. gate nascoste o mascherate Questi composti hanno delle caratteristiche chimiche diverse rispetto a quelle delle micotossine libere e pertanto non sono rivelabili con i metodi di analisi comunemente impiegati ma possono tuttavia contribuire alla tossicit globale in quanto tali o in seguito alla liberazione dei precursori durante i processi tecnologici o di digestione 5 Alcuni studi riportano la presenza di forme legate delle Fumonisine nei prodotti finiti a base di mais come ad esempio cornflakes o tortilla 6 ma anche in prodotti poco processati come farina pane e pasta e nelle materie prime Un ulteriore fenomeno di crescente interesse rappresentato dal paradosso delle Fumonisine secondo il quale tali metaboliti vengono per il 90 eliminati per via fecale quando somministrati per via orale esercitando tuttavia un elevato effetto tossico 7 Questo fatto potrebbe in parte essere spiegato se fosse evidenziata per queste micotossine una bioaccessibilit ovvero la quantit di una sostanza che dopo digestione si libera dalla matrice ed disponibile per l assorbimento da parte dell epitelio intestinale maggiore in seguito a digestione dovuta alla liberazione delle 16 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev forme nascoste la cui entit non stimabile con le comuni tecniche di analisi In questo studio stato applicato un modello di digestione in vitro 8 9 a granelle di mais e a prodotti a base di mais mediante l applicazi
230. ghebert A Chemical safety of conventionally and organically produced foodstuff a tentative comparison under Belgian conditions Food Control 2004 17 14 21 Tamm L Thurig B FiBL position papers mycotoxins in organic food Ecology and Farming 2002 4 Desiderio E Belocchi A D Egidio MG Fornara M Cecchi V Cecchini C Aureli G Flavoni A Risultati della sperimentazione nazionale 2007 08 Varieta di duro alla prova per le semine 2008 L Informatore Agrario 2008 64 34 Suppl 20 5 Quaranta F Belocchi A Camerini M D Egidio MG Fornara M Melloni S Le variet per il grano duro bio Risultati del 6 anno di prove L Informatore Agrario 2008 64 37 66 71 123 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev MONITORAGGIO DELLA GESTIONE DEL RISCHIO CONTAMINAZIONE DA AFLATOSSINE SULLE AZIENDE CONSERVIERE DELLA PROVINCIA DI IMPERIA CHE UTILIZZANO ANACARDI Marta Ferro a Lorella Terzano b a Dipartimento Provinciale di Genova Agenzia Regionale Protezione Ambiente Liguria Genova b Struttura Complessa Igiene degli Alimenti e della Nutrizione ASL 1 Imperiese Imperia Introduzione La noce di anacardio il seme oleoso dell Anacardium Occidentale L pianta tropicale originaria del Brasile Nord Orientale I maggiori produttori di anacardi sono il Vietnam l India il Brasile il Mozambico e la Tanzania mentre i maggiori importatori sono gli USA l Europa e il Giappone La noce viene utilizzata dall industria alimentare nella preparaz
231. gnificativa stato eseguito un t test per dati appaiati paired t test con p 0 05 e sono stati calcolati i valori di P ad una e due code Tutti i calcoli sono stati eseguiti mediante il software Excel di Microsoft XP Risultati e discussione La procedura del saggio ELISA semplice e rapida Le curve dose risposta absorbance vs log AFM concentration ottenute utilizzando gli standard forniti dal kit e gli standard del laboratorio sono lineari Figura 1 161 y 0 7319x 1 9128 ve 0 6054x 1 5828 1 4 R2 0 9848 1 4 R2 0 9777 12 1 2 4 1 a 0 8 0 8 0 6 0 6 0 41 0 47 0 2 0 24 0 o o 0 0 0 5 1 1 5 2 2 5 0 0 5 1 1 5 2 2 5 A B Figura 1 Curve dose risposta absorbance vs log AFM concentration con gli standard forniti dal kit A e gli standard del laboratorio B Il produttore del kit dichiara un valore del LOD del saggio pari a 0 002 ng mL calcolato matematicamente sulla base della deviazione standard del segnale medio dei bianchi matrice per il latte bovino termicamente trattato n 18 CV lt 2 Il LOQ del metodo stato sperimentalmente determinato a 0 004 ng g dall analisi di campioni di latte di differente specie fortificati questo valore vicino al LOQ del metodo di conferma con cromatografia liquida fluorescenza del laboratorio a 0 002 ng g La specificit del kit stata verificata analizzando campioni di latte di massa bovino 8 ovi caprino 2 e bufalino 5 e di latte term
232. gruppi funzionali Tra questi quelli appartenenti ai tipi A e B rappresentano i contaminanti principali delle derrate alimentari 1 La differenza tra i due gruppi data dalla presenza di una funzione carbonilica in posizione C8 nei Tricoteceni di tipo B mancante invece nella struttura di quelli di tipo A 2 Invece il gruppo funzionale comune a questi composti rappresentato da un epossido in posizione C12 C13 responsabile dell attivit tossicologica che si esplica sia a livello acuto che cronico come conseguenza dell inibizione dell attivit dell enzima peptidil transferasi 3 Sulla base dei dati epidemiologici la IARC International Agency for Research on Cancer ha inserito tali tossine nella classe 2B possibili cancerogeni per l uomo Al tipo A appartengono le Tossine T 2 HT 2 e Diacetossiscirpenolo DAS mentre nel tipo B rientrano Nivalenolo NIV Deossinivalenolo DON e le sue forme acetilate 3 acetil DON e 15 acetil DON Tra questi composti il DON o Vomitossina rappresenta il contaminante pi diffuso nei cereali 4 Le stesse specie di Fusarium produttori di Tricoteceni F culmorum e F graminearum sono responsabili anche della produzione di Zearalenone ZEA che spesso si trova quale co contaminante assieme al DON e i cui effetti di tossicit cronica sono legati alla sua somiglianza strutturale con l Estradiolo che ne determina la capacit di legarsi ai recettori degli estrogeni Pertanto lo ZEA classi
233. gt 337 10 12 0 3 Acetil DON 15 Acetil DON 7 00 11 00 397 10 gt 307 10 15 0 397 10 gt 58 60 15 0 ZEA 4 glucoside 10 00 12 00 479 13 gt 317 15 15 0 317 10 gt 187 10 27 0 ZEA 11 00 15 00 317 10 gt 175 20 27 0 317 10 gt 131 33 27 0 Risultati e discussione Confronto tra campioni maltati e non maltati Allo scopo di valutare l influenza del processo di maltazione sulla stabilit delle micotossine in esame e sull evoluzione del grado e del tipo di contaminazione con la possibile formazione dei coniugati glicosilati o la liberazione delle forme nascoste associate ai macrocomponenti stato analizzato un set di campioni di frumento maltato fornito dall Istituto Sperimentale per la Cerealicoltura di Fiorenzuola Piacenza Italia I risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli conseguiti analizzando la corrispondente materia prima non ancora sottoposta a maltazione Ogni campione stato analizzato in doppio e le concentrazioni degli analiti sono state quantificate sulla base di rette di taratura costruite in matrice e corrette per i fattori di recupero comprensivi della fase di estrazione e clean up su Mycosep calcolati per ZEA e DON in 92 e 72 rispettivamente Dall analisi dei campioni nella maggior parte dei casi stata osservata una drastica diminuzione dei livelli di DON come mostrato in Figura 2 Tale riduzione pu essere imputata sicuramente ad una parziale solubilizzazione della micotossina nelle
234. gt 295 11 0 355 gt 265 0 2 ZEA 17 50 ESI 40 0 317 gt 160 30 0 317 gt 132 0 2 T2 18 15 ESI 20 0 484 gt 305 15 0 484 gt 215 0 2 HT 2 19 00 ESI 15 0 442 gt 263 15 0 442 gt 215 0 2 Tabella 2 Gradiente di eluizione Tempo Eluente A Eluente B min H20 10 mM NH4Ac metanolo 0 0 90 0 10 0 12 0 10 0 90 0 18 0 10 0 90 0 20 0 90 0 10 0 30 0 90 0 10 0 206 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Risultati e discussione Determinazione simultanea di AFB e OTA Le rette di taratura per le AF sono state ottenute partendo da una soluzione di lavoro contenente le quattro Aflatossine in metanolo preparata per diluizione dello standard Supelco alle concentrazioni di 0 1 ug mL per AFB e AFG e di 0 03 ug mL per AFB e AFG Sono stati analizzati 5 livelli di concentrazione negli intervalli 0 4 4 0 ng mL per AFB e AFG e 0 1 1 2 ng mL per AFB e AFG Il coefficiente di correlazione sempre maggiore di 0 99 Tenendo conto dei passaggi di diluizione del metodo di preparazione del campione il limite di rivelazione 0 05 ug kg per i baby food e 0 5 ug kg per i cereali La retta di taratura per OTA stata ottenuta partendo da una soluzione di lavoro in metanolo preparata per diluizione dello standard Supelco alla concentrazione di 1 0 ug mL Sono stati analizzati 6 livelli di concentrazione nell intervallo 0 5 20 ng mL Il coefficiente di correlazione sempre maggiore di 0 99 Tenendo conto dei passaggi di diluizione del
235. guenti 99 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev elevata variabilita individuale tra gli animali carry over maggiore a inizio lattazione rispetto alla fase di lattazione avanzata aumenta in modo pi che proporzionale rispetto alla produzione di latte infezioni della mammella La quantit di AFM ug kg latte nel latte pu essere prevista utilizzando la seguente formula AFB ingerita capo giorno ug x 1 19 1 9 Per produrre latte con AFM lt 50 ng kg o meglio 0 05 pg kg latte gli animali devono ingerire una quantit di AFB lt 40 ug capo giorno Va tenuto presente che la comparsa di AF nel latte in seguito ad ingestione molto rapide se si somministrano alimenti contaminati AFM comparir nel latte gi nella mungitura successiva anche se ci vogliono 2 3 giorni perch il livello si stabilizzi quando poi si riprende a fornire una razione esente da AF i livelli di AFM nel latte diminuiscono dalla mungitura successiva azzerandosi in 2 3 giorni Esistono degli interventi pratici finalizzati a ridurre la possibilit di inquinamento da micotossine che ci sembrato interessante riportare e che possono essere cos riassunti monitorare il latte ogni 15 giorni e a ogni modifica della razione necessario verificare il livello di AFM nel latte presso un laboratorio di fiducia va tenuto presente che AFM nel latte la valutazione pi attendibile del livello di AFB nella razione monitorare le componenti della razione
236. h projects promoted at national and transnational level Therefore this event is addressed to all the researcher and stakeholders of the food and feed chain with the auspices that through their own experiences and contributions exhaustive information on operating and managerial activities to be implemented to control as much as possible mycotoxin contamination in food and feed products is achieved This approach would contribute to limit the sanitary impact of these xenobiotics on human and animal health and the negative consequences for the food and feed system Finally the topics addressed at this Congress can help the dissemination of scientific information related to safeguarding the Italian consumer to the exposure of such toxic substances the individuation of emerging needs to be included in the ongoing research projects and to achieve better competitiveness in the European and international markets Key words Mycotoxins Risk analysis Research projects Foodstuffs Si ringrazia Maria Antonietta Alessandrini per il lavoro di organizzazione del congresso Si ringrazia Maria Cristina Barea Toscan per l aiuto nella redazione del documento Per informazioni su questo documento scrivere a carlo brera iss it Il rapporto accessibile online dal sito di questo Istituto www iss it Questo rapporto contiene un contributo in pi pag 247 251 rispetto al precedente Rapporto ISTISAN 10 32 Citare questo documento come segue Brera C Gregor
237. hain Reaction PCR per la discriminazione di A carbonarius In particolare sono stati sviluppati due set di primer specie specifici sulla base della regione ITS Internal Transcribed Spacer noti per il loro utilizzo negli studi filogenetici e sulla base di sequenze parziali del gene codificante per la polichetide sintasi enzima responsabile della biosintesi dell OTA Alle condizioni testate in questo lavoro i primer individuati sono risultati essere specifici nei confronti del solo A carbonarius sia in vitro che in vivo ed entrambi i primer hanno dimostrato la capacit di rilevare la presenza del fungo anche quando l ispezione allo stereomicroscopio non lo permetteva Inoltre l uso della Real Time PCR ha dimostrato di migliorare le prestazioni di 100 o di 1000 volte rispetto alla PCR classica rendendo possibile l individuazione della presenza del fungo gi dopo 6h momento in cui sono presenti solo circa 20 conidi gr di bacca d uva Materiali e metodi Inoculo di Aspergillus carbonarius su bacca d uva Bacche d uva precedentemente sterilizzate superficialmente sono state inoculate con 10 uL di una sospensione acquosa contenente 1 5 conidi di A carbonarius Le bacche non inoculate hanno costituito il controllo Le bacche d uva sono state incubate a 30 C per 6h 12h 24h 48 ore Al termine dell incubazione ciascuna bacca stata sottoposta a conta dei conidi ed estrazione di DNA 193 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Estr
238. he ha caratterizzato i passati lavori sul tema Conclusioni Questa ricerca ha messo in evidenza l importante effetto della temperatura sul livello di ay pi alta la temperatura pi alta la ay a umidit costante Il modello Chung Pfost risultato il pi adeguato per descrivere le isoterme per la granella di mais durante la maturazione Questi risultati possono essere utilizzati in modelli di simulazione di funghi tossigeni nella granella di mais come il modello FUMAgrain per il quale questa ricerca stata pensata Bibliografia 1 Labuza TP Altunakar B Water activity prediction and moisure sorption isotherms In Barbosa Canovas GV Fontana AJJ Schmidt SJ Labuza TP Ed Water activity in foods Fundamentals and applications Ames Iowa USA IFT Press Blackwell Publishing 2007 p 440 2 Reid DS Water activity fundamentals and relationships In Barbosa Canovas GV Fontana AJJ Schmidt SJ Labuza TP Ed Water activity in foods Fundamentals and applications Ames Iowa USA IFT Press Blackwell Publishing 2007 3 Al Muhtaseb AH McMinn WAM Magee TRA Moisture sorption isotherm characteristics of food products a review Food and Bioproducts Processing 2002 80 2 118 28 4 Samapundo S Devlieghere F De Meulenaer B Atukwase A Lambonid Y Debevere JM Sorption isotherms and isosteric heats of sorption of whole yellow dent corn Journal of Food Engineering 2007 79 1 168 75 5 Quirijns EJ van Boxtel AJB
239. himica della BASF con il nome di Qualidon La procedura indicata per il Qualidon si diversifica da quella del RIDA QUICK DON solo per il quantitativo di campione di 2 g rispetto ad 1g per il RIDA QUICK DON stato organizzato un ring test coinvolgendo 8 laboratori privati e pubblici appartenenti principalmente all industria dei cereali e analizzando 6 campioni di grano macinati per la determinazione di DON utilizzando parallelamente 3 tecniche analitiche diverse ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay 1 laboratorio mediante l uso del kit RIDASCREEN FAST DON distribuito da R Biopharm AG HPLC High Performance Liquid Chromatography 4 laboratori kit RIDA QUICK DON 6 laboratori Materiali e metodi Il kit RIDA QUICK DON si basa su principi immunocromatografici sono utilizzati anticorpi monoclonali e un coniugato su strip Un campione pu essere considerato positivo per il DON quando sulla card si visualizzano 2 bande colorate mentre negativo se si sviluppa una sola banda L intensit del colore della banda letta mediante il lettore ed valutata in base ad 216 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev una curva standard prestabilita che permette di eseguire la quantificazione di DON Il tempo totale richiesto per l analisi dall estrazione del campione fino alla lettura dei risultati inferiore a 15 minuti Un altro vantaggio che i risultati ottenuti tramite il lettore possono essere stampati o esportat
240. i PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells sono stati isolati come descritto da Lacetera et al 13 e quindi risospesi densit 1 x 10 cellule mL nel medium arricchito RPMI 1640 ECM Cambrex Bio Science Verviers Belgium contenente 25 mM rispettivamente di Hepes acido 4 2 idrossietil 1 piperazinil etansolfonico ed L glutamina Le colture sono state allestite in duplicato utilizzando piastre in polistirene da 24 pozzetti Sarsted INC Newton USA Le cellule sono state incubate in presenza di 4 micotossine a diversa concentrazione Aflatossina B AFB 0 5 0 e 20 0 ug mL Tossina T 2 T2 0 2 5 e 10 0 ng mL Deossinivalenolo DON 0 1 0 e 5 0 ug mL e Fumonisina B FB 0 35 0 e 70 0 ug mL I range di concentrazione nel medium di coltura per le quattro micotossine sono stati scelti sulla base del loro potenziale tossico relativamente alla riduzione della proliferazione linfocitaria in vitro del 50 riportata in letteratura 6 7 14 17 L effetto dell esposizione dei linfociti alle quattro tossine stato valutato a differenti tempi 2 o 7 giorni incubando le piastre alla temperatura di 39 C in atmosfera al 95 aria e 5 CO2 Al termine delle prove le piastre sono state centrifugate a 300 x g per 20 minuti e a temperatura ambiente Il surnatante stato scartato e le cellule raccolte e conservate a 80 C fino all analisi La lisi delle cellule stata ottenuta in PBS Phosphate Buffered Saline tampone fosfato salino conten
241. i Transactions of the ASABE 2006 49 1235 45 188 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev VALIDAZIONE SECONDO LA DECISIONE 657 2002 CE DI UN METODO DI SCREENING IN IMMUNOENZIMATICA PER LA DETERMINAZIONE DI ZEARALENONE NELL ALIMENTAZIONE UMANA Rita De Pace Valeria Vita Dipartimento Chimica Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia Basilicata Foggia Introduzione Le micotossine sono metaboliti secondari di microscopici funghi tossici per gli animali superiori con un peso molecolare relativamente basso moderata o alta volatilita alta stabilita e una struttura specifica racchiusa nella tassonomia dei microorganismi produttori Questi metaboliti che variano enormemente nella loro struttura chimica mostrano un considerevole intervallo di effetti biologici dovuti alla loro abilit di interazione con vari organismi e o sistemi bersaglio La contaminazione da micotossine nell uomo avviene mediante passaggio da vegetali contaminati o da prodotti alimentari Oltre a problemi di salute la contaminazione di prodotti alimentari pu causare grandi perdite economiche a causa della ridotta produttivit degli animali nutriti con mangimi che contengono anche solo piccole concentrazioni di micotossine Lo Zearalenone ZEA una micotossina prodotta da almeno otto specie tossigene del genere Fusarium incluse F Graminearium F Culmorum e F Equiseti che colonizzano i cereali dove trovano eccellenti condizioni per la sintesi di micotossine G
242. i delle tecnologie e delle procedure impiegate consentono di ottenere RM con caratteristiche d eccellenza in termini di omogeneit e stabilit chimica e microbiologica Gli impianti possiedono inoltre caratteristiche di unicit e introducono elementi di innovazione nella preparazione degli RM quali ad esempio la possibilit di preparare Double Phase RM DP RM e RM monouso Con gli impianti descritti sono stati realizzati diversi Materiali di Riferimento di interesse per il settore agroalimentare tra cui diversi prodotti alimentari liofilizzati 22 24 funghi champignons pomodori freschi e pelati in latta fragole e broccolo e un mangime per pesci 25 Nell ambito di una collaborazione con il Laboratorio Comunitario di Riferimento per gli elementi chimici negli alimenti di origine animale presso 1 ISS CRL ISS sono stati preparati diversi RM liofilizzati muscolo e fegato bovino carne suina latte pesce da impiegare nei circuiti interlaboratorio internazionali 26 27 28 Nell ambito delle attivit riguardanti la qualit delle misure per la sicurezza degli ambienti di lavoro stato recentemente condotto uno studio di fattibilit per la realizzazione di un RM di toner a pi dimensioni ossia un RM da certificare per valori di propriet chimiche composizione chimica e o contenuto di sostanze tossiche e da accompagnare con valori di riferimento e o di informazione per propriet fisiche chimico fisiche e tossicologich
243. i Aflatossina B interno OG Met AF IV 2006 6 n anand MEER eee LEN aa ooo Ace sio pasta di pistacchio o li sui si Grano e prodotti derivati OcratossinaA interno OG Met OTA IV 2006 estensione _ del metodo UNI EN14132 2003 Deossinivalenolo interno OG Met DON I 2006 7 Al fine di operare in conformit con la norma UNI CEI EN ISO IEC 17025 per mantenere il controllo di qualit esterno il Laboratorio partecipa regolarmente ai programmi del FAPAS Central Science Laboratory Sand Hutton York UK Il reparto vanta la partecipazione a questo circuito da almeno quindici anni garantendo sempre risultati molto soddisfacenti Per l anno 2008 2009 il laboratorio ha partecipato al circuito FAPAS per l analisi dell Ocratossina A in baby food nella paprika nel caff e nel vino delle Aflatossine nel mais e nei mangimi del Deossinivalenolo nella farina di grano Tabella 2 Tabella 2 Partecipazione ai circuiti FAPAS 2008 2009 e valori degli z score ottenuti Micotossina Test FAPAS Matrice z score Ocratossina A 1772 alimenti per l infanzia a base di cereali 0 5 1773 paprica 0 6 1775 vino 0 3 1778 alimenti per l infanzia a base di cereali 0 2 Aflatossine totali 4122 mais 0 2 4124 mangime 1 0 4133 fichi secchi 1 0 4148 mais 0 7 Aflatossina M1 4146 latte 0 2 Deossinivalenolo 2247 farina di grano 0 5 2259 farina di grano 0 6 168 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev L LNR partecipa costantemente anche all attiv
244. i C I materiali di riferimento per il settore agroalimentare stato attuale e necessit In Atti del V Congresso Metrologia amp Qualit Torino 14 16 marzo 2007 Unione Europea Regolamento CE 683 2004 della Commisione del 13 aprile 2004 che modifica il regolamento CE n 446 2001 per quanto riguarda le aflatossine e l ocratossina A negli alimenti per lattanti e prima infanzia GUCE L 106 15 aprile 2004 Unione Europea Regolamento CE n 1881 2006 della Commissione del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari GUCE L 364 20 dicembre 2006 Italia Decreto legislativo 149 2004 Attuazione delle direttive 2001 102 CE 2002 32 CE 2003 57 CE e 2003 100 CE relative alle sostanze e ai prodotti indesiderabili nell alimentazione degli animali Gazzetta Ufficiale n 139 16 giugno 2004 Unione Europea Raccomandazione CE 17 08 2006 Presenza di Deossinivalenolo Zearalenone Ocratossina A tossine T 2 e HT 2 e Fumonisine in prodotti destinati all alimentazione degli animali GUCE L 229 23 agosto 2006 Carconi P Gatti R Zappa G Zoani C A systematic approach in the evaluation of uncertainty in analytical chemistry application to ICP AES analysis In Fajeli A Belli M Sansone U Ed Combining and reporting analytical results London RSC publishing 2007 p 161 7 Carconi P Gatti R Zappa G Zoani C L incertezza delle misure chimiche per la qualita e la sicurezza
245. i E De Santis B Miraglia M Ed 3 Congresso nazionale Le micotossine nella filiera agro alimentare e zootecnica Istituto Superiore di Sanit Roma 28 30 settembre 2009 Atti Roma Istituto Superiore di Sanit 2010 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Presidente dell Istituto Superiore di Sanit e Direttore responsabile Enrico Garaci Registro della Stampa Tribunale di Roma n 131 88 del 1 marzo 1988 Redazione Paola De Castro Sara Modigliani e Sandra Salinetti La responsabilit dei dati scientifici e tecnici dei singoli autori Istituto Superiore di Sanit 2010 INDICE PREMCS E alt et hates ciba i nei ieri Sues eat Ene ii ida PRIMA SESSIONE Valutazione del rischio da micotossine Livelli di Ocratossina A nel siero di un campione di popolazione molisana Amedeo Pietri Terenzio Bertuzzi Filippo Rossi Gianfranco Piva Silvia Rastelli Annalisa Mulazzi Romina di Giuseppe Licia Iacoviello cccccccccescesscesscetecesetuseesseesseeseesseesseeas Valutazione in vitro dell esposizione alle micotossine sullo stato ossidativo di linfociti del bovino da latte Umberto Bernabucci Loredana Basirico Pier Paolo Danieli Bruno Ronchi Valutazione della presenza di micotossine nascoste nei cereali mediante digestione gastrointestinale simulata Claudia Falavigna Chiara Dall Asta Gianni Galaverna Arnaldo Dossena Rosangela Marchelli iii Deossinivalenolo Zearalenone e loro meta
246. i ELISA presentati sono basati sulla competizione tra POTA libera contenuta nei campioni o negli standard e quella coniugata con l enzima rivelatore perossidasi esse competono per il legame con il medesimo anticorpo specifico anti OTA adsorbito alla fase solida pozzetto di una micropiastra Alla reazione di competizione segue una fase di lavaggio per allontanare i reagenti in eccesso Il rilevamento del coniugato enzimatico legato alla fase solida viene effettuato in una seconda reazione con l aggiunta di una soluzione cromogena L attivit enzimatica produce una soluzione colorata la cui assorbanza OD viene letta tramite un lettore per micropiastre Il valore di assorbanza inversamente proporzionale alla concentrazione dell OTA nel campione Il B Bo rappresenta il rapporto in percentuale tra la media delle OD misurate e quella dello Standard Zero Total Binding 239 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Configurazione saggio ELISA di riferimento Di seguito sono elencate schematicamente le fasi operative implementare 50 uL dello standard zero nei pozzetti del Total Binding TB implementare 50 uL di soluzioni standard di taratura e di campioni nei pozzetti preposti aggiungere 150 uL di OTA coniugato enzimatico in ogni pozzetto incubare 20 minuti a temperatura ambiente 20 25 C eliminare il liquido dai pozzetti svuotandoli per inversione della piastra lavare per 5 volte con la soluzione di lavaggio aggiungere 200 uL di so
247. i ISTISAN 10 32 Rev 160 140 120 100 80 pg kg 60 40 20 123 4 5 6 7 8 9 1011 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 campioni Figura 3 Concentrazione di OTA nei campioni pronti alla vendita non sottoposti a spazzolatura Dalle analisi emerso che dei 27 campioni non spazzolati il 67 ha un livello di OTA lt 30 ug kg il 26 ha un livello compreso tra 30 e 60 ug kg e il 7 ha un livello tra 60 e 150 pg kg Figura 4 Dei campioni con OTA lt 30 ug kg il 27 non presentava contaminazione gt LOD E lt 30 pg kg tra 30 e 60 ug kg tra 60 e 150 ug kg Figura 4 Percentuale di contaminazione da OTA nei campioni non sottoposti a spazzolatura Non stata riscontrata correlazione tra contenuto di OTA e tempo di stagionatura Le analisi a cuore del prodotto non hanno mai mostrato un contenuto di OTA superiore al valore di LOD questo conferma che POTA presente sulla superficie del budello non stata in grado di penetrare all interno del prodotto Per i campioni analizzati viene dunque rispettato il limite della circolare ministeriale di 1 ug kg 131 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev E stato possibile verificare Figura 5 che il contenuto di OTA nel budello viene ridotto tramite la spazzolatura in media per il 60 da un minimo di 30 ad un massimo di 93 160 a spazzolato i b non spazzolato 140 120 100 ug kg
248. i acido tricloroacetico al 15 e 2 mL di cloroformio La provetta stata agitata per 60 secondi su vortex e lasciata a temperatura ambiente per 4 ore agitando ogni 30 minuti per favorire l estrazione da parte del cloroformio e per una migliore precipitazione della frazione proteica Dopo centrifugazione per 5 minuti stata prelevata la fase inferiore di cloroformio per trasferirla in una seconda provetta La partizione con cloroformio stata ripetuta per altre 2 volte Il volume raccolto dalle 3 estrazioni stato ridotto a 2 mL sotto flusso di azoto Sono state condotte quindi 3 estrazioni con 2 mL ciascuna di soluzione 0 13 M di NaHCO trasferendo in un altra provetta la fase acquosa superiore Questa addizionata dello stesso volume di PBS Phosphate Buffered Saline stata purificata su colonna a immunoaffinit VICAM Effettuato un lavaggio con 2 mL di PBS POTA stata eluita in provetta graduata con 3 mL di CH CN Dopo avere concentrato l estratto sotto flusso di No stato portato ad 1 mL con una miscela CH3CN H 0 35 65 v v agitando in bagno ad ultrasuoni e su vortex infine il campione stato filtrato 0 45 um L OTA stata determinata mediante analisi HPLC High Performance Liquid Chromatography la separazione stata effettuata con colonna Luna Phenyl Hexyl Phenomenex utilizzando come fase mobile un gradiente CH3CN soluzione acquosa al 2 di CH3COOH da 35 a 67 di CH3CN in 9 minuti a flusso di 1 0 mL min
249. i al 95 di A 21 30 minuti ricondizionamento al 95 di A tempo totale di analisi 30 minuti Le impostazioni per le analisi spettrometriche sono state le seguenti ESI modalit di ionizzazione negativa voltaggio del capillare 2 5 kV cono 10 V per i Tricoteceni e ZEA 4 glucoside 60 kV per ZEA estrattore 3V temperatura della sorgente 150 C temperatura di desolvatazione 350 C flusso del gas del cono e del gas di desolvatazione azoto 50 L h e 500 L h rispettivamente La rivelazione stata effettuata utilizzando la modalit operativa Multiple Reaction Monitoring MRM messa a punto sull addotto acetato di ogni micotossina monitorando tre transizioni per ogni analita Le transizioni monitorate le relative energie di collisione e le finestre di acquisizione sono riassunte in Tabella 1 28 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 1 Finestre di acquisizione transizioni monitorate e relative energie di collisione impiegate per ogni analita Analita Finestra di Transizione Energie di collisione acquisizione min monitorata m z eV 371 30 gt 311 20 12 0 NIV 3 00 5 00 371 30 gt 281 20 15 0 371 30 gt 58 50 15 0 370 13 gt 310 13 12 0 13C DON standard interno 5 00 8 00 370 13 gt 279 10 15 0 370 13 gt 58 60 15 0 355 00 gt 295 20 12 0 DON 5 00 8 00 355 00 gt 265 10 15 0 355 00 gt 58 90 15 0 517 10 gt 457 10 20 0 DON 3 glucoside 6 00 8 50 517 10 gt 427 10 20 0 517 10 gt 59 10 55 0 397 10
250. i alla concentrazione di DON nei campioni di frumento duro in totale 1087 provenienti dal monitoraggio aziendale e dai centri di stoccaggio del Centro 436 e del Sud Isole 651 Risulta evidente il maggiore grado di contaminazione nelle aree del Centro rispetto a quelle del Sud Isole in relazione soprattutto ai livelli medi pi alti 477 ug kg contro 54 ug kg e ai massimi 13561 ug kg contro 906 pg kg Inoltre la variabilit delle condizioni climatiche nelle diverse annate ha condizionato in modo pi marcato il grado di contaminazione da DON nelle aree centrali rispetto a quelle meridionali dato che per queste ultime i valori medi dei campioni positivi sono risultati pressoch irrilevanti in quanto inferiori a 100 ug kg 86 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 1 Valori di contaminazione da DON in campioni di frumento duro provenienti dal monitoraggio aziendale Anni Centro Sud Isole n campioni DON in positivi n campioni DON in positivi ug kg ug kg totale positivi media max totale positivi media max 2006 150 60 84 449 299 74 54 906 2007 152 86 286 4351 254 89 48 422 2008 134 114 477 13561 98 28 45 329 Totale 436 260 651 191 La generale bassa contaminazione delle aree di coltivazione del Meridione confermata anche dai dati relativi ai campioni dei campi sperimentali della Rete nazionale riportati in Tabella 2 Infatti i valori medi si mantengono sempre su valori inferiori a 100 ug kg mentre i valori massimi
251. i analisi valori rappresentano la media di tre repliche per tesi ES Inoltre i primer hanno permesso di rilevare P expansum su mele commerciali sia biologiche che convenzionali in quantit bassissime Figura 2 rappresentanti comunque un inoculo sufficiente a far sviluppare il patogeno dopo 10 giorni di incubazione delle stesse mele a 25 C 245 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 4 00E 01 3 50E 01 3 00E 01 2 50E 01 2 00E 01 1 50E 01 1 00E 01 x 5 00E 02 2 0 00E 00 g DNA fungino mg mela Mele tradizionali Mele biologiche Figura 2 Quantita di DNA fungino rilevato in mele commerciali mediante RT PCR i valori rappresentano la media di tre repliche per tesi ES La mancata amplificazione del DNA di mela ha confermato la specificita dei primer per P expansum dati non mostrati I risultati ottenuti in tale lavoro hanno confermato la diffusa e comune presenza di P expansum su mele ed hanno evidenziato l elevata sensibilit dei primer PG1 e della PCR Real Time metodica che potrebbe essere facilmente applicata per early detection del fungo su scala commerciale in quanto applicabile al DNA estratto direttamente da tessuto vegetale senza necessit di isolare precedentemente la microflora identificarla e sottoporre ad estrazione il micelio fungino Bibliografia 1 Pitt JI Toxigenic Penicilli
252. i azoto a 40 C il residuo ricostituito in fase mobile CH30H 0 1M tampone fosfato a pH 3 15 60 40 v v ed infine filtrato su membrane Anotop 10 LC 0 2 um 10 mm Whatman Risultati e discussione Il metodo da noi proposto si basa su un processo automatizzato di derivatizzazione post colonna mediante OPA e Thiofluor In tal modo gli addotti di derivatizzazione vengono inviati rapidamente al rivelatore fluorimetrico consentendo di eliminare i problemi legati alla necessit di operare rapidamente e garantendo un aumento della riproducibilit della metodica di analisi Per il processo di derivatizzazione chimica post colonna stato utilizzato un semplice dispositivo disponibile sul mercato costituito da una pompa a doppio pistone collegata ad una riserva di agente derivatizzante e una camera di reazione termostatata LabService Analytica Srl La combinazione di una semplice procedura di clean up con la derivatizzazione chimica post colonna e la rivelazione fluorimetrica consente di ottenere una elevata affidabilit e sensibilit di analisi con limiti di rivelazione inferiori a 15 pg kg Tabella 2 Tabella 2 Curve di taratura di FB e FB2 valutate su soluzioni standard e in matrice y at bx valutata su soluzioni standard di Fumonisine at SD b SD r LOD LOQ ug L ug L FB 0 3 0 6 0 454 0 003 0 9998 4 13 FB2 1 0 0 6 0 375 0 003 0 9997 5 16 y a bx valutata su campioni di cornflakes additivati
253. i controllo con frequenza trimestrale sia mediante la partecipazione a ring test organizzati dall AIA Seppur nei limiti di una ridotta casistica possibile affermare che il sistema di vigilanza messo in atto risulta efficace e che i livelli di contaminazione riscontrati nei campioni analizzati non destano al momento preoccupazione di carattere igienico sanitario Bibliografia 1 Bhatnagar D Yu J Ehrich KC Toxins of filamentous fungi Chemical Immunology 2002 81 167 206 2 Unione Europea Decisione della Commissione del 12 agosto 2002 che attua la Direttiva 96 23 CEE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e all interpretazione dei risultati 2002 657 CEE GUCE L221 17 agosto 2002 3 Desimoni E Brunetti B Assicurazione di qualita nel laboratorio chimico Validazione dei metodi di analisi Bologna Edizioni CLUEB 2003 4 Gruppo di lavoro dei Laboratori di Chimica degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali Linee guida per la validazione intra laboratorio di metodi di prova Immunochimica di screening in accordo con la decisione 2002 657 CE 2007 5 Unione Europea Regolamento CE n 1126 2007 della Commissione del 28 settembre 2007 che modifica il regolamento CE n 1881 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari per quanto riguarda le Fusarium tossine nel granoturco e nei prodotti a base di granoturco GUCE L 255 29 settembre 2007 192 Rapporti ISTISAN 10 32 R
254. i delle serie di spettri ottenuti da tutti i campioni di mais inoculato e non stata confrontata utilizzando l analisi delle componenti principali Principle Component Analysis PCA I risultati delle analisi sono stati successivamente utilizzati per creare un modello per la identificazione della crescita fungina attraverso l analisi discriminante o l Analisi ANOVA sulle componenti principali individuate I risultati mostrano che l analisi spettrale associata a quella statistica permette di individuare rapidamente e precocemente la contaminazione con funghi potenzialmente tossigeni sulla base delle variazioni delle propriet di riflettanza spettrale del mais Tale metodo si dimostra efficace quando i metodi tradizionali non lo sono ancora e cio 48 ore dopo l inoculo con Aspergillus flavus o Aspergillus niger Lo sviluppo di sistemi di Imaging spettrale portatili o automatizzati renderebbe infine possibile l impiego della tecnica analitica presentata per rapide determinazioni in situ o online 187 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Bibliografia 1 Fanelli C Ricelli A Reverberi M Fabbri AA Aflatoxins and ochratoxins in cereal grains an open challenge In Pandalai SG Ed Recent research development in crop science vol 1 Kerala India Research Signpost 2004 p 295 317 2 Naceur Haouet M Altissimi MS Webzine Sanita pubblica veterinaria 2003 3 18 3 Pearson TC Wicklow DT Detection of corn kernels infected by fung
255. i diversi settori di competenza nelle analisi di mangimi e alimenti Il laboratorio comunitario di riferimento per le micotossine nei mangimi e alimenti il Joint Research Centre for mycotoxins JRC sito a Geel Belgio mentre il Reparto Organismi Geneticamente Modificati e Xenobiotici di Origine Fungina del Dipartimento di Sanit Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare DSPVSA ex Centro Nazionale per la Qualit e per i Rischi Alimentari stato designato Laboratorio Nazionale di Riferimento per le micotossine dal Ministero della Salute in ottemperanza al Regolamento 882 2004 Le attivit di tali laboratori devono coprire tutti gli ambiti della normativa in materia di mangimi e di alimenti e di salute degli animali in particolare quelli in cui vi la necessit di risultati analitici e diagnostici altamente accurati La elevata qualit e uniformit dei risultati analitici nell ambito del controllo ufficiale assicurata dalle attivit di tali laboratori di riferimento comunitari e nazionali che sono chiamati a rendere disponibili metodi analitici validati ad assicurare che siano disponibili materiali di riferimento ad organizzare test comparativi interlaboratorio e non ultimo a garantire la programmazione periodica di piani di formazione del personale di laboratorio Attivit I compiti specifici che ciascun Laboratorio Nazionale deve assolvere a supporto tecnico per la verifica della conformit alla normativa in materia di m
256. i fisiologiche del tratto gastrointestinale umano in termini di composizione dei fluidi digestivi pH e tempi di permanenza dell alimento in ogni compartimento E stato pertanto impiegato il protocollo 17 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev messo a punto da Versantvoort et al 2005 il quale simula i processi digestivi che hanno luogo dopo che un alimento stato somministrato ad un soggetto a digiuno La preparazione delle soluzioni saline e dei succhi gastrici artificiali saliva succo gastrico succo duodenale e bile stata effettuata secondo quanto previsto da questo modello 9 Prima di iniziare gli esperimenti tutte le soluzioni vengono preriscaldate a 37 2 C La digestione comincia aggiungendo 2 g di campione macinato a 3 mL di saliva contenente l enzima a amilasi gi portata a temperatura Dopo 5 minuti vengono aggiunti 6 mL di succo gastrico nel quale l enzima preposto alla digestione la pepsina e la miscela viene lasciata incubare per 2 ore prima dell aggiunta simultanea di 6 mL di succo duodenale contenente pancreatina e lipasi 3 mL di bile e 1 mL di carbonato di sodio 1 M Successivamente a quest ultima aggiunta si attende un periodo di altre 2 ore prima di considerare terminato l esperimento Durante tutta la durata della digestione in vitro la miscela viene mantenuta in agitazione mediante ancoretta magnetica 250 rpm a 37 2 C grazie all ausilio di una piastra riscaldante e il pH viene controll
257. i lipidi per affioramento dopo avere rimosso il grasso sovrastante trasferire 1 mL di campione in una provetta eppendorf centrifugare a 10000 g per 10 min prelevare e deporre nei pozzetti della piastra 200 uL di standard e campioni incubare a temperatura ambiente 19 lt T lt 25 C per 2 h Eliminare il liquido incubato e lavare 3 volte i pozzetti con PBS Tween 20 Aggiungere 100 uL di coniugato enzimatico horseradish peroxidase HRP a ogni pozzetto incubare a temperatura ambiente per 15 20 min lavare i pozzetti con PBS Tween 20 aggiungere 100 uL di substrato cromogeno TMB tetrametilbenzidina a ogni pozzetto incubare per 15 min Fermare la reazione con 100 uL di stop solution e misurare la densit ottica OD a 450 nm con un lettore di micropiastre Microplate Reader Model 680 BIO RAD Milano Italia Il saggio ELISA stato eseguito usando soluzioni standard di AFM a 0 004 0 005 0 010 0 025 0 050 0 100 ng mL Studio di validazione intra laboratorio Il LOQ stato determinato analizzando i bianchi campioni fortificati a concentrazioni decrescenti fino a 0 002 ng g La specificit del metodo stata valutata analizzando 2 campioni di latte di massa pastorizzato e UHT di origine bovina bufalino e ovi caprina risultati non contaminati da AFM all analisi HPLC bianchi campione Il CCP stato valutato al LOQ analizzando i 20 campioni bianchi matrice fortificati a 0 004 ng g La robustezza del metodo s
258. i ma dall altra non permettono di ricavare informazioni pi dettagliate sui diversi tipi di micotossine riscontrate nei singoli alimenti Aflatossine Bj Gi B2 G2 M Ocratossina Zearalenone Deossinivalenolo Fumonisine Patulina Si sono intraprese diverse iniziative per aggiornare i modelli di rilevazione e favorire di conseguenza una maggiore categorizzazione dei rischi lungo la filiera alimentare Si notano ancora numerose criticita legate alla lentezza di recepimento di questa proposta di innovazione da parte di diversi Assessorati e Laboratori Per far fronte alle nuove esigenze di programmazione regionale senza tuttavia trascurare le richieste della Commissione europea si rendera necessario apportare definitivamente delle modifiche ai modelli di rilevazione in uso ottimizzando i flussi informativi relativi al controllo ufficiale dei prodotti alimentari Questa esigenza gi emersa nell anno 2007 dovr essere oggetto di incontri tecnici prevedendo una revisione completa dei sistemi informativi 61 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Al contrario attraverso il Sistema di Allerta Comunitario RASFF Rapid Alert System for Food and Feed si in grado di conoscere dettagliatamente le informazioni sui diversi tipi di micotossine riscontrate nei singoli alimenti Questi dati per si riferiscono solo all attivazione del sistema di allerta e non indicano di conseguenza quale la percentuale di irregolarit su tutti i camp
259. i mais in 4 campioni di mais in 10 di cornflakes in 12 di snack e in 7 di prodotti per celiaci pasta gallette biscotti 227 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 4 Contaminazione di FB e FB nelle matrici reali Tipo di matrice Campioni Contaminazione Campioni Range Media n c gt 15 pg kg positivi ug kg ug kg Polenta 21 100 19 27 1433 330 Farina di mais 8 100 38 119 2481 960 Mais 7 57 14 41 1441 430 coealda 35 29 35 178 89 colazione Snack 16 75 22 561 110 Alimenti per celiaci 13 54 28 618 170 Valori riferiti ai soli campioni contaminati c gt 15 ug kg Livelli di contaminazione superiori ai limiti consentiti sono stati osservati in 4 campioni di polenta in 3 di farina di mais e in 1 di mais mentre non sono stati rilevati campioni positivi tra cereali da colazione snack e alimenti per celiaci Una minore incidenza di contaminazione stata osservata nell anno 2008 7 rispetto al 2007 19 Il differente grado di contaminazione delle varie matrici analizzate pu essere attribuito al tipo di processo adoperato in fase di produzione In particolare i trattamenti meccanici e i blandi processi di riscaldamento effettuati su polenta e farina di mais non riducono significativamente il contenuto di Fumonisine eventualmente presente nel mais di partenza I processi di tostatura ed estrusione a cui sono sottoposti i cornflakes gli snack e gli alimenti per celiaci determinano invece un dec
260. i mangimi senza sequestranti non sono state riscontrate differenze statisticamente significative tra i metodi di estrazione metanolo H2O 80 20 v v e acetone H 0 85 15 v v anche se livelli pi elevati si sono trovati utilizzando l estrazione con acetone In particolare per il mangime a maggiore contaminazione sono stati trovati valori medi di 13 8 1 0 e 15 3 1 2 ug kg rispettivamente usando l estrazione metanolo H O 80 20 v v e acetone H O 85 15 v v per quello a minore contaminazione valori di 7 0 0 6 e 7 5 0 6 ug kg rispettivamente Notevoli differenze sono state riscontrate per i mangimi contenenti sequestranti Tabelle 1 e 2 per tutti i campioni i risultati evidenziano un efficienza di estrazione molto scarsa della miscela metanolo H O 80 20 v v con percentuali di recupero inferiori al 25 Usando la miscela acetone H O 85 15 v v la percentuale media di recupero stata del 75 per i mangimi a livello maggiore e dell 84 per quelli a livello minore di AFB L efficienza di estrazione del metanolo nei mangimi contenenti sequestranti risultata quindi significativamente pi bassa p lt 0 001 rispetto a quella dell acetone Inoltre risultato un effetto dose dipendente p lt 0 01 i livelli di AFB si sono rivelati pi bassi quando la dose del sequestrante aggiunto ai mangimi stata pi elevata 2 236 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 1 Contenuto medio di AFB g kg nei mangimi a m
261. i riscontrati livelli elevati di acido valerianico Di seguito si riportano i valori medi degli acidi grassi volatili g kg t q riscontrati negli insilati dove l acido valerianico era assente Ac lattico 19 75 7 07 Ac acetico 10 91 1 76 Ac propionico 2 46 0 56 96 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Ac isobutirrico 4 44 1 19 Ac butirrico 2 75 0 80 Ac isovaleranico 0 00 0 00 Ac valerianico 0 00 0 00 I valori medi degli acidi grassi volatili g kg t q negli insilati che presentavano contaminazioni macroscopiche stata la seguente Ac lattico 12 04 2 14 Ac acetico 3 81 0 75 Ac propionico 3 57 0 42 Ac isobutirrico 1 68 0 87 Ac butirrico 2 25 0 36 Ac isovaleranico 0 73 0 05 Ac valerianico 16 64 7 85 Determinazione del contenuto in Aflatossina negli insilati di mais Dall esame dei dati ottenuti degli insilati raccolti emerso che nel 73 3 delle aziende stata registrata una presenza significativa di muffe e lieviti La colonizzazione da parte di questi microrganismi si verificata per il 63 16 delle volte nel periodo estivo Le elevate temperature e l umidit che caratterizzano questo periodo unitamente all utilizzazione della parte finale del silomais componente principale di gran parte delle diete somministrate probabilmente rappresentano la causa dei valori elevati riscontrati I valori di AF dosate nei singoli alimenti e calcolati sul totale delle razion
262. i somministrate rientrano in gran parte del periodo nei limiti stabiliti per la Bj dal Reg CE 1525 1998 Nella seguente Tabella riportiamo i valori di AFB nelle aziende considerate Tabella 1 Contenuti in AFB nelle aziende considerate Azienda AFB pg kg media deviazione standard A 3 78 0 12 B 2 89 0 08 C 3 14 0 10 D 3 72 0 12 E 3 84 0 14 F 3 57 0 10 G 2 81 0 09 H 4 72 0 20 Dall esame della Tabella appare evidente che i livelli di AFB risultano non particolarmente elevati Analisi campioni di latte Si riporta di seguito i dati relativi alla quantit di latte prodotto e le corrispettive percentuali di grasso e proteine nelle aziende selezionate sul territorio regionale Tabella 2 Sono state prese in considerazione 30 bufale pluripare per ogni azienda considerata nella prova sperimentale 97 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 2 Caratteristiche medie del latte nelle diverse aziende considerate Azienda kg latte prodotto di grasso proteine media DS media DS media DS A 10 21 3 07 9 04 1 24 4 69 0 46 B 9 20 2 92 8 56 1 63 5 06 0 48 C 8 29 2 85 8 31 1 48 5 03 0 43 D 9 70 2 36 8 75 1 93 4 85 0 41 E 9 59 2 34 8 73 1 92 4 75 0 39 F 9 84 3 01 8 70 1 62 4 56 0 29 G 12 29 2 74 8 58 2 02 4 65 0 37 H 11 51 2 30 8 13 1 85 4 66 0 41 DS Deviazione Standard Sono state prese in considerazione bufale tra la seconda e la quarta lattazione anche in vista del confronto statistico finale sull influenza
263. i su PC per la conservazione e la rintracciabilit dei valori Il metodo utilizzato per lo studio ha un intervallo di rivelazione compreso tra 0 5 e 5 5 mg kg anche possibile avere un intervallo compreso tra 0 25 e 0 9 mg kg modificando il rapporto tra il campione e il tampone di estrazione 2 g di un campione macinato rappresentativo sono stati aggiunti a 30 mL di tampone di estrazione e sono stati mescolati vigorosamente per 3 minuti La sospensione stata poi filtrata mediante carta da filtro Whatman n 1 e 100 uL del surnatante sono stati applicati sull area di analisi della strip I risultati sono stati letti dopo 5 minuti utilizzando il lettore RIDA QUICK SCAN Risultati e conclusioni I campioni di grano sono stati testati per DON in un circuito di analisi da 6 diversi laboratori che hanno usato lateral flow strip e un lettore portatile I risultati sono stati confrontati con i dati ottenuti con HPLC ed ELISA I campioni sono stati classificati da 0 5 a 2 5 mg kg 500 2500 ug kg I risultati ottenuti con il lettore RIDA QUICK SCAN sono in accordo con quelli in HPLC ed ELISA nel 95 dei casi tenendo in considerazione un incertezza del 30 sui risultati in HPLC durante l analisi Tabella 1 Tabella 1 Risultati del ring fest con metodi HPLC ELISA per l analisi di DON in campioni di grano Campioni Media HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC ELISA grano 2 lab 1 2 3 4 RIDASCREEN FAST DON 1 lab 1 0 302 0 33 0 27 0 40 0 30
264. ia a fattori individuali che allo stadio di lattazione Il carry over di un singolo animale 3 3 3 5 volte maggiore a inizio lattazione che a lattazione avanzata ed linearmente correlato con il livello produttivo Nel caso delle bufale nel latte accanto ad AFM viene eliminata anche AFB In considerazione del fatto che la principale influenza negativa sulla fertilit e quindi sulla produttivit deriva non tanto dalle infezioni specifiche o non della sfera genitale quanto dagli effetti di una serie di fattori che esercitano la loro azione interagendo fra loro rendendo difficile una diagnosi causale dell infertilit in un dato allevamento e che tra questi fattori le micotossine giocano un ruolo fondamentale si concentrata l attenzione degli autori sulla presenza di AFB nell insilato di mais sulla presenza di AFM nel latte e l influenza che questi hanno mostrato sugli aspetti produttivi e metabolici nella bufala mediterranea italiana Si preferito concentrare l attenzione sulla bufala mediterranea italiana in considerazione dell importanza economico ambientale sul sistema agro zootecnico del Mezzogiorno d Italia Materiale e metodi Analisi qualitativa degli insilati La determinazione della composizione chimica rappresenta il primo fondamentale passo nella valutazione qualitativa dell insilato Infatti non bisogna dimenticare che lo scopo dell alimentazione e nutrizione animale quello di massimizzare l efficie
265. ibilit riproducibilit e di accuratezza si proposto l utilizzo dei una metodo di screening quantitativo basato sulla tecnica ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay e l esecuzione di controlli limitatamente alla ricerca e determinazione di Aflatossina B e Ocratossina A su alimenti destinati agli animali da compagnia cani e gatti Le informazioni cos ottenute permettono di definire una mappatura del rischio sul territorio al fine di fornire risposte immediate a situazioni di allarme nel caso in cui la contaminazione dovesse estendersi anche a prodotti di origine animale destinati all alimentazione umana Con lo scopo di ottenere informazioni attendibili e rappresentative della reale situazione sul territorio stato definito il criterio di ripartizione dei campioni in ambito regionale Tabella 2 basato sulla rappresentativit delle produzioni su base geografica e su una scelta casuale delle aziende produttrici di mangimi e di materie prime Nell ottica degli obiettivi di tale piano si stabilito di scegliere quali stabilimenti oggetto di campionamento quelli adibiti a alla produzione di materie prime e mangimi destinati agli animali da latte e b alla distribuzione e produzione di mangimi per animali da compagnia e infine c quelli agricoli e zootecnici e fra le matrici da campionare presso i medesimi stabilimenti le seguenti materie prime mais sottoprodotti del mais grano altri cereali e loro prodotti e so
266. ical data In Fajeli A Belli M U Sansone U Ed Combining and reporting analytical results London RSC publishing 2007 p 205 15 179 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 8 O 10 1 12 13 14 15 16 IK 18 19 20 2 an 22 23 24 Gatti R Sangiorgio P Zappa G Zoani C Some considerations on certification of monoelemental Reference Solutions In Atti del Workshop Traceability to support CIPM MRA and other international arrangements Torino Italy 6 7 November 2008 Niessen L PCR based diagnosis and quantification of mycotoxin producing fungi International Journal of Food Microbiology 2007 119 38 46 Gancberg D Corbisier P Schimmel H Emons H Guidance document on the use of reference materials on genetic testing Luxembourg European Communities 2008 EUR 23256 EN 2008 Trapman S Burns M Broll H Machartur R Wood R Zel J Guidance document on Measurement Uncertainty for GMO Testing Laboratories Luxembourg European Communities 2009 EUR 22756 EN2 2009 COMAR International database for certified reference materials Disponibile all indirizzo www comar bam de ultima consultazione 14 9 10 VIRM Reference Material database Disponibile all indirizzo www virm net ultima consultazione 14 9 10 Del Monte MG Troisi L Zappa G Reference materials for agrofood Roma Rapporto tecnico ENEA n 7 INN 2000 Carconi P Gatti R Zappa G Zoan
267. icamente trattato 2 UHT e 3 pastorizzati non contaminati da AFMI Nessuno dei 20 campioni bianchi risultato positive al test ELISA Tabella 2 L omoschedasticit dei dati ottenuti in 2 diverse sessioni analitiche stata verificata mediante test F Fosservato lt F tabulato 9 gradi di libert p 0 05 Tabella 3 213 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 2 Analisi dei 20 campioni di latte bianchi e fortificati a 0 004 ng g Sessioni B Bo gruppo B Bo gruppo F A di lavoro dei inch bianchi dei ia Campione di latte 89 55 59 06 Latte bovino di massa 92 22 72 13 Latte bovino di massa 96 05 71 02 Latte bovino di massa 94 54 76 77 Latte bovino di massa Piima s ssione 100 23 71 84 Latte bovino di massa 102 06 47 94 Latte bovino di massa 100 21 47 94 Latte bovino di massa 87 23 58 79 Latte bovino di massa 96 52 71 43 Latte UHT iii IDI 73 46 ___ Atte pastorizzato ___ 88 97 80 14 Latte UHT 91 00 83 86 Latte pastorizzato 94 66 83 22 Latte pastorizzato 97 32 52 61 Latte di massa ovino i 98 15 52 54 Latte di massa di capra Seconda sessione 99 18 53 30 Latte di massa di bufalo 99 86 54 95 Latte di massa di bufalo 97 73 56 73 Latte di massa di bufalo 96 43 58 31 Latte di massa di bufalo 98 90 48 01 Latte di massa di bufalo Tabella 3 Risultati del test F per la valutazione dell omoschedasticita tra i dati in due sessioni di lavoro 9 gradi di libert p 0 05 Per entrambi i gruppi Featc lt Ftab
268. icativa tra i livelli di Fumonisine estratte e quelli ottenuti dopo digestione Nel caso dei prodotti alimentari a base di mais si osserva nella maggior parte dei casi uno scarso incremento di Fumonisine dopo applicazione del modello soprattutto per quei campioni la cui lavorazione relativamente semplice come ad esempio la polenta Conclusioni L applicazione del modello di digestione in vitro ha permesso di osservare il comportamento delle Fumonisine durante il processo digestivo stato innanzitutto osservato un buon accordo tra i dati ottenuti dalle digestioni e quelli acquisiti in seguito all applicazione di uno step di idrolisi alcalina questo conferma il fatto che l azione enzimatica in grado di liberare le forme mascherate associate ai componenti dell alimento Dall analisi dei campioni di mais e dei prodotti a base di mais come tendenza generale si notato un incremento dei livelli di Fumonisine libere in seguito alla digestione fatto che dimostra che la quantit di micotossine disponibile per l assorbimento nel piccolo intestino solitamente pi alta rispetto a quanto stimato con le comuni tecniche di analisi Questi risultati pertanto aprono una problematica pi ampia infatti mentre con il metodo di idrolisi chimica si evidenzia la presenza di forme nascoste altrimenti non rivelabili con gli esperimenti effettuati nel presente lavoro si nota chiaramente che gli enzimi coinvolti sono in grado di liberare tale
269. icelli c Anna Adele Fabbri b Corrado Fanelli b a Dipartimento Biotecnologie Agroindustria e Protezione della Salute Agenzia nazionale per le nuove tecnologie l energia e lo sviluppo economico sostenibile ENEA Centro Ricerche Casaccia Roma b Dipartimento di Biologia Vegetale Universit Sapienza Roma c Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari Centro Nazionale delle Ricerche Bari Introduzione Le contaminazioni fungine rappresentano un grave problema per la filiera cerealicola Alcune specie fungine quali Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Fusarium spp e Aspergillus niger possono produrre infatti in idonee condizioni ambientali micotossine metaboliti secondari tossici per l uomo e gli animali 1 2 Molti metodi sono stati utilizzati per misurare la contaminazione da funghi tossigeni e la presenza di tossine nei cereali Recentemente una particolare attenzione stata rivolta a metodi basati sull applicazione di tecniche analitiche non distruttive Obiettivo di questo lavoro la realizzazione di un metodo analitico non distruttivo basato sulla spettroscopia di immagine per la rilevazione della contaminazione da funghi potenzialmente tossigeni A flavus A parasiticus e A niger su cariossidi di mais La spettroscopia di immagine una tecnica analitica non distruttiva pertanto particolarmente indicata per la la caratterizzazione e l analisi di campioni biologici che consente di car
270. icotossine di cui nella Tabella 1 In base alle disposizioni normative sui prodotti destinati all alimentazione animale supportate inoltre dalle molteplici normative comunitarie relative a prodotti destinati all alimentazione umana alimenti come ad es il Reg CE 1881 2006 11 che definisce le concentrazioni massime per alcuni contaminati negli alimenti e nello specifico il limite per l Aflatossina M1 nel latte crudo trattato per riscaldamento e per il latte destinato a prodotti a base di latte pari a 0 05 ug kg oppure il Reg CE 1126 2007 12 modifica del precedente che definisce le concentrazioni massime di alcuni contaminanti negli alimenti e in particolare per le fusariotossine incluso il DON la parte tecnica del PNAA ha previsto l attivit di controllo sulla contaminazione da micotossine nell ambito dei piani di sorveglianza e vigilanza 69 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 1 Valori di riferimento per alcune micotossine secondo le normative europee Micotossina Prodotti destinati Valore di riferimento Fonte all alimentazione degli animali in mg kg ppm di normativa mangime al tasso di umidita del 12 Deossinivalenolo Materie prime 2 per mangimi DON Cereali e prodotti a base di cereali 8 eccetto i sottoprodotti del granoturco Sottoprodotti del granoturco 12 Mangimi complementari 3 e completi 4 5 Racc Ad eccezione di 2006 576 CE mangimi complementari e completi per suini 0 9 mangimi c
271. il caricamento anche in assenza di alterazioni aerobiche riconoscibili Per gli insilati in trincea queste porzioni sono costituite dalle parti superiori prossime alle spallette e per gli insilati in cumuli da tutta la parte superiore del cappello c aumentare la profondit di avanzamento del fronte del trinciato oltre 10 o 20 cm rispettivamente in inverno o quando la temperatura massima giornaliera supera i 15 C d scoprire l insilato sollevando il telo il meno possibile avendo cura di ricoprire il fronte con il telo stesso in caso di piogge intense e destinare agli animali gli insilati ottenuti da trinciature tardive settembre e ai capi meno sensibili quelli ottenuti con trinciature precoci agosto Questo perch il contenuto di 100 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev micotossine accumulato dall alimento in campo e nelle prime fasi dell insilamento maggiore con maturazioni della pianta e formazione del silo avvenute in condizioni di elevate temperature f distribuire propionato 0 03 0 04 nella porzione superiore della trincea soprattutto qualora il prodotto insilato presenti oltre il 35 di s s sostanza secca per ovviare alle difficolt di compattazione Nel caso di accertata presenza di Aflatossine nel campione o di elevata positivit di campioni provenienti da aree con condizioni di coltivazione simili necessario scartare le partite di granella con alterazioni scure visibili che coinvolgano pi
272. il coefficiente di determinazione R e la deviazione percentuale media P 4 40 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Risultati e discussione L evoluzione dell umidit e della ay nei due campi piemontesi hanno avuto andamento pressoch identico In Figura 1 a titolo di esempio mostrato l andamento di uno dei due campi Conseguentemente i dati dei due campi sono stati aggregati e analizzati insieme per lo studio delle isoterme rappresentate in Figura 2 In Figura 2 seguendo la direzione del processo di maturazione freccia nera la ay costante aw 1 000 fino ad un umidit intorno a 36 successivamente inizia a decrescere L effetto della temperatura invece inizia ad essere evidente intorno al 34 di umidit se si confrontano le isoterme a 15 C e 25 C e intorno a 26 se si confrontano le isoterme a 25 C e 40 C in tutte e due i casi appare chiaro che a umidit costante la ay aumenta con la temperatura Questi risultati indicano come atteso che all aumentare della temperatura il mais diventa pi igroscopico 4 Tra i sei modelli confrontati il modello di Chung Pfost risultato essere il migliore 15 C R 0 955 P 1 340 25 C R 0 960 P 0 775 40 C R7 0 963 P 0 457 per descrivere le isoterme alle tre temperature 70 1 000 amp y J lt 60 RAA Sito 1 0 LEFT amp g d A 50 Se jon Sito 1 A 40 D eee a de 3 0 850 o 3 30
273. in entrata e intervento diretto sugli allevatori il cui prodotto non fosse conforme In occasione del 1 Congresso Nazionale sulle micotossine tenutosi a Roma presso l Istituto Superiore di Sanit nel 2004 Newlat present un lavoro dal titolo Aflatossina M nel latte un problema risolvibile in cui si illustrava questo piano di controllo e l ottimo risultato che diede durante l episodio di grave contaminazione verificatosi durante la stagione 2003 2004 Oggi dopo 10 anni di monitoraggio delle micotossine nel latte possibile fare un bilancio dell attivit svolta capire come sia cambiato l approccio degli operatori della filiera nei confronti del problema e in quale misura la contaminazione interessi ancora il prodotto All inizio infatti la questione stata affrontata in maniera piuttosto disomogenea nonostante il rispetto del vincolo di legge ma dopo la crisi del 2003 2004 c stata una notevole evoluzione in fatto di attenzione e sensibilit al problema che ha favorito un grande sviluppo tecnico e gestionale che ha influito positivamente sulla qualit del prodotto finito Leggendo ad esempio i dati raccolti e valutando la percentuale sul totale di campioni con valori superiori a 40 ng kg soglia di attenzione in quanto il limite di legge 50 ng kg si nota che si partiti nel 1999 con una percentuale di circa il 10 fino ad arrivare nel biennio 2007 2008 a valori prossimi all 1 i pi bassi fino ad o
274. incrementata in maniera dose dipendente dall esposizione ad AFB sia a due che a sette giorni d incubazione Simili risultati sono stati ottenuti a seguito d esposizione alla FB particolarmente a 2 giorni d incubazione Anche per la Tossina T 2 stato registrato un incremento significativo di MDA intracellulare Figura 2a sebbene limitatamente alla pi alta concentrazione testata 10 ng mL e soprattutto per tempi lunghi d esposizione 7 giorni p lt 0 01 0 0307 E 2 giorni 0 080 E 2 giorni A seek ek pa pote E 0 035 7 giorni a 0 0704 7 giorni B 0 030 0 060 B B lt 0 025 5 lt 0 050 o 0 020 0 0404 S S N 0 015 A N 0 0304 5 0 0104 5 0 0204 oO amp 0 0054 0 010 A 0 000 r r i 0 000 r 0 2 5 10 0 1 5 T 2 ng mL DON g mL Figura 2 Concentrazione della MDA in linfociti bovini esposti per 2 o 7 giorni a differenti livelli di T 2 e DON a eb indicano p lt 0 05 tra livelli d esposizione per ogni tempo d incubazione mentre A e B p lt 0 01 tra livelli d esposizione per ogni tempo d incubazione p lt 0 05 tra tempi d incubazione entro ogni livello d esposizione p lt 0 01 tra tempi d incubazione entro ogni livello d esposizione Sempre per i saggi a 7 giorni l esposizione dei linfociti al DON per tutte le concentrazioni testate 1 ug mL e 5 ug mL ha fatto registrare incrementi altamente significativi
275. inistero della Salute le Regioni e le Province autonome di Trento e di Bolzano e le Aziende Unit Sanitarie Locali nell ambito delle rispettive competenze 57 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Il Ministero del Lavoro della Salute e delle Politiche Sociali di seguito indicato come Ministero della Salute l autorit centrale delle Stato Avvalendosi del supporto tecnico scientifico dell Istituto Superiore di Sanit ISS e in stretta collaborazione con il Comando Carabinieri per la Tutela della Salute che opera attraverso i Nuclei Antisofisticazione e Sanita NAS sul tutto territorio nazionale soprattutto nell ambito della repressione e della prevenzione il Ministero della Salute svolge compiti di indirizzo e di coordinamento generale in materia di sicurezza alimentare Il Ministero della Salute opera a livello centrale attraverso il Dipartimento per la Sanit Pubblica Veterinaria la Nutrizione e la Sicurezza degli Alimenti DSPVNSA A livello territoriale per il controllo alle frontiere si avvale dei propri Uffici periferici ovvero gli Uffici di Sanit Marittima Aerea e di Frontiera USMAF degli Uffici Veterinari Periferici che comprendono i Posti di Ispezione Frontaliera PIF e gli Uffici Veterinari per gli Adempimenti Comunitari UVAC Al Ministero spettano altres compiti di elaborazione e adozione dei piani pluriennali di controllo e di supervisione e controllo sulle attivit delle Regioni Province autonome e
276. ino Cyclotec PBI con una griglia da 0 5 mm e l analisi stata effettuata sullo sfarinato integrale mediante metodica immunoenzimatica Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ELISA utilizzando il kit Ridascreen DON R Biopharm A tal fine stato utilizzato il preparatore automatico BRIO SEAC e il lettore per micropiastre SIRIO SEAC Il limite di sensibilit del metodo pari a 18 5 ng g con un intervallo di linearit fino a 500 ng g il recupero di tossina nei cereali compreso fra 1 85 e il 110 I risultati rappresentano il valore medio di analisi ripetute n 2 CV lt 10 Per valutare statisticamente il grado di influenza dei diversi fattori variet anno tipo di coltivazione areale sui livelli di contaminazione da DON stato utilizzato un modello lineare generalizzato basato sulla distribuzione di Poisson e funzione di link data dal logaritmo Log DON variet anno areale coltivazione Risultati e discussione Il modello statistico utilizzato Tabella 1 risultato altamente significativo p lt 0 0001 ed ha permesso di valutare il grado di influenza dei quattro fattori variet anno tipo di coltivazione e areale sui livelli di contaminazione da DON nei campioni di frumento duro L areale stato il fattore predominante con una incidenza sulla devianza totale pari al 40 seguito poi dall anno e dal metodo di coltivazione 30 e 20 rispettivamente La scelta varietale risultata la meno influen
277. inoculate con sospensioni conidiche di singole specie fungine dopo 1 2 3 e 7 giorni dall inoculo 185 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev L analisi degli spettri dei campioni di mais inoculato ha permesso di individuare due intervalli di lunghezza d onda 500 700 nm e 850 950 nm 3 nell ambito dei quali possibile monitorare in maniera significativa le variazioni delle propriet di riflettanza del mais contaminato Nel primo intervallo 500 700 nm l assorbanza apparente log 1 R del mais maggiore per tutti i campioni contaminati rispetto a quelli non contaminati e aumenta all aumentare del grado di contaminazione delle cariossidi Figura 3a 3c 3e 3g Nel secondo intervallo 850 950 nm l assorbanza apparente del mais al contrario pi bassa in tutti i campioni contaminati rispetto a quelli non contaminati e diminuisce all aumentare del grado di contaminazione delle cariossidi Figure 3b 3d 3f 3h Le variazioni spettrali riscontrate nell intervallo spettrale saggiato tra i campioni inoculati e il controllo non inoculato sono maggiori in mais contaminato con Aspergillus niger rispetto a quello contaminato con Aspergillus flavus o Aspergillus parasiticus Figura 4 Mais non inoculato Mais inoculato con A flavus 3357 x Mais inoculato con A parasiticus 2999 Mais inoculato con A niger log 1 R 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 lunghezza d onda nm Figura 4
278. internazionali che si occupano di micotossine nell organizzazione di due studi di collaborazione 1 uno studio interlaboratorio per la determinazione in HPLC dell Ocratossina A in campioni di prosciutto crudo risultati in fase di elaborazione ii uno studio per la validazione di un metodo immunoenzimatico per la determinazione del Deossinivalenolo DON in campioni di grano tenero 2008 2009 Per l anno 2010 prevista l organizzazione di due studi collaborativi su le matrici e le micotossine che saranno risultate di interesse nell ambito delle riunioni con la rete del Sistema Sanitario Nazionale L LNR si prefigge inoltre di offrire assistenza scientifica e tecnica all Autorit Competente per l attuazione di piani di controllo coordinati avendo finora partecipato alla stesura del Piano Nazionale anno 2008 di Sorveglianza e di Vigilanza Sanitaria sull Alimentazione degli Animali PNAA 2008 2009 e 2010 Piano Nazionale per la ricerca dei Residui negli animali e nei prodotti di origine animale anno 2008 PNR 2008 Accreditamento Nel Regolamento di riferimento per le attivit dei laboratori nazionali di riferimento si legge che Le autorit competenti possono designare soltanto i laboratori che operano sono valutati e accreditati conformemente alle seguenti norme europee UNI CEI EN ISO IEC 17025 su Criteri generali sulla competenza dei laboratori di prova e di taratura UNI CEI EN 45002 su
279. io armonizzato in conformit alla normativa vigente I metodi di prova per la determinazione delle micotossine devono rispettare i requisiti previsti dal Reg CE 401 2006 2 e Reg CE 1881 2006 3 inoltre devono essere validati determinando le prestazioni analitiche indicate nel Reg CE 882 2004 allegato III 4 La linea guida rappresenta un approccio integrato e prevede anche alcuni alcuni criteri di rendimento opzionali definiti dalla Decisione 2002 657 CE 5 Il Reg CE 401 2006 non indica i limiti di rivelazione dei metodi di prova ma il Reg CE 882 2004 prevede di calcolare limite di rivelazione Limit Of Detection LOD e il limite di quantificazione Limit Of Quantification LOQ del metodo Inoltre il Reg CE 401 2006 prevede in maniera opzionale la possibilit di calcolare il limite di decisione CCa Decisione 2002 657 CE solo per tenere conto dell incertezza di misura per valutare la conformit non conformit del campione Lo scopo della linea guida quello di definire uno schema generale di validazione dei metodi di prova di conferma per l analisi delle micotossine per integrare i requisiti previsti dalle norme e indicare uno schema applicativo semplice nell ambito della rete degli IZS Questo approccio armonizzato favorisce il confronto delle prestazioni dei metodi di prova e la loro trasferibilit tra i laboratori 111 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Prestazioni dei metodi di prova I livelli di validazione per
280. io che risponde all esigenza di disporre di tecniche molecolari per il rilevamento tempestivo della presenza di A carbonarius in bacca d uva I risultati ottenuti mostrano come le tecniche molecolari messe a punto in questo lavoro rappresentino un contributo concreto alla prevenzione dalla contaminazione fungina permettendo di individuare la presenza del fungo direttamente da bacca d uva tal quale senza necessit di isolare precedentemente la microflora identificarla e sottoporre ad estrazione il micelio fungino Alle condizioni testate in questo lavoro la PCR Real Time ha permesso di individuare la presenza di A carbonarius gi a 6 h dopo l inoculo cio quando sono presenti solo 20 conidi per grammo di bacca 2 d uva L elevata sensibilit dei primer testati e della PCR Real Time inoltre dimostrata dalla capacit del sistema di rilevare la presenza del fungo su campioni reali Bibliografia 1 Perrone G Mule G Susca A Battilani P Pietri A Logrieco A Ochratoxin A Production and Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis of Aspergillus carbonarius Aspergillus tubingensis and Aspergillus niger Strains Isolated from Grapes in Italy Applied and Environmental Microbiology 2006 72 680 5 2 Selma MV Martinez Culebras PV Aznar R Real Time PCR based procedures for detection and quantification of Aspergillus carbonarius in wine grapes International Journal of Food Microbiology 2008 122 126 34 196 Rapporti ISTI
281. io mettere a punto una procedura di desalting e clean up che consentisse di allontanare i sali e gli enzimi al fine di rendere i campioni idonei all analisi LC ESI MS MS Il sistema proposto prevede l impiego di cartucce Sep Pak dotate di 19 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev fase stazionaria apolare Sono state pertanto effettuate delle prove preliminari di recupero sottoponendo a clean up una soluzione a concentrazione nota di FB pari a 500 ng g Dopo avere eluito il campione tutte le frazioni di lavaggio della cartuccia acqua acqua acetonitrile e acetonitrile sono state recuperate e analizzate in LC ESI MS MS per individuare in quali di queste la tossina venisse eluita e valutarne quindi il recupero attraverso il confronto diretto con una soluzione della medesima concentrazione ma analizzata senza che questa venisse sottoposta al passaggio su Sep Pak controllo In seguito all analisi si potuto notare che gli analiti eluiscono in un unica frazione di lavaggio rappresentata da acqua acetonitrile 1 1 con un recupero pari al 100 come mostrato in Figura 2 dove sono state messe a confronto le aree relative allo ione quantitativo m z 334 4 di FB rispettivamente della soluzione standard analizzate tal quale e della soluzione di uguale concentrazione sottoposta a clean up 100 18 95 987 Controllo xL WERE SEE Os E e LR eee REE ES A a e Ea e ot 5 00 10 00 15 00 20 00 25 00 30 00 35 100 18 97 1071 Soluzione standard p
282. ione Con LM indicato il limite massimo consentito attualmente in vigore per le Fumonisine 5 pari a 1000 ug kg nei prodotti alimentari a base di mais destinato al consumo umano diretto e 800 ug kg nei cereali da colazione e nelle merende 226 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 3000 2500 N LM 1000 pg kg l ola oll in salilana TA Bo Farina di mais Polenta Mais FB FB ug kg a Figura 2 Contenuto di Fumonisine valutato negli anni 2007 e 2008 in 8 campioni di farina di mais in 21 campioni di polenta e in 7 campioni di mais 1000 LM 800 pg kg 800 ee ee ee ee 600 400 FB FB g kg 200 Lo altal Cornflakes Snack Prodotti per celiaci Figure 3 Contenuto di Fumonisine valutato negli anni 2007 e 2008 in 35 campioni di cornflakes in 16 snack e in 13 prodotti per celiaci I risultati dell indagine sulla presenza delle Fumonisine sono riassunti nella Tabella 4 dove mostrata sia la percentuale di campioni contaminati ad una concentrazione superiore al limite di rivelazione del metodo pari a 12 ug kg per FB e 15 pg kg per FB2 sia la percentuale di campioni non conformi Dall indagine eseguita emersa la presenza delle Fumonisine in misura variabile in tutte le matrici analizzate Le FB e FB sono state riscontrate in concentrazioni superiori al limite di rivelazione in tutti i campioni di polenta e di farina d
283. ione di snack salse e condimenti viene normalmente commercializzata come tale o in farina documentato il rischio di contaminazione degli anacardi con funghi del genere Aspergillus durante la coltivazione e le fasi di post raccolta a causa delle condizioni climatiche caldo umide dei Paesi di origine abbinate a pratiche colturali e tecniche di stoccaggio inadeguate 1 e la conseguente presenza di Aflatossine nelle noci e nei prodotti derivati reperibili in commercio 2 L Aflatossina B AFB l Aflatossina dotata di maggior tossicit inserita dalla International Agency for Research on Cancer IARC nel Gruppo 1 sostanze sicuramente cancerogene per l uomo L elevata tossicit della AFB ha portato a non definire livelli di assunzione tollerabili ma a consigliare come indicato dal Joint Expert Committee on Food Additives JECFA che l esposizione debba essere la pi bassa possibile principio dell ALARA As Low as Reasonably Achievable La legislazione europea con il Reg CE 1881 2006 3 ha stabilito per la frutta secca e a guscio e i relativi prodotti di trasformazione destinati al consumo umano diretto o all impiego quali ingredienti di prodotti alimentari un Tenore Massimo di 2 ug kg per AFB e 4 ug kg per la somma delle Aflatossine B B2 G e G2 mentre per i prodotti alimentari trasformati e composti rimanda alla determinazione di un Limite Massimo Tollerabile calcolato sulla base di specifici fattori di co
284. ioni di frumento naturalmente contaminato da ceppi di Fusarium produttori di Tricoteceni sui quali un primo screening ha permesso di rivelare una discreta contaminazione da DON La produzione del malto stata eseguita cercando di simulare su piccola scala le tre fasi principali che compongono il processo che porta all ottenimento del malto base immersione delle cariossidi in acqua successiva germinazione su una superficie asciutta e asciugatura finale in forno essiccatore a ventilazione forzata come precedentemente descritto La successiva analisi dei campioni ha permesso per quanto concerne il DON di confermare la tendenza emersa 30 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev precedentemente nei campioni maltati sono stati riscontrati livelli di DON sensibilmente inferiori a quelli trovati nei corrispettivi non maltati come mostrato in Figura 4 300 N a Q N a a 2 Concentrazione media di DON ng g a E E E C 813 C 831 C 793 Conon maltati BI maltati Figura 4 Variazione dei livelli di DON in seguito a maltazione di campioni naturalmente contaminati Nei campioni maltati stato inoltre possibile osservare un incremento delle forme acetilate del DON 3 Acetil DON e 15 Acetil DON come riportato in Figura 5 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 C 813 C 831 C 793 di Acetil DON ng g
285. ioni sottoposti ad analisi e risultati conformi Nell anno 2008 le notifiche RASFF che hanno riguardato le micotossine sono state 933 Tabella 2 la maggior parte delle quali si riferiscono a respingimenti ai confini 85 9 La maggior parte delle notifiche per micotossine si riferiscono alle Aflatossine AF 902 notifiche seguita dall OTA 20 notifiche Deossinivalenolo DON 4 notifiche Patulina PAT 3 notifiche e Fumonisine e Zearalenone ZEA con due segnalazioni ciascuno In Tabella 3 sono riportati i dati riferiti al primo semestre dell anno 2009 per un confronto Tabella 2 Notifiche di allerta attraverso il sistema RASFF per l anno 2008 sui diversi tipi di micotossine riscontrate in alimenti e mangimi Tipo Notifiche Campioni irregolari per micotossina di notifica RASFF di allerta micotossine AF OTA DON Fumonisine PAT ZEA Respingimenti ai confini 802 792 8 0 0 0 2 Allerta 52 40 5 4 1 2 0 Informazioni 79 70 7 0 1 1 0 Totale 933 902 20 4 2 3 2 Tabella 3 Numero di notifiche di allerta attraverso il RASFF per il primo semestre dell anno 2009 sui diversi tipi di micotossine riscontrate in alimenti e mangimi Tipo NotificheRASFF Campioni irregolari per micotossina di notifica di allerta micotossine AF OTA DON Respingimenti ai confini 309 303 6 0 Allerta 32 29 1 2 Informationi 23 23 0 0 Totale 364 355 7 2 respingimenti corrispondono ad una percentuale del 84 9 di tutte le notifiche
286. iquota di 25 g di campione macinato stata estratta con 100 mL di una soluzione di acetonitrile H 0 84 16 e omogeneizzata per 3 minuti L omogeneizzato stato centrifugato per 10 minuti a 6000 rpm 4 mL di supernatante sono portati a secco sotto atmosfera d azoto Il campione di cereali da colazione stato risolubilizzato in 2 mL di tampone Tris mentre il campione di alimenti destinati all infanzia in 0 4 mL di tampone Tris Il recupero medio risultato da questa procedura di estrazione del 95 per i cereali da colazione e del 105 per gli alimenti destinati all infanzia Cereali da colazione campioni sperimentalmente contaminati Si proceduto con l analisi di campioni di cereali da colazione sperimentalmente contaminati con concentrazioni di DON pari a 100 300 500 700 e 1000 ng g I risultati ottenuti sono riportati in Tabella 2 I valori riportati deviazione standard relativa RSD e recupero medio sono la media di 9 determinazioni per ogni livello di concentrazione Tabella 2 Analisi ELIME di campioni di cereali da colazione sperimentalmente contaminati con concentrazioni note di DON confrontata con quella degli standard DON aggiunto ng g DON trovato ng g RSD Recupero 100 n d 300 268 20 89 500 410 12 82 750 716 15 95 1000 1098 9 110 156 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Cereali da colazione campioni naturalmente contaminati Campioni di cereali da colazione naturalmente contaminati dalla to
287. is AFB 2 92 7 50 5 06 0 7 FAPAS T041025 AFB2 1 27 3 26 2 38 0 4 AFG 1 30 3 35 2 14 0 9 AFG2 0 55 1 41 0 88 2 3 AF totali 6 0 15 4 10 05 0 7 Frutta secca AFB 2 51 6 47 4 89 46 FAPAS T04116 AFB2 0 81 2 09 1 79 2 9 AFG 1 32 3 39 2 42 3 1 AFG2 0 46 1 18 0 89 3 2 AF totali 5 09 13 09 9 99 3 8 221 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Conclusioni Le colonne AFLAOCHRA PREP consentono l isolamento e la determinazione quantitativa delle AF totali e dell OTA utilizzando un unico metodo di preparazione del campione e una singola impostazione delle condizioni per HPLC Questo porta ad avere un maggiore volume di campione oltre ad una riduzione dei materiali di consumo dei reagenti e dei relativi costi Le prestazioni delle colonne AFLAOCHRA PREP per quanto riguarda la percentuale di recupero e la ripetibilit sono in linea con le normative europee AFLAOCHRA PREP forniscono un metodo rapido e robusto adatto per una vasta gamma di materie prime cereali frutta secca e spezie e consentono una quantificazione accurata e a bassi livelli lt 2 ug kg delle 5 tossine 222 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev FUMONISINE B E B2 IN PRODOTTI ALIMENTARI A BASE DI MAIS OTTIMIZZAZIONE E VALIDAZIONE DEL METODO ANALITICO MEDIANTE HPLC FLD CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST COLONNA E MONITORAGGIO SU CAMPIONI REALI Sonia Lo Magro a Donatella Nardiello a Maria Campaniello a Marco Iammarino a Carmen Palermo b Marilena Muscarella a
288. isposta conclusiva sull effetto del metodo di coltivazione nel determinare il grado di contaminazione da DON 10 15 Lo scopo del presente lavoro stato quello di confrontare nel biennio 2007 2008 il comportamento di variet di frumento duro coltivate sia con metodo convenzionale che biologico in ambienti uguali o paragonabili dal punto di vista pedo climatico al fine di valutare quanto i diversi fattori presi in esame variet anno metodo di coltivazione e areale potessero incidere sul livello di contaminazione da DON 117 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Materiali e metodi I campioni sono stati reperiti nell ambito delle Reti Nazionali di confronto varietale in convenzionale 16 e in biologico 17 in otto localita rappresentative di alcune aree nelle quali maggiormente diffusa la coltura del frumento duro quattro al Centro Jesi AN Pollenza MC Papiano PG Alberese GR e quattro al Sud Campobasso Foggia S Stefano Quisquina AG e Catania Sono state prese in esame sei varieta con caratteristiche diverse in relazione al ciclo biologico P precoci M medie e T tardive Ciccio P Simeto P Duilio P Iride MP Claudio M e Creso T La valutazione dei livelli di contaminazione da DON stata effettuata nell ambito del progetto interregionale MICOCER per quanto attiene al metodo convenzionale e del progetto BIOCER del MiPAAF per quanto riguarda il metodo biologico I campioni di granella sono stati macinati con mul
289. istrati ad animali destinati alla produzione alimentare Bibliografia 1 Ministero del Lavoro della Salute e delle Politiche Sociali PNAA 2009 2010 2011 Piano Nazionale di sorveglianza e di vigilanza sanitaria sull Alimentazione degli Animali Roma Ministero del Lavoro della Salute e delle Politiche Sociali 2009 Disponibile all indirizzo http www salute gov it imgs C_17 pubblicazioni 942 _allegato pdf ultima consultazione 31 8 2010 2 Unione Europea Regolamento CE n 882 2204 del Parlamento europeo e del Consiglio del 29 aprile 2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformit alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali GUCE L 191 28 maggio 2004 3 Opinion of the Scientific Panel on contaminants in the food chain on a request from the Commission related to Deoxynivalenol as undesirable substance in animal feed adopted on 2 June 2004 The EFSA Journal 2004 73 1 42 4 Opinion of the Scientific Panel on contaminants in the food chain on a request from the Commission related to Zearalenone as undesirable substance in animal feed adopted on 28 July 2004 The EFSA Journal 2004 89 1 35 74 Nn ON N o0 O 10 1 jii 12 13 14 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Opinion of the Scientific Panel on contaminants in the food chain on a request from the Commission related to Ochratoxin A as undesirable substance in a
290. it Marittima Aerea e di Frontiera USMAF Bologna Unit territoriale di Ravenna Ravenna Introduzione Ravenna uno dei tredici punti di ingresso presenti in Italia per l importazione sul territorio nazionale e comunitario di alimenti e mangimi provenienti da paesi extra europei 1 L Ufficio di Sanit Marittima Aerea e di Frontiera USMAF di Bologna Unit territoriale di Ravenna quale articolazione periferica del Ministero del Lavoro della Salute e delle Politiche Sociali esercita funzioni in ambito portuale e aeroportuale di vigilanza e controllo su passeggeri e merci in arrivo dai paesi extra europei I laboratori di ARPA Agenzia regionale per la prevenzione e l ambiente Emilia Romagna operano a livello regionale per l esecuzione degli accertamenti analitici finalizzati al controllo ufficiale di alimenti e bevande verificandone la conformit alla normativa comunitaria I principali prodotti alimentari che transitano attraverso il porto di Ravenna sono cereali frutta a guscio arachidi pistacchi nocciole ecc frutta secca fichi secchi uva sultanina albicocche ecc spezie vegetali freschi frutta e verdura legumi oli e grassi vegetali prodotti trasformati frutta e verdura conservate succhi e puree di frutta sfarinati ecc Su queste derrate i parametri chimici pi frequentemente ricercati sono micotossine residui di fitofarmaci metalli pesanti additivi organismi geneticamente modificati e carat
291. it consenta di ottenere una elevata sensibilit LOD intorno a 1 ug kg anche utilizzando spettrometri di massa non di ultima generazione Non trascurabili sono inoltre i vantaggi derivanti dall iniezione di campioni molto puliti in termini di tempo di vita della colonna cromatografica e pulizia dell interfaccia dello spettrometro di massa che si traducono in una maggiore robustezza dell intera procedura analitica 249 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Conclusioni La metodica analitica proposta stata applicata con successo per la determinazione simultanea di Aflatossine Ocratossina A e Fusarium tossine in mais frumento e orzo L approccio sperimentale sviluppato basato su una doppia estrazione con tampone fosfato e metanolo acqua 70 30 e purificazione degli estratti mediante colonnine a immunoaffinit multi anticorpo consente la co estrazione di tutte le 11 micotossine considerate con recuperi accettabili Le caratteristiche del metodo in termini di recuperi e ripetibilit sono conformi ai criteri stabiliti dal Reg CE 401 2006 12 Il metodo risulta inoltre sufficientemente sensibile per essere applicato all analisi di cereali naturalmente contaminati e verificare in una singola analisi la conformit con i limiti massimi ammissibili stabiliti dalla legislazione vigente 2 3 per Aflatossine Ocratossina A Deossinivalenolo Zearalenone e Fumonisine Bibliografia 1 RASFF The Rapid Alert System for Food and Feed RASFF A
292. ita organizzata dal Laboratorio Comunitario CRL Mycotoxin JRC Geel per la validazione di metodi per le micotossine Dietro il coordinamento del CRL Mycotoxins il Laboratorio ha partecipato a Proficiency Tests organizzati per i soli LNR europei quali quello organizzato per l analisi del Deossinivalenolo nei cereali l Ocratossina A nei mangimi la T 2 e HT2 nella farina di cereali l Ocratossina A nelle spezie le Aflatossine nel burro di arachidi Sito web Oggi qualsiasi attivit di coordinamento che sia indirizzata sul territorio deve essere supportata con una interfaccia informatica aggiornata sia per dare visibilit che per assicurare una adeguata divulgazione delle attivit e delle informazioni in generale L LNR Micotossine ha recentemente lanciato il suo sito www iss it mico che attivo presso il sito web dell Istituto Superiore di Sanit con un link specifico A causa della sua nuova istituzione esso in continua evoluzione per il suo miglioramento grazie al lavoro costante di aggiornamento e ottimizzazione realizzato dal personale del Reparto Le sezioni attive sono Chi siamo Attivit di controllo Metodi di analisi Pubblicazioni Documenti Eventi Normativa Eventi IUPAC Mycotoxin Newsletter http www iss it myconews E prevista anche una sezione dedicata ai laboratori pubblici del sistema Nazionale con entrata riservata e controllata La presenza di questo strument
293. ivelazione Limit Of Detection LOD e di quantificazione Limit Of Quantification LOQ sono stati rispettivamente di 0 5 e 1 ng L Per quanto riguarda i risultati dell indagine Figura 1 solo in 3 campioni non stata riscontrata OTA positivit 99 1 il 62 ha mostrato una concentrazione inferiore a 200 ng L e solo nel 5 3 dei campioni n 18 stata rilevata una concentrazione superiore a 500 ng L valore massimo 2918 ng L Il valore medio stato pari a 228 234 ng L I dati relativi agli uomini sono risultati statisticamente superiori p lt 0 01 rispetto a quelli delle donne con un valore medio rispettivamente di 271 303 ng L contro 193 147 ng L Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 60 48 97 50 campioni lt 0 1 1 100 101 200 201 300 301 400 401 500 gt 500 OTA ng L Figura 1 Ripartizione percentuale dei campioni in funzione del livello di OTA nel siero Relazione tra comportamento alimentare e OTA Per evidenziare una correlazione tra il livello ematico di OTA e la dieta stato utilizzato un modello multivariato di base nel quale eta e sesso fossero inseriti come fattori confondenti Le analisi sono state condotte prima sulla totalita dei campioni poi separatamente su quelli delle donne e degli uomini correggendo i parametri antropometrici per l et e le calorie totali Considerando il comportamento alimentare in base ai questionari compilati stata riscontrata una correl
294. iversi probabili limiti di legge pi alto per i cereali da colazione destinati al consumo degli adulti e pi basso per gli alimenti destinati all infanzia con un limite di legge indicato come pi probabile pari a 200 ng g e 25 ng g rispettivamente Materiali e metodi Per la messa a punto del sistema di analisi sono stati utilizzati campioni bianchi di cereali da colazione e alimenti per l infanzia privi di contaminanti I campioni sono stati sottoposti ad estrazione eventuale purificazione dell estratto e portati a secco sotto flusso di azoto L estratto essiccato riportato in soluzione con tampone PBS Phosphate Buffered Saline e diluito in PBS di un fattore che funzione del tipo di matrice in esame L estratto ricostituito e diluito viene fortificato in modo da avere soluzioni standard di tossina compresi nell intervallo di lavoro del sistema e la curva di taratura cos ottenuta confrontata con curve di taratura ottenute dagli stessi standard di tossina preparati per in tampone PBS Per la verifica del suo funzionamento stato impiegato lo stesso tipo di matrici naturalmente contaminate Reagenti Tutti i reagenti impiegati sono di grado analitico noto L acqua si intende distillata ove non specificato Tampone PBS Dulbecco A Tampone Dietanolammina DEA sciogliere 0 0476g di MgCl anidro e 5 59g di KCl in 300 mL di acqua dopo la dissoluzione aggiungere poco per volta 51 mL di DEA 99 5 Aggiusta
295. ka R Baumagartner S Josephs R The state of the art in analysis of type A trichothecene mycotoxins in cereals Fresenius Jourmal of Analytical Chemistry 2001 371 285 99 Nn an N Micheli L Radoi A Guarrina R Massaud R Moscone D Palleschi G disposable immunosensor for determination of domoic acid in shellfish Biosensors and Bioelectronics 2004 20 190 6 164 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev LABORATORIO NAZIONALE DI RIFERIMENTO PER LE MICOTOSSINE UN ANNO DI ATTIVITA 2008 2009 Carlo Brera Barbara De Santis Emanuela Gregori Clara Berdini Francesca Debegnach Elena Pannunzi Marina Miraglia Dipartimento di Sanit Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Istituto Superiore di Sanit Roma Introduzione Con lo scopo di assicurare un approccio armonizzato in materia di controlli ufficiali il Reg CE 882 2004 1 stabilisce fra le altre attivit che vengano nominati i Laboratori Comunitari di Riferimento Community Reference Laboratory CRL per i mangimi e gli alimenti che questi agiscano in maniera integrata con la rete dei Laboratori Nazionali di Riferimento LNR e che congiuntamente operino secondo procedure approvate internazionalmente con metodi di analisi validati I laboratori di riferimento comunitari e nazionali sono designati rispettivamente dalla Commissione Europea in base al Reg CE 776 2006 2 e dalle Autorit governative preposte di ciascuno Stato Membro in funzione della consolidata esperienza per
296. kg L aumento delle non conformit stato riscontrato in coincidenza con l applicazione a partire dall inizio del 2003 delle modalit di campionamento stabilite dalla Direttiva 98 53 CE recepita in Italia dal DM 23 12 2000 e successivamente abrogata dal Reg CE 401 2006 2 Al contrario fino al 2002 per ogni partita di merce veniva prelevato un unico campione di 2 3 kg Queste tendenze indicano che le procedure definite dalla normativa comunitaria permettono di individuare un maggior numero di partite non conformi nonostante nel corso degli anni gli importatori abbiano messo in atto misure finalizzate a migliorare la qualit del prodotto attraverso una pi attenta selezione dei fornitori un migliore controllo in loco del processo produttivo e la presentazione di un certificato di analisi al momento dell importazione L unico paese da cui provengono le nocciole la Turchia Il numero di campioni Figura 1b ha registrato un aumento si passa da una decina di campioni nel 2002 fino a circa 50 campioni nel 2005 e 2006 per poi scendere a 25 campioni nel 2008 La percentuale di non conformit al massimo 10 anno 2008 e come osservato per i campioni di arachidi aumentata negli ultimi anni In Figura lc sono riportati i dati relativi ai pistacchi Iran e Turchia sono i paesi da cui principalmente provengono questi prodotti Nel 2009 sono stati analizzati per la prima volta prodotti provenienti dagli USA Nel 2004 stato o
297. kit lettura colorimetro e ditta metanolo La precisione stata eseguita su tre livelli di fortificazione 50 pg kg 100 ug kg 200 ug kg e i risultati sono presentati in Tabella 3 191 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 2 Piano sperimentale per gli studi di robustezza procedura di Youden per le singole variabili Variabile scelta Livello nominale Livello 1 Livello 2 Apertura kit Aperto chiuso Aperto A Chiuso a Preparazione campioni Fresco giorno prima Fresco B Giorno prima b Filtrazione campioni Tipo di filtro Su whatman C Su carta bibula c Temperatura kit Portato a T ambiente da 1 Portato a T ambiente da h D 45 min d Tempo di agitazione 3 min E 6 min e manuale Lettura colorimetro Immediata F Dopo 30 min dallo stop f Ditta metanolo Erba Baker Carlo Erba G Baker g Tabella 3 Livelli di fortificazione e valori medi di recupero e scarto tipo Livelli di fortificazione Valore medio Scarto tipo Recupero 50 ug kg 45 63 ug kg 2 30 91 0 100 pg kg 84 22 g kg 3 49 84 2 200 ug kg g 169 83 ug kg 8 69 84 0 Discussione Il metodo di prova nell intestazione risultato idoneo allo scopo della ricerca di ZEA in campioni di cereali per alimentazione umana L applicabilit del metodo stata verificata effettuando prove su campioni prelevati in maniera ufficiale dagli organi competenti Il metodo viene tenuto sotto controllo sia mediante la costruzione di opportune carte d
298. l applicazione dei limiti di legge ha portato allo sviluppo di diversi metodi analitici per la determinazione delle Aflatossine negli alimenti Tra questi i saggi ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay risultano dei metodi di screening veloci accurati ed economici che permettono l analisi di un elevato numero di campioni in un unica seduta analitica Il presente lavoro descrive le prestazioni del kit Celer AFLA B un immunosaggio competitivo diretto per la determinazione quantitativa dell AFB Il kit permette la determinazione dell Aflatossina in campioni di cereali frutta a guscio e frutta secca nonch in matrici complesse come germe di mais e mangimi Si tratta di un saggio di facile e rapido utilizzo con un intervallo di dosaggio in linea con le direttive europee in merito ai tenori massimi di AFB permessi nel cibo destinato all alimentazione umana 10 cos come nei mangimi 11 Materiali e metodi Saggio ELISA per la determinazione dell Aflatossina B Il kit Celer AFLA B un ELISA competitivo diretto per la determinazione dell Aflatossina B Il saggio viene effettuato su micropiastra di polistirene precedentemente adsorbita con anticorpi anti Aflatossina B Durante una prima incubazione avviene una competizione fra le molecole di Aflatossina libere contenute nelle soluzioni standard o nei campioni e l Aflatossina legata all enzima per i siti di legame dell anticorpo anti Aflatossina adsorbito ai
299. l di sotto della quale era posizionato un beacker di raccolta Il passaggio nella colonna stato impostato a una velocit di circa 1 2 gocce al secondo fino a quando nella colonna iniziata a entrare aria A questo punto la colonna stata lavata con 5 mL di acqua bidistillata alla stessa velocit del campione La colonna stata successivamente lavata con 1 mL di metanolo per HPLC High Performance Liquid Chromatography sempre alla stessa velocit e l eluato circa 1 mL stato raccolto in cuvetta di vetro stato poi aggiunto 1 mL di Aflatest Developer e agitato il tutto su vortex Circa 30 pL del campione cos ottenuto sono stati iniettati in HPLC L analisi in HPLC LC 10AC Shimatzu stata effettuata in isocratica con le seguenti condizioni colonna Supelcosil C18 termostata a 35 C fase mobile acetonitrile acqua 15 85 v v flusso di 1 mL min volume di iniezione 10 uL detector fluorimetro Aeccitazione a 365 nm ed Acmissione a 440 nm La soluzione standard di taratura stata ottenuta diluendo la soluzione stock nella stessa miscela di acetonitrile acqua con concentrazioni crescenti da 0 5 a 25 mg kg Analisi campioni di latte I campioni di latte sono stati prelevati individualmente su un campione rappresentativo della mandria in ogni azienda a entrambe le mungiture giornaliere 5 am e 5 pm Il campione finale stato ottenuto miscelando il campione raccolto a ogni mungitura tenendo conto
300. la soluzione s e trasferire in un set di matracci tarati da 2 mL i volumi riportati in Tabella 1 Soluzioni in PBS di anticorpo monoclonale HT 2 C 12 B8 Soluzioni in PBS di anticorpo secondario coniugato con Fosfatasi Alcalina diluizione 1 100 Tabella 1 Aliquote da prelevare e soluzioni da utilizzare per la preparazione dellesoluzioni standard di taratura per la Tossina HT 2 Soluzione standard Concentrazione Soluzione Volume prelevato di taratura di tossina ng mL utilizzata uL n 1 100 Soluzione standard di lavoro 20 n 2 20 Soluzione standard 400 di taratura n 1 n 3 8 Il 160 n 4 6 Il 120 n 5 4 Il 80 n 6 2 Il 40 0 0 PBS 0 Apparecchiature La strumentazione utilizzata di seguito elencata Bilancia analitica Bilancia tecnica Omogenizzatore ad alta velocit Centrifuga da banco Colonnina di purificazione Mycosep 227 Trich Colonnina purificazione Bond Elut Tubi da saggio in vetro da 4 mL Sistema di portata a secco in flusso di azoto Concentratore di microparticelle magnetiche Cronometro Computer portatile Potenziostato portatile Messa a punto del metodo stata studiata la messa a punto di un metodo rapido per l esecuzione di analisi di screening su campioni di cereali destinati al consumo umano nell infanzia e nell et adulta eseguibili anche da personale non specializzato Requisito fondamentale di una metodica di screening oltre alla rapidit del metodo quello di e
301. le operazioni di monitoraggio della razione vanno indirizzate soprattutto e almeno inizialmente verso il trinciato integrale di mais e il pastone e verso la granella di mais e i suoi derivati integrali Per quanto riguarda il monitoraggio va innanzitutto tenuto presente che i risultati delle analisi sono validi solo se si effettua un campionamento corretto e rappresentativo dell alimento inoltre se durante il periodo di tempo che intercorre tra il prelievo e l analisi l umidit del prodotto non stabilizzata i campioni vanno tenuti surgelati i risultati di una sola analisi devono essere confrontati con quelli ottenuti in condizioni simili nella zona al fine di ridurre gli errori di interpretazione o le conseguenze di un prelievo errato o sebbene siano rari gli errori in fase di analisi falsi positivi o negativi nell insilato a maturazione cerosa le alterazioni dovute alla presenza di muffe tossigene produttrici di Aflatossine non si vedono pertanto non bisogna fidarsi delle apparenze Nel caso sia stata accertata la presenza di Aflatossine negli alimenti aziendali o sia stato riscontrato un elevato numero di casi positivi nei trinciati o nei pastoni della zona di monitoraggio necessario a eliminare tutte le parti dell alimento che presentano deterioramento aerobico perch proprio l pi probabile la presenza di elevate concentrazioni di Aflatossine b scartare le porzioni di alimento meno compattate durante
302. legge rientrano nell intervallo 5 20 ug kg 11 100 R 0 997 75 50 B Bo 25 0 1 1 10 100 Aflatossina B4 ug kg Figura 1 Curva di taratura media su 38 sedute analitiche del saggio Celer AFLA B Limite di rivelazione e specificit del saggio Il limite di rivelazione Limit Of Detection LOD del kit Celer AFLA B stato determinato per le matrici mais fichi secchi uvetta nocciole pistacchi secondo il criterio descritto per i test quantitativi per l Aflatossina nella USDA GIPSA Program Notice FGIS PN 04 15 12 Venti campioni negativi per ciascuna matrice sono stati analizzati nel saggio e dal valore medio dei B Bo meno 2 deviazioni standard stato ottenuto un valore di LOD di 1 ug kg per tutte le matrici considerate Secondo la medesima normativa USDA GIPSA il LOD deve essere inferiore o uguale a 3 ug kg La specificit del saggio ottenuta per le stesse matrici riportata nella Tabella 2 La probabilit di rilevare dei falsi positivi con il kit Celer AFLA B pari a zero per la frutta secca e la frutta a guscio e del 5 5 per i campioni di mais Tabella 2 Specificit del saggio Celer AFLA B provata su 20 campioni negativi Matrice Specificit Mais 94 5 Fichi secchi 100 0 Uvetta 100 0 Nocciole 100 0 Pistacchi 100 0 Sensibilit del saggio La sensibilit del kit Celer AFLA B4 intesa come limite di quantificazione Limit Of Quantification LOQ stata determinata verificando qu
303. lievo Tesi Contenuto in ferro 0 mg kg di peso secco fogliare RDS Primo A 460 30 0 9 1 9 B 639 80 2 0 4 5 Secondo A 492 75 1 0 2 4 B 704 23 0 5 1 0 Isolamento e identificazione molecolare di Aspergillus carbonarius La diversa tipologia dei terreni MEA e MEAB scelti per l isolamento ha confermato la selettivit del terreno MEAB per A carbonarius infatti solo da due campioni di acini 1 2 stato possibile isolare il micete su questo terreno la cui positivit stata successivamente confermata dalla PCR specie specifica sul DNA estratto dal corrispettivo micelio Sono considerate positive quelle colture in cui si registrato lo sviluppo di conidi di A carbonarius i cui ceppi sono caratterizzati da testa conidiofora nera biseriata con conidi grandi globosi e rugosi difficilmente distinguibili dalle specie di A niger caratterizzata da testa conidiofora nera marrone con conidi molto pi piccoli rispetto ad A carbonarius e di forma variabile L isolamento su terreno MEA di miceti provenienti dagli altri campioni evidenzia come sia sicuramente presente una flora funginea contaminante ma non appartenente alla specie A carbonarius come dimostra la negativit della PCR specie specifica L analisi molecolare stata eseguita sia su DNA estratto dai miceli cresciuti in piastre che su quello estratto da bacche d uva Su 6 campioni di acini 4 sono risultati positivi alla PCR anche se su due campioni 3 4
304. luzione cromogena in ogni pozzetto incubare 20 minuti a temperatura ambiente lontano da luce diretta aggiungere 50 uL pozzetto di soluzione di arresto leggere con un lettore da micropiastre equipaggiato di filtro a 450 nm Configurazione saggio ELISA nuovo Di seguito sono elencate schematicamente le fasi operative implementare 150 uL dello standard zero nei pozzetti del TB implementare 150 uL di soluzioni standard di taratura e di campioni nei pozzetti preposti incubare 30 minuti a temperatura ambiente aggiungere 50 uL di OTA coniugato enzimatico in ogni pozzetto incubare 15 minuti a temperatura ambiente 20 25 C eliminare il liquido dai pozzetti svuotandoli per inversione della piastra lavare per 5 volte con la soluzione di lavaggio aggiungere 200 uL di soluzione cromogena in ogni pozzetto incubare 30 minuti a temperatura ambiente lontano da luce diretta aggiungere 50 uL pozzetto di soluzione di arresto leggere con un lettore da micropiastre equipaggiato di filtro a 450 nm Trattamento del campione La preparazione del campione differisce in base al contenuto di cacao Cioccolato con contenuto in cacao lt 35 estrarre 5 g di campione con 25 mL del tampone di estrazione 3 0 1 NaHCO Polietilenglicole 0 3 PEG pH 7 7 7 8 agitare in shaker per 30 minuti filtrare o centrifugare per 10 minuti a 10000 x g diluire 1 2 in PBS KCI 0 2 g L KH POy 0 2 g L Na HPO4 1 16 g L NaCl 8 g L a pH 7 4
305. m carcinogenesis and cytotoxicity assays American Journal of Epidemiology 1993 31 6 407 14 Norred WP Wang E Yoo H Riley RT Merril AH Jn vitro toxicology of fumonisins and the mechanistic implications Mycopathologia 1992 117 73 8 Riley RT Showker JL Owens DL Ross PF Disruption of sphingolipid metabolism and induction of equine leukoencephalomalacia by Fusarium proliferatum culture material containing fumonisin B2 or B3 Environmental Toxicology and Pharmacology 1997 3 221 8 Shier WT Abbas HK Mirocha CJ Toxicity of the mycotoxins fumonisins B1 and B2 and Alternaria alternata f Sp lycopersici toxin AL in cultured mammalian cells Mycopathologia 1991 116 97 104 Wang E Norred WP Bacon CW Riley RT Merrill AH Inhibition of sphingolipid biosynthesis by Fumonisins Journal of Biological Chemistry 1991 226 14486 90 Murphy PA Rice JLG Ross FP Fumonisin B1 B2 and B3 Content of Iowa Wisconsin and Illinois Corn and Corn Screenings Journal of Agricultural and Food Chemistry 1993 41 263 6 Henry MH Wyatt RD The toxicity of Fumonisin B1 B2 and B3 individually and in combination in chicken embryos Poultry Science 2001 80 401 7 Hughes TR Mao M Jones AR et al Expression profiling using microarrays fabricated by an ink jet oligonucleotide synthesizer Nature biotechnology 2001 19 342 7 Charbonnier Y Gettler B Fran ois P Bento M Renzoni A Vaudaux P Schlegel W Schrenzel J A generic approach for the design of
306. mL Deossinivalenolo isotopico al 98 25 ug mL tutte in acetonitrile sono state fornite da Biopure Tulln Austria Lo standard di ZEA 10 mg stato fornito da Sigma Stoccarda Germania Lo standard di Zearalenone glucoside 131 ug stato sintetizzato nel nostro laboratorio 10 Il metanolo utilizzato per le analisi HPLC High Perfomance Liquid Chromatography stato ottenuto da Carlo Erba Milano Italia mentre l acetonitrile sempre ad uso HPLC stato fornito da J T Baker Mallinckrodt Backer Phillipsburg NJ USA L acqua bidistillata stata prodotta in laboratorio utilizzando un sistema Alpha Q System Millipore Marlborough MA USA La matrice certificata FAPAS impiegata per i Tricoteceni una farina di frumento contaminata con 1062 110 ug kg di DON la matrice certificata FAPAS per lo ZEA una farina di mais contaminata con 60 9 ug kg di ZEA 27 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Campioni di frumento I campioni di frumento artificialmente inoculato con ceppi di Fusarium maltato e non maltato sono stati forniti dall Istituto Sperimentale Cerealicolo di Fiorenzuola Piacenza Italia Maltazione di grano duro 50 60 g di cariossidi pulite e setacciate sono state immerse in acqua potabile per 48 ore quindi sono state stese su carta assorbente e lasciate germinare per 10 giorni a temperatura ambiente Dopo allungamento delle radichette poco oltre la lunghezza del seme si proceduto all essiccazione
307. magnetiche costituite da una dispersione di ossidi di ferro ricoperta da un sottile guscio polimerico utile per l immobilizzazione di una grande variet di molecole per questo lavoro sono state scelte particelle magnetiche tosilattivate Gli step immunologici si susseguono in microtubi di poliestere e al termine di ogni step i microtubi vengono inseriti in un apposito concentratore magnetico che trattiene le microparticelle sulle parete interna del tubo in questo modo si possono alternare nei tubi le soluzioni contenenti i diversi bioreagenti lasciando indisturbate le microparticelle magnetiche I principali step immunologici sono i seguenti il coating al termine del quale le microparticelle magnetiche si troveranno legate a numerose molecole di DON il bloccaggio utile ad evitare legami aspecifici tra le microparticelle e i bioreagenti delle fasi successive al coating la competizione in cui le microparticelle legate a molecole di DON e bloccate vengono incubate con una soluzione contenente un adeguata diluizione di anticorpo anti DON in difetto e il DON da dosare presente nel campione o negli standard che competer con quello legato alla superficie per i limitati siti anticorpali L anticorpo utilizzato nell analisi costituito da un frammento Fab Antigen Binding Fragments specifico per il DON coniugato con una molecola di biotina L ultimo step il abelling in cui le microparticelle a cui legata la catena antigene Fab biotin
308. mali soprattutto nelle zone del Mediterraneo dove sono ampiamente diffusi e coltivati secondo le esigenze climatiche di ciascuna coltura La gran parte del territorio agricolo italiano destinato ai cereali e fra questi il frumento duro Triticum durum Desf costituisce la materia prima di una delle nostre pi qualificate filiere del settore agro alimentare come quella della pasta per la quale l Italia il maggiore produttore nel mondo Tuttavia se da un lato il frumento duro rappresenta una componente fondamentale e di largo consumo nell ambito della dieta mediterranea dall altro i prodotti da esso derivati possono rappresentare per il medesimo motivo una fonte di esposizione della popolazione verso l assunzione di sostanze estranee alla materia prima fitofarmaci metalli pesanti micotossine ecc In generale il rischio relativo alla presenza di tali composti nelle derrate cerealicole definite dalla normativa europea 1 come contaminanti degli alimenti pone sempre di pi l attenzione dei consumatori sulla sicurezza d uso e sulle caratteristiche igienico sanitarie della materia prima Fra i vari contaminanti del frumento le micotossine prodotti del metabolismo secondario di alcuni funghi del genere Fusarium fusariotossine rivestono un ruolo molto importante in considerazione sia delle propriet tossiche verso l uomo e gli animali sia della loro diffusione Il Deossinivalenolo DON metabolita appartenente al g
309. marciume 244 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Polymerase Chain Reaction Real Time Una coppia di primer specie specifici stata disegnata sulla sequenza conservata del gene della poligalatturonasi Pepg1 enzima coinvolto nella formazione del marciume molle nei tessuti vegetali 3 Tali primer PG1F 5 TTG ACA CGC AGT GTT GTT CTG GGA 3 PGIR 5 TGC ACC ACT GGT TCC CGA ATA GC 3 amplificano un frammento di 135 bp Diluizioni note di DNA plasmidico 0 0015 pg 150 ng contenente il frammento d interesse sono state prelinarmente amplificate e quantizzate per ottenere la curva di taratura R 0 9944 per mettere in relazione il segnale di fluorescenza al quantitativo di DNA nei campioni Condizioni ottimali di amplificazione 94 C per 1 min 94 C per 15 s 57 4 C per 20 s 72 C per 15 s steps da 2 a 4 ripetuti per 32 cicli 72 C per 8 min Risultati e discussioni Le condizioni di PCR Real Time messe a punto hanno mostrato un elevata sensibilit dei primer utilizzati permettendo di amplificare fino a 0 0015 pg di DNA fungino La tecnica ha consentito di rilevare e quantizzare il DNA fungino estratto da matrice inoculata artificialmente con 5 10 conidi dopo solo 6 ore dall inoculo Figura 1 6 0E 03 5 0E 03 4 0E 03 3 0E 03 2 0E 03 pg DNA fungino mg mela 1 0E 03 0 0E 00 ore Figura 1 Quantitativo di DNA estratto da mela inoculata con 5 10 conidi a differenti tempi d
310. mbe le tossine Il LOD di 20 g kg e il LOQ di 60 ug kg sia per FB che per FB2 Prove di recupero Si valutata l efficienza del metodo di estrazione effettuando otto prove di recupero su farine di mais ad un livello di contaminazione delle Fumonisine totali FB FB2 pari a 1000 ug kg valore corrispondente al limite di contaminazione massimo indicato dal Regolamento Comunitario 3 per il granoturco e prodotti derivati destinati al consumo umano diretto Il valore medio trovato 90 sia per FB che per FB2 Tali valori sono stati confermati replicando sei volte la matrice certificata di mais BRM 003003 Biopure Tallin Austria contaminata con FB 2406 630 ug kg e FB 630 116 ug kg e ottenendo il fattore di recupero pari a 143 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 90 per entrambe le tossine I valori di recupero risultanti sia per le prove di contaminazione di matrici bianche che per le prove sulla matrice certificata soddisfano i requisiti richiesti dal Reg CE 401 2006 4 Ulteriori conferme della validita del metodo sono state ottenute mediante la partecipazione annuale ai ring test del FAPAS The Food and Environment Research Agency Proficiency tests La Figura 1 mostra i cromatogrammi delle due transizioni di entrambe le Fumonisine ottenuti dall analisi del ring test mais del FAPAS T2255 contaminato da 389 ug kg di FB e da 228 pg kg di FB2 Fapas T2255 MRM of 4 Channels ES 16 59 722 4 gt 352 58
311. mento campionatore sonda d altro canto stato definito concettualmente di forma cilindrica e diametro idoneo 2 4 cm per l isolamento e raccolta di campioni elementari o incrementali IS di diverse materie prime granella di mais granaglie varie granelle di leguminose normalmente impiegati in zootecnia es favino pisello proteico D GENERATORE SOTTOPARTITE 8 TOTALE SU VALORE VERO CUMULATO GEN CONTAM CONTAM VERA RANDOM SOTTOPARTITA GENERATORE CAMPIONI GLOBALI 8 CONTAM CAMPIONE GLOBALE POOLING CAMPIONI ELEMENTARI FREQUENZA CONTATARE CAMPIONARIA CAMPIONI ELEMENTARI N MAX SU O convertitore stock a H5 e flusso o connettore d azione Figura 1 Layout del modello concettuale suddiviso in due sub modelli generatore sottopartite e generatore campioni globali 104 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Nel presente contributo le simulazioni sono state condotte considerando come materia prima da campionare il mais in granella destinato ad aziende agro zootecniche mangimifici o centri di stoccaggio di alimenti zootecnici In tale situazione considerando il peso ettolitrico CEE 9 della granella pari a 75 5 kg hL valore compatibile con le produzioni maidicole nazionali 10 e un affondamento dello strumento campionatore all interno della massa di mais alla rinfusa trasportato su camion pari a 1 06 m la massa di un IS ammonta a ca 360 g valore questo raffrontabile con quanto definit
312. metodo di preparazione del campione il limite di rivelazione 0 08 ug kg per i baby food e 0 8 ug kg per i cereali Le prestazioni delle colonnine AlfaOchra HPLC Vicam sono state valutate con 6 prove ripetute a due livelli di contaminazione prossimi ai limiti di legge 1 per i cereali e i baby food Un campione bianco di cereali per la prima colazione e uno di farina per l alimentazione destinata alla prima infanzia sono stati contaminati mediante aggiunta di standard ai livelli indicati in Tabella 3 Tabella 3 Recuperi delle IAC AlfaOchra HPLC Vicam confrontati con quelli delle IAC singole Analita Livello di Contaminazione ug kg R IAC AflaOcra R IAC Singole AFB cereali 2 0 90 940 baby food 0 6 78 AFB2 cereali 2 0 97 98 baby food 0 6 90 AFG cereali 2 0 95 910 baby food 0 6 70 AFG2 cereali 2 0 100 100 baby food 0 6 80 OTA cereali 4 0 90 97 2 baby food 0 5 92 Easy Extract Aflatoxin R Biopharm Rh ne LTD Ochraprep R Biopharm Rh ne LTD I recuperi delle colonnine di immunoaffinita IAC AlfaOchra HPLC Vicam sono stati confrontati con i recuperi medi ottenuti dai controlli di qualita interni effettuati con IAC singole Easy Extract Aflatoxin e Ochraprep R Biopharm Rh ne LTD durante gli ultimi 3 anni di lavoro Per entrambi i livelli di contaminazione le prestazioni delle IAC multi micotossine e delle IAC singole sono confrontabili e soddisfano i criteri di rendimento stabiliti dal Reg CE 4
313. metrico modello G1321A e di un dispositivo per la derivatizzazione fotochimica online UVETM LCTech GmbH Dorfen Germania La colonna cromatografica scelta stata la ZORBAX Eclipse XDB C18 Agilent Technologies di dimensioni 150 mmx 4 6 mm con particelle di 5 um Le condizioni cromatografiche ottimizzate sono riportate nella Tabella 1 Tabella 1 Condizioni sperimentali ottimizzate Parametro Ottimizzazione del parametro Fase Mobile H20 CH3CN CH30H 55 15 30 Flusso 1 0 mL min Volume di iniezione 20 uL Temperatura colonna 40 C Derivatizzazione Fotochimica Aderivatizzazione 254 nm Rivelazione fluorimetrica eccitazione 365 NM Aemissione 435 nm Preparazione del campione 15 g di campione macinato sono trattati con 30 mL di una soluzione metanolo acqua 80 20 per l estrazione delle Aflatossine Dopo agitazione con vortex e filtrazione 2 mL dell estratto aggiunti a 8 mL di PBS Phosphate Buffered Saline vengono purificati mediante colonnine ad immunoaffinit contenenti anticorpi monoclonali immobilizzati AflaCLEAN 3 mL Dopo lavaggio con 10 mL di acqua le Aflatossine vengono eluite con 2 mL di CH 0H Dopo evaporazione dell eluato sotto flusso di azoto a 40 C il residuo ricostituito in fase mobile H 0 CH3CN CHOH 55 15 30 ed infine filtrato su membrane Anotop 10 LC 0 2 um 10 mm Whatman 231 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Risultati e discussione In Figura 1 mostrato il confronto
314. mifici aziende zootecniche L obiettivo del presente contributo stato quello di sviluppare un modello versatile per simulare il processo di raccolta dei campioni elementari da lotti di alimenti zootecnici alla rinfusa al fine di valutare l effetto sulla rappresentativit campionaria del grado d eterogeneit con cui si possono distribuire le contaminazioni da AF 103 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Materiali e metodi Per la modellizzazione stato impiegato il pacchetto object oriented programming Stella 8 0 HPS Inc Hanover NH USA per Windows La simbologia utilizzata nello sviluppo del modello conforme a quanto riportato da Peterson amp Richmond 8 Per ragioni pratiche il modello si compone di due sub modelli un generatore di partite generatore sottopartite e un campionatore generatore campioni globali Figura 1 In una prima fase il modello prevede che la partita sia interamente suddivisa in un certo numero di Unit di Campionamento SU 6 il cui numero dipendente dalla tipologia di alimento es mais in granella dalle dimensioni della partita e dal tipo di strumento campionatore Nelle simulazioni effettuate stato scelto di operare a livello di 1 sub partita di 10 t definita conformemente al vigente Reg CE 152 2009 7 per le sostanze che possono essere distribuite in maniera non uniforme negli alimenti alla rinfusa per animali rispetto ad un lotto standard di mais trasportato su autotreno di 30 t Lo stru
315. milk production and rumen fermentation of dairy cows Journal of Dairy Science 2007 90 59 2355 66 8 Campanile G De Filippo C Di Palo R Taccone W Zicarelli L Influence of dietary protein on urea levels in blood and milk of buffalo cows Livestock Production Science 1998 55 135 43 102 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev SVILUPPO DI UN MODELLO PER LA VALUTAZIONE DI STRATEGIE PER IL CAMPIONAMENTO OTTIMALE DEGLI ALIMENTI ZOOTECNICI APPLICAZIONE AL CASO DELLE MICOTOSSINE Pier Paolo Danieli Umberto Bernabucci Bruno Ronchi Dipartimento di Produzioni Animali Universit della Tuscia Viterbo Introduzione Il processo di analisi per la contaminazione da micotossine di qualsiasi tipologia di alimento materia prima prodotto alimentare o mangime scomponibile in tre fasi principali campionamento preparazione del campione e analisi 1 2 Ad ognuna di queste fasi associabile una diversa quota dell errore complessivo del processo di analisi che in termini di varianza del dato analitico determinato dalla somma delle varianze associate alle singole fasi 1 3 Sia per il fatto che il campionamento rappresenta il primo passaggio di norma non replicabile anche a distanza di breve tempo sia per la continua riduzione dell entit del campione nelle fasi seguenti di preparazione e analisi anche fino ad un fattore 10 la sua rappresentativit un elemento cruciale per l affidabilit dell intera filiera analitica Inol
316. mpi e i costi di analisi necessario sviluppare metodi multiresiduo che permettano di estrarre e quantificare pi micotossine contemporaneamente In questo lavoro sono state testate due tipologie di colonnine di immunoaffinit IAC una per la determinazione simultanea di AFLA e OTA AlfaOchra HPLC Vicam seguita da analisi in HPLC Fluorimetro High Performance Liquid Chromatography e un altra per DON ZEA T2 HT 2 DZT R Biopharm Rh ne LTD seguita da quantificazione in LC MS MS Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry I risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli dei metodi precedentemente validati e correntemente in uso dal laboratorio sulle IAC singole di AFLA OTA DON e ZEA Nell ambito di questa sperimentazione per la prima volta sono state ricercate le tossine T2 e HT 2 Sono stati ottenuti buoni livelli di recupero sia in campioni di cereali per la prima colazione sia in baby food a due livelli di contaminazione prossimi ai limiti di legge I limiti di rivelazione sono inferiori alle concentrazioni massime ammesse nei baby food AFLA 0 05 ug kg OTA 0 08 ug kg DON 60 ug kg ZEA T2 e HT 2 10 ug kg Le prestazioni ottenute soddisfano i criteri di rendimento stabiliti dal Reg CE 401 2006 2 Le colonnine multi micotossine sono state utilizzate per l analisi di alcuni prodotti commerciali destinati al controllo ufficiale e campionati dagli organi competenti Materiali e metodi Materiali Le soluzioni
317. mportanza da un punto di vista sanitario Aflatossine Ocratossine e Fumonisine con un verifica quantitativamente pi consistente nelle regioni che possono rappresentare una probabilit di rischio maggiore per il benessere degli animali La numerosit campionaria risulta basata su una correlazione fra il rischio di contaminazione le diverse realt produttive e la relativa numerosit In particolare nella definizione del programma di campionamento si dovr considerare la diretta correlazione tra clima e contaminazione da micotossine e anche la diversa natura delle micotossine tossine da campo e tossine da stoccaggio In base a quanto sopra riportato si rende necessario il prelievo di campioni di prodotti in cui verificare la contaminazione da Aflatossina B e Ocratossina presso i centri di stoccaggio o negli allevamenti con riserve di mangime o di materia prima mentre campioni di prodotti potenzialmente contaminati da fusariotossine tossine da campo dovrebbero essere prelevati in qualsiasi sito dopo l essiccazione non essendo praticabile il campionamento in campo Per le prime due micotossine inoltre sar verificata la conformit alle normative vigenti prevedendo pertanto anche la possibilit di ricorrere alle analisi di revisione per le altre micotossine si terr conto dei limiti di cui alla Raccomandazione 2006 576 CE e spetter alle Aziende Sanitarie Locali individuare eventualmente le destinazioni d uso dei prodotti cont
318. n 12 ug kg valore medio SD 10 75 7 6 3 9 6 Bi 20 74 3 4 7 7 2 30 72 6 3 9 5 5 232 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 3 Campioni di semola di grano riproducibilita intra laboratorio e recupero delle AF Aflatossina Livello di additivazione Recupero RSD g kg valore medio SD Intra day n 6 Inter day n 18 1 76 4 6 5 3 5 9 9 Bi 2 83 0 9 8 4 9 11 0 3 92 2 8 3 2 7 6 8 0 25 79 5 11 6 9 1 12 0 Bo 0 50 82 1 9 9 5 9 11 0 0 75 92 8 8 0 3 1 7 6 1 80 4 9 6 7 7 14 0 Gi 2 83 4 11 1 6 2 15 0 3 94 6 8 2 4 4 8 1 0 25 89 2 16 9 8 8 20 0 Go 0 50 82 0 10 7 11 0 19 0 0 75 87 7 10 1 6 6 10 0 La selettivita del metodo valutata analizzando 10 campioni per specie grano mandorle pistacchi mais e avena ha consentito in combinazione con le prove di robustezza l applicazione del metodo di analisi alle matrici sopra indicate Infine sia i limiti di decisione LOD e LOQ Tabella 4 che i valori d incertezza estesa relativa per AFB 10 1 e per le Aflatossine totali 13 0 garantiscono un livello di precisione adeguato per l analisi di conferma Tabella 4 Curve di taratura LOD e LOQ delle Aflatossine y a bx Aflatossina b SD at SD r LOD LOQ B 0 87 0 01 0 02 0 01 0 9998 0 04 0 11 B2 2 31 0 04 0 02 0 01 0 9996 0 01 0 04 Gi 0 368 0 009 0 014 0 009 0 9991 0 08 0 24 G2 0 87 0 01 0 005 0 004 0 9996 0 02 0 05 ay il segnale espresso in uni
319. n aumento della riproducibilit della metodica di analisi che diventa facilmente gestibile e suscettibile di automazione 223 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev I requisiti del metodo analitico indicati nel Reg CE 882 2004 10 sono stati verificati tramite una procedura di validazione condotta integrando quanto specificato nel Reg CE 401 2006 11 con i protocolli riportati nella Decisione 657 2002 CE 12 e seguendo le indicazioni descritte nella linea guida degli IZS per la validazione intra laboratorio dei metodi di conferma per la determinazione di micotossine Il metodo analitico ottimizzato e validato stato infine adottato per condurre un monitoraggio sulla presenza di Fumonisine in 100 prodotti alimentari a base di mais 8 di farina di mais 21 di polenta 7 di mais 35 di corn flakes 16 di snack e 13 di prodotti per celiaci acquistati negli anni 2007 2008 in diversi punti vendita della Puglia e della Basilicata Materiali e metodi Reagenti Gli standard di FB e FB e cloruro di sodio cloruro di potassio fosfato bibasico di sodio monoidrato fosfato monobasico di potassio sono stati acquistati dalla Sigma Aldrich Steinheim Germania metanolo acetonitrile acqua per HPLC da Baker Deventer Olanda o ftalaldeide Thiofluor tampone diluente di borato di potassio 0D104 da Pickering Laboratories USA e colonnine ad immunoaffinit FUMONIPREP da R Biopharm Rh ne Ltd Apparecchiatura stato utilizzato un croma
320. n campione bianco della stessa composizione I valori ottenuti sono riportati rispettivamente nelle Tabelle 2 e 3 Tabella 2 HT 2 T 2 risultati di analisi su campioni di cereali da colazione naturalmente contaminati Contenuto endogeno Giorno di analisi Contenuto di Recupero di HT 2 T 2 ng g HT2 2 T 2 DS ng g 1 n d 80415 2 n d a 3 100 3 125 4 DS Deviazione Standard Tabella 3 HT 2 T 2 risultati di analisi su campioni di alimenti destinati all infanzia naturalmente contaminati Campione contaminato Contenuto Giorno Contenuto di RSD Recupero campione bianco endogeno di di analisi HT2 2 T 2 DS HT 2 T 2 ng g ng g 10 90 6 90 14 1 0 3 2 0 204 30 70 20 70 26 1 4 0 126 50 50 34 50 1 37 1 3 0 108 75 25 51 75 42 6 14 0 81 100 0 69 00 47 4 9 0 68 10 90 6 90 15 6 0 7 4 0 226 30 70 20 70 25 1 0 6 2 0 121 50 50 34 50 2 41 0 0 3 0 7 119 75 25 51 75 55 1 2 0 106 100 0 69 00 6043 5 0 87 DS Deviazione Standard Per i cereali da colazione si pu osservare come con un opportuna diluizione dell estratto ricostituito si possa determinare il contenuto di tossina con un valore intorno al 120 163 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Per quanto riguarda i campioni di alimenti per l infanzia vediamo che i campioni con un contenuto complessivo di tossine pari al limite di legge il cui segnale ricade nell intervallo di lavoro possono essere quantificati con un recupero intorno al 100 Nello stes
321. na soluzione di metanolo e bicarbonato di sodio 1 70 30 sono stati in seguito sottoposti a purificazione su colonna di immunoaffinit Ochratest VICAM secondo le condizioni suggerite dalla casa produttrice La quantificazione di OTA stata eseguita tramite High Performance Liquid Chromatography HPLC con rivelazione fluorimetrica e standardizzazione esterna L analisi stata condotta utilizzando una colonna Waters Xterra MS C18 150 mm x 4 6 5 um usando come fase mobile una miscela di 3 eluenti A CH30H H 0 1 1 B CH30H e C CH COOH1 CH30H 9 1 la composizione della miscela stata fatta variare in 2 minuti da 40 20 40 a 0 60 40 129 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Risultati e discussione Per quanto riguarda l analisi in HPLC la curva di taratura risultata lineare nell intervallo 0 16 20 ng mL e il limite di rivelazione Limit of Detection LOD risultato di 0 08 ng mL Nella Figura 1 viene riportata l immagine di un salame visibilmente contaminato da A ochraceus Figura 1 Salame visibilmente contaminato da A ochraceus Nella Figura 2 riportato il cromatogramma di un campione contaminato da OTA mVolts 1255 10 0 TA 7 152 7 5 5 0 0 0 i pel eae 3 0 E G 5 le 5 E 7 E 1 Minutes Figura 2 Cromatogramma di un campione contaminato da OTA Nella Figura 3 sono riportati i contenuti di OTA rilevati in tutti i campioni non spazzolati 130 Rapport
322. nalizzati nel 2008 Ogni campione rappresentativo di una partita di arachidi pistacchi o nocciole campione globale costituito da tre campioni di laboratorio due nel caso dei fichi secchi ciascun campione di laboratorio del peso di 10 kg omogeneizzato e singolarmente analizzato come descritto nella parte sperimentale In Figura 2 sono riportate le concentrazione di Aflatossina B nei tre campioni di laboratorio e la concentrazione nel campione globale calcolata come media della concentrazione dei tre campioni di laboratorio L Aflatossina Bj rappresenta in generale il principale contributo alle Aflatossine totali 80 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 140 dati fuori scala p 130 Camp1 351 ng g Camp2 227 ng g 4 Camp3 137 ng g Media 238 ng g f 120 110 Ri 6 campioni globali 100 con 3 campioni di laboratorio 90 7 campioni globali con contaminati 2 campioni di laboratorio p 80 A h contaminati 4 4 o 7 j gt 60 14 campioni globali con p p 1 campione di laboratorio i 4 M 4 50 contaminato 4 p 4 i 4 40 HAH i A AE Sali Ht MAFI I AHI ri A li A li 4 ee ve i n AU LIE s 4 9 10 f va CE ICI ro ne Ae Aa ool LLEVA ERIEN o Wolod nb Gb abot ot AP GEAR AR GEAR akih RAE girata Ble AANFNNNAAAAAAA FFAPAPA A APA AP E Campione di laboratorio 1 D Campione di laboratorio 2 Campione di laboratorio 3 F
323. ne L Ocratossina A OTA un metabolita secondario prodotto da funghi appartenenti ai generi Aspergillus e Penicillium L OTA ha attivit nefrotossica teratogena immunosoppressiva e cancerogena Molti sono gli alimenti interessati dalla contaminazione da parte di questa micotossina cereali caff frutta secca vino spezie ecc tra cui anche il cacao 1 La Circolare del Ministero della Salute n 6 del 28 11 2003 2 ha fissato in Italia il limite massimo tollerabile a 0 5 ug kg per l Ocratossina A nel cioccolato L obiettivo di questo lavoro stato quello di sviluppare e di fare una prima valutazione di un sistema ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay competitivo adatto allo screening dell OTA nel cioccolato Per poter determinare la presenza di OTA al limite imposto dalla legislazione italiana il nuovo sistema ELISA stato messo a punto a partire da un test gi disponibile Ochratoxin A quantitative ELISA Euroclone SpA cod EEM004096 modificando il design del saggio in modo da ottenere un aumento di capacit di rilevazione e di sensibilit Negli ELISA stata impiegata una fase solida ottenuta adsorbendo direttamente gli anticorpi specifici anti Ocratossina A ai pozzetti di una micropiastra Per la preparazione dei campioni stata valutata una estrazione veloce in 0 1 Bicarbonato Polietilenglicole 0 3 pH 7 7 in confronto ad una purificazione su colonna di immunoaffinita IAC Materiali e metodi Gl
324. ne animale sostanze indesiderabili e altri contaminanti micotossine Gaciana Fertiz cna ARG RATE TA Pha eI een SR Controllo ufficiale di micotossine in derrate alimentari di provenienza extra europea in ingresso dal Porto di Ravenna Maria Ferrari Angela Guerrini Davide Verna Ivan Scaroni Valerio Strocchi Luciano Calo Michele Buonaiuto Giuseppe Marrali Raffaella Patricelli Raffaella Perfetti Progetto MICOCER monitoraggio dei livelli di Deossinivalenolo nella granella di frumento duro Triticum durum Desf Gabriella Aureli Andreina Belocchi Michelangelo Pascale Tiziana Amoriello Maria Grazia D Egidio Ersilio Desiderio c ccsccssesecesessseeeenseesenseeecusecatesecneeecenaeeeeesecateneeneeates Effetti delle Aflatossine sugli aspetti produttivi nella bufala mediterranea italiana Giuseppe Auriemma Giuseppe Grazioli Rodolfo Baculo Fiorella Sarubbi iii Sviluppo di un modello per la valutazione di strategie per il campionamento ottimale degli alimenti zootecnici applicazione al caso delle micotossine Pier Paolo Danieli Umberto Bernabucci Bruno Ronchi i Linea guida degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali per la validazione intra laboratorio dei metodi di prova di conferma delle micotossine negli alimenti di origine animale Loredana Annunziata Alberto Biancardi Giancarlo Biancotto Giannina Chessa Pasquale Gallo Marilena Muscarella Ivan Pecorelli Alessandro Ross
325. nell inattivazione dei lipoperossidi LOO e degli idroperossidi LOOH La comparsa e la gravit della deplezione di GSH sono state proposte come indicatori della formazione di metaboliti tossici della FB 9 del DON e della Tossina T 2 28 Diversamente da quanto riportato in letteratura sebbene in condizioni d esposizione inferiori a quelle da noi testate per vari tipi cellulari quali cellule renali PK15 di suino 29 neuroblastoma umano SH SYSY glioblastoma di ratto C6 e cellule 10 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev ipotalamiche di topo GT1 7 30 i dati ottenuti nel corso della presente sperimentazione ad eccezione per l esposizione all AFB non mostrano un decremento generalizzato del contenuto intracellulare di tioli Tale evidenza sembra spiegabile in termini di differenze nel sistema di detossificazione per le diverse micotossine che nel caso dell AFB include un passaggio d epossidazione idrossilazione di entrambi gli anelli presenti nella molecola furanico e lattone e una de metilazione ossidativa con conseguente genesi di alcuni metaboliti polari Attraverso l azione della glutatione S trasferasi GST tali metaboliti sono prevalentemente coniugati con il GSH per essere successivamente escreti 31 Pertanto l esposizione ad AFB dei linfociti richiede ampie quantit di GSH che viene consumato nelle reazioni enzimatiche di coniugazione 32 Per quanto riguarda la produzione di MDA questa risultata essere
326. ngimi e degli alimenti di operatori del settore dei mangimi e degli alimenti oppure delle loro attivit Ne consegue che la sorveglianza include la raccolta di dati e la loro analisi la relativa interpretazione al fine di valutare l evoluzione nel tempo di un determinato fenomeno in riferimento a requisiti predefiniti e che permette di conseguenza la valutazione delle misure di controllo adottate e dell incidenza di queste sul fenomeno nonch una riprogrammazione delle azioni L attivit di vigilanza si prefigge un controllo mirato nella verifica della conformit alla normativa in materia di mangimi secondo quanto riportato agli art 3 e 10 del Reg CE 882 2004 dopo aver considerato i rischi associati a qualunque stadio del sistema di produzione del mangime le informazioni ottenute sulla conformit degli OSM alle disposizioni sui mangimi dati su altre situazioni non conformi l affidabilit dei propri controlli quindi rispetto alla precedente tipologia di attivit il controllo ufficiale dei mangimi risulta finalizzato ad obiettivi pi specifici Descrizione del PNAA 2009 2011 Il piano suddiviso in tre sezioni principali una parte generale descrittiva ove sono enunciate le finalit le competenze la programmazione delle attivit regionali e la normativa di riferimento inclusi gli interventi ispettivi per la verifica della conformit degli OSM una parte tecnico applicativa dove sono descritti i programmi di campion
327. ni delle suddette micotossine nei mangimi e le relative metodiche analitiche effettuando campionamenti casuali e mirati rivolti questi ultimi alle materie prime per mangimi in cui si ritiene possibile la presenza di concentrazioni elevate di micotossine ad esempio cereali semi oleosi e relativi prodotti e sottoprodotti nonch materie prime per mangimi immagazzinati per un lungo periodo o trasportati via mare per lunghe distanze Anche la Raccomandazione 2006 576 CE 10 il cui limite per l Ocratossina A stato recepito con DM 15 maggio 2006 relativa alla presenza di Deossinivalenolo Zearalenone Ocratossina A Tossine T 2 e HT 2 e Fumonisine in prodotti destinati all alimentazione degli animali invita gli Stati Membri attraverso un maggior coinvolgimento degli operatori del settore mangimi ad incrementare il monitoraggio delle suddette sostanze nei cereali e nei prodotti a base di cereali utilizzati nell alimentazione degli animali e a trasmettere regolarmente alla Commissione i risultati analitici ottenuti al fine dell inserimento in una banca dati che permette di dare una visione complessiva sullo stato della contaminazione da micotossine Al fine di permettere inoltre alle Autorit degli Stati Membri di giudicare l accettabilit di mangimi composti 1 e delle materie prime 2 la raccomandazione riporta i valori di riferimento da intendersi quali limiti superiori in quanto definiti per le specie meno sensibili per alcune m
328. ni di controllo verificano il rispetto delle disposizioni di legge relative ai mangimi lungo l intera filiera produttiva al fine di armonizzare la gestione dei controlli a livello territoriale nonch le strategie da adottare in caso di situazioni non conformi alle disposizioni di legge e garantire quindi un elevato livello di protezione della salute umana animale e dell ambiente 67 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tale piano non statico bens dinamico in quanto soggetto ad un continuo aggiornamento al fine di conformarsi a nuove normative e orientamenti comunitari ai nuovi sviluppi scientifici ai risultati dei controlli comunitari effettuati sul territorio nazionale nonch alle audit di settore svolte sul territorio e eventualmente alle disposizioni derivanti da nuove emergenze o rischi sanitari e dai precedenti controlli ufficiali L attuazione del piano nazionale di controllo si realizza attraverso la stesura dei Piani di controllo definiti dalle Regioni e dalle Province autonome anch essi di durata triennale su indicazione di quanto definito nel Piano nazionale e basati su un attivit di sorveglianza e un attivit di vigilanza che coinvolge le Autorit centrali regionali e locali nonch i Centri di referenza nazionali e i Laboratori nazionali di riferimento L attivit di sorveglianza consiste come da definizione del Reg CE 882 2004 nell osservazione approfondita di una o pi aziende del settore dei ma
329. nimal feed adopted on 22 September 2004 The EFSA Journal 2004 101 1 36 Opinion of the Scientific Panel on contaminants in the food chain on a request from the Commission related to Fumonisins as undesirable substance in animal feed adopted on 22 June 2005 The EFSA Journal 2005 235 1 32 Unione Europea Direttiva 2002 32 CE del Parlamento europeo e del Consiglio del 7 maggio 2002 sulle sostanze indesiderabili nell alimentazione animale GUCE L 140 1 30 maggio 2002 Italia Decreto legislativo 10 maggio 2004 n 149 Attuazione delle direttive 2001 102 CE 2002 32 CE 2003 57 CE 2003 100 CE relative alle sostanze ed ai prodotti indesiderabili nell alimentazione degli animali Gazzetta Ufficiale Serie Generale n 139 16 giugno 2004 Unione Europea Raccomandazione della Commissione del 14 dicembre 2005 2005 925 CE relativa al programma coordinato di ispezioni nel settore della nutrizione animale per l anno 2006 in accordo alla Direttiva del Consiglio 95 53 CE GUCE L 337 51 22 dicembre 2005 Unione Europea Raccomandazione della Commissione del 17 agosto 2006 2006 576 CE sulla presenza di Deossinivalenolo Zearalenone Ocratossina A tossine T 2 e HT 2 e Fumonisine inei prodotti destinati all alimentazione animale GUCE L 229 7 23 agosto 2006 Unione Europea Regolamento CE n 1881 2006 della Commissione del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari G
330. nnual report 2008 Luxembourg European Communities 2009 Disponibile all indirizzo http ec europa eu food food rapidalert report2008_en pdf ultima consultazione 7 10 2009 2 Unione Europea Regolamento CE n 1881 del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari GUCE L 364 5 20 dicembre 2006 3 Unione Europea Regolamento CE n 1126 2007 della Commissione del 28 settembre 2007 che modifica il reg CE n 1881 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari per quanto riguarda le Fusarium tossine nel granoturco e nei prodotti a base di granoturco Gazzetta ufficiale dell Unione europea L 255 del settembre 2007 4 Shephard GS Berthiller F Dorner J Krska R Lombaert GA Malone B Maragos C Sabino M Solfrizzo M Trucksess MW van Egmond HP Whitaker TB Developments in mycotoxin analysis an update for 2007 2008 World Mycotoxin Journal 2009 2 3 21 5 Z llner P Mayer Helm B Trace mycotoxin analysis in complex biological and food matrices by liquid chromatography atmospheric pressure ionization mass spectrometry Journal of Chromatography A 2006 1136 123 69 6 Songsermsakul P Razzazi Fazeli E A review of recent trends in applications of liquid chromatography mass spectrometry for determination of mycotoxins The Journal of Liquid Chromatography amp Related Technologies 2008 31 1641 86 7 Sulyok M Berthiller F Krska R Schuhmacher R De
331. no compiuti dai laboratori pubblici indicati dalle autorit competenti gli Istituti Zooprofilattici sperimentali IZS le Agenzie regionali per la Protezione Ambientale ARPA ecc Ogni anno i Dipartimenti di prevenzione delle ASL e i laboratori pubblici trasmettono alla Regione Provincia autonoma di appartenenza i risultati regionali relativi all attivit ispettiva e di campionamento avvalendosi degli appositi modelli di rilevazione Modelli A e Modelli B riportati nell Appendice 2 del DPR 14 luglio 1995 modificata dal DM 8 ottobre 1998 del Ministero della Sanit Il Ministero della Salute controlla i dati li elabora a livello nazionale li trasmette al Parlamento quindi pubblica i risultati Micotossine riferimenti normativi Relativamente alle micotossine il quadro normativo prevede riferimenti nazionali oltre che comunitari La Circolare del Ministero della Sanit n 10 del 9 giugno 1999 Direttive in materia di controllo ufficiale sui prodotti alimentari valori massimi ammissibili di micotossine nelle derrate alimentari di origine nazionale comunitaria e Paesi terzi sebbene superata dall attuale normativa comunitaria resta in vigore per alcuni valori guida per quelle matrici o quelle micotossine non contemplate nel regolamento CE Cos ad esempio nelle more dell emanazione di una normativa comunitaria restano in vigore i valori guida di Ocratossina A OTA per il caff crudo il cacao e i prodotti derivati
332. noltre rispetto alla precedente definizione di CRM viene aggiunto l aggettivo metrologica al termine riferibilit per evitare la confusione tra i due diversi significati del termine traceability rintracciabilit di prodotto e riferibilit metrologica Come sottolineato da Emons 3 il termine Reference Material RM non va quindi impiegato in contrapposizione al termine Certified Reference Material CRM con il significato di RM non certificato in quanto si tratta di un termine generale che indica una famiglia all interno della quale si possono identificare diverse tipologie di materiali da impiegare con diversa finalit all interno del processo di misurazione La terminologia legata ai RM risente di una certa confusione dovuta al diffondersi nei vari settori applicativi di termini diversi per l ambito metrologico e per l ambito dell assicurazione di qualit connessi spesso pi alla finalit di utilizzo che non al tipo di RM Alcuni esempi sono i seguenti Measurement standard Reference standard Analytical standard Laboratory standard Reference substance Standard material Proficiency Testing Material Laboratory Reference Material Laboratory Control Material Quality Control Material Calibration Material In Figura 1 si riporta una rappresentazione grafica della famiglia dei RM insieme A nella quale si evidenziano le relazioni tra i sottogruppi dei CRM sottoinsieme B Calibrant RM sottoinsieme C e Matri
333. non superano i 500 ug kg in ciascuno dei tre anni Nelle zone del Centro e ancor di pi in quelle del Nord stata registrata una forte influenza dell annata con i valori massimi raggiunti nel 2008 l anno pi critico per la diffusione della fusariosi nel frumento Nel complesso vi stata una chiara tendenza alla diminuzione dei livelli di concentrazione procedendo dal Nord verso il Sud Tabella 2 Valori di contaminazione da DON dei campioni prelevati presso i campi della Rete nazionale frumento duro Anni Nord Centro Sud Isole n DON in n DON in n DON in campioni positivi campioni positivi campioni positivi ug kg ug kg ug kg tot pos media max tot pos media max tot pos media max 2006 84 55 291 1280 258 129 225 791 297 46 62 219 2007 135 131 174 502 264 189 155 1285 305 173 88 459 2008 66 66 2211 6764 102 81 480 4613 132 44 57 233 Tot 285 252 624 399 734 263 opportuno al riguardo sottolineare che il riscontro in HPLC dei dati ottenuti con metodo ELISA ha evidenziato un elevato coefficiente di correlazione r 0 9888 fra i due metodi relativamente all intervallo di contaminazione 18 5 13561 ug kg Nella Figura 2 dove sono riportate le percentuali dei campioni positivi sul totale di quelli esaminati incidenza risulta evidente l influenza delle condizioni climatiche dell annata nelle aree del Nord e del Centro con un progressivo aumento di incidenza del DON dal 2006 al 2008 Nelle ar
334. nonuclear cells in vitro Mycopathologia 1998 143 105 11 Tiemann U Briissow K P Jonas L Pohland R Schneider F Danicke S Effects of diets with cereal grains contaminated by graded levels of two Fusarium toxins on selected immunological and histological measurements in the spleen of gilts Journal of Animal Science 2006 84 236 45 Atroshi F Rizzo A Westermarck T Ali Vehmas T Effects of tamoxifen melatonin coenzyme Qio and L carnitine supplementation on bacterial growth in the presence of mycotoxins Pharmacological Research 1998 38 4 289 95 Ferrante MC Meli R Mattace Raso G Esposito E Severino L Di Carlo G Lucidano A Effetts of Fumonisin B1 on structure and function of macrophage plasma membrane Toxicology Letters 2002 129 181 7 M ller G Burkert B M ller U Diller R Rohrmann B Rosner H K hler H Ochratoxin A and some of its derivatives modulate radical formation of porcine blood monocytes and granulocytes Toxicology 2004 199 251 9 Selkirk JK Croy RG Whitlock JP Jr Gelboin HV Jn vitro metabolism of benzo a pyrene by human liver microsomes and lymphocytes Cancer Research 1975 35 3651 5 Lacetera N Franci O Scalia D Bernabucci U Ronchi B Nardone A Effects on functions of ovine blood mononuclear cells for each of several fatty acids at concentrations found in plasma of healthy and ketotic ewes American Journal of Veterinary Research 2002 63 958 62 13 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 14 1
335. novembre 2007 11 36 lt 2 32 30 9 dicembre 2007 23 28 125 37 69 10 gennaio 2008 38 41 278 27 76 11 febbraio 2008 52 20 254 65 43 12 marzo 2008 19 17 36 28 105 media 25 15 36 24 71 96 3019 33 33 45 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Conclusioni Questa indagine ha rilevato che le contaminazioni da OTA e TCT di biscotti tipo frollini provenienti da cinque diverse marche italiane sono basse e quasi trascurabili nessun campione risultato avere un livello di contaminazione superiore a quello di legge per i prodotti da forno Inoltre quasi tutti i campioni hanno rispettato anche il limite per il baby food indicando che possono essere consumati anche da bambini nei primi anni di vita Non sono state rilevate differenze statisticamente significative fra le marche leader del mercato e quella presente solo nei punti vendita Hard Discount Bibliografia 1 Scudamore KA Mac Donald SJ A collaborative studiy of an HPLC method for determination of ochratoxin A in wheat using immunoaffinity column clean up Food Additives and Contaminants 1998 15 401 10 2 Radova Z Holadova K Hajslova J Comparison of two clean up principles for determination of trichothecenes in grain extract The Journal of Chromatography A 1998 829 259 67 3 Eskola M Rizzo A Sources of variation in tha analysis of trichothecenes in cereals by gas chromatography mass spectrometry Mycotoxin Research 2001 17 68 87 46 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev CONTAMINAZIONE INDIR
336. ntito l IZS in merito alla disponibilit di metodiche analitiche validate dispone che al momento della macellazione dei suini consumatori dell alimento contaminato venga eseguito il prelievo di campioni di carne suina muscolo fegato reni ecc e prodotti derivati L eventuale analisi di revisione sar effettuata dall Istituto Superiore di Sanit c nel caso di riscontro di elevati livelli di contaminazione di Zearalenone Deossinivalenolo Fumonisine e Tossine T 2 e HT 2 l IZS comunica il risultato alla ASL competente che eventualmente a seguito di un analisi del rischio dispone di destinare l alimento contaminato alle specie meno sensibili Il Reg CE 178 2002 13 considera a rischio i mangimi nei seguenti casi se hanno un effetto nocivo per la salute umana o animale se mettono a rischio per il consumo umano l alimento ottenuto dall animale destinato alla produzione alimentare In virt di ci esso stabilisce che i mangimi a rischio non possono essere immessi sul mercato n essere somministrati ad animali destinati alla produzione alimentare Tali misure sono conformi a quanto previsto dall articolo 17 comma 1 della Legge 281 1963 14 in base al quale in caso di contaminazioni che non permettano di considerare il mangime di qualit sana leale e mercantile e che rappresenta un pericolo per la salute degli animali e umana non possono essere immessi sul mercato e pertanto non possono essere sommin
337. nversione che devono essere forniti dall operatore del settore alimentare all autorit di controllo che li richieda L art 3 del Reg CE 1881 2006 sancisce inoltre il divieto di utilizzo nei prodotti alimentari di ingredienti che risultassero contaminati oltre i limiti sopra riportati e la miscelazione di partite conformi con altre non conformi Nel 2008 il Codex Alimentarius ha proposto un limite massimo di 10ug kg per le Aflatossine totali in mandorle nocciole e pistacchi pronti al consumo e la Commissione Europea sta valutando la possibilit di allineare la legislazione della UE a questo valore a tale proposito l EFSA European Food Safety Authority si espressa con due opinioni del panel scientifico CONTAM 4 5 la pi recente delle quali pubblicata nel giugno 2009 comprende anche la noce di anacardio e i suoi derivati in entrambe le opinioni viene ritenuto accettabile l innalzamento del limite in questione per tutta la frutta a guscio senza pregiudizio per la salute 124 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev dei consumatori della UE mentre viene puntualizzata la necessita di ridurre il numero di alimenti altamente contaminati immessi sul mercato Attualmente l importazione di anacardi e derivati da paesi terzi non soggetta alle condizioni particolari di controllo ai punti d ingresso che sono state invece previste per altra frutta secca e a guscio dalla Decisione della Commissione 2006 504 CE del 12 07 2006 relativamente al
338. nza di trasformazione dell alimento nelle diverse produzioni dell animale e se possibile anche quello di influenzare positivamente le caratteristiche qualitative delle produzioni stesse Nella Figura 1 si riporta lo schema base seguito per le determinazioni chimiche nutrizionali effettuati secondo le indicazioni AOAC 6 e di Bhandari et al 7 CAMPIONE INIZIALE IN STUFA Sostanza secca ESTRATTO ESTRATTO Ceneri ACQUOSO H SO 0 1N Proteine grezze Lipidi grezzi pH Acidi grassi volatili Cellulosa grezza Potere tampone NDF ADF ADL NH Figura 1 Schema base seguito per le determinazioni chimiche nutrizionali 94 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Determinazione delle AF Per la determinazione delle AFB 50 g circa di campione sono stati disposti in frullatore con 10 g di NaCl Sono stati aggiunti circa 200 mL di metanolo acqua 80 20 v v e frullati ad alta velocita per circa 1 minuto L estratto cos ottenuto stato filtrato su carta Whatmann 541 e raccolto in beuta Sono stati miscelati 10 mL dell estratto filtrato con 40 mL di acqua ultrapura in vortex La soluzione cos ottenuta e diluita stata filtrata ulteriormente con filtro in microfibra di vetro e aspirato in siringa di vetro fino ad ottenere circa 4 mL corrispondente a circa 0 2 g di campione iniziale Alla base della siringa stata posizionata una colonna cromatografica ad immunoaffinit monoclonali Aflatest a
339. o Rosanna Spatola Alessandro Ubaldi iii Deossinivalenolo nel frumento duro Triticum durum Desf confronto fra coltura convenzionale e biologica Gabriella Aureli Fabrizio Quaranta Tiziana Amoriello Sahara Melloni Ersilio Desiderio Mauro Fornara Maria Grazia D Egidio i Monitoraggio della gestione del rischio contaminazione da Aflatossine sulle aziende conserviere della Provincia di Imperia che utilizzano anacardi Marta Ferro Lor lla Ter zan sxc ssaa ai Studio di un sistema di decontaminazione dell Ocratossina A dai prodotti di salumeria Tiziana Pinciroli Luca Maria Chiesa Carlo Cantoni Pier Antonio Biondi 1999 2009 Aflatossina M nel latte un problema risolto Luca Sillari Enzo Casarini Alberto Zaniboni Kalinka GrOozeva ii TERZA SESSIONE Diagnostica delle micotossine Analisi di Fumonisine B e B in farine di mais mediante tecnica HPLC MS MS e valutazione della loro tossicita su Vibrio fischeri Barbara Romagnoli Maria Ferrari Cecilia Bergamini Paola Silingardi Elena Morandi Annamaria Colacci ccceccesescsesesssesecseeescnseeccesecaceseceeeecsseeeeesecaeeseceeeeeaeeneeaeeaees 141 Sviluppo di un nuovo sistema immunoelettrochimico per la determinazione del Deossinivalenolo Daniela Romanazzo Silvia Vesco Giulia Volpe Francesco Ricci Danila Moscone Giuseppe Palleschi c a ssccaci iena ai lanan aan 153 Immunosensore el
340. o al momento dell analisi 51 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Latte intero Panna di affioramento Latte caldaia Siero innesto caglio Latticello Figura 1 Schema generale delle mini caseificazioni Analisi di AFM nel latte siero cotto scotta latticello Un aliquota di 40 mL di campione stata centrifugata per 10 min a 7000 g e a 4 C e successivamente filtrata su filtro di carta 20 mL del filtrato sono stati quindi purificati mediante colonna ad immunoaffinit R Biopharm 1 Dopo lavaggio della colonna con 5 mL di acqua distillata AFM stata eluita in provetta graduata con 2 5 mL di CH3OH L estratto purificato stato concentrato sotto flusso di N2 quindi portato a 2 mL con la miscela CH3CN H 0 25 75 agitando in bagno ad ultrasuoni e su vortex L estratto stato infine filtrato 0 45 um prima dell analisi HPLC High Performance Liquid Chromatography Analisi di AFM in formaggi panna burro e ricotta Ad un aliquota di 5 g di campione pesati in un provettone da centrifuga sono stati aggiunti 50 mL di una soluzione di pepsina allo 0 2 in HCI 0 075 N 2 Il campione dopo aver controllato che il pH della soluzione fosse compreso tra 2 4 e 3 0 eventualmente corretto con NaOH 0 1 N stato posto in stufa termostato a 42 C per 16 ore sotto continua agitazione Al termine della digestione enzimatica la soluzione stata neutralizzata a pH 7 7 5 con NaOH IN 3 5 mL centrifugata a 11
341. o dovrebbe facilitare lo scambio di informazioni fra i laboratori della rete del Sistema Sanitario Nazionale avendo come prime finalita quelle di aggiornare e condividere le informazioni in possesso e di armonizzare le procedure analitiche in tutto il territorio Ad oggi l accesso alla Araea Riservata non stato ancora avviato ma sar predisposto quanto prima attraverso l utilizzo di username e password Nel sito particolare rilievo ha la sezione Mycotoxin Newsletter a cui si pu accedere anche direttamente www iss it myconews che vuole rappresentare una finestra sulle attivit che si svolgono sul tema delle micotossine a livello internazionale In particolare in questa sezione sono raccolte informazioni tecnico scientifiche linee guida pubblicazioni ed eventi congressuali di maggiore interesse a livello mondiale Bibliografia 1 Unione Europea Regolamento CE 882 2004 del Parlamento Europeo e del Consiglio del 29 aprile 2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformit alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali GUCE L 165 30 aprile 2004 2 Unione Europea Regolamento CE N 776 2006 della Commissione del 23 maggio 2006 che modifica l allegato VII del regolamento CE n 882 2004 del Parlamento europeo e del Consiglio per quanto riguarda i laboratori comunitari di riferimento GUCE L 136 24 maggio 2006 3 Brera C Grossi S Miraglia M Interl
342. o i Paesi Terzi dai quali provengono i prodotti alimentari di origine non animale a rischio di contaminazione ha individuato i prodotti soggetti a controlli accresciuti ha definito la percentuale di campionamento obbligatoria per ognuno di essi ed ha indicato la documentazione che deve accompagnare obbligatoriamente la merce 64 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 4 Rischio micotossine mangimi e alimenti di origine non animale oggetto di un livello accresciuto di controlli ufficiali nel punto di entrata designato Mangimi e alimenti Paese Rischio Frequenza dei controlli fisici uso previsto di origine e d identita Arachidi e prodotti derivati Argentina Aflatossine 10 alimenti e mangimi Brasile Aflatossine 50 Ghana Aflatossine 50 India Aflatossine 10 Vietnam Aflatossine 10 Spezie i Aflatossine 50 Uve secche alimenti Ocratossina A 50 Riso Basmati destinato al consumo Pakistan Aflatossine 50 umano diretto India Aflatossine 10 Inoltre su indicazione di ogni Stato Membro sono stati indicati i punti di ingresso dei prodotti alimentari oggetto di controlli accresciuti Recentemente la Decisione 504 2006 CE stata aggiornata e modificata e la nuova versione andr in vigore dal 1 gennaio 2010 In base invece all art 15 punto 5 del Reg CE 882 2004 nel luglio di quest anno stato emanato il nuovo Reg CE 669 2009 che entrer in vigore a partire dal 25 Gennaio 2010 che prevede un attivit di controllo
343. o per il controllo ufficiale 7 Ogni campione incrementale cos prelevato conterrebbe 1 4 10 cariossidi Per il mais destinato alla zootecnia la normativa vigente in materia di sostanze indesiderate prevede un limite massimo di 20 ug kg U 12 per l Aflatossina Bj AFB 11 sebbene nella prassi corrente soventemente le partite di mais destinate alla produzione di mangimi per bovini da latte sono contrattate al fine di garantire livelli massimi di contaminazione da AFB pi stringenti Per tale motivo in tutte le simulazioni effettuate stato scelto un livello di contaminazione della sub partita da campionare pari a 5 ug kg Nella generazione operata dal sub modello generatore sottopartite vedi Figura 1 inoltre stato tenuto conto di due aspetti distribuzione della contaminazione tra le diverse SU non uniforme ma soggetta a variabilit di livello che definisce una prima dimensione dell eterogeneit E per cui un campione incrementale estratto dalla sub partita pu presentare una contaminazione compresa tra un valore minimo SET EL MIN pari a zero nel caso limite e un valore massimo SET EL MAX nella pratica entrambi non noti a priori Nel modello sviluppato questa fonte d eterogeneit affidata ad un generatore di numeri casuali GEN RANDOM CONTAM controllabile mediante l assegnazione di coppie di valori MINC SU MAXC SU Il valore di E definito come il rapporto percentuale MAXC SU 5 5 Pertanto in ba
344. o test ha una curva con una capacita di rilevazione maggiore rispetto al vecchio sistema 0 010 1 28 ng mL e dimostra una buona ripetibilita vedi Tabella 1 Per quanto riguarda l analisi di campioni di cioccolato gi in sede di progettazione dello studio emersa subito una criticit a carico della tipologia di campioni su cui eseguire l analisi essendo la matrice molto complessa e variabile rispetto al contenuto percentuale di cacao L effetto matrice espresso in termini di concentrazione di analita apparente ancora troppo elevato per permettere delle quantificazioni accurate di recupero sui campioni addizionati spike Ciononostante ragionando in termini di variazione di B Bo tra i campioni negativi e quelli addizionati la differenza riscontrata tale da poter candidare il sistema come uno strumento utile in una analisi di screening Comunque i dati preliminari ottenuti suggeriscono che una procedura rapida di preparazione del campione pu essere applicata con successo solo a cioccolati con contenuto di cacao lt 35 Per campioni con contenuto di cacao gt 35 invece richiesta una purificazione su IAC in modo da renderli idonei all analisi in ELISA Il test si presta inoltre a trovare applicazione in altre matrici alimentari laddove si richieda di determinare la presenza di OTA A a basse concentrazioni Bibliografia 1 Serra Bonveh J Occurrence of ochratoxin A in cocoa products and choccolate Journal of Agricultural and
345. oda prova anche la robustezza del metodo per cambiamenti lievi l analista la temperatura ambiente la specie Tabella 4 Risultati del t test per dati appaiati p 0 05 dei due gruppi dei campioni bianchi e fortificati Parametri statistici Gruppo 1 Gruppo 2 Media 96 16718861 63 94571678 Varianza 15 81922432 158 3361576 Numero di osservazioni 19 19 Correlazione di Pearson 0 599753614 Differenza ipotizzata tra le medie 0 Gradi di libert 18 Statistica t 9 177831568 Valore di p test a una coda 1 6440478 Valore critico di t test a una coda 1 734063592 Valore di p test a due code 3 28809 Valore critico di t test a due code 2 00922037 Conclusioni E stato eseguito uno studio di validazione intra laboratorio del metodo ELISA per la rivelazione della AFM in latte con elaborazione statistica dei dati per verificare le prestazioni in termini di specificit LOQ CCB robustezza per cambiamenti lievi l intervallo di risposta lineare Per ridurre il rumore di fondo del segnale dei campioni bias stata introdotta una centrifugazione ad alta velocit prima della reazione immunochimici in piastra Il campo di applicazione del kit stato esteso a tutti i tipi di latte sulla base dello studio statistico indipendentemente dalla quantit di grasso Il LOQ a 0 004 ng g indica una elevate sensibilit del saggio il CCB del metodo stato valutato al LOQ Questo studio pu rappresentare uno schema generale p
346. omplementari e completi per vitelli lt 4 mesi agnelli e capretti 2 1 2 3 4 per le definizioni cfr art 3 Reg CE 767 2009 Zearalenone Materie prime per mangimi ZEA Cereali e prodotti a base di cereali 2 Racc eccetto i sottoprodotti del granoturco 2006 576 CE Sottoprodotti del granoturco 3 Mangimi complementari e completi per suini e scrofette giovani scrofe 0 1 per scrofe e suini da ingrasso 0 25 per vitelli bovini da latte ovini inclusi agnelli e caprini inclusi capretti 0 5 Ocratossina A Materie prime per mangimi OTA Cereali e prodotti a base di cereali 0 25 Racc 2006 576 CE Mangimi complementari e completi per suini 0 05 DM per pollame 0 1 15 5 2006 Fumonisine Materie prime per mangimi B1 B2 Granoturco e prodotti derivati 60 Mangimi complementari e completi per suini equini Equidi conigli e animali 5 da compagnia Racc per pesci 10 2006 576 CE per pollame vitelli lt 4 mesi agnelli e capretti 20 per ruminanti adulti gt 4 mesi e visoni 50 Piano di sorveglianza Il Piano di sorveglianza si avvale di un campionamento statisticamente rappresentativo distribuito in modo uniforme e casuale conseguente alla necessit di rivelare possibili fonti di rischio emergenti o ri emergenti in siti specifici come per esempio le aziende produttrici di 70 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev materie prime o di mangimi destinati agli animali da latte in quanto rappresentativi di una maggio
347. on acido formico condizioni iniziali al 70 di A 0 2 minuti condizioni isocratiche 2 5 minuti al 45 di B 5 25 minuti al 90 di B 25 35 minuti condizioni isocratiche al 90 di B 35 36 minuti ripristino delle condizioni iniziali al 70 di A 36 50 minuti ricondizionamento al 70 di A tempo totale di analisi 50 minuti Parametri di MS ESI modalit di ionizzazione positiva voltaggio del capillare 4 0 kV Cono 50 kV Estrattore 2 V temperatura della sorgente 120 C temperatura di desolvatazione 350 C flusso del gas del cono e del gas di desolvatazione azoto 50 L h e 700 L h rispettivamente La rivelazione stata effettuata utilizzando la modalit operativa Multiple Reaction Monitoring MRM monitorando due transizioni per ogni analita Le transizioni scelte per ogni analita e le relative energie di collisione sono riportate in Tabella 1 Tabella 1 Transizioni monitorate per ogni analita e relative energie di collisione Analita Transizione monitorata Energie di collisione eV FB 722 4 334 4 40 722 4 352 4 35 706 4 336 4 35 FB2 FB 706 4 gt 318 4 35 La prima transizione riportata quella che viene impiegata per quantificare mentre la seconda stata scelta come qualitativa Risultati e discussione Prove preliminari di recupero su cartucce Sep Pak Considerata l elevata concentrazione salina del chimo al termine della digestione prima di effettuare gli esperimenti si reso necessar
348. one Tale risposta non sembra essere condizionata in modo preponderante dall epoca di fioritura delle singole cultivar Considerata l imprevedibilit delle variabili climatiche nelle annate agrarie la scelta varietale in funzione non solo delle caratteristiche agronomiche ma anche dell adattabilit all ambiente di coltivazione rimane uno degli aspetti pi importanti nella gestione del rischio di contaminazione da DON Bibliografia 1 Unione Europea Regolamento CEE dell 8 febbraio 1993 n 315 che stabilisce le procedure comunitarie relative ai contaminanti nei prodotti alimentari Gazzetta ufficiale dell Unione europea L 37 13 febbraio 1993 2 Edwards SG Barrier Guilliot B Clasen P E Hietaniemi V Pettersson H Emerging issues of HT 2 and T 2 toxins in European cereal production World Mycotoxin Journal 2009 2 2 173 9 3 Rossi V Fusariosi della spiga malattia a molte facce L Informatore Agrario 2006 12 Suppl 19 23 4 Pestka JJ Smolinski AT Deoxynivalenol toxicology and potential effects on humans Journal of Toxicology and Environmental Health Part B 2005 8 39 69 91 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 5 10 Romani S Pinnavaia G Dalla Rosa M Caratteristiche qualitative e presenza di micotossine in grano duro infetto da Fusarium spp Tecnica Molitoria 2005 6 617 24 Campagna C Haidukowski M Pancaldi D Pascale M Ravaglia S Silvestri M Visconti A Fonti di rischio e gestione delle micotossin
349. one Europea Decisione della Commissione 2006 504 CE del 12 luglio 2006 che stabilisce condizioni particolari per l importazione di determinati prodotti alimentari da alcuni paesi terzi a causa del rischio di contaminazione da Aflatossine di tali prodotti GUCE L 199 21 luglio 2006 Ringraziamenti Si ringraziano per la ASL 1 Imperiese la Dott ssa Maria Lina Montaldi e i tecnici della prevenzione Roberta Arnaldi Corrado Bonato Uliano Bottino e Marco Ferretti e per il Dipartimento Provinciale dell ARPAL di Genova i tecnici di laboratorio Silvia Anselmo e Lucia Angella 128 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev STUDIO DI UN SISTEMA DI DECONTAMINAZIONE DELL OCRATOSSINA A DAI PRODOTTI DI SALUMERIA Tiziana Pinciroli Luca Maria Chiesa Carlo Cantoni Pier Antonio Biondi Dipartimento di Scienze e Tecnologie Veterinarie per la Sicurezza Alimentare Facolta di Medicina Veterinaria Universita degli Studi Milano Introduzione Le Ocratossine sono un importante gruppo di micotossine tra cui la pi rilevante l Ocratossina A OTA L OTA il prodotto del metabolismo secondario di miceti dei generi Aspergillus e Penicillium e ha effetti epatotossici nefrotossici teratogenetici ed un possibile cancerogeno per l uomo IARC gruppo 2B 1 Muffe produttrici di OTA sono in grado di svilupparsi su molti alimenti soprattutto in fase di conservazione e stagionatura cereali frutta secca caff cacao spezie liquirizia vino birra e sulla
350. one dell estratto essiccato e ricostituito in PBS stato scelto in funzione del limite di legge della specifica matrice in esame in modo tale da far ricadere il segnale relativo ad un campione con un contenuto di tossina pari al limite di legge nel mezzo dell intervallo di lavoro Condizioni elettrochimiche di misura Il saggio ELISA elettrochimico viene effettuato tramite un anticorpo secondario coniugato con Fosfatasi Alcalina come marcatore La lettura eseguita utilizzando come substrato della Fosfatasi Alcalina I 1 Naftil Fosfato trasformato in 1 Naftolo per idrolisi La quantificazione dell 1 Naftolo condotta applicando condizioni elettrochimiche gi da noi standardizzate e riportate in letteratura 7 162 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tampone di analisi DEA pH 9 8 Potenziale inizio scansione 0 V Potenziale fine scansione 0 6 V Altezza dello step 0 016 V Altezza dell impulso 0 0339 V Velocit di scansione 0 1 V s Larghezza impulso 0 06 s Risultati e discussione L applicabilit del sistema ottimizzato stata valutata esaminando i valori di recupero relativi ad una serie di campioni naturalmente contaminati stato analizzato un campione di cereali da colazione mentre per quanto riguarda gli alimenti destinati all infanzia a base di mais un campione con un elevata contaminazione naturale di tossina stato omogeneizzato in diverse proporzioni con u
351. one di tre step che simulano bocca stomaco e piccolo intestino sono state riprodotte le condizioni e i processi a cui vanno incontro gli alimenti durante il processo digestivo al fine di valutare l effettiva presenza di Fumonisine nascoste che potenzialmente possono essere rilasciate dalla matrice esposta all azione idrolitica degli enzimi presenti in ambito gastrointestinale e stimarne quindi la bioaccessibilit Materiali e metodi Reagenti Le soluzioni standard di FB e FB in miscela 50 ug mL e FB 50 ug mL entrambe in acqua acetonitrile 1 1 sono state fornite da Biopure Tulln Austria Il metanolo utilizzato per le analisi HPLC High Perfomance Liquid Chromatography stato fornito da Carlo Erba Milano Italia mentre l acetonitrile stato fornito da J T Baker Mallinckrodt Backer Phillipsburg NJ USA L acqua bidistillata stata prodotta in laboratorio utilizzando un sistema Alpha Q System Millipore Marlborough MA USA Cloruro di potassio cloruro di sodio cloruro di ammonio diidrogeno fosfato di potassio carbonato di sodio e cloruro anidro di calcio sono stati forniti da Carlo Erba Milano Italia tiocianato di potassio e solfato di sodio sono stati forniti da Riedel de Ha n Hannover Germania il diidrogenofosfato monoidrato di sodio stato fornito da Fluka Chemika Biochemika Basilea Svizzera e il cloruro di magnesio esaidrato stato fornito da Merck Darmstadt Germania Urea 98 D
352. oni elementari per una sub partita di ca 10 t come richiederebbe la strategia campionaria indicata dal Reg CE 152 2009 7 possa risultare riduttivo e comportare un errore di campionamento piuttosto consistente CV fino al 30 nelle simulazioni effettuate Figure 3a e 3b Probabilmente uno sforzo di campionamento intermedio per sub partite da 10 t ad esempio 16 campioni elementari potrebbe essere da un lato fattibile con strumenti di prelievo adeguati es sonde pneumatiche e dall altro maggiormente rappresentativo Ad esempio nelle peggiori condizioni tra quelle testate in quanto ad eterogeneit della sub partita E 100 E70 Figura 3a i valori del CV sono risultati interpolabili dalla seguente funzione CV 0 7673 N IS 0 4767 r 0 9962 P lt 0 01 che per 16 campioni incrementali consente di stimare un CV pari a 20 4 14 2 nel caso del livello Ep100 Figura 3b Considerando che la varianza associata alla fase del campionamento pu ammontare al 60 90 di quella totale dell intero processo di analisi 1 4 appare chiaro come un incremento accettabile dello sforzo campionario da 8 a 16 campioni incrementali che porti ad una riduzione di 1 3 della variabilit dei campioni globali pu avere ripercussioni notevoli a beneficio dell affidabilit del dato finale E 100 y 0 512x 46 R 0 997 N di campioni incrementali N di campioni incrementali E5 B E10 4 E15 x
353. oni provenienti dal monitoraggio aziendale e prelevati in campo nella fase di post raccolta trebbiatura oppure all arrivo degli stessi nei centri di stoccaggio 1643 campioni provenienti dai campi sperimentali della Rete nazionale di confronto varietale frumento duro coordinata dal CRA QCE stato considerato un gruppo di sei variet sempre presenti nel triennio in tutti gli areali della Rete scelte per la loro diffusione e per la diversa epoca di fioritura Ciccio Simeto Duilio Iride Claudio e Creso Nel biennio 2006 2007 oltre alle sei variet suddette nei principali ambienti rappresentativi delle aree della durogranicoltura sono state analizzate anche tutte le variet presenti nella Rete 30 in totale per ciascun anno Nella Figura 1 viene riportato nel dettaglio il numero totale dei campioni relativo a ciascuna regione In particolare sono stati presi in esame 285 campioni nelle regioni del Nord Piemonte Lombardia Veneto ed Emilia Romagna 1063 nel Centro Toscana Umbria Lazio Marche e Abruzzo e 1382 nel Sud Isole Molise Campania Puglia Basilicata Calabria Sicilia e Sardegna L analisi di screening del DON stata eseguita presso il CRA QCE di Roma utilizzando un test immunoenzimatico ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay kit Ridascreen DON R Biopharm con un limite di sensibilit di 18 5 ug kg e un recupero di tossina nei cereali compreso fra P85 e il 110 Sul 12 circa dei campioni totali stata eff
354. ono la natura e la frequenza dei controlli che devono essere effettuati regolarmente durante un determinato periodo In Italia il DPR 14 luglio 1995 Patto di indirizzo e coordinamento alle Regioni Province sui criteri uniformi per l elaborazione dei programmi di controllo ufficiale degli alimenti e bevande In base al suddetto Decreto le Regioni Province autonome predispongono appositi programmi per definire la natura e la frequenza dei controlli che debbono essere effettuati regolarmente nelle fasi di produzione confezionamento somministrazione e commercializzazione Il controllo sul territorio viene effettuato lungo tutta la filiera produttiva dalla produzione primaria alla trasformazione al magazzinaggio al trasporto e al commercio fino alla somministrazione e al consumo Esso riguarda tutti i prodotti e gli additivi alimentari nonch i materiali destinati a venirne a contatto commercializzati nel territorio nazionale o destinati all esportazione L indagine prevede accertamenti completi sul prodotto attraverso ispezioni campionamenti e analisi di laboratorio sopralluoghi nell ambito dell ambiente di produzione e indagini sul personale addetto nonch controlli sull applicazione dei programmi di HACCP che le aziende predispongono per l individuazione dei punti critici della catena produttiva Il controllo prevede attivit ispettive prelievo dei campioni e successiva analisi dei medesimi Gli accertamenti analitici so
355. ono stati macellati e di ciascuno le porzioni muscolari e adipose sono state lavorate per 47 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev la preparazione di alcuni prodotti tipici quali salame pancetta coppa e prosciutto crudo Le spezie usate per la preparazione dei prodotti stagionati sono risultate non contaminate da OTA I prodotti sono stati successivamente stagionati in tre impianti industriali per tempi diversi 50 giorni per i salami 4 6 e 14 mesi rispettivamente per le pancette le coppe e i prosciutti Dai tessuti muscolari adiposi e dai prodotti stagionati sono stati prelevati campioni di 200 g per la determinazione dell OTA per i prosciutti l analisi stata condotta sia su un campione relativo alla parte interna sia su uno prelevato in vari punti 1 cm sotto la superficie I campioni sono stati conservati a 20 C fino al momento dell analisi Analisi dell OTA L estrazione di OTA nei campioni stata effettuata mediante digestione enzimatica del campione con pancreatina 5 Per avere un campione il pi possibile omogeneo ai campioni esterni di prosciutto crudo prima dell estrazione stato aggiunto lentamente un volume noto di H2O distillata sotto continua agitazione fino ad ottenere una pasta omogenea slurry Ad un aliquota di 5 g di campione o di una quantit di slurry equivalente a 5 g di campione iniziale pesati in un provettone da centrifuga da 250 mL sono stati aggiunti 100 mL di soluzione di pancreatina all
356. onomici L obiettivo della ricerca quello di studiare gli effetti del terreno sulla resistenza sensibilit della vite all attacco del fungo ocratissigeno Aspergillus carbonarius sulla produzione di OTA Pochi sono i dati sperimentali sull effetto del suolo alcune ricerche ancora in fase preliminare 4 hanno dimostrato come il suolo calcareo sia in grado di indurre assieme a gravi sintomi di clorosi fogliare un maggiore accumulo di OTA nell uva rispetto ad un suolo neutro Sono note invece le interazioni dell ambiente sul genotipo e come a parit di genotipo l espressione dei risultati quali quantitativi possa essere influenzata dallo stesso Materiali e metodi La seguente ricerca stata condotta su due siti sperimentali Tesi A Contrada Casale Marsala TP e Tesi B Contrada Biesina Marsala TP distinti per condizioni pedologiche nello specifico per il diverso contenuto calcareo del suolo La cultivar a bacca rossa Nero d Avola innestata sullo stesso portinnesto 140 Ru stata individuata per la prova perch 33 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev ampiamente diffusa in Sicilia Il microclima dei due ambienti stato caratterizzato recependo i dati dalle stazioni del servizio agrometereologico della Regione Sicilia SIAS Il campionamento del suolo mediante carotaggio stato utilizzato per rilevare le caratteristiche chimico fisiche del terreno Sulle piante sono stati valutati visivamente i sintomi
357. opea ha pertanto stabilito i livelli massimi ammissibili in cereali e prodotti derivati per tutte le principali micotossine ovvero Aflatossine Ocratossina A Fumonisine Zearalenone e Deossinivalenolo 2 3 mentre i limiti per le Tossine T 2 e HT 2 sono attualmente in discussione e saranno emanati a breve Per assicurare il rispetto della legislazione e per proteggere il consumatore lo sviluppo di metodiche analitiche sensibili robuste ed affidabili per la determinazione di micotossine nelle varie matrici agroalimentari in continua evoluzione 4 Negli ultimi decenni la cromatografia liquida ad alte prestazioni HPLC High Performance Liquid Chromatography diventata la tecnica pi ampiamente utilizzata per l analisi delle micotossine sottoposte a regolamentazione in alimenti e mangimi In questo contesto l utilizzo dello spettrometro di massa come rivelatore HPLC ne aumenta ulteriormente le potenzialit offrendo la possibilit di ottenere determinazione quantitativa e conferma univoca in un unica analisi La diffusione di questa tecnica ha aperto inoltre la strada allo sviluppo di metodiche multi residuali per la determinazione simultanea di micotossine appartenenti a diverse famiglie Tuttavia le recenti pubblicazioni in merito mettono in evidenza come queste metodiche non siano facili da sviluppare proprio in ragione delle diverse propriet chimico fisiche delle varie micotossine che devono essere attentamente gestite in tutte le f
358. opo precipitazione i campioni sono stati caricati su gel di acrilammide e trasferiti elettroforeticamente ad una membrane di nylon caricata positivamente BrightStar Plus Ambion Inc Austin Texas USA Per la quantificazione del RNA messaggero per GSH Px SOD quantita note di RNA sintetizzato in vitro sono state ibridizzate con un eccesso di sonde anti senso marcate per la costruzione di curve standard L RNA messaggero stato cross legato alla membrana dopo il trasferimento La rivelazione non isotopica delle sonde protette stata effettuata usando i kit BrightStar e BioDetect Ambion Inc Austin TX USA Infine la chemioluminescenza stata analizzata con un densitometro Kodak EDAS 290 e relativo software ID Image Analysis Eastman Kodak Company Rochester NY USA I dati ottenuti sono stati trasformati in quantit assolute di mRNA pg 10ug RNA totale mediante curve standard Tutti i dati sono stati analizzati mediante la procedura GLM del SAS SAS 1999 I quantitativi di GSH Px e SOD mRNA sono stati sottoposti a log trasformazione prima dell analisi statistica Il modello ha incluso come effetti fissi l animale il trattamento micotossina il livello d esposizione la durata e l errore residuale Le differenze sono state considerate significative per P lt 0 05 Risultati e discussione Un significativo incremento del livello dei ROM intracellulari stato osservato alla pi elevata concentrazione
359. ordinamento nella loro sfera di competenza delle attivit dei laboratori ufficiali responsabili delle analisi del controllo ufficiale Nelle sua veste istituzionale gi da molti anni il Reparto Organismi Geneticamente Modificati e Xenobiotici di Origine Fungina ha istaurato con le realt dei laboratori pubblici coinvolti nel controllo ufficiale rapporti di collaborazione che si sono consolidati nel tempo oggi anche come LNR Micotossine prosegue tale attivit con la finalit di informare formare e supportare le strutture di laboratorio a cui affiancare una reale attivit di coordinamento in un momento cruciale di generale riorganizzazione di tutto l impianto delle attivit di controllo ufficiale degli alimenti e mangimi in Italia L attivit di programmazione iniziata con una prima riunione tenutasi nel marzo 2009 che ha aperto un tavolo di comunicazione con gli Istituti Zooprofilattici Sperimentali IZS i Laboratori periferici e le ASL e che proseguir con appuntamento annuale Durante la prima riunione si sono acquisite informazioni tecniche per avere informazioni generali sulla tipologia di strumentazione in dotazione e sui metodi di analisi in uso presso tali laboratori Si per questo distribuito un questionario per raccogliere non solo informazioni generali ma anche per fare esplicita richiesta riguardo le necessit e priorit per ci che riguarda i proficiency testing o studi di validazione da organizzare Resoconto dei da
360. orie di fatto nei disciplinari biologici sono elementi di primaria importanza per il contenimento delle fusariosi e quindi delle relative micotossine al fine di ottenere una materia prima con elevate caratteristiche qualitative soprattutto per quanto riguarda gli aspetti igienico sanitari che della qualit costituiscono il requisito pi importante Bibliografia 1 D Egidio MG Aureli G Quaranta F Cecchini C Melloni S Moscaritolo S Safety and quality of durum wheat from organic crop in Italy Tecnica Molitoria International 2009 60 10 A 79 88 2 Unione Europea Regolamento CEE dell 8 febbraio 1993 n 315 che stabilisce le procedure comunitarie relative ai contaminanti nei prodotti alimentari GUCE L 37 13 febbraio 1993 3 Edwards SG Barrier Guilliot B Clasen P E Hietaniemi V Pettersson H Emerging issues of HT 2 and T 2 toxins in European cereal production World Mycotoxin Journal 2009 2 173 9 4 Miller JD Mycotoxins in small grains and maize Old problems new challenge Food Additives and Contaminants 2008 25 2 219 30 5 Rocha O Ansari K Doohan FM Effects of trichothecene mycotoxins on eukaryotic cells A review Food Additives and Contaminants 2005 22 4 369 78 6 Unione Europea Regolamento EC n 1881 del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari GUCE L 364 5 20 dicembre 2006 7 Unione Europea Raccomandazione n 583 del 17 agosto 2006 sulla preven
361. ormaggio avviene su latte di massa e non su latte individuale appare chiaro che tali valori percentuali possono essere considerati non significativi Infatti indagini effettuate su latte di massa per azienda non hanno mostrato alcuna positivita Per completezza dei risultati si riportano che il 48 dei campioni hanno mostrato valori di AFM inferiori a 0 02 mg kg il 20 valori tra 0 02 e 0 03 mg kg e il 4 tra 0 03 e 0 05 mg kg Analisi campioni di sangue per la determinazione del profilo metabolico Si riporta di seguito la Tabella relativa ai dosaggi dei principali parametri ematochimici rappresentativi dei diversi metabolismi Tabella 4 Tabella 4 Alcuni parametri del profilo metabolico di campioni di sangue media e DS Azienda Urea Glucosio Creatinine AST ALT mg dL mmol L mol L UI L UI L A 54 62 8 12 3 34 0 26 137 43 16 79 157 01 25 87 66 49 8 58 B 56 40 9 41 3 36 0 95 136 27 18 36 158 08 26 13 65 85 9 24 C 50 90 7 67 3 41 0 64 127 55 16 57 165 77 27 67 66 15 10 7 D 50 62 8 25 3 34 0 71 129 78 15 32 161 87 29 92 67 53 9 15 E 51 25 8 16 3 43 0 68 130 54 16 24 160 39 26 15 66 58 8 57 F 54 12 7 59 3 39 0 59 131 01 14 39 159 87 24 31 65 97 7 89 G 52 36 8 23 3 25 0 71 129 69 14 27 161 05 20 98 65 47 9 02 H 53 16 6 98 3 15 0 70 130 03 15 63 160 34 21 39 63 21 7 96 Dall esame della tabella appare evidente che non sono risultate differenze significative tra le aziende anche se le aziende A e B hanno mostrato valori significativament
362. oro 4 dove viene sottolineato che l idoneit di un RM per un determinato scopo deve essere valutata caso per caso e che la qualit di un RM strettamente connessa allo specifico impiego e alle condizioni di utilizzo Ad esempio l omogeneit va valutata in relazione alla dimensione dell aliquota analitica e la scelta tra Matrix RM o sostanza pura per la taratura va effettuata tenendo conto delle potenziali interferenze di matrice e del contributo all incertezza finale In linea generale infatti le sostanze pure possono essere certificate con un metodo primario o attraverso misure direttamente riferibili al Sistema Internazionale SI durante il processo stesso di preparazione 8 e quindi il loro utilizzo nella taratura comporta un minore contributo all incertezza rispetto all impiego dei Matrix CRM la cui certificazione avviene nella maggior parte dei casi attraverso l analisi statistica dei risultati di un interlaboratorio Controlli per l individuazione e la determinazione quantitativa di micotossine si rendono necessari lungo l intera filiera agroalimentare e zootecnica essi devono riguardare sia la produzione primaria che i processi agro industriali e devono essere condotti su alimenti bevande e mangimi a livello di materie prime prodotti intermedi e finali Considerando la molteplicit degli analiti e la variet delle matrici per stato fisico e composizione l effettuazione di questi controlli richiede una grande
363. otti di trasformazione consumati principalmente da bambini Per assicurare la qualit e la salubrit di frutti e succhi quindi fondamentale disporre di un rapido e specifico metodo di rilevamento di tale patogeno che consenta di accertarne tempestivamente la presenza e di adottare le opportune misure di sanificazione L obiettivo di tale lavoro stato quello di sviluppare e ottimizzare un saggio basato su Polymerase Chain Reaction Real Time PCR Real Time metodica maggiormente sensibile rispetto alla PCR classica per il precoce rilevamento di Penicillium expansum su mele Materiali e metodi Inoculo di Penicillium expansum su mele Mediante carotatore sterile sono state fatte quattro ferite 6 mm x 3 mm nella zona circostante il picciolo di mele cv Golden delicious precedentemente sterilizzate e sono state inoculate con 15 uL di una sospensione acquosa contenente 5 10 conidi di P expansum Le ferite non inoculate hanno costituito il controllo Le mele sono state incubate a 25 C e 90 di umidit relativa per 6 12 24 48 72 96 120 ore Estrazione del DNA Le ferite di mela recuperate tramite carotatore sterile sono state liofilizzate e sottoposte ad estrazione del DNA utilizzando il metodo TRIS SDS Lysis Buffer 2 con alcune modifiche stato inoltre estratto il DNA direttamente da mele acquistate in diversi punti vendita provenienti sia da agricoltura biologica che convenzionale integre e prive di alcun segno di
364. ovenienti dal circuito commerciale dimostrano una discreta variazione tra i valori di B Bo delle varie tipologie di campioni e dei rispettivi addizionati confermando le potenzialit di applicabilit del nuovo sistema ELISA ad una analisi di screening attitudine gi dimostrata dal sistema durante le prime prove di ripetibilit Tabella 2 Analisi preliminare di alcuni campioni a contenuti variabili di cacao addizionati a diversi livelli di OTA 0 5 pg kg 1 0 pg kg e 2 0 pg kg Campione 0D1 0D2 MEDIA DS CV B B0 di cacao Camp G 30 1230 1272 1251 29 2 4 79 7 Camp G 0 5 ug kg 1011 959 985 36 3 7 62 1 Camp G 1 0 ug kg 902 852 877 35 4 0 55 0 Camp G 2 0 g kg 681 661 671 14 2 1 41 3 Camp N 30 1181 1168 1175 9 0 8 74 6 Camp N 0 5 ug kg 928 958 943 21 2 2 59 3 Camp N 1 0 pg kg 839 811 825 19 2 4 51 5 Camp N 2 0 pg kg 626 618 622 5 0 9 38 1 Camp L 30 993 1013 1003 14 1 4 63 3 Camp L 0 5 ug kg 922 924 923 1 0 2 58 0 Camp L 1 0 pg kg 814 802 808 8 1 1 50 4 Camp L 2 0 ug kg 726 587 657 98 15 0 40 4 Camp Z 50 835 887 865 27 3 1 82 0 Camp Z 0 5 ug kg 655 689 672 24 3 6 63 0 Camp Z 1 0 ug kg 561 591 578 15 2 7 53 0 Camp R 71 923 896 910 19 2 1 87 0 Camp R 0 5 ug kg 774 810 792 25 3 2 75 0 Camp R 1 0 ug kg 634 642 638 5 0 9 59 0 valori di OD sono moltiplicati per 1000 242 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Conclusioni Come si puo vedere dalla Figura 1 il nuov
365. oxin A in healthy adults in Tuscany Correlation with individual characteristics and between repeat measurements Cancer Epidemiol Biomarkers 1999 Prev 8 265 9 3 Hassen W Abid S Achour A Creppy E Bacha H Ochratoxin A and 2 microglobulinuria in healthy individuals and in chronic interstitial nephropathy patients in the Centre of Tunisia a hot spot of Ochratoxin exposure Toxicology 2004 199 185 93 4 Dinis AM Lino CM Pena AS Ochratoxin A in nephropathic patients from two cities of central zone in Portugal Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2007 44 2 553 7 5 Grosso F Said S Mabrouk I Fremy JM Castegnaro M Jemmali M Dragacci S New data on the occurrence of ochratoxin A in Human sera from patiets afflected or not by renal diseases in Tunisia Food and Chemical Toxicology 2003 41 1133 40 Ringraziamenti Si ringrazia la Fondazione Romeo ed Enrica Invernizzi che ha finanziato la ricerca Rapporti ISTISAN 10 32 Rev VALUTAZIONE IN VITRO DELL ESPOSIZIONE ALLE MICOTOSSINE SULLO STATO OSSIDATIVO DI LINFOCITI DEL BOVINO DA LATTE Umberto Bernabucci Loredana Basiric Pier Paolo Danieli Bruno Ronchi Dipartimento di Produzioni Animali Universit della Tuscia Viterbo Introduzione Le micotossine sono metaboliti secondari prodotti da muffe e rilasciati negli alimenti e nei mangimi Le micotossine a seguito d ingestione contatto e inalazione possono essere causa di numerose manifestazioni a carattere p
366. per micotossine Generalmente i prodotti notificati per micotossine hanno origine extracominutaria come Turchia USA Iran Argentina Cina brasile India Egitto ecc La maggior parte dei prodotti notificati per micotossine hanno origine extracomunitaria in particolare provenienti da Turchia USA Iran Argentina Cina India ed Egitto Le Aflatossine sono state riscontrate principalmente nella frutta secca spezie e cereali L Ocratossina A principalmente nel cacao e caff Per le altre micotossine le notifiche si riferiscono allo Zearalenone e Fumonisine principalmente nel mais Deossinivalenolo nel grano e Patulina succhi di mele e omogeneizzati 62 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Controlli alle frontiere Come precedentemente accennato il Ministero della Salute effettua l attivit di controllo alle frontiere attraverso i propri Uffici territoriali gli USMAF ai quali spettano i controlli sui prodotti di origine non animale e gli Uffici Veterinari Periferici i PIF e gli UVAC Per quanto riguarda l attivit di controllo degli Uffici Veterinari Periferici occorre distinguere fra l attivit dei P I F relativa a partite di alimenti di origine animale animali vivi e mangimi provenienti da Paesi Terzi e l attivit degli UVAC relativa a partite di alimenti di origine animale e animali vivi provenienti dagli altri Paesi dell Unione Europea Nel primo caso si tratta di un controllo obbligatorio di carattere sistematico
367. protocollo di preparazione del campione per estrarre le tossine dalle diverse matrici oltre alla capacit delle colonne ad immunoaffinit di catturare le 5 tossine quando sono esposte a campioni di estratti diluiti Tabella 2 Recuperi medi n 6 su campioni di matrici reali Tipo di Livello di Recupero medio RSD matrice arricchimento g kg AF OTA AFB AFB2 AFG AFG2 OTA Mais 10 3 86 5 93 1 86 3 87 4 102 5 3 7 5 5 Grano 4 3 100 8 104 4 104 3 105 9 104 4 1 2 3 4 Pepe nero 10 15 88 1 90 3 81 2 79 0 90 6 2 6 4 4 Paprika 40 50 92 5 94 9 98 1 91 0 81 0 0 7 2 3 Uva sultanina 4 10 84 3 84 8 77 1 78 0 87 9 2 6 3 8 Fichi secchi 10 10 86 2 85 4 83 9 81 5 93 7 4 0 5 2 Valori di recupero ottenuti da campioni FAPAS Per tutti i materiali di riferimento FAPAS Tabelle 3 e 4 il quantitativo di tossine recuperato entro i limiti accettabili per le 5 tossine singole e per le AF totali Tabella 3 Risultati dell applicazione del metodo per la determinazione di OTA per i materiali di riferimento del circuito FAPAS Matrice Intervallo FAPAS AFLAOCHRA PREP RSD codice circuito g kg mg kg ug kg Succo di uva sultanina T1760 5 31 13 66 11 1 0 6 Paprika T1763 11 90 30 70 28 5 0 3 Tabella 4 Risultati dell applicazione del metodo per la determinazione di AF per i materiali di riferimento del circuito FAPAS Matrice Micotossina Intervallo FAPAS AFLAOCHRA PREP RSD ug kg codice circuito ug kg g kg Ma
368. questranti di Aflatossine miscelandoli con l alimento contaminato La miscelazione dei sequestranti deve essere molto accurata perch la loro efficacia direttamente collegata alla possibilit di contatto tra la tossina e il sequestrante Attenzione l aggiunta di sequestranti nel carro miscelatore non efficace Bibliografia 1 Council for Agricultural Science and Technology Mycotoxin economic and healths risks Ames IA CAST 1989 Task force report 116 2 Whitlow LW Hagler WMJr Mycotoxin contamination In Van Horn HH Wilcox CJ Ed Large dairy herd management Champaign IL American Dairy Science Association 1992 p 585 3 Coulomb RA Jr Biological action of mycotoxins Journal of Dairy Science 1993 76 880 91 4 Guthrie L D Effects of aflatoxin in corn on production and reproduction in dairy cattle Journal of Dairy Science 1979 62 1 134 5 5 Bodine AB Mertens DR Toxicology metabolism and physiological effects of aflatoxins in the bovine In Diener UL Asquith RL Dickens JW Ed Aflatoxin and Aspergillus flavus in corn Auburn Ala Department of Research Information Alabama Agricultural Experiment Station Auburn University 1983 p 46 58 101 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 6 AOAC Official Methods of Analysis Association Official Analysis chemical 16 ed rev 4 Washington DC AOAC 1998 7 Bhandari SK Ominski KH Wittenberg KM Plaizier JC Effect of choplenght of alfalfa and corn silage on
369. r Cecilia Per favorire lo sviluppo fungino i campioni di mais sono stati umidificati al 30 per aggiunta di acqua distillata Sistema per la spettroscopia d immagine Nei nostri esperimenti stato utilizzato un Desktop Spectral Scanner basato su uno Spettrometro di Immagine ImSpector V10 prodotto dalla SpecImTM operante nell intervallo spettrale visibile vicino infrarosso 400 1000 nm e su un software per l elaborazione dei dati spettrali Spectral Scanner v 2 0 DV srl 2003 Le analisi spettrali sui funghi tossigeni e sul mais sono state condotte in condizioni di riflettanza misurando cio l intensit della luce riflessa dal campione sottoposto ad analisi rispetto all intensit della luce incidente su di esso Risultati e discussione Acquisizione delle immagini spettrali da mais non contaminato Ibridi di mais differenti presentano profili spettrali sovrapponibili nella regione spettrale del Vicino Infrarosso 850 950 nm mentre nella regione del visibile 500 700 nm mostrano profili spettrali che possono differire in maniera anche significativa ANOVA Fisher s LSD test in funzione della colorazione delle cariossidi La Figura 1 riporta a titolo di esempio lo spettro di fiflettanza di cariossidi dell ibrido di mais Cecilia 1 8 1 0 0 2 log 1 R 0 6 1 4 400 500 600 700 800 900 1000 lunghezza d onda nm Figura 1 Spettro di riflettanza di cariossidi di ibrido di mais Cecilia non contaminato
370. r importanza per diffusione e quantit il Deossinivalenolo DON Il DON stato classificato dallo IARC nel gruppo 3 sostanza non cancerogena per l uomo Per il DON nella UE in vigore un limite di 500 ug kg per prodotti da forno e i cereali da colazione Nella presente ricerca stato effettuato un monitoraggio sulla contaminazione da OTA e da alcuni TCT DON 3 Ac DON 15 Ac DON Nivalenolo NIV tossine HT 2 e T 2 di campioni di biscotti prelevati al dettaglio Materiali e metodi Prelevamento campioni Da aprile 2007 a marzo 2008 sono stati prelevati con cadenza mensile campioni di biscotti tipo frollini di 5 diverse marche italiane A B C D E Quattro di queste A B C D sono aziende leader del mercato mentre una E presente solo in punti vendita Hard Discount I campioni del peso minimo di 500 g sono stati macinati e conservati a 20 C fino al momento dell analisi Analisi di OTA L OTA stata estratta da 10 g di campione macinato con 100 mL di miscela CH OH soluzione acquosa di NaHCO al 3 50 50 v v agitando per 45 minuti 1 Dopo filtrazione su filtro a pieghe 5 mL del filtrato sono stati diluiti a 50 mL con tampone fosfato 10 mM pH 7 4 PBS Phosphate Buffered Saline e la soluzione stata fatta passare su colonna di immunoaffinit Effettuato un lavaggio con 5 mL di PBS POTA stata eluita in provetta graduata con 3 mL di CH CN Dopo avere concentrato l estratto sotto flusso di N3 lo si
371. ra Alla luce di questi dati si pu dire che 10 anni di lavoro hanno permesso a Newlat non solo di controllare il fenomeno della contaminazione dell Aflatossina M1 AFM nel latte ma di incrementarne notevolmente la qualit fornendo un prodotto altamente sicuro e a far s che tale problema sia passato dall essere un emergenza ad essere una fenomeno sotto controllo Tecniche d analisi e gestione del rischio Le prime analisi dell AFM nel latte erano difficili e costose e si facevano essenzialmente in High Performance Liquid Chromatography HPLC mediante l utilizzo di colonnine ad immunoaffinit poich altri metodi cosiddetti rapidi o di screening erano poco diffusi o non pienamente affidabili L analisi in HPLC era quella in grado di fornire i risultati pi attendibili richiedeva per una strumentazione costosa tecnici adeguatamente preparati e tempi lunghi di realizzazione per ogni campione erano necessari infatti circa 90 minuti prima di avere il risultato A questo periodo risale la decisione di Newlat di porre un limite interno sul contenuto di AFM nel latte crudo in arrivo 20 ng kg contro i 50 ng kg previsti dalla legge fornendo per 134 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev contro agli allevatori la possibilita di far analizzare i propri mangimi relativamente al contenuto di Aflatossina B AFB che fonte della contaminazione del latte Tale restrizione ha dapprima creato problemi con gli allevatori percepita
372. re Diode Array Diode Array Detector DAD i criteri sono rivelazione UV VIS a scansione totale Amax nello spettro dell analita Amax dello standard di taratura 2 nm La differenza osservata tra i due spettri non superiore in alcun punto al 10 dell assorbanza dello standard di taratura rivelazione fluorimetrica FLD si applica alle molecole che presentano fluorescenza nativa e alle molecole che presentano fluorescenza dopo trasformazione o derivatizzazione Cromatografia liquida spettrometria di massa e gascromatografia spettrometria di massa adottato il criterio dei punti di identificazione Identification Point IP introdotto dalla Decisione 2002 657 CE secondo il quale ad ogni ione diagnostico attribuito un coefficiente Per le sostanze di categoria B come le micotossine sono necessari 3 IP per la conferma in spettrometria di massa MS secondo lo schema seguente Tecnica MS IP per ione Spettrometria di massa a bassa risoluzione LR 1 0 LR MS ione precursore 1 0 LR MS prodotti di transizione 1 5 112 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Linearita della risposta strumentale Per valutare la linearita della risposta strumentale possono essere seguite queste indicazioni Curve di taratura in solvente sono calcolate riportando la Conc vs rapporto segnale dell analita segnale dello standard interno SI se si utilizza uno standard interno di riferimento quantitativo oppure Conc vs segnale dell
373. re dal 2004 sono drasticamente diminuiti i campioni di pistacchi mentre sono aumentati quelli di nocciole Relativamente a tali categorie si effettua un analisi pi approfondita sui risultati analitici ottenuti Per quanto riguarda l Ocratossina A l unica matrice sulla quale sono state riscontrate non conformit l uva sultanina nel 2002 vedi Tabella 4 In Figura la riportato il numero di campioni di arachidi analizzati suddivisi in conformi e non conformi con le percentuali di questi ultimi I campioni di arachidi sono sempre elevati 50 70 dei campioni per la ricerca di Aflatossine si osserva tuttavia un calo delle partite di merce controllate 132 campioni nel 2001 250 nel 2002 110 120 negli anni 2003 2005 circa 100 nel 2006 e 2007 solo 77 nel 2008 Sono cambiati nel corso degli anni i paesi di origine Israele ed Etiopia sono i principali paesi di provenienza nel 2001 a partire dal 2002 si sono aggiunti Egitto e Cina dal 2003 l Egitto il principale paese da cui provengono le derrate di arachidi La percentuale di campioni non conformi aumentata passando da 1 nel 2001 e 2002 a 6 8 nel 2004 2005 e 2007 nel 2006 e 2008 si sono raggiunte percentuali di non conformit pari a 22 25 La concentrazione di Aflatossina Bj aumentata Negli anni 2001 2004 si sono in genere osservati livelli inferiori ai 10 ug kg mentre dal 2005 si sono presentati sempre pi casi di contaminazioni a concentrazioni superiori a 30 ug
374. re il pH a 9 8 Portare al volume finale di 500 mL Tampone Borato sciogliere 3 09 g di HBO in 300 mL di acqua aggiustare il pH a 9 5 con NaOH 6 M portare al volume finale di 0 5 L Tampone Tris idrossimetil amminometano sciogliere 4 85 g in 0 1 L d acqua e aggiustare il pH con HCI 6M Portare al volume finale di 0 2 L con acqua Soluzione TRIS Albumina da Siero Bovino BSA 0 1 Soluzione tampone PBS Tween 20 0 05 Soluzione PBS BSA 0 1 Soluzione PBS BSA 0 1 NaN 0 02 Acetonitrile per HPLC Metanolo per HPLC Solvente di estrazione acetonitrile acqua 84 16 Solvente di estrazione metanolo acqua 80 20 Soluzione di bloccaggio sciogliere 0 2 g di latte in polvere totalmente scremato in 20 mL di PBS Soluzione substrato enzimatico 1 Naftil fosfato in DEA 1mg mL Materiale di riferimento Tossina T 2 in polvere Materiale di riferimento Tossina HT 2 in polvere Soluzione standard madre di Tossina T 2 1 mg mL in aceto nitrile Soluzione standard madre di Tossina HT 2 1 mg mL in aceto nitrile 160 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Soluzione standard di lavoro di Tossina HT 2 prelevare 20 uL della soluzione r e trasferirli in un matraccio tarato da 2 mL contenente circa 1 mL di acetonitrile Dopo l aggiunta portare al volume finale di 2 mL con aceto nitrile Soluzioni standard di taratura di Tossina HT 2 prelevare dal
375. re quota di rischio Tra le materie prime il mais da considerarsi il cereale pi a rischio per la contaminazione da micotossine in considerazione della possibilit della presenza contemporanea di diverse micotossine a concentrazioni tali da costituire fonte di rischio per gli animali e per l uomo nel caso di trasferimento delle tossine agli alimenti di origine animale Nell ambito della sorveglianza il piano dunque si prefigge molteplici obiettivi al fine di ottenere una stima dei livelli di contaminazione sul territorio nazionale a la definizione un programma di campionamento omogeneo sul territorio al fine di verificare l eterogeneit regionale al rischio di contaminazione da micotossine b la definizione dello stato di contaminazione da micotossine non normate su materie prime finalizzata ad evidenziare prevalenze riferibili a specifiche produzioni utilizzate in aree geografiche pi suscettibili a rischio c la valutazione la compresenza di pi micotossine nello stesso campione per raccogliere informazioni su potenziali effetti tossici derivanti dall azione sinergica di pi micotossine nello stesso campione d la ricerca su campioni di avena e grano e sui mangimi contenenti tali materie prime la presenza di Tossine T 2 e HT 2 al fine di definire lo stato di contaminazione per tali tossine a livello nazionale Dato che allo stato attuale non sembra essere disponibile un metodo di analisi affidabile in termini di ripet
376. re separatamente le diverse Aflatossine requisito indispensabile quando necessario accertare il livello della sola AFB come nel caso degli alimenti per uso zootecnico Nel presente lavoro riportata la procedura di validazione del metodo analitico High Performance Liquid Chromatography HPLC con derivatizzazione fotochimica post colonna per la determinazione delle AFB AFB AFG e AFG nei prodotti alimentari e nelle materie prime per mangimi 9 I requisiti del metodo analitico sono stati verificati tramite una procedura di validazione eseguita in accordo con quanto definito nel Reg CE 882 2004 10 che consente di integrare il Reg CE 401 2006 11 con i protocolli europei in materia di validazione riportati nella Decisione 657 2002 12 230 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Materiali e metodi Reagenti Metanolo acetonitrile acqua per HPLC sono satti acquistati dalla Baker Deventer Olanda cloruro di sodio cloruro di potassio fosfato bibasico di sodio monoidrato fosfato monobasico di potassio e TWEEN 20 dalla Sigma Aldrich Germania colonnine ad immunoaffinita AflaCLEAN da LCTech GmbH Dorfen Germania Le soluzioni standard delle AFB AFB AFG e AFG sono state acquistate dalla Riedel de Ha n Sigma Aldrich Laborchemikalien Seelze Germania Apparecchiatura L apparecchiatura utilizzata stata un cromatografo liquido Agilent Technologies SL 1200 Series Waldbronn Germania corredato di rivelatore fluori
377. relativi fortificati a 100 ug kg con ZEA Dato l elevato numero di prove sono state eseguite 2 sedute analitiche I dati sono riassunti in Tabella 1 190 Tabella 1 Specificita del kit ELISA per la determinazione di ZEA nella prima e seconda seduta analitica Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Campione Tipo campione B B0 B B0 Bianco campione Fortificati Prima seduta 1 Avena 116 40 36 39 2 Avena 117 90 38 76 3 Orzo 119 49 36 97 4 Orzo 105 01 31 86 5 Grano duro 118 00 36 52 6 Grano duro 118 68 33 07 7 Grano duro 119 40 35 18 8 Grano tenero 114 90 31 86 9 Grano tenero 114 84 34 01 10 Grano tenero 118 00 34 66 media 116 26 34 93 deviazione standard 4 28 2 27 varianza 18 31 5 15 Seconda seduta 11 Avena 116 91 36 70 12 Avena 105 87 32 20 13 Orzo 118 61 36 87 14 Orzo 117 63 38 92 15 Grano duro 119 20 37 13 16 Grano duro 115 51 32 20 17 Grano duro 115 15 34 22 18 Grano tenero 118 71 33 21 19 Grano tenero 119 69 35 30 20 Grano tenero 118 15 34 84 media 116 54 35 16 deviazione standard 4 03 2 25 varianza 16 02 5 06 Analisi statistica L analisi statistica stata condotta con un programma computerizzato calcolando la varianza ANOVA test il test di Fisher il test di Student Le variabili sono state modificate utilizzando piani sperimentali secondo la procedura elaborata da Youden Tabella 2 Il metodo risultato robusto per i parametri preparazione del campione apertura kit filtrazione campioni temperatura
378. remento significativo del tenore di Fumonisine Tale riduzione varia dal 30 per il solo processo di estrusione al 60 70 per il processo completo di estrusione e tostatura 13 Per questi prodotti stata riscontrata una minore incidenza di contaminazione e l assenza di positivit Tra i campioni analizzati quelli provenienti da agricoltura biologica hanno presentato una maggiore percentuale di contaminazione da Fumonisine Conclusioni Nel presente lavoro di ricerca stato messo a punto e ottimizzato un metodo analitico rapido sensibile e automatizzato per la determinazione delle FB e FB2 in prodotti alimentari destinati al consumo umano Il metodo basato sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni abbinata alla rivelazione fluorimetrica previa derivatizzazione chimica post colonna mediante o ftalaldeide e Thiofluor Il metodo ottimizzato si dimostrato semplice affidabile e altamente sensibile e consente di ottenere una elevata riproducibilit di analisi La validazione eseguita in accordo con quanto definito nel Reg CE 822 2004 ha dimostrato la rispondenza dei requisiti analitici del metodo ai criteri previsti nel Reg CE 401 2006 confermandone l affidabilit nella valutazione della contaminazione da Fumonisine nei prodotti alimentari a base di mais nelle analisi di controllo ufficiale Dall indagine svolta sui 100 prodotti alimentari emerso che il 54 dei campioni analizzati risulta contaminato da Fumonisine ad
379. rezza alimentare l analisi di prodotti per la rilevazione di contaminanti una pratica di importanza cruciale per garantire la sicurezza e la qualit degli stessi In letteratura sono riportati gli effetti negativi dell OTA sulla salute umana quali l azione nefrotossica epatotossica teratogena e immunodepressiva 1 A conferma di ci alcuni dati tossicologici derivati da studi condotti su animali hanno dimostrato che vi correlazione fra la presenza di micotossine e l insorgenza di alcune forme tumorali e o di altre patologie altrettanto gravi 2 Dalla IARC International Agency for Research on Cancer suddetta tossina stata inserita nel gruppo 2B cio possibile agente cancerogeno per l uomo 3 La dose giornaliera tollerabile estremamente bassa quella massima giornaliera ritenuta di 0 1 ug kg di peso corporeo A tal proposito l Unione Europea ha provveduto mediante il Reg CE 1881 2006 a stabilirne il tenore massimo assimilabile in 2 ug L per il vino il mosto e le bevande a base di succo d uva A tal proposito opportuno effettuare analisi mirate a prevenirne la causa gi a partire dal pieno campo e nel caso specifico riferito al settore enologico dal vigneto Le analisi estese a tutta la filiera vitivinicola permettono di correlare non solo gli aspetti prettamente enologici ma anche tutti i principali fattori responsabili di eventuali contaminazioni come quelli pedoclimatici ambientali e tecnico agr
380. ri sono stati determinati sul siero usando il Reflotron Boehringer Ingelheim Germania Risultati e discussione Determinazione della composizione chimico nutrizionale degli insilati L analisi chimico nutrizionale Tabella 1 degli insilati raccolti nelle aziende considerate risultata essere nella media del buon insilato a dimostrazione della seria pratica agronomica effettuata dagli allevatori Le determinazioni del pH e del potere tampone sono state effettuate su estratti acquosi degli insilati appena campionati I risultati ottenuti Tabella 1 sono risultati essere nella media dei valori riportati in bibliografia Tabella1 Valori medi con le rispettive deviazioni standard della composizione chimica del pH e del potere tampone degli insilati campionati Parametri degli insilati Valore Sostanza secca 28 36 3 54 Ceneri 6 24 1 14 Proteine grezze 7 68 1 87 Lipidi grezzi 2 26 0 74 NDF 45 36 4 86 ADF 27 89 3 67 ADL 3 75 0 97 pH 4 24 0 65 Potere tampone 67 72 28 46 Determinazione degli acidi grassi volatili La determinazione degli acidi grassi volatili stata effettuata su estratti solforici ottenuti su campioni freschi nello stesso giorno del campionamento Gran parte degli insilati ha mostrato una composizione in acidi grassi volatili nella norma dei buoni insilati In qualche caso dove anche a livello macroscopico vi era la presenza di muffe e o di un cappello visibile sulla superfice superiore del silos sono stat
381. ri studiati le caratteristiche climatiche dell annata agraria e l areale di coltivazione rappresentano i fattori di incidenza pi importanti sul livello di contaminazione da DON il frumento duro maggiormente suscettibile all accumulo di DON al Centro rispetto al Sud dove peraltro i livelli di micotossina sono molto contenuti il metodo di coltivazione risultato avere minore importanza nell influenzare il livello di contaminazione ma con risultati sempre migliori adottando tecniche biologiche la scelta varietale risultata il fattore di minor peso comunque significativo e legato all espressione genetica di diversi livelli di suscettibilit Le cultivar Creso e Claudio hanno evidenziato livelli di contaminazione pi bassi In conclusione il lavoro svolto ha fornito dei risultati che possono avere una ricaduta positiva nell approccio ai problemi relativi alla valutazione del rischio di contaminazione da micotossine L ipotesi di maggiori livelli di DON nei campioni di frumento duro in coltura biologica sembrerebbe non suffragata dai risultati sperimentali di questo lavoro svolto in pi ambienti e anni anzi si verificata una minor contaminazione rispetto al convenzionale stata inoltre confermata l importanza della vocazionalit delle zone meridionali e insulari italiane per la coltivazione del frumento duro coltura insostituibile per l economia locale Le buone tecniche agronomiche obbligat
382. ricoteceni conosciuti sono stati suddivisi in quattro gruppi principali in funzione della loro struttura chimica tra questi i Tricoteceni di tipo A in particolare T 2 e HT 2 e di tipo B in particolare DON e Nivalenolo rappresentano quelli pi frequentemente rinvenuti nei prodotti agricoli quali farine insilati grano granturco 1 L assunzione di bassi livelli di Deossinivalenolo provoca nell uomo nausea vomito dissenteria e immunosoppressione il DON viene infatti anche detto vomitossina l assunzione di pi alti livelli pu provocare immunosoppressione Il DON stabile fino a 120 C e non si decompone in condizioni debolmente acide 2 solubile in acqua e in solventi polari quindi in miscele di acqua e metanolo e acqua e acetonitrile Inoltre queste caratteristiche di solubilit e polarit giustificano la facilit di tali tossine a penetrare le membrane cellulari e la loro successiva interazione con DNA RNA e organuli subcellulari La Commissione delle Comunit Europee ha definito i tenori massimi di talune Fusarium tossine contaminanti presenti nelle derrate alimentari rappresentate principalmente da prodotti a base di cereali quali grano e granturco come riportato in Tabella 1 3 Tabella 1 Deossinivalenolo tenori massimi pubblicati nel Reg CE 1126 2007 Matrice Tenore massimo ug kg Cereali non trasformati diversi da grano duro avena e granturco 1250 Grano duro e avena non trasformati 1750 Cereali de
383. rischio di contaminazione da Aflatossine a seguito della frequente rilevazione di partite irregolari 6 Obiettivi e metodi Nell anno 2007 controlli operati dal Nucleo Antisofisticazioni e Sanit NAS presso importatori di Genova hanno portato a segnalazioni di non conformit per presenza di Aflatossine superiori ai limiti previsti di diverse partite di farina di anacardi di origine vietnamita Sulla base di queste segnalazioni e in considerazione che tale ingrediente risultava utilizzato presso le numerose aziende conserviere a carattere prevalentemente artigianale e piccolo industriale del territorio della provincia di Imperia a partire dal 2008 la Struttura Complessa Igiene degli Alimenti e della Nutrizione della Azienda Sanitaria Locale ASL 1 Imperiese ha introdotto nel proprio piano di controllo ufficiale degli alimenti un programma di audit per la verifica delle procedure permanenti basate sul sistema Hazard Analysis and Critical Control Points HACCP adottate da queste aziende al fine di limitare il rischio di utilizzo di materie prime contaminate con particolare riguardo al rischio Aflatossine proveniente dagli anacardi e dall altra frutta a guscio eventualmente utilizzata tale controllo risultato abbinato in un primo approccio al campionamento di prodotti finiti contenenti l ingrediente in questione che sono stati destinati alla ricerca di AFB e totali al fine di ottenere un quadro il pi possibile rappresentativo della
384. rodotti alimentari GUCE L70 12 9 marzo 2006 Spanjer MC Scholten JM Kastrup S Jorissen U Schatzki TF Toyofuku N Sample comminution for mycotoxin analysis dry milling or slurry mixing Food Additives and Contaminants 2006 23 1 73 83 Schatzi TF Toyofuku N Sample preparation and presampling of pistachios Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003 51 6068 72 Ozay G Seyhan F Yilmaz A Whitaker TB Slate AB Giesbrecht F Sampling hazelnuts for aflatoxin uncertainty associated with sampling preparation and analysis Journal of AOAC International 2006 89 4 1004 11 SANCO 1208 Guidance document for competent authorities for the control of compliance with EU legislation on aflatoxin 2009 Unione Europea Regolamento CE n 882 2004 del Parlamento Europeo e del Consiglio del 29 aprile 2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformita alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali GUCE L 165 1 30 aprile 2004 AOAC Official method 999 07 Aflatoxin BI and total Aflatoxins in peanuts butter pistacchio paste fig paste and paprika powder AOAC International 2000 Unione Europea Regolamento CE n 1881 2006 della Commissione del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari GUCE L364 5 20 dicembre 2006 aggiornato il 23 07 2008 Opinion of the scientific panel on cont
385. rodotti ortofrutticoli max 2 3 11 ed evidenziano un elevato rischio per la salute umana legato alla contaminazione da Aflatossine in frutta a guscio e frutta secca A partire dal 2003 con l applicazione delle procedure di campionamento previste dalla normativa comunitaria stato riscontrato un aumento della percentuale di non conformit per Aflatossina B e totali 10 20 negli ultimi cinque anni le matrici pi interessate sono pistacchi arachidi nocciole e fichi secchi Il 60 dei campioni non conformi presenta concentrazioni di Aflatossina B gt di 14 ug kg in almeno 1 dei 3 campioni di laboratorio Nonostante l attuazione delle nuove procedure di campionamento le criticit legate alla contaminazione eterogenea da micotossine permangono come indicato dalle diverse concentrazioni di Aflatossina B trovate nei 3 campioni di laboratorio appartenenti allo stesso campione globale Bibliografia 1 Unione Europea Decisione della Commissione n 2006 504 CE del 12 luglio 2006 che stabilisce condizioni particolari per l importazione di determinati prodotti alimentari da alcuni paesi terzi a causa del rischio di contaminazione da Aflatossine di tali prodotti GUCE L 199 21 21 luglio 2006 82 8 10 11 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Unione Europea Regolamento CE n 401 2006 della Commissione del 23 febbraio 2006 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei p
386. rritorio nazionale mentre la variet CV sembra avere un ruolo incisivo soprattutto nel Centro Sud interessante osservare fra l altro che in Sicilia per le caratteristiche climatiche proprie di tale ambiente la scelta varietale ha un ruolo primario sia come fattore singolo che come interazione con l anno e la provincia Le interazioni hanno un peso pi marcato nel Centro Sud e nelle isole rispetto al Nord Tabella 3 Campioni del monitoraggio aziendale e della Rete nazionale livelli di significativit degli effetti dei fattori singoli e interazioni sulla contaminazione da DON sull insieme dei campioni Regioni CV Cc A P CVxC CVxA CVxP CxA CxP AxP Piemonte kkk kkk kkk kkk kkk ns kkk ns kkk ns Lombardia kkk kkk kkk kkk ns kkk kkk ns ns kkk Veneto i pri piso ns si ns ns ns ns ns E Romagna kkk kkk kkk kkk ns kkk kkk ns ns kkk Marche kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk Abruzzo kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk Toscana kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk Umbria pa i pi cide ns gag ns ns ns ns Lazio kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk Molise kkk kkk kkk kkk kkk kkk e Basilicata kkk kkk kkk kkk ns kkk kkk kkk ns kkk Calabria ns ia ns ns Campania ane ES nei x ns ns ns ns ns ns Puglia kkk kk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk Sardegna kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk ns kkk Sicilia kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk kkk CV variet C campione A anno P province significativo p lt 0 0001
387. rti e Congressi ISTISAN deve essere preventivamente autorizzata Le richieste possono essere inviate a pubblicazioni iss it Stampato in proprio Roma ottobre dicembre 2010 n 4 1 Suppl
388. ruppo dei Tricoteceni la micotossina di pi frequente riscontro nei cereali e nel frumento in particolare 2 4 dove viene prodotta e accumulata nella granella a seguito di attacchi di fusariosi della spiga causati soprattutto da F graminearum e F culmorum Il frumento duro presenta inoltre sia una maggiore suscettibilit all infezione fungina sia livelli pi elevati di contaminazione da DON rispetto al frumento tenero 5 6 Sulla base della valutazione dell azione dannosa del DON sulla salute umana e del rischio di esposizione della popolazione attraverso l assunzione di alimenti contaminati la normativa europea 7 ha previsto una dose giornaliera tollerabile Tolerable Daily Intake TDI pari a 1 ug kg di peso corporeo e limiti massimi accettabili sul piano tossicologico che nel caso del frumento duro non trasformato corrispondono a 1750 ug kg La sostanziale stabilit chimica del Deossinivalenolo e delle micotossine in generale ne favorisce in varia misura la permanenza lungo tutte le fasi della filiera fino ai prodotti finiti 8 9 Lo scopo di questo lavoro svolto nell ambito del Progetto MICOCER stato quello di monitorare i livelli di contaminazione da DON nel frumento duro a livello nazionale nel triennio 2006 2008 al fine di fornire indicazioni a tutti gli operatori del settore non solo sulla presenza 84 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev di tale micotossina nelle varie aree di coltivazione ma anche sull inci
389. s and Contaminants 2003 20 2 161 9 Shier WT The Fumonisin paradox a review of research on oral bioavailability of Fumonisin B1 a mycotoxin produced by Fusarium moniliforme Journal of Toxicology Toxin reviews 2000 19 2 161 87 Oomen AG Rompelberg CJM Bruil MA Dobbe CJG Pereboom DPKH Sips AJAM Development of an in vitro digestion model for estimating the bioaccessibility of soil contaminants Archive of Enviromental and Contaminant Toxicology 2003 44 281 7 Versantvoort CHM Oomen AG Van de Kamp E Rompelberg CJM Sips AJAM Applicability of an in vitro digestion model in assessing the bioaccessibility of mycotoxins from food Food and Chemical Toxicology 2005 43 3 1 40 Dall Asta C Mangia M Berthiller F Molinelli A Sulyok M Schuhmacher R Krska R Galaverna G Dossena A Marchelli R Difficulties in Fumonisin determination the issue of hidden Fumonisins Analitical and Bioanalitical Chemistry 2009 395 1335 45 25 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev DEOSSINIVALENOLO ZEARALENONE E LORO METABOLITI NELLA FILIERA DEI CEREALI Claudia Falavigna Chiara Dall Asta Gianni Galaverna Arnaldo Dossena Rosangela Marchelli Dipartimento di Chimica Organica e Industriale Universit degli Studi Parma Introduzione I Tricoteceni sono una famiglia di sesquiterpeni ciclici prodotti dai funghi del genere Fusarium quali metaboliti secondari tossici classificati in 4 gruppi A D a seconda delle caratteristiche dei loro
390. se al valore scelto per il parmetro E nelle simulazioni possibile definire la massima concentrazione assegnabile ad una SU e quello minore MINC SU MAXC SU 2 La scelta della distribuzione casuale per questa componente della variabilit e stata dettata da una mancanza di adeguato consenso scientifico sul tipo di distribuzione statistica delle contaminazioni da micotossine nelle casistiche reali 12 A tale riguardo da sottolineare come nella pratica i vari passaggi che portano all allestimento del carico da trasportare stoccaggi movimentazioni carico siano tutti in grado di influenzare la distribuzione finale delle contaminazioni senza che si possa ricostruire con certezza la dinamica e valutarne gli effetti sulla distribuzione delle contaminazioni in maniera attendibile non tutte le SU sono a priori assoggettabili alla condizione i in altri termini una certa percentuale di SU distribuite casualmente all interno della sub partita pu essere considerata AFB free Questa seconda dimensione dell eterogeneita Er nella distribuzione del carico contaminante della massa da campionare pu variare tra 100 tutte le SU sono potenzialmente contaminate e 1 N una sola contaminata sul totale SU della sub partita 6 infatti noto come particolarmente nel caso delle Aflatossine la contaminazione delle partite di materie prime alla rinfusa sia dipendente da una relativamente bassa percentuale di porzioni fortemente contamina
391. siderando che il calcolo della Tm reale per complesso e dipendente da molte variabili in generale viene approssimato utilizzando il modello The Nearest Neighbour NN Tale modello assume che l entropia e l entalpia totale di una sequenza duplex di acidi nucleici derivi dalla somma dei contributi di ciascun coppia di paia di basi vicine Per ciascuna coppia sia normale che mismatch sono calcolati i parametri termodinamici che dipenderanno da energie di accoppiamento e di stacking Al momento i migliori software per il disegno di probe per microarray calcolano la Tm utilizzano il modello NN con la matrice di parametri SantaLucia 98 17 Questo approccio rimane ancora quello pi utilizzato e soprattutto l unico consigliato per il probe design in organismi procarioti Agilent attraverso il suo portale dedicato al microarray design e array https earray chem agilent com earray offre uno strumento per il disegno degli oligonucleotidi dedicati alla espressione genica basato sul metodo NN SL98 GE probe design tool Si deciso quindi di utilizzare questo software per disegnare gli oligonucleotidi necessari per costruire un microarray dedicato allo studio di espressione in V fischeri Il ceppo di cui stato pubblicato l intero genoma il V fischeri ES114 isolato dall organo luminoso della seppia Euprymna scolopes 18 Il genoma costituito da due molecole di DNA circolari cromosoma I e II ed un plasmide caratteristico
392. sione 2002 657 CEE della Commissione del 12 Agosto 2002 che attua la Direttiva 96 23 CEE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e all interpretazione dei risultati GUCE L221 17 agosto 2002 Soriano JM Dragacci S Occurence of Fumonisins in foods Food Research International 2004 37 985 1000 Ringraziamenti Lavoro eseguito con i fondi di ricerca corrente del Ministero della Salute Progetto RC IZS PB 004 07 Si ringrazia P D Antini Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Foggia per la collaborazione tecnica 229 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev AFLATOSSINE B B2 G E G2 IN PRODOTTI ALIMENTARI E ALIMENTI PER USO ZOOTECNICO VALIDAZIONE DEL METODO DI CONFERMA HPLC CON DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA ONLINE E RIVELAZIONE FLUORIMETRICA Marilena Muscarella a Marco Iammarino a Donatella Nardiello a Sonia Lo Magro a Carmen Palermo b Diego Centonze b a Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Foggia b Dipartimento di Scienze Agro Ambientali Chimica e Difesa Vegetale Universit degli Studi Foggia Introduzione Le Aflatossine AF sono metaboliti secondari prodotti dai funghi Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus Sono state identificate almeno 17 differenti forme e tra di esse le Aflatossine B B2 G e Gz sono considerate le pi pericolose manifestando propriet di genotossicit cancerogenit e immunotossicit 1 3
393. sitivi nell areale Centro sono stati ottenuti i livelli pi alti sia per quanto riguarda i valori medi di contaminazione 106 ng g in biologico e 201 ng g in convenzionale che massimi 428 ng g in biologico e 1894 ng g in convenzionale mentre nel Sud il valore massimo non ha superato i 233 ng kg nel convenzionale 250 7 2 201 ja max 1894 amp 200 5 o E 1507 E o 100 N E g 507 c Q o 0 Centro Sud Centro Sud biologico convenzionale Figura 5 Valori medi dei campioni positivi nel biennio 2007 2008 tra parentesi valori massimi della serie negli areali Centro e Sud In modo analogo si manifestato l andamento dell incidenza percentuale ovvero n positivi n totale x 100 dei riscontri positivi sul totale dei campioni analizzati nel biennio Figura 6 nell areale Centro si sono raggiunti i livelli pi elevati sia in biologico 58 che in convenzionale 81 rispetto al Sud dove il valore massimo dei positivi non ha superato il 50 con entrambi i sistemi colturali 100 zZz Pi 80 a 5 g 60 iv N S 40 207 0 T Centro Sud Centro Sud biologico convenzionale Figura 6 Incidenza dei campioni positivi nel biennio 2007 2008 negli areali Centro e Sud 121 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Conclusioni Dall insieme dei risultati ottenuti durante il biennio di sperimentazione possibile trarre alcune indicazioni relative ai fatto
394. situazione di questi prodotti locali relativamente alla problematica in questione Il condimento prodotto pi comunemente dalle aziende locali risulta il pesto alla genovese la ricetta tradizionale del quale prevede basilico olio extravergine di oliva formaggio parmigiano grana padano o pecorino aglio pinoli noci facoltative sale l utilizzo degli anacardi in abbinamento o in sostituzione dei pinoli discende per lo pi da ragioni economiche e in taluni casi anche tecnologiche diminuzione dell acqua libera Al momento settembre 2009 sono state visitate 18 aziende locali presso 13 delle quali stato verificato l utilizzo delle noci di anacardi generalmente acquistate in frammenti o come farina presso ogni azienda si proceduto all esame dell analisi dei rischi effettuata nel piano di autocontrollo e alla verifica della presenza di documentazione inerente i lotti di anacardi acquistati documenti di trasporto specifiche tecniche certificazioni rilasciate dai paesi di origine ulteriori certificazioni analitiche fornite dall importatore o commissionate dall azienda a laboratori esterni e dei piani dei controlli previsti sulla materia prima e sui prodotti finiti richiedendo laddove necessario l adozione di specifiche azioni correttive e o preventive finalizzate alla corretta gestione del rischio d introduzione in produzione di anacardi contaminati da Aflatossine Si proceduto inoltre alla acquisizione del dato
395. smi Geneticamente Modificati e Biosicurezza dell Agenzia Regionale Prevenzione e Ambiente dell Emilia Romagna Nell ambito dell attivit scientifica stata studiata la contaminazione da Fumonisine B1 e B2 FB e FB2 nella matrice mais valutando sia la loro presenza nelle farine mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa High Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry HPLC MS MS sia il loro effetto tossico su Vibrio Fischeri Sono stati analizzati 70 campioni di farine di mais di cui il 90 risultato contaminato anche a livelli superiori a 2000 ug kg Le Fumonisine sono state estratte dalla farina di mais con un miscela di acetonitrile metanolo e H20 il filtrato diluito con Phosphate Buffered Saline PBS stato purificato su colonnine di immunoaffint Fumoniprep e l eluato analizzato in HPLC MS MS mediante tecnica elettrospray in ionizzazione positiva ESI Gli ioni frammento scelti per FB e FB sono stati rispettivamente m z 334 e 336 per la quantificazione e m z 352 e 318 per la conferma Il range di linearit compreso tra 35 500 ng mL sia per FB che per FB con un coefficiente di correlazione r di 0 999 e il limite di rivelazione di 20 ug kg La percentuale di recupero 90 per entrambe le tossine Il metodo analitico viene periodicamente controllato mediante la partecipazione al FAPAS Proficiency Test dal 2007 La tossicit di FB e FB stata valutata
396. so tempo i campioni il cui contenuto di tossina al di fuori dell intervallo di lavoro possono comunque essere valutati distinguendo tra campioni conformi al limite di legge e campioni non conformi Non sono stati rilevati falsi positivi Il metodo sviluppato una valida alternativa ai metodi di screening tradizionali basati su tecniche ELISA a rilevazione spettrofotometrica per la determinazione della concentrazione complessiva delle tossine T 2 ed HT 2 poich in grado di fornire risultati in tempi pi rapidi 1 5 ore rispetto alle 3 5 ore di un saggio ELISA spettrofotometrici Bibliografia Koch P State of the art of trichothecenes analysis Toxicology Letters 2004 153 109 12 GLM Gruppo di lavoro Micotossine Sintesi del V forum Fusarium Tossine DG SANCO UE BRUXELLS del 10 e II gennaio 2008 Disponibile all indirizzo http www micotossine it public pag_561 pdf ultima consultazione 13 9 10 N U Schlatter J Toxicity data relevant for hazard characterization Toxicology Letters 2004 153 83 9 A Unione Europea Regolamento CE n 856 2005 della Commissione del 6 giugno 2005 che modifica il regolamento CE n 466 2001 per quanto riguarda le Fusarium tossine GUCE L143 7 giugno 2005 Delibato E Bancone M Volpe G De Medici D Moscone D Palleschi G Development and Comparative Evaluation of Different Screening Methods for Detection of Staphylococcus aureus Analytical Letters 2005 38 1569 86 Krs
397. solution 74 g Figura 2 Schematizzazione della procedura analitica e impiego di RM nelle diverse fasi La necessit di RM pu riguardare sia le fasi di trasporto conservazione e omogeneizzazione sia quelle di pretrattamento macinazione deidratazione purificazione e preconcentrazione sia la fase analitica propriamente detta taratura controlli di purezza e specificit dei reagenti controlli delle interferenze Mentre per le prime fasi sarebbero necessari RM quanto pi simili in termini di composizione stato fisico omogeneit ecc al campione TQ nelle fasi successive possono essere convenientemente impiegati differenti RM con caratteristiche simili a quelle degli intermedi di lavorazione del campione quali ad esempio i materiali macinati anidri Per ragioni di natura tecnico economica la produzione di Matrix RM riguarda quasi totalmente i materiali deidratati e omogeneizzati ci comporta una limitazione nelle possibilit di impiego di questi RM in quanto possono essere controllate soltanto le fasi analitiche successive all ottenimento di un campione stabile e omogeneo 20 La possibilit di realizzare e impiegare RM di prodotti agroalimentari TQ strettamente legata alle caratteristiche di stabilit e omogeneit del prodotto In linea generale ci fattibile pi per i prodotti trasformati che per la produzione primaria in quanto in questo secondo caso i prodotti presentano caratteristiche di stabilit tali da richi
398. spike pari a 0 5 ed 1 ug kg In Tabella 1 vengono riportati i dati preliminari di ripetibilit ottenuti Dall analisi dei CV delle medie dei B Bo riportati si nota che la ripetibilit ottenuta buona Si inoltre osservata una variazione tra la media dei B Bo delle repliche del campione analizzato tal quale rispetto alla media dei B Bo dello stesso campione addizionato di OTA a due livelli diversi di contaminazione tale variazione rende idoneo il sistema a candidarsi come strumento valido per un analisi di screening 241 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 1 Risultati dell analisi di un campione di cioccolato con contenuto di cacao lt 35 suddiviso in 10 aliquote che vengono testate e addizionate a 2 diversi livelli di OTA 0 5 ug kg ed 1 0 pg kg Campione B Bo Campione B IBo Campione B Bo 0 5 pg kg 1 0 pg kg 1 52 8 1 0 5 44 8 1 1 0 34 7 2 58 1 2 0 5 39 7 2 1 0 36 7 3 51 9 3 0 5 38 5 3 1 0 38 2 4 52 7 4 0 5 41 6 4 1 0 33 5 5 47 4 5 0 5 41 2 5 1 0 33 0 6 49 9 6 0 5 40 4 6 1 0 32 9 7 49 3 7 0 5 42 0 7 1 0 37 0 8 50 8 8 0 5 38 9 8 1 0 36 0 9 50 4 9 0 5 42 4 9 1 0 34 1 10 52 0 10 0 5 39 4 10 1 0 33 6 Media 51 5 Media 40 9 Media 35 0 DS 2 9 DS 1 9 DS 1 8 CV 5 6 CV 4 7 CV 5 3 DS deviazione standard CV coefficiente di variazione In Tabella 2 vengono riportati i dati preliminari ottenuti dall analisi di alcuni campioni I dati preliminari raccolti durante le prove eseguite su campioni pr
399. sservato un drastico decremento dei campioni analizzati imputabile forse ad un calo della domanda dell industria alimentare oppure alla scelta da parte degli importatori di un altro punto di ingresso Le non conformit riguardano in 79 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev prevalenza i prodotti di origine iraniana con una percentuale di non conformita sul totale dei campioni analizzati in 8 anni del 40 Solo tre campioni di provenienza turca sono risultati non conformi Nel corso degli anni si evidenzia un inversione nel rapporto conformit non conformit nei primi due anni considerati la percentuale di non conformit intorno al 25 successivamente sale al 74 nel 2003 al 78 nel 2004 fino ad arrivare al 100 nel 2005 Negli anni successivi tale percentuale calata pur rimanendo elevata Come osservato per le altre tipologie di campioni tale aumento riconducibile all applicazione delle procedure di campionamento previste dalla normativa comunitaria Il principale paese da cui provengono i fichi secchi la Turchia Il numero di campioni Figura 1d ha subito un decremento nel corso degli anni Contrariamente a tale tendenza a partire dal 2007 le non conformit sono aumentate sensibilmente interessando il 50 dei campioni totali 250 60
400. ssetto e o corsivo sono comunque statisticamente diversi dalle variet indicate con il carattere normale 89 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 5 Monitoraggio aziendale e Rete nazionale sensibilita alla contaminazione da DON per le sei variet Ciccio Simeto Duilio Iride Claudio e Creso Macro area Regione i bi Sensibilit al DON Piemonte Iride Claudio Duilio Simeto Ciccio Creso Nord Lombardia Claudio Duilio Iride Creso Simeto Ciccio Veneto Claudio Creso Ciccio Iride Duilio Simeto Emilia Romagna Claudio Ciccio Iride Creso Duilio Simeto it Marche Creso Iride Duilio Ciccio Simeto Claudio Centro Adriatico Abruzzo Ciccio Claudio Duilio Iride Simeto Creso Toscana Creso Ciccio Duilio Iride Simeto Claudio Centro Tirrenico Umbria Creso Claudio Iride Simeto Ciccio Duilio Lazio Creso Claudio Duilio Iride Simeto Ciccio Molise Ciccio Iride Creso Duilio Simeto Claudio Basilicata Duilio Ciccio Creso Claudio Simeto Iride Sud Calabria Creso Claudio Duilio Iride Ciccio Simeto Campania ns ns ns ns ns ns Puglia Ciccio Claudio Iride Simeto Creso Duilio Sardegna Creso Claudio Iride Ciccio Duilio Simeto Isole Sicilia Duilio Iride Creso Ciccio Claudio Simeto Il comportamento delle singole cultivar appare ben differenziato nelle diverse zone geografiche del territorio italiano In particolare la variet Claudio risulta essere la meno sensibile nel Nord e una delle meno sensibili nel Centro Sud con l eccezione di Marche Toscana
401. ssina DON sono stati analizzati con l immunosensore ELIME ottimizzato I risultati sono mostrati in Tabella 3 I valori riportati sono la media di 6 determinazioni per ogni livello di concentrazione Tabella 3 Valori di recupero ottenuti dall analisi con DON immunosensore di campioni di cereali da colazione naturalmente contaminati Contenuto di DON ng g DON trovato ng g Recupero 485 61 475 80 98 364 47 432 55 119 242 31 201 17 83 121 16 n d Alimenti per l infanzia campioni sperimentalmente contaminati Si proceduto con l analisi di campioni di alimenti destinati all infanzia a base di cereali sperimentalmente contaminati con concentrazioni di DON pari a 50 100 200 400 e 1000 ng g I risultati ottenuti sono riportati in Tabella 4 I valori riportati sono la media di 9 determinazioni per ogni livello di concentrazione Tabella 4 Valori di recupero del DON immunosensore ottenuti analizzando campioni di alimenti per l infanzia sperimentalmente contaminati DON aggiunto ng g DON trovato ng g RSD Recupero 50 n d 100 97433 33 97 200 198420 10 99 400 434 52 12 108 1000 1050 157 15 105 Conclusioni stato messo a punto un sistema immunomagnetico elettrochimico ELIME per la determinazione del DON in matrici alimentari a base di cereali Ottimizzate le condizioni per il saggio ELIME stato valutato l effetto interferente di diverse matrici cereali da colazione e alimenti per
402. ssinivalenolo zearalenone ocratossina A tossine T 2 e HT 2 e fumonisine in prodotti destinati all alimentazione degli animali GUCE L229 23 agosto 2006 Castells M Marin S Sanchis V Ramos AJ Distribution of Fumonisins and aflatoxins in corn fractions during industrial cornflake processing International Journal of Food Microbiology 2008 123 81 7 Z llner P Mayer Helm B Trace mycotoxin analysis in complex biological and food matrices by liquid chromatography atmospheric pressure ionisation mass spectrometry The Journal of Chromatography A 2006 1136 123 69 Muscarella M Lo Magro S Nardiello D Palermo C Centonze D Development of a new analytical method for the determination of Fumonisins B1 and B2 in food products based on high performance liquid chromatography and fluorimetric detection with post column derivatization The Journal of Chromatography A 2008 1203 88 93 Unione Europea Regolamento CE 882 2004 del Parlamento Europeo e del Consiglio del 29 aprile 2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformita alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali GUCE L 191 30 aprile 2004 Unione Europea Regolamento CE N 401 2006 della Commissione del 23 febbraio 2006 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari GUCE L70 12 9 marzo 2006 Unione Europea Deci
403. ssioni sull attivita del porto di Ravenna con una ulteriore diminuzione delle quantita di merci transitate specialmente di frutta secca e cereali Tabella 2 Quantit delle principali categorie di merci soggette a controllo di micotossine Tipologia di merce t a 2006 t a 2007 t a 2008 t a 2009 Cereali 324 476 3 563 831 427 896 156 610 Frutta secca a guscio 32 170 35 626 24 690 7 384 Spezie 99 81 19 105 dati disponibili fino al 31 08 2009 In Tabella 3 e 4 sono riportati i campioni sui quali sono state ricercate le Aflatossine e l Ocratossina A suddivisi per tipologia di matrice analizzati dal 2001 al 2008 I campioni sono stati classificati rispetto ai limiti di legge Reg CE 1881 2006 9 come conformi C e non conformi NC Nella voce altra frutta sono compresi pinoli noci mandorle armelline anacardi e albicocche secche I campioni di spezie ed erbe infusionali sono costituiti principalmente da pepe peperoncino ed erbe aromatiche Nella voce cereali sono compresi legumi e prodotti derivati Tabella 3 Numero di campioni conformi C e non conformi NC rispetto ai limiti di legge analizzati negli anni 2001 2008 per la ricerca di Aflatossine Anno CoNC Arachidi Pistacchi Nocciole Fichi Altra Cereali Spezie Totale NC secchi frutta 2001 C 134 32 2 21 13 60 6 208 NC 1 13 0 5 0 0 0 19 10 2002 C 251 33 11 4 35 119 19 353 NC 2 10 0 0 0 1 1 14 4 2003 C 123 7 3 6 10 11 28 188 NC
404. sson H Toxicological evaluation of trichothecenes in animal feed Animal Feed Science and Technology 2004 114 205 39 Yin JJ Smith MJ Eppley RM Page SW Sphon JA Effects of Fumonisin B1 on lipid peroxidation in membranes Biochimica et Biophysica Acta 1998 1371 134 42 Vitali A Danieli PP Bernabucci U Lacetera N Nardone A Ronchi B Assessment of genotoxicity and cytotoxicity of AFBI by peripheral blood mononuclear cells in goats In Proceedings of the 58 Annual Meeting of the EAAP Dublin Ireland August 26 29 2007 15 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev VALUTAZIONE DELLA PRESENZA DI MICOTOSSINE NASCOSTE NEI CEREALI MEDIANTE DIGESTIONE GASTROINTESTINALE SIMULATA Claudia Falavigna Chiara Dall Asta Gianni Galaverna Arnaldo Dossena Rosangela Marchelli Dipartimento di Chimica Organica e Industriale Universit degli Studi Parma Introduzione Le Fumonisine sono metaboliti secondari tossici prodotti da diverse specie fungine appartenenti al genere Fusarium in particolare da Fusarium verticilloides Fusarium moniliforme Fusarium nygamai e Fusarium proliferatum Quelle appartenenti al gruppo B in particolare FB FB2 ed FB rappresentano le forme pi abbondantemente prodotte dai suddetti ceppi e si ritrovano soprattutto quali contaminanti del mais 1 Chimicamente sono definibili come polidrossialchilammine che portano due unit tricarballiliche esterificate su una catena alifatica a venti atomi di carbonio 2 La tossicit di
405. ssono indurre la sintesi di radicali liberi e o la riduzione delle difese anti ossidanti della cellula animale 10 L effetto citotossico delle micotossine spesso studiato su modelli biologici in vivo o in vitro usando in tal caso cellule epatiche o renali Tuttavia i dati della letteratura dimostrano come gli effetti siano molto variabili in base al tipo cellulare target probabilmente a causa delle peculiarit del metabolismo dei diversi tipi cellulari 11 Considerando che i linfociti in qualit di componenti del sistema immunitario sono bersaglio delle micotossine e posseggono ossidasi a funzione mista in grado di trasformare gli xenobiotici con attivazione di molti processi propri dello stress ossidativo 12 l obiettivo del presente contributo stato quello di valutare l idoneit di colture linfocitarie d origine bovina come modello per lo studio del potere ossidante delle tossine fungine AFB T 2 DON e FB Materiali e metodi Le popolazioni linfocitarie sono state ottenute da sei vacche di razza Holstein 621 kg 24 kg di peso vivo in buono stato di salute e della stessa et Campioni di sangue periferico sono stati prelevati dalla giugulare mediante tubi sotto vuoto contenenti sodio eparina 170 I U BD Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Vacutainer Becton Dickinson amp Company Plymuth UK e fino all utilizzo sono stati conservati in refrigeratore alla temperatura di 4 C Gli elementi cellulari mononucleat
406. stanze indesiderabili e di altri contaminanti nei prodotti destinati all alimentazione animale micotossine La contaminazione da micotossine ha suscitato particolare attenzione sull alimentazione animale anche a seguito dei pareri dell EFSA European Food Safety Authority 3 6 relativi a specifiche micotossine Deossivalenolo Zearalenone Ocratossina Fumonisine considerate tossiche per alcune specie animali evidenziando contestualmente la necessit di raccogliere dati al fine di una pi approfondita valutazione e di legiferare in proposito Alla Direttiva 2002 32 CE 7 sulle sostanze indesiderabili nell alimentazione animale recepita con DL vo n 104 del 10 maggio 2004 8 che si limita a definire il massimo contenuto mg kg di Aflatossina B in diversi prodotti materie prime mangimi completi e complementari specificando fra l altro la tipologia di specie di destinazione sono seguite molteplici raccomandazioni comunitarie su specifiche micotossine attraverso le quali il legislatore si prefisso determinati obiettivi come di seguito riportato all interno della Comunit La Raccomandazione 2005 925 CE 9 evidenziando la mancanza sul territorio comunitario di regolamentazione per alcune micotossine Ocratossina A Zearalenone Deossinivalenolo Fumonisine e Tossine T 2 e HT 2 ha sollecitato ciascuno Stato Membro alla raccolta di informazioni tramite un programma coordinato di controllo per verificare le concentrazio
407. stata impostata una sola serie di condizioni per l HPLC High Performance Liquid Chromatography basandosi sull uso della KOBRA cell per la derivatizzazione di AFB e AFG ed stata permessa la quantificazione di tutte e cinque le micotossine con una singola analisi Il metodo stato validato per la determinazione di AF totali e OTA in cereali frutta secca e spezie L impiego di un solo metodo di preparazione del campione e di una singola impostazione dell HPLC consente di avere un volume maggiore di campione e una riduzione dei solventi e dei materiali di consumo Materiali e metodi Trattamento del campione e selezione del livello di arricchimento I campioni sono stati analizzati per testare la naturale contaminazione di tutte e 5 le tossine I livelli di arricchimento sono conformi a quelli della legislazione europea o almeno 5 volte rispetto al naturale livello di contaminazione di ogni singola tossina I valori di recupero sono stati sempre ricondotti alla contaminazione naturale Gli step della preparazione del campione si possono cos sintetizzare 1 pesare 25 g di campione macinato nel contenitore per miscelatore 2 aggiungere 5 g di cloruro di sodio e 100 mL di metanolo acqua 80 20 v v 3 miscelare per 2 minuti ad alta velocit e filtrare con carta da filtro Whatman N 113 4 4a peri cereali diluire 1 mL di filtrato con 9 mL di PBS Phosphate Buffered Saline 4b per la frutta secca e le spezie diluire 1mL
408. stati stabiliti ufficialmente dalla Unione Europea in quanto al momento attuale il Comitato Scientifico incaricato non ha valutato sufficienti i dati raccolti mancano inoltre metodi analitici rapidi standardizzati e gli studi sulla valutazione del rischio per l alimentazione zootecnica stato stabilito tuttavia dalla Joint FAO WHO Expert Committee on Food Additives nel 2001 un valore di TDI Tolerable Daily Intake pari a 0 06 ug kg riferito alla somma complessiva di T 2 ed HT 2 4 In questo contesto stato messo a punto un sistema per l analisi rapida della somma di T 2 ed HT 2 Il metodo basato su un saggio Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ELISA di tipo competitivo indiretto in cui il supporto solido rappresentato da microsfere di materiale paramagnetico accoppiato ad un sistema di rilevazione elettrochimico 5 Il sistema fornisce una misura rapida poich grazie ad una speciale connessione denominata Multi 8 in grado di eseguire automaticamente la misura relativa ad otto campioni o standard di tossina L utilizzo delle microsfere magnetiche come supporto solido permette di condurre le reazioni del saggio immunoenzimatico in soluzione senza entrare in contatto diretto col sensore fino al momento della misura 159 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Il metodo stato messo a punto su due differenti matrici cereali da colazione e alimenti a base di mais destinati all infanzia a diversi livelli di contaminazione e con d
409. stinati al consumo umano diretto farina di cereali compresa la farina di granturco la semola di granturco e il granturco grits crusca 750 come prodotto finito commercializzato per il consumo umano diretto Pasta 750 Pane compresi piccoli prodotti da forno prodotti della pasticceria biscotteria merende a base di cereali e cereali da colazione Alimenti a base di cereali e altri alimenti destinati ai lattanti e ai bambini 200 153 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev E fortemente sentita da parte delle industrie alimentari la necessita di disporre di metodi semplici rapidi e affidabili per accertare la presenza di queste tossine nei prodotti alimentari e per soddisfare tali esigenze sono in via di sviluppo molti metodi di screening per rivelare i piu rappresentativi Tricoteceni 4 Lo scopo del presente lavoro stato quello di sviluppare un nuovo metodo di screening per la rivelazione del Deossinivalenolo in matrici alimentari a base di cereali il sistema rappresentato da un sensore immunomagnetico enzimatico elettrochimico Materiali e metodi Il saggio immunomagnetico enzimatico elettrochimico ELIME Enzyme Linked ImmunoMagnetic Electrochemical assay utilizza il format del classico saggio Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA ma finalizzato ad elevarne l efficienza A tale scopo l immobilizzazione dei bioreagenti eseguita su micropalline magnetiche IMB Le microparticelle immunomagnetiche sono particelle superpara
410. sultati molto bassi e variabili per le basse concentrazioni e le difficolt nel recupero quantitativo del burro pari rispettivamente a 0 2 0 3 e a 9 14 Conclusioni In conclusione ipotizzando per il latte intero una concentrazione di 0 100 pg kg le concentrazioni medie di cagliata siero cotto ricotta e burro risulterebbero rispettivamente di 0 348 0 060 0 123 e 0 021 ug kg Figura 2 Latte intero 0 100 100 Latte caldaia 0 096 90 Panna di affioramento 0 048 1 6 Siero innesto caglio Siero cotto 0 060 55 Burro 0 021 0 4 Latticello 0 023 0 7 Cagliata 0 348 24 Ricotta 0 123 2 Scotta 0 048 43 Figura 2 Concentrazioni pg kg e percentuali di distribuzione tra parentesi di AFM nei prodotti della caseificazione partendo da un latte contaminato a livello di 0 100 pg kg Bibliografia 1 Mortimer DN Gilbert J Shepher MJ Rapid and highly sensitive analysis of AFMI in liquid and powdered milk using an affinity column cleanup Journal of Chromatography 1987 407 393 8 2 Pietri A Bertuzzi T Fortunati P Piva G Determinazione dell Aflatossina M1 nei formaggi nuovo metodo enzimatico di estrazione In Miraglia M Brera C Ed Congresso nazionale Le micotossine nella filiera agro alimentare Istituto Superiore di Sanit Roma 29 30 novembre 2004 Atti Roma Istituto Superiore di Sanit 2005 Rapporti ISTISAN 05 42 p 318 21
411. sults Official Journal L 221 17 agosto 2002 N 116 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev DEOSSINIVALENOLO NEL FRUMENTO DURO TRITICUM DURUM DESF CONFRONTO FRA COLTURA CONVENZIONALE E BIOLOGICA Gabriella Aureli a Fabrizio Quaranta a Tiziana Amoriello b Sahara Melloni a Ersilio Desiderio a Mauro Fornara a Maria Grazia D Egidio a a Unita di Ricerca per la Valorizzazione Qualitativa dei Cereali Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura Roma b Direzione Centrale Attivita Scientifica Servizio Trasferimento e Innovazione Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura Roma Introduzione Negli ultimi anni il crescente interesse dei consumatori verso gli alimenti biologici ha creato una tendenza di mercato che privilegia gli aspetti qualitativi e nutrizionali salutistici dei prodotti alimentari con particolare riguardo a quelli igienico sanitari legati alla sicurezza d uso Il metodo di coltivazione biologico ampiamente utilizzato in Italia per realizzare colture cerealicole la quota pi consistente delle quali costituita dal frumento duro 1 che trova principale impiego nella trasformazione in pasta alimentare Visti i suoi forti consumi pro capite risulta di particolare importanza l acquisizione di elementi conoscitivi in merito alla possibile assunzione di sostanze contaminanti estranee alla materia prima 2 Tra queste ultime sono comprese le micotossine prodo
412. superficie dei salumi In Italia per quanto riguarda i prodotti carnei la circolare del Ministero della Sanit n 10 del 9 giugno 1999 ha fissato il limite massimo di 1 ug kg di OTA nella carne suina e prodotti derivati 2 Lo scopo del nostro lavoro stato monitorare il livello di contaminazione da Ocratossina A in salami del Nord Italia e studiare l efficacia della spazzolatura meccanica dei budelli come sistema di decontaminazione Materiali e metodi Nella fase iniziale di screening sono stati analizzati 21 salami pronti per la vendita provenienti da aziende del Nord Italia per monitorare il livello di contaminazione da OTA AI fine di studiare l efficacia della spazzolatura sono state poi considerate 6 coppie di campioni pronti per la vendita ciascuna proveniente da un medesimo lotto con il medesimo tempo di stagionatura compreso tra 40 e 140 giorni e condizioni di stagionatura Di ciascuna coppia un campione stato spazzolato mentre l altro non stato sottoposto ad alcun trattamento di decontaminazione La possibile contaminazione a spot del budello ne ha reso necessaria la completa asportazione per l analisi stato rilevato e quantificato il livello di OTA nel budello e di alcuni campioni stata analizzata anche la parte edibile a cuore del prodotto Il procedimento analitico ha seguito la metodica descritta da Chiavaro et al 3 I campioni di budello e parte edibile prelevata a cuore sono stati estratti con u
413. t di luminescenza LU x il valore della concentrazione in g L Coefficiente di correlazione Valori espressi in ug L Conclusioni Nel presente lavoro stato validato un metodo per la determinazione simultanea delle Aflatossine basato sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni con rivelazione fluorimetrica previa derivatizzazione fotochimica online La procedura di validazione effettuata in accordo con quanto definito nel Reg CE 882 2004 ha dimostrato la rispondenza dei requisiti del metodo ai criteri previsti dal Reg CE 401 2006 confermandone l affidabilit nel controllo ufficiale delle Aflatossine B e G nei prodotti alimentari e nelle materie prime per mangimi La procedura di validazione descritta risulta particolarmente utile nel campo delle analisi multi 233 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev residuali delle micotossine in varie matrici per le quali sono stati stabiliti differenti limiti di legge Bibliografia En N U a A an N o0 O 10 1 12 Dickens F Jones HE The carcinogenic action of aflatoxin after its subcutaneous injection in the rat British Journal of Cancer 1963 17 691 8 Bullerman LB Significance of mycotoxins to food safety and human health Journal of Food Protection 1979 42 65 86 Harwig J Munro IC 1975 Mycotoxins of possible importance in diseases of Canadian farm animals Canadian Veterinary Journal 1975 16 125 41 Eaton DL Groopman
414. ta nonch di sintesi di Aspergillus 8 Le osservazioni eseguite in campo hanno rilevato che le foglie prelevate da viti allevate in condizioni pedologiche caratterizzate da un maggiore contenuto di calcare attivo mostrano in maniera pi marcata uno stato evidente di ingiallimento internervale Parimenti le osservazioni sulle bacche hanno messo in evidenza i sintomi di un avvenuto attacco fungineo Tale comportamento emerso anche dal risultato ottenuto con l analisi molecolare tramite tecnica PCR che ha portato all identificazione molecolare del DNA equivalente a quello di A carbonarius I campioni analizzati per il contenuto di OTA hanno riportato valori al di sotto dei limiti di legge Reg CE 1881 2006 Ci presumibilmente da imputare alla buona conduzione e gestione dei vigneti in osservazione alle pratiche agronomiche e ai trattamenti chimici effettuati che hanno ridimensionato la contaminazione funginea e il livello di OTA nelle uve e nel vino Quest ultimo stato ottenuto da micro vinificazione delle uve si tratta pertanto di una quantit esigua di prodotto che per tale ragione facilmente gestibile Questo aspetto presumibilmente permette di contenere significativamente l eventuale contaminazione di Ocratossina nella massa totale Bibliografia 1 Visconti A Pascale M Centonze G Determination of ochratoxin A in wine by means of immunoaffinity column clean up and high performance liquid chromatography Journal of
415. ta per la determinazione delle Fumonisine la cromatografia liquida con rivelazione fluorimetrica pi affidabile delle tecniche immunoenzimatiche 7 contraddistinte da problemi di cross reattivit e inadeguatezza nella quantificazione delle singole Fumonisine Essa inoltre risulta essere caratterizzata da una maggiore rapidit e facilit di utilizzo rispetto alle tecniche cromatografiche abbinate alla spettrometria di massa 8 che pur offrendo sensibilit elevate richiedono una strumentazione costosa e sofisticata La rivelazione in fluorescenza delle Fumonisine tuttavia necessita di processi di derivatizzazione pre colonna che presentano limitazioni dovute a scarsa sensibilit effetti matrice utilizzo di agenti tossici e basse cinetiche di reazione Nel presente lavoro descritta l ottimizzazione e la validazione di un metodo analitico sensibile e selettivo per la determinazione delle Fumonisine in prodotti alimentari a base di mais basato sulla cromatografia liquida a fase inversa e la rivelazione fluorimetrica degli addotti fluorescenti formati per reazione post colonna delle Fumonisine con o ftalaldeide OPA e N N dimetil 2 mercaptoetilammina Thiofluor 9 La derivatizzazione post colonna consente di eliminare i problemi legati alla necessit di operare rapidamente tra il processo di derivatizzazione delle Fumonisine i cui addotti hanno una vita media di pochi minuti e l iniezione in colonna In tal modo si garantisce u
416. taminato da Aflatossina B latte con Aflatossina M L Aflatossina B AFB quella presente in maggior quantit e sulla quale stato focalizzato l interesse dei ricercatori per via della sua elevata tossicit acuta e cronica Gli alimenti che contengono AF con maggior frequenza sono i cereali e suoi derivati ma va ricordato che una cattiva conservazione pu far comparire le AF anche in prodotti non considerati a rischio I livelli di AF comprese tra 0 3 0 7 mg kg vengono considerati tossici per le vacche da latte 1 mentre i vitelli sono gi sensibili alla presenza 0 02 mg kg 2 Bovini suini e volatili sono gli animali maggiormente sensibili alla AFB e i sintomi vengono osservati gi ad 1 o 2 giorni dall esposizione 3 Contaminazioni di 0 2 mg kg sono gi in grado di diminuire la crescita giornaliera di ridurre l attivit ruminale l efficienza alimentare e riproduttiva causando una minore produzione di latte 4 5 L effetto sulla riproduzione non sembra essere diretto ed piuttosto dovuto a un azione indiretta attraverso altri sistemi fisiologici 93 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev L AFM milk toxin stato il primo metabolita della AFB ad essere identificato Tutti i poligastrici che ingeriscono AFB ne eliminano una quota come AFM nel latte nel caso dei grossi ruminanti la quota eliminata generalmente 1 1 3 di quella ingerita Vi tuttavia un elevata variabilit di escrezione dovuta s
417. tata valutata analizzando i bianchi matrice e campioni fortificati in 2 sessioni di lavoro con 2 analisti diversi e a temperature comprese tra 19 e 25 C Il piano della validazione riportato in Tabella 1 Tabella 1 Sintesi del piano della validazione per la rivelazione di AFM nel latte Parametro Criterio da valutare Prove eseguite Criterio di accettabilit Specificit Interferenza da parte della Analisi di 20 campioni Applicabile a tutti i tipi di matrice non contaminati latte Recupero Segnale relativo ai campioni Analisi di 20 campioni AI massimo 1 falso fortificati significativamente non contaminati negativo diverso da quello dei bianchi fortificati a 0 004 ng g CCB Capacit di Errore B lt 5 Dalla valutazione delle Al massimo 1 falso rivelazione a 0 004 ng g prove di recupero negativo Robustezza Effetti di differenti condizioni Almeno 2 sessioni Nessuna variabilita tra i sperimentali analitiche eseguite in risultati complessivi differenti condizioni delle sessioni analitiche sperimentali 212 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Analisi statistica dei dati Per la verifica del CCB stata valutata l omoschedasticit dei dati per i campioni bianchi matrice e per i campioni fortificati mediante un F Test 5 di confidenza confrontando le varianze dei due gruppi nell ambito di ciascuna sessione di lavoro Per verificare che la differenza tra la media dei segnali dei bianchi matrice e dei campioni fortificati fosse si
418. tati emersi dai precedenti controlli in merito al rispetto della normativa comunitaria da parte degli operatori del settore mangimi OSM e tutte le informazioni a disposizione indicative di situazioni di non conformit Gli obiettivi dei controlli ufficiali cos come definiti dall art 10 del Reg CE 882 2004 possono essere raggiunti attraverso appropriati metodi e tecniche di controllo quali il monitoraggio la sorveglianza le verifiche le audit le ispezioni i campionamenti e le analisi Il piano quindi nell ottica degli scopi del regolamento diventa un utile strumento strategico per la gestione dei controlli promuovendo un approccio coerente e coordinato in tutti gli stadi della catena di produzione incluse le attivit di importazione e introduzione cfr definizione art 2 Reg CE 882 2004 identificando le priorit in funzione dei rischi e i criteri per definire la categoria di rischio delle diverse attivit del settore nonch le procedure di controllo indicando le fasi nella produzione del mangime significativi al fine della verifica della conformit alle disposizioni legislative incoraggiando l adozione delle buone pratiche a tutti i livelli del sistema di controllo nonch controlli efficaci sul sistema di tracciabilit Esso contiene informazioni sulla struttura e organizzazione del sistema di controlli ufficiali ossia le modalit secondo cui l Autorit centrale e le Autorit regionali locali insieme ad appositi Orga
419. tatione perissidasi GSH Px stato isolato omogeneizzando i linfociti in 1 mL di TRI REAGENT Applied Biosystems CA USA La quantificazione dello mRNA stata effettuata mediante saggio RPA Ribonucleotide Protection Assay Ambion Inc Austin TX USA come descritto precedentemente da Bernabucci et al 22 Specifiche sonde sono state generate utilizzando cDNA per GSH Px SOD e gliceraldeide 3 fosfato deidrogenasi GAPDH come controllo interno mediante RT PCR da RNA di linfociti bovini I differenti primers sono stati disegnati sulla base di sequenze bovine per GSH Px SOD e GAPDH pubblicate Tabella 1 Tabella 1 Sequenza dei primer PCR posizione nella sequenza codificante CDS lunghezza prodotti PCR e numero dell accessione in GeneBank delle sequenze nucleiche di bovino pubblicate Gene Sequenza del primer 5 3 CDS Lunghezza GeneBank for AACGCCAAGAACGAGGAGAT 265 336 X13684 GSH Px fev GGACAGCAGGGTTTCAATGT 600 66 for TGGAGACAATACACAAGGCTG 147 234 X54799 rev CTGCCCAAGTCATCTGGTTT 380 for TCATCCCTGCTTCTACTGGC 581 177 U85042 GAPDH rev CCTGCTTCACCACCTTCTTG 757 Forward Reverse La reazione di trascrizione inversa stata effettuata secondo il protocollo del produttore Superscript II GIBCO BRL Life Technologies USA Dopo trascrizione tutte le sonde sono state purificate a biotinilate mediante kit BrighstarTM Psoralen Biotin Ambion Inc Austin TX USA Per la quantificazione d
420. te hot spots distribuite in maniera casuale 4 La generazione di tale componente della variabilit stata affidata ad un generatore stocastico di Monte Carlo MTC gi utilizzato in studi analoghi 13 L assegnazione dei valori di E ed Ex alle sub partite generate dal modello nel corso delle simulazioni riepilogata in Tabella 1 Complessivamente stata simulata la generazione di 28 tipologie di sub partita caratterizzate da livelli differenti d eterogeneit tra un minimo E_5 Er100 e un massimo E 100 Er70 grado possibile Al fine di garantire che l assegnazione 105 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev della contaminazione alle singole SU costituenti la sub partita presentaasse un carattere realmente casuale true randomess la generazione delle SU stata sottoposta a verifica d autocorrelazione per valutare eventuali periodicit del processo di creazione delle sub partite 14 I test effettuati non hanno fatto registrare autocorrelazioni significative coefficiente d autocorrelazione rx compreso tra 0 046 e 0 039 P gt 0 1 per tutti i valori di ag compresi tra 1 ed 27644 cio il numero di SU totali costituenti la sub partita meno uno Tabella 1 Modalit di generazione delle partite a diverso grado di eterogenit nella distribuzione della contaminazione da AFB concentrazione nominale della sub partita 5 g kg Eterogeneit Modo Grado di generazione 1 2 3 4 5 6 7 EL RANDOM E1100 E175 E
421. te 10 anche se non trascurabile essendosi verificata una risposta significativamente differente p lt 0 0001 tra le sei variet relativamente al grado di suscettibilit al DON Tabella 1 Modello lineare generalizzato Log DON variet anno coltivazione areale Parametri caratterizzanti Valore statistico Significativit p Devianza 19795 Log verosimiglianza 48000 24157 lt 0 0001 x variet 1192 lt 0 0001 x anno 3646 lt 0 0001 Va coltivazione 2461 lt 0 0001 x areale 4932 lt 0 0001 118 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev I risultati ottenuti dall analisi dei campioni provenienti dalle otto localita considerate hanno fornito un quadro generale caratterizzato da bassi livelli di contaminazione da DON Infatti i valori medi e massimi dei campioni positivi registrati nel biennio 2007 2008 non hanno superato il limite massimo consentito 1750 ng g ad eccezione di un solo campione di Duilio 1894 ng g in coltivazione convenzionale Figura 1 valore limite 1750 A _ 1894 1000 800 N E biologico gt Hii convenzionale z 600 a 400 Da i i a Ciccio Simeto Duilio Iride Claudio Creso Ciccio Simeto Duilio Iride Claudio Creso Centro Variet Sud Figura 1 Valori medi massimi e minimi della concentrazione di DON nei campioni positivi delle sei variet comuni di frumento raggruppate in due macroareali nel biennio 2007 2008 Nella
422. teristiche di composizione In questo lavoro viene esaminato il flusso di alimenti sottoposti a controllo per la ricerca di micotossine provenienti da paesi extra europei negli anni 2001 08 prelevati da personale USMAF presso il porto di Ravenna e analizzati dal Laboratorio Integrato ARPA Sezione Provinciale di Ravenna Materiali e metodi Il campionamento di alimenti destinati alla ricerca di micotossine viene eseguito dal personale tecnico USMAF in base alle procedure stabilite dal Reg CE 401 2006 2 La merce all interno di un container trasportato via nave pu essere sfusa o contenuta in 600 700 sacchi da 25 30 kg o in una dozzina di sacchi da 650 kg big bag Nel caso di merce sfusa si ricorre al campionamento in stiva tramite l utilizzo di sonde nell altro caso il container viene svuotato e i sacchi di merce riposti in un magazzino dove avviene il campionamento Le partite di frutta a 76 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev guscio e spesso quelle di frutta secca sono maggiori di 15 t pertanto viene prelevato un campione globale di 30 kg che mescolato e suddiviso in 3 campioni di laboratorio del peso di 10 kg ognuno I 3 campioni di laboratorio sigillati e accompagnati dal verbale di prelievo sono consegnati alle strutture di ARPA che si occupano della loro omogeneizzazione e dell esecuzione delle analisi Attualmente sono a disposizione due tipologie di apparecchiature in grado di processare fino a 10 30 kg di prodo
423. ti sia per quanto riguarda la numerosita degli intervenuti sia per i lusinghieri commenti da parte degli stessi Di questo siamo particolarmente soddisfatti in quanto il successo mostrato per noi di fondamentale importanza per continuare a rispondere alle necessit e alle esigenze sia della Autorit Competente che del comparto ricerca e degli operatori interessati al settore delle micotossine a livello nazionale Questa edizione stata caratterizzata da alcuni aspetti innovativi con particolare riguardo alla presentazione delle pi strutturate e pi significative ricerche nazionali e internazionali riguardanti i temi classici sia della valutazione e gestione del rischio che della diagnostica I risultati presentati dai relatori hanno pertanto fornito una utilissima visione d insieme sulla ricerca fin qui dedicata alla situazione micotossine in Italia indispensabile punto di partenza per l avvio di progetti di ricerca innovativi armonizzati e di maggiore fruibilit per il settore produttivo al fine di meglio proteggere la salute del consumatore e la qualit del prodotto nazionale Pi specificatamente stata effettuata una disamina critica della distribuzione della progettualit evidenziando una sproporzione alquanto evidente fra le risorse investite nella diagnostica rispetto ad altri temi di ricerca incluso il campionamento Particolarmente puntuali sono stati gli interventi delle Autorit governative che hanno illustrato
424. ti e di proseguimento alimenti dietetici a fini medici speciali destinati specificamente ai lattanti 20 campioni a scelta tra le varie tipologie disponibili esclusi quelli a base di pesce di frutta e di vegetali Formaggi 20 campioni a scelta tra le varie tipologie disponibili Muscolo 20 campioni di muscolo suino Verificare l assenza di interferenti significativi nell intervallo di tolleranza massima definita per il tempo di ritenzione dell analita rispetto ad un campione fortificato ammesso che al massimo il 5 dei campioni analizzati dia un segnale significativo interferente con la rivelazione e o identificazione dell analita Ci significa che l errore B del metodo lt 5 e la presenza dell analita nel campione rivelata con una probabilit gt 95 Esattezza Per quanto riguarda l esattezza si consiglia di seguire queste indicazioni eseguire l analisi quantitativa per ogni sessione analitica calcolare il recupero per ogni prova effettuata per tutti i livelli di fortificazione calcolare il recupero medio e il suo scarto tipo per ogni livello di validazione e verificare che i valori del recupero medio ottenuti soddisfino i criteri riportati nella legislazione in funzione del livello di fortificazione effettuato 113 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Precisione E espressa mediante alcuni parametri in condizioni di ripetibilita sr scarto tipo o deviazione standard calcolata
425. ti raccolti dalle risposte al questionario inviato agli IZS marzo 2009 Strumentazione Per quanto riguarda la strumentazione tutti gli IZS tranne uno dispongono di strumentazione per l analisi in cromatografia liquida High Performance Liquid Chromatography HPLC cromatografia liquida spettrometria di massa ed Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ELISA I laboratori non preparano lo slurry del campione e preferiscono manipolare il campione a secco macinandolo con strumentazione a disposizione del laboratorio Sistema di qualit Tutti i laboratori hanno implementato un sistema qualit e il 67 dei laboratori accreditato secondo la norma UNI CEI EN ISO IEC 17025 2005 I metodi acccreditati riguardano l analisi delle principali micotossine Aflatossine totali Aflatossina M Ocratossina A Zearalenone Deossinivalenolo Fumonisine nei cereali e mangimi principalmente I metodi accreditati prevedono l analisi in HPLC ad eccezione di un 5 che viene eseguito in ELISA Tutti i laboratori accreditati utilizzano Materiali di Riferimento Certificati Certified Reference Material CRM e carte di controllo per tenere sotto controllo il dato analitico partecipano a circuiti FAPAS The Food and Environment Research Agency e studi 166 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev interlaboratorio per il controllo di qualita esterno Tutti i laboratori calcolano il recupero per esprimere il risultato delle analisi Tutti i laboratori effettua il
426. tografo liquido Agilent Technologies SL 1200 Series Waldbronn Germania corredato di rivelatore fluorimetrico modello G1321A e di un dispositivo per la derivatizzazione chimica post colonna LabService Analytica Srl Anzola Emilia BO Italia La colonna cromatografica scelta stata la ZORBAX Eclipse XDB C18 Agilent Technologies di dimensioni 150 mmx 4 6 mm con particelle di 5 um Le condizioni cromatografiche ottimizzate sono riportate nella Tabella 1 Tabella 1 Condizioni sperimentali ottimizzate Parametro Ottimizzazione del parametro Fase mobile Eluizione in gradiente a base di A Tampone Fosfato 0 1 M pH 3 15 B CH30H Flusso 0 8 mL min Volume di iniezione 100 uL Temperatura colonna 40 C Derivatizzazione post colonna mediante OPA Thiofluor F 0 4 mL min Temperatura di derivatizzazione 40 C Rivelazione fluorimetrica Xeccitazione 343 NM Aemissione 445 nm Preparazione del campione 5 g di campione macinato sono trattati con 2 x 12 5 mL di una miscela di acetonitrile metanolo acqua 30 30 40 per l estrazione delle Fumonisine Dopo sonicazione e centrifugazione a 3500 rpm 2 mL del filtrato aggiunti a 8 mL di PBS Phosphate Buffered 224 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Saline vengono purificati mediante colonnine ad immunoaffinita IAC contenenti anticorpi monoclonali immobilizzati Dopo lavaggio con 10 mL di PBS le FB e FB sono eluite con 4 mL di CH 0H Dopo evaporazione dell eluato sotto flusso d
427. tra il profilo cromatografico di una soluzione standard delle Aflatossine alla concentrazione totale di 2 5 ug kg e di un campione di mandorle additivato con AFB e AFG a 2 0 ug kg e AFB e AFG a 0 5 ug kg 0 44 0 40 0 36 0 32 Segnale L U 0 40 0 36 0 32 0 2 4 6 8 10 tempo min Figura 1 Cromatogrammi di una soluzione standard delle Aflatossine alla concentrazione totale di 2 5 g kg A e di un campione di mandorle fortificato con AFB e AFG a 2 0 pg kg e con AFB e AFG a 0 5 pg kg B L HPLC con rivelazione a fluorescenza pu essere adoperata come metodo quantitativo di conferma per la determinazione delle Aflatossine purch i requisiti del metodo soddisfino quanto indicato nel Reg CE 401 2006 11 Tale normativa individua i criteri di precisione e di accuratezza da soddisfare e definisce con il Reg CE 882 2004 10 i parametri di prestazioni del metodo da valutare Il metodo di analisi proposto stato validato sia per le materie prime per mangimi Tabella 2 che per i prodotti alimentari Tabella 3 I criteri di rendimento valutati su 2 sedute analitiche per i primi e su 3 sedute per i secondi a 0 5 1 ed 1 5 il limite massimo consentito sono risultati rispondenti a quanto definito nel Reg CE 401 2006 11 Tabella 2 Campioni di grano duro mangime riproducibilit intra laboratorio e recupero delle Aflatossine Aflatossina Livello di additivazione Recupero RSD
428. traverso cui le Fumonisine possono incrementare lo stress ossidativo e il danno cellulare 10 L espressione della SOD risultata significativamente ridotta dalla presenza di basse concentrazioni di AFB nel mezzo di coltura 5 ug mL nel caso d incubazione a 7 giorni L effetto della Tossina T 2 si manifestato con una significativa riduzione d espressione sia della SOD che della GSH Px p lt 0 05 enzima quest ultimo che risultato depresso anche dall esposizione al DON ad elevate concentrazioni 5 ug mL tanto a 2 che a 7 giorni d incubazione p lt 0 01 L esposizione alla FB ha prodotto una riduzione dose dipendente della sintesi di mRNA per la SOD a 7 giorni d incubazione p lt 0 05 e per la GSH Px sia nel caso di linfociti incubati per 2 che per 7 giorni p lt 0 05 Per quanto riguarda l espressione genica di SOD e GSH Px in termini generali stato osservato un decremento a fronte di incrementi consistenti dei ROM e del contenuto cellulare di MDA quest ultimo anche in assenza di una sostenuta deplezione di tioli intracellulari come osservato nel caso di esposizione a T 2 e DON In questo caso ipotizzabile che i Tricoteceni testati su linfociti bovini non siano in grado in vitro di indurre tossicit mediante stress ossidativo anche in presenza di lipoperossidazione delle membrane I risultati ottenuti indicano come vi siano delle differenze nell effetto che tricotecenti DON e T 2 da un lato e AFB e FB d
429. tre la modalit con cui viene effettuato il campionamento viepi determinante se si tiene conto della natura es tossigenesi pre raccolta vs post raccolta e della distribuzione delle contaminazioni Nel caso delle Aflatossine AF la distribuzione del carico contaminante all interno di partite di alimenti altamente eterogenea a causa della presenza di piccole porzioni di derrata altamente contaminate 4 Whitaker et al 5 hanno infatti dimostrato che nel caso di lotti di arachidi in guscio comune che anche solo un aliquota di semi inferiore all 1 o possa essere effettivamente contaminata da AF a livelli elevatissimi Per tali motivi da tempo numerose organizzazioni internazionali hanno prodotto linee guida e regolamenti nel tentativo di indicare le migliori strategie di campionamento in funzione dell entit e tipologia delle partite della sostanza indesiderata dei sistemi di trasporto e di movimentazione degli alimenti 1 6 A livello comunitario nel caso del controllo ufficiale di mangimi e alimenti zootecnici la modalit di campionamento oggi armonizzata dal Reg CE 152 2009 7 che pur fissando numerosit di campioni elementari entit del campione globale e modalit di estrazione dei sub campioni da destinare alla fase analitica non consente di individuare per le pratiche d autocontrollo una strategia adattabile alle esigenze dei diversi operatori della filiera agro zootecnica produttori stoccatori mangi
430. tre repliche di 371 probe dirette contro i geni del metabolismo del DNA e detossificazone del V cholerae in modo da verificare anche la specificit delle probe di V fisheri rispetto al V cholerae A questi probe sono stati aggiunti da Agilent i controlli positivi e negativi automaticamente aggiunti a seconda del formato scelto Il primo esperimento di espressione genica ha voluto verificare la specificit della slide A questo scopo abbiamo effettuato una titolazione combinando percentuali diverse di cRNA marcato di V Fisheri ed E coli per coprire il range 100 0 Tabella 5 Tabella 5 Esperimento di titolazione della slide per V fischeri cRNA marcato geni differenzialmente Fold change DS CV di V Fisheri E coli espressi t test p lt 0 05 valore medio valore atteso 100 75 65 1 31 1 33 0 09 7 100 25 77 3 65 4 00 0 53 14 75 25 72 2 82 3 00 0 30 11 DS Deviazione Standard CV Coefficiente di Variazione I risultati ottenuti sono soddisfacenti in quanto la correlazione tra array replicati risultata pari a 0 98 0 99 Agilent 0 99 la riproducibilita media inter array pari a 0 11 0 19 CV Agilent 0 08 0 11 considera accettabili sotto 0 2 e la riproducibilita intra array pari a 0 08 a 0 11 CV Agilent 0 06 0 08 L analisi trascrizionale degli effetti dovuti a trattamento con entrambe le micotossine stata condotta testando in triplo sia le molecole singole ad una concentrazione pari a 16 mg L che la combinazione
431. tti del metabolismo secondario dei funghi che possono avere effetti dannosi nell uomo e negli animali I funghi produttori di tali composti che maggiormente interessano le colture di frumento appartengono al genere Fusarium In particolare le specie F graminearum e F culmorum risultano le pi comuni produttrici di Deossinivalenolo DON fusariotossina di tipo tricotecenico 3 5 Sulla base della valutazione del rischio di esposizione dei consumatori e considerata l impossibilit di eliminare completamente il DON e pi in generale le micotossine sia dalla materia prima che dai prodotti finiti le azioni di prevenzione e contenimento con la definizione dei limiti ammissibili di contaminazione 6 7 rappresentano strumenti idonei per la tutela della salute Il limite massimo di concentrazione di DON ammissibile per il frumento duro non trasformato stato stabilito con questo regolamento pari a 1750 ng g Il frumento duro manifesta una pi marcata suscettibilit rispetto al tenero sia verso i funghi responsabili della fusariosi della spiga sia all accumulo del DON nelle cariossidi 8 9 Il metodo di coltivazione biologico con l impossibilit di ricorrere a fitofarmaci per il controllo dei funghi patogeni ha posto il problema dell eventuale aumento dei livelli di contaminazione da micotossine rispetto al metodo convenzionale Allo stato attuale dai lavori riportati in letteratura su questo argomento non possibile trarre una r
432. tto garantendo un elevato grado di omogeneizzazione un mulino a coltelli di tipo industriale per la macinazione a secco e un mixer verticale con testa disintegrante ad immersione per la macinazione ad umido 3 5 Il laboratorio ARPA di Ravenna utilizza principalmente la tecnica di omogeneizzazione ad umido raccomandata dalle linee guida redatte da organismi tecnici della comunit europea SANCO 1208 2009 6 La macinazione e omogeneizzazione dei campioni ad umido prevede la preparazione di un impasto semi fluido s urry costituito dal campione finemente macinato in presenza di acqua rispettando le proporzioni indicate in Tabella 1 Queste proporzioni sono indicative e possono variare in base alla capacit del campione di assorbire acqua Tabella 1 Rapporto ponderale campione acqua per l omogeneizzazione dei campioni con preparazione di s urry Tipologia di campione Campione Acqua p p Pistacchi in guscio 1 1 Arachidi in guscio 1 2 Arachidi nocciole pistacchi senza guscio fichi secchi 1 1 0 1 0 8 Mais grano e orzo 1 1 o 1 1 5 Derivati di cereali cracker ecc 1 1 o 1 2 Il laboratorio Integrato ARPA opera con un sistema di gestione della qualit conforme alla norma UNI CEI EN ISO IEC 17025 in ottemperanza alle disposizioni dell art 12 del Reg CE 882 2004 7 La determinazione delle Aflatossine viene eseguita secondo quanto previsto dal metodo AOAC 999 07 8 soggetto ad accreditamento SINAL e ISS Il metodo soddisf
433. ttoprodotti mangimi destinati al bestiame da latte per la ricerca di Aflatossina B Ocratossina A Zearalenone Deossinivalenolo Fumonisine mangimi complementari e completi mangimi per animali da compagnia cane e gatto per la ricerca di Aflatossina B e Ocratossina A materie prime avena grano e mangimi complementari o completi che le contengono per la ricerca delle Tossine T 2 e HT 2 71 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 2 Numero campioni diviso per regioni e per matrici secondo il Piano di sorveglianza relativo alle micotossine Regione Materie prime Mangimi Avena grano Totale e mangimi per per animali e mangimi con campioni animali da reddito da compagnia avena e grano Abruzzo 60 3 6 69 Basilicata 60 3 5 68 Bolzano 30 3 3 36 Calabria 60 3 6 69 Campania 60 8 10 78 Emilia Romagna 60 11 81 152 Friuli Venezia Giulia 60 3 9 72 Lazio 60 6 9 75 Liguria 60 3 4 67 Lombardia 60 35 56 151 Marche 60 3 8 71 Molise 60 3 5 68 Piemonte 60 16 53 129 Puglia 60 3 7 70 Sardegna 60 3 10 73 Sicilia 60 4 10 74 Toscana 60 7 22 89 Trento 30 3 3 36 Umbria 60 9 23 92 Valle d Aosta 60 3 3 66 Veneto 60 20 67 147 Totale 1200 152 400 1752 Piano di vigilanza Il piano di vigilanza rappresenta una verifica lungo l intera catena agro alimentare e zootecnica della conformit ai limiti massimi stabiliti dalle normative vigenti basata sull analisi del rischio per quelle micotossine aventi maggiore i
434. uardando la struttura chimica lo ZEA un lattone dell acido resorcinolico in grado di combinarsi con recettori estrogenici producendo una risposta estrogeno affine Per questa ragione lo ZEA oltre ad avere una specifica e acuta tossicit agisce come sostituto del 17 B estradiolo legandosi ai suoi recettori Di conseguenza esso si pu considerare come una sostanza ormonale che esibisce attivit anabolica e utertropica Uno studio italiano condotto dalla clinica pediatrica dell universit di Pisa in collaborazione con la Facolt di Medicina Veterinaria rivela un aumento di casi di pubert precoce nelle bambine nel Nord Ovest della Toscana probabilmente legati a tossine rilasciate nell ambiente da muffe del genere Fusarium tra cui la micotossina ad azione estrogenica ZEA Lo ZEA stato classificato dallo International Agency for Research on Cancer IARC come cancerogeno di categoria 3 per l inconsistenza della sperimentazione disponibile Possiamo dire comunque che in generale questa micotossina epatotossica ematotossica immunotossica e genotossica Recentemente stato approvato da parte del Ministero della Salute con nota prot 0001664 P 02 04 2009 DSVET il Piano vegetali presentato dagli IZS in attuazione del DM 27 Febbraio 2008 che trasferisce queste competenze ai suddetti Istituti 189 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Materiali e metodi Preparazione dei campioni Le specie di mangimi testate sono 6 campioni di gr
435. um species In Doyle MP Beuchat LB Montville TJ Food microbiology fundamentals and frontiers Washington DC ASM Press 1997 p 406 18 2 Marek P Annamalai T Venkitanarayanan K Detection of Penicillium expansum by polymerase chain reaction Inernational Journal of Food Microbiology 2003 89 139 44 3 Yao C Conway WS Ren R Sams CE 1998 Cloning and analysis of a gene encoding polygalacturonase in Penicillium expansum Direct Submission Genbank accession AF047713 246 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev DETERMINAZIONE SIMULTANEA DI AFLATOSSINE OCRATOSSINA A E TOSSINE DI FUSARIUM IN CEREALI MEDIANTE PURIFICAZIONE SU COLONNINE A IMMUNOAFFINIT MULTIANTICORPO E LC MS MS Veronica M T Lattanzio a Michele Solfrizzo a Stefania Della Gatta a Stephen P Powers b Angelo Visconti a a Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari ISPA Centro Nazionale Ricerche Bari b Vicam Group of Waters Technology Corp Watertown USA Introduzione Il sistema di allarme rapido europeo Rapid Alert System for Food and Feed RASFF vede le micotossine al primo posto tra i diversi contaminanti per numero di notifiche di superamento dei limiti massimi consentiti nelle derrate alimentari all importazione Tra le diverse categorie di prodotti monitorate quella dei cereali e prodotti a base di cereali merita una particolare attenzione per la suscettibilit alla contaminazione simultanea di diverse micotossine 1 La Commissione Eur
436. un rapporto quantitativo mediamente costante che va da 3 1 a 2 1 a favore della FB Il Reg CE 1881 2006 testo integrato del 23 07 08 impone nel valutare la conformit di un campione di analizzare le due Fumonisine nell insieme Per questo motivo si voluto testare con il sistema Microtox la tossicit acuta delle due Fumonisine sia singolarmente che in differenti combinazioni L analisi della tossicit acuta su V fischeri ci ha consentito di definire i valori di ECso per FB ed FB2 Come riportato in Figura 3 il Microtox mostra una buona linearit di risposta alle due Fumonisine con una sensibilit inferiore alla FB ECs pari a 93 mg L rispetto alla FB il cui valore di ECso risulta pari a 7 4 mg L 100 A FB E FB 10 E E D 1 0 1 10 100 1000 concentrazione mg L Figura 3 Linearit di risposta del test Microtox 90 basic test for pure compounds per FB e FB2 coefficiente gamma vs concentrazione Entrambe le Fumonisine sono inibitori competitivi della sintesi de novo degli sfingolipidi e sono in grado di inibire la ceramide sintasi Mentre il profilo tossicologico della FB abbastanza noto per la FB sono disponibili ancora pochi dati e ancor meno sul loro effetto combinato 5 14 Considerando che entrambe le micotossine provocano sul V fischeri un effetto tossico facilmente quantificabile diventa di particolare interesse studiarne l effetto combinato In Figura
437. un livello maggiore del LOD 15 ug kg ma inferiore al limite legale espresso come somma FB FB2 Soltanto tra mais polenta e farina di mais si riscontrano campioni non conformi C gt 1000 ug kg con percentuali variabili nell intervallo 14 38 228 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Bibliografia 1 10 11 12 13 Gelderblom WCA Jaskiewicz K Marasas WFO Thiel PG Horak MJ Vleggaar R Fumonisins novel mycotoxins with cancer promoting activity produced by Fusarium monoliforme Applied and Environmental Microbiology 1998 54 1806 11 Trucksess MW Mycotoxins The Journal of AOAC International 2001 84 202 11 Shephard GS Chromatographic determination of the Fumonisins mycotoxins The Journal of Chromatography A 1998 815 31 9 World Health Organizatiopn International Agency for Research on Cancer JARC monograph on the evaluaion of carcinogenic risk to humans Volume 82 Some tradiiotnal herbal medicines some mycotoxins naphthalene and styrene Lyon France IARC Press 2002 Unione Europea Regolamento CE N 1126 2007 della Commissione del 28 settembre 2007 che modifica il regolamento CE n 1881 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari per quanto riguarda le Fusarium tossine nel granoturco e nei prodotti a base di granoturco GUCE L255 29 settembre 2007 Unione Europea Raccomandazione 2006 576 CE della Commissione del 17 agosto 2006 sulla presenza di deo
438. unto una PCR tradizionale End Point PCR tramite il termociclatore 2720 Applied Biosystems utilizzando una coppia di primer OTA F OTA R che generano un prodotto di amplificazione di 141bp 4 Gli amplificati sono stati separati mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio alla concentrazione del 2 visualizzati al transilluminatore e mediante apposito software stata acquisita la foto stato considerato positivo il campione in cui il prodotto di amplificazione lungo 141bp Come controllo positivo interno stato usato un campione di DNA estratto da un ceppo di riferimento di A carbonarious NRRL67 Risultati Dall analisi del terreno emerso che il suolo di C da Casale Tesi A presenta un contenuto di calcare attivo pari a 117 g kg maggiore rispetto a quello riscontrato per il Campo Biesina Tesi B dove risulta pari a 25 g kg Si conferma quindi con il dato analitico la presenza dell ingiallimento fogliare dovuto a sintomi da clorosi I risultati dell analisi fogliare Tabella 2 fanno emergere che il contenuto di ferro presente nelle foglie prelevate dal vigneto insistente sul Campo Biesina Tesi B superiore rispetto a quello caratterizzato da suolo con un contenuto di calcare attivo superiore Campo Casale TESI A 35 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Tabella 2 Contenuto di ferro nelle foglie di vite cv Nero d Avola allevata su due suoli a diverso contenuto di calcare attivo Tesi A e B Pre
439. urificata mse su Sep Pak 50 1000 1500 2000 2500 3000 35 Figura 2 Confronto tra soluzioni standard di FB4 In alto standard analizzato tal quale controllo in basso soluzione standard passata su Sep Pak Si quindi deciso di impiegare tale metodo per il desalting di tutti i campioni di mais e prodotti a base di mais sottoposti a digestione 20 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Digestione in vitro di una soluzione standard di FB Prima di procedere con la digestione dei campioni il protocollo stato applicato ad una soluzione a concentrazione nota di FB pari a 5000 ng g allo scopo di valutare la possibilit da parte degli enzimi coinvolti e delle drastiche condizioni in cui la tossina viene a trovarsi durante il processo di degradazione dell analita Il risultato ottenuto dall analisi dello standard digerito stato quindi confrontato con quello fornito dall analisi di una soluzione standard di controllo di FB a 250 ng g concentrazione attesa dal campione sottoposto all esperimento qualora non si fosse verificata alcuna degradazione dell analita La Figura 3 mostra il confronto tra le aree ricavate sempre per lo ione quantitativo della tossina in esame di FB nella soluzione di controllo e nella soluzione alla quale stato applicato il protocollo di digestione Std_250ppb 3 MRM of 2 Channels ES 100 21 93 1017 722 4 gt 334 4 6 14e3 Area 3 4 tI i eta lia ri in ANITA pn 0 T T T T T T T T T T
440. utilizzando il Microtox toxicity test system su V fischeri ceppo NRRL B11177 Il trattamento simultaneo dei batteri luminescenti con FB e FB ha indotto un effetto sinergico significativo rispetto alla tossicit di ogni singola molecola Abbiamo inoltre sviluppato una slide per lo studio dell espressione genica di Vibrio fischeri proprietaria e stiamo attualmente caratterizzando la risposta sinergica osservata a livello trascrizionale 141 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Determinazione di FB e FB in HPLC MS MS in farine di mais Materiali e metodi Materiali La soluzione standard di una miscela di FB e FB in acetonitrile acqua ultrapura 50 50 v v alla concentrazione di 50 ug mL ciascuna stata acquistata da Biopure Tallin Austria e conservata a 20 C L acqua ultrapura utilizzata prodotta da un impianto Milli Q Micropore Corporation Billerica MA USA Tutti i reagenti sono forniti da Carlo Erba Reagenti Milano Italia l acetonitrile e il metanolo sono di grado HPLC il fosfato bibasico di sodio il fosfato monobasico di potassio e il cloruro di sodio utilizzati per la preparazione del tampone fosfato Phosphate Buffer Solution BPS sono di grado tecnico cos come l acido formico utilizzato come additivo per la soluzione eluente Le colonnine di immunoaffinit Fumoniprep sono della ditta Rhone Diagnostic Technologies Glasgow Scozia I campioni estratti sono filtrati con filtri di carta Carlo Erba Reag
441. uto di controlli ufficiali sulle importazioni di alcuni mangimi e alimenti di origine non animale Il Reg CE 669 2009 che si applicher a decorrere dal 25 gennaio 2010 fissa le norme relative al livello accresciuto di controlli ufficiali conformemente alle disposizioni di cui all art 15 paragrafo 5 del Reg CE n 882 2004 nonch stabilisce un elenco di mangimi e alimenti di origine non animale che sulla base dei rischi noti o emergenti deve essere oggetto di un livello accresciuto di controlli ufficiali nel punto di entrata designato Allegato I La Tabella 4 evidenzia i mangimi e gli alimenti di origine non animale che devono essere oggetto di un livello accresciuto di controlli ufficiali nel punto di entrata designato per quanto riguarda il rischio Aflatossine Sempre in relazione al rischio Aflatossine la Commissione ha anche emanato la Decisione 2008 47 CE che approva i controlli pre esportazione effettuati dagli USA sulle arachidi e i prodotti derivati per quanto riguarda la presenza di Aflatossine Nell ambito dei controlli ufficiali effettuati dagli Uffici di Sanit Marittima ed Aerea nell anno 2008 per i prodotti di origine non animale si evince come il controllo sulle micotossine incida per quasi la met dei controlli analitici totali in particolare per le Aflatossine spesso riscontrate sulla frutta secca di origine o di provenienza nota Come gi accennato la Decisione 2006 504 CE e successive modifiche ha individuat
442. velopment and validation of a liquid chromatography tandem mass spectrometric method for the determination of 39 mycotoxins in wheat and maize Rapid Communications in Mass Spectrometry 2006 20 2649 2659 8 Ren Y Zhang Y Shao S Cai Z Feng L Pan H Wang Z Simultaneous determination of multi component mycotoxin contaminants in foods and feeds by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2007 1143 48 64 9 Spanjer MC Rensen PM Sholten JM LC MS MS multi method for mycotoxins after single extraction with validation data for peanuts pistachio wheat maize cornflakes raisins and figs Food Additives amp Contaminants 2008 25 4 472 489 10 S rensen LK Elb k TH Determination of mycotoxins in bovine milk by liquid chromatography tandem mass spectrometry Journal of Chromatography B 2005 820 183 96 11 Lattanzio VMT Solfrizzo M Powers S Visconti A Simultaneous determination of aflatoxins ochratoxin A and Fusarium toxins by liquid chromatography tandem mass spectrometry after multitoxin immunoaffinity clean up Rapid Communications in Mass Spectrometry 2007 21 3253 61 250 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev 12 Unione Europea Regolamento CE n 401 2006 della Commissione del 23 febbraio 2006 Metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari GUCE L 70 9 marzo 2006 251 La riproduzione parziale o totale dei Rappo
443. verso l impiego di miscelatori conici VRIECO NAUTA volumi disponibili 5 10 e 240 L o con un sistema di rotazione su due assi planetario che consente di evitare travasi di materiale in quanto pu operare con contenitori commerciali di diversi volumi e materiali Per la macinazione dei materiali l impianto dotato di diversi sistemi con parti a contatto inerti o anti contaminazione che consentono la lavorazione di materiali di diverse caratteristiche meccaniche durezza friabilit ecc Altri componenti dell impianto sono sistemi per il setacciamento dei materiali sistemi per la ripartizione e l imbottigliamento di liquidi o solidi un apparato semiautomatico per la sigillatura delle fiale in vetro e una pasticcatrice automatica 178 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Presso il Centro Ricerche Casaccia sono stati realizzati laboratori per condurre le prove di stabilita sotto stress termico e luminoso di omogeneita e di caratterizzazione chimica e chimico fisica dei Matrix RM ed in corso di allestimento un laboratorio di metrologia chimica per la realizzazione di Calibrant RM Le facilities di irraggiamento presenti in Casaccia reattore Triga e impianto Calliope consentono l impiego della tecnica di Analisi per Attivazione Neutronica INAA per gli studi di omogencit stabilit e caratterizzazione degli RM e per la sterilizzazione degli RM mediante raggi y Gli impianti realizzati in considerazione dei materiali costruttiv
444. viene predisposto al fine di un costante monitoraggio per la tutela della salute dell andamento delle frodi e delle sofisticazioni alimentari sul territorio nazionale attuato a partire dal 1986 a seguito dell uso fraudolento del vino al metanolo il pi grave scandalo di adulterazione alimentare in Italia con conseguenze drammatiche nel 1986 delle partite di vino adulterato provocarono in Lombardia Liguria e Piemonte la morte di 19 persone e arrecarono gravi lesioni ad atre 15 Ai sensi dell art 6 della Legge n 462 1986 legge di conversione con modificazioni del DL n 282 1986 recante misure urgenti in materia di prevenzione e repressione delle sofisticazioni alimentari il Ministero della Salute definisce un programma sistematico di interventi mirati alla sicurezza alimentare impartendo nell ambito delle proprie competenze le direttive necessarie ai competenti servizi centrali e periferici di vigilanza e di repressione Ai sensi del comma 5 dell art 8 la relazione e i relativi dati vengono trasmessi annualmente al Parlamento 58 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Nei Paesi UE il controllo era armonizzato dalla Direttiva 89 397 CEE relativa al controllo ufficiale dei prodotti alimentari recepita in Italia dal DL vo n 123 1993 poi abrogata dal regolamento CE n 882 2004 Parimenti il DL vo n 123 1993 stato abrogato dal DL vo n 193 2007 Le competenti Autorit degli Stati Membri devono elaborare programmi che definisc
445. vitare i risultati falsi conformi L efficienza del metodo stata dunque valutata calcolando i valori di recupero su campioni naturalmente e sperimentalmente contaminati in condizioni di misura ottimizzate 161 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Ottimizzazione del sistema Sono stati ottimizzati in primo luogo parametri immunologici del saggio ELISA competitivo indiretto quali la selezione dell anticorpo specifico pi adatto la quantit di Tossina HT 2 da immobilizzare la quantit di anticorpo monoclonale specifico per T 2 ed HT 2 La selezione del clone stata fatta in base ai valori di cross reattivit che i vari anticorpi a nostra disposizione avevano nei confronti delle due tossine da analizzare stato scelto il clone HT 2 C12 B8 la cui cross reattivit era pi simile nei confronti delle due tossine in questo modo possibile determinare correttamente la somma delle due tossine La quantit di tossina da immobilizzare sulla superficie delle microparticelle magnetiche cos come la concentrazione di anticorpo specifico da utilizzare sono state studiate attraverso curve di binding Le prestazioni del sistema sono state valutate eseguendo l analisi su soluzioni standard di tossina preparate in tampone fosfato I risultati ottenuti in termini di limite di rivelazione sono soddisfacenti e adatte all analisi dei campioni di cereali da colazione e alimenti per l infanzia a base di cereali tenendo presente i limiti proposti ma non uf
446. x RM sottoinsieme D 4 I CRM come risulta dalle definizioni ISO REMCO e VIM sono RM BcA caratterizzati mediante una procedura metrologicamente valida per una o pi propriet e accompagnati da un certificato che ne fornisce i valori l incertezza e la riferibilit metrologica 171 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev a 2 5 Di no Figura 1 Famiglia dei materiali di riferimento I Calibrant RM sono RM CCA in cui il valore di una o pi propriet metrologicamente riferibile con un incertezza idonea all impiego per una specifica taratura 5 e quindi a differenza dei CRM possono anche non essere accompagnati da un certificato conforme ai requisiti della Guida ISO REMCO 31 6 I Matrix RM sono materiali stabili e omogenei per una o pi propriet DCRM quanto pi possibile simili per composizione e stato chimico e chimico fisico ai campioni da analizzare utilizzati in pi fasi del processo di misurazione per diversi scopi quali il controllo degli effetti matrice l individuazione delle fonti di incertezza e i controlli di qualit 7 La gran parte dei CRM sono Matrix RM BND altrimenti si tratta di sostanze pure o miscele impiegate per la taratura BNC BNCND o per indagini di tipo qualitativo B BND BNC Le diverse tipologie di RM le funzioni che questi possono assolvere durante il processo di misurazione e i parametri di scelta sono stati approfonditamente esaminati in un recente lav
447. y down e dell acqua libera durante il processo di maturazione in campo ii determinare le isoterme di sorbimento di granella di mais durante il suo sviluppo a 15 25 40 C iii determinare il miglior modello matematico per descrivere le tre isoterme di sorbimento Metodologia Durante la campagna 2007 campioni di mais sono stati raccolti da due campi aziendali in Piemonte seminati con l ibrido PR34N43 Pioneer Hi Bred nella terza decade di marzo I campioni sono stati raccolti settimanalmente a partire dal 60 1 di umidit della granella fino al 40 41 e poi due volte alla settimana fino al 17 1 Per ogni raccolta sono state prelevate tre ripetizioni da 10 spighe ciascuna in tre diversi punti dei campi I campioni sono stati sgranati e la granella accuratamente miscelata I campioni di granella sono stati quindi pesati e misurati per la determinazione della ay Aqualab 3TE by Decagon Devices range 0 030 1 000 ay accuratezza 0 003 a risoluzione 0 001 ay entro 10 15 minuti dalla raccolta I campioni sono stati poi essiccati in stufa ventilata a 103 C per 72 ore per la determinazione dell umidit American Association of Cereal Chemists and American Society of Agricultural Engineers Sei diversi modelli matematici trovati in letteratura sono stati parametrizzati attraverso regressione non lineare per descrivere le isoterme di sorbimento alle tre temperature e le loro performance son state valutate mettendo a confronto
448. zione e sulla riduzione delle Fusarium tossine in cereali e prodotti derivati GUCE L 234 35 29 agosto 2006 8 Romani S Pinnavaia GG Dalla Rosa M Caratteristiche qualitative e presenza di micotossine in grano duro infetto da Fusarium spp Tecnica Molitoria giugno 2005 617 24 9 Campagna C Haidukowski M Pancaldi D Pascale M Ravaglia S Silvestri M Visconti A Fonti di rischio e gestione delle micotossine nel frumento L Informatore Agrario 2005 1 39 47 122 10 1 12 13 14 15 16 17 Rapporti ISTISAN 10 32 Rev Edwards SG Fusarium mycotoxin content of UK organic and conventional wheat Food Additives and Contaminants 2009 26 4 496 506 Vanova M Klem K Misa P Matusinsky P Hajslova J Lancova K The content of Fusarium mycotoxins grain yield and quality of winter wheat cultivars under organic and conventional cropping system Plant Soil and Environment 2008 54 395 402 Pussemier L Pie Rard JY Anselme M Tangni EK Motte JC Larondelle Y 2006 Development and application of analytical methods for the determination of mycotoxins in organic and conventional wheat Food Additives and Contaminants 2006 23 11 1208 18 Koch HJ Pringas C Maerlaender B Evaluation of environmental and management effects on Fusarium head blight infection and deoxynivalenol concentration in the grain of winter wheat European Journal of Agronomy 2006 24 357 66 Pussemier L Larondelle Y Van Peteghem C Huy

III Congresso Nazionale "Le Micotossine nella filiera agro

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

III Congresso Nazionale &quot;Le Micotossine nella filiera agro

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

III Congresso Nazionale "Le Micotossine nella filiera agro