ImmunoBlot e ImmunoBlot XL
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1. una certa diminuzione di intensit del segnale pu essere osservato Gli anticorpi possono essere impoverito in piccolo volume del canale ImmunoBlot Aumentare la concentrazione di anticorpi piega 2 5 Aumentare il volume di soluzione di anticorpi per canale Per fare questo inserire standard 200 ul puntali di plastica in entrambe le porte d ingresso per ogni canale Questi fungono da serbatoi per i volumi di campione pi grande del volume del canale stesso mentre incubazi one a bilanciere Iniettare il campione degli anticorpi con una punta che rimane poi nella porta di ingresso e diventa un tale serbatoio Eseguire le incubazioni anticorpo secondario in un vassoio Vedere l Appendice A Nota 6 problema possibili cause raccomandazioni Nota Piccole bolle in genere muovono quando l unit scosso e di solito non influisce sui risultati Le soluzioni erano troppo freddo Gas disciolto emerge dalla soluzione al crescere della temperatura Portare le soluzioni a temperatura ambiente prima di caricare i campioni Canali contenuti residue gocce di liquido prima che i campioni sono stati caricati Inclinare l unit e liquido aspirato dalla estremit inferiore di ciascun canale con una pipetta di plastica attaccato ad una forte depressione Tecnica di pipettamento improprio stato utilizzato Sedile il puntale saldamente nel foro e numerato erogare il campione con una sola a2. Covare I Posizionare l unit su una piattaforma oscillante con i canali allineati nella direzione di oscillazione Nota Per ottenere risultati ottimali utilizzare una bassa velocit a dondolo da 5 a 6 cicli di inclinazi one al minuto Una piattaforma scuotimento rotatorio non efficace per questo scopo Incubare l unit sulla piattaforma oscillante dai 30 ai 60 minuti a temperatura ambiente 5Si veda l Appendice A Nota 5 Montaggio gli O ring nelle scanalature Rimuovere soluzioni anticorpo primario e lavare la macchia Utilizzare il collettore di lavaggio per rimuovere la soluzione di anticorpi e lavare il blot 9 Posizionare i 2 parti identiche del collettore di lavag gio nelle fessure su entrambi i lati della piastra supe riore e premere fino gli O ring sono seduti nel slots Per aspirare contemporaneamente tutti i campioni prima collegare pezzi di tubo fornito con l unit di entrambe le parti del collettore usando un raccordo luer Ora collegare l estremit aperta del tubo dal pezzo collettore di una trappola collegato ad una sorgente di vuoto Quindi posizionare l estremit aperta del tubo dal pezzo secondo collettore in un becher contenente tampone di lavaggio Quando si avvia le soluzioni anticorpo vuoto nei canali vengono rimossi e il tampone di lavaggio viene aspi rata dal lato Si prega di fare riferimento al protocollo di rilevamento occidentale per le istruz
3. nel ImmunoBlot In molti casi blocco soddisfacenti pu essere ottenuto mediante incubazione con PBS 10 vitello neonato serum 0 1 Tween 20 per un minimo di un ora a temperatura ambiente Tuttavia agenti bloccanti differiscono nella loro efficacia a seconda delle circostanze Per blot di lisati di cellule intere blocco 50 o il 100 di siero pu essere molto efficace nel ridurre il legame non specifico Nota 2 Allineare la membrana Per esperimenti di Western blotting importante che le corsie e bande di proteine sulla membrana allineati con i canali dell unit ImmunoBlot Questo pu essere realizzato in 2 fasi Passo 1 Utilizzare la appositamente progettati ImmunoBlot pettini al momento di elettroforesi Questo assicura che le corsie sul gel e successivamente le corsie e le bande proteiche sul blot sono allineati con i canali sul ImmunoBlot Combs con spaziature e che corrispondono le distanze corsia delle unit ImmunoBlot sono elencati di seguito Si prega di notare che il numero di pozzi non sempre corrisponde al numero di corsie in un rapporto di 1 1 9 pozzi x 45 A O O O campione pozzi Poi ERA ie se se ze se ze se ge se se ser ge se dos 14 TOA TO I LL seistes 56789 i 4 Oni CI STE 4 2 pe 1 z blot c
4. 9 Fax 1 508 893 0176 E mail support hoeferinc com Web www hoeferinc com Hoefer e ImmunoBlot sono marchi registrati di Hoefer Inc ECL un marchio di GE Health care gi Amersham Biosciences 2012 Hoefer Inc Tutti i diritti riservati Stampato negli USA Hoefer
5. anali lt Canali Blot sotto pozzetti dei campioni Canali Blot non sono sotto i pozzetti del campione Fig A Il pettine 9 ben 1 0 mm PR511 9 1 0 si allinea con i canali 45 del ImMmunoBlot XL e pu essere usato per sondare 9 campioni con fino a tre sonde per campione pll 12 pozzi x 25 canali __ O O O campione pozzi PERE TA ae LULU LI LI LIL LIL blot canali RO af l I l l t l l t L i 3 1 2 Canali Blot sotto pozzetti dei campioni Canali Blot non sono sotto i pozzetti del campione Fig B 12 ben 1 0 mm pettine PR511 12 1 0 si allinea con i canali 25 del IMmunoBlot e pu essere usato per sondare 12 campioni con una sonda per campione 25 pozzi x 25 canali O O O campione pozzi EURI fi I I iL UL I I UTI i U LIVELLO HLI I I I I OW i USL LU ELE LL LI LL U E UIL LI LIL E L blot canali ALILILLILILLLLLILILLIALLILILLLLLI 1 2 34 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Canali Blot sotto pozzetti dei campioni Fig C 25 ben 1 0 mm pettine PR511 25 1 0 allinea anche con i canali 25 del ImMmunoBlot e pu essere usato per sondare 25 campioni con una sonda per campione p12 Passo 2 Dopo che i ge
6. attenzione e comparare i contenuti con la packing list assi curandosi che tutti gli elementi arrivato Se una parte manca rivolgersi all ufficio vendite locale Controllare tutti i componenti per i danni che possono essersi verificati mentre l unit era in transito Se una parte risulta danneggiata contattate immediatamente Essere sicuri di mantenere tutto il materiale di imballaggio per richieste di risarcimento danni o per utilizzare qualora risultasse necessario restituire l unit 1Si veda l Appendice A Nota 1 Bloccando la membrana 2Si veda l Appendice A Nota 2 Allineamento della membrana Istruzioni Il dettaglio di seguito i passaggi per sondare una membrana utilizzando il ImmunoBlot Selezionare e bloccare membrana I Seleziona una membrana di scelta nitrocellulosa Hybond ECL PVDF Hybond P low fluorescent PVDF Hybond LFP per il saggio e tagliato a Lunghezza 15 cm Larghezza Tagliare per ospitare i canali da utilizzare larghezza massima per tutti i canali 15 cm 2 Membrane Block con eccesso non specifico protein Nota Se membrane bloccati sono stati immagazzinati in una proteina priva di soluzione loro re blocco per 1 a 2 minuti in un vassoio di soluzione bloccante Caricare membrana 9 Rimuovere la piastra superiore acrilico del ImmunoBlot e capovolgerlo 2 Con l antigene faccia portante della membrana rivolta verso i canali ImmunoBlot posizio
7. circa 5 pl di metile verde 0 1 soluzione in 50 glicerolo o pironina Y 0 05 in soluzione 50 glicerolo alle corsie desid erati Questi coloranti migrare appena prima del fronte di colorante blu di bromofenolo in gel e trasferir in modo permanente alla membrana Una seconda aliquota del colorante aggiunto al gel vicino alla fine della corsa elettroforetica entrer nel gel risolvere in 5 a 10 minuti e servono per segnare l inizio del gel Si prega di tenere presente che questi coloranti fluo rescenti possono interferire con i metodi occidentali di rilevazione blotting e deve quindi essere rimossa prima di imaging Se lasciato sulla membrana che si tradurr in segnali non specifici in fluorescente rileva mento Western blotting p13 p14 Nota 3 Eliminare le bolle Piccole bolle nei canali generalmente non influ enzare la reazione finale e dovrebbe muoversi avanti e indietro sulla superficie della membrana quando il ImmunoBlot viene agitata Per elimi nare bolle grandi prelevare la soluzione dal canale e ri iniettare Per ulteriori informazioni consultare la sezione Risoluzione dei problemi Nota 4 Volumi ottimali Il volume ottimale per i canali ImmunoBlot vari er leggermente a seconda del tipo di membrana impiegata La soluzione aggiunta dovrebbe quasi 95 riempire l intero canale Ridurre il volume se la soluzione si riversa fuori della porta di ingresso quando l unit incubato su una piattafor
8. ide della membrana agiscono come stoppini per luidi dalle aree adiacenti Sempre pre bagnato prima di montare la membrana nell unit Riempire ogni canale che copre la membrana con il tampone Membrane non coprire l intera unghezza del canale Assicurarsi che la membrana viene tagliato a misura corretta Fluido nei canali sovraccariche versato quando unit stata colpita causando la contaminazione dei canali adiacenti Non riempire troppo i canali Riutilizzati pastiglie di tenuta non sigillare correttamente Non riutilizzare pastiglie di tenuta in quanto comprimono durante l uso Vassoio di incubazione Considerate la vostra incubazione blot con anticorpo secondario nella ImmunoBlot piut tosto che di incubazione vassoio Vedere l Appendice A Nota 6 La membrana viene spogliato di bloccare proteine Si prega di fare attenzione a non togliere la macchia di bloccare le proteine mentre il lavaggio prima dell aggiunta di anticorpi primari Si prega di seguire le istruzioni dal vostro kit occidentale rilevamento blotting Un protocollo campione dato in Appendice B Canali non lavate conteneva anticorpi che ha contaminato l esperimento Pulire l unit dopo ogni uso Per i consigli per la pulizia vedere la sezione Clean ImmunoBlot a pagina 7 Sensibilit bassa Quando bassa affinit o anticorpi basso titolo sono utilizzati in diluizione elevata 1 100 000 o superiore
9. ioni di lavag gio Per il rilevamento occidentale si consiglia almeno 2 lavaggi rapidi nel buffer seguite da due pi lunghi lavaggi nel buffer 5 min mentre a dondolo suffici ente prima di introdurre gli anticorpi secondari Si veda l Appendice A Nota 6 Incubazione anticorpo secondario Introdurre anticorpo secondario e incubare L incubazione anticorpo secondario pu essere eseguita in unit o in un vassoio Per eseguire l incubazione nell unit ImmunoBliot 9 Iniettare la soluzione di anticorpo secondario nei canali accuratamente con una pipetta singola o multi canale Incubare l unit su una piattaforma oscillante con i canali allineati nella direzione di oscillare per 30 a 60 minuti a temperatura ambiente Aspirare la soluzione di anticorpo secondario utiliz zando una sorgente di vuoto o pipetta come descritto in precedenza pagina 5 fase 2 e lavare il blot con tampone di lavaggio per pochi secondi Lavare la macchia impedisce la contaminazione incrociata dei diversi canali di anticorpi secondari attraverso i canali durante la rimozione della macchia dall unit Raccomandazione Una soluzione all 1 di soluzione di pulizia 7X Flow Laboratories 50 ml di concentrato in 5 litri di acqua calda Nota Non sterilizzare in autoclave l unit ImmunoBlot o collettore di lavaggio Non esporre l unit ImmunoBilot ad alcool o altri solventi organici Rimuovere e svi
10. l sono cancellati le bande sulla membrana non sono visibili Aggiunta di un colorante reattivo non render facile allineare la membrana Ci pu essere fatto in due modi A Per carichi proteina pi grande gt 250 ng Ponceau S pu essere utilizzato per colorare le proteine revers ibilmente sulla membrana successivo trasferimento elettroforetico Sciacquare la membrana brevemente in acqua e macchia nello 0 2 Ponceau S per 1 o 2 minuti quindi Decolorare in diversi cambiamenti di acqua distillata fino a bande rosse appaiono su uno sfondo bianco Poich la macchia viene perso durante la successiva fase di bloccaggio bande proteiche devono essere marcati in questa fase con fori o con una matita appuntita La macchia pu anche essere fotocopiata Ponceau S macchie colorate possono essere conser vati per mesi a 4 C mantenuto umido tra fogli di carta parafilm o buffer saturo filtro Macchie possono anche essere congelati in un sacchetto di plastica Polvere Ponceau S deve essere sciolto in acqua distil lata per ottenere una soluzione di lavoro La soluzione pu essere riutilizzato per diverse settimane o mesi a seconda del numero di macchiato membrane B Per carichi proteico inferiore lt 250 ng verde di metile pironina Y o viola profondi possono essere usati per marcare in modo permanente alla parte superiore e inferiore del gel per successivo allinea mento con i canali ImmunoBiot Quando si carica il gel aggiungere
11. luppare la macchia 9 Svitare il ImmunoBlot e separare le due met 2 Eliminare il pad di tenuta utilizzato e lavare la membrana in un vassoio con 3 a 5 cambi di tampone per un totale di 10 a 15 minuti Sviluppare la macchia seguendo le istruzioni dal vostro kit per il rilevamento occidentale vedi anche appendice B Pulire il ImmunoBlot Pulire l unit accuratamente dopo ogni utilizzo eseguendo le seguenti operazioni Q Sciacquare l unit ImmunoBiot e collettore di lavaggio sotto l acqua distillata 2 Utilizzare un non abrasiva agente di pulizia alcalina laboratorio che non lascia residui dopo il risciacquo quale un detergente destinato pulizia coltura tissutale vetreria Detergenti concentrati devono essere diluiti alla forza normale Immergere l unit ImmunoBilot e collettore di lavaggio in soluzione detergente e spazzola delicatamente con una spazzola morbida facendo attenzione a non graf fiare le superfici interne Q Sciacquare l unit ImmunoBlot e lavaggio collettore accuratamente con acqua di rubinetto seguita da acqua distillata Per lavare facilmente i piccoli fori numerati montare l unit e le unit molteplici senza una membrana e pad di tenuta e risciacquare con acqua distillata Risoluzione dei problemi problema possibili cause raccomandazioni Perdite soluzione di anticorpi si spostata ai canali adiacenti Zone ar
12. ma oscillante Nota Fare attenzione quando si eseguono incubazioni cassetto perch gli anticorpi monoclonali a bassa affinit si pu dissociare dai loro rispettivi antigeni nel corso del tempo L incubazione in un vassoio consente di tali anticorpi per diffondere attra verso la soluzione di incuba zione e riassociare altrove sul blot Tale striature rilevabile come macchie tra corsie campi one o in corsie di controllo negativo in corrispondenza della posizione di uno o pi gruppi fortemente reattivi Nota 5 Montaggio delle O ring nelle scanalature Se i molteplici unit di lavaggio non si adattano con facilit nelle fessure applicare una piccola quantit di grasso al silicone intorno agli O ring Posizionare il gruppo collettore liberamente nella fessura e premere verso il basso sul lato del collettore verso di voi Quindi premere sul lato lontano dalla sede di collettore saldamente nella scanalatura Nota 6 Incubazioni anticorpo secondario Si prega di seguire le istruzioni fornite con il sistema occidentale di rilevamento blotting Quando l anticorpo secondario viene utiliz zato nel ImmunoBlot ad una diluizione elevata 1 100 000 o maggiore una certa diminuzione dell intensit del segnale pu essere osservato Ci pu essere dovuto a deplezione di anticorpi nel piccolo volume del canale Il problema pu essere generalmente corretta da 1 Aumentando la concentrazione anticorpale 2 5 volte 2 A
13. nare la membrana in modo che copra tutto il channels Inserire un nuovo pad a secco di tenuta in dotazione con l unit sulla membrana Q Impostare la piastra inferiore dell unit sulla piastra capovolta superiore modo che i perni di allineamento combaciare Assicurarsi che non vi sia spazio tra le piastre supe riore e inferiore Raccomandazione utilizzare una punta di pipetta monouso collegata ad un aspiratore d acqua a questo scopo Importante Fate attenzione a non toccare la punta della pipetta in qualsiasi punto della unit se non nel foro di campionamento desiderata 3Si veda l Appendice A Nota 3 eliminazione bolle Si veda l Appendice A Nota 4 volumi ottimali Aspirare e introdurre soluzioni di anticorpi I Aspirare il liquido in eccesso dai canali attraverso i fori numerati Nota per evitare l essiccamento della membrana i canali devono essere caricati entro cinque 5 minuti di aspirazione Aggiunta della soluzione di anticorpi attraverso i fori numerati Premere la punta della pipetta con fermezza in ogni foro e inietta il liquido rapidamente in una singola azione liscio fino a quando il canale pieno Fare attenzione a non introdurre bolle d aria Aggiungi tampone a tutti i canali inutilizzati che coprono la membrana numero di canale volume modello canali approssimativo ImmunoBlot 25 250 pl ImmunoBlot XL 45 140 pl
14. sce parallele Questa procedura distrugge tuttavia la corrispondenza tra corsie o posizioni diverse su un gel Il IMmunoBlot e ImmunoBlot XL preservare questa corrispondenza riducendo al minimo il volume dei reagenti di rilevazione necessari per corsie individuali Due lastre di plastica traspar ente uno liscio e uno con canali e bloccare un 15 x 15 cm della membrana trasferimento definire e separare le corsie gel originali in singoli canali Questi canali separati consentire l uso di reagenti di rilevazione diverse anticorpi primari e secondari coniugati anticorpi antigeni e o substrati di reazione in ogni canale pl Esistono 2 principali applicazioni per la ImmunoBlot e ImmunoBlot XL Antisieri multipla o sonde possono essere testati contro un unico campione di proteine o acidi nucleici Il singolo campione viene caricato attra verso l intera parte superiore di una lastra di gel quindi eseguire e cancellati a una membrana Quando fissato al ImmunoBlot la membrana pu essere testata contro antisieri o sonde multiple Un antisiero singolo o sonda pu essere testata contro antigeni multipli o acidi nucleici I due modelli differiscono nel numero e volume dei canali di reazione Il ImmunoBlot dispone di 25 canali che tengono un volume massimo di 250 pl ciascuno Il ImmunoBlot XL dispone di 45 canali che tengono un volume massimo di 140 pl ciascuno Disimballaggio e inventario Scartare tutti i pacchetti con
15. ta da 4 lavaggi pi in PBS T 4 x 5 min a dondolo Q Detection soluzione A e B sono miscelati e pipettati sulla membrana per una breve incubazione 8 Drenare eccesso di reagente di rilevamento e avvolgere la membrana in Saran Wrap prima dell esposizione ai raggi X film p17 Informazioni per l ordine prodotto quantit codice ImmunoBlot per l uso con gel di dimensioni standard 1 PR625 di membrana ad esempio SE600 25 corsie sonda distanziati 5 3 millimetri distanza Include piastra superiore piastra inferiore 2 viti collettore di lavaggio 2 pezzi 2 pezzi di tubi raccordi tubi e 5 pastiglie di tenuta ImmunoBlot XL per l utilizzo con lo standard membrana 1 PR645 gel imprese ad es SE600 45 corsie sonda distanziati 3 0 millimetri di distanza Include piastra superiore piastra inferiore 2 viti collettore di lavaggio 2 pezzi 2 pezzi di tubi raccordi tubi e 5 pastiglie di tenuta Pastiglie di tenuta di plastica 10 PR630 31 Lavaggio Kit Collettore 1 PR630 32 O ring 2 PR630 33 Collettore connettori Luer 4 PR630 34 Vite di serraggio 1 PR630 36 Pannello superiore per PR625 1 PR625T Pannello superiore per PR645 1 PR645T Piastra di fondo 1 PR630 37 Pettine 9 pozzi 1 0 mm 1 PR511 9 1 0 Pettine 12 pozzi 1 0 mm 1 PR511 12 1 0 Pettine 25 pozzi 1 0 mm I PR511 25 1 0 p18 Hoefer Inc 84 October Hill Road Holliston MA 01746 Numero verde 1 800 227 4750 Telefono 1 508 893 899
16. uale utente Italiano ImmunoBlot e ImmunoBlot XL Istruzioni per l uso mu PR645 IM Italian Rev B0 08 12 Atto e fe r Indice Intr odU ON ennetada oiea e a S Ee 1 Disimballaggio e inventario 2 IS FUZIONI ippici 3 Selezionare e bloccare membrana 3 Caricare membrana reidi ein 3 Aspirare e introdurre soluzioni di anticorpi 4 COVvalesanzi iaia aaa 4 Rimuovere soluzioni anticorpo primario e lavare la Mmacehidissn irnar aningen 5 Introdurre anticorpo secondario e incubare 6 Rimuovere e sviluppare la macchia 7 Pulire il IMMUROBIOt 7 Risoluzione dei problemi 8 Appendice A note tecniche 10 Appendice B rilevamento utilizzando ECL sistemi occidentali di rilevamento blotting 16 Informazioni per l ordine 18 Introduzione Trasferimento delle proteine o acidi nucleici frazionato mediante gel elettroforesi ad una superficie della membrana immobilizzazione aumenta la sensibilit di una vasta gamma di metodi di rilevazione riduce i tempi di analisi e rende possibile sequenziale sondaggio In particolare si reso possibile utilizzo di proce dure immunologiche che non sono pratico per realizzare in un gel Per materiale test su un foglio di membrana con sonde differenti contem poraneamente richiede comunemente primo taglio della membrana in un numero di stri
17. umentando il volume anticorpo o 3 Rimuovere la membrana dall unit ed eseguendo l incubazione anticorpo secondario in un vassoio p15 p16 Appendice B rilevamento utilizzando ECL sistemi occidentali di rilevamento blotting Hoefer raccomanda di eseguire etichettatura e la rilevazione sulle macchine seguendo le istruzi oni fornite nella etichettatura Western blotting e kit per il rilevamento Di seguito riportato un protocollo generale in base al GE Healthcare gi Amersham Biosciences ECL Kit occidentale Blotting Detection Ci sono diversi sistemi occidentali di rilevazione ECL blotting disponibili Il seguente protocollo generale si consiglia I Dopo l elettroforesi e trasferimento di proteine separate su nitrocellulosa o PVDF basso Hybond LFP fluorescenti per la massima sensibilit della membrana bloccare i siti aspecifici con una soluzione adeguata di blocco 2 Blocco seguita da due lavaggi in rapidi PBS 0 1 Tween PBS T Immergere e incubare la membrana con un anticorpo antigene specifico primario di concentrazione ottimizzato 4 Rimuovere la membrana con due lavaggi rapidi di PBS T seguita da 2 lavaggi pi lunghi 2 x 5 min a dondolo Incubare la membrana con una concentrazione otti male di anticorpo secondario coniugato n wu w j lt G Brevemente sciacquare la membrana con due cambi di tampone di lavaggio segui
18. zione liscia Pastiglie di tenuta erano umidi prima del montaggio Assicurarsi che gli elettrodi di saldatura siano asciutti prima di montarli sul ImmunobBlot Scarsa qualit o una pipetta scarsa manutenzione introdotto bolle nei canali Prova a iniettare campioni con una pipetta o una marca di punta Bolle formata nel tempo Mettere uno strato di pellicola trasparente tra la membrana e il pad di tenuta Collettore difficile da inserire O ring potrebbe essere necessario lubrificazione o sostituzione Per lubrificare e Rimuovere gli O ring accurata mente con la punta di una spatola piatta pesatura e Applicare grasso al silicone leggera e Reinstallare p9 p10 Appendice A note tecniche Nota 1 Blocco della membrana Le membrane devono sempre essere bloccato prima di montare in ImmunoBlot Si prega di seguire le istruzioni per il blocco previsto nel kit di rilevamento occidentale blotting Generalmente 5 di latte non grasso secco o 5 BSA sono usati come agenti bloccanti Blocco con detergenti Tween 20 o un altro sole non raccomandato in quanto potrebbe causare una lenta diffusione laterale delle proteine attra verso la membrana di nitrocellulosa consi gliabile eseguire la fase iniziale di blocco in una soluzione contenente proteina per esempio 5 BSA senza detergente Evitare lavaggi estese con soluzioni contenenti nessuna proteina prima di montare la membrana
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