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Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity

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1. 106 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 Funzionamento Prima di attivare l alimentazione seguire le istruzioni della sezione relativa all installazione Inoltre osservare quanto segue Non rimuovere i coperchi dello strumento mentre in funzione Prima dell accensione tutti i terminali a terra le prolunghe gli autotrasformatori e i dispositivi connessi devono essere collegati a massa mediante una presa a terra Qualsiasi interruzione della messa a terra protettiva causer un rischio potenziale di scosse elettriche con possibilit di lesioni gravi Laddove questa protezione risulti danneggiata necessario mettere lo strumento fuori fun zione e impedirne l uso Assicurarsi che siano utilizzati esclusivamente fusibili con la corrente nomi nale richiesta e del tipo specificato apertura circuito normale ritardo ecc Non utilizzare fusibili riparati ed evitare il cortocircuito dei supporti fusibile Alcune modifiche descritte nel manuale devono essere effettuate con la cor rente collegata e lo strumento privo di coperchi La corrente presente in molti punti pu in caso di contatto provocare lesioni alle persone Qualsiasi operazione di modifica manutenzione e riparazione dello strumento aperto sotto tensione deve essere per quanto possibile evitata Queste opera zioni quando inevitabili devono essere eseguite da persone competenti e con sapevoli del rischio a cui sono so
2. installare il Kit della valvola limitatrice della pressione in linea 64212 68001 vedere il manuale dei rivelatori a serie di diodi Agilent serie 1200 Infinity Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 67 3 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Come prevenire ostruzioni della colonna 68 Le colonne impaccate con particelle di dimensioni inferiori a 2 micron necessi tano anche di setti porosi con pori di piccole dimensioni per impedire che il materiale di impaccamento venga trascinato via Ci comporta un immediato aumento del rischio di ostruzione di questi setti porosi con particolati prove nienti dal campione dalla fase mobile e o dallo stesso strumento Per proteg gere la colonna possibile utilizzare ulteriori filtri di piccole dimensioni Figura 20 pagina 69 a monte della colonna Si consiglia inoltre di sottoporre il campione a filtrazione o e centrifugazione accurate e di evitare la presenza di qualsiasi tipo di particolato nelle fasi mobili Per ottenere risultati ottimali osservare le seguenti semplici linee guida per l uso 1 Installare e far funzionare la colonna solo nella direzione di flusso indicata sulla colonna stessa 2 Utilizzare esclusivamente solventi di alta qualit e grado cromatografico Prima dell uso filtrare tutte le soluzioni tampone acquose e tutti i campioni attraverso un filtro adatto da 0 2 um 4 Sostituire le bottiglie di tampone del
3. pe Agilent Technologies Informazioni legali Agilent Technologies Inc 2006 2008 2011 2013 Nessuna parte di questo manuale pu essere riprodotta in alcun formato o con alcun mezzo inclusa l archiviazione e la scansione elettroniche o la traduzione in una lingua straniera senza previo consenso scritto di Agilent Technologies Inc secondo le disposizioni di legge sul diritto d autore degli Stati Uniti internazionali e locali appli cabili Codice del manuale G1312 94303 Edizione 02 2013 Stampato in Germania Agilent Technologies Hewlett Packard Strasse 8 76337 Waldbronn Questo prodotto pu essere utilizzato come componente di un dispositivo diagnostico in vitro qualora sia stato registrato presso le autorit compe tenti e sia conforme alle disposizioni di legge vigenti In caso contrario destinato esclusivamente ad usi generici di laboratorio Versione software Il presente manuale valido per la versione A 01 04 di Agilent OpenLAB CDS Windows un marchio di Microsoft Cor poration registrato negli Stati Uniti Garanzia Le informazioni contenute in questo documento sono for nite allo stato corrente e sono soggette a modifiche senza preavviso nelle edizioni future Agilent non rilascia alcuna altra garanzia esplicita o implicita com prese le garanzie implicite di com merciabilit ed idoneit ad uno uso speci fico relativamente al presente manuale e alle informazioni in ess
4. Integration Events Value al Tangent Skim Mode Standard J Tail Peak Skim Height Ratio 0 00 eo Front Peak Skim Height Ratio 0 00 Skim Valley Ratio 20 00 i Baseline Correction Advanced Peak to Valley Ratio 500 00 ill J S g g 20 8 w Specific Events For Signal IN o Li DAD Default n pe a r r r r 3 2 3 4 5 e minj gt r Time Integration Events Value Time Area Height Width Area Symmetry Initial Slope Sensitivity 5 1 0 747 301 105 9 0 0452 29 738 0 718 Initial Peak Width 0 02 2 1 023 275 9 76 8 0 0539 27 257 0 64 Initial Area Reject 5 3 2 571 178 2 26 9 0 1013 17 604 0 634 Initial Height Reject 1 4 5 856 257 1 16 9 0 2255 25 401 0 676 Initial Shoulders OFF 2 Fare clic sull icona Set Integration Events Table fi per aprire la tabella come mostrato 3 Perle analisi del gradiente impostare Baseline Correction in Advanced Impostare Slope Sensitivity su 5 Valori superiori integrano i picchi pi ripidi e ignorano i picchi meno ripidi 5 Impostare il valore Peak Width sul picco di interesse pi stretto in questo caso circa 0 02 6 Per scartare i picchi pi bassi si possono impostare Area Reject e Height Reject 7 Fare clic sull icona Integrate ali per aggiornare i risultati in base a queste nuove impostazioni 8 Uscire dalla tabella Integration Events utilizzando l icona con il segno di spunta verde Dl 102 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema
5. Specificare il report Guida introduttiva 5 Analisi dei dati 1 Sulla barra del menu fare clic su Report gt Specify Report per visualizzare la finestra mostrata in figura Specify Report Instrument 1 t tt uantitation settings Report mode O Use Intelligent Reporting Style Report style Short Use Classic Reporting Quantitative result sorted by C Sample info on each page Add chromatogram output Add sample custom fields to sample info Report layout for uncalibrated peaks O Separately With calibrated peaks Destination File setting O Printer M Screen M Eile Unique PDF file name File prefix Report F Add fraction table and ticks Add summed peaks table Add compound custom fields Do not report Chromatogram output of pages Portrait Time fico Landscape Response 40 Multi page Landscape 1 Pages Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 103 5 104 Guida introduttiva Analisi dei dati Specify Report Instrument 1 Reporting settings Quantitation settings Calculation mode Calculate Percent IRA Based on Area v ISTD correction V Use multiplier and dilution factor with ISTDs Calculation factors Use sample data From Data File Compound
6. Capillare ST 0 12 mm x 180 mm S S Da autocampionatore a TCC Capillare ST 0 12 mm x 280 mm S S Da autocampionatore raffreddato a TCC o al componente 3 se installato Unit di riscaldamento lunga lato superiore0 12 mm d i 1 6 pL volume interno Unit di riscaldamento lunga lato inferiore 0 12 mm d i 1 6 uL volume interno Capillare ST 0 12 mm x 105 mm S S Da TCC a colonna non necessario se installato il componente 3 Capillare ST 0 12 mm x 150 mm S S Da colonna a rivelatore DAD Tubo in PTFE 0 8 mm x 2 m riordinazione 5 m Da rivelatore DAD a scarico Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 79 4 Configurazione e installazione del sistema Adescamento del sistema Quando Parti richieste Preparazioni ATTENZIONE Adescamento iniziale Prima di utilizzare un degassatore o un tubo del solvente necessario eseguire l adescamento del sistema Il solvente consigliato per eseguire l adescamento l isopropanolo poich miscibile con quasi tutti i solventi per HPLC e presenta eccellenti propriet bagnanti Quantit Descrizione 1 Isopropanolo Effettuare il collegamento idraulico di tutti i moduli come descritto nei rispettivi manuali Riempire ogni bottiglia di solvente con circa 100 mL di isopropanolo Accendere il sistema L apertura dei capillari o dei raccordi dei tubi potrebbe provocare la fuoriuscita del solvente I solventi e reagenti tossici o pericolosi po
7. Ciascuno di essi comprende una lunghezza d onda del segnale una larghezza di banda dei diodi raggruppati e se necessario una lunghezza d onda e una larghezza di banda di riferimento L uscita dei segnali pu avvenire a 80 Hz 80 punti dati secondo per la registrazione accurata dei picchi cromatografici pi rapidi i pi stretti Contemporaneamente il modulo pu anche inviare in uscita al sistema di dati gli spettri dell intervallo completo alla stessa fre quenza di 80 Hz Per i laboratori regolamentati importante che vengano registrati tutti i para metri dei metodi Il rivelatore DAD 1260 Infinity non solo registra i valori di regolazione dello strumento ma dotato anche di tag RFID tag di identifica zione a radiofrequenza integrati nella lampada e nella cartuccia della cella di flusso cosicch il sistema registra l identit e le variabili di questi importanti componenti Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto 1 Valvole Quick Change serie 1200 Infinity Le valvole Quick Change Agilent 1200 Infinity supportano un ampio spettro di complesse applicazioni basate sull uso di valvole Ogni testa della valvola dotata di un kit completo contenente tutti i capillari necessari scambiatori di calore a bassa dispersione aggiuntivi e altre parti Tra le applicazioni tipiche delle valvole Quick Change si annoverano Selezione di due
8. della temperatura 0 05 C e la specifica dell accuratezza 0 5 C con calibrazione Questi valori vengono raggiunti grazie alla combi nazione data dalla conduzione derivante dal contatto con i vani del termo stato dalla temperatura dell aria statica nell ambiente della colonna e soprattutto grazie al pre riscaldamento o pre raffreddamento della fase mobile ottenuto facendola passare attraverso uno scambiatore di calore prima che entri nella colonna In ogni modulo TCC vi sono due zone di temperatura indipendenti che possono funzionare insieme per colonne lunghe fino a 300 mm o funzionare a temperature diverse per colonne corte di lunghezza pari o inferiore a 100 mm Il modulo dotato di uno scambiatore di calore a bassa dispersione da 1 6 ul e ogni kit di valvole contiene in aggiunta altri scambiatori di calore a bassa dispersione per ciascuna colonna supportata Gli scambiatori di calore a bassa dispersione in numero massimo pari a 4 possono essere montati in modo flessibile nel modulo TCC Per le applicazioni HPLC convenzionali sono dispo nibili anche scambiatori di calore integrati da 3 ul e 6 ul Ogni modulo TCC pu alloggiare un sistema di azionamento interno delle val vole per facilitare le applicazioni basate sulla commutazione delle valvole dalla semplice commutazione tra due colonne alla rigenerazione alternata delle colonne alla preparazione del campione o al lavaggio in controcorrente della colonna Ogni tes
9. Configurazione e installazione del sistema 4 Capillari e tubi di collegamento nel circuito idraulico A seconda della configurazione del sistema si utilizzano capillari di varia lun ghezza e diametro I capillari sono descritti di seguito Vedere i manuali dei moduli per informazioni sui tubi e capillari di collega mento interni dei moduli Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 75 4 76 Configurazione e installazione del sistema Installazione dei moduli Collegamenti per la configurazione per volume di ritardo standard In Figura 21 pagina 76 sono mostrati i capillari e tubi di collegamento nel cir cuito idraulico per la configurazione per volume di ritardo standard del sistema LC binario 1260 Infinity Comparto solventi Degassatore Pompa Autocampionatore Termostato 2 Comparto colonne termostatato 3 4 Rivelatore DAD 5 Figura 21 Capillari e tubi di collegamento nel circuito idraulico configurazione per volume di ritardo standard Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Parte Codice 1 G1312 87303 1 G1312 87304 2 G1367 87304 2 01090 87306 3 G1316 87300 4 G1315 87311 5 5062 2462 5 5062 8535 Configurazione e installazione del sistema Descrizione Capillare ST 0 17 mm x 400 mm S S Da pompa ad autocampionatore Capillare ST 0 17 mm x 700 mm S S Da pompa ad autocampionatore raffreddato Capillare ST 0 17 mm x 250 mm S S Da au
10. Enable overlapped injection anche questa funzione commuta la valvola di iniezione dalla posizione di mainpass a quella di bypass dopo l esecu zione dell iniezione dopo che il campione stato eliminato dall iniettore o in uno specifico istante successivo dell analisi L iniettore aspira quindi il campione successivo in preparazione dell iniezione successiva ridu cendo cos il tempo di ciclo complessivo e aumentando l efficienza di ela borazione dei campioni Injection Valve Cleaning Injector Cleaning consente il lavaggio del sistema di iniezione con il sol vente Injection Valve Cleaning consente di commutare la valvola in momenti pre stabiliti durante l analisi per minimizzare l effetto memoria quando ven gono iniettati composti problematici Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 121 6 Appendice Impostazione di un metodo con la funzione di modifica di tutto il metodo Scheda dell autocampionatore ad alte prestazioni HiP ALS Injector Program Setup Method a HiPALS Injector Program H4 BinPump ag TCC 7 DAD lt Instrument Curves Parameter Draw default volume from sample with default speed using default offset ii Delete ii Clear all I Move up Paste Move down Figura 26 Schermata Imposta metodo Scheda del programma dell iniettore dell auto campionatore HiP Consente di creare procedure di iniezione specialistiche che prevedono la
11. I grafici di van Deemter in Figura 7 pagina 30 indicano che la riduzione delle dimensioni delle particelle aumenta l efficienza Il passaggio da particelle di dimensioni pari a 3 5 um e 5 0 um comunemente utilizzate a particelle da 1 8 um migliora in misura significativa le prestazioni Alle particelle da 1 8 um sono associati valori di altezza dei piatti da due a tre volte inferiori ed effi cienze proporzionalmente superiori Ci permette di utilizzare una colonna pi corta senza compromettere la risoluzione e di conseguenza anche il tempo di analisi si riduce di un fattore pari a due o tre L aumento di efficienza deriva in larga misura dalla riduzione dei percorsi di flusso multipli grazie alle minori dimensioni delle particelle fattore che comporta un valore minore della costante A diffusione vorticosa Inoltre particelle pi piccole impli cano tempi di trasferimento di massa pi brevi riducendo il termine C e si pu rilevare come l effetto complessivo sia una perdita di efficienza molto ridotta all aumentare della velocit di flusso la pendenza della curva diminui sce Ci significa che la separazione su particelle di dimensioni inferiori pu essere ulteriormente accelerata aumentando le velocit di flusso senza ridurre significativamente l efficienza 0 0045 0 0040 0 0035 0 0030 0 0025 5 0 um 0 0020 HETP cm piastra 0 0015 3 5 um 0 0010 0 0005 1 8 ym 0 0000 4 2 ml min 5 0 ml
12. o facendo clic con il pulsante destro del mouse sull interfaccia utente grafica di qualsiasi icona dei moduli e quindi selezionando Method nel menu contestuale Questo passaggio di Edit Entire Method costituisce la schermata del Setup Method suddivisa in sei schede per moduli o funzioni diverse Le schede sono autocampionatore ad alte prestazioni HiP ALS HiP ALS Injector Program pompa binaria BinPump Comparto colonna termostatato TCC Rivelatore a serie di diodi DAD Instrument Curves Per spostarsi tra le schede fare clic sul nome della scheda sulla parte alta della schermata Quando i parametri sono stati cambiati possono essere inviati immediatamente allo strumento facendo clic su Apply oppure quando tutte le schede sono state completate facendo clic su 0K si inviano ai moduli tutti i parametri la schermata si chiude e si passa alla schermata successiva Le schede per inserire i parametri hanno lo stesso aspetto in tutti i programmi di controllo ChemStation EZChrom MassHunter ecc per la scelta di Agilent di utilizzare driver RC Net comuni a tutti i moduli dello strumento Per analizzare la separazione della miscela campione come nel caso della mag gioranza dei metodi non necessario cambiare ogni parametro disponibile tuttavia essi verranno descritti nelle prossime sezioni per ragioni di comple tezza Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Scheda dell autocampion
13. sente di ampliare il ventaglio di possibilit volte ad accelerare la separazione In questa sezione vengono illustrati i metodi disponibili per aumentare la riso luzione esaminando quanto segue Ottimizzazione della selettivit e Impaccamento con particelle di dimensioni pi ridotte e Colonne di maggiore lunghezza e Gradienti meno pronunciati maggiore velocit di flusso Volume extra colonna minimo e Ottimizzazione di volume e solvente di iniezione Raccolta dati sufficientemente rapida La risoluzione tra due picchi descritta dall equazione della risoluzione 1 a 1 k 1 Rs 4 N 2 i 4 a k in cui R risoluzione e N piatti teorici misura dell efficienza della colonna e a selettivit tra due picchi ko fattore di ritenzione del secondo picco in precedenza noto come fat tore di capacit Il termine che incide in misura pi significativa sulla risoluzione la selettivi t a che in pratica pu essere variata utilizzando un diverso tipo di fase sta zionaria C18 C8 fenile nitrile e cos via e modificando la fase mobile e la temperatura per aumentare al massimo le differenze di selettivit tra i soluti da separare Si tratta di un complesso di operazioni piuttosto impegnative che preferibile affrontare ricorrendo a un sistema automatico di sviluppo di metodi che consente di valutare un ampio spettro di condizioni su varie colonne e con diverse fasi mobili tramite un preci
14. Al termine il solvente viene pompato per altri 15 s per pulire la porta di lavaggio Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 119 120 Location determina il vial o la piastra a pozzetti da utilizzare qualora sia stata selezionata l opzione Wash Vial I vial devono essere privi di setto ossia devono essere aperti per evitare il trasferimento di materiale sul setto con conseguente effetto memoria Repeat determina nel caso in cui sia stata selezionata la funzione relativa al vial di lavaggio quante volte l ago viene immerso nel vial imposta zione predefinita 3 valore massimo 5 Stop Time Post Time vengono impostati su No Limit Off e questi valori ven gono quindi definiti nella scheda della pompa Advanced Auxiliary Draw speed la velocit alla quale il campione viene introdotto nell ago Il valore predefinito 100 ul min La velocit deve essere ridotta in caso di campioni viscosi o per una maggiore precisione con piccoli volumi lt 2 uL di campione Eject speed la velocit di emissione dall ago Draw position lo scarto verticale dalla posizione di iniezione nominale di 10 mm al di sopra del fondo di un vial Ci corrisponde a circa met corsa lungo un vial da 2 ml pertanto necessario impostare uno scarto negativo affinch il campione venga prelevato in prossimit del fondo del vial ad esempio un valore pari a 7 mm posizionerebbe la punta dell ago a 3 mm dal
15. Attendere l equilibrazione del sistema alle condizioni della verifica elencate in Tabella 9 pagina 93 e in Tabella 10 pagina 94 per 10 min 8 Preparare un vial del campione di verifica isocratico Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 95 5 Guida introduttiva Impostazione del metodo Prerequisiti 96 In questa sezione illustrato come impostare rapidamente le condizioni del metodo per un analisi Il metodo predefinito DEF_LC M stato caricato in modo da predisporre la preparazione del nuovo metodo Ora si possono modificare i parametri principali per creare il nuovo metodo 1 Per accedere rapidamente alla pagina Method di ogni modulo fare clic con il pulsante destro del mouse sul diagramma del sistema per il modulo e sele zionare Method dal menu contestuale Tutti i moduli vanno impostati in questo modo Fare clic con il pulsante destro del mouse sull area della pompa e selezio nare Method dal menu contestuale a Nella pagina Method di 1260 Infinity Binary Pump inserire i seguenti para metri Flow rate Velocit di flusso 4 0 ml min Solvent A Solvente A selezionare Water dall elenco a discesa relativo alla compressibilit Solvent B Solvente B selezionare la casella di controllo per attivare il solvente B Impostare il valore di B su 60 Stop Time Tempo finale 1 min Post Time Tempo post analisi 1 min b Per gli altri parametri si possono lasciare i va
16. Delete Row Signal Description Figura 31 Dettagli segnale Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 135 136 Appendice Modifica eventi di integrazione La schermata Edit Integration Events pu essere anche raggiunta direttamente dalla finestra Method and Run Control facendo clic con il pulsante destro del mouse sull interfaccia utente grafica dell icona Eventi di integrazione e quindi facendo clic su Edit Integration Events nel menu contestuale Nella visualizza zione Data Analysis vi si pu accedere attraverso il menu Integration gt Integration Events o sull icona di attivit Edit Integration Events cb Calibration Ud Signal ID Pu du IS cd Report Short Eaa DADI A Sig 242 ONE MIX 008 D v EN t gt 21135 0 Method Manual Events IT Initial Events For All Signals Integration Events Value Tangent Skim Mode Standard Tail Peak Skim Height Ratio 0 00 Front Peak Skim Height Ratio 0 00 Skim Valley Ratio 20 00 Baseline Correction Classical Specific Events For Signal DAD Default Time Integration Events Value Initial Slope Sensitivity 5 Initial Peak Width 0 05 Initial Area Reject 5 Initial Height Reject 1 Initial Shoulders OFF Figura 32 Schermata Modifica eventi di integrazione L integrazione la calibrazione e la creazione del rapporto costituiscono la parte relativa all analisi dei dati del meto
17. Hz 5 Consumo elettrico 220 VA 74 W 253 BTU Massimo Temperatura ambiente operativa 4 55 C Temperatura ambiente non 40 70 C operativa Umidit lt 95 di umidit relativa a 40 C Senza condensa Altitudine operativa Fino a 2000 m Altitudine non operativa Fino a 4600 m Per l immagazzinaggio del modulo Standard di sicurezza Categoria di installazione Il Solo per uso all interno IEC CSA UL grado di inquinamento 2 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 23 1 24 Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto Specifiche delle prestazioni Tabella 2 Specifiche delle prestazioni della pompa binaria Agilent 1260 Infinity G1312B Tipo Specifica Commenti Sistema idraulico Intervallo di flusso impostabile Intervallo di flusso Precisione del flusso Accuratezza del flusso Intervallo della pressione operativa Pulsazione della pressione Compensazione della compressibilit Intervallo di pH consigliato Formazione del gradiente Due pompe con due pistoni in serie sistema di trasmissione a corsa variabile controllato da servomotore trasmissione con ingranaggi e viti a sfere pistoni flottanti Valori preimpostati nell intervallo 0 001 5 mL min con incrementi pari a 0 001 mL min 0 05 5 0 mL min RSD lt 0 07 o SD lt 0 02 min a seconda in base al tempo di ritenzione del maggiore dei due valori a temperatura amb
18. T J Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Guida introduttiva 5 Schermata dell analisi dei dati Per aprire un cromatogramma nella schermata Data Analysis 1 lanciare una sessione di ChemStation in modalit off line 2 Fare clic su Data Analysis sul lato in basso a sinistra della schermata 3 Nel Pannello di navigazione trovare la directory dei dati contenente i file dei dati Tutti i dati relativi alle singole iniezioni sono raggruppati sotto Single Runs Fare doppio clic su Single Runs per caricare questi file dei dati nella Tavola di navigazione 4 Selezionare un file nella Tavola di navigazione e fare doppio clic su essa per caricare il cromatogramma nel visualizzatore Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 101 5 Guida introduttiva Integrazione di un segnale 1 Selezionare lo strumento delle attivit di integrazione vedere la figura riportata di seguito Nella figura seguente sono evidenziate le icone Integrate e Set Integration Events Table E a Calibration Ul Signal DU Purity l s Spectrum fi E u Report snor it i DADIA Sig MO 005 0105 D SES OMON Ra ZA di 2N ALIN fa DADI A Sig 254 4 Ref 550 100 DEMO 005 0105 D E mU Method Manual Events I 100 il Initial Events For All Signals 8 80
19. asciugare la camera Per ottimizzare la durata del sensore di pressione non lasciare HFIP nella camera quando l unit spenta Zaffiro rubino e ceramiche basate su Al 03 Zaffiro rubino e ceramiche basate su ossido di alluminio Al903 sono inerti nei confronti di quasi tutti gli acidi le basi e i solventi di uso comune Non sono note incompatibilit documentate per le applicazioni HPLC Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 113 6 Appendice Agilent Technologies su Internet Per informazioni aggiornate su prodotti e servizi visitare il sito Web di Agilent al seguente indirizzo http www agilent com 114 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 Impostazione di un metodo con la funzione di modifica di tutto il metodo In ChemStation un metodo contiene tutti i parametri per l acquisizione dei dati per il controllo del sistema e per l analisi dei dati per l elaborazione dei dati per fornire risultati quantitativi e qualitativi Ai parametri si accede attraverso una serie di schermate ognuna dedicata a un modulo o funzione A queste schermate si accede facendo clic su un icona dell interfaccia utente gra fica GUI o tramite i menu a discesa della barra dei menu Un nuovo metodo pu essere creato caricando e modificando un metodo esistente oppure cari cando e modificando il modello in bianco del metodo DEF_LC M Per modificare solo alcuni parametr
20. colonne Arricchimento del campione e Pulizia del campione Rigenerazione alternata delle colonne Applicazioni speciali quali lo sviluppo di metodi o applicazioni 2D LC Per descrizioni dettagliate di queste applicazioni fare riferimento al manuale per l utente delle soluzioni basate su valvole Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 21 1 Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto Specifiche 22 Il design modulare del sistema LC binario 1260 Infinity consente di configu rare un sistema che risponde perfettamente alle specifiche esigenze delle sin gole applicazioni La specifica configurazione pu differire dalla configurazione standard descritta nel manuale per l utente del sistema Di seguito sono riportate le specifiche fisiche e delle prestazioni della pompa binaria 1260 Infinity Informazioni sulle specifiche degli altri moduli inclusi nel sistema sono disponibili nei rispettivi manuali per l utente dei moduli Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto 1 Specifiche fisiche della pompa binaria 1260 Infinity G1312B Tabella 1 Specifiche fisiche Tipo Specifica Commenti Peso 15 5 kg Dimensioni 180 x 345 x 435 mm altezza x larghezza x profondit Tensione di rete 100 240 VAC 10 Sono accettati valori di tensione ampiamente diversi Frequenza di rete 50 o 60
21. con acqua le linee di solvente con concentrazioni elevate di sale gt Non eseguire le operazioni dal passo 5 al passo 7 per i canali in cui si utilizza come solvente una soluzione tampone acquosa 5 Sostituire la bottiglia del solvente con una bottiglia di isopropanolo Irrigare il canale con una velocit di flusso idonea al tubo installato nor malmente 3 5 mL min per 5 min 7 Scambiare la bottiglia di isopropanolo con una bottiglia di solvente per l applicazione 8 Ripetere i passaggi da 1 a 7 per gli altri canali della pompa Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 83 4 84 Configurazione e installazione del sistema 9 Installare la colonna desiderata impostare la composizione e il flusso richiesti dall applicazione ed equilibrare il sistema per circa 10 minuti prima di avviare un analisi Tabella 8 Scelta dei solventi per l adescamento in base al tipo di attivit Attivit Solvente Commenti Dopo l installazione Nel passaggio tra fase inversa e fase normale entrambe le volte Dopo l installazione Per la pulizia del sistema in caso di utilizzo di tamponi Dopo aver sostituito i solventi acquosi Dopo l installazione di guarnizioni per fase normale Tenute PE confezione da 2 0905 1420 Isopropanolo Isopropanolo Etanolo o metanolo Acqua di grado HPLC Acqua di grado HPLC Esano 5 di isopropanolo Solvente ideale per far fuoriuscire l
22. consente di analizzare fino a 768 campioni senza l intervento dell operatore Principio di funzionamento dell autocampionatore Durante la sequenza di campionamento i movimenti dei componenti dell auto campionatore vengono continuamente controllati dal processore dell autocam pionatore Il processore definisce intervalli temporali e intervalli meccanici specifici per ciascun movimento Se una determinata fase della sequenza di campionamento non viene completata correttamente viene visualizzato un messaggio di errore Tramite la valvola di iniezione il solvente by passa l auto campionatore durante la sequenza di campionamento L ago si sposta sulla posizione desiderata del campione e viene fatto scendere nel liquido conte nente il campione per consentire al dispositivo di dosaggio di aspirare il volume desiderato ritraendo lo stantuffo di un tratto specifico L ago viene quindi risollevato e spostato nella sede per chiudere il loop del campione Il campione viene introdotto nella colonna quando la valvola di iniezione ritorna nella posizione di mainpass al termine della sequenza di campionamento La sequenza di campionamento standard viene eseguita nel seguente ordine 1 La valvola di iniezione si sposta nella posizione di bypass 2 Lo stantuffo del dispositivo di dosaggio si sposta nella posizione di inizializ zazione Il blocco dell ago si sposta verso l alto 4 L ago si sposta sulla posizione desiderata del vial o della piastra a pozz
23. consente di memorizzare insieme ai dati flussi di dati monitorati diversi dai segnali del rivelatore Questi vengono principalmente usati a scopi diagnostici e sono elencati qui di seguito e Pompa pressione flusso composizione A B pu essere utile per sovrapporre il profilo del gra diente su un cromatogramma e Comparto colonna termostatato temperatura dello scambiatore di calore sinistro destro e Rivelatore temperatura della scheda temperatura dell unit ottica tensione anodo della lampada UV 134 Appendice Analisi dei dati Dettagli segnale La schermata Signal Details pu anche essere raggiunta direttamente dalla visualizzazione Method and Run Control fare clic con il pulsante destro del mouse sull interfaccia utente grafica sull icona Calibration e quindi selezionare Signal Details dal menu contestuale Nella visualizzazione Analisi dei dati si pu accedere attraverso il menu Calibration gt Signal Details La schermata Signal Details il passaggio successivo di Edit Entire Method che indica all Analisi dei dati quale tra i segnali acquisiti elaborare La casella a discesa elenca i segnali disponibili compresi i segnali analitici definiti nelle impostazioni del rivelatore nonch i parametri registrati come temperatura flusso composizione pressione e tracce diagnostiche Selezionare un segnale e fare clic su Add to Method per trasferirlo alla tabella Signal Details mostrata nella parte bassa dello scherm
24. di eliminazione del campione Sample Info Informazioni sul campione Sample name Nome campione Save Salva Save As Salva con nome 145 Glossario IU Save Method As Salva metodo con nome Save Method As Salva metodo con nome Save Method with Data Salva metodo con dati Screen Schermata Select Run Method Task Seleziona attivit di esecuzione del metodo Selected Signal Segnale selezionato Selected Signals Segnali selezionati Set Integration Events Table Imposta tabella degli eventi di integra zione Setup Instrument Method Imposta metodo dello strumento Setup Method Imposta metodo Show timetable graph Mostra grafico della tabella di pro grammazione Signal A Segnale A Signal Description Descrizione segnale Signal Details Dettagli segnale Signal Window 1 Finestra del segnale 1 Signals Segnali Single Runs Analisi singole Size Dimensioni 146 Skip Ignora Slope Sensitivity Sensibilit della pendenza Solvents Solventi Specific Events For Signal Eventi specifici per segnale Specify Report Specifica rapporto Spectrum Store Memorizzazione spettro Standard Data Analysis Analisi standard dei dati Standard injection Iniezione standard Step Passo Stop Time Tempo finale Stop Time Post Time Tempo finale Tempo post analisi Stoptime Tempo finale Store Memorizza Style Stile Subdirectory Sottodirectory Switch module name on Accendi nome del modulo System On Off Accensione Spegnimento d
25. durante il normale funzionamento nella maggior parte dei casi ci assicura un efficace eliminazione dell effetto memoria La funzione di riduzione auto matica del volume di ritardo ADVR consente di ridurre il volume di ritardo ma riduce anche il lavaggio dell autocampionatore e non deve essere utilizzata con analiti potenzialmente in grado di provocare problemi di effetto memoria Per ottenere un effetto memoria minimo osservare le seguenti raccomanda zioni e Utilizzare sempre l autocampionatore con la valvola di iniezione nella posi zione di mainpass e Lavare la superficie esterna dell ago con un solvente adatto utilizzando la porta di lavaggio La durata del lavaggio deve essere pari ad almeno 10 s Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 53 3 54 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Se possibile ridurre la velocit di aspirazione a 10 uL min e Utilizzare vial con tappo Agilent da 2 mL Fiala con tappo a vite 2 mL 5182 0556 Sela sede contaminata utilizzare un opportuna procedura di lavaggio della sede e Utilizzare solventi di lavaggio in grado di dissolvere i composti del cam pione Utilizzare fasi mobili acide per i composti basici Lavaggio e pulizia dell autocampionatore per ottenere un effetto memoria pressoch nullo Nel corso della routine di iniezione il loop del campione la parte interna dell ago il capillare della sede e il can
26. fondo del vial Equilibration time indica il tempo di ritardo tra l aspirazione del campione e il movimento dell ago Sample flush out factor stabilisce il tempo di attesa dell autocampionatore dopo l iniezione prima di permettere alla valvola di commutare in posi zione di bypass Ci assicura che la zona del campione sia libera dall ago dalla sede e dalla valvola di iniezione Il valore predefinito 5 Vial Well bottom sensing un alternativa all utilizzo dello scarto per la posizione di aspirazione L ago si muove lentamente verso il basso finch non tocca il fondo del vial o del pozzetto e quindi si solleva di 1 mm Si tratta di un modo versatile per assicurarsi che l ago si trovi in prossimit del fondo del vial ma il completamento dell iniezione richiede un tempo leggermente superiore inoltre questa opzione non deve essere utilizzata se sul fondo del vial sono presenti particolati che potrebbero ostruire l ago Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 Advanced High Throughput Automatic delay volume reduction ADVR commuta la valvola di iniezione dalla posizione di mainpass a quella di bypass dopo l esecuzione dell inie zione e dopo che un volume definito dal fattore di eliminazione del cam pione stato fatto passare attraverso l iniettore Ci riduce il volume di ritardo del sistema di circa 70 ul e consente alle variazioni di gradiente di raggiungere prima la colonna
27. intervallo di pH compreso tra 1 e 10 e nella mag gior parte dei solventi organici incompatibile con gli acidi minerali concen trati per esempio l acido solforico l acido acetico glaciale il DMSO e il THF Inoltre soggetta a degradazione da parte di sostanze nucleofile quali l ammo niaca per esempio i sali ammonici in presenza di condizioni basiche o gli ace tati Polietilene PE Agilent utilizza miscele di PTFE PE UHMW peso molecolare ultra elevato per le guarnizioni gialle dei pistoni e le guarnizioni di lavaggio presenti nelle pompe 1290 Infinity e per le applicazioni in fase normale nelle pompe 1260 Infinity Il polietilene dotato di buona stabilit nei confronti della maggior parte dei solventi inorganici comuni inclusi acidi e basi in un intervallo di pH compreso tra 1 e 12 5 compatibile con molti solventi organici utilizzati nei sistemi cro matografici quali metanolo acetonitrile e isopropanolo caratterizzato da Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 una stabilit limitata nei confronti di idrocarburi alifatici aromatici e aloge nati THF fenolo e derivati acidi e basi concentrati Per le applicazioni in fase normale la pressione massima non deve superare 200 bar Tantalio Ta Il tantalio inerte nei confronti della maggior parte dei solventi HPLC e di quasi tutti gli acidi eccetto l acido fluoridrico e gli acidi con anidride solforica libera P
28. min 0 0005 T 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 1 2 1 4 1 6 Velocit interstiziale lineare uy cm sec Figura 7 Curva di Van Deemter per particelle di diverse dimensioni Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Introduzione 2 Una separazione cromatografica pu essere ottimizzata in base ai parametri fisici della colonna HPLC quali dimensione delle particelle dimensione dei pori morfologia delle particelle lunghezza e diametro della colonna velocit del solvente e temperatura Inoltre possibile prendere in considerazione la termodinamica di una separazione e regolare le propriet del soluto e delle fasi mobile e stazionaria percentuale di solvente organico forza ionica e pH in modo da ottenere i tempi di ritenzione pi brevi e la massima selettivit possibili Adsorbimento o de adsorbimento lento Isoterme non lineari Equilibrio chimico pH Pressione Dimensione delle particelle porosit Propriet della fase mobile e dimensioni della colonna velocit di flusso di quella stazionaria propriet temperatura del soluto temperatura Figura 8 Selezione delle condizioni ottimali per l HPLC Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 31 2 32 Introduzione La risoluzione pu essere descritta in funzione di tre parametri efficienza della colonna o piatti teorici N e selettivit a e fattore di ritenzione k In base all equazione della ris
29. necessario quando la colonna supera i 15 cm di lunghezza e deve essere supportata da entrambe le sezioni I due lati possono operare separatamente quando necessario disporre di due colonne che funzionano a temperature diverse Questa fun zione pu essere attivata quando installata anche una valvola di commu tazione per alternare tra loro le due colonne Un altro impiego di zone di temperatura separate si ha quando la colonna viene fatta funzionare a una temperatura elevata ad esempio superiore a 60 C da un lato mentre lo scambiatore di calore sull altro lato viene utilizzato per raffreddare l eluente prima che entri nel rivelatore riducendo cos il rumore dovuto agli Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 127 6 Appendice effetti termici nella cella di flusso Selezionando l opzione As Detector Cell viene letta automaticamente la temperatura della cella nel rivelatore La temperatura di ogni zona pu essere impostata da 5 C a 100 C e spetta all utente verificare che la specifica colonna sia compatibile con la temperatura impostata La fase StableBond delle colonne Agilent ZORBAX RRHT possono essere utilizzate all estremo superiore dell intervallo La temperatura controllata con una precisione pari a 0 15 C fino a 10 C al di sotto della temperatura ambiente tenere presente tuttavia che sono poche le applicazioni eseguite a temperature inferiori a 12 15 C Evitare l utilizzo del modu
30. pari a 0 12 mm verificare che la lunghezza del collegamento tra colonna e rivelatore sia ridotta al minimo e della cella di flusso a cartuccia Max Light Infine qualsiasi guadagno in termini di risoluzione deve essere preservato uti lizzando una velocit di raccolta dati sufficientemente rapida da ottenere pro fili accurati dei picchi stretti Riepilogando per aumentare la risoluzione tenere presente quanto segue Il primo passaggio nel miglioramento della risoluzione consiste sempre nel testare una serie di fasi stazionarie in modo da selezionare la colonna carat terizzata dalla separazione migliore Si tratta del parametro pi importante per quanto riguarda la risoluzione Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 57 3 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Il secondo passaggio consiste nell utilizzo di colonne lunghe o addirittura di colonne accoppiate per aumentare i piatti teorici e Un terzo passaggio consiste nello spostare i picchi a fattori di ritenzione pi alti Nel caso di valori k compresi tra 5 e 10 le conseguenze sono significa tive Nel caso di valori k pi alti l effetto molto contenuto In pratica ci significa che colonne pi lunghe aventi selettivit adeguata for niscono una migliore risoluzione 58 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Configurazi
31. schermata successiva Si tratta di un processo a senso unico Se si preme inavvertitamente 0K prima di aver immesso tutti i valori necessario utilizzare il tasto Cancel e ricominciare la procedura Edit Entire Method In alternativa proseguire e tornare alla schermata non completata una volta terminato Facendo clic su Cancel viene visualizzato il pulsante Skip che permette di ignorare le schermate rimanenti Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 Impostazione di un metodo con la funzione di modifica di tutto il metodo Informazioni sul metodo La schermata Method Information pu anche essere raggiunta direttamente dal menu Method gt Method Information o facendo clic con il pulsante destro del mouse sull interfaccia utente grafica Questa scheda permette di inserire informazioni sul metodo Queste informa zioni compariranno sopra il diagramma del sistema nella schermata Method and Run Control ogni volta che il metodo viene caricato e risiede nella memoria Method Intormation Instrument 2 Method Comments This method runs the test sample to demonstrate how to run an analysis Figura 24 Informazioni sul metodo Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 117 118 Appendice Strumento Acquisizione Impostazione del metodo dello strumento La schermata Setup Method pu essere raggiunta direttamente dal menu Instrument gt Setup Instrument Method
32. seconda del maggiore dei due valori lt 0 15 RSD o lt 0 04 min SD a seconda del maggiore dei due valori 0 35 assoluta a 2 mL min a 10 MPa 100 bar Software di controllo Agilent ad esempio ChemStation EZChrom OL MassHunter Agilent Instant Pilot Per il monitoraggio della pressione 1 33 mV bar una uscita CAN rete area controllore RS 232C APG remoto segnali di pronto avvio interruzione e arresto LAN opzionale Ampio supporto per la risoluzione dei problemi e la manutenzione tramite Instant Pilot Agilent Lab Advisor e Chromatography Data System Le funzioni correlate alla sicurezza includono rivelazione delle perdite gestione delle perdite in sicurezza segnale di perdita in uscita per lo spegnimento del sistema di pompaggio e bassa tensione nelle principali aree soggette a manutenzione Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema misura effettuata con acqua a 1 mL min rivelatore caffeina acqua a 0 2 e 1 mL min in base al tempo di ritenzione a temperatura ambiente costante rivelatore caffeina acqua Versione B 02 00 o successiva 25 1 26 Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto Tabella 2 Specifiche delle prestazioni della pompa binaria Agilent 1260 Infinity G1312B Tipo Specifica Commenti Funzioni GLP Involucri Avviso di manutenzione preventiva EMF per il controllo continuo dell uso dello strument
33. vengono modificate le nuove impostazioni vanno inserite sia nella tabella di programmazione sia nella sezione della schermata relativa ai valori di regolazione Solvents Show timetable graph se questa casella selezionata le modifiche apportate alla tabella di programmazione vengono rappresentate graficamente Stop Time definisce il tempo complessivo della separazione o dell analisi e a volte denominato tempo di analisi da alcuni utenti Indica il momento in minuti a partire dall esecuzione dell iniezione in cui l analisi finisce ossia il momento in cui termina l acquisizione dei dati Il flusso la composi zione e altre impostazioni del sistema ritornano ai valori iniziali per il metodo e il sistema diventa disponibile per eseguire l iniezione successiva Questo tempo deve essere sempre pari o superiore all ultimo valore immesso nella tabella di programmazione in caso contrario l analisi si interrompe e vengono ripristinate le condizioni iniziali prima che vengano completati gli eventi previsti dalla tabella Il parametro Stop Time pu essere impostato su No Limit nel qual caso l utente deve interrompere manual mente l analisi Anche se tutti i moduli del sistema possiedono parametri Stop Time propri il parametro Stop Time della pompa viene considerato il principale e gli altri moduli in genere vengono impostati per seguire questo valore Post Time definisce un intervallo di conto alla rovescia dopo il termine dell anali
34. 0 Infinity ottimizzato per ridurre al minimo la contropressione mentre la distribuzione delle dimensioni delle particelle delle colonne ZORBAX RRHT realizzata in modo da generare una riduzione significativa della contropressione rispetto ad altre colonne STM Di seguito sono elencati caratteristiche e vantaggi del design del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Il volume di ritardo configurabile fino a 120 uL della pompa binaria 1260 Infinity abbinato a un intervallo di velocit di flusso compreso tra 0 05 e un massimo di 5 mL min per valori di pressione fino a 600 bar permette di ese guire applicazioni con colonne da narrow bore diametro interno di 2 1 mm a standard bore diametro interno di 4 6 mm consentendo di sod disfare i requisiti sia delle applicazioni LC sia di quelle LC MS e La configurazione per volume di ritardo standard della pompa binaria 1260 Infinity consente di eseguire non soltanto applicazioni UHPLC ma anche metodi HPLC tradizionali senza riduzione delle prestazioni o variazione dei pattern cromatografici e Ildesign a flusso passante di nuova generazione dell autocampionatore ad alte prestazioni 1260 Infinity consente di ottenere la pi elevata precisione per un ampio intervallo di volumi di iniezione da 0 1 fino a 100 uL senza sostituire il loop del campione progettato per offrire un alta efficienza di elaborazione dei campioni un basso effetto memoria e cicli di iniezione rapidi L alta te
35. 0 min 2 0 time 2 5 H v minii oe resonet El Margin for negative Absorbance Stoptime Posttime 100 m u As Pump Injector Of Autobalance Lamps on required for acquisition C 10 min 1 00 lt min V Prerun vV UV Lamp Postrun Timetable empty TT Show timetable graph Figura 29 Schermata di impostazione del metodo Scheda del rivelatore a serie di diodi Signals si possono registrare fino a otto segnali cromatogrammi separati Affinch un segnale venga contrassegnato per la raccolta selezionare la casella Use Signal per il segnale di interesse definire la lunghezza d onda e la larghezza di banda e se necessario un segnale di riferimento selezio nare e definire anche la relativa casella Wavelength consente di impostare la lunghezza d onda centrale nm del segnale Bandwidth consente di impostare l ampiezza nm del segnale Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 129 130 Appendice Reference Wavelength consente di impostare la lunghezza d onda centrale nm della banda di riferimento che viene sottratta dal segnale analitico Reference Bandwidth consente di impostare l ampiezza nm della banda di riferimento Peakwidth consente di impostare la velocit di campionamento dati e il fil traggio del segnale Stoptime Posttime vengono impostati su As Pump Injector e Off e questi valori in genere vengono definiti nella scheda Pump Tuttavia p
36. 00 Miscelatore 400 Autocampionatore 270 Scambiatore di calore a bassa dispersione 1 6 Scambiatore di calore integrato 3 eb 1 nella configurazione per volume di ritardo basso con smorzatore e miscelatore by passati 2 nella configurazione per volume di ritardo standard Tabella 5 Volumi di ritardo delle configurazioni del sistema LC binario 1260 Infinity Configurazione di sistema Volume di ritardo pL Configurazione per volume di ritardo basso Pompa 120 Autocampionatore Configurazione per volume di ritardo medio Pompa 320 Configurazione per volume di ritardo standard Pompa 600 800 possibile alternare tra loro le configurazioni in due modi diversi e manualmente scollegando e ricollegando i capillari e automaticamente utilizzando una valvola opzionale a 2PS 6PT da 600 bar Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Configurazione ottimale dello strumento per colonne di diametro interno di 2 1 mm Configurazione per volume di ritardo basso per ottenere il minimo ritardo del gradiente per separazioni in gradiente ultra rapide Nella configurazione per volume di ritardo basso della pompa binaria Agilent 1260 Infinity lo smorzatore e il miscelatore vengono by passati per ridurre il volume di ritardo della pompa a circa 120 uL In Figura 13 pagina 43 sono mostrati i collegamenti del circuito idraulico per questa config
37. 1 mm Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Nel caso delle separazioni isocratiche l aumento del fattore di ritenzione k si traduce in una migliore risoluzione in quanto il soluto viene ritenuto pi a lungo Nelle separazioni in gradiente la ritenzione descritta dal fattore k in base alla seguente equazione pelo F_100 A B V S m in cui k valore k medio ta durata temporale del gradiente o del segmento del gradiente in minuti F velocit di flusso mL min Vn volume di ritardo della colonna A B variazione nella frazione di solvente B durante il gradiente S costante circa 4 5 per piccole molecole L equazione dimostra che possibile aumentare k e quindi la risoluzione uti lizzando un gradiente meno pronunciato indicativamente una variazione da 2 a 5 min una velocit di flusso pi alta e una colonna di volume pi conte nuto L equazione dimostra inoltre come accelerare un gradiente esistente se la velocit di flusso raddoppia ma la durata del gradiente si dimezza k rimane costante e la separazione ha un aspetto identico ma avviene in met tempo Una qualsiasi riduzione del volume extra colonna riduce la dispersione e migliora la risoluzione Il volume extra colonna gi ottimizzato nel sistema LC binario 1260 Infinity grazie all uso di capillari narrow bore diametro interno
38. 9 porte una per cia scuno dei due moduli TCC I moduli TCC in cluster sono rappresentati dal software come un unica unit con un unica interfaccia per la semplicit di uti lizzo Altri miglioramenti rispetto ai modelli precedenti sono il migliore isolamento termico migliori guide dei capillari e un sensore di sportello aperto che per mette ai metodi di stabilire che lo sportello deve essere chiuso una funzione particolarmente utile nel caso dei metodi a bassa o alta temperatura Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto 1 Rivelatore a serie di diodi 1260 Infinity G4212B Il rivelatore a serie di diodi DAD 1260 Infinity vanta un nuovo design ottico che utilizza una cella a cartuccia con tecnologia a guida d onda optofluidica e offre un elevata sensibilit bassa dispersione ampio intervallo lineare e linea di base molto stabile per le applicazioni LC standard e ultra rapide La cella a cartuccia Max Light Agilent aumenta drasticamente la trasmissione della luce grazie al principio della riflessione interna totale lungo un capillare di silice fusa non rivestito consentendo di raggiungere un nuovo livello di sensibilit senza compromettere la risoluzione a causa degli effetti di dispersione del volume della cella Questo design riduce al minimo le perturbazioni della linea di base causate dall indice di rifrazione o dagli effetti
39. ISTD Amount Amount Multiplier Dilution Cancel Help 2 Con le impostazioni mostrate come esempio nelle figure sopra possibile riprodurre sullo schermo un Rapporto di area percentuale 3 Nella sezione Destination selezionare Printer se si desidera una copia carta cea oppure File e PDF per ottenere un utile file PDF del rapporto memoriz zato nel file dei dati il file dei dati con suffisso D in realt una directory Il file del rapporto pu essere visualizzato direttamente in ChemStation oppure si pu cercare nella directory usando la normale funzione File Explorer di Windows 4 Salvare ancora una volta il metodo per assicurarsi che le impostazioni del rapporto vengano memorizzate dal metodo per usi futuri Quando si user ancora il metodo per produrre il rapporto verranno usate queste impostazioni degli eventi di integrazione e dei rapporti Questa sezione riporta brevi indicazioni su come usare l Analisi dei dati del software ChemStation Consultare imanuali ChemStation e il sistema di aiuto on line per maggiori dettagli sulle potenti caratteristiche di ChemStation Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 6 Appendice Informazioni per la sicurezza 106 Informazioni sui solventi 109 Informazioni sui materiali 109 Agilent Technologies su Internet 114 Impostazione di un metodo con la f
40. PTFE che semplifica l adescamento del sistema di pompaggio Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 11 12 1 Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto Componenti del sistema Valvola di spurgo Miscelatore Smorzatore Uscita della pompa 4 Sensore di pressione allo scarico Valvola alvole Valvola di uscita di uscita 3 Valvola x d ingresso Camera di Valvola d ingresso rai miscelazione da bottiglia a da bottiglia di solvente A Guarnizioni Guarnizioni di solvente B Pistoni Pistoni Testa della pompa A Testa della pompa B Figura 1 Percorso idraulico della pompa binaria con regolatore e miscelatore Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto 1 Componenti del sister Lo smorzatore e il miscelatore possono essere by passati per ottenere il minimo volume di ritardo della pompa binaria Tale configurazione consi gliata per applicazioni a bassa velocit di flusso con gradienti ripidi In Figura 2 pagina 13 illustrato il circuito idraulico in modalit a volume di ritardo basso Per istruzioni su come passare da una configurazione all altra vedere il manuale dell utente della pompa binaria G1312B Non possibile by passare il miscelatore lasciando in linea lo smorzatore poich tale configurazione potrebbe provocare un fu
41. RBAX RRHT da 1 8 um utilizzano la stessa fase chimica delle colonne ZORBAX con particelle da 3 5 e 5 um Di conseguenza per qualsiasi particolare fase delle colonne ZORBAX le particelle da 5 0 3 5 e 1 8 um for niscono identica selettivit consentendo un semplice rapido e sicuro trasferi mento bidirezionale del metodo tra LC convenzionale e UHPLC Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 33 2 Vantaggi delle colonne con particelle di dimensioni ridotte 34 Cromatografia pi rapida La riduzione dei tempi di analisi comporta numerosi vantaggi I laboratori ad alta produttivit ora possiedono una capacit superiore e possono analizzare un maggior numero di campioni in tempi pi stretti L analisi di un maggior numero di campioni in tempi pi stretti si traduce in costi pi contenuti Per esempio riducendo il tempo di analisi da 20 min per campione a 5 min il costo per 700 campioni si riduce del 79 Tabella 3 pagina 34 Tabella 3 Risparmio di tempo e di costi su 700 analisi Durata del ciclo Ciclo di 20 min Ciclo di 5 min Analisi 700 700 Costo analisi appr 10 58 2 24 Costo 700 analisi appr 7 400 1 570 Risparmio dei costi 5 830 Tempo 10 giorni 2 5 giorni solventi 27 1 smaltimento 2 1 mano d opera 30 h 2 24oreal giorno Il calcolatore del risparmio Agilent fornisce un metodo semplice per calcolare il risparmio in termini di costi associato al passaggi
42. SB sono compatibili con una temperatura massima di 90 C a pH basso Rigenerazione alternata delle colonne L utilizzo congiunto di una valvola di rigenerazione delle colonne e di una pompa di rigenerazione consente di ridurre ulteriormente i tempi di ciclo Uti lizzando questa configurazione la rigenerazione della colonna utilizzata in precedenza ha luogo durante l analisi eseguita sulla seconda colonna Ci con sente di ridurre in misura notevole il tempo di ciclo Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 49 3 50 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Utilizzando due colonne due pompe e una valvola a 2 posizioni e 10 porte possibile alternare tra loro le colonne per ridurre al massimo i tempi di ciclo tra iniezioni successive In genere colonne della stessa natura chimica e appartenenti allo stesso lotto garantiscono una precisione dei tempi di riten zione tale da consentire l elaborazione dei dati basata sull utilizzo della stessa tabella di calibrazione Fare riferimento al manuale per l utente delle soluzioni basate su valvole per una descrizione pi dettagliata della rigenerazione alternata delle colonne Riduzione automatica del volume di ritardo ADVR L autocampionatore ad alte prestazioni Agilent 1260 Infinity offre la possibili t di eseguire iniezioni sovrapposte OI e o la riduzione automatica del volume di ritardo ADVR Ci significa che la valvola di ini
43. Velocit di campionamento superiori al necessario devono essere evitate a causa dell incremento dei livelli di rumore I rivelatori UV disponibili sono il rivelatore a serie di diodi Agilent 1260 Infinity G4212B e il rivelatore a lunghezza d onda variabile Agilent 1260 Infinity G1314F con velocit di campionamento di 80 Hz e livelli di rumore e deriva notevolmente pi bassi Scelta della cella di flusso pagina 66 fornisce una panoramica sulle celle di flusso disponibili con il rivelatore DAD G4212B Per informazioni sulle celle di flusso utilizzate con il rivelatore VWD G1314F fare riferimento al manuale per l utente del rivelatore a lunghezza d onda variabile Agilent 1260 Infinity Condizioni cromatografiche Per ottenere un valore ottimale del rapporto segnale rumore conveniente che l eluizione dei picchi sia rapida Utilizzare velocit di flusso elevate per eluire i picchi a bassi valori k possibile inoltre applicare gradienti pi rapidi per eluire i picchi a bassi valori k Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Colonne La sensibilit espressa in termini di rapporto segnale rumore S N e per tanto necessario aumentare al massimo l altezza dei picchi e ridurre al minimo il rumore della linea di base La riduzione della dispersione dei picchi permette di mantenere l altezza dei picchi e pertanto il v
44. a vuoto gli eventuali gas dissolti nei solventi si diffondono attraverso i tubi e raggiungono le camere a vuoto Pertanto quando escono dalle uscite del degassatore sotto vuoto i solventi sono degassificati Circuito Pompa di controllo p a vuoto Sensore 4 camere a vuoto separate Solvente Contenitore per il vuoto Figura Panoramica riportato uno solo dei quattro canali del solvente 14 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto 1 Autocampionatore ad alte prestazioni 1260 Infinity G1367E Caratteristiche L autocampionatore ad alte prestazioni 1260 Infinity compatibile con un intervallo di pressione pi ampio fino a 600 bar e consente pertanto l utilizzo della moderna tecnologia per colonne colonne narrow bore con particelle di dimensioni inferiori a due micron con il sistema LC binario Agilent 1260 Infi nity Le nuove parti ottimizzate aumentano la robustezza il design a flusso passante si traduce in alta velocit ed effetto memoria minimo l incremento della velocit di iniezione dei campioni assicura un alta efficienza di elabora zione dei campioni la modalit di sovrapposizione delle iniezioni aumenta la produttivit mentre l ampia gamma di recipienti per campioni quali vial e pia stre a pozzetti rende flessibile e pratica la manipolazione dei campioni L uti lizzo di piastre a 384 pozzetti
45. aggiunge per qualche istante la pressione massima impostata il flusso viene ridotto per alcuni secondi per diminuire la pressione Se la pressione continua a essere limitata in questo modo viene generata una condizione di errore e il flusso viene interrotto Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 123 124 Appendice Solvents definisce le fasi mobili disponibili e le proporzioni percentuali pompate nei due canali A e B Su ciascun canale una casella a discesa per mette di selezionare un solvente da un elenco in modo che il controllo della pompa utilizzi le impostazioni di compressibilit ottimali Ci consente di ottimizzare le propriet del flusso come descritto in Configurazione otti male dello strumento per colonne di diametro interno di 2 1 mm pagina 43 Una seconda casella di testo consente di inserire una descrizione della fase mobile Se nella pompa installata la valvola di selezione del sol vente ogni canale ha due opzioni per il solvente e l opzione corretta per il metodo va selezionata mediante il pulsante di scelta alla sinistra della descrizione del solvente La pompa forma miscele binarie dei canali selezio nati A e B ad esempio A2 e B1 non possibile miscelare A1 con A2 o B1 con B2 Il valore immesso per le proporzioni di A e B definisce la composi zione di un metodo isocratico o le condizioni iniziali di un metodo a gra diente e le condizioni di equilibrazione tra analisi in g
46. ale principale della valvola di iniezione sono inseriti nel circuito idraulico e vi rimangono per l intera durata dell ana lisi Ci significa che questi componenti sono lavati in continuo dalla fase mobile durante l intera analisi soltanto durante l aspirazione del campione che la valvola di iniezione viene rimossa dal circuito idraulico In questa posi zione l effluente della pompa viene inviato direttamente nella colonna Prima dell iniezione le superfici esterne dell ago vengono lavate con solvente fresco Questa operazione viene eseguita utilizzando la porta di lavaggio dell autocam pionatore e previene la contaminazione della sede dell ago La porta di lavag gio dell autocampionatore viene nuovamente riempita con solvente fresco da una pompa peristaltica installata nell alloggiamento dell autocampionatore Il volume della porta di lavaggio pari a circa 680 uL e la pompa eroga 6 mL min Impostando il tempo di lavaggio su 10 s il volume della porta di lavaggio viene riempito pi di una volta con solvente fresco il che sufficiente nella maggior parte dei casi per pulire la superficie esterna dell ago Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Come ottenere una maggiore risoluzione L aumento della risoluzione di una separazione migliora l analisi dei dati qua litativi e quantitativi permette di separare un maggior numero di picchi o con
47. alori corretti di compressibilit per le fasi mobili utilizzate Sono disponibili curve di cali brazione per i solventi pi comuni Configurazione per volume di ritardo medio per ottenere la massima sensibilit UV Per le applicazioni UV ad alta sensibilit possibile installare un miscelatore aggiuntivo da 200 uL Miscelatore a basso volume 200 uL 5067 1565 al fine di ridurre l eventuale rumore residuo di miscelazione Questo piccolo miscela tore permette di ottenere il pi basso rumore della linea di base UV anche in presenza di condizioni estreme di gradiente Vedere Figura 14 pagina 44 Volume di ritardo medio pari a 320 uL per applicazioni ultra rapide e sensibilit UV superiore con colonne di diametro interno di 2 1 mm Miscela zione T Smorzatore da 600 bar Sensore di pressione Miscelatore da 200 uL Valvola di spurgo Figura 14 Configurazione per volume di ritardo medio per colonne di diametro interno di 2 1 mm e massima sensibilit UV 44 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Configurazione ottimale dello strumento per colonne di diametro interno di 3 e 4 6 mm Configurazione per volume di ritardo standard per la massima sensibilit UV e la trasferibilit diretta dei metodi I volumi relativi delle colonne di diametro interno pari a 3 mm e 4 6 mm sono circa due e cinque volte superiori rispetto a colonn
48. anced Analog Output Il rivelatore DAD 1260 Infinity possiede un connettore di uscita del segnale analogico per l uso con i sistemi di dati che non accettano un segnale digi tale in ingresso Si possono inserire le seguenti impostazioni Zero Offset imposta il livello zero su una determinata percentuale del segnale in uscita consentendo quindi una certa tolleranza per la deriva negativa Attenuation riporta in scala sull uscita completa l assorbanza impostata Advanced Margin for Negative Absorbance L impostazione predefinita 100 mAU che significa che l intervallo dina mico del rivelatore sufficiente tenendo in considerazione l impostazione del livello zero per misure fino a questo valore Per misurare picchi nega tivi pi ampi o per seguire una linea di base con una forte deriva negativa il valore va regolato verso il basso per impedire al segnale di appiattirsi sul fondo dell intervallo Tuttavia non va cambiato senza un buon motivo per ch rendendolo pi negativo si aumenta il rumore della linea di base e si riduce l intervallo disponibile per la misura dei picchi positivi Advanced Autobalance imposta su zero il livello di assorbanza a tutte le lun ghezze d onda ossia bilancia tutti i punti dello spettro su zero e pertanto azzera anche il segnale della linea di base Prerun questa opzione viene sele zionata per eseguire il bilanciamento subito prima dell inizio dell analisi si tratta della situazione n
49. apidamente una prima analisi dopo l installazione fungendo sia da esempio per un esercitazione sia da verifica del funzionamento complessivo del sistema Include anche informazioni pi dettagliate sui parametri dei metodi Questo esempio illustra la configurazione e l esecuzione di un analisi utiliz zando le colonne e il campione di verifica forniti unitamente al sistema LC binario Agilent 1260 Infinity L esempio fa riferimento ai menu e ai comandi di OpenLAB CDS ChemStation Edition ma funzioni identiche sono disponibili anche con le opzioni di controllo alternative quali OpenLAB CDS EZChrom Edition e il software MassHunter Di seguito i termini ChemStation ed EZChrom si riferiscono sempre ad Agi lent OpenLAB CDS ChemStation Edition e ad Agilent OpenLAB CDS EZChrom Edition rispettivamente Per il punto di partenza si presuppone che il sistema sia stato installato acceso e sia stato eseguito il primo adescamento vedere Adescamento iniziale pagina 80 La lampada UV deve essere accesa almeno 30 minuti prima di eseguire qualsiasi determinazione quantitativa Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Guida introduttiva 5 Preparazione del sistema Accensione del sistema Se il sistema non completamente acceso con il software indicante lo stato Pronto eseguire i seguenti passaggi 1 Accendere il computer del sistema e attendere la comparsa del desktop di Windows 2 Attivare l alimentazione ele
50. aria dal sistema Miscibile con quasi tutti i solventi Alternativa all isopropanolo seconda scelta se quest ultimo non disponibile Solvente ideale per la dissoluzione dei cristalli di soluzione tampone Solvente ideale per la dissoluzione dei cristalli di soluzione tampone Buone propriet bagnanti Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema e Guida introduttiva Informazioni sulla guida introduttiva Preparazione del sistema 86 87 87 Caricamento del metodo predefinito Configurazione del diagramma in linea Spurgo della pompa 91 Accensione del sistema 88 89 Acquisizione dei dati nella schermata del metodo e controllo analisi 92 92 Parametri del metodo per la verifica del sistema con il campione di verifica isocratico Impostazione del metodo 96 Esecuzione del metodo per una singola iniezione 98 Analisi dei dati 100 Schermata dell analisi dei dati Integrazione di un segnale Specificare il report 101 102 103 Nel presente capitolo vengono fornite informazioni sull acquisizione e sull ana lisi dei dati con il sistema LC binario 1260 Infinity i Agilent Technologies 85 5 Guida introduttiva Informazioni sulla guida introduttiva 86 Nel presente capitolo vengono fornite informazioni sul funzionamento del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity La guida pu essere utilizzata per eseguire r
51. atore amp Method of G1367E PPAAN00005 Injection Mode Injection volume 100 ul Standard injection Injection with needle wash Needle wash Mode Tim tin Stoptime Posttime As Pump No Limit Off min min Appendice 6 0 x G l Advanced a Auriliary i Draw speed 100 0 pL min Eject speed 100 0 pL min Draw position 00 mm Equilibration time EB sec Sample flush out factor 50 times injection volume V Vial well bottom sensing High throughput Automatic delay volume reduction Enable overlapped injection Vhen Sample Is Flushed Out After Period Of Time mi X 4 E l Injection Cleaning X Ok Cancel Figura 25 Injection Mode Schermata di impostazione del metodo Scheda dell autocampionatore ad alte prestazioni Injection volume imposta il volume da iniettare ad esempio 1 ul Standard injection indica che non viene eseguito il lavaggio esterno dell ago Injection with needle wash utilizzata per ridurre il potenziale effetto memoria Si tratta dell opzione consigliata che viene configurata nel pas saggio successivo Needle Wash se stato selezionato in precedenza Mode determina la modalit di lavaggio della superficie esterna dell ago o il lavaggio attivo in Flush Port o per immersione in uno specifico Wash Vial Time intervallo espresso in secondi durante il quale la pompa peristal tica collegata alla porta di lavaggio pompa il solvente di risciacquo
52. caratteristiche del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity sono discusse nel capitolo Descrizione del prodotto Nel capitolo Ottimizzazione sono discusse l applicazione della teoria e l utilizzo di queste caratteristiche per svi luppare separazioni ottimizzate Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 37 2 Introduzione Riscaldamento per attrito 38 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 3 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Configurazione del volume di ritardo ottimale 40 Volume di ritardo e volume extra colonna 40 Volumi di ritardo nel sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 42 Configurazione ottimale dello strumento per colonne di diametro interno di 2 1 mm 43 Configurazione ottimale dello strumento per colonne di diametro interno di3e 4 6mm 45 Come ottenere volumi di iniezione maggiori 47 Come ridurre i tempi di ciclo 49 Come ottenere una maggiore produttivit 52 Come ridurre al minimo l effetto memoria 53 Come ottenere una maggiore risoluzione 55 Configurazione ottimale dello strumento per l alta risoluzione 59 Come ottenere una maggiore sensibilit 63 Configurazione ottimale dello strumento per l alta sensibilit 64 Scelta della cella di flusso 66 Come prevenire ostruzioni della colonna 68 Nel presente capitolo sono discusse l applicazione della teoria e l utilizzo de
53. collegamento nel circuito idraulico 75 Adescamento del sistema 80 Nel presente capitolo vengono fornite informazioni su installazione del sof tware installazione dei moduli e preparazione del sistema per l utilizzo oa Agilent Technologies n 4 Configurazione e installazione del sistema Installazione del software Installazione del software di controllo e del sistema di dati Per informazioni dettagliate sulle procedure di installazione del software fare riferimento al manuale del rivelatore e ai manuali del software 72 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Configurazione e installazione del sistema 4 Installazione del software Agilent Lab Advisor Per dettagli sulle procedure di installazione del software Agilent Lab Advisor fare riferimento alla documentazione relativa al software sul DVD Lab Advi sor Agilent Lab Advisor sostituisce e amplia le funzioni diagnostiche in prece denza disponibili esclusivamente nel software ChemStation Agilent Lab Advisor un applicazione basata su Windows che monitora gli strumenti del laboratorio in tempo reale e senza interruzioni e aumenta la produttivit tramite la notifica automatica delle esigenze di manutenzione e assistenza mediante l uso di contatori avanzati Ci consente di risolvere un problema prima che possa incidere sui risultati Il software include una suite estesa di informazioni e documentazione per l utente un insieme di calcola tori e
54. d del rivelatore 1260 Infinity DAD inserire i seguenti parametri Use Signal disattivare tutti i segnali eccetto Signal A deselezionando le caselle di controllo Signal A Segnale A 254 nm larghezza di banda 4 nm riferimento 550 nm larghezza di banda 100 nm Peak width Ampiezza del picco 0 02 b Nella sezione Advanced impostare Spectrum Store su All c Per gli altri parametri si possono lasciare i valori delle impostazioni pre definite Fare clic su 0K per uscire dalla finestra Le modifiche vengono inviate al modulo DAD 6 Sono stati cos inseriti tutti i parametri necessari dei moduli Selezionare Method gt Save Method As e immettere ISO 1 M per salvare il metodo con un nuovo nome ChemStation non consente di salvare il metodo con il nome DEF_LC M per evitare che il modello del metodo predefinito venga modificato 7 Lasciar equilibrare il sistema per almeno 10 min e prima di avviare l analisi verificare che la linea di base in Online Plot sia stabile Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 97 5 Guida introduttiva Esecuzione del metodo per una singola iniezione In questa sezione illustrato come eseguire una singola iniezione del cam pione di verifica isocratico utilizzando le condizioni impostate nella sezione precedente Su ChemStation le analisi possono essere eseguite in due modalit Run Method singole iniezioni ad esempio nello sviluppo interattivo del metodo util
55. d oppure Method Menu gt Save Method As Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Glossario IU 1 1260 Infinity Autosampler Autocampionatore 1260 Infinity 1260 Infinity Binary Pump Pompa binaria 1260 Infinity 1260 Infinity DAD DAD 1260 Infinity 1290 Infinity TCC TCC 1290 Infinity A Add Aggiungi Add Chromatogram Output Aggiungi uscita cromatogramma Add to Method Aggiungi al metodo Adjust Regola Advanced Avanzate Advanced Analog Output Avanzate Uscita analogica Advanced Autobalance Avanzate Bilanciamento automatico Advanced Auxiliary Avanzate Ausiliarie Advanced High Throughput Avanzate Alta produttivit Advanced Lamps on required for acquisi tion Avanzate Lampade accese richieste per l acquisizione Advanced Margin for Negative Absor bance Avanzate Margine per l assorbanza negativa Advanced Spectrum Avanzate Spettro All Tutti All in Peak Tutto nel picco All Programs Tutti i programmi Apex Baselines Apice Linee di base Apex Slopes Baselines Apice Pendenze Linee di base Apply Applica Apply to Method Applica al metodo Area Reject Scarto area Area Reject Height Reject Scarto area Scarto altezza As Detector Cell Come cella nel rivelatore As Pump lnjector Come pompa iniettore Attenuation Attenuazione Automatic delay volume reduction Riduzione automatica del volume di ritardo Available Signals Segnali disponibili Siste
56. dell ago New Method Nuovo metodo No Limit Nessun limite No Limit Off Nessun limite Disattivato None Nessuno 0 Off Disattivato Online Plot Diagramma in linea Online Signals Segnali in linea OpenLAB Control Panel Pannello di controllo OpenLAB P Parameter Parametro Parameter Mismatch Accoppiamento errato dei parametri Paste Incolla Peak Width Ampiezza del picco Peakwidth Ampiezza picco Post Time Tempo post analisi Postrun Post analisi Post Run Command Macro Comando post analisi Macro Posttime Tempo post analisi Prerun Pre analisi Pre Run Command Macro Comando pre analisi Macro Pressure Limits Limiti di pressione Printer Stampante Pump Pompa Q Quantitation settings Impostazioni quantificazione Quantitative results sorted by Risultati quantitativi suddivisi per Range Intervallo Reference Bandwidth Larghezza di banda di riferimento Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Glossario IU Reference Wavelength Lunghezza d onda di riferimento Remove Rimuovi Repeat Ripeti Report Rapporto Report mode Modalit del rapporto Report Style Stile del rapporto Reporting settings Impostazioni del rapporto Response Risposta Run Control Controllo analisi Run Method Esegui metodo Run Queue Coda di analisi Run Sequence Esegui sequenza Run Time Checklist Lista di controllo del tempo di analisi S Sample flush out factor Fattore
57. do I parametri di integrazione e la tabella di calibrazione sono di semplice impostazione una volta acquisiti i dati i quali possono essere ricontrollati nella finestra Analisi dei dati Gli eventi di integrazione possono essere ottimizzati in quel momento e spesso si usano le impostazioni predefinite per le analisi iniziali di acquisizione Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 La schermata Edit Integration Events caratterizzata da due tabelle e Initial Events For All Signals contiene gli eventi parametri di integrazione che si applicano a tutti i segnali acquisiti con il metodo Specific Events For Signal contiene gli eventi che sono specifici per un tipo di rivelatore o specifici per diversi segnali dallo stesso rivelatore In questa tabella i parametri principali sono quelli sotto elencati Slope Sensitivity rappresenta la pendenza e la curvatura della linea di base necessarie per marcare l inizio e la fine di un picco Peak Width vanno inseriti i valori dell ampiezza a met altezza del picco di interesse pi stretto Questo serve all integratore per distinguere tra rumore e picchi molto piccoli Area Reject Height Reject valori che controllano l eliminazione dai risul tati dei picchi la cui area o altezza ricade all interno di questi valori Integration OFF ON sopprime l integrazione tra limiti definiti Funzione usata quasi sempre per inibire l integrazione nella regio
58. e comunicazioni 25 controllo e valutazione dei dati 25 fisiche 23 prestazioni 24 uscita del segnale analogico 25 spurgo 91 Strumento Acquisizione 116 T tabella degli eventi di integrazione 102 temperatura ambiente non operativa 23 temperatura ambiente operativa 23 temperatura non operativa 23 temperatura operativa 23 tempo di ciclo configurazione dello strumento 49 tensione di rete 23 U umidit 23 uscita del segnale analogico 25 V valutazione dei dati e controllo 25 valvola di selezione del solvente 11 volume di iniezione ottenimento di volumi maggiori 47 volume di ritardo commutazione automatica 42 descrizione 40 esempio 40 volume extra colonna descrizione 41 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Indice Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 149 www agilent com In questo volume Il presente manuale contiene informazioni sul sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Vengono trattati i seguenti argomenti Descrizione del prodotto e introduzione specifiche ottimizzazione del sistema e configurazione e installazione del sistema guida introduttiva Agilent Technologies 2006 2008 2011 2013 Printed in Germany 02 2013 G1312 94303 vai Agilent Technologies
59. e evidenziare il segnale nella finestra di dialogo Selected Signal e impostare i valori richiesti nella met inferiore della pagina Oltre ai segnali del rivelatore nel diagramma si possono ottenere anche le tracce di altri parametri come temperatura e pressione Selezionando Apply to Method le impostazioni di questa pagina possono essere archiviate nel metodo La finestra Online Plot si comporta come la carta di registrazione dei tracciati in quanto registra in modo continuo i dati in uscita da uno o pi rivelatori e altri parametri in uscita I segnali iniziano a essere tracciati sul lato destro della finestra e si spostano verso sinistra Sono accessibili dati risalenti fino ai 90 min precedenti Ci risulta utile per controllare la linea di base e per esami nare le iniezioni precedenti Le scale degli assi X e Y possono essere regolate direttamente con i pulsanti su gi situati su ogni asse Il pulsante Adjust nella finestra Online Plot sposta il punto attualmente presente sul segnale selezionato facendolo coincidere con lo zero Il segnale selezionato indicato dal colore dei contrassegni dell asse Y Un particolare segnale pu essere selezionato facendo clic sul segnale o sulla relativa descrizione nella parte alta del diagramma Premendo il pulsante Balance tutti i rivelatori vengono azzerati Le modifiche apportate nella pagina Online Plot non hanno alcun effetto sui dati archiviati nei singoli file dei dati Sistema LC bi
60. e di pari lunghezza e diame tro interno di 2 1 mm inoltre le velocit di flusso impiegate sono proporzio nalmente pi alte Pertanto il volume di ritardo standard della pompa binaria non comporta un ritardo del gradiente superiore in misura significativa Scollegare esclusivamente qui Circuito idraulico Miscelatore da 4099E 2 Miscelazione T Sensore Sensore di pressione di pressione Volume di ritardo standard 600 800 uL Smorzatore Miscelatore da 400 uL Valvola di spurgo Figura 15 Configurazione per volume di ritardo standard per colonne di diametro interno di 3 e 4 6 mm e massima sensibilit UV Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 45 3 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity La configurazione per volume di ritardo standard anche la configurazione che permette il trasferimento diretto dei metodi dai sistemi LC Agilent serie 1100 e 1200 al sistema LC binario 1260 Infinity o viceversa In Figura 16 pagina 46 sono mostrati due cromatogrammi sovrapposti di un metodo di ana lisi del paracetamolo e relative impurezze Il metodo stato trasferito da un sistema LC Agilent serie 1200 a un sistema LC binario Agilent 1260 Infinity senza alterare le condizioni cromatografiche colonna fase mobile imposta zioni della pompa volume di iniezione temperatura della colonna imposta zioni del rivelatore Come evidente dalla figura possibile trasferire diretta
61. e lunghezza appropriati la possibilit di operare con colonne STM pi lunghe non mai stata cos accessibile Le colonne PoroShell sono note come colonne con particelle porose in superfi cie SPP Al contrario delle colonne in silice completamente porosa queste colonne SPP possiedono un nucleo solido diametro di 1 7 um e uno strato di silice porosa spessore di 0 5 um intorno al nucleo Velocit e risoluzione delle colonne PoroShell sono confrontabili con quelle delle colonne con parti celle inferiori a due micron con una riduzione massima della contropressione fino al 50 Ultimamente nel caso delle colonne PoroShell si assiste a una par ticolare diffusione delle particelle di dimensioni pi ridotte rispetto alle meno recenti colonne con particelle pellicolari L attuale interesse in questa tecno logia stimolato dalla reintroduzione di particelle di dimensioni inferiori quali le dimensioni inferiori ai 3 micron per l uso nelle separazioni in fase inversa di piccole molecole Molti laboratori conducono un esaustivo processo di screening per selezionare la migliore combinazione di fase stazionaria fase mobile e temperatura per le rispettive separazioni La soluzione per lo sviluppo di metodi multipli Agilent serie 1200 Infinity agevola l automazione completa di questi processi di sele zione dispendiosi in termini di tempo rendendo lo sviluppo e lo trasferimento dei metodi un operazione semplice e affidabile Le colonne ZO
62. e su sensibilit e risoluzione Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 65 3 66 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Scelta della cella di flusso Sono disponibili svariati modelli della cella di flusso a cartuccia Max Light vedere Tabella 7 pagina 66 Tabella 7 Specifiche delle celle di flusso a cartuccia Max Light Celle a cartuccia Cella a cartuccia Max Light 10 mm V s 1 0 uL G4212 60008 Cella a cartuccia Max Light bioinerte 10 mm V s 1 0 uL G5615 60018 Cella a cartuccia Max Light 60 mm V s 4 0 uL G4212 60007 Cella a cartuccia Max Light bioinerte 60 mm V s 4 0 uL G5615 60017 Cella a cartuccia Max Light HDR 3 7 mm V s 0 4 uL G4212 60032 Cella a cartuccia Max Light ULD 10 mm V s 0 6 uL G4212 60038 Cella a cartuccia Max Light per test G4212 60011 Pressione 70 bar 1015 psi pressione operativa massima MOP assina 150 bar 2175 psi pressione incidentale massima MIP Intervallo di pH 1 0 12 5 a seconda del solvente 1 Pressione operativa massima MOP la pressione massima alla quale il sistema in grado di funzi onare ininterrottamente in condizioni normali 2 Pressione incidentale massima MIP la pressione massima alla quale il sistema pu essere sog getto per un breve intervallo Applicazioni normali La Cella a cartuccia Max Light 10 mm V s 1 0 uL G4212 60008 compati bile con un ampia gamma di applicaz
63. el sistema TCC TcC Temperature Temperatura Threshold Soglia Time Tempo Timetable Tabella di programmazione U Unique PDF file name Nome unico del file PDF Unique Sequence Folder Creation Creazione della cartella di sequenza unica Use Signal Usa segnale V Vial Location Vial Posizione Vial Well bottom sensing Rilevazione del fondo del vial pozzetto View Visualizza wW Wash Vial Vial di lavaggio Water Acqua Wavelength Lunghezza d onda Wavelength Calibration Calibrazione della lunghezza d onda Z Zero Offset Scarto zero Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Indice A accuratezza del flusso 24 accuratezza della composizione 25 adescamento tramite pompa 82 ADVR 50 Agilent internet 114 altitudine non operativa 23 altitudine operativa 23 analisi dei dati 116 analisi dati 100 C calcolatore costi 34 caricamento predefinito 88 cella di flusso 66 classe di sicurezza 106 colonna stabilizzazione termica 37 temperatura 37 colonne particelle di dimensioni inferiori a 2 micron 34 comparto colonne termostatato descrizione 17 compensazione della compressibilit 24 compensazione compressibilit 24 componenti del sistema comparto colonne termostatato 17 rivelatore a serie di diodi 19 configurazione e installazione del sistema integrazione in rete 74 configurazione ottimizzata colonne di diametro interno di 2 1 mm 43 colonne di diametr
64. enza Ogni volta che si scala un metodo verso il basso da una colonna pi grande a una colonna pi piccola importante che il trasferimento del metodo con senta di ridurre il volume di iniezione in proporzione al volume della colonna in modo da mantenere inalterate le prestazioni del metodo Ci serve a mante nere costante il rapporto percentuale tra il volume di iniezione e il volume della colonna Ci particolarmente importante se il solvente di iniezione pi forte pi eluotropico rispetto alla fase mobile iniziale e qualsiasi aumento influir sulla separazione in particolare per i picchi che eluiscono all inizio dell analisi fattore di ritenzione basso In alcuni casi ci causa la distorsione dei picchi la regola generale prevede di utilizzare un solvente di iniezione identico o pi debole rispetto alla composizione iniziale del gra diente Ci determina se o quanto il volume di iniezione pu essere aumen tato l utente deve verificare l eventuale aumento della dispersione picchi pi ampi o pi asimmetrici e minore risoluzione dei picchi in corrispondenza dei tentativi di aumento del volume di iniezione Se si esegue un iniezione in un solvente debole probabile che il volume possa essere ulteriormente aumen tato poich si avr l effetto di concentrare l analita sulla testa della colonna all avvio del gradiente Al contrario se l iniezione avviene in un solvente pi forte della fase mobile iniziale l aumen
65. erico e cos via La mag Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 109 110 Appendice gior parte dei dati fa riferimento alla temperatura ambiente in genere 20 25 C 68 77 F Se sono possibili processi di corrosione essi in genere si verificano pi velocemente a temperature pi elevate In caso di dubbi consul tare la letteratura tecnica relativa alla compatibilit chimica dei materiali PEEK Il PEEK polietereterchetone coniuga eccellenti propriet di resistenza chi mica e stabilit meccanica e termica stabile in un intervallo di pH compreso tra 1 e 12 5 ed inerte nei confronti di molti solventi di uso comune nota l incompatibilit con diversi prodotti chimici quali cloroformio cloruro di metilene THF DMSO gt 1 acidi forti acido nitrico gt 10 acido solforico gt 10 acido tricloroacetico acidi sulfonici alogeni o soluzioni acquose di alo geni fenolo e derivati cresoli acido salicilico ecc Se utilizzato a tempera ture superiori alla temperatura ambiente il PEEK sensibile nei confronti di basi e vari solventi organici e pu essere soggetto a rigonfiamenti Poliimmide Agilent utilizza poliimmide semicristallina per le guarnizioni del rotore nelle valvole e per le sedi degli aghi negli autocampionatori Un fornitore di poliim mide DuPont che la commercializza con il marchio Vespel utilizzato anche da Agilent La poliimmide stabile in un
66. erire un nome diverso per il metodo Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Guida introduttiva 5 Preparazione del sistema Configurazione del diagramma in linea 1 Sela finestra Online Plot non visibile fase clic su View gt Online Signals gt Sig nal Window 1 per visualizzarla E Online P lot DADIA DAD Signal A 2 Per configurare uno o pi dei segnali desiderati nella finestra Online Plot fare clic su Change Si apre la pagina di impostazione Edit Signal Plot Edit Signal Plot Available Signals Selected Signals PMP1B BinPump Pressure PMP1C BinPump Flow PMP1D BinPump Solvent Ratio A E PMP1E BinPump Solvent Ratio B HMiA TCC Left Temperature MIO TEC Right Temperature PEER i D Signal B lt Remove DADIC DAD Signal C ml Window x axis 3 3 min DADIA DAD Signal A Type acquired y axis range 100 Smau I auto y adjust Offset 10 H m Method Settings F Use method settings Apply to Method OK Cancel Help I draw zero line Fraction Collector action collection ticks Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 89 5 90 Guida introduttiva 3 Nella finestra di dialogo Available Signals evidenziare i segnali richiesti e fare clic su Add per spostarli nella finestra di dialogo Selected Signals 4 Per configurare le singole impostazioni di ciascun segnal
67. etti del campione Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 15 1 16 Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto L ago scende nel vial del campione o nella piastra a pozzetti Il dispositivo di dosaggio aspira il volume di campione preimpostato 5 6 7 L ago esce dal vial del campione o dalla piastra a pozzetti 8 L ago viene quindi spostato nella sede per chiudere il loop del campione 9 Il blocco dell ago si sposta verso il basso 10 Il ciclo di iniezione si conclude quando la valvola di iniezione ritorna nella posizione di mainpass Il lavaggio dell ago se necessario viene eseguito tra la fase 7 e la fase 8 Sequenza di iniezione Prima dell inizio della sequenza di iniezione e durante l analisi la valvola di iniezione si trova nella posizione di mainpass In questa posizione la fase mobile fluisce attraverso il dispositivo di dosaggio il loop del campione e l ago dell autocampionatore in modo che tutte le parti a contatto con il campione vengano lavate durante l analisi per ridurre al minimo l effetto memoria All inizio della sequenza di campionamento la valvola passa alla posizione di bypass Il solvente proveniente dalla pompa entra nella valvola dalla porta 1 e fluisce direttamente nella colonna attraverso la porta 6 L ultimo passaggio della sequenza di campionamento rappresentato dalla fase di iniezione e analisi La valvola a sei porte viene comm
68. eve essere il pi piccolo possibile Per le colonne di diametro interno pari a 4 6 mm necessario utilizzare la configurazione per ritardo standard per la pompa vedere Figura 15 pagina 45 Per le colonne di diametro interno pari a 2 1 mm necessario utilizzare la configurazione per ritardo basso per la pompa e installare il kit a bassa dispersione nel comparto colonne Per ottenere la massima sensibilit UV si consiglia di utilizzare anche il miscelatore corto Vedere Figura 13 pagina 43 e Figura 14 pagina 44 Anche il volume di iniezione un fattore importante in particolare se il campione dissolto in un solvente organico In questo caso il gradiente deve iniziare con una bassa percentuale di fase organica per concentrare i composti in testa alla colonna Ci evita la dispersione dei picchi derivante dall iniezione La cella a cartuccia Max Light da 10 mm presenta un basso volume di dispersione o volume 1 0 uL e non richiede alcuna ulteriore ottimizza zione del volume Nei casi in cui si utilizza la cella alternativa Max Light da 60 mm ad alta sensibilit per ottenere una maggiore sensibilit il volume della cella otti mizzato per l uso con colonne di diametro interno pari a 3 mm e 4 6 mm Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Velocit di campionamento L impostazione della velocit di campionamento del rivelato
69. ezione viene rimossa dal circuito idraulico una volta che il campione ha raggiunto la testa della colonna In questo modo si ottiene una riduzione significativa del volume di ritardo vedere Figura 17 pagina 50 DADI A Sig 245 10 Ref 360 80 E CHEM32 1 DATA NODAMPNOMIX100X21 30000009 D DADI A Sig 245 10 Ref 360 80 E CHEM32 1 DATA NODAMPNOMIX100X21 30000005 D DADI A Sig 245 10 Ref 360 80 E CHEM32 1 DATA WMIXANDDAMPADVRX21 ADVR30000005 D DADI A Sig 245 10 Ref 360 80 E CHEM32 1 DATA REPROVIAL30 30000023 D mAU 80 70 60 Configurazione per volume di ritardo basso ADVR 50 TE WE AN m Configurazione per volume 40 di ritardo basso 30 Configurazione 20 standard ADVR 10 Configurazione standard gini 0 1 2 3 4 5 6 7 Min Figura 17 Riduzione del volume di ritardo Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Tanto pi bassa la velocit di flusso tanto pi ingenti sono le conseguenze negative risultanti dal volume di ritardo In Figura 17 pagina 50 stata utiliz zata una colonna di diametro interno pari a 2 1 mm a una velocit di flusso di 0 6 mL min Il volume di ritardo si riduce gradualmente dalla traccia pi in basso alla traccia pi in alto L influenza sul tempo di analisi totale e l impatto in particolare sull ampiezza e sull altezza dei primi picchi evidente Lo svantaggio del
70. fe risce l acetonitrile in quanto i picchi presentano forme migliori sono pi stretti e la viscosit inferiore il metanolo tuttavia in genere consente di ottenere una migliore selettivit in particolare per piccole molecole con peso molecolare inferiore a circa 500 Da La viscosit pu essere ridotta aumen tando la temperatura tenendo presente tuttavia che ci pu modificare la selettivit della separazione L aumento o la diminuzione della selettivit devono essere determinate sperimentalmente Tenere presente che all aumen tare di velocit di flusso e pressione aumenta anche il riscaldamento per attrito nella colonna Ci pu provocare un leggero aumento della dispersione e una lieve variazione della selettivit che possono tradursi in una diminu zione della risoluzione Quest ultimo fenomeno pu essere contrastato ridu cendo di alcuni gradi la temperatura del termostato e determinando sperimentalmente l effetto risultante La curva di van Deemter evidenzia che la velocit di flusso ottimale attraverso una colonna con particelle di dimensioni inferiori a 2 micron STM pi alta rispetto al caso di particelle di dimensioni maggiori e assume un andamento piuttosto piatto all aumentare della velocit di flusso In genere in prossimit delle condizioni ottimali le velocit di flusso per le colonne STM sono 2 ml min per colonne di diametro interno pari a 4 6 mm e 0 4 ml min per colonne di diametro interno pari a 2
71. finity Manuale per l utente del sistema Introduzione 2 Riscaldamento per attrito Il flusso forzato della fase mobile attraverso la colonna a pressioni e velocit di flusso pi elevate genera calore I gradienti radiale e longitudinale di tempe ratura risultanti possono influenzare l efficienza della colonna Power F p in cui F la velocit di flusso e p la pressione Un elevata termostatazione della colonna per esempio mediante l uso di un bagno termostatato genera un forte gradiente radiale di temperatura che comporta una perdita significativa di efficienza della colonna La stabilizza zione termica della colonna sfruttando l aria statica riduce il gradiente radiale di temperatura e quindi riduce le perdite di efficienza anche se in questo caso necessario accettare una temperatura pi elevata in uscita dalla colonna L aumento della temperatura pu influenzare la selettivit A valori pi bassi di contropressione le perdite di prestazione dovute al riscaldamento per attrito sono ridotte al minimo cosicch le colonne di diametro interno pari a 4 6 o 3 mm con particelle inferiori a 2 micron presentano ancora efficienze superiori rispetto alle colonne corrispondenti di diametro interno pari a 2 1 mm Riepilogando l utilizzo di materiale di impaccamento con particelle di dimen sioni inferiori a due micron offre i seguenti vantaggi aumento dell efficienza risoluzione superiore e separazioni pi rapide Le
72. hiamato DEF_LC M che viene caricato alla prima esecuzione oppure ogni volta che richiesto un nuovo modello vuoto per definire il metodo Contiene imposta zioni predefinite per tutti i moduli Con questa procedura viene caricato il metodo DEF_LC M Pu essere usato per configurare tutti i parametri in base a impostazioni predefinite o per otte nere un modello vuoto prima di configurare un nuovo metodo 1 Portarsi sulla schermata di ChemStation Method and Run Control 2 Sulla barra del menu selezionare Method gt New Method quindi selezionare DEF_LC M dal menu contestuale In alternativa possibile usare l icona Load Method Lo nella barra del menu o fare doppio clic sul nome del metodo DEF_LC M nella scheda Methods del pannello di navigazione File RunControl Instrument Method Sequence View Abort Help v _ Sequences kd pEFLC S Method and Run Control Method and Run Control la Wan Automation Controls rl PHENONES2 M Ka Single Sample NM NAAI pe M Il metodo predefinito DEF_LC M caratterizzato da una serie di parametri predefiniti che possono essere modificati successivamente per creare un nuovo metodo Ad esempio la velocit di flusso impostata su zero e Method Information e Method History sono vuoti Si noti che questo metodo non pu mai essere sovrascritto con nuovi parametri Quindi facendo clic su Save si verr reindirizzati alla funzione Save As dove necessario ins
73. i possibile passare direttamente alle pagine di impostazione relative ai parametri da cambiare Gli utenti meno esperti possono preferire l utilizzo della funzione Edit Entire Method poich scorre automaticamente tutte le pagine Ad essa si accede dal menu Method gt Edit Entire Method che apre la finestra di dialogo Check Method Sections to Edit Edit Method Instrument 2 Check Method Sections to Edit Hethod Information Instrumani Acqusiton E Data Anapsis FM Bun Time Checklist Cancel Figura 23 Controlla le sezioni del metodo da modificare Questa finestra di dialogo fornisce un riepilogo delle sezioni che verranno visualizzate e offre la possibilit di escludere parti specifiche deselezionan dole Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 115 116 Appendice A seconda delle parti selezionate la funzione mostra in sequenza diverse schermate e Method Information comprende una descrizione testuale del metodo e Instrument Acquisition comprende parametri dell iniettore parametri della pompa parametri del forno parametri del rivelatore e curve dello strumento Data Analysis comprende dettagli del segnale parametri di integrazione e parametri del report e Run Time Checklist comprende le parti del metodo che verranno eseguite Mentre si utilizza la funzione Edit Entire Method facendo clic su OK si chiude la schermata corrente per l immissione dei valori e si passa alla
74. i applicazioni a bassa velocit di flusso oppure quando si desidera un volume transiente minimo Le applicazioni tipiche riguardano i metodi ad alta produt tivit con gradienti rapidi su colonne ad alta risoluzione da 2 1 mm La pompa in grado di erogare il flusso nell intervallo 0 1 5 mL min fino a un massimo di 600 bar Una valvola opzionale di selezione del solvente consente di for mare miscele binarie isocratiche o gradienti da uno dei due solventi per canale Il lavaggio attivo delle guarnizioni opzionale disponibile per l uso con soluzioni tampone concentrate Principio di funzionamento La pompa binaria basata su un design a due canali e due pistoni in serie che integra tutte le funzioni essenziali tipiche di un sistema di erogazione del sol vente Il dosaggio del solvente e l erogazione al lato ad alta pressione vengono effettuate da due gruppi pompa in grado di generare un pressione massima pari a 600 bar Ogni canale comprende un gruppo pompa che include sistema di azionamento della pompa testa della pompa valvola d ingresso attiva con cartuccia sosti tuibile e valvola di uscita Entrambi i canali sono collegati a una camera di miscelazione a basso volume a sua volta collegata mediante un fascio di capil lari di restrizione a un unit di smorzamento e a un miscelatore Un sensore della pressione controlla la pressione della pompa Sull uscita della pompa montata una valvola di spurgo dotata di setto poroso in
75. i selezione del solvente attaccare una siringa con un apposito adattatore ed estrarre il liquido attraverso il sistema di degasaggio Ricollegare il tubo alla valvola di selezione del solvente 6 Pompare 30 mL di isopropanolo per rimuovere bolle d aria residue 7 Passare al successivo canale del solvente e ripetere le operazioni 5 e 6 fino a spurgare tutti i canali 8 Disattivare il flusso e chiudere la valvola di spurgo Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 81 4 Configurazione e installazione del sistema Adescamento normale Quando Quando il sistema di pompaggio rimane spento per un lungo periodo di tempo ad esempio di notte l aria si diffonde nuovamente nel canale del solvente tra il degassatore sottovuoto e la pompa Se i solventi che contengono componenti volatili vengono lasciati nel sistema di degassaggio senza flusso per un periodo di tempo prolungato si verificher una leggera perdita di tali componenti Preparazioni Accendere il sistema Per spurgare automaticamente la pompa possibile utilizzare lo strumento di spurgo di Lab Advisor 1 Aprire la valvola di spurgo della pompa ruotandola in senso antiorario e impostare il flusso su 5 mL min 2 Lavare il sistema di degasaggio sottovuoto e tutti i tubi con almeno 10 mL di solvente Ripetere i passaggi 1 e 2 per gli altri canali della pompa Impostare la composizione e il flusso richiesti per l applicazione e chiudere la valvola di s
76. i tutto il metodo Curve relative allo strumento Instrument Curves Instrument 2 Select curves to overlay Instrument Data Curves Figura 34 Schermata Curve relative allo strumento Le caselle di spunta della scheda Instrument Curves consentono a questi para metri registrati di essere sovrapposti in forma grafica sul cromatogramma 140 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 Lista di controllo del tempo di analisi La schermata della Run Time Checklist pu anche essere raggiunta direttamente dal menu Method gt Run Time Checklist o facendo clic sull icona Run Time Check list sulla parte alta della schermata Run lime Checklist Instrument 2 Check Method Sections to Run Der Data Acquisition V Standard Data Analysis C Customized Data Analysis Macro C Save GLP Data C Post Run Command Macro C Save Method with Data Figura 35 Schermata Lista di controllo del tempo di analisi La Run Time Checklist permette di scegliere se il metodo deve prevedere sia l acquisizione dei dati che la loro analisi e offre anche l opportunit di colle gare comandi o programmi macro in diversi punti del flusso di lavoro Nella maggior parte dei casi le caselle Data Acquisition e Standard Data Analysis sono spuntate Se l analisi dei dati non necessaria ad esempio in una serie di ana lisi per lo sviluppo del metodo si pu togliere la spunta da Standard Data Analy sis per non
77. ianuri com plessanti e acidi concentrati quali l acqua regia Ossido di zirconio Zr0 L ossido di zirconio inerte nei confronti di quasi tutti gli acidi le basi e i sol venti di uso comune Non sono note incompatibilit documentate per le appli cazioni HPLC Platino iridio Il platino iridio inerte nei confronti di quasi tutti gli acidi le basi e i solventi di uso comune Non sono note incompatibilit documentate per le applicazioni HPLC Polimeri fluorurati PTFE PFA FEP FFKM I polimeri fluorurati quali il PTFE politetrafluoroetilene il PFA perfluoroal cossi e il FEP etilene propilene fluorurato sono inerti nei confronti di quasi tutti gli acidi le basi e i solventi di uso comune FFKM una gomma perfluoru rata resistente alla maggior parte dei composti chimici Trattandosi di un ela Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 stomero pu dare luogo a rigonfiamenti in presenza di alcuni solventi organici quali gli idrocarburi alogenati I tubi di copolimero in TFE PDD utilizzati in tutti i degassatori Agilent eccetto il modello G1322A non sono compatibili con i solventi fluorurati quali Freon Fluorinert o Vertrel In presenza di esafluoroisopropanolo HFIP presentano una durata utile ridotta Per ottenere la massima durata utile possibile in pre senza di HFIP preferibile dedicare una camera specifica a questo solvente non cambiare solventi e non lasciare
78. ica la presenza di tensioni pericolose Indica un terminale di messa a terra protetto Indica il rischio di lesioni oculari in caso di visione diretta della luce prodotta dalla lampada al deuterio utilizzata nel prodotto Se l apparecchiatura contrassegnata da questo simbolo sono presenti superfici molto calde che non devono essere toccate dall utente gt O aNg L indicazione ATTENZIONE segnala situazioni che potrebbero potenzialmente causare lesioni gravi o mortali gt Prima di continuare a usare lo strumento verificare di aver compreso e attuato quanto indicato nell indicazione di attenzione L indicazione AVVERTENZA indica situazioni che possono causare una perdita di dati o danni allo strumento AVVERTENZA gt Non procedere oltre finch non stato compreso ed eseguito quanto indicato 108 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 Informazioni sui solventi Osservare le seguenti raccomandazioni sull uso dei solventi e Attenersi alle raccomandazioni per evitare la comparsa di alghe fare riferi mento ai manuali della pompa e Piccole particelle possono ostruire in modo permanente i capillari e le val vole Filtrare sempre i solventi con filtri da 0 4 um e Evitare o ridurre al minimo l uso di solventi che possano corrodere le parti del circuito idraulico Osservare le specifiche relative all intervallo di pH consigliato per i diversi materiali ad e
79. icazioni di Agilent Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema In questa guida In questa guida Il presente manuale contiene informazioni sul sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 1 Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto Nel presente capitolo sono presentate le caratteristiche del sistema LC binario 1260 Infinity 2 Introduzione Nel presente capitolo riportata un introduzione al sistema LC binario Agilent 1260 Infinity e ai principi su cui esso si basa 3 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Nel presente capitolo sono discusse l applicazione della teoria e l utilizzo delle caratteristiche del sistema LC per sviluppare separazioni ottimizzate 4 Configurazione e installazione del sistema Nel presente capitolo vengono fornite informazioni su installazione del sof tware installazione dei moduli e preparazione del sistema per l utilizzo 5 Guida introduttiva Nel presente capitolo vengono fornite informazioni sull acquisizione e sull ana lisi dei dati con il sistema LC binario 1260 Infinity 6 Appendice Nel presente capitolo vengono fornite ulteriori informazioni di natura legale sulla sicurezza e sulle risorse disponibili sul Web oltre che sull impostazione di un metodo Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 3 Sommario Sommario Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prod
80. icolare nel caso delle colonne narrow bore ossia di diametro interno pari a 2 1 mm spesso utilizzate nella rivelazione tramite spettrometria di massa A titolo di esempio nei metodi HPLC con impaccamento da 5 um si utilizzano in genere velocit di flusso pari a 1 ml min con colonne di diametro interno di 4 6 mm e pari a circa 0 2 ml min con colonne di diametro interno di 2 1 mm stessa velocit lineare nella colonna In un sistema avente un volume di ritardo tipico pari a 1000 ul e con una colonna da 2 1 mm il segmento isocra tico iniziale nascosto sarebbe pari a 5 min mentre in un sistema con volume di ritardo pari a 600 ul il ritardo sarebbe di 3 min Volumi di ritardo di questa entit sarebbero eccessivi per tempi di analisi di uno o due minuti Nel caso degli impaccamenti con particelle di dimensioni inferiori a due um la velocit di flusso ottimale in base alla curva di van Deemter leggermente pi ele vata e pertanto la cromatografia rapida pu utilizzare velocit di flusso da tre a cinque volte superiori producendo ritardi di circa un minuto Tuttavia il Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 volume di ritardo deve essere ulteriormente ridotto per ottenere ritardi pari a una frazione del tempo di analisi desiderato Ci possibile con il sistema LC binario Agilent 1260 Infinity grazie al basso volume di ritardo del circuito
81. idraulico della pompa e al basso volume del circuito idraulico attraverso l autocampionatore Volume extra colonna Il volume extra colonna un fattore di dispersione dei picchi che riduce la risoluzione della separazione e pertanto deve essere ridotto al minimo Colonne di diametro pi piccolo richiedono volumi extra colonna proporzio nalmente pi piccoli per mantenere su valori minimi la dispersione dei picchi In un cromatografo liquido il volume extra colonna dipende dai tubi di collega mento tra l autocampionatore la colonna e il rivelatore nonch dal volume della cella di flusso nel rivelatore Nel sistema LC binario Agilent 1260 Infinity il volume extra colonna ridotto al minimo grazie ai tubi narrow bore diame tro interno pari a 0 12 mm agli scambiatori di calore a basso volume nel com parto colonne e alla cella a cartuccia Max Light nel rivelatore Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 41 3 42 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Volumi di ritardo nel sistema LC binario Agilent 1260 Infinity In Tabella 4 pagina 42 e Tabella 5 pagina 42 sono mostrati i volumi dei com ponenti che contribuiscono al volume di ritardo del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Tabella 4 Volumi di ritardo dei moduli del sistema LC binario 1260 Infinity Componenti Volume di ritardo pL Pompa binaria 120 Pompa binaria 600 800 Miscelatore a basso volume 2
82. iente costante 1 010 pL min a seconda del maggiore dei due valori pompaggio di H70 degassificata a 10 MPa 100 bar Intervallo operativo 0 60 MPa 0 600 bar 0 8700 psi fino a 5 mL min lt 2 di ampiezza in genere lt 1 3 o lt 0 3 MPa 3 bar a seconda del maggiore dei due valori con isopropanolo a 1mL min a tutte le pressioni gt 1 MPa 10 bar 147 psi Configurazione per volume di ritardo basso lt 5 di ampiezza in genere lt 2 Predefinita in base alla compressibilit della fase mobile 1 0 12 5 i solventi con pH lt 2 3 non devono contenere acidi in grado di corrodere l acciaio inossidabile Miscelazione binaria ad alta pressione Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto 1 Tabella 2 Specifiche delle prestazioni della pompa binaria Agilent 1260 Infinity G1312B Tipo Specifica Commenti Volume di ritardo Intervallo di composizione Precisione della composizione Accuratezza della composizione Controllo Controllo locale Uscita analogica Comunicazioni Sicurezza e manutenzione Configurazione per volume di ritardo standard 600 800 uL include miscelatore da 400 uL a seconda della contropressione Configurazione per volume di ritardo basso 120 uL intervallo impostabile 0 100 intervallo consigliato 1 99 o 5 pL min per canale a
83. il segnale A come rivelatore a banda ampia per assicurarsi che siano disponibili spettri dei picchi per tutti i segnali alle varie lunghezze d onda Store controlla la modalit di raccolta degli spettri con le opzioni elencate di seguito None non viene memorizzato alcuno spettro Apex Baselines vengono acquisiti tre spettri in corrispondenza dell ini zio dell apice e della fine del picco Apex Slopes Baselines vengono acquisiti cinque spettri in corrispon denza dell inizio della pendenza ascendente dell apice della pendenza discendente e della fine del picco All in Peak vengono memorizzati tutti gli spettri disponibili in un picco All vengono memorizzati tutti gli spettri dell analisi Every 2nd Spectrum vengono memorizzati solo spettri alternati acquisiti durante l analisi Range gli spettri possono essere salvati sull intero intervallo del rivela tore da 190 nm a 640 nm o su un qualsiasi intervallo ridotto ritenuto opportuno dall utente Ci riduce la quantit di dati da memorizzare Step controlla l intervallo nm dei dati memorizzati in uno spettro e quindi incide sulla risoluzione spettrale osservata L impostazione prede finita pari a 2 nm una buona scelta per la maggior parte delle applica zioni Threshold stabilisce che non vengono memorizzati spettri per altezze di picco inferiori a questo valore MAU Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 131 6 Appendice Adv
84. ioni tutte le colonne di diametro minimo pari a 2 1 mm ID o addirittura inferiore applicazioni con dispersione dei picchi ampiezza del picco x flusso minima pari a 2 uL esempio ampiezza del picco 0 04 min e flusso 0 1 mL min comporta una dispersione dei picchi pari a 0 04 min x 0 1 mL min 0 004 mL 4 uL Alta sensibilit Se necessaria una maggiore sensibilit possibile utilizzare la Cella a car tuccia Max Light 60 mm V s 4 0 uL G4212 60007 Questa cella migliora il rivelatore riducendo il limite di rivelazione LOD di un fattore circa pari a 3 a seconda dell applicazione Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Dispersione ultra bassa La cella ULD a cartuccia Max Light pu essere utilizzata con i rivelatori DAD G4212A e G4212B La cella un requisito obbligatorio nel caso del kit a dispersione ultra bassa attualmente esistente come Kit a dispersione ultra bassa 1290 Infinity 5067 5189 La cella deve far parte della soluzione a dispersione ultra bassa Alto intervallo dinamico La cella HDR a cartuccia Max Light pu essere utilizzata con i rivelatori DAD G4212A e G4212B La cella obbligatoria come componente della soluzione HDR High Dynamic Range ad alto intervallo dinamico che sar introdotta a marzo aprile 2013 Per proteggere la cella di flusso dalla sovrappressione ad esempio nei sistemi LC MS
85. ioni delle particelle efficienza e tempo di analisi possibile ridurre il tempo di analisi senza compromettere l efficienza della colonna mediante l ottimizzazione delle dimensioni delle particelle e della pressione Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 35 2 36 Introduzione Risoluzione superiore Le colonne lunghe impaccate con particelle pi piccole offrono un efficienza migliore e una risoluzione superiore Si tratta di fattori importanti per l analisi di campioni complessi negli studi di metabolomica o proteomica Anche appli cazioni quali la determinazione del profilo delle impurit possono avvantag giarsi del maggior potere di separazione Analogamente l analisi LC MS dei farmaci nei liquidi biologici pu trarre vantaggi dalla superiore capacit dei picchi grazie alla ridotta interferenza della soppressione ionica In generale un potere di separazione superiore equivale a una maggiore affidabilit dei risultati analitici 35 z n Capacit del picco 694 m 2 LC con risoluzione GC S 20 2 9 15 lt i 10 54 PE TRAI ALATA MANN A 0 nl UNI W koa NN U W1 UN Mw IN VM WA Mud AAA ua Mr A N 5 10 15 20 25 30 35 40 Tempo min Figura 12 Nell analisi di un digerito triptico di BSA si possono raggiungere capacit di picco superiori a 700 usando una colonna ZORBAX RRHT SB C18 2 1 x 150 mm 1 8 um Sistema LC binario 1260 In
86. ipico lt t0 6 uAU cm per un eccezionale sensibilit di rivelazione possibile eseguire l aggiornamento graduale dalla serie 1100 o 1200 al sistema LC binario Agilent 1260 Infinity per esempio un rivelatore serie 1100 o un comparto colonne serie 1200 pu essere abbinato a una pompa binaria 1260 Infinity Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 9 1 Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto Componenti del sistema Sono possibili svariate configurazioni del sistema LC binario 1260 Infinity ciascuna adatta agli specifici requisiti delle singole applicazioni Alcune confi gurazioni sono descritte in maggiore dettaglio nel presente manuale vedere Configurazione e installazione del sistema pagina 71 I moduli descritti nelle sezioni che seguono sono i componenti tipici di un sistema LC binario 1260 Infinity Oltre a questi componenti principali soluzioni individuali sono disponibili per applicazioni specifiche alcune sono descritte nel capitolo Ottimizzazione 10 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto 1 Pompa binaria 1260 Infinity G1312B La pompa binaria include due pompe identiche integrate in un unico alloggia mento I gradienti binari vengono creati tramite miscelazione ad alta pres sione possibile by passare lo smorzatore di impulsi e il miscelatore nel caso d
87. istema Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto Caratteristiche del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 8 Componenti del sistema 10 Pompa binaria 1260 Infinity G1312B 11 Degassatore ad alte prestazioni 1260 Infinity G4225A 14 Autocampionatore ad alte prestazioni 1260 Infinity G1367E 15 Comparto colonne termostatato 1290 Infinity G1316C 17 Rivelatore a serie di diodi 1260 Infinity G4212B 19 Valvole Quick Change serie 1200 Infinity 21 Specifiche 22 Nel presente capitolo sono presentate le caratteristiche del sistema LC binario 1260 Infinity GE Agilent Technologies 7 1 Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto Caratteristiche del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Il principio che ispira il design del sistema LC binario 1260 Infinity la possi bilit di eseguire applicazioni di cromatografia liquida con separazioni ultra rapide e ad alta risoluzione pur preservando l intero spettro di funziona lit per le applicazioni HPLC standard Pertanto il sistema assicura la com pleta retrocompatibilit con imetodi HPLC e UHPLC consolidati gi sviluppati dall utente L utilizzo di particelle di dimensioni inferiori a due micron STM significa che per ottenere velocit di flusso pi alte o in presenza di colonne lunghe necessaria una pressione superiore per far fluire la fase mobile attra verso la colonna Il circuito idraulico del sistema LC binario 126
88. izzando le impostazioni dei parametri attivi in quel momento Run Sequence serie di iniezioni automatiche da pi vial se possibile con pi metodi Per ulteriori dettagli fare riferimento ai manuali ChemStation Fare clic sull icona Select Run Method Task w Se al momento non sono caricate le condizioni del metodo desiderate per caricarle selezionare Method gt Load Method o l icona dB che si trova sulla barra del menu Se in un metodo caricato sono stati introdotti cambiamenti che non sono ancora stati salvati un asterisco giallo sull icona dello stato del metodo lo segnala L iniezione pu essere eseguita senza prima salvare i cambiamenti di quei parametri ChemStation archivia sempre una copia dei parametri di acquisizione in file di dati come ACO TXT per garantire la protezione dei parametri del metodo originari Posizionare la fiala del campione in posizione 1 ossia la posizione frontale delle 10 posizioni delle fiale da 2 ml sul lato destro del vassoio portacam pioni Selezionare Run Control gt Sample Info e immettere i parametri del campione necessari Per esempio Subdirectory opzionale Name Pattern Vial Location Sample name Comment 5 Seilsistema gi equilibrato e la linea di base stabile fare clic su Run 98 Method nella pagina Sample Info per avviare l iniezione In alternativa fare Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Guida introduttiva 5 clic su 0K e qua
89. jector Timetable funziona come negli altri moduli aggiungere una riga selezionare la funzione da modificare e immettere i nuovi valori di tale funzione Le modifiche apportate che interessano il rivelatore si verificano immediata mente in corrispondenza dell istante specificato Le seguenti funzioni pos sono essere modificate durante l analisi Balance Change Signal Change Threshold Change Peak detector Peakwidth Change Spectra Acquisition Mode Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 Change Contacts e Advanced Spectrum Durante l analisi gli spettri possono essere salvati su base continua o con trollata dai picchi valido per il software ChemStation alcuni pacchetti sof tware ad esempio EZChrom supportano solo la raccolta continua di tutti gli spettri e le opzioni per il controllo da parte dei picchi non compaiono La raccolta degli spettri e la raccolta dei segnali sono operazioni indipen denti eseguite dal firmware del rivelatore e non dipendono dal software del computer che estrae i dati dalla matrice di dati 3D La velocit di acquisi zione degli spettri determinata dall impostazione Peakwidth durante l intervallo specificato da Peakwidth vengono acquisiti otto spettri Il fir mware esegue la rivelazione dei picchi sul segnale A solo per determinare quando devono essere salvati gli spettri controllati dai picchi Per i segnali multipli pu essere necessario impostare
90. l autocampionatore viene lavato con la fase mobile Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 51 3 52 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Come ottenere una maggiore produttivit L iniezione pu essere ottimizzata in termini di velocit tenendo presente che un aspirazione troppo rapida del campione pu ridurre la riproducibilit I vantaggi ottenibili sono comunque marginali in quanto i volumi di campione utilizzati tendono in ogni caso verso l estremit inferiore dell intervallo Una frazione significativa del tempo di iniezione rappresentata dal tempo neces sario per introdurre ed estrarre l ago dal vial e nella porta di lavaggio Queste operazioni possono essere eseguite mentre in corso la separazione prece dente Questo metodo noto come iniezione sovrapposta e pu essere facil mente attivato dalla schermata di impostazione dell autocampionatore nel software di controllo L autocampionatore pu essere impostato in modo da commutare su bypass il flusso attraverso l autocampionatore dopo che l inie zione stata eseguita e quindi dopo che sono trascorsi i primi 3 minuti di un analisi di 4 minuti avviare il processo di aspirazione del campione succes sivo e di preparazione dell iniezione In questo modo in genere possibile risparmiare da 0 5 minuti a 1 minuto per iniezione Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del
91. l metodo 115 predefinito 115 singola iniezione 98 miscelatore 11 miscelazione ad alta pressione 11 0 ostruzioni della colonna prevenzione 68 ottimizzazione della risoluzione comparto colonne 59 condizioni cromatografiche 62 velocit di campionamento 61 volume extra colonna 60 ottimizzazione cella di flusso 66 condizioni per l analisi HPLC 31 ottenimento di una maggiore risoluzione 55 ottenimento di una maggiore sensibilit 63 sensibilit del rivelatore 65 separazione cromatografica 31 uso delle colonne 65 volumi di iniezione 47 P particelle di dimensioni inferiori a 2 micron 34 peso 23 piatti teorici 32 pompa a vuoto 14 148 pompa binaria 11 precisione del flusso 24 precisione della composizione 25 pressione intervallo operativo 24 pulsazione 24 prestazioni specifiche 24 principio di funzionamento 14 rapporto specifiche 103 riduzione automatica del volume di ritardo 50 rigenerazione alternata delle colonne 49 riscaldamento per attrito 37 risoluzione aumento 55 ottimizzazione 55 rivelatore a serie di diodi descrizione 19 rivelatore ottenimento di una maggiore sensibilit 65 sensibilit configurazione dello strumento 64 ottimizzazione 63 sensore di pressione 14 sicurezza informazioni generali 106 simboli 108 standard 23 sistema idraulico 24 sistema accensione 87 soluzioni tampone 11 solventi sostituzione 83 sostituzione dei solventi 83 specifiche fisiche 23 specifich
92. l sistema di rivelazione utilizzato Per la rivelazione UV le colonne di diametro interno pari a 3 0 mm sono ideali in quanto consentono di ottenere le velocit lineari pi elevate possibile ottenere velocit lineari elevate anche con colonne di diametro interno pari a 4 6 mm ma la velocit di flusso massima limitata a 5 mL min La pompa deve essere utilizzata nella configurazione per volume di ritardo standard vedere Figura 13 pagina 43 per le colonne di diametro interno pari a 4 6 mm e 3 0 mm Per le colonne di diametro interno pari a 2 1 mm deve essere utilizzata la configurazione per volume di ritardo basso Inoltre in caso di utilizzo di colonne di diametro interno di 2 1 mm necessario installare il kit a bassa dispersione per ottenere il pi basso volume extra colonna Per la massima sensibilit UV si raccomanda inoltre di utilizzare il miscelatore corto Miscelatore a basso volume 200 uL 5067 1565 Le condizioni cromatografiche dipendono in misura notevole dai composti da analizzare sebbene sia possibile seguire alcune regole empiriche per ridurre i tempi di ciclo e Utilizzare le pi alte velocit di flusso compatibili con la risoluzione deside rata la contropressione e il sistema di rivelazione e Utilizzare gradienti ripidi e Si consiglia di operare a temperature elevate della colonna per permettere l utilizzo di alte velocit di flusso e ridurre ulteriormente il tempo di analisi Le colonne Zorbax
93. la fase mobile ogni 24 48 h non aggiungere fase mobile alla bottiglia utilizzare sempre una bottiglia nuova 5 Non utilizzare una fase mobile a base di soluzione tampone altamente salina gt 50 mM insieme a concentrazioni elevate di acetonitrile perch potrebbe formarsi del precipitato 6 Siraccomanda l uso di un filtro in linea per intrappolare i particolati e pro lungare la durata della colonna Utilizzare il filtro in linea 1260 Infinity ade guato per la colonna specifica filtro in linea LC 1260 Infinity 2 1 mm filtro con pori di dimensioni pari a 0 2 um max 600 bar capillare di collegamento SS da 70 x 0 12 mm 5067 1551 per colonne di diametro interno pari a 2 1 filtro in linea LC 1260 Infinity 4 6 mm filtro con pori di dimensioni pari a 0 2 um max 600 bar capillare di collegamento SS da 90 x 0 17 mm 5067 1553 per colonne di diametro interno pari a 4 6 mm o 3 0 mm Sosti tuire il filtro quando la pressione aumenta del 10 7 Spurgare le pompe i collegamenti fino alla colonna da tutte le fasi mobili a base di soluzioni tampone e farvi fluire 5 mL di solvente prima di collegare la colonna allo strumento Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Come prevenire ostruzioni della colonna 8 Lavare la colonna con una fase mobile compatibile iniziando lentamente a 0 1 mL min per una colonna con diametro interno di 2 1 mm a 0 2 mL
94. le iniezioni sovrapposte e della riduzione automatica del volume di ritardo rappresentato dal fatto che l autocampionatore non inse rito nel circuito idraulico per l intera durata del tempo di analisi Nel caso di composti molto aderenti ci potrebbe comportare un maggiore effetto memo ria e o discriminazione dei composti L effetto memoria la percentuale di composto che rimane nei componenti dello strumento che vengono a contatto con il campione e non viene introdotta nella colonna per l analisi Ci significa che questa percentuale va perduta ai fini della misurazione quantitativa ossia discriminata possibile misurare l effetto memoria iniettando solvente puro al termine dell analisi del cam pione Discriminazione ed effetto memoria possono essere anche pi significa tivi se i composti degli analiti sono non polari e la fase iniziale del gradiente contiene un alta percentuale di acqua Nel caso peggiore il composto non polare precipita sulla superficie di contatto Piccole prese di dimetilsolfossido per esempio prima e dopo la presa del campione possono consentire di ridurre al minimo il problema Per le iniezioni sovrapposte o la riduzione automatica del volume di ritardo l intervallo temporale che precede la commutazione della valvola di iniezione nella modalit di bypass deve essere incrementato utilizzando il fattore di eli minazione impostato su 20 Ci amplia l intervallo durante il quale il volume di ritardo del
95. lle caratteristiche del sistema LC per sviluppare separazioni ottimizzate SPE Agilent Technologies 39 3 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Configurazione del volume di ritardo ottimale 40 Volume di ritardo e volume extra colonna Il volume di ritardo definito come il volume del sistema tra il punto di miscelazione della pompa e la sommit della colonna Il volume extra colonna definito come il volume tra il punto di iniezione e il punto di rilevazione escluso il volume presente nella colonna Volume di ritardo Nelle separazioni in gradiente questo volume causa un ritardo tra la modifica della miscela nella pompa e l istante in cui la nuova miscela raggiunge la colonna Il ritardo dipende dalla velocit di flusso e dal volume di ritardo del sistema In pratica ci significa che in ogni sistema HPLC all avvio di ogni ana lisi presente un segmento isocratico aggiuntivo nel profilo del gradiente In genere il profilo del gradiente viene descritto in termini di impostazioni della miscela all altezza della pompa mentre il volume di ritardo non viene citato sebbene abbia un effetto sulla cromatografia Questo effetto diventa pi signi ficativo a basse velocit di flusso e per colonne di volume ridotto e pu inci dere in notevole misura sulla trasferibilit dei metodi a gradiente Pertanto per eseguire separazioni in gradiente rapide importante che i volumi di ritardo siano ridotti in part
96. lo TCC a temperature cos basse da formare condensa di acqua dall umidit dell aria in quanto ci provoca l attivazione del sensore delle perdite e Column Switching Valve questa opzione attiva solo quando installata una valvola tra i supporti della colonna Sono disponibili tre tipi di valvole 2 posizioni e 6 porte utilizzata per la commutazione tra 2 colonne 2 posizioni e 10 porte utilizzata per la rigenerazione alternata delle colonne 8 posizioni e 9 porte utilizzata per la selezione di pi colonne in MDS 128 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 Impostazione di un metodo con la funzione di modifica di tutto il metodo Scheda del rivelatore a serie di diodi Setup Method xl E Binary Pump Sampler Sampler Injector Program aP Column Comp SW DAD amp Instrument Curves Signals Advanced Use Wave Band Reference Reference Spectrum Signal length width Wavelength Bandwidth Store None v Signal A v 2540 40 V 360 0 1000 nm Signal B vi 210 0 40 V 360 0 100 0 nm Range from 3 to 400 0 nm Signal C a 2140 40 3600 1000 nm Sle Dom Signal D vi 230 0 40 V 360 0 100 0 nm T i Signal E 9 2600 40 lt f 3600 1000 nm reshad diz Signal F erai 4 0 i ioi Nn Analog Output Signal G 80 0 4 0 100 0 nm Output 1 Signal H 250 0 40 60 0 100 0 nm Zero Offset EH Peakwidth Attenuation 1000 v mAU gt 0 1
97. lori delle impostazioni pre definite Fare clic su 0K per uscire dalla finestra Le modifiche vengono inviate al modulo della pompa Fare clic con il pulsante destro del mouse sull area dell autocampionatore e selezionare Method dal menu contestuale a Nella pagina Method di 1260 Infinity Autosampler inserire i seguenti para metri Injection volume Volume di iniezione 1 0 ul Injection with Needle Wash Iniezione con lavaggio dell ago Mode Flush Port Time Modalit porta di lavaggio tempo 6 s Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Guida introduttiva 5 b Per gli altri parametri si possono lasciare i valori delle impostazioni pre definite Fare clic su 0K per uscire dalla finestra Le modifiche vengono inviate al modulo dell autocampionatore 4 Fare clic con il pulsante destro del mouse sull area del comparto colonne termostatato TCC e selezionare Method dal menu contestuale a Nella pagina Method di 1290 Infinity TCC inserire i seguenti parametri Left Temperature Temperatura sinistra 40 C Right Temperature Combined Temperatura destra combinata b Per gli altri parametri si possono lasciare i valori delle impostazioni pre definite Fare clic su 0K per uscire dalla finestra Le modifiche vengono inviate al modulo TCC 5 Fare clic con il pulsante destro del mouse sull area del rivelatore a serie di diodi e selezionare Method dal menu contestuale a Nella pagina Metho
98. lte Le caratteristiche auspicabili di una buona separazione sono la presenza di picchi stretti e di una linea di base stabile caratterizzata da rumore minimo La scelta della configurazione strumentale incide sulla sepa razione particolarmente rilevante l impostazione del rivelatore Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 63 3 64 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Configurazione ottimale dello strumento per l alta sensibilit Considerazioni generali Per ottenere il pi basso rumore della linea di base si consiglia la configu razione per volume di ritardo standard per la pompa binaria 1260 Infinity Anche in questo caso il volume di iniezione e il solvente di dissoluzione del campione sono fattori importanti Operare in maniera atta a concentrare i composti in testa alla colonna per evitare la dispersione dei picchi causata dall iniezione che ridurrebbe l altezza dei picchi A tale scopo il campione deve essere dissolto in un solvente la cui composizione presenta una capaci t di eluizione inferiore rispetto alla fase mobile La temperatura della colonna non deve essere troppo bassa al fine di evi tare una ritenzione prolungata dei picchi nella colonna Una temperatura troppo bassa comporta anche dispersione dei picchi e riduzione della loro altezza La velocit di campionamento del rivelatore UV deve essere selezionata in base all ampiezza effettiva del picco
99. ma LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Glossario IU Balance Bilanciamento Bandwidth Larghezza di banda Based on Basato su Baseline Correction Correzione della linea di base BinPump PompaBin C Calculate Calcola Calculation mode Modalit calcolo Calibration Calibrazione Cancel Annulla Change Contacts Modifica contatti Change Peak detector Peakwidth Modifica picco Ampiezza del picco del rivelatore Change Signal Modifica segnale Change Spectra Acquisition Mode Modifica modalit di acquisizione degli spettri Change Threshold Modifica soglia 143 Glossario IU Change Cambia Check Method Sections to Edit Controlla le sezioni del metodo da modificare Chromatogram Output Uscita cromatogramma Clear all Cancella tutto Column Switching Valve Valvola di commutazione della colonna Combined Combinata Comment Commento Customized Data Analysis Macro Macro personalizzata per l analisi dei dati Cut Taglia D Data Acquisition Acquisizione di dati Data Analysis Analisi dei dati Delete Row Elimina riga Destination Destinazione Draw position Posizione di aspirazione Draw speed Velocit di aspirazione E Edit Entire Method Modifica tutto il metodo 144 Edit Integration Events Modifica eventi di integrazione Edit Signal Plot Modifica diagramma del segnale Eject speed Velocit di emissione Enable overlapped injection Abilita iniezione
100. manipolazione di aliquote da pi vial come ad esempio nella derivatizzazione pre colonna I reagenti chimici vengono miscelati automaticamente con il cam pione per incrementare la rivelabilit o la sensibilit Un esempio spesso citato la derivatizzazione di amminoacidi con i reagenti OPA e FMOC Per informa zioni dettagliate fare riferimento al manuale dell autocampionatore ad alte prestazioni Agilent 1260 Infinity 122 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 Impostazione di un metodo con la funzione di modifica di tutto il metodo Scheda della pompa binaria Setup Method xl jO Sampler Sampler Injector Program Pal Column Comp v DAD 3X Instrument Curves Flow Advanced Timetable empty 0 000 mL min function centric Solvents 5 3 Time min A BR lan Max ressure K ooo gt ME X oo 100 00 0 000 400 00 B 0 H2 v Pressure Limits Min 000 bar Max 400 00 bar Stoptime Posttime As Injector No Limit ot O 1 00 min min Add Remove Clear All ClearEmpty Cut Copy Paste ShiftTimes min SI TT Show timetable graph OK Apply Cancel Help Figura 27 Schermata di impostazione del metodo Scheda della pompa binaria Flow consente di impostare la velocit di flusso fino a 5 mL min Per la separazione di esempio si utilizza la velocit di 4 mL min Se la contropres sione r
101. mente il metodo mAU Paracetamol 1004 RT shift lt 1 4 804 J Imp B 604 Imp K Imp A Imp H 40 i ImpJ J Agilent 1200 Series Impl 20 J Agilent 1260 Infinity SL N TTTTTT TrT TT t gt sr r_ lt T7T K TY rrrTTrre r a 0 5 10 15 20 25 30 35 min Figura 16 Confronto tra sistema Agilent serie 1200 e sistema LC Agilent 1260 Infinity sulla stessa configurazione 46 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Come ottenere volumi di iniezione maggiori La configurazione standard dell autocampionatore Agilent 1260 Infinity con sente di iniettare un volume massimo pari a 100 uL con il capillare del loop standard Per aumentare il volume di iniezione possibile installare il Kit di aggiornamento multiaspirazione G1313 68711 Il kit consente di aumentare il volume di iniezione dell iniettore di un massimo di 400 uL o 1400 uL In tal caso il volume totale pari a 500 uL o 1500 uL per l autocampionatore 1260 Infinity con testa analitica da 100 uL Tenere presente che il volume di ritardo dell autocampionatore aumenta se si utilizzano i capillari prolungati della sede disponibili nel kit multiaspirazione Quando si calcola il volume di ritardo dell autocampionatore necessario raddoppiare il volume dei capillari prolun gati Il volume di ritardo del sistema associato all autocampionatore aumenta di consegu
102. min per una colonna con diametro interno di 3 0 mm e a 0 4 mL min per una colonna con diametro interno di 4 6 mm Aumentare la velocit di flusso fino al valore desiderato nell arco di 5 minuti 9 Quando la pressione si stabilizzata collegare la colonna al rivelatore 10 Prima dell uso equilibrare la colonna e il rivelatore con 10 volumi di colonna della fase mobile 1 5 mL a seconda delle dimensioni della colonna 11 Evitare una pressione eccessiva Controllare l intervallo di pressione del gradiente utilizzato che pu essere pari o superiore a 100 130 bar prima di avviare qualsiasi sequenza Per setti porosi da 2 1 mm utilizzareinserti con cono piccolo Per setti porosi da 4 6 mm utilizzare inserti con cono grande Figura 20 Protezione per colonne di diametro interno pari a 4 6 e 2 1 mm impaccate con particelle da 1 8 um setto poroso d ingresso con pori di dimensioni pari a 0 2 ym Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 69 3 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Come prevenire ostruzioni della colonna 70 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 000 d0 4 Configurazione e installazione del e sistema Installazione del software 72 Installazione dei moduli 74 Installazione dei moduli del sistema 74 Integrazione in rete 74 Capillari e tubi di
103. mperatura fino a 100 C su particolari colonne migliora la flessibi lit della selettivit e riduce la viscosit dei solventi per una separazione ancora pi rapida 8 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto 1 e Nel comparto colonne termostatato 1290 Infinity possibile installare diversi elementi riscaldanti 1 6 uL e raffreddanti 1 5 uL per ottenere un basso volume extra colonna La temperatura regolabile da 10 C al di sotto della temperatura ambiente fino a 100 C Il nuovo design pull out del sistema di azionamento delle valvole e le valvole Quick Change sostituibili dall utente del comparto colonne termostatato 1290 Infinity incrementano l utilizzabilit e spianano il cammino a soluzioni multi metodo e di sviluppo automatico dei metodi a produttivit ultra ele vata Ikitditubi a bassa dispersione e le celle di flusso a basso volume riducono al minimo la dispersione dei picchi per le colonne narrow bore Uniformit della linea di base e acquisizione spettrale rapida a velocit di campionamento fino a 80 Hz grazie al nuovo design ottico del rivelatore a serie di diodi 1260 Infinity e Sono disponibili diverse celle di flusso per rivelatori UV per l uso con colonne di diametro interno di 2 1 3 0 e 4 6 mm inclusa la rivoluzionaria cella di flusso a cartuccia Max Light Agilent con cammino ottico di 60 mm rumore t
104. nario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Guida introduttiva 5 Spurgo della pompa Spurgare la pompa se stato eseguito per la prima volta l adescamento della pompa La pompa deve essere spurgata con solvente fresco prima di utilizzare il sistema oppure si deve sostituire il solvente con un solvente diverso La pompa rimasta inattiva per alcune ore o per un periodo pi lungo pu essersi diffusa aria nelle linee dei solventi e si raccomanda di eseguire lo Spurgo e Iserbatoi dei solventi sono stati rabboccati e la pompa deve essere spurgata per riempire il sistema con solvente fresco Se si devono utilizzare solventi diversi assicurarsi che il nuovo solvente sia miscibile con il solvente prece dente e se necessario inserire un passaggio intermedio utilizzando un sol vente co miscibile l isopropanolo spesso una buona scelta consultare una tavola di miscibilit dei solventi Per informazioni sulla procedura di spurgo fare riferimento a Adescamento normale pagina 82 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 91 5 Guida introduttiva Acquisizione dei dati nella schermata del metodo e controllo analisi 92 Parametri del metodo per la verifica del sistema con il campione di verifica isocratico Per la verifica del sistema LC binario 1260 Infinity viene eseguita un analisi di prova con una miscela di prova isocratica Campione di verifica isocratica Agi len
105. ncipali 1 Cromatografia pi rapida Le colonne corte con particelle inferiori a due micron offrono la possibilit di ridurre drasticamente i tempi di analisi aumentando la velocit di flusso senza abbassare le prestazioni in termini di separazione 2 Risoluzione superiore Le colonne lunghe con particelle inferiori a due micron offrono un effi cienza superiore e quindi la maggiore risoluzione necessaria per la separa zione di campioni complessi La pressione necessaria per far fluire il solvente attraverso una colonna conte nente particelle STM inferiori a due micron aumenta rapidamente al cre scere della velocit di flusso quando si desiderano separazioni pi rapide e aumenta molto rapidamente al crescere della lunghezza della colonna quando si desidera una risoluzione pi elevata La diffusione delle colonne STM quindi stata contestuale allo sviluppo dei sistemi UHPLC ovvero sistemi HPLC che offrono pressioni superiori rispetto ai consueti 400 bar in uso sin dagli albori della tecnica HPLC Attualmente Agilent mette a disposizione il sistema LC 1290 Infinity per rispondere ai massimi requisiti UHPLC con pressioni fino a 1200 bar 28 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Introduzione 2 Teoria Nell HPLC l efficienza di separazione pu essere descritta grazie all equazione di van Deemter Figura 6 pagina 29 Tale equazione deriva dal modello dell altezza dei piatti teorici adottat
106. ndo il sistema pronto selezionare Run Control gt Run Method L elemento viene aggiunto a Run Queue e quindi avviato automatica mente dalla coda 6 L iniezione viene eseguita e il cromatogramma appare in Online Plot L acqui sizione dei dati si arresta quando viene raggiunto l istante Stop Time L aspetto del cromatogramma deve essere simile a quello riportato di seguito DADI A Sig 254 4 Ref 550 100 DEMO 005 0105 D MAU Ss 100 1 023 80 min Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 99 5 Guida introduttiva Analisi dei dati Origine del metodo Tavola di navigazione Attivit di integrazione Attivit dello spettro Pannello di navigazione 100 In ChemStation un metodo contiene tutti i parametri per l acquisizione dei dati per il controllo del sistema e per l analisi dei dati per l elaborazione dei dati per fornire risultati quantitativi e qualitativi In questa sezione sono trat tati in breve l integrazione e i report nell analisi dei dati per consentire di inte grare e stampare le separazioni generate seguendo la procedura descritta precedentemente in questo capitolo Per maggiori informazioni sull analisi dei dati compreso l uso della calibrazione per la quantificazione fare riferimento al manuale ChemStation fe dd pf rec mi ax lt a Ta acc rar ua PIA n SE ESE 3 trotto nd n Conn deo tao gini mt tt mte E pm
107. ne dall iniezione al fronte del solvente o al marcatore di picchi non ritenuti Per aggiungere alla tabella le righe come Integration OFF ON usare le icone in cima alla finestra Fare clic su 0K per uscire e si aprir la schermata successiva del processo di Modifica tutto il metodo Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 137 6 Appendice Specifica rapporto La schermata Specify Report pu anche essere raggiunta direttamente dalla finestra Method and Run Control facendo clic con il pulsante destro del mouse sull interfaccia utente grafica dell icona Rapporto e quindi facendo clic su Specify Report nel menu contestuale Nella visualizzazione Data Analysis vi si pu accedere attraverso il menu Report gt Specify Report o sull icona di attivit Specifica rapporto Specify Report Instrument 1 Reporting settings Quantitation settings Report mode O Use Intelligent Reporting Use Classic Reporting Style Chromatogram output Report style Short J na cal of Quantitative result sorted by Signal J Portait of pages Time fi co Sample info on each page Add fraction table and ticks O Landscape v dd chromatogram output Add summed peaks table C Add sample custom fields to sample info C Add compound custom fields Response 10 Multi page Landscape Report layout for uncalibrated peaks i Pages O Separately With calibra
108. nto la pressione scenda al di sotto di tale valore Si tratta di una misura di salvaguardia alternativa nel caso in cui la colonna non si trova all interno di un modulo dotato di sen sore delle perdite o qualora il sistema pompi a secco In genere per il limite minimo di pressione si imposta un valore compreso tra 10 e 20 bar Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 Impostazione di un metodo con la funzione di modifica di tutto il metodo Scheda del comparto colonne termostatato TCC Setup Method Q HiP ALS Q HiP ALS Injector Program sk BinPump TCC 7 DAD Instrument Curves Temperature Timetable Left Right Advanced D Not Controlled Not Controlled Enable Analysis 40 0 5 C 20 0 V when front door open D As Detector Cell As Detector Cell Left Right With any temperature with any temperature Column Switching Valve Meo mese vibo Wenterestsurete nia Posi c E 08 Potio 2 Stoptime Posttime As Pump Iniector or 1 00 ji E T Figura 28 Schermata Imposta metodo Scheda del comparto colonna termostatato Temperature consente di definire la temperatura dei supporti di colonna destro e sinistro che possono essere controllati in modo indipendente o interconnesso facendo clic sul pulsante di scelta Combined Se si utilizza l opzione combinata le impostazioni per il lato sinistro controllano entrambe le sezioni e ci sicuramente
109. nzionamento imprevisto della pompa binaria Miscelatore Smorzatore Valvola di spurgo lt Uscita della pompa lt gt Sensore di pressione allo scarico Valvola di uscita Valvola di uscita Valvola Ve Valvola ingresso Camera di d ingresso Rat miscelazione i da bottiglia Guami Guarni da bottiglia di solvente A n zioni zioni n di solvente B Pistoni E n Pistoni Testa della pompa A Testa della pompa B Figura 2 Percorso idraulico della pompa binaria con regolatore e miscelatore bypassati Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 13 1 Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto Degassatore ad alte prestazioni 1260 Infinity G4225A I componenti del degassatore ad alte prestazioni Agilent 1260 Infinity modello G4225A sono quattro camere a vuoto separate con tubi semipermea bili una pompa a vuoto e un gruppo di controllo All accensione del degassa tore sottovuoto il gruppo di controllo mette in funzione la pompa a vuoto che crea la bassa pressione nelle camere a vuoto La pressione viene misurata da un sensore di pressione Il degassatore sottovuoto mantiene la bassa pressione tramite perdita controllata nel filtro d ingresso dell aria e regolazione della pompa a vuoto mediante il sensore di pressione La pompa LC aspira i solventi dalle bottiglie attraverso i tubi semipermeabili delle camere a vuoto Quando i solventi attraversano le camere
110. o Si pu scegliere se selezionare alcuni o tutti i segnali acquisiti del rivelatore perch vengano elaborati Se non vengono rile vati segnali la tabella vuota In questa situazione ChemStation per imposta zione predefinita elaborer tutti i segnali acquisiti del rivelatore A volte l utente potrebbe modificare un metodo esistente per creare un nuovo metodo e incappa in un errore di Parameter Mismatch quando tenta di attivare il metodo In pratica nel vecchio metodo i Signal Details contenevano un segnale specificato ad esempio 250 nm con ampiezza di banda di 8 nm e que sto valore nel nuovo metodo stato cambiato ad esempio in 254 nm 12 nm La tabella Signal Details contiene ancora i dettagli precedenti e il processo le sta indicando un segnale che non viene pi acquisito Evidenziare il segnale pre cedente all interno della tabella e usando il pulsante Delete Row il problema verr corretto Se un sistema utilizza rivelatori multipli come il rivelatore a serie di diodi e uno spettrometro di massa le righe Signal Description permettono di inserire i tempi di ritardo per il rivelatore a valle del flusso cos il software pu alli neare picchi da diversi rivelatori Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 Impostazione di un metodo con la funzione di modifica di tutto il metodo Signal Details Instrument 2 Available Signals DADI A 5ig 250 100 Retoft Insert Row Append Row
111. o contenute Salvo il caso di dolo o colpa grave Agilent non sar respon sabile di errori o danni diretti o indi retti relativi alla fornitura o all uso di questo documento o delle informazioni in esso contenute In caso di separato accordo scritto tra Agilent e l utente con diverse condiz ioni di garanzia relativamente al con tenuto di questo documento in conflitto con le condizioni qui ripor tate prevarranno le condizioni dell accordo separato Licenze tecnologia componenti hardware e o software descritti in questo documento vengono for niti con licenza e possono essere utilizzati o copiati solo in conformit ai termini di tale licenza Indicazioni di sicurezza AVVERTENZA L indicazione AVVERTENZA segnala un rischio Richiama l attenzione su una procedura operativa o analoga operazione che se non eseguita corretta mente o non rispettata pu provocare danni al prodotto o la perdita di dati importanti Non eseguite mai alcuna operazione ignorando l AVVERTENZA fatelo solo dopo aver compreso e appli cato completamente le indica zioni di Agilent ATTENZIONE L indicazione ATTENZIONE segnala un rischio serio Richiama l attenzione su una procedura operativa o analoga operazione che se non eseguita correttamente o non rispettata pu provocare lesioni personali o morte Non eseguite mai alcuna operazione ignorando l indicazione ATTENZIONE fatelo solo dopo aver compreso e applicato completamente le ind
112. o dall HPLC convenzionale all UHPLC basata su colonne con particelle di dimensioni pari a 1 8 um Il cal colatore disponibile sul sito Web di Agilent Technologies insieme a un calco latore di trasferimento del metodo www chem agilent com I risultati sono presentati sia in formato grafico sia tabellare Analisi di durata pi breve forniscono anche risposte pi rapide Si tratta di un fattore importante nel controllo dei processi e nei test a risposta rapida Invece di attendere ore per rilasciare un unico lotto di un farmaco l idoneit del sistema la sua calibrazione e l analisi dei campioni possono essere eseguiti complessivamente in meno di un ora Le risposte rapide sono importanti Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Lunghezza colonna mm 150 100 75 50 30 Introduzione 2 anche per gli operatori nella chimica di sintesi che utilizzano sistemi LC MS ad accesso aperto per la conferma dei composti e il controllo delle reazioni Analisi di durata pi breve possono inoltre accelerare significativamente il processo di sviluppo dei metodi Efficienza Efficienza Efficienza Riduzione colonna colonna colonna del tempo N 5 um N 3 5 um N 1 8 um di analisi 12 500 21 000 35 000 8 500 14 000 23 250 Efficienza N Tempo 33 di analisi 6 000 10 500 17 500 50 Pressione 4 200 7 000 12 000 Volume 67 del picco N A 4 200 6 500 Uso 80 del solvente Figura 11 Relazione tra dimens
113. o in termini di usura delle guarnizioni e volume di fase mobile pompata con limiti predefiniti e impostabili dall utente e messaggi di avviso Registri elettronici delle attivit di manutenzione e degli errori Tutti i materiali sono riciclabili Per velocit di flusso al di sotto dei 500 ul min o per l uso in assenza di regolatore e miscelatore necessario un degassatore sottovuoto Tutte le misurazioni delle specifiche sono state effettuate con solventi degassati Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 00 Q0 2 o90 Introduzione e e J Teoria dell impiego di particelle pi piccole nella cromatografia liquida 28 Vantaggi delle colonne con particelle di dimensioni ridotte 34 Riscaldamento per attrito 37 Nel presente capitolo riportata un introduzione al sistema LC binario Agilent 1260 Infinity e ai principi su cui esso si basa oa Agilent Technologies 27 2 Introduzione Teoria dell impiego di particelle pi piccole nella cromatografia liquida Introduzione Nel 2003 Agilent ha introdotto per la prima volta sul mercato le colonne di silice completamente porosa con particelle da 1 8 um In combinazione con il sistema LC binario Agilent 1260 Infinity queste colonne con particelle di dimensioni inferiori a due micron 1 8 um possono essere impiegate per perseguire i due seguenti obiettivi pri
114. o interno di 3 e 4 mm 45 configurazione per volume di ritardo basso 43 configurazione per volume di ritardo medio 44 configurazione per volume di ritardo standard 45 configurazione diagramma in linea 89 volume di ritardo basso 43 volume di ritardo medio 44 volume di ritardo standard 45 consumo elettrico 23 controllo e valutazione dei dati 25 D dati analisi 100 DEF_LCM 115 degassatore sottovuoto 26 design con due pistoni in serie 11 design 11 diagramma in linea configurazione 89 dimensioni 23 E effetto memoria 51 53 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Indice equazione di van Deemter 29 F fattore di ritenzione 32 formazione del gradiente 24 frequenza di rete 23 G gruppo di controllo 14 guida introduttiva introduzione 86 impostazione del metodo dello strumento 118 Informazioni sul metodo 116 117 iniezioni sovrapposte 50 installazione Lab Advisor 73 sistema di dati 72 software di controllo 72 integrazione in rete 74 integrazione 102 internet 114 intervallo di composizione 25 intervallo di flusso impostabile 24 intervallo di flusso impostabile 24 operativo 24 intervallo di frequenza 23 intervallo di pH consigliato 24 Intervallo di pH 24 intervallo di tensione 23 introduzione al degassatore 14 147 Indice L lavaggio attivo delle guarnizioni 11 Lista di controllo del tempo di analisi 116 M metodo impostazione 96 modifica tutto i
115. o per misurare la dispersione degli analiti mentre si spostano lungo la colonna H indica l altezza equivalente a un piatto teorico talvolta nota come HETP d indica le dimensioni delle particelle del materiale di impaccamento della colonna ug la velocit lineare della fase mobile e A B e C sono costanti correlate alle varie forze dispersive La costante A indica la diffusione vorticosa o i percorsi di flusso multipli attra verso la colonna B indica la diffusione molecolare lungo l asse longitudinale della colonna C indica il trasferimento di massa dell analita tra le fasi mobile e stazionaria La separazione tanto pi efficiente quanto pi basso il valore di H Gli effetti di ogni singolo termine e l equazione combinata sono mostrati in Figura 6 pagina 29 il cui grafico riporta l altezza dei piatti in funzione della velocit di flusso lineare attraverso la colonna Questo tipo di grafico noto come curva di van Deemter e viene utilizzato per determinare la velocit di flusso ottimale il punto di minimo della curva per ottenere la migliore effi cienza di separazione da una colonna E o 2 o o agi A o particella particella grande piccola o He N N 2 lt Resistenza al trasferimento H della massa min D ove vo Up Diffusione longitudinale Flusso lineare u Figura 6 Curva ipotetica di Van Deemter Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 29 2 30 Introduzione
116. olume extra colonna deve essere ridotto al minimo utilizzando capillari di collegamento corti e di diametro interno ridotto e raccordi installati correttamente L utilizzo di colonne di diametro interno pi ridotto dovrebbe consentire di aumentare l altezza dei picchi e pertanto ideale per le applicazioni in cui la quantit di campione limitata Se possibile iniettare la stessa quantit di campione in una colonna di minore diametro interno la diluizione associata al diametro della colonna inferiore e la sensibilit aumenta Per esempio la riduzione del diametro interno della colonna da 4 6 mm a 2 1 mm si traduce in un aumento teorico dell altezza dei picchi pari a 4 7 times a causa della minor diluizione in colonna Nel caso di uno spettrometro di massa le velocit di flusso pi basse tipiche delle colonne pi strette possono incrementare l efficienza dei feno meni di ionizzazione e migliorare quindi la sensibilit Impostazioni del rivelatore E possibile utilizzare una serie di parametri del rivelatore per ottimizzare le prestazioni Nelle sezioni che seguono descritto come i parametri del rivela tore incidono sulle caratteristiche delle prestazioni e La cella di flusso incide sulla sensibilit La lunghezza d onda e la larghezza di banda incidono su sensibilit seletti vit e linearit e La larghezza della fenditura incide su sensibilit risoluzione spettrale e linearit e L ampiezza del picco incid
117. oluzione Figura 9 pagina 32 la selettivit ha l impatto pi preponderante sulla risoluzione Figura 10 pagina 32 Ci signi fica che la scelta di propriet adatte delle fasi stazionaria e mobile e della tem peratura un fattore critico per ottenere una buona separazione ETT Figura 9 Equazione della risoluzione R f 01 4 i f N 2 f k 1 20000 40000 60000 80000 N 1 05 1 10 1 15 1 20 Q 5 10 15 20 k Figura 10 Effetto del numero dei piatti del fattore di separazione e del fattore di riten zione su R Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Introduzione 2 Tanto per i metodi di separazione UHPLC di nuova concezione quanto per il semplice trasferimento da un metodo tradizionale esistente vantaggioso avere a disposizione una vasta gamma di chimiche per la fase stazionaria in un ampia tipologia di formati di colonna Agilent offre oltre 140 colonne ZORBAX Rapid Resolution High Throughput RRHT con particelle da 1 8 um 14 opzioni di selettivit lunghezza da 15 a 150 mm diametri interni di 2 1 3 0 e 4 6 mm Oltre alle colonne ZORBAX sono disponibili le colonne PoroShell con nove opzioni di selettivit per l uso con il sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Ci permette di scegliere la fase stazionaria ottimale in modo da ottenere la massima selettivit La risoluzione la velocit di flusso e il tempo di analisi possono essere ottimizzati selezionando la colonna di diametro
118. one ottimale dello strumento per l alta risoluzione Comparto colonne Il comparto colonne pu essere utilizzato nella versione standard per colonne di diametro interno pari a 4 6 mm A velocit di flusso superiori a 2 mL min e temperature superiori a 60 C l effluente dalla colonna deve essere raffred dato alla temperatura del rivelatore utilizzando il dispositivo di raffredda mento riscaldamento da 1 5 uL nel comparto colonne Ci consente di ridurre al minimo il rumore con i rivelatori UV anche a velocit di flusso di 5 mL min e temperature di 80 C vedere Figura 18 pagina 59 Con raffreddamento post colonna Rumore punto a punto 0 8289 mAU S N per il picco 4 482 Senza raffreddamento post colonna Rumore punto a punto 1 5905 MAU Raffreddamento S N per il picco 4 392 necessario gt 2 mL min 0 2 0 4 0 6 0 8 1 min Figura 18 Influenza del raffreddamento post colonna PCC sul rumore della linea di base Se si utilizzano colonne di diametro interno pari a 2 1 mm a basse velocit di flusso necessario impiegare il dispositivo di riscaldamento piccolo per ridurre al minimo il volume extra colonna Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 59 3 60 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Volume extra colonna Per preservare l alta risoluzione ottenuta con la colonna il volume extra colonna in particolare a valle della colonna d
119. oni di acidi organici acido acetico formico e cos via in solventi organici Ad esempio una soluzione di acido acetico 1 in metanolo in grado d intaccare l acciaio e Soluzioni che contengono agenti complessanti forti ad esempio EDTA acido etilendiamminotetracetico e Miscele di tetracloruro di carbonio con 2 propanolo o THF Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 111 112 Appendice Carbonio simile al diamante DLC Il carbonio simile al diamante inerte nei confronti di quasi tutti gli acidi le basi e i solventi di uso comune Non sono note incompatibilit documentate per le applicazioni HPLC Silice fusa e quarzo Si0 La silice fusa utilizzata nei capillari e nelle celle di flusso 1290 Infinity Il quarzo utilizzato nelle finestre delle celle di flusso tradizionali inerte nei confronti di tutti i solventi e acidi comuni fatta eccezione per l acido fluori drico e i solventi acidi contenenti fluoruri soggetto a corrosione da parte di basi forti e non deve essere utilizzato a pH superiore a 12 a temperatura ambiente La corrosione delle finestre delle celle di flusso pu incidere negati vamente sui risultati delle misure Se il pH superiore a 12 si consiglia di uti lizzare celle di flusso con finestre in zaffiro Oro L oro inerte nei confronti di tutti gli acidi le basi e i solventi HPLC di uso comune nell intervallo di pH specificato Pu essere corroso da c
120. ormale In alternativa a volte viene selezionata l opzione Postrun per eseguire il bilanciamento al termine dell analisi una volta trascorso il tempo post analisi Ad esempio se il segnale mostra sem pre una deriva negativa e l utente preferisce che l analisi termini ad assor banza zero allora questa opzione consente di impostare il livello zero corretto per l analisi successiva Questa opzione non modifica retrospettiva mente l analisi al termine della quale ha eseguito il bilanciamento e Advanced Lamps on required for acquisition il rivelatore DAD 1260 Infinity dotato di una lampada UV che deve essere accesa per l analisi pertanto questa casella deve essere selezionata 132 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Scheda Instrument Curves setup Method HiPALS Q HiP ALS Injector Program amp 4 BinPump ag TCC 7 DAD X Instrument Curves BinPump v Pressure bar lt Flow ml min K Solvent Ratio A lt Solvent Ratio B TEC Left Temperature C _ Right Temperature C DAD Board Temperature C _ Optical Unit Temperature C C UV Lamp Anode Voltage V C Show timetable graph OK Apply Cancel Help Figura 30 Schermata Imposta metodo Scheda delle curve relative allo strumento Spuntando l apposita casella la scheda delle curve relative allo strumento
121. ossibile impo stare un tempo finale del rivelatore diverso dal tempo finale della pompa se necessario interrompere l analisi dei dati prima della fine dell analisi defi nita nella pompa Ci pu verificarsi nel caso in cui al termine del gradiente stata impostata una rampa di equilibrazione del gradiente Per esempio B pu aumentare fino a 95 a 10 min e si prevede che tutti i picchi siano stati eluiti dalla colonna L analisi praticamente completata ma si aggiunge un segmento extra di gradiente per riportare B al valore iniziale nell arco di due minuti per iniziare gradualmente la riequilibrazione della colonna Durante questa rampa discendente non si prevedono dati e per tanto il tempo finale del rivelatore impostato su 10 min e la raccolta dei dati si interrompe mentre il tempo finale della pompa pari a 12 min per consentire il completamento della rampa discendente Si tratta di una scelta personale dell utente e in alcuni casi pur sapendo che i minuti finali del cromatogramma non contengono informazioni utili li si registra comun que per evitare l inconveniente che il tempo finale del rivelatore sia diverso da quello della pompa Il tempo finale del rivelatore non ha la priorit rispetto a quello della pompa e non determina l interruzione dell analisi come invece accadrebbe nel caso di un tempo finale anticipato in un qual siasi altro modulo ne risulta pertanto la praticit di impostare il tempo finale su As Pump In
122. otto 7 Caratteristiche del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 8 Componenti del sistema 10 Specifiche 22 Introduzione 27 Teoria dell impiego di particelle pi piccole nella cromatografia liquida 28 Vantaggi delle colonne con particelle di dimensioni ridotte 34 Riscaldamento per attrito 37 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 39 Configurazione del volume di ritardo ottimale 40 Come ottenere volumi di iniezione maggiori 47 Come ridurre i tempi di ciclo 49 Come ridurre al minimo l effetto memoria 53 Come ottenere una maggiore risoluzione 55 Come ottenere una maggiore sensibilit 63 Come prevenire ostruzioni della colonna 68 Configurazione e installazione del sistema 71 Installazione del software 72 Installazione dei moduli 74 Guida introduttiva 85 Informazioni sulla guida introduttiva 86 Preparazione del sistema 87 Acquisizione dei dati nella schermata del metodo e controllo analisi 92 Analisi dei dati 100 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sommario 6 Appendice 105 Informazioni per la sicurezza 106 Informazioni sui solventi 109 Agilent Technologies su Internet 114 Impostazione di un metodo con la funzione di modifica di tutto il metodo 115 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sommario 6 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del s
123. prima analisi di separazione configurazione per volume di ritardo basso Modulo Parametro Impostazione Pompa Solvente A Acqua Solvente B Acetonitrile Velocit di flusso 0 75 mL min Composizione del 40 A 60 B solvente Tempo finale 1 2 min 1 min tempo post analisi Autocampionatore Iniezione 1yL Comparto colonne Colonna Colonna SB C18 4 6 x 50 mm 1 8 um 600 bar 827975 902 Temperatura 40 C Rivelatore Segnale Lunghezza d onda 250 nm larghezza di banda 4nm Lunghezza d onda di riferimento 360 nm larghezza di banda di riferimento 100 nm Specifiche della verifica e nel cromatogramma sono visibili quattro picchi Intensity Test superato Wavelength Calibrationt1 nm 94 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Guida introduttiva 5 Preparazione della verifica 1 Riempire la bottiglia di solvente A con acqua di grado HPLC Riempire la bottiglia di solvente B con acetonitrile di grado HPLC 2 Se installato spurgare ogni canale del degassatore in linea utilizzando la siringa in dotazione 3 Aprire la valvola di spurgo della pompa e spurgare ogni canale a 5 mL min Questa operazione dovrebbe essere sufficiente per rimuovere l aria dal sistema 4 Installare la colonna in dotazione nel comparto colonne 5 Lavare la cella di flusso con acqua di grado HPLC per 5 min 6 Eseguire un test di calibrazione della lunghezza d onda e un test dell inten sit se pertinenti 7
124. produrre il rapporto i dati possono essere controllati visivamente in un momento successivo nella visualizzazione Data Analysis Per collegare un programma macro a uno dei punti di accesso va spuntata la casella pertinente e il nome della macro va digitato nella casella di testo a destra Il software cerca la macro nella directory C Chem32 Core se salvata altrove inserire il percorso Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 141 142 Appendice I punti di accesso nel flusso di lavoro del metodo sono i seguenti Pre Run Command Macro Customized Data Analysis Macro Post Run Command Macro Save Method with Data salva una copia del metodo nel file dei dati e le assegna il nome RUN M Questa operazione non necessaria se ChemStation viene atti vata nella configurazione consueta perch il software salva sempre il metodo nel file dei dati tutte le versioni a partire dalla B 02 01 Questa opzione risulta rilevante sono se ChemStation stata configurata in modo che la fun zione Unique Sequence Folder Creation sia disattivata e quindi i metodi non ven gono copiati di routine nel file dei dati Poich questa la schermata finale del processo facendo clic su 0K si uscir dal Run Time Checklist e dal processo Edit Entire Method Il metodo ora deve essere salvato nella directory dei metodi principali che per impostazione pre definita C Chem32 1 Methods usandoFile gt Save As gt Metho
125. purgo 5 Pompare per circa 10 minuti prima di avviare l applicazione 82 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Quando Parti richieste Preparazioni AVVERTENZA Configurazione e installazione del sistema 4 Sostituzione dei solventi Quando necessario sostituire il solvente di un canale con un altro solvente non compatibile i solventi sono immiscibili o uno dei due contiene un tampone necessario attenersi alla procedura seguente per evitare che la pompa si ostruisca a causa della precipitazione di sale o che liquido residuo goccioli su parti del sistema Quantit Codice Descrizione 1 Spurgo dei solventi vedere Tabella 8 pagina 84 1 5022 2184 Raccordo ZDV Rimuovere la colonna e sostituirla con un raccordo ZDV Preparare le bottiglie con solventi intermedi appropriati vedere Tabella 8 pagina 84 Se il canale non riempito di tampone andare al passo 4 Inserire il filtro di immissione del solvente in una bottiglia di acqua Irrigare il canale con una velocit di flusso idonea al tubo installato nor malmente 3 5 mL min per 10 min 4 Modificare il circuito idraulico del sistema in base ai requisiti della speci fica applicazione Il sale del tampone contenuto in soluzioni tampone acquose pu precipitare nell isopropanolo residuo Di conseguenza potrebbe verificarsi l ostruzione di capillari e filtri gt Prima di procedere all introduzione di solvente organico irrigare
126. radiente necessario immettere solo il valore B in quanto A si aggiorna al valore pari a 100 meno B quando si sposta il cursore Nella separazione di esempio impo stare A sull acqua e B sull acetonitrile al 60 A sar pari a 40 Timetable indica in dettaglio le modifiche che devono essere apportate durante l analisi alle composizioni percentuali di A e B nella fase mobile o se necessario alla velocit di flusso e la pressione massima consentita La tabella di programmazione apporta variazioni lineari ai parametri tra i valori di regolazione definiti Le impostazioni specificate altrove in questa schermata fungono da condizioni iniziali e cambiano solo se si modifica uno dei valori della tabella di programmazione Ad esempio se durante l analisi il flusso costante non sussiste la necessit di immettere un valore relativo al flusso nella tabella di programmazione Per immettere un valore nella tabella di programmazione fare clic sul pulsante Add per aggiungere una riga alla tabella inserire il tempo del valore di regolazione selezionare la voce da modificare dall elenco a discesa composizione flusso pressione e fare clic sulla casella Parameter per aprire la casella in cui immettere il valore Se l inserimento dei valori nella tabella di programmazione viene effettato senza seguire una sequenza logica i valori immessi vengono riordi nati automaticamente in ordine temporale Le righe della tabella di pro grammazione possono es
127. ramenti per quanto riguarda Ampiezza del picco 30 Risoluzione 30 Capacit del picco 40 Efficienza apparente della colonna 70 Condizioni cromatografiche Come ricordato in precedenza le condizioni cromatografiche dipendono dai composti da analizzare Anche in questo caso tuttavia possibile tenere pre sente alcune regole empiriche Utilizzare velocit di flusso moderate tenere presente tuttavia che alcuni esperimenti recenti hanno dimostrato che anche velocit di flusso elevate possono risultare vantaggiose ai fini del miglioramento della separazione Per colonne di diametro interno pari a 4 6 mm impaccate con particelle di dimensioni inferiori a 2 micron si raccomanda di utilizzare una velocit di flusso iniziale pari a 2 mL min Per colonne di diametro interno pari a 2 1 mm con particelle di dimensioni inferiori a 2 micron una velocit di flusso di 0 4 mL min un buon punto di partenza Utilizzare gradienti moderati per esempio una variazione di gradiente pari a2 5 al minuto La temperatura della colonna un altro parametro ottimizzabile La tempe ratura pu incidere sulla separazione ed un fattore da non trascurare Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Come ottenere una maggiore sensibilit La sensibilit di una separazione correlata alla fase mobile e alla fase stazio naria sce
128. re UV deve essere selezionata in maniera opportuna La selezione di una velocit di campiona mento troppo bassa comporta l aumento dell ampiezza dei picchi e una minore risoluzione vedere Figura 19 pagina 61 Ampiezza del picco 0 30 sec J I AA JU E raven J SA nn a J C i _ Ampiezza del picco 0 33 sec Ju ne 7 Ampiezza del picco 0 42 sec We I N A fre I L 20 Hz Ampiezza del picco 0 67 sec IA ii Ampiezza del picco 1 24 sec a eoe h x She o 0 04 0 5 min Figura 19 Ampiezza del picco in funzione della velocit di campionamento UV In Tabella 6 pagina 62 mostrata la dipendenza dalla velocit di campiona mento dell ampiezza del picco della risoluzione e della capacit del picco Per analisi LC rapide e ultra rapide sono necessarie velocit di campionamento elevate in caso contrario la separazione ottenuta con la colonna viene per duta nel rivelatore Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 61 3 62 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Tabella 6 Relazione tra velocit di campionamento e prestazioni cromatografiche Velocit di campionamento Ampiezza del picco Risoluzione Capacit del picco 80 Hz 0 300 2 25 60 40 Hz 0 329 2 05 55 20 Hz 0 416 1 71 45 10 Hz 0 666 1 17 29 5 Hz 1 236 0 67 16 80 Hz velocit di campionamento confrontati con 20 Hz evidenziano miglio
129. sempio le celle di flusso i materiali delle valvole e cos via nonch le raccomandazioni riportate nelle sezioni seguenti Informazioni sui materiali I materiali nel circuito idraulico sono selezionati accuratamente sulla base dell esperienza ultradecennale di Agilent nello sviluppo di strumenti della massima qualit per le analisi HPLC Tali materiali vantano un eccellente robustezza in presenza delle condizioni HPLC tipiche Qualora si operi in pre senza di condizioni speciali consultare la sezione relativa alle informazioni sui materiali o rivolgersi ad Agilent Esclusione di responsabilit I dati successivi sono stati raccolti da risorse esterne e devono essere intesi come riferimento Agilent non garantisce la correttezza e la completezza di tali informazioni I dati sono basati sulle librerie di compatibilit che non sono specifiche per la stima della durata utile a lungo termine in presenza di condi zioni specifiche ma estremamente variabili di solventi miscele di solventi campioni e sistemi UHPLC Inoltre le informazioni non possono essere gene ralizzate a causa degli effetti catalitici di impurit quali ioni metallici agenti complessanti ossigeno e cos via Oltre alla pura corrosione chimica neces sario tenere in considerazione altri effetti quali elettro corrosione formazione di cariche elettrostatiche in particolare nel caso dei solventi organici non con duttori rigonfiamento delle parti in materiale polim
130. sere modificate direttamente e per aggiungerne o rimuoverne altre si possono utilizzare i pulsanti Cut Paste e Remove Per creare un profilo di gradiente si possono aggiungere pi righe per ottenere una serie di segmenti a gradiente lineare Per impostare un gradiente sem plice se sono presenti valori nella tabella di programmazione questi vanno prima cancellati utilizzando il pulsante Clear all quindi aggiungere una riga e immettere il tempo e la composizione del solvente necessari Se necessa Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 rio un gradiente a gradini questo pu essere creato inserendo due valori per le impostazioni prima del gradino e dopo il gradino separati da 0 01 min Questa procedura viene spesso utilizzata per eluire rapidamente da una colonna picchi a forte ritenzione in prossimit della fine di un ana lisi aumentando la percentuale di solvente pi forte e o la velocit di flusso in un gradiente a gradini ad esempio aumentando la di B da 75 a 95 Non necessario inserire nella tabella di programmazione le impostazioni per il tempo 0 00 min in quanto questi valori vengono ricavati da altri valori di regolazione presenti in questa schermata Alcuni utenti tuttavia deside rano visualizzare un elenco completo nella tabella di programmazione e quindi inseriscono un valore per 0 00 min Ci non costituisce un problema tuttavia ogni volta che le condizioni iniziali
131. si durante il quale non pu essere eseguita l iniezione successiva Consente di attendere il tempo necessario per l equilibrazione del sistema dopo un analisi in gradiente Per un metodo isocratico pu essere impostato su Off Per un metodo a gradiente il valore pu essere determinato speri mentalmente osservando il comportamento della linea di base ma in genere sar pari alla somma tra il tempo del volume di ritardo del sistema e almeno l equivalente di tre cinque volumi di colonna da far fluire attraverso il sistema Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 125 126 Appendice Pressure Limits questo parametro controlla il comportamento della pompa in termini di pressione La pompa binaria 1260 Infinity compatibile con una pressione massima di 600 bar ma alcune colonne possono tollerare solo pressioni inferiori e impostando qui questo valore si protegge la colonna La pompa genera una condizione di errore se si supera questo valore di pressione Qualsiasi analisi in corso viene arrestata e la pompa viene impostata nella modalit di attesa senza flusso Le informazioni sulla pressione massima di una particolare colonna sono fornite insieme alla colonna Le colonne Agilent ZORBAX RRHT sono adatte per operare a 600 bar Il limite di bassa pressione disattivato quando il valore impo stato zero ma se impostato un qualsiasi altro valore la pompa genera un errore nel caso in cui durante il funzioname
132. sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Come ridurre al minimo l effetto memoria L effetto memoria si verifica quando picchi residui derivanti da un iniezione precedente di campione compaiono in un iniezione successiva di bianco L effetto memoria tra iniezioni successive di campioni pu generare risultati errati Il livello dell effetto memoria espresso come rapporto percentuale tra l area del picco nella soluzione del bianco e l area nell iniezione di campione precedente L autocampionatore Agilent 1260 Infinity ottimizzato per ridurre al minimo l effetto memoria grazie all attenta progettazione del cir cuito idraulico e all utilizzo di materiali caratterizzati da un assorbimento minimo del campione Dovrebbe essere possibile ottenere un valore di effetto memoria pari a 0 002 anche nel caso in cui si utilizzi come rivelatore uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo Le impostazioni operative dell autocampionatore consentono all utente di impostare i parametri oppor tuni per ridurre al minimo l effetto memoria per le applicazioni che interes sano composti in grado di permanere nel sistema possibile utilizzare le seguenti funzioni dell autocampionatore per ridurre al minimo l effetto memoria e Lavaggio dell interno dell ago e Lavaggio dell esterno dell ago e Lavaggio in controcorrente della sede dell ago e Pulizia della valvola di iniezione Il circuito idraulico incluso l interno dell ago viene lavato costantemente
133. so protocollo di esplora Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 55 3 56 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity zione In questa sezione viene discusso come incrementare la risoluzione con una qualsiasi combinazione scelta di fase stazionaria e fase mobile Se per sce gliere le fasi si fatto ricorso a un sistema automatico di sviluppo di metodi probabile che siano state utilizzate colonne corte per eseguire analisi rapide in ciascuna fase dell esplorazione In base all equazione della risoluzione il secondo termine pi significativo rappresentato dai piatti teorici o efficienza N un fattore che pu essere otti mizzato in vari modi N inversamente proporzionale alle dimensioni delle particelle e direttamente proporzionale alla lunghezza della colonna pertanto utilizzando particelle pi piccole e una colonna di maggiore lunghezza i piatti teorici aumentano La pressione aumenta con l inverso del quadrato delle dimensioni delle particelle e proporzionalmente alla lunghezza della colonna La risoluzione aumenta con la radice quadrata di N e pertanto se si raddop pia la lunghezza della colonna la risoluzione aumenta di un fattore pari a 1 4 Ci che possibile ottenere dipende dalla viscosit della fase mobile che direttamente correlata alla pressione Le miscele di metanolo generano una contropressione superiore rispetto alle miscele di acetonitrile Spesso si pre
134. sovrapposta Enhanced Solvent Compressibility Compressibilit migliorata del solvente Equilibration time Tempo di equilibrazione Every 2nd Spectrum Ogni 2 spettri F File Setting Impostazione file Flow Flusso Flush Port Porta di lavaggio Height Reject Scarto altezza HiP ALS Injector Program programma dell iniettore di HiP ALS pan itial Events For All Signals Eventi iniziali per tutti i segnali jection Mode Modalit di iniezione bn jection Valve Cleaning Pulizia della valvola di iniezione njection volume Volume di iniezione njection with needle wash Iniezione con lavaggio dell ago njector Cleaning Pulizia dell iniettore nstrument Strumento nstrument Curves Curve relative allo strumento nstrument Acquisition Strumento Acquisizione nstruments Strumenti Integrate Integra ntegration Integrazione ntegration Events Eventi di integrazione ntegration OFF ON Integrazione ATTIVA DISATTIVA ntensity Test Test dell intensit L Launch online Lancia in linea Load Method Carica metodo Location Posizione M Method Metodo Method and Run Control Metodo e controllo analisi Method History Cronologia del metodo Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema ethod Information Informazioni sul metodo ethod Menu Menu del Metodo ethod Metodo ethods Metodi ode Modalit Name Pattern Nome pattern Needle Wash Lavaggio
135. ssono essere dannosi per la salute gt Rispettare le procedure di sicurezza appropriate indossare gli occhiali protettivi i guanti e gli abiti antinfortunistici come descritto nelle schede sulla sicurezza dei materiali fornite dal fornitore di solventi specialmente in caso di utilizzo di sostanze tossiche o pericolose 80 Per spurgare automaticamente la pompa possibile utilizzare lo strumento di spurgo di Lab Advisor Se la pompa non in grado di prelevare il solvente dalle bottiglie utilizzare una siringa per far fluire manualmente il solvente attraverso i tubi e il degassatore Quando si esegue l adescamento del degassatore sottovuoto con una siringa il solvente viene aspirato molto velocemente attraverso i tubi del degassatore Pertanto il solvente all uscita del degassatore non sar completamente degassificato Pompare per circa 10 minuti alla velocit di flusso desiderata prima di avviare un analisi In questo modo il degassatore sottovuoto sar in grado di degassificare adeguatamente il solvente contenuto nei tubi Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Configurazione e installazione del sistema 4 Aprire la valvola di spurgo della pompa Impostare la velocit di flusso su 5 mL min Selezionare il canale A1 Attivare il flusso GC A OO N Verificare che il solvente nel tubo del canale A1 avanzi verso la pompa In caso contrario scollegare il tubo del solvente dalla valvola d
136. strumenti che facilitano la configurazione la calibrazione e la manuten zione dello strumento oltre a test e routine diagnostiche per verificare la correttezza delle prestazioni Agilent Lab Advisor fornisce anche avvisi e solu zioni per tutti gli errori strumentali che potrebbero insorgere Il software fun ziona con o senza i sistemi di dati Agilent Il software monitora Lo stato del modulo LC e Gli avvisi di manutenzione preventiva per verificare la necessit di aggior namento o sostituzione Inoltre il software Rende automatici test utili e Tenta di identificare gli strumenti a interfaccia LAN supportati che sono accesi e collegati al PC dell utente o alla rete del laboratorio e Suggerisce automaticamente le parti da sostituire e le attivit di risoluzione dei problemi per alcuni problemi strumentali pi frequenti Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 73 4 Configurazione e installazione del sistema Installazione dei moduli Installazione dei moduli del sistema Per dettagli sulle procedure di installazione per i moduli fare riferimento ai manuali dei singoli moduli Questi manuali contengono anche informazioni su specifiche manutenzioni e parti Integrazione in rete Per l integrazione in rete del proprio sistema fare riferimento ai manuali per l utente dei rispettivi moduli capitolo Configurazione LAN 74 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema
137. t 01080 68704 sulla colonna ordinata e fornita con il sistema in uso Campione di verifica isocratica Agilent 01080 68704 contiene i seguenti com ponenti dissolti in metanolo dimetilftalato dietilftalato e bifenile o terfenile I parametri del metodo per la separazione di questa miscela di prova sono rie pilogati in Tabella 9 pagina 93 per la configurazione per volume di ritardo standard e in Tabella 10 pagina 94 per la configurazione per volume di ritardo basso Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Guida introduttiva 5 Tabella 9 Parametri del metodo per la prima analisi di separazione configurazione per volume di ritardo standard Modulo Parametro Impostazione Pompa Solvente A Acqua Solvente B Acetonitrile Velocit di flusso 4 0 mL min Composizione del 40 A 60 B solvente Tempo finale 1 min 1 min tempo post analisi Autocampionatore Iniezione 1yL Comparto colonne Colonna Colonna Eclipse Plus C18 4 6 x 100 mm 3 5 um 959961 902 Colonna Poroshell 120 EC C18 3 0 x 50 mm 2 7 um 699975 302 Colonna Poroshell 120 EC C18 4 6 x 50 mm 2 7 um 699975 902 Temperatura 40 C Rivelatore Segnale A Lunghezza d onda 250 nm larghezza di banda 4 nm Lunghezza d onda di riferimento 360 nm larghezza di banda di riferimento 100 nm Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 93 5 Guida introduttiva Tabella 10 Parametri del metodo per la
138. ta della valvola dotata di un kit completo contenente tutti i capillari necessari scambiatori di calore a bassa dispersione aggiuntivi e altre parti Le valvole di commutazione sono caratterizzate da un eccezionale semplicit d uso e flessibilit per effettuare i collegamenti alla valvola Una volta pre muta l unit di azionamento della valvola Quick Change scorre in avanti per semplificare l accesso vedere Figura 4 pagina 18 a sinistra A seconda dell applicazione l utente pu installare teste delle valvole alternative sul mec canismo di azionamento vedere Figura 4 pagina 18 a destra Si noti il tag RFID sulla parte superiore della testa della valvola 1 Tutte le specifiche sono valide per l acqua distillata alla temperatura ambiente di 25 C valore di regolazione pari a 40 C e velocit di flusso compresa tra 0 2 e 5 mL min Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 17 1 18 Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto Componenti del sistema N Figura4 Valvola a sostituzione rapida nel TCC possibile disporre in cluster fino a tre moduli TCC per eseguire applica zioni avanzate quali la commutazione tra otto colonne per lo sviluppo automa tico di metodi o per rendere disponibili colonne aggiuntive per varie applicazioni Pertanto la colonna da utilizzare diviene un semplice parametro del metodo Ci richiede due teste di valvola a 8 posizioni
139. ted peaks Do not report F r Signal options Destination File setting Printer File prefix Report Screen File Unique PDF file name Cancel Help Figura 33 Schermata Specifica rapporto Per impostare un semplice rapporto riportante l area percentuale mediante la funzione di Stesura classica di rapporti che stampa su stampante e su un file PDF immettere le seguenti impostazioni nelle sezioni elencate di seguito della schermata Specifica rapporto Sulla scheda Reporting settings e Report mode utilizza la stesura classica dei rapporti Style Report Style breve 138 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Appendice 6 Quantitative results sorted by segnale Add Chromatogram Output verificato e Chromatogram Output verticale Size Asse del Time 100 della pagina Asse della Response 40 della pagina Destination Printer verificata Screen non verificata File verificato File Setting PDF verificato Unique PDF file name verificato Sulla scheda Quantitation settings e Calculation mode Calculate percentuale Based on area Fare clic su OK per uscire e si aprir la schermata successiva del processo di Modifica tutto il metodo Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 139 6 Appendice Impostazione di un metodo con la funzione di modifica d
140. termici e consente di ottenere un integrazione pi affidabile delle aree dei picchi Specchio Reticolo Guida d onda optofluidica Lampada al deuterio Cella a cartuccia Max Light Fenditura Serie di diodi a 1024 elementi Figura 5 Cammino ottico attraverso il rivelatore DAD Il modulo integra anche il controllo elettronico della temperatura per incre mentare ulteriormente la resistenza agli effetti della temperatura ambiente Sebbene il volume idraulico della cella a cartuccia Max Light sia molto ridotto il cammino ottico ha il valore standard pari a 10 mm Tuttavia per sensibilit ancora superiori disponibile in alternativa la cella ad alta sensibilit Max Light Agilent che presenta un cammino ottico di 60 mm Le celle si sosti tuiscono facilmente inserendole o estraendole dal relativo alloggiamento e vengono allineate automaticamente nel banco ottico La sorgente luminosa del rivelatore DAD una lampada al deuterio che opera su un intervallo di lun ghezze d onda da 190 a 640 nm La rivelazione avviene tramite una serie di Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 19 1 20 Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto 1024 diodi L ingresso allo spettrografo costituito da una fenditura ottica fissa di 4nm I segnali cromatografici vengono estratti dai dati generati dalla serie di diodi tramite il firmware del modulo possibile definire fino a otto singoli segnali
141. to del volume di iniezione comporta un allargamento della banda dell analita lungo la colonna prima del gradiente causando la dispersione dei picchi e perdita di risoluzione Probabilmente il fattore principale di cui tenere conto nella determinazione del volume di iniezione il diametro della colonna in quanto incide in misura Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 47 3 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity notevole sulla dispersione dei picchi Le altezze dei picchi possono essere mag giori su una colonna stretta rispetto al caso di un iniezione pi grande su una colonna pi larga poich la dispersione dei picchi minore Nel caso delle colonne di diametro interno pari a 2 1 mm i volumi di iniezione tipici massimi possono essere compresi tra 5 e 10 ul ci tuttavia dipende molto dalla natura chimica dell analita e della fase mobile come discusso in precedenza Nel caso di una separazione in gradiente si possono ottenere volumi di iniezione pari a circa 5 del volume della colonna mantenendo al tempo stesso buone caratte ristiche di risoluzione e dispersione dei picchi 48 Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity 3 Come ridurre i tempi di ciclo possibile ridurre i tempi di ciclo scegliendo una colonna corta dotata di buona selettivit Le dimensioni della colonna dipendono anche da
142. tocampionatore a TCC Capillare ST 0 17 mm x 380 nm S S Da autocampionatore raffreddato a TCC Capillare ST 0 17 x 90 mm S S Da TCC a colonna Capillare ST 0 17 mm x 380 mm S S Da colonna a rivelatore DAD Tubo in PTFE 0 8 mm x 2 m riordinazione 5 m Da rivelatore DAD a scarico Kit di accessori di scarico Da rivelatore VWD a scarico Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 4 77 4 Configurazione e installazione del sistema Installazione dei moduli Comparto solventi Degassatore Pompa Autocampionatore Termostato Comparto colonne termostatato Rivelatore DAD 78 Collegamenti per la configurazione per volume di ritardo medio e basso In Figura 22 pagina 78 sono mostrati i capillari e tubi di collegamento nel cir cuito idraulico per le configurazioni per volume di ritardo medio e basso del sistema LC binario 1260 Infinity Figura 22 Capillari e tubi di collegamento nel circuito idraulico configurazioni per volume di ritardo medio e basso Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Parte Codice 1 G1312 87303 1 G1312 87304 2 G1313 87304 2 01090 87610 3 G1316 80002 3 G1316 80003 4 01090 87611 5 G1315 87312 6 5062 2462 Configurazione e installazione del sistema 4 Descrizione Capillare ST 0 17 mm x 400 mm S S Da pompa ad autocampionatore Capillare ST 0 17 mm x 700 mm S S Da pompa ad autocampionatore raffreddato
143. ttoposte Non tentare riparazioni o modifiche interne se non presente un altra persona in grado di prestare soccorso e ria nimazione Non sostituire parti con il cavo di alimentazione collegato Non usare lo strumento in presenza di gas infiammabili o fumi L uso dello strumento al pari di altre apparecchiature elettriche in queste condizioni pu compromettere la sicurezza Non installare parti di ricambio e non effettuare modifiche non autorizzate I condensatori all interno dello strumento possono essere ancora carichi anche se lo strumento non collegato alla presa di corrente Questo strumento utilizza tensioni pericolose in grado di provocare gravi lesioni alle persone Usare collaudare e riparare lo strumento con la massima cautela Quando si utilizzano solventi si devono osservare le procedure di sicurezza appropriate ad esempio occhiali protettivi guanti di sicurezza e indumenti di protezione come descritto nella scheda sull uso e sulla sicurezza dei materiali del produttore dei solventi in particolare quando si utilizzano solventi tossici o pericolosi Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 107 6 Appendice Simboli di sicurezza Tabella 11 Simboli di sicurezza Simbolo Descrizione Se l apparecchiatura contrassegnata da questo simbolo l utente tenuto a consultare il manuale d uso al fine di evitare il pericolo di lesioni all operatore e danni all apparecchiatura Ind
144. ttrica dei moduli LC premendo il pulsante sul lato inferiore sinistro di tutti i moduli Al centro del pulsante sar visibile la luce verde di accensione 3 Aprire il software di controllo sul computer facendo clic sull icona se confi gurato In alternativa possibile selezionare Start gt All Programs gt Agilent Technologies gt OpenLAB gt OpenLAB Control Panel Selezionare lo strumento di interesse nel pannello di navigazione alla voce Instrumentse fare clic suLaunch online Il software ChemStation si apre con la schermata Method and Run Control Ini zialmente i moduli sono in modalit di pausa In attesa e nello stato Non pronto ad eccezione dell autocampionatore che viene inizializzato imme diatamente e commutato nello stato Pronto 4 Per accendere ogni modulo singolarmente fare clic con il pulsante destro del mouse sulla rispettiva icona e selezionare Switch module name on dal menu contestuale In alternativa si possono accendere tutti i moduli del sistema simultanea mente facendo clic sul pulsante System On Off situato in basso a destra del diagramma del sistema Lo stato del sistema cambia da Non pronto indica zione gialla a Pronto indicazione verde dopo un breve ritardo in attesa di ottenere i valori di regolazione Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 87 5 Guida introduttiva Caricamento del metodo predefinito Il software ChemStation comprende un metodo predefinito c
145. u essere corroso da basi forti per esempio soluzioni di idrossidi gt 10 dietilammina Non consigliato per l uso con l acido fluoridrico e i fluo ruri Acciaio inossidabile SST L acciaio inossidabile inerte nei confronti di molti solventi comuni In pre senza di acidi e basi stabile nell intervallo di pH compreso tra 1 e 12 5 Pu essere corroso da acidi con pH inferiore a 2 3 Inoltre pu essere soggetto a corrosione nei seguenti solventi e Soluzioni di alogenuri di metalli alcalini e relativi acidi ad esempio ioduro di litio cloruro di potassio e cos via e soluzioni acquose di alogeni e Concentrazioni elevate di acidi inorganici quali l acido nitrico e solforico e solventi organici in particolare a temperature pi elevate se il metodo cro matografico lo consente sostituirli con acido fosforico o tampone fosfato meno corrosivi nei confronti dell acciaio inossidabile e Solventi alogenati o miscele che formano radicali e o acidi ad esempio 2 CHCl 09 2 COCls 2 HCI Questa reazione nella quale l acciaio inossidabile probabilmente agisce da catalizzatore avviene rapidamente in presenza di cloroformio anidro se il processo di disidratazione elimina l alcool stabilizzatore Eteri di grado cromatografico che possono contenere perossidi ad esem pio THF diossano diisopropiletere Tali eteri devono essere filtrati attra verso ossido di alluminio anidro che assorbe i perossidi e Soluzi
146. unzione di modifica di tutto il metodo 115 Informazioni sul metodo 117 Strumento Acquisizione 118 Analisi dei dati 134 Lista di controllo del tempo di analisi 141 Nel presente capitolo vengono fornite ulteriori informazioni di natura legale sulla sicurezza e sulle risorse disponibili sul Web oltre che sull impostazione di un metodo Fg Agilent Technologies 105 6 Appendice Informazioni per la sicurezza Informazioni generali sulla sicurezza Le seguenti precauzioni generali di sicurezza devono essere rispettate durante tutte le fasi di utilizzo manutenzione e riparazione dello strumento Il man cato rispetto di tali precauzioni o di avvertenze specifiche riportate in altri punti del presente manuale implica la violazione degli standard di sicurezza della progettazione della produzione e dell uso previsto dello strumento Agi lent Technologies non riconosce alcuna responsabilit per eventuali danni risultanti dal mancato rispetto delle istruzioni fornite ATTENZIONE Verificare che lo strumento venga utilizzato correttamente La protezione fornita dallo strumento potrebbe risultare insufficiente gt L operatore di questo strumento tenuto a utilizzarlo come specificato nel presente manuale Standard di sicurezza Questo strumento classificato come facente parte della Classe di Sicurezza I provvisto di terminale di messa a terra ed stato prodotto e collaudato secondo gli standard di sicurezza internazionali
147. urazione Que sta configurazione permette di ridurre al minimo il ritardo del gradiente per separazioni in gradiente ultra rapide Per sfruttare al massimo il controllo elettronico dello smorzamento che sostituisce lo smorzamento fisico del volume importante selezionare la rispettiva funzione Enhanced Solvent Com pressibility nella schermata ausiliaria del menu della pompa Per ridurre al minimo la dispersione dei picchi necessario installare il kit a bassa dispersione Kit a bassa dispersione G1316 68744 Il kit include capil lari corti con diametro interno di 0 12 mm e scambiatori di calore a bassa dispersione 1 6 uL e 1 5 uL per il comparto colonne termostatato Per mante nere la risoluzione nel rivelatore UV necessario utilizzare una cella di flusso a basso volume Vedere Scelta della cella di flusso pagina 66 per indicazioni sulla cella di flusso Circuito idraulico Scollegare esclusivamente qui Miscela zione T Sensore di pressione Sensore di pressione Volume di ritardo basso Valvola Ritardo di 120 uL i spurgo Valvola di spurgo Figura 13 Configurazione a basso ritardo per colonne di diametro interno pari a 2 1 mm Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema 43 3 Ottimizzazione del sistema LC binario Agilent 1260 Infinity importante ricordare di impostare il parametro corretto nella schermata ausiliaria della pompa Ci assicura che siano sempre applicati i v
148. utata sulla posi zione di mainpass e convoglia nuovamente il flusso attraverso il loop del cam pione che a questo punto contiene una certa quantit di campione Il flusso di solvente trasferisce il campione nella colonna e la separazione comincia questo l inizio della fase di analisi In questa fase grazie al flusso di solvente i principali componenti hardware che incidono sulle prestazioni sono sottopo sti a lavaggio Nel caso delle applicazioni standard non necessaria alcuna ulteriore procedura di lavaggio Lavaggio dell ago Prima dell iniezione al fine di ridurre l effetto memoria nel caso di analisi estremamente sensibili possibile lavare l esterno dell ago in una porta di lavaggio che situata dietro la porta dell iniettore sull unit di campiona mento Non appena l ago si trova sulla porta di lavaggio una pompa peristal tica eroga solvente per uno specifico intervallo per pulire l esterno dell ago Al termine di questo processo l ago ritorna nella posizione della porta di inie zione Sistema LC binario 1260 Infinity Manuale per l utente del sistema Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity Descrizione del prodotto 1 Comparto colonne termostatato 1290 Infinity G1316C Il comparto colonne termostatato TCC Agilent 1290 Infinity controlla la tem peratura tra 10 C al di sotto della temperatura ambiente e un massimo di 100 C a 2 5 ml min e 80 C fino a 5 ml min rispettivamente La specifica della stabilit

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