ChemStation Agilent para Espectroscopía UV
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1. F Elegir On Encendido en el grupo Stirrer Mezclador para activar el mezclador Cuando el mezclador est encendido se puede definir la velocidad en rpm introduci ndola en el campo Speed Velocidad Enel grupo On line Trace Monitor Monitor de trazas en l nea se puede especificar la escala de absorbancia eje de ordenadas y del monitor de trazas en l nea Elegir Auto Scaling Ajuste autom tico de escala para permitir que ChemStation calcule la escala de absorbancia en funci n de las intensidades de las se ales o bien elegir Fixed Scaling Escala fija para definir una escala de absorbancia fija Si se selecciona Fixed Scaling Escala fija se podr n definir los l mites inferior y superior de la escala de absorbancia introduci ndolos en los campos From De y To A Enel grupo Idle Temperature Temperatura durante tiempo de inactividad se puede editar la temperatura que se define entre experimentos de desnaturalizaci n t rmica En el grupo Ramping Speed Velocidad a rampas se puede seleccionar la velocidad a la que se incrementa la temperatura Elegir Slow Lenta para aumentar la temperatura incrementalmente con cada paso de la rampa de temperatura Elegir Fast R pida para aumentar la temperatura bal sticamente con cada paso de la rampa de temperatura Si los pasos son largos existe el peligro de que la temperatura rebase los l mites en la modalidad Fast R pida e Seleccionar Autosave s2. caso que Agilent y el usuario tengan un acuerdo escrito separado con condiciones de garant a que cubran el material de este documento y que est n en conflicto con estas condi ciones prevalecer n las condiciones de garant a del acuerdo separado Licencias sobre la tecnolog a El hardware y o software descritos en este documento se suministran bajo una licencia y pueden utilizarse o copiarse nicamente de acuerdo con las condiciones de tal licen cia Avisos de seguridad PRECAUCI N Un aviso de PRECAUCI N indica un peligro Llama la atenci n sobre un procedimiento de operaci n una pr ctica o similar que si no se realizan correctamente o no se ponen en pr ctica pueden provocar da os en el producto o p rdida de datos importantes No avance m s all de un aviso de PRECAUCI N hasta que se entien dan y se cumplan completamente las condiciones indicadas ADVERTENCIA Un aviso de ADVERTENCIA indica un peligro Llama la atenci n sobre un procedimiento de opera ci n una pr ctica o similar que si no se realizan correctamente o no se ponen en pr ctica pueden provocar da os personales o la muerte No avance m s all de un aviso de ADVERTENCIA hasta que se entiendan y se cumplan completamente las condiciones indicadas Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent En este manual El software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent a ade la modalidad cin tica y
3. la ventana Trace Traza y la ventana Sample Information Informaci n de la muestra En primer lugar el controlador de temperatura Peltier define la temperatura de inicio en el soporte de la celda Una vez transcurrido el tiempo de retenci n definido en el cuadro de di logo Temperature Ramp Rampa de temperatura se mide el primer espectro y el controlador de temperatura Peltier ajusta la siguiente temperatura de la rampa Durante la medida t rmica se puede observar en tiempo real la adquisici n de los espectros y las trazas de temperatura en la ventana All Spectra Todos los espectros y en la ventana Trace Traza Una vez que la medida t rmica haya finalizado o haya sido interrumpida por el usuario los datos se almacenar n de la manera especificada en el cuadro de di logo Temperature amp Options Temperatura y opciones Las trazas se eval an mediante el procedimiento definido en el cuadro de di logo Calculation Parameters Par metros del c lculo Estos resultados aparecen en la ventana Result Resultado Evaluaci n de los datos de desnaturalizaci n t rmica Una vez que haya finalizado la medida de la desnaturalizaci n t rmica existe la posibilidad de volver a evaluar los datos experimentales Puesto que durante la medida se han adquirido espectros completos se pueden modificar todos los par metros del cuadro de di logo Calculation Parameters Par metros del c lculo Hacer clic en Aceptar para activar los cambio
4. n t rmica 40 Visualizaci n de los resultados 41 Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 9 Contenido ndice 43 6 Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent ChemStation Agilent para Espectroscopia UV Visible Gu a del usuario para software de an lisis bioqu mico 1 Instalaci n y configuraci n Instalaci n del software de an lisis bioqu mico 8 Configuraci n del controlador de temperatura Peltier Agilent 89090A 9 Antes de poder utilizar el software de an lisis bioqu mico es necesario instalarlo y configurar el espectrofot metro En este cap tulo se describen las herramientas y los procedimientos de instalaci n En primer lugar se debe instalar el software de an lisis bioqu mico en la ChemStation Agilent Si se desea utilizar la modalidad de desnaturalizaci n t rmica de la ChemsStation Agilent tambi n ser necesario configurar el controlador de temperatura Peltier Agilent 89090A Esta instalaci n es opcional para la modalidad cin tica EE Agilent Technologies 7 1 Instalaci n y configuraci n Instalaci n del software de an lisis bioqu mico El software de an lisis bioqu mico G1117A es un m dulo opcional e incluye el software de uso general G1115A 1 2 3 Introducir el CD ROM que contiene la ChemStation Agilent Ejecutar setup exe Seleccionar G1115AA UV VIS General Purpose ChemsStation ChemsStation de uso general UV VIS en Available P
5. los componentes de hardware necesarios para llevar a cabo experimentos cin ticos y de desnaturalizaci n t rmica Adem s contiene informaci n sobre las funciones m s importantes del software que ayudan a resolver los problemas anal ticos Agilent Technologies Deutschland GmbH 2002 2003 Impreso en Alemania 10 2003 E Agilent Technologies
6. ventana Results Resultados y la tabla Method Summary Resumen del m todo e Measured Single Spectra Espectro nico medido muestra un espectro medido en la ventana Single Spectra Espectros nicos e Last Blank Spectrum ltimo espectro en blanco muestra la ventana Last Blank Spectrum Ultimo espectro en blanco e Tabulate Selected Spectrum Trace Tabular espectro traza seleccionado muestra la tabla Tabular Data of Spectra Datos tabulares de espectros del espectro seleccionado o la tabla Tabular Data of Time Traces Datos tabulares de trazas de tiempo de la traza de tiempo seleccionada Estas tablas tambi n aparecen autom ticamente cuando se hace doble clic con el bot n izquierdo del rat n en un espectro traza de tiempo en una ventana gr fica o cuando se pulsa la tecla Intro mientras se utiliza el cursor El t tulo de la tabla indica el tipo de espectro por ejemplo Sample Muestra Standard Est ndar con el n mero del espectro traza de tiempo mostrado en la ventana entre corchetes por ejemplo 1 Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 41 3 42 Modalidad de desnaturalizaci n t rmica Logbooks Historiales muestra el cuadro de di logo Logbooks Historiales donde se puede seleccionar un historial para mostrarlo o imprimirlo Load Logbook Cargar historial muestra el cuadro de di logo Load Logbook Cargar historial donde se puede seleccionar un historial almacenado previame
7. ChemsStation Agilent m A para Espectroscopia UV Visible s Gu a del usuario para software de an lisis bioqu mico egege Agilent Technologies Avisos O Agilent Technologies Inc 2002 2003 No se permite la reproducci n de parte alguna de este manual bajo cualquier forma ni por cualquier medio incluyendo su alma cenamiento y recuperaci n electr nicos y la traducci n a idiomas extranjeros sin el con sentimiento previo por escrito de Agilent Technologies Inc seg n lo estipulado por las leyes de derechos de autor estadounidenses e internacionales N mero de referencia del manual 61117 95008 Edici n 10 2003 Impreso en Alemania Agilent Technologies Deutschland GmbH Hewlett Packard Strasse 8 76337 Waldbronn Garantia El material contenido en este docu mento se proporciona tal como es y est sujeto a modificaciones sin pre vio aviso en ediciones futuras Adem s hasta el m ximo permitido por la ley aplicable Agilent rechaza cualquier garant a expresa o impl cita en relaci n con este manual y con cualquier informaci n con tenida en el mismo incluyendo pero no limitado a las garant as implicitas de comercializaci n y adecuaci n a un fin determinado En ning n caso Agilent ser responsable de los errores o de los da os incidentales o consecuentes relacionados con el suministro utilizaci n o uso de este documento o de cualquier infor maci n contenida en el mismo En el
8. Spectrophotometer 8453 GPIB 25 2 Si todav a no se ha configurado un instrumento Agilent 8453 agregar un instrumento nuevo New Instrument de la manera descrita en el Manual del Operador del Sistema de Espectroscop a UV Visible Agilent 8453 3 Seleccionar Instruments Instrumentos en el men Configure Configurar 4 Introducir el nombre del instrumento en Instrument Name elegir el tama o inicial de la ventana en Initial Screen Window Size y hacer clic en Aceptar al Seleccionar TemCo o Elegir una direcci n GPIB 20 Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 9 1 Instalaci n y configuraci n 7 Hacer clic en Add Agregar para aceptar la configuraci n 8 Hacer clic en Aceptar para cerrar el cuadro de di logo Device Configuration Configuraci n de dispositivos 9 Cerrar el editor de configuraci n Configuration Editor 10 Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent ChemStation Agilent para Espectroscopia UV Visible Gu a del usuario para software de an lisis bioqu mico 2 Modalidad cin tica Preparaci n de una medida basada en el tiempo 12 La medida cin tica 24 En este cap tulo se describen las tareas m s importantes de la modalidad cin tica del software de an lisis bioqu mico Puesto que una correcta preparaci n es esencial para realizar una medida cin tica el primer apartado Preparaci n de una medida basada e
9. a flecha hacia abajo y seleccionar el tipo de c lculo en la lista desplegable None Ninguno especifica que no se ha realizado ning n c lculo de velocidad Initial rate Velocidad inicial especifica que se realiza un ajuste cuadr tico de acuerdo con la ecuaci n a bt ct donde b es la constante de la velocidad inicial Zero order Orden cero especifica que se realiza un ajuste lineal de acuerdo con la ecuaci n a bt donde b es la constante de velocidad en UA Ss First order Primer orden especifica que se realiza un ajuste exponencial de acuerdo con la ecuaci n a b exp kt donde k es la constante de velocidad en 1 s Delta AU especifica que la absorbancia inicial se resta de la absorbancia final ADS tcfinal 7 ADStanicial e Se puede especificar que el c lculo de la velocidad se realice a lo largo de un rango temporal limitado Escribir el tiempo de inicio del c lculo en el campo from de y el tiempo de finalizaci n en el campo to a Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 21 2 22 Modalidad cin tica e Seleccionar Multiply Rate Multiplicar velocidad si se desea activar un factor de conversi n para el resultado de la velocidad Especificar el factor y las nuevas unidades en el campo To convert to Rate unit Convertir a unidad de velocidad Seleccionar Subtract Rate of Cell Restar velocidad de celda para restar el resultado de una cel
10. ad de la interfase gr fica de usuario En la Figura 2 se muestra la interfase gr fica de usuario para la modalidad de desnaturalizaci n t rmica del software Agilent ChemStation La modalidad actual aparece en el cuadro desplegable Mode Modalidad en la barra de herramientas La barra de herramientas tambi n incluye el campo del nombre del m todo donde aparece el nombre del m todo anal tico actual y varios botones de m todo abreviado que se describen en la Gu a del usuario del Sistema de Espectroscop a UV Visible Agilent 8453 TE 84h UV Visible System 1 Ultine Dak Fulle Ele Edi Mesrod Meague rommet Yew Mode Cory Hep D Calculation AE NET on H Sanpling Den Abocrbanes arz Della Temperature fran1 5 Cto74 7 T E E Meting Tenge 621087 laca Z 2 60 2 Figura 2 La interfase gr fica de usuario de la modalidad de desnaturalizaci n t rmica El panel anal tico superior incluye un bot n de m todo abreviado que abre el cuadro de di logo Calculation Parameters Par metros del c lculo La barra de estado de color azul muestra el desarrollo de la medida de Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 31 3 32 Modalidad de desnaturalizaci n t rmica desnaturalizaci n t rmica El panel de muestreo contiene un bot n de m todo abreviado que abre el cuadro de di logo Temperature Ramp Rampa de temperatura y muestra la temperatura actual Co
11. ato Inhibidores La concentraci n del primero de dos sustratos en el campo A mg ml este campo s lo aparecer si se ha seleccionado A B en el cuadro de di logo Configure Substrate Inhibitors Configurar sustrato Inhibidores La concentraci n del segundo de dos sustratos en el campo B Gmg mD este campo s lo aparecer si se ha seleccionado A B en el cuadro de di logo Configure Substrate Inhibitors Configurar sustrato Inhibidores Si se ha configurado un sistema de muestreo con mecanismo de transporte multicelda podr elegirse Configure Substrate Inhibitors Configurar sustrato Inhibidores en la ventana Results Resultados para mostrar el cuadro de di logo Configure Substrate Inhibitors Configurar sustrato Inhibidores Permite incluir informaci n de los sustratos y los inhibidores con los resultados Tambi n se puede seleccionar el cuadro de di logo Configure Substrate Inhibitors Configurar sustrato Inhibidores haciendo Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad cin tica 2 clic en el bot n del cuadro de di logo Edit Sample Information Editar informaci n de la muestra El cuadro de di logo Configure Substrate Inhibitors Configurar sustrato Inhibidores contiene los siguientes par metros None Ninguno especifica que no se han incluido sustratos ni inhibidores e S especifica que se ha incluido un sustrato e S I especifica que se ha incluido un sus
12. ca de usuario Si se pulsa la tecla F7 o se selecciona Thermal Measurement Medida t rmica en el men Measure Medir o en la barra lateral de la interfase gr fica de usuario aparecer el cuadro de di logo Sample Information Informaci n de la muestra e Introducir un nombre de muestra en el campo Sample Name Nombre de la muestra El nombre de la muestra se incluye en la tabla y en los informes Introducir un nombre de disolvente en el campo Solvent Disolvente Los detalles del disolvente se incluyen en la tabla Results of Trace Resultados de la traza y en los informes Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 39 3 40 Modalidad de desnaturalizaci n t rmica En el campo Molarity M Molaridad M introducir la molaridad de la muestra en mol l La molaridad se incluye en la tabla Results of Trace Resultados de la traza y en los informes y se utiliza en el c lculo de G C e Introducir la longitud del DNA de la muestra en parejas base pb en el campo DNA Length K Longitud del DNA K La longitud del DNA se incluye en la tabla Results of Trace Resultados de la traza y en los informes y se utiliza en el c lculo de G C e En el campo Comment Comentario se puede introducir un comentario por ejemplo una descripci n de la muestra Pulsar el bot n Run Ejecutar en la ventana Sample Muestra para iniciar la adquisici n y mostrar la ventana All Spectra Todos los espectros
13. con anterioridad al an lisis mostrar el cuadro de di logo Sample Information Informaci n de la muestra antes de iniciar las medidas e Seleccionar Start Run on Trigger Iniciar an lisis en el momento del disparo para iniciar la adquisici n de datos utilizando el cierre de los contactos 13 y 15 de la interfase GPIO De esta manera se asegura que transcurra un tiempo m nimo aproximadamente 0 12 segundo entre la acci n de disparo y el comienzo de la adquisici n de datos tiene como finalidad utilizarse con medidas cin ticas de reacci n r pida e Se puede escribir una descripci n del m todo en el campo Method Information Informaci n del m todo Este campo acepta cualquier car cter alfanum rico y la descripci n puede tener una longitud cualquiera El texto pasa autom ticamente de una l nea a otra Se puede editar una descripci n existente mediante cualquiera de los procedimientos est ndar de tratamiento de textos por ejemplo Copiar Cortar y Pegar Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 23 2 Modalidad cin tica La medida cin tica 24 Realizaci n de una medida basada en el tiempo Las medidas se pueden iniciar utilizando el men Measure Medir de la barra de men s pulsando los botones Blank En blanco Sample Muestra y Time Based Measurement Medida basada en el tiempo de la barra lateral de la interfase gr fica de usuario o utilizando determinadas teclas F Si ha selecci
14. da de referencia de los resultados de la velocidad de todas las dem s celdas Elegir la flecha hacia abajo y seleccionar la celda de referencia en la lista desplegable Esta opci n s lo estar disponible si se ha configurado una medida multicelda En el cuadro de di logo Options Information Opciones e informaci n se pueden definir las condiciones de adquisici n para el experimento cin tico Options and Information FT Move multi cell transport for stirring if possible X Adjust gains separately from Blank measurement FT Straylight correction on Data Path C UAHPCHEMMADATAS xX Autosave spectra to file Prompt for sample information before run l Start Run on Trigger Method Information pa Method of Kinetics Mode 3 Al mover el mecanismo de transporte multicelda si es posible para mezclar su contenido se mover la celda actual a su posici n para mezclar la muestra durante el tiempo de inactividad entre dos ciclos si el tiempo de ciclo es suficientemente largo aproximadamente el tiempo de ciclo m nimo m s 4 segundos por cada celda configurada Esta casilla s lo estar disponible si se selecciona un sistema de transporte multicelda Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad cin tica 2 e Adjust gains separately from blank measurement Ajustar ganancias independientemente de la medida en blanco a ade el comando Set Gains Definir ganancias a
15. dad 22 P poner a cero las celdas 24 Rampa de temperatura 32 40 rango de c lculo 21 35 resultados matem ticos 27 S sistema de muestreo 16 sustrato 26 43 ndice T temperatura sensor externo 35 sensor interno 35 tiempo de inactividad 37 unidades 37 temperatura de fusi n 35 derivada 35 promedio 35 sensibilidad 35 temperatura de inicio 33 40 temperatura final 33 tiempo de ciclo 15 21 23 tiempo de ciclo m nimo 21 tiempo de ejecuci n 20 tiempo de inicio 20 tiempo de integraci n 15 23 tiempo de retenci n 33 U utilizar longitud de onda 19 34 V velocidad a rampas 37 velocidad del mezclador 37 velocidad inicial 21 ventana resultados 25 27 ventana traza de tiempo 25 44 Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent www agilent com En este manual El software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent a ade la modalidad cin tica y la modalidad de desnaturalizaci n t rmica al software de uso general Estas dos modalidades permiten realizar experimentos cin ticos y de desnaturalizaci n t rmica con el espectrofot metro Agilent 8453 Incluye posibilidades para desarrollar m todos anal ticos monitorizaci n en l nea en tiempo real para visualizar la marcha de los experimentos y herramientas para evaluar y procesar los datos experimentales Este manual contiene instrucciones para la instalaci n del software y describe
16. de temperatura En los campos adyacentes introducir una longitud de filtro Filter Length para el c lculo de la derivada y una sensibilidad Sensitivity para presentar los valores de Tm T El valor del campo Filter Length Longitud de filtro define el n mero de datos que se utilizan para calcular cada punto de la traza de la derivada El valor debe ser un n mero impar comprendido entre 5 y 749 el valor por defecto es 21 Al incrementar el n mero de puntos aumenta el grado de suavizado de la traza resultante e S lo se presentan los m ximos y m nimos que sean al menos iguales que el valor del campo Sensitivity Sensibilidad y que sean distintos de sus m ximos o m nimos contiguos Si se deja en blanco este campo la sensibilidad se ajusta a 1 1 000 de la diferencia entre los valores m ximos y m nimos Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 35 3 36 Modalidad de desnaturalizaci n t rmica El grupo Equation Ecuaci n permite definir la ecuaci n para el c lculo de un resultado e Escribir un nombre de par metro para el resultado en el campo situado a la izquierda de la ecuaci n e introducir la ecuaci n en el campo situado a la derecha Utilizar Tm Tf temperatura de fusi n M molaridad de la muestra y K longitud de DNA El grupo Equation for Thermal Expansion Ecuaci n para expansi n t rmica permite realizar una correcci n del cambio de absorbancia debido a la expa
17. do autom ticamente de todos los espectros sucesivos medidos para corregir las diferencias pticas que puedan existir entre las celdas 1 Llenar todas las celdas de medida con el mismo medio en blanco por ejemplo agua 2 Asegurarse de que no haya burbujas ni part culas flotantes en las celdas Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad cin tica 2 3 Realizar una medida en blanco seleccionando Blank En blanco en el men de medida haciendo clic en el bot n Blank En blanco de la barra lateral de la interfase gr fica de usuario o utilizando la tecla F4 4 Iniciar la medida Zero Cells Poner a cero las celdas desde el men Measure Medir Los espectros de las celdas puestas a cero aparecen en la ventana Zero Cells Spectra Espectros de celdas puestas a cero que se puede activar en el men View Ver Asegurarse de no cambiar las celdas despu s de realizar la medida Zero Cell Poner a cero las celdas Para medir un nico espectro de la soluci n contenida en la celda y mostrarlo en la ventana Sample Spectra Espectros de la muestra seleccionar Sample Single Spectrum Muestra Espectro nico en el men Measure Medir Tambi n se puede medir un nico espectro pulsando la tecla F5 o haciendo clic en el bot n Sample Muestra de la barra lateral de la interfase gr fica de usuario Si se pulsa la tecla F7 y se selecciona la medida basada en el tiempo en el men Measure Medir o e
18. e l mparas del panel del instrumento mostrado en la barra lateral de la interfase gr fica de usuario Si se modifican los par metros de las l mparas cambiar n el m todo actual y el estado de las l mparas Si se produce un fallo en una l mpara fallo de encendido defecto de la l mpara o portezuela de las l mparas abierta los par metros de la l mpara o las lamparas podr n aparecer como On encendida aunque la l mpara o las l mparas est n apagadas Comprobar el estado de las l mparas en la ventana Spectrophotometer Status Estado del espectrofot metro o en el panel del instrumento mostrado en la barra lateral de la interfase gr fica de usuario El estado del espectrofot metro se resume en la ventana Spectrophotometer Status Estado del espectrofot metro En esta ventana aparecen los valores siguientes Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 15 2 Modalidad cin tica Tipo de instrumento rango de longitudes de onda intervalo de longitud de onda tiempo de integraci n hora de encendido estado de la l mpara o las l mparas y el estado general del espectrofot metro Agilent 8453 preparado no preparado Configuraci n del sistema de muestreo PRECAUCI N El sistema de muestreo se puede seleccionar y configurar en el men Instrument Instrumento o en el panel del instrumento mostrado en la barra lateral de la interfase gr fica de usuario Al seleccionar Sampling System Sistema de
19. e se extraer n los valores de amplitud para el resultado de la longitud de onda La longitud de onda por defecto es de 480 nm Si se introducen longitudes de onda en las que no hay disponibles datos medidos por ejemplo valores que no sean n meros enteros los valores de amplitud se calcular n mediante una interpolaci n lineal El campo Background Correction Correcci n de fondo permite especificar cualquier correcci n de fondo que se aplique al resultado de la longitud de onda para calcular el resultado de una funci n Elegir la flecha hacia abajo y seleccionar un procedimiento de correcci n de fondo en la lista desplegable Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 19 2 20 Modalidad cin tica none ninguna especifica que el resultado de la longitud de onda se utiliza de la manera medida sin correcci n de fondo single reference wavelength longitud de onda de referencia nica especifica que la absorbancia a una nica longitud de onda se resta del resultado de la longitud de onda En el campo se especifica la longitud de onda de fondo subtract average over a range restar promedio de un rango especifica que la absorbancia media de un rango de longitudes de onda se resta del resultado de la longitud de onda En los campos se especifican los l mites inferior y superior del rango de longitudes de onda de fondo three point drop line l nea vertical de tres puntos especifica qu
20. e at temperature C TM calculation O Average mean value 8 Derivative Filterlength 21 Sensitivity Equation ZGC 2 44 TM 81 5 16 66 log M Equation for thermal expansion l Volume correction Volume T 0 99829 104 5E 6 T 3 5E 6 SQR T El campo Use Wavelength at Utilizar longitud de onda a permite definir la longitud de onda de los datos procesados a partir de los cuales se extraen los valores de amplitud para el resultado de la longitud de onda La longitud de onda por defecto es de 260 nm Si se introduce una longitud de onda en la que no hay disponible ninguna medida por ejemplo un valor que no sea un n mero entero los valores de amplitud se calcular n mediante una interpolaci n lineal El campo Background Correction Correcci n de fondo permite especificar cualquier correcci n de fondo que se aplique al resultado de la longitud de onda para calcular el resultado de una funci n Elegir la flecha hacia abajo y seleccionar un procedimiento de correcci n de fondo en la lista desplegable Las opciones disponibles son id nticas a las de los procedimientos de la modalidad cin tica Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad de desnaturalizaci n t rmica 3 El grupo Temperature Temperatura permite seleccionar la fuente de la medida Elegir la flecha hacia abajo y seleccionar la fuente de temperatura en la lista desplegab
21. e una absorbancia de fondo calculada mediante una l nea vertical de tres puntos se resta del resultado de la longitud de onda Los l mites superior e inferior del rango de longitudes de onda de fondo utilizado para el c lculo del fondo se especifican en los campos adyacentes de la izquierda inferior y la derecha superior El monitor de trazas Trace Monitor es una traza de tiempo actualizada continuamente que muestra el cambio de absorbancia a la longitud de onda especificada en el campo Use Wavelength Utilizar longitud de onda con el paso del tiempo Definir la escala del eje de absorbancia y introduciendo los l mites inferior y superior en los campos Y scaling from escala de Y de y to a Se puede monitorizar el ltimo espectro adquirido o los espectros de una celda espec fica Elegir la flecha hacia abajo y seleccionar Last Spectrum ltimo espectro Cell n Celda n para medidas multicelda o All Spectra Todos los espectros para medidas de celda nica Definir la escala del eje de absorbancia y introduciendo los l mites inferior y superior en los campos Y scaling from escala de Y desde y to a El tiempo de ejecuci n Run Time es la duraci n total del an lisis El rango m ximo del tiempo de ejecuci n Run Time es de 999 999 segundos 11 5 d as El tiempo de ejecuci n Run Time debe ser mayor que el tiempo de ciclo Cycle Time m s el tiempo de inicio Start Time El t
22. ectra Espectros de celdas puestas a cero e Math Results Resultados matem ticos muestra la ventana Math Result Resultado matem tico Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 27 2 28 Modalidad cin tica Tabulate Selected Spectrum Trace Tabular espectro traza seleccionado muestra la tabla Tabular Data of Spectra Datos tabulares de espectros del espectro seleccionado o la tabla Tabular Data of Time Traces Datos tabulares de trazas de tiempo de la traza de tiempo seleccionada Estas tablas tambi n aparecen autom ticamente cuando se hace doble clic con el bot n izquierdo del rat n en un espectro traza de tiempo en una ventana gr fica o cuando se pulsa la tecla Intro mientras se utiliza el cursor El t tulo de la tabla indica el tipo de espectro por ejemplo Sample Muestra Standard Est ndar con el n mero del espectro traza de tiempo mostrado en la ventana entre corchetes por ejemplo 1 Logbooks Historiales muestra el cuadro de di logo Logbooks Historiales donde se puede seleccionar un historial para mostrarlo o imprimirlo Load Logbook Cargar historial muestra el cuadro de di logo Load Logbook Cargar historial donde se puede seleccionar un historial almacenado previamente para cargarlo Next Window Ventana siguiente muestra la siguiente ventana de la serie Si la ventana est oculta detr s de otras ventanas Next Window Ventana siguiente la muestra en primer plano Si
23. iempo de inicio Start Time es el periodo que transcurre entre el inicio de la medida y el comienzo propiamente dicho de la medida y es opcional El valor por defecto es 0 0 Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad cin tica 2 El tiempo de ciclo Cycle Time es el periodo que transcurre entre el comienzo de una medida y el comienzo de la siguiente el valor por defecto es 5 0 segundos para el funcionamiento multicelda y 0 5 segundo para el funcionamiento con una nica celda valores m nimos aceptables El tiempo de ciclo m nimo depende del hardware y el valor dado es tan s lo una aproximaci n Para evitar la p rdida de datos debe determinarse experimentalmente el tiempo de ciclo m nimo para la configuraci n El tiempo de ciclo m nimo depende del sistema de muestreo n mero de medidas por ciclo el tiempo de integraci n definido en el cuadro de di logo Setup Spectrophotometer Configurar espectrofot metro y la correcci n de dispersi n luminosa definida en el cuadro de di logo Info amp Options Informaci n y opciones e Seleccionar Increment Cycle Time Incrementar tiempo de ciclo para activar el aumento del tiempo de ciclo Especificar el porcentaje de incremento en el campo y un intervalo de tiempo en segundos en el campo After initial time of Despu s del tiempo inicial de Se puede elegir de entre cinco tipos de evaluaci n cin tica diferentes Elegir l
24. iempo y c lculo y en el cuadro de di logo Info amp Options Informaci n y opciones del men Method M todo El cuadro de di logo Time amp Calculation Tiempo y c lculo tambi n aparece cuando se pulsa el bot n Setup Configuraci n Los par metros m s importantes del m todo aparecen en la ventana Method Summary Resumen del m todo de la interfase gr fica de usuario En el cuadro de di logo Time amp Calculation Tiempo y c lculo se pueden definir las condiciones para la medida basada en el tiempo Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad cin tica 2 Time amp Calculation Parameters rWavelengths Use wavelength 400 nm Background correction subtract average over range M 550 570 nm Trace monitor Y scaling from o to j AU Monitor spectra Last Spectrum M Y scaling from o to j AU Timing Options Run time 2500 s Increment cycle time by 20 z Start time a after initial time of j 000 s Cycle time j 25 s min 11 9s Rate calculation Type First order y Calculation time range from 0 0 to 0 0 s FT Multiply Rate by f to convert to Rate unit TF Subtract Rate of cell z from all other Rates e El campo Use Wavelength Utilizar longitud de onda permite definir la longitud de onda para medidas multicelda o un m ximo de seis longitudes de onda para medidas de celda nica de los datos procesados de los qu
25. integraci n es el tiempo en segundos durante el cual se recoge y se integra la se al El tiempo de integraci n debe estar comprendido entre 0 1 y 25 5 segundos el valor por defecto es 0 5 segundo Los tiempos de integraci n mayores mejoran la relaci n se al ruido ya que la se al se acumula mientras que el ruido se promedia El tiempo de integraci n seleccionado influye directamente en el tiempo de ciclo m nimo de una medida cin tica El tiempo de ciclo m nimo no puede ser menor que el tiempo de integraci n Por tanto podr ser necesario reducir el tiempo de integraci n para realizar medidas cin ticas r pidas El n mero mostrado en el campo Interval Intervalo define el intervalo de medida de la longitud de onda El intervalo m nimo es de 1 nm que corresponde a la resoluci n m s alta Se recomienda no cambiar el valor por defecto de 1 nm para conseguir un rendimiento ptimo con el espectrofot metro Seleccionar Lamp s L mpara s para mostrar el cuadro de di logo Lamp s Parameter Par metros de l mpara s Permite definir los par metros de las l mparas del espectrofot metro El formato del cuadro de di logo Lamp s Parameter Par metros de l mpara s depende del tipo de espectrofot metro Con el espectrofot metro 8453 se dispone de la opci n de encender On y apagar Off las l mparas de deuterio y de wolframio Las l mparas tambi n se pueden encender y apagar haciendo clic en los iconos d
26. l men Measure Medir Set Gains Definir ganancias realiza un ajuste de la ganancia una referencia y una medida el comando Blank En blanco s lo realiza una referencia y una medida El ajuste independiente de la ganancia en un medio en blanco con elevada transmisi n por ejemplo agua o una sustancia tamp n ajusta las ganancias a un valor inferior para evitar un desbordamiento del convertidor A D y datos no v lidos debido a trazas de tiempo con pendientes negativas e Straylight Correction On Correcci n de dispersi n luminosa activada activa la opci n de correcci n de dispersi n luminosa Cuando est activada se realiza una segunda medida con el filtro de dispersi n luminosa instalado y se corrige la dispersi n luminosa del espectro de la muestra utilizando este espectro La correcci n de la dispersi n luminosa incrementa el tiempo de ciclo m nimo a adiendo el tiempo de integraci n definido en el cuadro de di logo Instrument Parameters Par metros del instrumento m s 2 segundos e Activar Autosave spectra to file Guardar autom ticamente el espectro en un fichero para guardar en disco todos los espectros adquiridos Escribir un nombre para el archivo en el campo adyacente Los espectros se almacenan en el directorio por defecto HPCHEMANADATA con la extensi n KD El directorio por defecto se puede cambiar en el men Config e Prompt for sample information before run Mostrar informaci n de la muestra
27. la modalidad de desnaturalizaci n t rmica al software de uso general Estas dos modalidades permiten realizar experimentos cin ticos y de desnaturalizaci n t rmica con el espectrofot metro Agilent 8453 Incluye posibilidades para desarrollar m todos anal ticos monitorizaci n en l nea en tiempo real para visualizar la marcha de los experimentos y herramientas para evaluar y procesar los datos experimentales Este manual contiene instrucciones para la instalaci n del software y describe los componentes de hardware necesarios para llevar a cabo experimentos cin ticos y de desnaturalizaci n t rmica Adem s contiene informaci n sobre las funciones m s importantes del software que ayudan a resolver los problemas anal ticos Este manual est organizado en tres cap tulos que abarcan desde la instalaci n del software hasta la evaluaci n y presentaci n de un experimento cin tico o de desnaturalizaci n t rmica 1 Instalaci n y configuraci n Este cap tulo describe la instalaci n del software Agilent ChemStation y la configuraci n del controlador de temperatura Peltier Agilent 89090A que es necesario para los experimentos de desnaturalizaci n t rmica 2 Modalidad cin tica Este cap tulo describe la configuraci n del espectrofot metro y el sistema de muestreo el desarrollo de un m todo cin tico y la realizaci n de una medida cin tica y por ltimo la evaluaci n de los datos experimentales 3 Modalidad de de
28. la ventana est minimizada en forma de icono Next Window Ventana siguiente la muestra con su tama o y posici n por defecto Pulsar la tecla F11 del teclado equivale a elegir Next Window Ventana siguiente Previous Window Ventana anterior muestra la ventana anterior de la serie Si la ventana est oculta detr s de otras ventanas Previous Window Ventana anterior la muestra en primer plano Si la ventana est minimizada en forma de icono Previous Window Ventana anterior la muestra con su tama o y posici n por defecto Reset Current View Restaurar vista actual restaura todas las ventanas de la vista actual a sus tama os y posiciones por defecto Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent ChemStation Agilent para Espectroscopia UV Visible Gu a del usuario para software de an lisis bioqu mico 3 Modalidad de desnaturalizaci n e t rmica Preparaci n de una medida de desnaturalizaci n t rmica 30 El experimento de desnaturalizaci n t rmica 39 En este cap tulo se describen las herramientas esenciales para desarrollar un m todo de desnaturalizaci n t rmica y adquirir y evaluar los datos mediante la modalidad de desnaturalizaci n t rmica del software de an lisis bioqu mico El primer apartado Preparaci n de una medida de desnaturalizaci n t rmica en la p gina 30 contiene informaci n sobre los pasos que se deben seguir antes de realizar la medida Se explica c mo configurar el es
29. le Si se elige un sensor interno se utilizar la temperatura del soporte de celda provista de termostato que se mide mediante el controlador de temperatura Peltier para la evaluaci n de los datos Si se elige un sensor externo se utilizar la temperatura de la muestra que se mide mediante el sensor de temperatura externo para la evaluaci n de los datos El grupo Set Calculation Range Definir rango del c lculo permite limitar el c lculo de los resultados en todas las trazas a un rango de temperatura especificado En los campos From De y To A se especifican los l mites inferior y superior del rango de temperatura El grupo Absorbance Ratio Relaci n de absorbancia permite especificar una temperatura a la que se normalizan las absorbancias la traza de temperatura se divide por el valor de absorbancia a la temperatura especificada Seleccionar Normalize at temperature Normalizar a temperatura para activar la normalizaci n y especificar la temperatura de normalizaci n en el campo adyacente El grupo Tm Calculation C lculo de Tf permite seleccionar el m todo de c lculo para la temperatura de fusi n e Elegir Average Promedio valor medio para calcular la temperatura de fusi n como la temperatura en el valor medio de la absorbancia al inicio del rango de c lculo y al final del rango de c lculo e Elegir Derivative Derivada para calcular la temperatura de fusi n utilizando la primera derivada de la traza
30. meters Par metros del instrumento 14 cuadro de di logo Options amp Info Opciones e informaci n 18 22 24 cuadro de di logo Temperature amp Options Temperatura y opciones 36 40 cuadro de di logo Time amp Calculation Tiempo y c lculo 18 26 D datos no v lidos 23 24 definir ganancias 24 delta AU 21 desnaturalizaci n t rmica 31 disparo externo 23 DNA Contenido de GC 40 longitud 36 40 E ecuaci n edici n 36 editor de configuraci n 9 espectro en blanco 27 39 41 espectros de celdas puestas a cero 27 expansi n t rmica 36 G guardar autom ticamente 23 37 H historial 28 42 incrementar ciclo 21 informaci n de la muestra 23 26 inhibidor 26 instalaci n software 8 interfase gr fica de usuario 12 31 intervalo de longitud de onda 15 L mpara de deuterio 15 mpara de tungsteno 15 mparas 15 nea vertical de tres puntos 20 ongitud de filtro 35 ongitud de ruta 17 18 Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent M mecanismo de transporte multicelda 16 22 21 medida basada en el tiempo 13 25 t rmica 39 medida en blanco 25 men Config 23 Instrument Instrumento 13 32 Medir 24 M todo 18 Mode Modalidad 12 31 View Ver 27 m todo desnaturalizaci n t rmica 33 informaci n 23 37 par metros 18 26 MKD files 27 monitor de trazas 20 monitor en l nea 37 multiplicar veloci
31. mientas tambi n incluye el campo del nombre del m todo donde aparece el nombre del m todo anal tico actual Las letras Mod que aparecen al lado del campo del nombre del m todo indican que este m todo se ha modificado y que estos cambios todav a no se han guardado La barra de herramientas tambi n incluye varios botones de m todo abreviado que se describen detalladamente en la Gu a del Usuario del Sistema de Espectroscop a UV Visible Agilent 8453 12 Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad cin tica 2 Figura 1 La interfase gr fica de usuario de la modalidad cin tica La barra lateral est dividida en dos partes El panel anal tico superior incluye un bot n Setup Configuraci n que abre el cuadro de di logo Method M todo Este cuadro de di logo incluye los par metros m s importantes de los m todos En el panel del instrumento inferior se puede seleccionar el sistema de muestreo y encender y apagar las l mparas del espectrofot metro La interfase gr fica de usuario por defecto de la modalidad cin tica contiene la ventana Time Trace Traza de tiempo la ventana Results Resultados y la ventana Method Summary Resumen del m todo En estas ventanas aparecen las trazas de tiempo cin ticas los datos cin ticos evaluados y los par metros principales del m todo despu s de realizarse la medida Configuraci n del espectrofot metro Seleccionar el men Instr
32. muestreo aparece el cuadro de di logo Sampling System Sistema de muestreo que permite seleccionar un funcionamiento Manual o el sistema de transporte multicelda 8 celdas o 7 celdas Si se desea utilizar el controlador de temperatura Peltier Agilent 89090A n 100 deber seleccionarse el sistema de muestreo Manual Cuando se cambia del muestreo Manual al sistema de transporte multicelda se desechan los resultados de la celda actual 16 Setup Sampling System Configurar sistema de muestreo muestra el cuadro de di logo Setup Configuraci n que permite definir los par metros de tiempo de ejecuci n del sistema de muestreo seleccionado El cuadro de di logo Cells Celdas permite configurar los par metros de tiempo de ejecuci n del mecanismo de transporte multicelda Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad cin tica 2 Pathlength cm Blank y Sample y LUUL El cuadro de di logo contiene las celdas utilizadas en formato de tabla con las siguientes columnas e Cell n Celda n indica las posiciones de las celdas en el mecanismo de transporte multicelda la celda 1 es la m s pr xima a la parte frontal del espectrofot metro En la columna central de la tabla se describe la muestra contenida en la celda Elegir Sample Muestra Blank En blanco o Not Used No utilizada en la lista desplegable e Los campos Path Length Paso ptico muestran las longitude
33. n el tiempo en la p gina 12 contiene informaci n sobre los pasos que se deben seguir antes de realizar la medida cin tica Se explica c mo configurar el espectrofot metro el sistema de muestreo y un m todo anal tico En el segundo apartado La medida cin tica en la p gina 24 se describe la medida basada en el tiempo y las posibilidades de procesamiento de datos as como la evaluaci n de los datos con el software Agilent ChemsStation EE Agilent Technologies 11 2 Modalidad cin tica Preparaci n de una medida basada en el tiempo Antes de realizar una medida basada en el tiempo es necesario configurar el sistema de acuerdo con la aplicaci n utilizada En este apartado se explica c mo configurar el espectrofot metro seleccionar y configurar un sistema de muestreo y desarrollar un m todo cin tico Ello permitir utilizar las funciones del software de an lisis bioqu mico con el fin de encontrar la mejor soluci n para la medida cin tica Inicio de la modalidad cin tica Para iniciar la modalidad cin tica del software de an lisis bioqu mico elegir Kinetics Cin tica en el men Mode Modalidad o en el cuadro desplegable Mode Modalidad de la interfase gr fica de usuario En la Figura 1 se muestra la interfase gr fica de usuario para la modalidad cin tica del software Agilent ChemStation La modalidad actual aparece en el cuadro desplegable Mode Modalidad en la barra de herramientas La barra de herra
34. n la barra lateral de la interfase gr fica de usuario se preparar el software para iniciar la medida basada en el tiempo Aparecer n entonces las ventanas Time Trace Traza de tiempo y Sample Spectra Espectros de la muestra Elegir Start Iniciar en la nueva barra de men s para iniciar la adquisici n o Abort Interrumpir para cancelar la adquisici n en curso Durante la medida basada en el tiempo se puede observar en tiempo real la adquisici n de los espectros y las trazas de tiempo en la ventana Time Trace Traza de tiempo y en la ventana Sample Spectra Espectros de la muestra Hacer doble clic con el bot n izquierdo del rat n en la ventana Time Trace Traza de tiempo o en la ventana Sample Spectra Espectros de la muestra para ajustar autom ticamente la escala del eje de ordenadas y Una vez que la medida basada en el tiempo haya finalizado o haya sido interrumpida por el usuario los datos cin ticos se almacenar n de la manera especificada en el cuadro de di logo Options amp Info Opciones e informaci n Las trazas de tiempo se eval an por tipo de velocidad que se define en el cuadro de di logo Time amp Calculation Tiempo y c lculo Estos resultados aparecen en la ventana Results Resultados Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 25 2 26 Modalidad cin tica Evaluaci n de los datos cin ticos Una vez que haya finalizado la medida basada en el tiempo existe la po
35. nfiguraci n del espectrofot metro Seleccionar el men Instrument Instrumento del software de an lisis bioqu mico para configurar el espectrofot metro Agilent 8453 con el fin de realizar una medida de desnaturalizaci n t rmica La configuraci n de los principales par metros del espectrofot metro es id ntica a la descrita para la modalidad cin tica de la ChemStation Agilent v ase Configuraci n del espectrofot metro en la p gina 13 Configuraci n de la rampa de temperatura En la modalidad de desnaturalizaci n t rmica se debe definir el controlador de temperatura Peltier como sistema de muestreo que aparece como Thermostattable Cell Celda provista de termostato en el campo Sampling Muestreo del panel del instrumento Pulsar el bot n Setup Configuraci n situado al lado del campo Sampling Muestreo para abrir el cuadro de di logo Temperature Ramp Rampa de temperatura que permite configurar el programa de temperatura para el experimento de desnaturalizaci n t rmica Temperature Ramp _Insert_ Append _Detoe No Start Stop Increment Hold Time 20 0 C 70 0 C 70 0 C 20 0 C Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad de desnaturalizaci n t rmica 3 Cada l nea de este cuadro de di logo define una rampa de temperatura La columna No N contiene el n mero de la rampa de temperatura las rampas de temperatura se numeran en orden La columna Start I
36. nicio contiene la temperatura inicial de la rampa Cuando se a ade una rampa la temperatura de inicio por defecto es la temperatura de parada de la rampa anterior La columna Stop Parada contiene la temperatura final de la rampa Cuando se a ade una rampa al programa la temperatura final no est definida La temperatura de parada m xima es de 100 C La columna Increment Incremento contiene el valor utilizado para incrementar paso a paso la temperatura El incremento por defecto es de 0 5 C La columna Hold Time Tiempo de retenci n contiene el tiempo que se debe mantener cada paso de temperatura El tiempo de retenci n por defecto es de 1 00 minuto Configuraci n de un m todo de desnaturalizaci n t rmica Para editar los par metros anal ticos del m todo de desnaturalizaci n t rmica seleccionar Calculation C lculo en el men Method M todo o pulsar el bot n Setup Configurar del panel anal tico de la interfase gr fica de usuario Se abrir el cuadro de di logo Calculation Parameters Par metros del c lculo Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 33 3 34 Modalidad de desnaturalizaci n t rmica Calculation Parameters Wavelength Use wavelength at 260 nm Background correction subtract average over range 500 nm 550 nm Temperature Use temperature from Internal sensor M Set calculation range Absorbance ratio Fom C wf c T Normaliz
37. nsi n t rmica de la soluci n al calentarse Seleccionar Volume Correction Correcci n de volumen para especificar que debe realizarse una correcci n de la expansi n t rmica Introducir la ecuaci n para la correcci n del volumen en el campo Volume T Volumen T Pueden utilizarse los mismos operadores en la ecuaci n de correcci n del volumen y en el grupo Equation Ecuaci n Utilizar la variable T para la temperatura de la muestra Seleccionar Temperature amp Options Temperatura y opciones en el men Method M todo para abrir el cuadro de di logo Temperature amp Options Temperatura y opciones En este cuadro de di logo se puede elegir de entre varias opciones para el experimento de desnaturalizaci n t rmica Temperature amp Options Temperature unit Stirrer Online trace monitor 8 Celsius a Off 8 Auto scaling O Kelvin O On O Fixed scaling O Fahrenheit Speed rpm From to AU r Ramping speed Idle temperature 25 00 15 C Slow 0 Fast Save spectra X Autosave spectra to file Method Information Default Method of Thermal Denaturation Mode Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad de desnaturalizaci n t rmica 3 El grupo Temperature Unit Unidad de temperatura permite elegir las unidades de temperatura para fines de medida y control Las opciones disponibles son Celsius C Kelvin K y Fahrenheit
38. nte para cargarlo Next Window Ventana siguiente muestra la siguiente ventana de la serie Si la ventana est oculta detr s de otras ventanas Next Window Ventana siguiente la muestra en primer plano Si la ventana est reducida en forma de icono Next Window Ventana siguiente la muestra con su tama o y posici n por defecto Pulsar la tecla F11 del teclado equivale a elegir Next Window Ventana siguiente Previous Window Ventana anterior muestra la ventana anterior de la serie Si la ventana est oculta detr s de otras ventanas Previous Window Ventana anterior la muestra en primer plano Si la ventana est minimizada en forma de icono Previous Window Ventana anterior la muestra con su tama o y posici n por defecto Reset Current View Restaurar vista actual restaura todas las ventanas de la vista actual a sus tama os y posiciones por defecto Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent ndice A ajuste autom tico de escala 25 ajustes de ganancia 23 24 barra de herramientas 12 31 Barra lateral 13 C cin tica de orden cero 21 cin tica de primer orden 21 cin tica de reacci n r pida 15 23 confirmaci n de la instalaci n 8 Controlador de temperatura Peltier 9 16 18 32 40 correcci n de dispersi n luminosa 21 23 correcci n de fondo 19 34 Cuadro de di logo Calculation Parameters Par metros del c lculo 32 33 41 Cuadro de di logo Instrument Para
39. odalidad de desnaturalizaci n t rmica 3 El experimento de desnaturalizaci n t rmica Una vez definida la rampa de temperatura y editados los par metros del m todo se podr iniciar el experimento de desnaturalizaci n t rmica En este apartado se incluye informaci n sobre el monitor en l nea en tiempo real y las funciones de la ChemStation Agilent utilizadas para procesar los datos experimentales Realizaci n de un experimento de desnaturalizaci n t rmica Las medidas se pueden iniciar utilizando el men Measure Medir de la barra de men s pulsando los botones Blank En blanco Sample Muestra y Thermal Measurement Medida t rmica de la barra lateral de la interfase gr fica de usuario o utilizando determinadas teclas F Antes de medir un espectro nico o de realizar un experimento de desnaturalizaci n t rmica es necesario medir un espectro en blanco seleccionando la opci n Blank En blanco en el men Measure Medir pulsando la tecla F4 o haciendo clic en el bot n Blank En blanco de la barra lateral de la interfase gr fica de usuario Para medir un nico espectro de la soluci n contenida en la celda y mostrarlo en la ventana Sample Spectra Espectros de la muestra seleccionar Sample Single Spectrum Muestra Espectro nico en el men Measure Medir Tambi n se puede medir un nico espectro pulsando la tecla F5 o haciendo clic en el bot n Sample Muestra de la barra lateral de la interfase gr fi
40. onado la opci n Adjust gains separately from blank measurement Ajustar ganancias independientemente de la medida en blanco en el cuadro de di logo Options amp Info Opciones e informaci n Set Gains Definir ganancias estar incluido en el men Measure Medir El ajuste independiente de la ganancia en un medio en blanco con elevada transmisi n por ejemplo agua o una sustancia tamp n ajusta las ganancias a un valor inferior y evita un desbordamiento del convertidor A D Esto contribuye a evitar datos no v lidos debido a trazas de tiempo con pendientes negativas 1 Introducir en el soporte una celda llena de agua u otro medio de baja absorbancia 2 Mover el mecanismo de transporte multicelda a la posici n correcta 3 Hacer clic en Set Gains Definir ganancias en el men Measure Medir Con un sistema de muestreo multicelda se recomienda medir los espectros mediante Zero Cells Poner a cero las celdas para corregir las propiedades pticas ligeramente diferentes de las celdas de medida Se debe inicializar el mecanismo de transporte multicelda con un medio en blanco id ntico en todas las celdas El comando Zero Cells Poner a cero las celdas mide un verdadero espectro en blanco para la celda 1 y a continuaci n mide los espectros para las celdas restantes La diferencia entre los espectros se obtiene restando el espectro en blanco de los espectros de las celdas individuales y seguidamente se resta el resulta
41. pectra to file Guardar autom ticamente los espectros en un fichero para indicar que se deben guardar los espectros adquiridos Escribir un nombre para el fichero de datos en el campo Autosave Filename Nombre de fichero para guardar autom ticamente El nombre debe seguir las convenciones de designaci n de ficheros del DOS 8 caracteres alfanum ricos como m ximo Si no se selecciona Autosave spectra to file Guardar autom ticamente los espectros en un fichero no se guardar n los espectros e Se puede escribir una descripci n del m todo en el campo Method Information Informaci n del m todo Este campo acepta cualquier car cter alfanum rico y la descripci n puede tener una longitud cualquiera El texto pasa autom ticamente de una l nea a otra Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 37 3 Modalidad de desnaturalizaci n t rmica El cuadro de di logo Set Individual Calculation Range Definir rango de c lculo individual aparece cuando se elige el comando Set Individual Calculation Range Definir rango de c lculo individual en el men Method M todo Permite definir un rango de temperatura para el c lculo de los resultados de la desnaturalizaci n t rmica en la traza mostrada en ese momento En los campos From De y To A del cuadro de di logo se introducen los l mites inferior y superior del rango de temperatura 38 Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent M
42. pectrofot metro definir la rampa de temperatura para el controlador de temperatura Peltier y elegir una de las diversas opciones de evaluaci n anal tica En el segundo apartado El experimento de desnaturalizaci n t rmica en la p gina 39 se describe la medida t rmica real la monitorizaci n en l nea en tiempo real y las posibilidades de proceso de datos con el software Agilent ChemStation EE Agilent Technologies 29 3 Modalidad de desnaturalizaci n t rmica Preparaci n de una medida de desnaturalizaci n t rmica 30 Antes de realizar una medida de desnaturalizaci n t rmica es necesario configurar el sistema de acuerdo con la aplicaci n utilizada En este apartado se explica c mo configurar el espectrofot metro y la rampa de temperatura con un controlador de temperatura Peltier y se describe c mo desarrollar un m todo de desnaturalizaci n t rmica para analizar una muestra de DNA o de prote na El controlador de temperatura Peltier Agilent 89090A se debe configurar antes de iniciar la modalidad de desnaturalizaci n t rmica Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad de desnaturalizaci n t rmica 3 Inicio de la modalidad de desnaturalizaci n t rmica Para iniciar la modalidad de desnaturalizaci n t rmica del software de an lisis bioqu mico elegir Thermal Denaturation Desnaturalizaci n t rmica en el men Mode Modalidad o en el cuadro desplegable Mode Modalid
43. roducts Productos disponibles y hacer clic en Add Agregar 4 Introducir el n mero de licencia de G1115AA y hacer clic en Add Agregar 5 Seleccionar G1117AA UV VIS Biochemical Add on mode Modalidad OO O N a opcional bioqu mica UV VIS en Available Products Productos disponibles y hacer clic en Add Agregar Introducir el n mero de licencia de G1117AA y hacer clic en Add Agregar Hacer clic en Aceptar Hacer clic en Install Instalar Una vez realizada la instalaci n ejecutar Installation Qualification cualificaci n de la instalaci n que est disponible en el men Agilent ChemsStation 10 Si Installation Qualification cualificaci n de la instalaci n se ejecuta satisfactoriamente el software de an lisis bioqu mico y el de uso general se habr n instalado correctamente Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Instalaci n y configuraci n 1 Configuraci n del controlador de temperatura Peltier Agilent 89090A Si se tiene previsto utilizar la modalidad de desnaturalizaci n t rmica del software de an lisis bioqu mico tambi n ser necesario configurar el controlador de temperatura Peltier Agilent 890904 1 Iniciar el editor de configuraci n UV Vis Configuration Editor desde el men Agilent ChemStations 845x UV Visible System 1 Device Configuration UYVVis Modules 0 GPIB CLAN 8452A 8453 GPIB Address zo Temp Control a Selected Modules
44. s Los nuevos resultados aparecen en la ventana Results of Heating Trace Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad de desnaturalizaci n t rmica 3 Resultados de la traza de calentamiento Si se han cambiado los par metros del m todo el indicador de modificaci n Mod aparecer en la barra de herramientas de la interfase gr fica de usuario Si se pulsa el bot n Edit Sample Information Editar informaci n de la muestra en la ventana Results of Heating Trace Resultados de la traza de calentamiento aparecer el cuadro de di logo Sample Information Informaci n de la muestra Permite incluir informaci n sobre las muestras que se puede utilizar en los c lculos de resultados Visualizaci n de los resultados Hay varias opciones para mostrar los datos adquiridos y procesados as como los resultados tabulados Seleccionar el men View Ver que contiene All spectra Todos los espectros muestra todos los espectros adquiridos en la ventana Sample Spectra Espectros de la muestra e Spectra of Current Trace Espectros de la traza actual muestra los espectros de la traza seleccionada en ese momento en la ventana Spectra of Current Trace Espectros de la traza actual All Traces Todas las trazas muestra todas las trazas de temperatura en la ventana Temperature Trace Traza de temperatura Traces and Results Trazas y resultados muestra la ventana Time Traces Trazas de tiempo la
45. s en cent metros de las celdas de muestras en cada posici n del mecanismo de transporte multicelda El valor por defecto para cada celda es 1 cm lUna buena pr ctica de medida consiste en utilizar la posici n 1 para la medida Blank En blanco As el espectro de Blank En blanco siempre se renovar al comienzo de un ciclo de medida Esto es especialmente importante cuando se realizan experimentos cin ticos de larga duraci n Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 17 2 Modalidad cin tica El cuadro de di logo Single Cell Celda nica permite configurar los par metros de tiempo de ejecuci n para un funcionamiento manual Single Cell Single cell Pathlength fi cm En el campo Path Length Paso ptico es necesario editar la longitud en cm de la celda de muestra que se est utilizando El valor por defecto es 1 cm Seleccionar Wait for Temperature Ready Esperar hasta que la temperatura est preparada para asegurar que la ChemStation Agilent espere a recibir una se al de preparado del accesorio de control de temperatura Peltier Agilent 89090A antes de realizar una medida Se borrar la condici n por defecto Esta casilla de verificaci n s lo estar disponible si se ha configurado el controlador de temperatura Peltier Agilent 89090A Configuraci n de un m todo cin tico Los par metros de los m todos se editan en el cuadro de di logo Time Calculation T
46. sibilidad de volver a evaluar los datos cin ticos Puesto que todos los espectros se han adquirido durante la medida se pueden modificar los par metros de los campos Wavelength Longitud de onda y Rate Calculation C lculo de velocidad del cuadro de di logo Time amp Calculation Tiempo y c lculo Hacer clic en Aceptar para activar los cambios Los nuevos resultados aparecen en la ventana Results Resultados Si se han modificado los par metros del m todo el indicador de modificaci n Mod aparecer en la interfase gr fica de usuario Si se ha configurado un sistema de muestreo manual podr elegirse Edit Sample Information Editar informaci n de la muestra en la ventana Results Resultados para mostrar el cuadro de di logo Sample Information nformaci n de la muestra Permite incluir informaci n de la muestra con los resultados El cuadro de di logo Sample Information Informaci n de la muestra contiene los siguientes par metros El nombre de la muestra Un comentario por ejemplo una descripci n de la muestra e La concentraci n de un sustrato en el campo S G mg ml este campo s lo aparecer si se ha seleccionado S o S I en el cuadro de di logo Configure Substrate Inhibitors Configurar sustrato Inhibidores e La concentraci n de un inhibidor en el campo I mg m este campo s lo aparecer si se ha seleccionado S I en el cuadro de di logo Configure Substrate Inhibitors Configurar sustr
47. snaturalizaci n t rmica Este cap tulo describe la configuraci n de una rampa de temperatura y un m todo anal tico para realizar un experimento de desnaturalizaci n t rmica Se describen la monitorizaci n de experimentos en l nea y las posibilidades de evaluaci n de datos que ofrece el software Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 3 Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Contenido Instalaci n y configuraci n 7 Instalaci n del software de an lisis bioqu mico 8 Configuraci n del controlador de temperatura Peltier Agilent 89090A Modalidad cin tica 11 Preparaci n de una medida basada en el tiempo 12 Inicio de la modalidad cin tica 12 Configuraci n del espectrofot metro 13 Configuraci n del sistema de muestreo 16 Configuraci n de un m todo cin tico 18 La medida cin tica 24 Realizaci n de una medida basada en el tiempo 24 Evaluaci n de los datos cin ticos 26 Visualizaci n de los resultados 27 Modalidad de desnaturalizaci n t rmica 29 Preparaci n de una medida de desnaturalizaci n t rmica 30 Inicio de la modalidad de desnaturalizaci n t rmica 31 Configuraci n del espectrofot metro 32 Configuraci n de la rampa de temperatura 32 Configuraci n de un m todo de desnaturalizaci n t rmica 33 El experimento de desnaturalizaci n t rmica 39 Realizaci n de un experimento de desnaturalizaci n t rmica 39 Evaluaci n de los datos de desnaturalizaci
48. trato y un inhibidor e A B especifica que se han incluido dos sustratos Introducir las unidades de concentraci n de los sustratos y los inhibidores en el campo Unit Unidad Para cargar y evaluar datos antiguos generados por el software HP 89532K elegir Import from MKD Importar desde MIKD en el men File Archivo Visualizaci n de los resultados Hay varias opciones para mostrar los datos adquiridos y procesados as como los resultados tabulados Seleccionar el men View Ver que contiene All spectra Todos los espectros muestra todos los espectros adquiridos en la ventana Sample Spectra Espectros de la muestra e Spectra of Cell Espectros de la celda muestra los espectros de una determinada celda en la ventana Sample Spectra Espectros de la muestra El n mero de la celda se selecciona en el submen e Traces and Results Trazas y resultados muestra la ventana Time Traces Trazas de tiempo la ventana Results Resultados y la tabla Method Summary Resumen del m todo e Measured Single Spectra Espectro nico medido muestra un espectro medido en la ventana Single Spectra Espectros nicos e Last Blank Spectrum ltimo espectro en blanco muestra la ventana Last Blank Spectrum Ultimo espectro en blanco e Zero Cell Spectra Espectros de celdas puestas a cero se incluye en el men View Ver cuando se ha configurado un sistema de transporte multicelda Muestra la ventana Zero Cell Sp
49. ument Instrumento del software de an lisis bioqu mico para configurar el espectrofot metro Agilent 8453 con el fin de realizar una medida basada en el tiempo Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent 13 2 14 Modalidad cin tica Elegir Setup Spectrophotometer Configurar espectrofot metro para mostrar el cuadro de di logo Instrument Parameters Par metros del instrumento que permite definir los par metros de tiempo de ejecuci n del espectrofot metro En este cuadro de di logo se pueden definir los siguientes par metros Instrument Parameters Wavelength range from fso nm roo nm Integration time 05 seconds O Interval n e Pueden utilizarse los campos para especificar los l mites inferior y superior del rango necesario para el an lisis El campo From De define el l mite inferior del rango y el campo To A define el l mite superior del rango Los valores por defecto son los l mites del rango de longitudes de onda del espectrofot metro configurado Se recomienda utilizar el rango m ximo de longitudes de onda del espectrofot metro Esto permite aprovechar al m ximo las posibilidades del espectrofot metro provisto de matriz de diodos como por ejemplo evaluaci n post an lisis de los datos a distintas longitudes de onda Software de an lisis bioqu mico para la ChemStation Agilent Modalidad cin tica 2 El valor del campo Integration Time Tiempo de
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