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Guía de referencia del ensayo de secuenciación - Support

1. ADVERTENCIA y Este conjunto de reactivos contiene formamida una amida alif tica que es una toxina reproductiva probable Evite su inhalaci n o ingesti n o el contacto con la piel o los ojos pues podr an producirse lesiones Deseche los contenedores y los contenidos no utilizados de acuerdo con las normativas de seguridad oficiales de su zona Para obtener m s informaci n consulte la hoja de datos de seguridad de este kit en support ilumina com sds ilmn Preparaci n 1 Prepare NaOH 0 1 N nuevo a adiendo 30 ul de NaOH 10 N a 2970 ul de agua est ril 2 Retire el Diluyente de normalizaci n de bibliotecas de su almacenamiento a una temperatura de entre 25 C y 15 C y deje que alcance la temperatura ambiente Utilice un ba o de agua a una temperatura de entre 20 C y 25 C seg n sea necesario NOTA Diluyente de normalizaci n de bibliotecas puede formar precipitados o cristales visibles Antes de su uso agite con vigor y a continuaci n sujete el tubo delante de una luz e inspecci nelo visualmente para asegurarse de que todos los precipitados se hayan disuelto por completo 3 Retire las Bolas de biblioteca y el Lavado de normalizaci n de bibliotecas de su almacenamiento a una temperatura de entre 2 C y 8 C y deje que alcancen la temperatura ambiente Utilice un ba o de agua a una temperatura de entre 20 C y 25 C seg n sea necesario 4 Agite las Bolas de biblioteca con vigor durante un m
2. aspirar los reactivos de modo que resulta importante que estos no presenten burbujas de aire 4 Coloque el cartucho de reactivo en hielo o almac nelo a una temperatura de entre 2 C y 8 C hasta seis horas hasta que est listo para configurar el experimento Para obtener unos resultados ptimos proceda directamente con la carga de la muestra y la configuraci n del experimento Preparaci n de muestras para secuenciaci n 1 Deje que el Tamp n de diluci n de biblioteca alcance la temperatura ambiente Agite el Tamp n de diluci n de biblioteca y aseg rese de que todos los precipitados se hayan disuelto por completo 2 Sila placa SGP se ha almacenado congelada descong lela a temperatura ambiente 5 A N de referencia 15038346 Rev A ESP 10 11 12 13 Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx Centrifugue la placa SGP a 1000 x ga 20 C durante un minuto para recoger la condensaci n Asigne la etiqueta PAL_Plate_ID PAL_Placa_ID a un tubo Eppendorf nuevo Si la placa SGP se ha almacenado congelada con una pipeta multicanal P200 con configuraci n de pipeteo a 40 ul mezcle cada biblioteca que se deba secuenciar pipeteando arriba y abajo entre tres y cinco veces Cambie las puntas entre muestras Transfiera 5 ul de cada biblioteca que se deba secuenciar de la placa SGP a una gradilla de ocho tubos de PCR Selle la placa SGP con un sello adhesivo para pl
3. C y 15 C N de referencia 15038346 Rev A ESP Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx caja 2 Tabla 3 Reactivos de posamplificaci n de la caja 2 Componente Cantidad Contenido Almacenamiento Cartucho de 6 cartuchos Cartucho de un solo uso que contiene Entre 25 C MiSeqDx reactivos para la generaci n y y 15 C Ensayo de secuenciaci n de grupos para su uso con secuenciaci n MiSeqDx incluidos formamida 2 cl nica de la mercaptoetanol y DMSO lt 2 fibrosis qu stica Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx caja 3 Tabla 4 Reactivos de preamplificaci n de la caja 3A Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Tamp n de Soluci n acuosa tamponada que Entre 2 C y 8 C lavado contiene sales 2 mercaptoetanol restrictivo y formamida Tamp n de 1 tubo 48ml Soluci n acuosa tamponada que Entre 2 C y 8 C lavado contiene sales universal Tabla5 Reactivos de posamplificaci n de la caja 3B Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Bolas de Soluci n acuosa Entre 2 C y 8 C limpieza de tamponada que contiene PCR bolas paramagn ticas de fase s lida y polietilenglicol Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx sosed soJeuulq Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Lavado de So
4. Se precisa un ciclador t rmico El ciclador t rmico debe tener una tapa caliente y cumplir con las especificaciones de rendimiento siguientes Rango de control de temperatura Entre 4 C y 99 C Precisi n de control 0 25 C de 35 C a 99 C Agitador de microplacas Se precisa un agitador de microplacas en el rea de posamplificaci n del laboratorio El agitador de placas debe cumplir con las especificaciones de rendimiento siguientes Velocidad de mezcla m x 3000 rpm Rango de velocidad de mezcla De 200 a 3000 rpm Centrifugadora de sobremesa Se precisa una centrifugadora de sobremesa que pueda mantener 20 C Se precisa una centrifugadora independiente en el rea de preamplificaci n Se admite cualquier centrifugadora de placas que alcance las velocidades indicadas del protocolo de 280 a 2400 x g Bloque de calor Se precisa un bloque de calor para tubos El bloque de calor debe cumplir con las especificaciones de rendimiento siguientes Rango de temperatura Ambiente de 5 C a 99 C Regulaci n de temperatura 0 1 C a 37 C 0 4 C a 60 C Soporte magn tico Se precisa un soporte magn tico para una placa de 96 pocillos Se obtiene un mejor resultado cuando los imanes se encuentran en un lado del soporte y no en la parte inferior Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 1 3 6 Pipetas de precisi n Se precisa un conjunto de pipetas de precisi n S
5. Tiempo estimado Duraci n total 50 minutos Tiempo de participaci n activa 20 minutos Consumibles Art culo Tamp n de eluci n Bolas de limpieza de PCR Etanol al 80 reci n preparado Placas MIDI de 96 pocillos Sello adhesivo para placas Cubetas Preparaci n j NOTA Cantidad 1 tubo 400 ul por cada ocho muestras 5 ml por cada ocho muestras 2 Seg n sea necesario Seg n sea necesario Almacenamiento Entre 15 C y 30 C Enter enone Entre 15 C y 30 C Entre 15 C y0 E Entre 15 C y 30 C Entre 15 C y 30 C Suministrado por Ilumina Ilumina Usuario Usuario Usuario Usuario Consulte la secci n Precauciones al inicio del presente protocolo en relaci n con la manipulaci n de bolas magn ticas y el lavado con etanol al 80 durante la limpieza de PCR 1 Deje que Bolas de limpieza de PCR alcance la temperatura ambiente 42 N de referencia 15038346 Rev A ESP Prepare una soluci n nueva con etanol al 80 a partir de una soluci n de etanol absoluta NOTA Para el procedimiento de lavado prepare siempre una soluci n nueva con etanol al 80 El etanol puede absorber agua del aire y repercutir en los resultados Procedimiento 1 10 11 Centrifugue la placa AMP a 1000 x g a 20 C durante un minuto para recoger la condensaci n Asigne la etiqueta CLP_Plate_ID CLP_Placa_ID a una nueva placa MIDI Invierta las Bolas de limp
6. siempre puntas de pipetas nuevas entre las dispensaciones de reactivos y de muestras Mezcle las placas seg n se indique Mezcle las muestras con una pipeta multicanal y centrifugue la placa cuando se indique No agite las placas Utilice puntas resistentes a los aerosoles Al utilizar puntas resistentes a los aerosoles se reduce el riesgo de contaminaci n cruzada entre muestras y de restos de amplicones Lavado con etanol al 80 durante el paso de limpieza de PCR Prepare etanol nuevo al 80 Prepare siempre etanol nuevo al 80 para los pasos de lavado El etanol puede absorber agua del aire y afectar a los resultados Retire todo el etanol de los pocillos Aseg rese de extraer todo el etanol del fondo de los pocillos ya que pueden contener contaminantes residuales Utilice una pipeta multicanal P20 para retirar el etanol residual y acelerar el secado Permita una evaporaci n completa Emplee al menos cinco minutos para el secado fuera del soporte magn tico a temperatura ambiente para una evaporaci n completa Los restos de etanol pueden afectar al rendimiento de las reacciones posteriores Requisitos de entrada de ADN El protocolo Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx de Illumina requiere 250 ng de ADN gen mico Illumina recomienda encarecidamente la cuantificaci n del material gen mico de inicio 1 3 N de referencia 15038346 Rev A ESP Cuantificaci n de ADN de entrada Cuantifique el material ge
7. traslade los reactivos de posamplificaci n al rea de almacenamiento de posamplificaci n adecuado Procedimientos de laboratorio de preamplificaci n y posamplificaci n Para evitar la contaminaci n de productos de PCR resulta importante establecer los procedimientos de laboratorio y seguir las pr cticas recomendadas Illumina recomienda realizar una limpieza diaria y semanal de las reas de laboratorio con hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 x PRECAUCI N Para evitar la degradaci n de las muestras o los reactivos aseg rese de que se hayan disipado por completo todos los vapores de la soluci n de limpieza antes de comenzar cualquier proceso Limpieza diaria del rea de preamplificaci n Una limpieza diaria del rea de preamplificaci n con una soluci n de hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 ayuda a eliminar producto de PCR que se ha introducido en el rea de preamplificaci n Identifique las reas de preamplificaci n que constituyan el mayor riesgo de contaminaci n y l mpielas con una soluci n de hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 antes de comenzar cualquier proceso de preamplificaci n Las reas de alto riesgo pueden ser entre otros los siguientes componentes Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 1 5 Partes superiores de las mesas Mangos de puertas Mangos de las puertas de los refrigeradores o los congeladores Rat n
8. 25 C y 15 C y descong lelos en una mesa a temperatura ambiente Espere unos 20 minutos hasta que los reactivos se descongelen Cuando los cebadores de ndice est n completamente descongelados agite cada tubo para mezclarlo y centrif guelos brevemente en una microcentrifugadora Utilice tubos Eppendorf de 1 7 ml como adaptadores para la microcentrifugadora Coloque los cebadores en una gradilla de acuerdo con la siguiente disposici n a Disponga los tubos de cebadores Cebadores de ndice C A503 D A504 y E A505 tapones blancos y soluci n clara en posici n vertical alineados por filas de la A a la H b Disponga los tubos de cebadores Cebadores de ndice 1 A701 2 A702 y 10 A710 tapones naranjas y soluci n amarilla en posici n horizontal alineados por columnas de la 1 a la 12 3 3 N de referencia 15038346 Rev A ESP Figura 6 Fijaci n de la placa de ndices A Cebadores de ndice C A503 D A504 y E A505 tapones blancos B Cebadores de ndice 1 A701 2 A702 y 10 A710 tapones naranjas C Placa AMP 6 Asigne la etiqueta AMP placa de amplificaci n a una nueva placa de PCR de 96 pocillos 7 A ada cebadores de ndice a la placa AMP de acuerdo con la hoja de muestras siguiente a Con una pipeta multicanal a ada 4 ul de cebadores de ndice C A503 D A504 y E A505 soluci n clara a los pocillos correspondientes en una columna de la placa AMP No es necesario cambiar la
9. Cobadores de indico NaOH Resultado Placa AMP N Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx oAesus jep ofege ep oN Preparaci n de la hoja de muestras de MiSeqDx 1 En la pantalla Welcome Bienvenida del Gestor de la lista de trabajos de Ilumina IWM seleccione Create Worklist Crear lista de trabajo Se abre la pantalla Enter Run Parameters Introducir par metros del experimento Figura 2 Pantalla Enter Run Parameters Introducir par metros del experimento del Gestor de la lista de trabajos de Illumina Illumina Worklist Manager Please Enter Run Parameters 2 En el campo Test Type Tipo de prueba seleccione Ensayo de secuenciaci n cl nica de FO 3 En el campo Worklist Name Nombre de la lista de trabajo introduzca un nombre para la hoja de muestras Este campo es obligatorio Si se usa el ID alfanum rico del c digo de barras del cartucho de reactivo para el nombre de la hoja de muestras Software operativo de MiSeq MOS encontrar la hoja de muestras autom ticamente El ID del c digo de barras se encuentra en la etiqueta del cartucho de reactivo justo debajo del c digo de barras Si se asigna otro nombre a la hoja de muestras se puede usar el bot n Browse Examinar de Software operativo de MiSeq MOS para localizar la hoja de muestras correspondiente 4 Opcional Escriba una descripci n para identificar el experimento 2 E N de referen
10. Retire el Grupo de oligonucle tidos del ensayo de secuenciaci n cl nica de fibrosis qu stica el Tamp n de hibridaci n las muestras de ADN gen mico y la muestra de control positivo de su almacenamiento a una temperatura de entre 25 C y 15 C y descong lelos a temperatura ambiente 2 Agite el Grupo de oligonucle tidos del ensayo de secuenciaci n cl nica de fibrosis qu stica y el Tamp n de hibridaci n con fuerza para asegurarse de que todos los precipitados se hayan disuelto por completo y a continuaci n centrifugue brevemente los tubos para recoger el l quido NOTA Antes de utilizar el Tamp n de hibridaci n sujete el tubo delante de una luz e inspecci nelo visualmente para asegurarse de que todos los precipitados se hayan disuelto por completo 3 Caliente un bloque de calor de 96 pocillos a 95 C 4 Precaliente una incubadora a 37 C para prepararse para el paso de extensi n ligadura 5 Cree la placa de muestras de acuerdo con el gr fico de placa impreso con el IWM Verifique la ubicaci n de las coincidencias de controles positivos y negativos Illumina recomienda procesar las muestras en lotes no inferiores a ocho 4 NOTA El uso de controles permite al servicio de asistencia t cnica de Illumina proporcionar una asistencia eficaz para la soluci n de problemas El servicio de asistencia t cnica de Illumina no proporcionar asistencia a menos que estas reacciones de control estuvieran incluidas en el an
11. Usuario PCR y 30 Hielera de 2 5 1 1 Entre 15 C Usuario y 30 C Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 5 sexajolalq ap uoivedn By Preparaci n para agrupaci n de bibliotecas 1 Caliente un bloque de calor apto para tubos de centr fuga de 1 5 ml a 96 C 2 En una hielera prepare un ba o de agua con hielo Enfr e el Tamp n de diluci n de biblioteca en el ba o de agua con hielo 3 Empiece a descongelar el cartucho de reactivo de MiSeqDx Preparaci n de una diluci n nueva de NaOH x PRECAUCI N El uso de una soluci n nueva de NaOH diluida es esencial para desnaturalizar completamente las muestras para la generaci n de grupos en MiSeqDx Para desnaturalizar las muestras prepare 1 ml de NaOH 0 1 N La preparaci n de un volumen de 1 ml evita que los peque os errores de pipeteo afecten a la concentraci n final de NaOH 1 Combine los vol menes siguientes en un tubo de microcentr fuga Agua sin ARNasa ni ADNasa 900 ul Preparado de NaOH 1 0 N 100 ul 2 Invierta el tubo varias veces para mezclar Desnaturalizaci n y diluci n de Control interno PhiX 1 Combine los siguientes vol menes para diluir la biblioteca Control interno PhiX a2nM Biblioteca Control interno PhiX de 10 nM 2 ul 1 tamp n TE 8 ul 2 Combine los siguientes vol menes de biblioteca Control interno PhiX de 2 nM y NaOH 0 1 N en un tubo de microcentr fuga para que d como resultado un
12. bloque de calor se haya enfriado hasta los 40 C Mientras la placa HYB todav a est en el bloque de calor refuerce el sello con un rodillo de goma o una cu a de sellado Si no se alcanzan los 40 C en 80 minutos siga con la incubaci n hasta que el bloque de calor se haya enfriado hasta los 40 C Retire la placa HYB del bloque de calor y centrifugue a 1000 x g a 20 C durante un minuto para recoger la condensaci n Con una pipeta multicanal con configuraci n de pipeteo a 60 pl transfiera el volumen ntegro de cada muestra al centro de los pocillos de prelavado correspondientes de la placa del filtro Cambie las puntas despu s de cada columna para evitar la contaminaci n cruzada Cubra la placa del filtro con la tapa y centrifugue a 2400 x g a 20 C durante cinco minutos Lave la placa del filtro como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de Tamp n de lavado restrictivo en cada pocillo de muestra Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas b Cubra la placa del filtro con la tapa y centrifugue a 2400 x g a 20 C durante cinco minutos Repita el lavado como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de Tamp n de lavado restrictivo en cada pocillo de muestra Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas b Cubra la placa del filtro con la tapa y c
13. de lavado restrictivo garantizan una eliminaci n completa de los oligonucle tidos sin ligar Un tercer paso de lavado con el Tamp n de lavado universal elimina el Tamp n de lavado restrictivo residual y prepara las muestras para el paso de extensi n ligadura Y ADVERTENCIA Este conjunto de reactivos contiene formamida una amida alif tica que es una toxina reproductiva probable Evite su inhalaci n o ingesti n o el contacto con la piel o los ojos pues podr an producirse lesiones Deseche los contenedores y los contenidos no utilizados de acuerdo con las normativas de seguridad oficiales de su zona Para obtener m s informaci n consulte las hojas de datos de seguridad de este kit en support illumina com sds ilmn Tiempo estimado Duraci n total 20 minutos Tiempo de participaci n activa 20 minutos Consumibles Art culo Cantidad Almacenamiento Suministrado por Mezcla de extensi n 1 tubo Entre 25 C Ilumina ligadura y 15 C Tamp n de lavado 1 botella Ente Ilumina restrictivo Tamp n de lavado 1 tubo Entre 2 C y 8 C Ilumina universal Placa del filtro 1 placa Entre lose Ilumina y 30 C 9 O N de referencia 15038346 Rev A ESP Art culo Collar adaptador Placa MIDI Cubetas Preparaci n Cantidad 1 placa 1 placa Seg n sea necesario Almacenamiento Entre 15 C y 30 C Entre 15 C y WC Entre 15 C y 30 C Suministrado por Ilumina Usuario Usuario 1 Retire la Me
14. del ordenador Teclados Limpieza diaria del rea de posamplificaci n Si se reduce la cantidad de producto de PCR en el rea de posamplificaci n se contribuye a reducir el riesgo de contaminaci n en el rea de preamplificaci n La limpieza diaria del rea de posamplificaci n con una soluci n de hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 ayuda a lograrlo Identifique las reas de posamplificaci n que constituyan el mayor riesgo de contaminaci n y l mpielas con una soluci n de hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 todos los d as Las reas de alto riesgo pueden ser entre otros los siguientes componentes Cicladores t rmicos Espacio de la mesa utilizado para procesar ADN amplificado Mangos de puertas Mangos de las puertas de los refrigeradores o los congeladores Rat n del ordenador Teclados Limpieza semanal de todas las reas del laboratorio Una vez a la semana realice una limpieza profunda de las reas de preamplificaci n y posamplificaci n con una soluci n de hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 Limpie todas las partes superiores de las mesas y las superficies del laboratorio Limpie todos los instrumentos que no se limpien diariamente Limpie bien el suelo del laboratorio Aseg rese de haber formado correctamente al personal responsable de la limpieza semanal sobre la prevenci n de la contaminaci n de productos de PCR Elementos que caen al suelo El suelo est contaminado con produ
15. lisis Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx z T sopnoajonuoblio sp odn 16 ap UOINepuaqlH Procedimiento 1 Asigne la etiqueta HYB_Plate_ID HYB_Placa_ID a una nueva placa de PCR de 96 pocillos 2 A ada 5 ul de muestra o control a 50 ng ul 250 ng total en los pocillos correspondientes de la placa HYB Siga la disposici n de placas generada para una selecci n correcta de los pocillos NOTA Verifique que la disposici n de muestras de ADN y las posiciones de controles positivos y negativos coincidan con el gr fico de la placa 3 Con una pipeta multicanal a ada 5 ul de Grupo de oligonucle tidos del ensayo de secuenciaci n cl nica de fibrosis qu stica en todos los pocillos que contienen ADN gen mico Cambie las puntas despu s de cada columna para evitar la contaminaci n cruzada 4 Con una pipeta multicanal a ada 40 ul de Tamp n de hibridaci n en cada muestra de la placa HYB Pipetee con cuidado arriba y abajo entre tres y cinco veces para mezclar Cambie las puntas despu s de cada columna para evitar la contaminaci n cruzada NOTA Aseg rese de que se hayan disuelto todos los cristales y precipitados en el Tamp n de hibridaci n NOTA No mezcle Grupo de oligonucle tidos del ensayo de secuenciaci n cl nica de fibrosis qu stica y Tamp n de hibridaci n para el almacenamiento Al combinarse Grupo de oligonucle tidos del ensayo de secuenciaci
16. para garantizar una aspiraci n completa y evitar la formaci n de burbujas de aire e Transfiera las columnas restantes desde la placa del filtro a la placa AMP de una manera similar Se deben cambiar las puntas despu s de cada columna para evitar la contaminaci n cruzada entre ndices y muestras f Una vez transferidas todas las muestras se puede desechar la placa MIDI de recogida de residuos de la FPU El collar adaptador met lico se debe limpiar y guardar para su uso en el futuro 7 Cubra la placa AMP con el sello para placas adecuado y aseg rela con un rodillo de goma 8 Centrifugue a 1000 x g a 20 C durante un minuto 9 Transfiera la placa AMP al rea de posamplificaci n 10 Realice el proceso de PCR siguiendo este programa en un ciclador t rmico 95 C durante 3 minutos 25 ciclos de 95 C durante 30 segundos 62 C durante 30 segundos 72 C durante 60 segundos 72 C durante 5 minutos Mantenga la temperatura a 10 C PUNTO DE DETENCI N DE SEGURIDAD Si no se procede de manera inmediata a la limpieza de PCR la placa AMP puede permanecer en el ciclador t rmico toda la noche o se puede almacenar a una temperatura de 2 C a 8 C hasta 48 horas Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 4 Hd U QPeoyduy Limpieza de PCR Este proceso utiliza las Bolas de limpieza de PCR para purificar los productos de PCR de los dem s componentes de las reacciones
17. reci n preparado tal y como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 200 ul de etanol al 80 reci n preparado en cada pocillo de muestra Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas En este momento no debe resuspender las bolas b Incube la placa en el soporte magn tico durante un m nimo de 30 segundos O hasta que el sobrenadante se distinga con claridad c Extraiga y deseche con cuidado el sobrenadante Con la placa CLP en el soporte magn tico realice un segundo lavado con etanol como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 200 ul de etanol al 80 reci n preparado en cada pocillo de muestra b Incube la placa en el soporte magn tico durante un m nimo de 30 segundos O hasta que el sobrenadante se distinga con claridad c Extraiga y deseche con cuidado el sobrenadante Utilice una pipeta multicanal P20 con configuraci n de pipeteo a 20 ul para extraer el exceso de etanol Retire la placa CLP del soporte magn tico y deje secar las bolas durante 10 minutos Con una pipeta multicanal a ada 30 ul de Tamp n de eluci n en cada muestra y a continuaci n agite brevemente Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas Selle la placa con un sello adhesivo para placas Agite la placa CLP en un agitador de microplacas a 1800 rpm durante dos minutos NOTA Aseg rese de que todas l
18. sello de pel cula de aluminio y sustit yalo por la tapa de la placa del filtro Se recomienda retirar el sello de pel cula de aluminio antes del centrifugado para garantizar el drenaje ptimo del sobrenadante de la reacci n en la placa de residuos Centrifugue la FPU a 2400 x g a 20 C durante dos minutos Con una pipeta multicanal a ada 25 ul de NaOH 0 05 N en cada pocillo de muestra de la placa del filtro Aseg rese de que las puntas de las pipetas entren en contacto con la membrana y a continuaci n pipetee NaOH arriba y abajo cinco o seis veces Debe cambiar las puntas tras cada columna Cubra e incube la placa del filtro a temperatura ambiente durante cinco minutos Mientras la placa del filtro se incuba utilice una pipeta multicanal para transferir 22 ul de la soluci n de trabajo de PCR a cada pocillo de la placa AMP que contiene cebadores de ndice Cambie las puntas entre muestras 4 O N de referencia 15038346 Rev A ESP 6 Transfiera muestras eluidas desde el filtro hasta la placa AMP como se indica a continuaci n a Configure una pipeta multicanal P20 a 20 ul b Pipetee las muestras en la primera columna de la placa del filtro arriba y abajo cinco o seis veces c Transfiera 20 ul desde la placa del filtro a la columna correspondiente de la placa AMP d Pipetee con cuidado arriba y abajo cinco o seis veces para combinar bien el ADN con la soluci n de trabajo de PCR NOTA Incline ligeramente la placa FPU
19. Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx PARA USO DIAGN STICO IN VITRO PROPIEDAD DE ILLUMINA N de referencia 15038346 Rev A ESP Abril de 2014 Introducci n Primeros pasos Flujo de trabajo del ensayo Preparaci n de la hoja de muestras de MiSeqDx Hibridaci n de grupo de oligonucle tidos Eliminaci n de oligonucle tidos sin ligar Extensi n ligadura de oligonucle tidos ligados Amplificaci n PCR Limpieza de PCR Normalizaci n de bibliotecas Agrupaci n de bibliotecas Pasos siguientes Asistencia t cnica 21 22 26 30 35 37 42 46 51 57 illumina Este documento y su contenido son propiedad de Illumina Inc y sus afiliados Illumina y est n previstos solamente para el uso contractual de sus clientes en conexi n con el uso de los productos descritos en l y no para ning n otro fin Este documento y su contenido no se utilizar n ni distribuir n con ning n otro fin ni tampoco se comunicar n divulgar n ni reproducir n en ninguna otra forma sin el consentimiento previo por escrito de Illumina Illumina no transfiere mediante este documento ninguna licencia bajo sus derechos de patente marca comercial copyright ni derechos de autor ni similares derechos de terceros Para asegurar el uso correcto y seguro de los productos descritos en este documento personal cualificado y adecuadamente capacitado debe seguir las instrucciones incluidas en este de man
20. Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx T Componente Mezcla de extensi n ligadura Cebadores de ndice C A503 D A504 y E A505 Cebadores de ndice 1 A701 2 A702 y 10 A710 Polimerasa de PCR Mezcla maestra de PCR Volumen Cantidad de llenado 1 tubo 4 8 ml 1 tubo 192 ul por cebador 1 tubo 128 ul por cebador 1 tubo 56 ul 1 tubo 2 8 ml Principios activos Soluci n acuosa tamponada que contiene una mezcla patentada de ADN polimerasas ADN ligasa y dNTP Cebadores de PCR con secuencias de ndice y adaptadores de secuenciaci n Cebadores de PCR con secuencias de ndice y adaptadores de secuenciaci n ADN polimerasa patentada Soluci n acuosa tamponada que contiene sales y ANTP Tabla 2 Reactivos de posamplificaci n de la caja 1B Componente Diluyente de normalizaci n de bibliotecas Tamp n de diluci n de biblioteca Control interno PhiX Volumen Cantidad de llenado 1 tubo 4 6 ml 1 tubo 4 5 ml 1 tubo 10 ul Principios activos Soluci n acuosa tamponada que contiene sales 2 mercaptoetanol y formamida Soluci n acuosa tamponada Soluci n acuosa tamponada que contiene ADN gen mico PhiX Almacenamiento Entre 25 C y 15 C Entre 25 C y 15 C Entre 25 C y 15 C Entre 25 C y 15 C Entre 25 C y 15 C Almacenamiento Entre 25 C y 15 C Entre 25 C y 15 C Entre 25
21. a biblioteca Control interno PhiX de 1 nM Biblioteca Control interno PhiX de 2 nM 10 ul NaOH 0 1 N 10 ul 5 2 N de referencia 15038346 Rev A ESP 3 Agite brevemente para mezclar la soluci n de la biblioteca Control interno PhiX de 1 nM 4 Centrifugue la soluci n de plantilla a 280 x g a 20 C durante un minuto 5 Inc bela durante 4 5 minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar la biblioteca Control interno PhiX en cadenas individuales 6 A ada el siguiente volumen de Tamp n de diluci n de biblioteca previamente refrigerado en el tubo que contiene la biblioteca Control interno PhiX desnaturalizada para obtener una biblioteca Control interno PhiX de 20 pM Biblioteca Control interno PhiX desnaturalizada 20 ul Tamp n de diluci n de biblioteca enfriado previamente 980 ul p NOTA Puede almacenar la biblioteca Controlinterno PhiX de 20 pM desnaturalizada hasta tres semanas a una temperatura de entre 25 C y 15 C como al cuotas de un solo uso Despu s de tres semanas los n meros de grupos tienden a disminuir Preparaci n del cartucho de reactivo Las instrucciones siguientes describen c mo descongelar el cartucho de reactivo con un ba o de agua a temperatura ambiente Este m todo conlleva aproximadamente una hora 1 Extraiga el cartucho de reactivo almacenado a una temperatura de entre 25 C y 15 C 2 Sumerja el cartucho de reactivo en un ba o de agua con suficiente agua desionizada a temper
22. acas y res rvela L NOTA Tras su uso almacene la placa SGP sellada a una temperatura de entre 25 C y 15 C La placa SGP sellada permanece estable hasta tres d as Combine y transfiera el contenido de la gradilla de ocho tubos de PCR al tubo PAL Mezcle bien el tubo PAL agit ndolo Asigne la etiqueta DAL_Plate_ID DAL_Placa_ID a un tubo Eppendorf nuevo A ada 585 ul de Tamp n de diluci n de biblioteca en el tubo DAL A ada 6 ul de 20 pM de Control interno PhiX en el tubo DAL Con la misma punta pipetee arriba y abajo entre tres y cinco veces para enjuagar la punta y garantizar una transferencia completa Transfiera 9 ul de PAL al tubo DAL que contiene Tamp n de diluci n de biblioteca Con la misma punta pipetee arriba y abajo entre tres y cinco veces para enjuagar la punta y garantizar una transferencia completa Mezcle la DAL agitando el tubo tan r pido como pueda NOTA k Si desea guardar el contenido de PAL restante para su uso en el futuro almacene el tubo PAL a una temperatura de entre 25 C y 15 C La PAL almacenada permanece en buenas condiciones durante tres d as La DAL de la biblioteca diluida debe estar reci n preparada y debe utilizarse de manera inmediata para la carga de MiSeqDx El almacenamiento de DAL reducir considerablemente la densidad de grupos Centrifugue el tubo DAL a 1000 x g a 20 C durante un minuto para recoger el contenido DO sexajolalq ap uoinedn By 14 Con un bloq
23. al P20 con configuraci n de pipeteo a 20 ul para extraer el exceso de Lavado de normalizaci n de bibliotecas Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx A 9 sexa 01q q Sp UOIDezIpeuuON 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Retire la placa LNP del soporte magn tico y a ada 30 ul de NaOH 0 1 N en cada pocillo para eluir la muestra Selle la placa LNP con un sello adhesivo para placas Agite la placa LNP en un agitador de microplacas a 1800 rpm durante cinco minutos Durante los cinco minutos de eluci n asigne la etiqueta SGP_Plate_ID SGP_ Placa_ID a una nueva placa de PCR de 96 pocillos A ada 30 ul de Tamp n de almacenamiento de biblioteca a cada pocillo que se debe utilizar en la placa SGP Tras la eluci n de cinco minutos aseg rese de que todas las muestras de la placa LNP est n resuspendidas por completo Si las muestras no est n completamente resuspendidas pipetee con cuidado las muestras arriba y abajo o golpee ligeramente la placa contra la mesa para resuspender las bolas y a continuaci n agite cinco minutos m s Coloque la placa LNP en el soporte magn tico durante un m nimo de dos minutos Con una pipeta multicanal con configuraci n de pipeteo a 30 ul transfiera el sobrenadante de la placa LNP a la placa SGP Pipetee con cuidado arriba y abajo cinco veces para mezclar NOTA En caso de aspirar bolas con las puntas sin darse cuenta co
24. as muestras est n resuspendidas por completo Si hay muestras cuyas bolas no est n completamente resuspendidas pipetee con cuidado arriba y abajo para resuspender las bolas y repita los dos pasos anteriores 4 4 N de referencia 15038346 Rev A ESP 19 20 21 22 23 24 Incube a temperatura ambiente de 15 C a 30 C durante dos minutos Coloque la placa CLP en el soporte magn tico durante un m nimo de dos minutos o hasta que el sobrenadante se distinga con claridad Asigne la etiqueta LNP_Plate_ID LNP_Placa_ID a una nueva placa MIDI Con una pipeta multicanal P20 y puntas finas transfiera con cuidado 20 ul del sobrenadante de la placa CLP a la placa LNP Cambie las puntas entre muestras para evitar la contaminaci n cruzada p NOTA En caso de aspirar bolas con las puntas sin darse cuenta coloque las bolas de nuevo en la placa deje reposar la placa sobre el soporte magn tico durante dos minutos y confirme que el sobrenadante se distingue con claridad Opcional Transfiera los 10 ul de sobrenadante restante de la placa CLP a una nueva placa y asigne una etiqueta a la placa que incluya un nombre de experimento y la fecha Almacene la placa a una temperatura de entre 25 C y 15 C hasta la finalizaci n del experimento de secuenciaci n y el an lisis de los datos Los productos de PCR limpios se pueden utilizar con fines de soluci n de problemas en caso de que se produzcan fallos en las muestras Si se de
25. atura ambiente como para sumergir la base del cartucho de reactivo hasta la l nea de agua impresa en este Tenga en cuenta que el agua no debe sobrepasar la l nea de nivel m ximo de agua Figura 7 L nea de nivel m ximo de agua Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 5 3 sexajolaq ep uoivedn By 3 Descongele el cartucho de reactivo en el ba o de agua a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora o hasta que se haya descongelado por completo 4 Saque el cartucho del ba o de agua y d unos suaves toques en la mesa para que el agua salga de la base del cartucho Seque la base del cartucho Aseg rese de que no haya salpicaduras de agua en la parte superior del cartucho de reactivo Inspecci n del cartucho de reactivo 1 Invierta el cartucho de reactivo diez veces para mezclar los reactivos descongelados y a continuaci n compruebe visualmente que todas las posiciones est n descongeladas NOTA j Es esencial que los reactivos del cartucho est n completamente descongelados y mezclados para garantizar una correcta secuenciaci n 2 Inspeccione visualmente el reactivo de la posici n 1 para asegurarse de que se haya mezclado completamente y no presente precipitados 3 Golpee suavemente el cartucho en la mesa para reducir las burbujas de aire en los reactivos E NOTA Los tubos del dispensador de MiSeqDx acceden al fondo de cada dep sito para
26. bre este software consulte la Gu a del usuario de MiSeg Reporter n de referencia 15038356_ESP Herramientas de seguimiento Illumina proporciona las siguientes herramientas para la orientaci n y el seguimiento de muestras en el laboratorio Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 5 Se puede utilizar el formulario de seguimiento de laboratorio para registrar informaci n como por ejemplo el nombre del operador la informaci n de la muestra y del ndice las horas de inicio y detenci n los n meros de los lotes de reactivos y los c digos de barras Gestor de la lista de trabajos de Illumina se utiliza para crear la hoja de muestras mediante una aplicaci n basada en asistente Gestor de la lista de trabajos de Illumina ofrece una funci n para el registro de par metros de la placa de muestras tales como el ID de la muestra los ndices dobles y otras caracter sticas aplicables al experimento d NOTA Puede descargar los documentos del Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx de Illumina anteriores en el sitio web de Illumina en http support illumina com Vaya a la p gina de asistencia t cnica de Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx de Illumina y haga clic en la ficha Documentation z Literature Documentaci n y literatura N de referencia 15038346 Rev A ESP Primeros pasos Esta secci n describe el conten
27. ces apropiados Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 2 3 xqb sI ep sesan sp eloy e sap uorceJedeld 2 Opcional Para registrar informaci n m s detallada sobre las muestras introduzca un nombre y una descripci n de la muestra 3 Opcional Para identificar controles en la placa seleccione Negative Negativo o Positive Positivo en el men desplegable Control Control 4 Vaya a la ficha Plate Graphic Gr fico de placa y utilice la opci n Copy to Clipboard Copiar al portapapeles o Print Imprimir para capturar una imagen de la placa de muestras Figura 4 Ficha Plate Graphic Gr fico de placa del Gestor de la lista de trabajos de Illumina Illumina Worklist Manager Please Enter Sample Information CF Cinical Sequencing Assay Fite indicates inva raid samples CFTR Screening Tabe Pite Pete Graphe 2 3 4 5 6 7 3 e L Le JU JU Je e o 1 AE J IE I 5 Seleccione Finish Finalizar Producci n de muestras y representaci n de ndices Para el Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx de Illumina la producci n de muestras por experimento de MiSeqDx es de ocho muestras Los cebadores de ndice utilizados durante la amplificaci n PCR se deben elegir en funci n del rendimiento final de muestras que se desee con el fin de garantizar la diversidad de la
28. cia 15038346 Rev A ESP 5 Aseg rese de que la fecha coincida con la fecha de inicio del experimento La fecha actual se muestra de forma predeterminada 6 Seleccione Next Siguiente Se abre la pantalla Enter Sample Information Introducir informaci n de muestras Figura 3 Pantalla Enter Sample Information Introducir informaci n de muestras del Gestor de la lista de trabajos de Illumina Illumina Worklist Manager Please Enter Sample Information CF Clinical Sexuenting Assay Plate SamolelD SampleName haer I7 Indes2 115 Conto 470 4503 A7 A7 A72 A72 A72 A70 A70 Introducci n de informaci n de la muestra 1 En la ficha Table Tabla o Plate Placa introduzca la siguiente informaci n de cada pocillo de muestra a Sample ID ID de muestra Introduzca un ID de muestra nico El ID de muestra se utiliza para realizar el seguimiento de la muestra desde la preparaci n hasta la secuenciaci n y el an lisis Aunque el ID suele ser un c digo de barras se acepta cualquier valor b Index 1 ndice 1 e Index 2 ndice 2 Especifique el adaptador de ndices que se utilizar para cada lectura del ndice Illumina recomienda utilizar combinaciones que den como resultado al menos una base A o C rojo y al menos una base G o T verde en cada ciclo J NOTA Consulte Producci n de muestras y representaci n de ndices en la p gina 24 para obtener ayuda a la hora de elegir los ndi
29. convenientemente preparado para reducir el riesgo de contaminaci n de productos de PCR Separaci n f sica de reas de preamplificaci n y posamplificaci n Separe f sicamente el espacio del laboratorio en el que se realizan los procesos de preamplificaci n extracci n cuantificaci n y normalizaci n de ADN del espacio del laboratorio en el que se realizan los procesos de posamplificaci n No utilice nunca el mismo fregadero para limpiar las cubetas de preamplificaci n y de posamplificaci n 1 A N de referencia 15038346 Rev A ESP No utilice nunca el mismo sistema de purificaci n de agua en los procesos de preamplificaci n y posamplificaci n Almacene todos los suministros utilizados en los protocolos del rea de preamplificaci n y transfi ralos al rea de posamplificaci n seg n resulte necesario Equipo y suministros espec ficos Utilice conjuntos completos e independientes de equipos y suministros pipetas centrifugadoras hornos bloques de calor etc en los procesos de laboratorio de preamplificaci n y posamplificaci n y no los intercambie nunca entre procesos Emplee reas de almacenamiento independientes congeladores y frigor ficos para consumibles de preamplificaci n y de posamplificaci n sosed soJeuulq Dado que los reactivos de preamplificaci n y los de posamplificaci n se suministran juntos es importante que los desembale en el rea del laboratorio de preamplificaci n y que a continuaci n
30. cto de PCR que se transfiere a los zapatos de las personas que proceden del rea de posamplificaci n por lo tanto cualquier elemento 1 6 N de referencia 15038346 Rev A ESP que caiga al suelo debe tratarse como un objeto contaminado Los elementos desechables que se han ca do al suelo tales como tubos vac os puntas de pipetas guantes y perchas de batas de laboratorio deben desecharse Los art culos no desechables que se caigan al suelo como las pipetas o un contenedor de muestras importante deben limpiarse concienzudamente de manera inmediata con una soluci n de hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 para evitar la contaminaci n de productos de PCR Limpie cualquier superficie del laboratorio que haya entrado en contacto con el elemento contaminado Las personas que manipulen cualquier objeto desechable o no que haya ca do al suelo siempre deber n desechar los guantes que est n utilizando y utilizar unos nuevos Precauciones Siga estas recomendaciones a la hora de preparar bibliotecas para la secuenciaci n con este protocolo Garant a de la homogeneidad Utilice pipetas multicanal Para garantizar la homogeneidad entre las muestras utilice una pipeta multicanal siempre que sea posible Calibre las pipetas con regularidad Coherencia para preparaciones de muestras de menor tama o Cada tubo de reactivo que se suministra con el kit contiene volumen suficiente para generar resultados utilizando pipetas manuales y
31. cubetas de reactivos conforme a las t cnicas de laboratorio est ndar Para garantizar la administraci n del volumen de reactivo pertinente pipetee un nico reactivo en cada pocillo o pipetee con una pipeta multicanal en una gradilla de ocho tubos de PCR Manipulaci n de bolas magn ticas Utilice a temperatura ambiente Deje que las bolas alcancen la temperatura ambiente antes de su utilizaci n Agite hasta que est bien suspendido Inmediatamente antes de su uso agite las bolas hasta que est n bien suspendidas y el color sea homog neo Mezcle las muestras completamente Despu s de a adir las bolas a las muestras mezcle pipeteando arriba y abajo diez veces Illumina tambi n recomienda utilizar un agitador para mezclar bien las muestras Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 1 T sosed soJ wlld Permita la m xima ligadura Para obtener unos resultados ptimos incube las mezclas de bolas muestras a temperatura ambiente durante todo el per odo que se indique en el protocolo Aspire lentamente la soluci n aclarada Despu s de colocar la placa en el soporte magn tico espere a que la soluci n se aclare antes de continuar Mantenga la placa en el soporte magn tico cuando aspire lentamente la soluci n aclarada y evite alterar las bolas apartadas Procedimientos para evitar la contaminaci n cruzada Cambie las puntas entre las dispensaciones de reactivos y muestras Utilice
32. decuada del protocolo del Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx Se ha concebido para servir de complemento y no con el fin de reemplazar a la informaci n del prospecto Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 3 poxul uolon C mo funciona el ensayo Se ha dise ado un par de oligonucle tidos de fibrosis qu stica para cada amplic n de CFTR La hibridaci n de estos oligonucle tidos en ADN gen mico se produce en una placa de 96 pocillos seguida de la extensi n y la ligadura para formar las plantillas de ADN que se componen de las regiones de inter s flanqueadas por secuencias del cebador universal Con los cebadores indexados suministrados con el kit las plantillas de ADN se amplifican mediante PCR se agrupan en un solo tubo y se secuencian en el instrumento MiSeqDx P7 ndice 1 UO0U gt Sonda Regi n de Sonda s personalizada 1 inter s personalizada 24 A eeraamo A MN AA Becaria a A Sonda Sonda personalizada 2 personalizada 1 ndice 2 P5 P7 ndice 1 ndice 2 PS Hibridaci n de sondas de oligonucle tidos personalizados Extensi n y ligadura Adici n de ndices y adaptadores de secuenciaci n mediante PCR Amplic n final listo para secuenciaci n con MiSeq N de referencia 15038346 Rev A ESP Descripci n general del proceso El proceso del Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fib
33. diagrama se muestra el flujo de trabajo del Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx de Illumina Los puntos de detenci n segura se marcan entre los pasos Figura 1 Flujo de trabajo del Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx de Illumina Horacion deronipa d Limpieza mediante PCR oligonucle tidos q Tiempo de perteipaci n activa 20 mn is oral Procesamiento 30 min Reactivos Tamp n de eluci n Grupo de oligonucie tidos del ensayo de _ secuenciaci n c nica de fibrosis qu stica de rc incoada Hybridization Butter Resultado Resultado RCA YO Placa LNP l Eliminaci n de Normalizaci n de bibliotecas sin ligar Tiempo de participaci n activa 30 min Tiempo de participaci n activa 20 min n Reactivos Roactivos Dilyyente de normalizaci n de bibliotecas Tamp n de lavado meticuloso de biblioteca Tamp n de lavado universal Lavado de normalizaci n de bibliotecas Resultado Tamp n de almacenamiento de biblioteca Placa de la FPU EtOH NaOH Resultado Ligadura de extensi n de ligados Terea Kanaane aB ma a Agrupaci n de bibliotecas Reactivos Tiempo de participaci n activa 10 min Mezcla de ligadura de extensi n Reactivos Resultado Tamp n de diluci n de biblioteca Placa de la FPU Resultado Tubos DAL y PAL I Amplificaci n PCR Tiempo de participaci n activa 30 min Duraci n del ciclo 90 min Reactivos Mezcla maestra de PCR Polimerasa PCR
34. dos de la fibrosis qu stica que contiene oligonucle tidos ascendentes y descendentes espec ficos del gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qu stica CFTR se hibrida en muestras de ADN gen mico ADVERTENCIA y Este conjunto de reactivos contiene formamida una amida alif tica que es una d toxina reproductiva probable Evite su inhalaci n o ingesti n o el contacto con la piel o los ojos pues podr an producirse lesiones Deseche los contenedores y los contenidos no utilizados de acuerdo con las normativas de seguridad oficiales de su zona Para obtener m s informaci n consulte la hoja de datos de seguridad de este kit en support illumina com sds ilmn Tiempo estimado Duraci n total 1 hora 35 minutos Tiempo de participaci n activa 15 minutos Consumibles Art culo Cantidad Almacenamiento Suministrado por Grupo de oligonucle tidos 1 tubo Entre 25 C Ilumina del ensayo de secuenciaci n y 15 C cl nica de fibrosis qu stica Tamp n de hibridaci n 1 tubo Entre 252 Illumina yaC ADN gen mico se 5 ul Entre 25 C Usuario recomienda 50 ng ul y 15 C Placa de PCR con faldones 1 placa Entre l5 SC Usuario de 96 pocillos yA E 2 6 N de referencia 15038346 Rev A ESP Art culo Cantidad Almacenamiento Suministrado por Sello de pel cula de 2 juntas Entre 15 C Usuario aluminio adhesiva y 30 C Cubetas est riles Seg n sea Entre 192 Usuario necesario vanas Preparaci n 1
35. e precisa un conjunto independiente en el rea de preamplificaci n Se precisa el uso de pipetas de precisi n para garantizar la administraci n precisa de reactivo y muestra Se pueden utilizar pipetas de un solo canal o multicanal si se calibran con frecuencia y ofrecen precisi n del 5 del volumen indicado 7 Consumibles Se precisan los consumibles siguientes Placas de PCR con faldones de 96 pocillos de 0 2 ml de polipropileno o equivalente Placas de almacenamiento de 96 pocillos de 0 8 ml placas MIDI NOTA Aseg rese de que la placa de 96 pocillos sea compatible con el soporte magn tico Tubos c nicos de 15 ml Tubos de microcentr fuga Eppendorf recomendados con cierre de rosca Gradillas de ocho tubos de PCR Recipientes de soluci n de PVC sin ADNasa ni ARNasa cubeta Sellos de pel cula de aluminio adhesiva Sellos adhesivos para placas Puntas de pipeta resistentes a los aerosoles Prevenci n de contaminaci n de productos de PCR El proceso de PCR se suele utilizar en el laboratorio para amplificar secuencias de ADN espec ficas A menos que se siga una higiene de laboratorio adecuada los productos de PCR pueden contaminar los reactivos los instrumentos y las muestras de ADN gen mico lo que se traduce en unos resultados imprecisos y poco fiables La contaminaci n de productos de PCR puede detener los procesos de laboratorio y retrasar de forma significativa las operaciones normales Aseg rese de que el laboratorio est
36. ecomendadas respectivas Para preservar la estabilidad no se deben congelar las bolas de Bolas de biblioteca ni mezclarlas con Diluyente de normalizaci n de bibliotecas si no se van a utilizar de manera inmediata 4 Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de la soluci n de trabajo Diluyente de normalizaci n de bibliotecas Bolas de biblioteca combinada en cada pocillo de la placa LNP que contiene bibliotecas Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas 5 Selle la placa LNP con un sello adhesivo para placas 6 Agite la placa LNP en un agitador de microplacas a 1800 rpm durante 30 minutos 4 NOTA Esta incubaci n de 30 minutos es fundamental para garantizar una normalizaci n de bibliotecas adecuada Las incubaciones superiores o inferiores a 30 minutos pueden afectar a la representaci n de bibliotecas y la densidad de grupos 7 Coloque la placa en un soporte magn tico durante un m nimo de dos minutos o hasta que el sobrenadante se distinga con claridad A 3 N de referencia 15038346 Rev A ESP 8 Con la placa LNP en el soporte magn tico utilice una pipeta multicanal con configuraci n de pipeteo a 80 ul para extraer y desechar con cuidado el sobrenadante en un contenedor de residuos peligrosos adecuado NOTA En caso de aspirar bolas con las puntas sin darse cuenta coloque las bolas de nuevo en la placa y deje reposar la placa durante dos minutos o hasta que el s
37. ediante una ADN ligasa Esto conlleva la formaci n de productos que contienen las regiones de inter s objetivo flanqueadas por las secuencias necesarias para la amplificaci n Tiempo estimado Duraci n total 50 minutos Tiempo de participaci n activa 5 minutos Consumibles Art culo Cantidad Almacenamiento Suministrado por Mezcla de extensi n 1 tubo Entre 25 C Ilumina ligadura y 15 C Sello de pel cula de 1 sello Enmenbk E Usuario aluminio adhesiva y 30 C Cubetas Seg n sea Entre 15 C Usuario necesario y 30 C Procedimiento 1 Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de Mezcla de extensi n ligadura en cada pocillo de muestra de la placa del filtro La reacci n de extensi n ligadura se produce en la membrana de la placa del filtro Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 3 5 sopebBl sopnosjonuoblo sp enmpebl uosuajx3 2 Selle la placa del filtro con pel cula de aluminio adhesiva y a continuaci n c brala con la tapa para asegurar la pel cula durante la incubaci n 3 Incube todo el conjunto de la FPU en la incubadora precalentada a 37 C durante 45 minutos 4 Mientras la placa de la FPU se incuba prepare la placa AMP tal y como se describe en la secci n siguiente 9 6 N de referencia 15038346 Rev A ESP Amplificaci n PCR En este paso l
38. entrifugue a 2400 x g a 20 C durante cinco minutos c Siel tamp n de lavado no se drena completamente vuelva a centrifugar la placa del filtro a 2400 x g a 20 C durante cinco minutos Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 3 3 Jepi uis sSOprosj9nuobBlo sp vol euuly 7 Deseche todo el flujo que contiene formamida recogido hasta este punto en un contenedor de residuos peligrosos adecuado y a continuaci n vuelva a montar la FPU Se puede volver a utilizar la misma placa MIDI para el resto del proceso de preamplificaci n 8 Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de Tamp n de lavado universal en cada pocillo de muestra Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas 9 Cubra la placa del filtro con la tapa y centrifugue a 2400 x g a 20 C durante diez minutos NOTA Aseg rese de que se haya drenado todo el l quido tras el centrifugado Repita el centrifugado en caso necesario El tamp n de lavado residual puede inhibir las reacciones enzim ticas posteriores 9 4 N de referencia 15038346 Rev A ESP Extensi n ligadura de oligonucle tidos ligados Este proceso conecta los oligonucle tidos ascendentes y descendentes hibridados Una ADN polimerasa se extiende desde el oligonucle tido ascendente hasta la regi n objetivo Despu s se produce la ligadura al extremo 5 del oligonucle tido descendente m
39. era rigurosa y expresa Se debe leer y entender completamente todo el contenido de este documento antes de usar estos productos SINO SE LEE COMPLETAMENTE EL DOCUMENTO Y NO SE SIGUEN EXPRESAMENTE TODAS LAS INSTRUCCIONES DESCRITAS EN ESTE PODR AN PRODUCIRSE DA OS AL PRODUCTO LESIONES A LAS PERSONAS INCLUIDOS LOS USUARIOS Y OTROS Y DA OS A OTRA PROPIEDAD ILLUMINA NO ASUME RESPONSABILIDAD ALGUNA QUE SURJA DEL USO INCORRECTO DE LOS PRODUCTOS AQU DESCRITOS INCLUIDAS LAS PIEZAS O EL SOFTWARE NI DEL USO DE DICHOS PRODUCTOS FUERA DEL MBITO DE LAS LICENCIAS EXPRESAS ESCRITAS O LOS PERMISOS OTORGADOS POR ILLUMINA EN CONEXI N CON LA ADQUISICI N DE DICHOS PRODUCTOS POR PARTE DE LOS CLIENTES PARA USO DIAGN STICO IN VITRO O 2012 2014 Illumina Inc Todos los derechos reservados Ilumina y MiSeqDx son marcas comerciales o marcas comerciales registradas de Illumina Inc Todas las dem s marcas y nombres mencionados en el presente documento pertenecen a sus respectivos propietarios AMPure Beckman y Beckman Coulter son marcas comerciales o marcas comerciales registradas de Beckman Coulter Inc Introducci n Uso previsto El Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx de Illumina es un sistema de diagn stico in vitro de secuenciaci n selectiva que secuencia de nuevo las regiones codificadoras de prote nas y los l mites de intrones y exones del gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qu
40. idaci n La incubadora debe cumplir con las especificaciones de rendimiento siguientes Rango de temperatura Entre 10 C y 100 C Regulaci n de temperatura 0 2 C Centrifugadora de sobremesa Se precisa una centrifugadora de sobremesa que pueda mantener 20 C Se precisa una centrifugadora independiente en el rea de posamplificaci n Se admite cualquier centrifugadora de placas que alcance las velocidades indicadas del protocolo de 280 a 2400 x g Pipetas de precisi n Se precisa un conjunto de pipetas de precisi n Se precisa un conjunto independiente en el rea de posamplificaci n Se precisa el uso de pipetas de precisi n para garantizar la administraci n precisa de reactivo y muestra Se pueden utilizar pipetas de un solo canal o multicanal si se calibran con frecuencia y ofrecen precisi n del 5 del volumen indicado 1 2 N de referencia 15038346 Rev A ESP 5 Consumibles Se precisan los consumibles siguientes Placas de PCR con faldones de 96 pocillos de 0 2 ml de polipropileno o equivalente NOTA Aseg rese de que la placa de 96 pocillos sea compatible con el soporte magn tico Placas de almacenamiento de 96 pocillos de 0 8 ml placas MIDI Recipiente de soluci n de PVC sin ADNasa ni ARNasa cubeta Sello de pel cula de aluminio adhesiva Sello para placas de PCR adecuado Puntas de pipeta resistentes a los aerosoles sosed soJeuulq Materiales y equipo de la posamplificaci n 1 Ciclador t rmico
41. ido del kit del Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx de Illumina los consumibles y el equipo utilizados las recomendaciones de entrada de ADN y las pr cticas recomendadas que aplicar durante el protocolo Contenido del kit del Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx El kit del Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx de Illumina consta de los siguientes componentes Almacene los componentes del kit a la temperatura especificada y en las reas de preamplificaci n y posamplificaci n designadas sosed soJeuuld Dado que los reactivos de preamplificaci n y los de posamplificaci n se suministran juntos es importante que desembale los reactivos en el rea del laboratorio de preamplificaci n y que a continuaci n traslade los reactivos de posamplificaci n al rea de almacenamiento de posamplificaci n adecuado Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx caja 1 Tabla 1 Reactivos de preamplificaci n de la caja 1A Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Grupo de 1 tubo 600 ul Soluci n acuosa tamponada Entre 25 C oligonucle tidos que contiene oligonucle tidos y 15 C del ensayo de espec ficos para el gen CFTR secuenciaci n cl nica de fibrosis qu stica Tamp n de 1 tubo 4 32ml Soluci n acuosa tamponada Entre 25 C hibridaci n que contiene sales y y 15 C formamida
42. ieza de PCR 10 veces Agite con vigor y a continuaci n vuelva a invertir 10 veces Inspeccione visualmente la soluci n para garantizar que las bolas est n bien resuspendidas Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de Bolas de limpieza de PCR en cada pocillo de la placa CLP Con una pipeta multicanal con configuraci n de pipeteo a 60 ul transfiera todo el producto de PCR de la placa AMP a la placa CLP Cambie las puntas entre muestras Selle la placa CLP con un sello adhesivo para placas Agite la placa CLP en un agitador de microplacas a 1800 rpm durante dos minutos Incube a temperatura ambiente de 15 C a 30 C sin agitar durante 10 minutos Coloque la placa en un soporte magn tico durante un m nimo de dos minutos o hasta que el sobrenadante se distinga con claridad Con la placa CLP en el soporte magn tico y una pipeta multicanal con configuraci n de pipeteo a 100 ul extraiga y deseche con cuidado el sobrenadante Cambie las puntas entre muestras NOTA En caso de aspirar bolas con las puntas sin darse cuenta coloque las bolas Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx A 3 Hd ep ezardur 12 13 14 15 16 17 18 de nuevo en la placa deje reposar la placa sobre el soporte magn tico durante dos minutos y confirme que el sobrenadante se distingue con claridad Con la placa CLP en el soporte magn tico lave las bolas con etanol al 80
43. inuto invirti ndolas de manera intermitente hasta que las bolas se resuspendan y no quede pellet en el fondo del tubo cuando este se invierte Procedimiento 1 A ada 394 ul de Diluyente de normalizaci n de bibliotecas en un tubo nuevo de 15 ml Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 47 sexa 01q q ap UQIODLEZIJEWJON 2 Utilice una pipeta P1000 con configuraci n de pipeteo a 1000 ul para resuspender las Bolas de biblioteca completamente pipeteando arriba y abajo 10 veces NOTA Resulta muy importante resuspender completamente el pellet de las bolas de la biblioteca del fondo del tubo Si utiliza una P1000 se asegurar de que las bolas queden resuspendidas de manera homog nea y de que no quede masa de bolas en el fondo del tubo Esto resulta fundamental para lograr una densidad de grupos homog nea en la celda de flujo 3 Pipetee 72 ul de Bolas de biblioteca en el tubo que contiene Diluyente de normalizaci n de bibliotecas D la vuelta al tubo entre 15 y 20 veces para mezclar bien el contenido 4 NOTA Para resuspender completamente las bolas en el paso 2 se precisa una pipeta P1000 con configuraci n de pipeteo a 1000 ul Mezcle solo las cantidades necesarias de Diluyente de normalizaci n de bibliotecas y Bolas de biblioteca para el ensayo en curso Debe almacenar los restos de Diluyente de normalizaci n de bibliotecas y Bolas de biblioteca por separado a las temperaturas r
44. loque las bolas de nuevo en la placa deje reposar la placa sobre el soporte magn tico durante dos minutos y confirme que el sobrenadante se distingue con claridad Selle la placa SGP con un sello adhesivo para placas y a continuaci n centrifugue a 1000 x g a 20 C durante un minuto PUNTO DE DETENCI N DE SEGURIDAD Si no se procede de manera inmediata a la agrupaci n de bibliotecas y la consiguiente secuenciaci n en MiSeqDx almacene la placa SGP sellada a una temperatura de entre 25 C y 15 C hasta tres d as 5 O N de referencia 15038346 Rev A ESP Agrupaci n de bibliotecas En la preparaci n para la secuenciaci n y la generaci n de grupos se combinan vol menes iguales de bibliotecas normalizadas diluidas en tamp n de hibridaci n y desnaturalizadas mediante calor antes de su secuenciaci n en el instrumento MiSeqDx PhiX se utiliza como control interno para la secuenciaci n Tiempo estimado Duraci n total 10 minutos Tiempo de participaci n activa 10 minutos Consumibles Art culo Cantidad Almacenamiento Suministrado por Tamp n de diluci n de 1 tubo Entre 25 C Ilumina biblioteca y 15 C Control interno PhiX de 10 2l Entre 25 C Ilumina nM y 15 C NaOH 0 1 N reci n 1ml Entre 15 C Usuario preparado y 30 C 1 tamp n TE 8 ul Entre 15E Usuario y 30 C Tubos Eppendorf se 2 tubos Entre 15 C Usuario recomienda con tap n y 30 C roscado Gradilla de ocho tubos de il Entre 15 C
45. luci n acuosa Entre 2 C y 8 C normalizaci n tamponada que contiene de bibliotecas sales 2 mercaptoetanol y formamida Bolas de Soluci n acuosa Entre 2 C y 8 C biblioteca tamponada que contiene bolas paramagn ticas de fase s lida Celda de flujo 6 contenedores Sustrato de cristal con Entre 2 C y 8 C de MiSeqDx oligonucle tidos ligados Ensayo de de manera covalente secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx caja 4 Tabla 6 Reactivos de posamplificaci n de la caja 4 Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Soluci n SBS de 6 botellas 353 1 ml Soluci n acuosa tamponada Entre 2 C y 8 C MiSeqDx PR2 Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica 1 O N de referencia 15038346 Rev A ESP Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx caja 5 Tabla 7 Reactivos de preamplificaci n de la caja 5 Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Placa del filtro 6 placas Placa de microtitulaci n de Entre 15 C polipropileno con una y 30 C membrana de polietersulfona modificada Tabla 8 Reactivos de posamplificaci n de la caja 5 Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Tamp n de Soluci n acuosa tamponada Entre 15 C eluci n y 30 C Tamp n de 1 tubo 3 53m1 Soluci n acuosa tamponada E
46. n cl nica de fibrosis qu stica se vuelve inestable incluso si se almacena congelado 5 Selle la placa HYB con una pel cula de aluminio adhesiva y asegure la junta con un rodillo de goma o una cu a de sellado 6 Centrifugue a 1000 x g a 20 C durante un minuto 7 Coloque la placa HYB en el bloque precalentado a 95 C e inc bela durante un minuto D 8 N de referencia 15038346 Rev A ESP 8 Reduzca la temperatura del bloque precalentado a 40 C y s galo incubando hasta que el bloque de calor alcance los 40 C El tiempo de reducci n es de unos 80 minutos NOTA i Durante la incubaci n la temperatura del bloque de calor desciende gradualmente de 95 C a 40 C Ese proceso suele demorarse unos 80 minutos Esta refrigeraci n gradual es fundamental para una correcta hibridaci n por lo tanto no se recomiendan los cicladores t rmicos para PCR con refrigeraci n activa por ejemplo efecto Peltier o refrigeraci n termoel ctrica para este proceso PUNTO DE DETENCI N DE SEGURIDAD Cuando el bloque de calor alcanza 40 C la placa HYB permanece estable a 40 C durante dos horas Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx D 9 sopnoajonuoblio sp odn 16 ap UOINepuaqlH Eliminaci n de oligonucle tidos sin ligar Este proceso elimina oligonucle tidos sin ligar del ADN gen mico con un filtro con capacidad de selecci n de tama o Dos pasos de lavado con el Tamp n
47. n mico de inicio con ayuda de m todos de espectrometr a UV basados en lecturas de densidad ptica A260 A280 Valoraci n de calidad de ADN Las mediciones de absorbancia a 260 nm se suelen utilizar para cuantificar el ADN El ndice de absorbancia entre 260 nm y 280 nm se utiliza como indicador de la pureza de una muestra Este protocolo est optimizado para un ADN con unos valores de ndice de absorbancia superiores a 1 5 Controles de calidad Las pr cticas recomendadas de laboratorio indican que se incluya una muestra de ADN de control positivo y una muestra de control negativo sin plantilla en cada experimento sosed soJeuulq La muestra de ADN de control positivo debe contar con unas caracter sticas bien definidas y con una mutaci n del gen CFTR conocida Ilumina tambi n recomienda incluir un control salvaje en cada experimento Acr nimos Tabla 9 Acr nimos del Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx de Ilumina Acr nimo Definici n AMP Placa de amplificaci n CIR Placa de limpieza DAL Biblioteca de amplicones diluida ERU Unidad de la placa del filtro HYB Placa de hibridaci n LNP Placa de normalizaci n de bibliotecas NTC Control de plantilla negativo Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 1 9 Acr nimo Definici n Control positivo 20 N de referencia 15038346 Rev A ESP Flujo de trabajo del ensayo En el siguiente
48. na Correo electr nico techsupport illumina com Tabla 12 N meros de tel fono del servicio de asistencia al cliente de Ilumina Zona N mero de contacto Zona N mero de contacto Norteam rica 1 800 809 4566 Irlanda 1 800 812949 Alemania 0800 180 8994 Italia 800 874909 Austria 0800 296575 Noruega 800 16836 B lgica 0800 81102 Pa ses Bajos 0800 0223859 Dinamarca 80882346 Reino Unido 0800 917 0041 Espa a 900 812168 Suecia 20790181 Finlandia 0800 918363 Suiza 0800 563118 Francia 0800 911850 Otros pa ses 44 1799 534000 Hojas de datos de seguridad Las hojas de datos de seguridad est n disponibles en el sitio web de Illumina en support illumina com sds ilmn Documentaci n del producto La documentaci n del producto en PDF est disponible para su descarga en el sitio web de Illumina Vaya a support illumina com seleccione un producto y a continuaci n haga clic en Documentation amp Literature Documentaci n y literatura Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx eo1U99 eloua sisy Ilumina Emergo Europe San Diego 92122 Califomia EE UU Molenstraat15 1 800 809 ILMN 4566 2513 BH La Haya 1 858 202 4566 fuera de Norteam rica Pa ses Bajos techsupport ilumina com www ilumina com
49. ntre 15 C almacenamiento y 30 C de biblioteca Reactivos necesarios no suministrados Reactivos de preamplificaci n gt NaOH 10 N preparaci n a partir de comprimidos o uso de una soluci n est ndar gt Tamp n TE gt Agua sin ARNasa ni ADNasa Reactivos de posamplificaci n gt NaOH 10 N preparaci n a partir de comprimidos o uso de una soluci n est ndar gt Etanol 200 proof para biolog a molecular gt Tamp n TE gt Agua sin ARNasa ni ADNasa Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 1 1 sosed soJeuuld Materiales y equipo Materiales y equipo suministrados vendidos por separado 1 2 3 4 Instrumento MiSeqDx n de cat logo DX 410 1001 Kit TruSeq Index Plate Fixture n de cat logo FC 130 1005 Kit TruSeq Index Plate Fixture amp Collar n de cat logo FC 130 1007 Tapones de recambio para el adaptador de ndices n de cat logo DX 502 1003 Materiales y equipo necesarios no suministrados Materiales y equipo de la preamplificaci n 1 Bloque de calor Se precisa un bloque de calor para una placa de 96 pocillos El bloque de calor debe cumplir con las especificaciones de rendimiento siguientes Los bloques de calor con tapas calientes se pueden utilizar Rango de temperatura Ambiente de 5 C a 99 C Regulaci n de temperatura 0 1 C a 37 C 0 4 C a 60 C Incubadora de muestras Se precisa una incubadora horno de hibr
50. obrenadante se distinga con claridad 9 Retire la placa LNP del soporte magn tico y lave las bolas con Lavado de normalizaci n de bibliotecas como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de Lavado de normalizaci n de bibliotecas en cada pocillo de muestra Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas Selle la placa LNP con un sello adhesivo para placas Agite la placa LNP en un agitador de microplacas a 1800 rpm durante cinco minutos Coloque la placa en el soporte magn tico durante un m nimo de dos minutos O hasta que el sobrenadante se distinga con claridad Extraiga y deseche con cuidado el sobrenadante en un contenedor de residuos peligrosos adecuado 10 Retire la placa LNP del soporte magn tico y repita el lavado con Lavado de normalizaci n de bibliotecas como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de Lavado de normalizaci n de bibliotecas en cada pocillo Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas Selle la placa LNP con un sello adhesivo para placas Agite la placa LNP en un agitador de microplacas a 1800 rpm durante cinco minutos Coloque la placa en el soporte magn tico durante un m nimo de dos minutos Extraiga y deseche con cuidado el sobrenadante en un contenedor de residuos peligrosos adecuado 11 Utilice una pipeta multican
51. os productos de extensi n ligadura se amplifican con cebadores que a aden secuencias de ndice para el multiplexado de muestras as como los adaptadores comunes necesarios para la generaci n de grupos Tiempo estimado Duraci n total Aproximadamente 90 minutos Tiempo de participaci n activa 30 minutos Consumibles Art culo Cantidad Almacenamiento Suministrado por Mezcla maestra de PCR 1 tubo Entre 25 C Ilumina y 15 C Cebadores de ndice C 1 tubo por Entre 252C Ilumina A503 D A504 y E A505 cebador y 525 Cebadores de ndice 1 1 tubo por Entre 25 C Ilumina A701 2 A702 y 10 A710 cebador y 15 C Polimerasa de PCR 1 tubo Entre 252C Illumina yS Sello para placas de PCR 1 Entre 15 C Usuario adecuado y 30 C NaOH 0 05 N reci n Seg n sea Entrellosa Usuario preparado necesario SONAS Placa de PCR con faldones 1 placa Entre 15 C Usuario de 96 pocillos y 30 C Cubetas Seg n sea Entrellose Usuario necesario y0 Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 37 y Od U Deoypduy Preparaci n 1 Prepare NaOH 0 05 N nuevo a adiendo 25 ul de NaOH 10 N a 4975 ul de agua est ril Determine los cebadores de ndice que se deben utilizar de acuerdo con la impresi n del gr fico de la placa de Gestor de la lista de trabajos de Illumina Retire la Mezcla maestra de PCR y los cebadores de ndice adecuados de su almacenamiento a una temperatura de entre
52. rosis qu stica MiSeqDx de Illumina se puede resumir en los siguientes pasos poxul Creaci n de una hoja de muestras UO0IDan En primer lugar prepare una hoja de muestras que utilizar MiSeqDx para identificar cada muestra y su correspondiente ndice Para preparar la hoja de muestras utilice Gestor de la lista de trabajos de Illumina una aplicaci n basada en asistente para el registro del ID de la muestra los ndices y otros par metros aplicables a la placa de 96 pocillos La hoja de muestras tambi n se utiliza como gu a para configurar la placa durante el flujo de trabajo del ensayo Preparaci n de bibliotecas Prepare las bibliotecas con el protocolo que se detalla en esta gu a del usuario Secuenciaci n de muestras en MiSeqDx El Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx debe secuenciarse en un instrumento MiSeqDx con un experimento paired end de 150 ciclos Para obtener instrucciones sobre c mo realizar un experimento de secuenciaci n en MiSeqDx consulte la Gu a de referencia del instrumento MiSegDx n de referencia 15038353_ESP An lisis de datos y secuenciaci n automatizados MiSeq Reporter procesa las llamadas de bases que genera el instrumento MiSeqDx Se trata de un software integrado en el instrumento que se incorpora a los procesos del instrumento MiSeq Reporter genera informaci n sobre la alineaci n y las variantes estructurales Para obtener m s informaci n so
53. s puntas entre columnas b Para evitar la contaminaci n cruzada entre ndices deseche los tapones blancos originales y coloque tapones blancos nuevos c Con una pipeta multicanal a ada 4 ul de cebadores de ndice 1 A701 2 A702 y 10 A710 soluci n amarilla a los pocillos correspondientes en una Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 3 9 Hod UoOIoe9duuy fila de la placa AMP Se deben cambiar las puntas despu s de cada fila para evitar la contaminaci n cruzada entre ndices d Para evitar la contaminaci n cruzada entre ndices deseche los tapones naranjas originales y coloque tapones naranjas nuevos Retire todos los tubos de cebadores de ndice del rea de trabajo Prepare la soluci n de trabajo de PCR de Mezcla maestra de PCR Polimerasa de PCR tal y como se indica a continuaci n a A ada 5 6 ul de Polimerasa de PCR a 280 ul de Mezcla maestra de PCR b Invierta la soluci n de trabajo de PCR preparada 20 veces para mezclarla En la siguiente secci n a adir la soluci n de trabajo a la placa AMP La soluci n de trabajo de PCR permanece estable a temperatura ambiente durante 10 minutos NOTA A ada siempre Polimerasa de PCR a Mezcla maestra de PCR justo antes de su uso Nunca almacene la soluci n de trabajo de PCR combinada Procedimiento 1 Tras finalizar la reacci n de extensi n ligadura de 45 minutos retire la FPU de la incubadora Retire el
54. secuencia de ndice MiSeqDx utiliza un LED verde para secuenciar bases G T y un LED rojo para secuenciar bases A C En cada ciclo se debe leer al menos uno de los dos nucle tidos de cada canal de color para garantizar un registro adecuado Resulta importante mantener el equilibrio de colores de cada base de la lectura de ndice que es objeto de secuenciaci n ya que de lo contrario se podr a producir un error de registro durante la secuenciaci n de la lectura del ndice 2 4 N de referencia 15038346 Rev A ESP Utilice el siguiente conjunto m nimo de ndices con equilibrio de color para los experimentos de secuenciaci n de ocho muestras Tabla 10 Combinaciones de cebadores de ndice para experimentos de secuenciaci n de ocho muestras Cebador de ndice Cebador de ndice Cebador de ndice 1 A701 2 A702 10 A710 Cebador de ndice C Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 A503 Cebador de ndice D Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 A504 _Cebador de ndice E Muestra 7 Muestra 8 A505 Si no se dispone de seis muestras nicas excluidos los controles positivos y negativos es aceptable llenar el experimento con duplicados de cualquier muestra de ADN gen mico humano Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 2 5 xqb sI ep sesan sp eloy e sap uorcejedeld Hibridaci n de grupo de oligonucle tidos Durante este paso el grupo de oligonucle ti
55. stica CFTR en el ADN gen mico aislado de muestras de sangre humana total perif rica recogidas en EDTA K La prueba detecta variantes de nucle tido nico as como peque as inserciones y deleciones en la regi n secuenciada e identifica asimismo dos mutaciones intr nicas profundas y dos deleciones de gran tama o La prueba est destinada para su uso en el instrumento MiSeqDx de Illumina La prueba se ha dise ado para utilizarla como ayuda en el diagn stico de personas con s ntomas de fibrosis qu stica Este ensayo resulta m s apropiado cuando el paciente presenta una fibrosis qu stica at pica o no cl sica o cuando otros paneles de mutaciones no han podido identificar las mutaciones causantes Los resultados de la prueba los debe interpretar un especialista en gen tica molecular cl nica o equivalente certificado y se deben utilizar junto con otra informaci n disponible como por ejemplo los s ntomas cl nicos otras pruebas diagn sticas y el historial familiar Esta prueba no est indicada para fines de diagn stico independiente pruebas diagn sticas de fetos pruebas previas a implantaciones el cribado de portadores el cribado de reci n nacidos o el cribado de la poblaci n Acerca de esta gu a Esta gu a de referencia proporciona instrucciones m s detalladas sugerencias de t cnicas y tiles consejos para usuarios que han recibido una formaci n reciente con el objeto de servirle de gu a para una ejecuci n a
56. tiene en este punto selle la placa LNP con un sello adhesivo para placas y a continuaci n centrifugue a 1000 x g a 20 C durante un minuto para garantizar que todo el sobrenadante est en el fondo del pocillo PUNTO DEDETENCI N DE SEGURIDAD Tras la limpieza de PCR la placa permanece estable hasta tres horas a una temperatura de entre 2 C y 8 C Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx A 5 Hd ep ezardur Normalizaci n de bibliotecas Este proceso normaliza la cantidad de cada biblioteca para garantizar una representaci n de bibliotecas equitativa en la muestra agrupada Tiempo estimado Duraci n total 1 hora 20 minutos Tiempo de participaci n activa 30 minutos 46 N de referencia 15038346 Rev A ESP Consumibles Art culo Cantidad Almacenamiento Suministrado por Diluyente de normalizaci n 1 tubo Entre 25 C Ilumina de bibliotecas y 15 C Bolas de biblioteca 1 tubo Ente LaCie Ilumina Lavado de normalizaci n 2 tubos Entre 2 C y 8 C Ilumina de bibliotecas Tamp n de 1 tubo Entre lo SC Ilumina almacenamiento de y0 T biblioteca NaOH 0 1 N reci n 2 ml por cada 48 Entre 15 C Usuario preparado muestras y 30 C Placa de PCR con faldones 1 placa Entre 15RE Usuario de 96 pocillos y0 E Tubo c nico de 15 ml 1 tubo Entre 15 C Usuario y 30 C Sello adhesivo para placas Seg n sea Entre 192 Usuario necesario y 30
57. ue de calor incube el tubo DAL a 96 C durante dos minutos 15 Tras la incubaci n invierta el tubo DAL una o dos veces para mezclar y a continuaci n col quelo inmediatamente en el ba o de agua con hielo 16 Mantenga el tubo DAL en el ba o de agua con hielo durante cinco minutos p NOTA Debe realizar el paso de desnaturalizaci n t rmica inmediatamente antes de cargar la DAL en el cartucho de reactivo de MiSeqDx para garantizar una carga eficaz de cadenas molde en la celda de flujo de MiSeqDx 5 6 N de referencia 15038346 Rev A ESP Pasos siguientes Despu s de que se haya agrupado la biblioteca de amplicones con el PhiX diluido y desnaturalizado las bibliotecas estar n listas para cargarse en el Cartucho de MiSeqDx Ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica en el dep sito designado con la etiqueta Load Samples Carga de muestras A continuaci n el experimento de secuenciaci n se configura con la interfaz del Software operativo de MiSeq MOS Consulte la Gu a de referencia del instrumento MiSegDx n de referencia 15038353_ESP para obtener instrucciones Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 5 T sa uaInbis SOSed Notas Asistencia t cnica Si necesita asistencia t cnica p ngase en contacto con el servicio de asistencia t cnica de Illumina Tabla 11 Informaci n de contacto general de Illumina Sitio web de www illumina com Illumi
58. zcla de extensi n ligadura de su almacenamiento a una temperatura de entre 25 C y 15 C y descongele a temperatura ambiente Mezcla de extensi n ligadura se utiliza en el paso de extensi n ligadura y tarda aproximadamente 20 minutos en descongelarse 2 Retire el Tamp n de lavado restrictivo y el Tamp n de lavado universal de su almacenamiento a una temperatura de entre 2 C y 8 C y res rvelos a temperatura ambiente Gu a de referencia del ensayo de secuenciaci n cl nica de la fibrosis qu stica MiSeqDx 31 Jepi uis sSOpnosj9nuobBlio sp vol eu 3 Monte el conjunto de la unidad de la placa del filtro FPU en el orden siguiente desde la parte superior hasta la parte inferior Figura 5 Conjunto de la unidad de la placa del filtro A Tapa B Placa del filtro C Collar adaptador D Placa MIDI 4 Asigne la etiqueta FPU_Plate_ID FPU_Placa_ID a la placa del filtro El ID de la placa debe coincidir con el ID utilizado para la placa HYB 5 Realice un lavado previo a la membrana de la placa del filtro como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de Tamp n de lavado restrictivo en cada pocillo b Cubra la placa FPU con la tapa de la placa del filtro y d jela cubierta durante cada paso del centrifugado 3 2 N de referencia 15038346 Rev A ESP c Centrifugue la FPU a 2400 x g a 20 C durante cinco minutos Procedimiento 1 Al finalizar la hibridaci n confirme que el

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