Instructivo de Uso NCPanaftosa Prueba Confirmatoria
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1. no inducen una respuesta de anticuerpos que pueda interferir con la evaluaci n de los muestreos Cabe mencionar los resultados de modelos bovinos experimentales de PANAFTOSA en los cuales se estudiaron muestras pareadas de l quido esof gico far ngeo LEF y sueros Estas fueron colectadas de 85 bovinos 37 no vacunados y 48 vacunados infectados o expuestos al VFA bajo condici n controlada La colecta de las muestras se realiz durante un comprobado estado de infecci n Independientemente del estado de vacunaci n los resultados sugieren que la sensibilidad diagn stica del sistema NCPanaftosa Pruebas Tamiz Confirmatoria relativa a muestras LEF positivas n 436 es 100 muestras positivas a LEF eran aquellas en las que el virus pudo ser aislado En cambio la sensibilidad de aislamiento por LEF relativa a resultados positivos mediante NCPanaftosa Pruebas Tamiz Confirmatoria n 893 en estos animales solo alcanz valores de 48 8 En las referencias bibliogr ficas se ejemplificaron los resultados obtenidos para poblaciones bovinas representativas de las siguientes situaciones epidemiol gicas poblaciones de animales de reas libres sin vacunaci n animales experimentalmente infectados poblaciones de animales involucrados en brotes de fiebre aftosa poblaciones de animales menores de 2 a os de reas con vacunaci n sistem tica sin enfermedad cl nica en los ltimos 4 poblaciones de animales2. 1 gel 25 muestras 4 sueros controles 500 ml 50 ml 2 geles 50 muestras 8 sueros controles 1000 ml 100 ml 3 geles 75 muestras 12 sueros controles 1500 ml 150 ml Buffer de lavado 1x diluir 10 veces con agua deionizada y o destilada la soluci n buffer de lavado 10 BL De observarse precipitado antes de diluir disolverlos en Ba o Mar a a 37 0 5 C Buffer de saturaci n para preparar 50 ml de esta soluci n disolver 2 59 de leche descremada LP en aproximadamente 30 ml de agua deionizada y o destilada Adicionar 5 ml de buffer de lavado 10 x BL 50ul de Escherichia coli EC homogeneizar y llevar a volumen final de 50 ml con agua deionizada y o destilada Preparar en el momento de uso un volumen suficiente para cada prueba descartando el volumen no utilizado al final de la prueba La diluci n del conjugado y del sustrato debe realizarse 5 10 minutos antes de su uso de acuerdo a lo especificado en la Tabla II 6 14 TABLA II Preparaci n del conjugado y sustrato en funci n del n mero de geles N mero de Buffer de Conjugado Diluyente de muestras saturaci n 100x substrato 1 gel 25 MESAS 185 yl 15 5 ml 55 yl 4 sueros controles 2 geles ASE 360 yl 31 ml 110 yl 8 sueros controles 3 geles 75 muestras 540 ul 45 ml 160 pl 12 sueros controles 8 2 Ejecuci n del ensayo Saturaci n de las tiras e Colocar una tir
3. Instrumentos Diagn sticos para la Vigilancia de la Fiebre Aftosa Centro Panamericano de Fiebre Aftosa OPS OMS Selecci n de Trabajos del Seminario Internacional sobre Uso de Instrumentos Seroepidemiol gicos y Virol gicos en la Vigilancia de Fiebre Aftosa Santiago Chile 10 11 de Marzo En prensa Bergmann I E Malirat V amp Neitzert E 2003 Pruebas Serol gicas y Virol gicas en la Vigilancia Activa de la Fiebre Aftosa Centro Panamericano de Fiebre Aftosa OPS OMS Selecci n de Trabajos del Seminario Internacional sobre Uso de Instrumentos Seroepidemiol gicos y Virol gicos en la Vigilancia de Fiebre Aftosa Santiago Chile 10 11 de Marzo En prensa Malirat V Neitzert E Bergmann I E Maradei E amp Beck E 1998 Detection of cattle exposed to foot and mouth disease virus by means of an indirect ELISA test using bioengineered nonstructural polyprotein 3ABC The Veterinary Quarterly Vol 20 Sup 2 S24 S26 Neitzert E Beck E Aug de Mello P Gomes I amp Bergmann I E 1991 Expression of the aphtovirus RNA polymerase gene in Escherichia coli and its use together with other bioengineered nonstructural antigens in detection of late persistent infections Virology 184 799 804 Office International des Epizooties World organisation for animal health Manual of standards for diagnostic tests and vaccines 2000 OIE Paris 13 14 13 ANEXO ELISA 3ABC EITB Lote o o
4. act a la enzima fosfatasa del conjugado Como resultado de la acci n de la misma se observar el surgimiento de bandas color viol ceo en la tira en donde los ant genos hayan retenido anticuerpos espec ficos y consecuentemente conjugado Por ltimo la reacci n es interrumpida al lavarse las tiras de nitrocelulosa con agua deionizada y o destilada 2 14 La lectura de las tiras se realiza por comparaci n de la intensidad del color de las bandas de las muestras frente a las del control padr n 1 CP1 recomendado como valor de corte cut off para la prueba Esto permite clasificar los sueros problema 4 CUIDADOS Y PRECAUCIONES Todos los componentes del kit deben conservarse en heladera 2 a 8 Conservar los materiales en sus envases originales Respetar el plazo de validez que figura en la etiqueta de la caja No usar ni mezclar componentes de otros kits lotes o fabricantes Seguir estrictamente el procedimiento descrito para ejecuci n del ensayo Todos los materiales del kit se destinan a reacciones in vitro y deben ser manipulados cumpliendo buenas pr cticas de laboratorio BPL No usar soluciones que presenten se ales de alteraci n tales como precipitados turbidez etc En casos de alteraciones entrar en contacto con PANAFTOSA Manipular las tiras de nitrocelulosa siempre con pinza pl stica evitando contacto directo con las manos Manipular las muestras y los sueros controles cumpliendo BPL Todos
5. de congelamiento descongelamiento No usar sueros contaminados o que presenten material precipitado Homogeneizar los sueros antes de usarlos 5 14 8 PROCEDIMIENTO 8 1 Procedimientos preliminares Aproximadamente una hora antes de comenzar la prueba retirar los siguientes reactivos de la heladera tiras sensibilizadas buffer de lavado 10x y diluyente de sustrato para permitir que estabilicen a temperatura ambiente TA 20 25 C Preparar el buffer de lavado 1x y el buffer de saturaci n dej ndolos estabilizar tambi n a temperatura ambiente Retirar los otros reactivos sueros padrones F coli conjugado 100X NBT BCIP en el momento de su uso Preparar la planilla de la prueba P g 14 teniendo en cuenta que deben reservarse 4 tiras de cada gel para los sueros controles CN CP1 CP2 y un suero control interno del laboratorio Los controles deben ser siempre repetidos en cada gel y para cada prueba ya que los resultados deben ser siempre interpretados por comparaci n de la reactividad del suero problema con la del control CP1 procesado en el mismo gel y en la misma prueba Se recomienda homogeneizar los reactivos antes de su uso Preparar las soluciones necesarias para la prueba en funci n del n mero de muestras a procesar siguiendo lo especificado en la Tabla I TABLA I Vol menes a preparar en funci n del n mero de muestras N mero de Buffer lavado 1x Buffer de saturaci n muestras
6. de exposici n al virus activo Puede ser usado independientemente del estado de vacunaci n del animal Como las PNC son altamente conservadas entre los diferentes serotipos la prueba puede ser aplicada para investigaci n de cualquier serotipo del VFA 3 PRINCIPIO DEL ENSAYO El ensayo se realiza en 3 etapas 1 Incubaci n de muestras suero bovino bubalinos 2 Incubaci n del conjugado y 3 Incubaci n del sustrato Siguen a las tres etapas ciclos de lavado Incubaci n de las muestras Las prote nas 3ABC 3D 2C 3B y 3A inmovilizadas en la tira de nitrocelulosa al entrar en contacto con la muestra reaccionar n con los anticuerpos espec ficos de estar presentes formando el complejo inmune ant geno anticuerpo Otros anticuerpos presentes en la muestra no espec ficos no reaccionar n y ser n eliminados en la etapa de lavado que sigue a la incubaci n de las muestras quedando s lo los anticuerpos espec ficos adheridos a la tira de nitrocelulosa a trav s de las prote nas espec ficas Incubaci n del conjugado en esta etapa se agrega el conjugado anticuerpos anti IgG de bovino con fosfatasa alcalina que se unir espec ficamente al complejo ant geno anticuerpo de haberse formado De no formarse el complejo en la etapa anterior el conjugado no se unir y ser eliminado durante el lavado que sigue a esta etapa Incubaci n del sustrato en esta tercera etapa se adiciona el substrato NBT BCIP sobre el cual
7. mayores de 2 a os de reas con vacunaci n sistem tica sin enfermedad cl nica en los ltimos 4 a os 12 14 10 11 12 13 14 15 12 BIBLIOGRAF A Bergmann I E Aug de Mello P Neitzert E Beck E amp Gomes I 1993 Diagnosis of persistent aphtovirus infection and its differentiation from vaccination response in cattle by use of enzyme linked immunoeletrotransfer blot analysis with bioengineered nonstructural viral antigens Am J Vet Res 54 825 831 Bergmann I E 1994 Uso de la prueba de EITB para identificaciones de reas con ausencia de actividad viral Veterinaria 70 16 20 Bergmann I E amp Malirat V 1995 Performance of a rapid enzyme linked immunoelectrotransfer blot assay for detection of cattle exposed to foot and mouth disease virus Bol Centr Panam Fiebre Aftosa 61 1 5 Bergmann I E Malirat V Dias L E amp Dilandro R 1996 Identification of foot and mouth disease virus free regions by use of a standardized enzyme linked immunoelectrotransfer blot assay Am J Vet Res Vol 57 No 7 972 974 Bergmann I E Astudillo V Malirat V amp Neitzert E 1998 Serodiagnostic strategy for estimation of foot and mouth disease viral activity through highly sensitive immunoassays using bioengineered nonstructural proteins The Veterinary Quarterly Vol 20 Sup 2 56 59 Bergmann I E Malirat V Neitzert E Panizzutti N S nchez C amp Falczk 2000 Improv
8. 5 o o E c 2 No gt 9 c 3 1 9 2 E E E g E 5 S g 2 8 lt 5 5 5 a g 2 y la A Y Re o o z Fecha 14 14
9. EMEMMMMMMMMMMMMMMAAAKMN 6 8 1 Procedimientos preliminares essent tnter tette tette ttti 6 TABLA I Vol menes a preparar en funci n del n mero de muestras 6 TABLA II Preparaci n del conjugado y sustrato en funci n del n mero de 7 8 2 Ejecuci n del ensayo nio pire pe pod united avere E reas 7 Resumen de los procedimientos del ensayo ssssssssssssssseeeeeeeeennenneten trennen tenentes 9 9 INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS sese ennt tnnt tnnt treten tnnt nn SESS ioner Esi 10 9 1 Criterios de validaci n del gel tette terret treten tret tetti tette tetti tette 10 9 2 An lisis de los resultados 10 10 CONSIDERACIONES METODOLOGICAS sse tenente eren tenete nite tentent retenti 11 10 1 Eventuales problemas y posibles 5 nennen tete teens 11 10 2 Consideraciones metodol gicas soso 11 11 DESCRIPCI N DE LAS CARACTER STICAS DE DESEMPE O DE LA 11 12 11 13 13 M 14 1 14 1 NOMBRE Y USO RECOMENDADO El kit denominado NCPanaftosa Prueba Confirmatoria Bovino est integrado por un conjunto de reactivos necesarios para r
10. Organizaci n Panamericana de la Salud f Ka Oficina Regional de la 5 EN Organizaci n Mundial de la Salud Unidad de Salud P blica Veterinaria CENTRO PANAMERICANO DE FIEBRE AFTOSA Instructivo de Uso NCPanaftosa Prueba Confirmatoria Bovino Kit diagn stico para detecci n de anticuerpos contra prote nas no capsidales del virus de la Fiebre Aftosa Conjunto de reactivos para la detecci n in vitro de anticuerpos contra las prote nas 3ABC 3D 2C 3B y 3A del Virus de la Fiebre Aftosa suficientes para el estudio de 200 muestras de suero bovino b falos Bubalus bubalis USO VETERINARIO NDICE 1 NOMBRE Y USO RECOMENDADO ici eno 2 2 INTRODUCCION m 2 3 PRINCIPIO DEL ENSAYO otitis 2 4 CUIDADOS Y PRECAUCIONES treten 3 5 REACTIVOS SUMINISTRADOS EN EL tenerent tnter rennes 3 6 EQUIPOS Y MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS sss trennen tnnt 5 6 1 Material de laboratorio sse tenete tenete teretes 5 6 2 EAUS M aS 5 m3 SUSTO rain deb NER aa Er Fair RE RI 5 7 MANEJO Y CONSERVACION DE LAS MUESTRAS sess tenete tete tenir tentent tenerent 5 8 PROCEDIMIENTO RRRRRMMMEMEMMM
11. a en cada una de las canaletas de las bandejas usando pinza pl stica Adicionar 0 8ml de buffer de saturaci n en cada canaleta verificar que las tiras queden bien sumergidas y con la numeraci n visible e Colocar las bandejas sobre el agitador y dejar incubando durante 30 minutos a TA La velocidad del agitador debe ser de 6 ciclos oscilatorios ida y vuelta minuto n mero 5 del agitador Esta velocidad debe mantenerse durante toda la prueba Incubaci n de las muestras e Adicionar a los 0 8 ml de buffer de saturaci n 4 de la muestra o suero control diluci n final 1 200 de acuerdo al orden establecido en el protocolo de prueba Obs Para permitir que la reacci n se inicie simult neamente en todas las canaletas posicionar el agitador durante la adici n de los sueros de tal forma que las bandejas queden inclinadas en un ngulo de aproximadamente 30 Posicionar las tiras en la parte superior de la canaleta para que no tengan contacto con el buffer en la parte inferior donde se adicionan las muestras y los sueros controles e con agitaci n durante 60 minutos a TA Verificar que el lado numerado de la tira est visible Lavado e Concluida la etapa de incubaci n eliminar el buffer de saturaci n inclinando la bandeja evitando que trasborde l quido de una canaleta hacia otra Invirtiendo la bandeja secarla muy bien sobre papel toalla Lavar las canaletas y tiras con abundante buffer de lavado 1x usando u
12. amos que el procesamiento de las mismas sea realizado en un nico gel 10 14 10 CONSIDERACIONES METODOL GICAS 10 1 Eventuales problemas y posibles causas e Ausencia total de reacci n o coloraci n extremadamente tenue Verifique calidad del agua mantenga el excedente de conjugado y substrato para realizar prueba de viraje de color mezcl ndolos en un tubo de ensayo Controlar posibles retenciones en punteras e Sueros controles fuera del rango Verifique la temperatura de la sala controle que los tiempos de incubaci n sean los recomendados confiera el estado de calibraci n de las micropipetas verifique la calidad del lavado del material especialmente cuando reusa las bandejas verifique la velocidad del agitador aseg rese que la reacci n es interrumpida ni bien las bandas del control CP1 comienzan a hacerse visibles e Resultados no reproducibles Verifique el estado de calibraci n de las micropipetas certif quese que los procedimientos de lavado sean los recomendados Verifique la calidad del lavado del material y la calidad del material descartable e Bandas con aspecto difuso Verifique la velocidad del agitador 10 2 Consideraciones metodol gicas Esta prueba diagn stica est basada en la detecci n de anticuerpos Debe tenerse en cuenta que la presencia de los mismos no necesariamente indica presencia del virus ya que pueden estar reflejando tambi n infecci n pasada memoria inmunol gica As
13. e la fase numerada de las tiras sea visible Incubar con agitaci n a TA hasta que la tira del CP1 desarrolle cinco bandas apenas visibles aproximadamente 15 minutos Interrupci n de la reacci n Descartar o aspirar el substrato crom geno y lavar las tiras con abundante agua deionizada y o destilada Por ltimo secar muy bien las bandejas invirti ndolas y golpe ndolas sobre papel secante Dejar secar las tiras aproximadamente dos horas a TA dentro de las bandejas o bien con ayuda de una pinza depositarlas sobre papel de filtro Una vez secas se recomienda pegarlas en el mapa de reacci n P g 14 con cinta adhesiva transparente Obs La lectura de los resultados no precisa ser inmediata sin embargo conviene analizar y registrar las bandas observadas hasta no m s de una semana despu s de realizada la prueba Con el tiempo la coloraci n se aten a Se recomienda el registro de las pruebas utilizando un sistema captador de im genes a color fotocopia scanner controlando que la copia sea fiel al original 8 14 Saturaci n de las tiras Buffer de saturaci n 1x Aplicaci n e incubaci n de las muestras y sueros controles Lavado Soluci n lavado 1x Aplicaci n e incubaci n del conjugado Conjugado diluido Lavado Soluci n lavado 1x Aplicaci n e incubaci n del sustrato Sustrato diluido Detenci n de la prueba Resumen de los procedimientos del ensayo V
14. ealizaci n de ensayo inmunoenzim tico que permite la detecci n in vitro de anticuerpos contra las prote nas capsidales PNC 3ABC 3D 2C 3B y 3A del Virus de la Fiebre Aftosa VFA Este ensayo que consiste en una prueba de EITB Enzyme linked immunoelectrotransfer blot fue padronizado como prueba confirmatoria de un sistema que usa el kit NCPanaftosa Prueba Tamiz Bovino como prueba inicial Su uso est recomendado en la vigilancia activa de la Fiebre Aftosa en poblaciones bovinas menores de 2 a os EI kit tambi n fue validado para su uso en sueros de B falo Bubalus bubalis en las mismas condiciones que para el bovino 2 INTRODUCCI N La Fiebre Aftosa enfermedad infecciosa que afecta a los animales biungulados es causada por el VFA Los animales infectados presentan en general lesiones aftas en la boca y patas pudiendo ocurrir el establecimiento de infecci n subcl nica inclusive estando vacunados que se puede hacer persistente y de duraci n variable que en el bovino puede extenderse a m s de dos 5 Debido a esta caracter stica la demostraci n fehaciente de ausencia de actividad viral es esencial para acompa ar la evoluci n de los programas de erradicaci n El presente ensayo desarrollado para evaluar actividad viral en poblaciones animales introdujo un enfoque diagn stico innovador basado en la detecci n de anticuerpos contra las prote nas no capsidales 3ABC 3D 2C 3B y 3A del VFA como marcadores
15. ement of serodiagnostic strategy for FMDV surveillance in cattle under systematic vaccination A combined system of an indirect ELISA 3ABC with an enzyme linked immunoelectrotransfer blot assay Archives of Virology Vol 145 473 489 Bergmann I amp Neitzert E 2000 Fiebre Aftosa Instrumentos seroepidemiol gicos para evaluar actividad viral I ELISA 3ABC y EITB Sistema para detecci n de anticuerpos contra ant genos no estructurales del Virus de la Fiebre Aftosa Centro Panamericano de Fiebre Aftosa Manual t cnico Rio de Janeiro Bergmann I E Malirat V Neitzert E amp Correa Melo E 2003 Validation of the I ELISA 3ABC EITB System for Use in Foot and Mouth Disease Surveillance Overview of the Southamerican Experience Foot and Mouth Disease Control Strategies 361 370 Elsevier SAS Eds Bergmann I E Malirat V Neitzert E amp Correa Melo E 2003 Vaccines and Companion Diagnostic Tests for Foot and Mouth Disease Virus An overview of the Experience in South America Vaccines for OIE List A and Emerging Animal Diseases Dev Biol Basel Karger 114 57 63 Brown F Roth eds Bergmann I E Neitzert N Malirat V Ortiz S Colling A S nchez C amp Correa Melo E 2003 Rapid Serological Profiling by Enzyme Linked Immunosorbent Assay and its Use as an Epidemiological Indicator of Foot and Mouth Disease Viral Activity Archives of Virology Vol 148 891 901 Bergmann I E Malirat V amp Neitzert E 2003
16. fer de saturaci n seg n lo indicado en los Procedimientos preliminares p g 6 Una vez abierta la bolsa pl stica mantener el resto del contenido herm ticamente cerrado en heladera 2 a 8 C 5 5 Suero Control Negativo CN 1 tubo conteniendo 36 Suero bovino sin anticuerpos contra el VFA tratado con cloroformo y BEI con conservante Manipular seg n lo indicado en Incubaci n de las muestras p g 7 Conservar en heladera 2 a 8 Centrifugar antes de su uso 5 6 Suero Control Padr n 1 CP1 1 tubo conteniendo 36ul Suero bovino con bajo t tulo de anticuerpos contra las prote nas 3ABC 3D 2C 3B y 3A del VFA tratado con cloroformo y BEI con conservante Manipular seg n lo indicado en Incubaci n de las muestras p g 7 Conservar en heladera 2 a 8 C Centrifugar antes de su uso Padr n validado contra un standard primario que corresponde al suero de un animal a 714 dpi d as post infecci n experimental y del cual no se recuperaba virus del LEF L quido esof gico far ngeo desde los 328 dpi La reactividad de este suero equivale a la m xima reactividad de fondo observada individualmente para cada uno de los cinco ant genos en animales no vacunados en regiones libres de fiebre aftosa 5 7 Suero Control Padr n 2 CP2 1 tubo conteniendo 36ul Suero bovino con t tulo medio de anticuerpos contra las prote nas 3ABC 2C y del VFA tratado con cloroformo y BEI con conservante Manipular seg n lo
17. imismo es importante resaltar que existe un intervalo temporal entre la exposici n al virus y la formaci n de anticuerpos Pruebas realizadas con el NCPanaftosa Prueba Confirmatoria Bovino en animales experimentalmente infectados permitieron establecer que el proceso de seroconversi n puede detectarse a partir de los 7 d as post infecci n 11 DESCRIPCI N DE LAS CARACTER STICAS DE DESEMPENO DE LA PRUEBA e La especificidad del sistema estimada con animales v rgenes provenientes de reas libres sin vacunaci n de Am rica del Sur y Europa result en valores que excedieron el 9996 e La sensibilidad calculada para animales con comprobada infecci n persistente establecida en forma experimental y en animales de campo no vacunados en Am rica del Sur y Europa llega al 100 Para animales vacunados y con comprobada infecci n persistente la sensibilidad tambi n llega a 100 En animales vacunados en reas libres con vacunaci n sistem tica los valores de especificidad diagn stica para el sistema superan el 99 en animales lt 2 a os Es importante recordar que estos valores pueden variar seg n la pureza de las vacunas en relaci n a su contenido de prote nas no capsidales PNCs as como al n mero de vacunaciones En este sentido se recomienda el uso de vacunas que no induzcan respuesta de anticuerpos anti 11 14 PNC en animales vacunados revacunados En general vacunas purificadas mediante m todos convencionales
18. indicado en Incubaci n de las muestras p g 7 Conservar en heladera 2 a 8 Centrifugar antes de su uso Padr n validado contra un standard primario que corresponde al suero de un animal no vacunado a 714 dpi experimental y del cual se recuperaba ocasionalmente virus del LEF La reactividad de este suero equivale a las mayores reactividades observadas para los cinco ant genos en regiones de muy bajo riesgo epidemiol gico tres a os despu s del ltimo brote 5 8 Conjugado 100x concentrado CJ 1 tubo conteniendo 1 5ml Anticuerpos de conejo anti IgG bovino conjugados con fosfatasa alcalina con estabilizantes Diluir seg n lo indicado en la Tabla II p g 7 Conservar en heladera 2 a 8 C 5 9 Diluyente de sustrato DS 1 frasco conteniendo 130ml Soluci n tamp n espec fica para la diluci n del y BCIP Conservar en heladera 2 a 8 C Lista para su uso Usar seg n lo indicado en la Tabla II p g 7 5 10 NBT Nitro Blue Tetrazolium NB 1 tubo conteniendo 0 88ml Soluci n 5 de en 70 de Dimetilformamida Conservar en heladera 2 a 8 C Preparar el volumen necesario de substrato seg n lo indicado en los Procedimientos preliminares P g 6 5 11 BCIP 4 5 Bromo 4 Chloro 3 Indolyl Phosphate BC 1 tubo conteniendo 0 44 ml Soluci n 5 de BCIP en 100 de Dimetilformamida Conservar en heladera 2 a 8 C Preparar el volumen necesario de substrato seg n lo indicado en los Procedimientos preliminare
19. los materiales y residuos de la prueba cubas frascos y l quidos resultantes de las diferentes etapas deber n ser tratados antes de ser eliminados Se recomienda autoclavar durante 45 minutos a 121 a 1 atm sfera o tratar con hipoclorito de sodio a concentraci n final de 596 durante 1 hora 5 REACTIVOS SUMINISTRADOS EN EL KIT Composici n 5 1 5 2 5 3 Tiras sensibilizadas NC 8 geles compuestos por 29 tiras c u Tiras de nitrocelulosa sensibilizadas con 20 ng mm de cada una de las prote nas purificadas 3ABC 3D 2C 3B y 3A obtenidas por ingenier a gen tica Estas prote nas son separadas en funci n de su peso molecular gel de SDS PAGE y transferidas a las tiras de nitrocelulosa donde se adhieren como bandas discretas Las tiras est n listas para su uso Buffer lavado 10x concentrado BL 3 frascos conteniendo 170ml cada uno Soluci n tamp n con Tween 20 concentrada 10 veces Espec fica para la preparaci n de la soluci n de lavado y del buffer de saturaci n que se preparan seg n lo indicado en los Procedimientos preliminares p g 6 Conservar en heladera 2 a 8 C Escherichia coli EC 1 tubo conteniendo 450ul Lisado de Escherichia coli para adicionar al buffer de saturaci n seg n lo indicado en los Procedimientos preliminares p g 6 Conservar en heladera 2 a 8 C 3 14 5 4 Leche en polvo descremada LP 1 bolsa pl stica conteniendo 25g Leche en polvo descremada para adicionar al buf
20. na piceta Secar las bandejas con papel secante Adicionar a continuaci n 1 ml de buffer de lavado 1x por canaleta y dejar agitando durante 5 minutos a TA Repetir dos veces este ltimo procedimiento de lavado Luego del ltimo lavado secar muy bien las bandejas golpe ndolas invertidas sobre papel toalla 7 14 Alternativo Aspirar el buffer de saturaci n usando sistema de vac o y a continuaci n lavar las tiras con 1 ml de buffer de lavado 1x aspirar y volver a lavar al menos 2 veces del mismo modo Finalmente adicionar 1 ml de buffer de lavado 1x y dejar agitando 5 minutos repetir este procedimiento 2 veces m s Incubaci n del conjugado Antes de finalizar la etapa de lavado diluir el conjugado seg n lo indicado en la Tabla II p g 7 y aplicar 0 6 ml por canaleta posicionando las bandejas seg n lo indicado en Incubaci n de las muestras p g 7 y verificar nuevamente que el lado numerado de las tiras sea visible Incubar con agitaci n durante 60 minutos a TA Lavado Proceder del modo indicado para el lavado de la etapa anterior Incubaci n del sustrato crom geno Antes de finalizar la etapa de lavado preparar el sustrato crom geno NBT BCIP seg n lo indicado en la Tabla II p g 7 adicionando con cuidado y lentamente primero el NBT al buffer substrato y luego el BCIP Aplicar 0 5 ml por canaleta posicionando las bandejas seg n lo indicado para la Incubaci n de las muestras p g 7 Verificar qu
21. nas con intensidades superiores a las del CP1 Cuando los sueros controles cumplan las condiciones detalladas el gel podr ser considerado v lido y se podr proceder al an lisis de los resultados En caso contrario el gel deber ser considerado inv lido y deber ser repetido 9 2 An lisis de los resultados La reactividad de cada suero deber ser analizada visualmente por comparaci n con la reactividad del suero control CP1 del mismo gel corrido en la misma prueba evaluando comparativamente la intensidad de cada una de las cinco bandas La muestra deber ser considerada No Reactiva si se observa alguna de estas condiciones e Ausencia total de reacci n para las cinco prote nas e Reactividad con intensidad menor a la de la banda correspondiente del CP1 para cada uno de las cinco prote nas individualmente o en conjunto 0 e Reactividad igual o mayor a la de la banda correspondiente del CP1 para un m ximo de dos prote nas simult neamente La muestra deber ser considerada reactiva si se observa e Reactividad para 3ABC 3D 2C con intensidad igual o superior a la de la banda correspondiente al suero control CP1 El resultado deber ser considerado indeterminado e Cuando el padr n de bandas obtenido no se ajuste a los par metros definidos para muestras reactivas o no reactivas Obs Caso la prueba sea utilizada para an lisis comparativo de muestras colectadas de un mismo animal recomend
22. olumen Procedimiento Adicionar en cada canaleta de la bandeja Incubar durante 30 minutos a TA con agitaci n Adicionar en cada canaleta de la bandeja de acuerdo al protocolo de la prueba Incubar durante 60 minutos a TA con agitaci n Lavar abundantemente cada canaleta con piceta Lavar cada canaleta 3 veces con 1 ml durante 5 minutos con agitaci n Por ltimo secar las bandejas Preparar el conjugado 1x Adicionar 0 6 ml en cada canaleta Incubar durante 60 minutos a TA con agitaci n Lavar abundantemente cada canaleta con piceta Lavar cada canaleta 3 veces con 1 ml durante 5 minutos con agitaci n Por ltimo secar las bandejas Preparar el sustrato diluido Adicionar 0 5 ml en cada canaleta Incubar aproximadamente durante 15 minutos a TA con agitaci n Lavar las tiras con abundante agua deionizada y o destilada y dejar secar Pegar las tiras al protocolo de reacci n 9 14 9 INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS 9 1 Criterios de validaci n del gel El gel ser v lido cuando los sueros controles presenten los siguientes resultados e Control Negativo CN no debe presentar banda de reacci n para ninguna de las cinco prote nas o estas deben ser apenas apreciables e Control Padr n 1 CP1 debe presentar bandas muy tenues y de intensidad homog nea para cada uno de las cinco prote nas e Control Padr n 2 CP2 debe presentar bandas muy visibles para cada uno de las cinco prote
23. s p g 6 La soluci n pude presentar un precipitado el cual no necesita ser solubilizado antes del uso 4 14 6 EQUIPOS Y MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS 6 1 Material de laboratorio Micropipetas de volumen ajustable 10 20 100 y 1000 ul con precisi n y exactitud verificadas Punteras descartables adecuadas a las micropipetas Garantizar que las mismas no retenga anticuerpos contra las prote nas 3ABC 3D 2C 3B e 3A e Bandejas de incubaci n con ocho canaletas Accutran Mini Incubation Trays Bio Rad cat logo 170 3902 y 170 3903 o similares Piceta e Material de laboratorio probetas frascos para preparar las soluciones Agua deionizada y o destilada e Hipoclorito de sodio para tratar el material a descartar materiales y soluciones resultantes de la prueba 6 2 Equipos e Agitador tipo rocker oscilante Hoefer PR50 o Thomas Scientific cat logo 8292 B76 e Homogeneizador tipo v rtex e Bomba de vac o opcional e Balanza e Microcentr fuga tipo Eppendorf o similar Seguir las instrucciones de los fabricantes para el uso frecuencia de calibraci n y mantenimiento 6 3 Suero control interno Suero bovino con desempe o conocido 7 MANEJO Y CONSERVACI N DE LAS MUESTRAS Para el manejo y conservaci n de los sueros recomendamos Conservarlos en heladera 2 a 8 C no m s de 2 d as para per odos mayores conservar a 20 5 C Evitar repetidos ciclos
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