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1. ESTRUCTURA GEN TICA Y DIVERSIDAD DE LINAJES DE Pyricularia grisea EN LA ZONA ARROCERA VENEZOLANA Asia Y Zambrano Ariadne Vegas Reinaldo Cardona Zulay Guti rrez y Jhonny R Demey RESUMEN Se caracteriz la estructura gen tica y la diversidad de li najes de Pyricularia grisea en la zona arrocera venezolana Se emplearon 448 aislamientos monosp ricos de P grisea prove nientes de variedades comerciales l neas experimentales varie dades for neas y l neas diferenciadoras internacionales durante las cosechas de los a os 1998 1999 y 2000 en los estados de Barinas Cojedes Gu rico y Portuguesa La caracterizaci n se realiz a trav s de la reacci n en cadena de la polimerasa con los iniciadores Pot2 1 y Pot2 2 Fueron identificados siete lina SUMMARY The genetic structure and lineage diversity of Pyricularia grisea in the Venezuelan rice zone were characterized using 448 monosporic isolates of P grisea from commercial varieties expe rimental lines foreign varieties and international differential lines grown in plots during 1998 1999 and 2000 in the Bari nas Cojedes Guarico and Portuguesa states Characterization was made by polymerase chain reaction amplification using primers Pot2 1 and Pot2 2 Seven lineages were identified as jes identificados como Ven 1 Ven 2 Ven 3 Ven 4 Ven 5 Ven 6 y Ven 7 El estudio de las relaciones gen ticas entre los linajes de P grisea gener tres grupos homog neos2. 2322 Ven 7 Pot2 456 Pot2 2428 MM Marcador Molecular ADN de 4 digerido con EcoRI Hind Ill Figura 1 Patr n electrofor tico e identidad gen tica de linajes venezolanos del hongo P grisea mediante PCR tercero los linajes Ven 1 y Ven 6 As mismo se destaca la diferencia del Ven 5 res pecto al resto de los linajes La distribuci n de frecuencia de los linajes fue 76 34 11 16 5 58 2 01 2 23 1 56 1 12 para el Ven 1 al Ven 7 respectivamente Los resul tados no permiten establecer una correspondencia entre las relaciones gen ticas de los li najes estudiados a trav s del rbol de consenso y su distri buci n Aunque se destaca que en el 100 de los casos en que se construye el rbol el linaje Ven 5 se diferencia del resto la distribuci n de frecuencia no muestra dife rencias estad sticamente sig nificativas p gt 0 05 respecto a los linajes Ven 4 Ven 6 y Ven 7 La Tabla I presenta las frecuencias de los linajes de P grisea por localidad y a o y el ndice de equidad asociado Los resultados re feridos al ndice de equidad muestran que con excepci n del a o 2000 el estado Gu VEN 5 0 1 rico es el sitio m s caliente Este ndice ajustado por la metodolog a del Bootstrap corrige las imperfecciones derivadas del muestreo ga rantizando la calidad de los resultados obtenidos Adicio nalmente la distribuci n de frecuencia observada del li naje Ven 1 es gt 75 lo
3. Una vez esporuladas las lesiones con la ayuda de un microsco pio estereoscopio y un hisopo met lico se tomaron esporas que fueron transferidas y es parcidas en cajas de Petri es t ril contentivas de agar agua acidificado AAA A las 24h de ser transferidas se toma ron secciones de AAA contentivas de una sola espora germinada ubicada con la ayuda del microscopio y se colocaron 3 trozos por caja de Petri est ril contentiva de agar salvado de arroz ASA obteniendo as los aislamien tos monosp ricos La identifi caci n de P grisea fue confir mada con la ayuda de un mi croscopio compuesto Cada aislamiento se alma cen sobre papel de filtro seco bajo refrigeraci n 4 C hasta su utilizaci n Los aisla mientos fueron reactivados colocando una secci n de pa pel de filtro contentivo de micelio y esporas del hongo en una c psula de Petri est ril conteniendo ASA Se obtuvo un total de 448 aislamientos monosp ricos de P grisea provenientes de hojas de arroz infectadas en campo Extracci n y amplificaci n del ADN El ADN total de cada aisla miento monosp rico de P grisea se extrajo mediante el protocolo de miniextracci n con CTAB descrito en CIAT 64 1994 la cuantificaci n se realiz por comparaci n vi sual con el ADN de fago A no digerido y su amplifica ci n se efectu seg n meto dolog a propuesta por George et al 1998 y CIAT 1994 Las amplificaciones del ADN se realiza
4. el primero formado por el linaje Ven 5 el segundo por los linajes Ven 2 Ven 3 Ven 4 y Ven 7 y el tercero por los linajes Ven 1 y Ven 6 La distribu ci n de frecuencias fue de 76 34 11 16 5 58 2 01 2 23 1 56 y 1 12 para el Ven 1 al Ven 7 respectivamente El ndice de equidad ajustado por remuestreo identifica al estado Gu rico como el hot spot site Ven 1 Ven 2 Ven 3 Ven 4 Ven 5 Ven 6 and Ven 7 The study of the genetic relations between the lineages of P grisea generated three homogenous groups the first formed by Ven 5 the second formed by the lineages Ven 2 Ven 3 Ven 4 and Ven 7 and the third by the lineages Ven 1 and Ven 6 Frequency counts were of 76 34 11 16 5 58 2 01 2 23 1 56 and 1 12 for Ven 1 to Ven 7 respectively The equitability index fit by resampling techniques identifies the State of Guarico as the hot spot site Introducci n El arroz Oryza sativa L es uno de los mayores cereales producidos a nivel mundial supliendo aproximadamente el 23 de la energ a per c pita de seis mil millones de perso nas Tan et al 2001 Ocupa el segundo lugar despu s del trigo en superficie cosechada pero desde el punto de vista alimenticio una mayor canti dad de poblaci n depende del arroz En Venezuela anualmen te se cultivan alrededor de 135000ha de arroz con un producci n anual promedio de 700000ton IRRI 2005 dis tribuidas en los estados Bari nas Cojedes Delta Ama
5. la resisten cia duradera es debida a la combinaci n multig nica de variedades que expresan la complementariedad de la re sistencia a un amplio rango de linajes del hongo AGRADECIMIENTOS La investigaci n fue parcial mente financiada por el INIA CENIAP y FUNDARROZ a trav s del proyecto Identifi caci n y caracterizaci n de ra zas y linajes gen ticos del hongo Pyricularia grisea en Venezuela REFERENCIAS Ahn SW 1994 International col laboration on breeding for re sistance to rice blast En Zeigler RS Leong SA Teng PS Eds Rice blast disease CABTIRRI Wallingford RU pp 137 153 Anderson JA Churchill GA Autrique JE Tanksley SD Sorrells ME 1993 Optimizing parental selec tion for genetic linkage maps Genome 36 181 186 66 Arnao E Vegas A Guti rrez Z Mar n C 2003 Estandarizaci n de la t cnica de PCR para la caracterizaci n gen tica de una poblaci n venezolana de Pyri cularia grisea Fitopatol Ve nez 16 1 3 10 Balzarini M Di Rienzo J Casa noves F 2003 Info Gen Un ambiente integrado para el an lisis de datos gen ticos En II Meeting Caribbean and Central American Region In ternational Biometrics Society Puerto Rico USA pp 20 CIAT 1994 Taller Integraci n de fitopatolog a mejoramiento y biolog a molecular para el de sarrollo de resistencia estable al a ublo del arroz Pyri cularia grisea Centro Interna cional de Agricultura Tropical Ca
6. peque os n meros entre 2 y 8 de linajes bien diferencia dos Se han detectado 6 lina jes en Colombia Levy et al 1991 1993 7 linajes en Fili pinas Zeigler et al 1995 5 linajes en Europa Francia Hungr a Italia Portugal y Es pa a Roumen et al 1997 8 linajes en Estados Unidos Correl et al 2000 2 linajes en Brasil Prabhu et al 2002 y 5 linajes en Ir n Javan Nikkhah et al 2004 La conformaci n de la refe rencia internacional de la di versidad del pat geno permiti r la selecci n de fuentes de resistencia para regiones pro ductoras de arroz del mundo En Venezuela se han reali zado estudios preliminares de estandarizaci n de la metodo log a de amplificaci n de rep PCR Arnao et al 2003 Con el objeto de generar la informaci n b sica que contri buya a la estrategia de mejo ramiento en el presente tra bajo se caracteriza la estructu ra gen tica y se estudia la di versidad de linajes de P grisea en la zona arrocera ve nezolana a trav s de la t cni ca rep PCR Materiales y M todos Material vegetal La colecci n del hongo se realiz en parcelas comer ciales de los estados vene zolanos de Barinas Coje des Gu rico y Portuguesa en las localidades de Toru no San Carlos Bancos de San Pedro y Araure El muestreo fue realizado de manera aleatoria sobre las variedades comerciales l neas experimentales varie dades for neas y l neas di ferenciad
7. que disminuye la incertidumbre respecto a las frecuencias de ceros Las localidades con ndice equidad igual o cerca na a l indican que la distri buci n de la probabilidad de aparici n de cada linaje es constante e igual a 1 n mero de linajes Estos resultados fueron co rroborados generando las dife rencias necesarias para que todos los sitios tuviesen la misma frecuencia de linajes es decir el n mero de linajes que hubiesen sido necesarios para producir el mismo valor de diversidad de Shannon para cada localidad Este an lisis de redundancia mostr resultados similares a los ob tenidos con el ndice de equi VEN 7 VEN 4 VEN 1 VEN 6 Figura 2 Relaciones gen ticas entre los linajes de P grisea estudiada a trav s del rbol generado con la disimilitud debida al coeficiente de Dice y el Neighbor Joining como m todo de agregaci n INERCIENCIA JAN 2006 VOL 31 N 1 dad ajustado datos no mos trados Estudios moleculares de di versidad gen tica de P grisea con aislamientos del hongo provenientes de diferentes re giones del mundo se alan que en relaci n con Venezuela 7 linajes existe menor diversi dad del hongo en Brasil Prabhu et al 2002 Ir n Javan Nikkhah et al 2004 Francia Hungr a Italia Por tugal y Espa a Roumen et al 1997 y Colombia Levy et al 1991 y 1993 igual di versidad del pat geno en Fili pinas Zeigler et al 1995 y mayor diversidad de P
8. 0 nos estados de Barinas Cojedes Gu rico e Portuguesa A caracterizac o se realizou a trav s da rea o em cadeia da polimerasa com os iniciadores Pot2 1 e Pot2 2 Foram identificados sete linhagens identificados como Ven 1 Ven 2 Ven 3 Ven 4 Ven 5 Ven 6 e Ven 7 O estu do das rela es gen ticas entre as linhagens de P grisea gerou tr s grupos homog neos o primeiro formado pela linhagem Ven 5 o segundo pelas linhagens Ven 2 Ven 3 Ven 4 e Ven 7 e o terceiro pelos linhagens Ven 1 e Ven 6 A distribui o de fre q i ncias foi de 76 34 11 16 5 58 2 01 2 23 1 56 e 1 12 para o Ven 1 ao Ven 7 respectivamente O ndice de eqiidade ajustado por re amostragem identifica ao estado Gu rico como o hot spot site miento Cuando no hay des trucci n total del cultivo es bastante dif cil estimar las perdidas por lo que no hay una estimaci n exacta de las mismas pero se considera que las perdidas son propor cionales al porcentaje del rea foliar o del cuello de la pan cula afectada Ou 1985 El mecanismo de resistencia gen tica a piricularia ha sido atribuido a genes dominantes de efectos mayores Kiyosawa et al 1986 y en otros casos a grupos de genes de efectos menores Lin 1986 y Wang et al 1989 constituyendo el de sarrollo de variedades resisten tes a la enfermedad la v a m s econ mica para su control y con menor impacto ambiental Sin embargo esta resistencia es usualmente s
9. 71 19 2 0 2 3 1 0 5545 Cojedes 47 10 4 3 1 1 2 0 6506 Gu rico 82 4 12 5 1 2 2 0 5199 Portuguesa 0 2 0 0 1 0 O 1 0000 2000 Barinas 1 0 1 2 0 0 0 0 9809 Cojedes si si si si si si si si Gu rico 39 8 0 41 0 0 O 0 6811 Portuguesa 8 0 1 9 0 0 O 0 2886 Total Barinas 82 21 3 0 2 3 1 0 5336 Cojedes 63 11 5 3 1 1 2 0 5662 Gu rico 171 14 15 6 1 2 2 0 4198 Portuguesa 26 4 2 0 6 1 0 0 7732 si Sin informaci n 65 nocturnas Mu oz y Gamboa 1998 Navas et al 2003 condiciones que han sido re portadas como favorables a desarrollo del hongo El monitoreo de la evolu ci n que conduce a cambios importantes en el espectro ge n tico de la estructura y de la virulencia del pat geno es im portante para identificar genes de resistencia y sus combina ciones que les permitan resis tir los nuevos patotipos y pre venir la interrupci n de la re sistencia Aunque no es posible pre decir si la resistencia a una enfermedad es duradera o ef mera el conocimiento de la estructura gen tica de las po blaciones del pat geno puede ser de utilidad para hacer pre dicciones sobre la posibilidad de adaptaci n del pat geno a las variedades resistentes lo cual es de inter s antes de que stas se siembren extensi vamente El conocimiento de los linajes de P grisea que afectan los cultivares de arroz bajo ensayos comerciales en Venezuela es de utilidad para el establecimiento de los pro gramas de mejoramiento tra dicionales ya que
10. curo Gu rico y Portuguesa Cerca del 85 de la producci n na cional se concentra en el rea bajo riego de los estados Gu rico y Portuguesa con un ren dimiento promedio de 5 19t ha IRRI 2005 El hongo piricularia Pyricularia grisea Cooke Sacc es considerada la m s devastadora enfermedad del arroz a nivel mundial debido a su amplia distribuci n y las graves perdidas econ micas que ocasiona Produce una enfermedad criptog mica compleja debido a la variabi lidad patog nica y la rapidez con que este hongo vence la resistencia de la planta El micelio del hongo produce una sustancia t xica conocida como piricularina que inhibe el crecimiento de los tejidos y los desorganiza En las hojas las lesiones t picas son man chas el pticas de color gris o blanquecino en el centro y bordes marrones a rojizo las cuales pueden unirse depen diendo de las condiciones am bientales y de la susceptibili dad del cultivar lo que produ ce la reducci n del rea foto sint tica y por tanto del ren dimiento En el cuello de la pan cula la colonizaci n del hongo inhibe el flujo de foto sintetizados hacia los granos en formaci n originando pan culas vac as y la ca da de las mismas Los cultivares susceptibles sembrados en condiciones favorables para el desarrollo del hongo pueden ser totalmente destruidos en la fase de pl ntula o macolla PALABRAS CLAVE A ublo Diversidad gen tica Linaje O
11. es O Salazar M Mar n C Crespo J Guti rrez R 2003 Estimaci n de la poca de mayor presi n de in culo de Pyricularia grisea Sacc en el campo experimental del Centro de Investigaciones Agropecuarias del Estado Bari nas Venezuela Investigaci n Agr cola 8 2 www redpav fpolar info ve danac volumen8 art2 index html i M Kumar S 2000 Molecular Evolution and Phylogenetics Oxford University Press New York EEUU 333 pp Ou SH 1985 Rice Diseases 2 ed Commonwealth Agricul tural Bureau Wallingford Inglaterra 660 pp Page RDM 1996 TREEVIEW An application to display phyloge netic trees on personal comput ers Computer Applications in the Biosciences 12 357 358 Pavlicek A Hrda S Flegr J 1999 FreeTree Freeware program for construction of phyloge netic trees on the basis of dis tance data and bootstrap jack Z e knife analysis of the tree ro bustness Application in the RAPD analysis of the genus Frenkelia Folia Biol Praha 45 97 99 Pielou EC 1975 Ecological Diver sity Wiley Nueva York EEUU 165 pp Pla L 2004 Bootstrap confidence intervals for the Shannon biodiversity index A simula tion study J Agric Biol Environ Stat 9 1 15 Prabhu AS Filippi MC Araujo LG Faria JC 2002 Genetic and phenotypic characterization of isolates of Pyricularia grisea from the rice cultivars epagri 108 and 109 in the state of Tocantins Fitopatol Bras 27 566 573 Ra
12. grisea en Estados Unidos Correl et al 2000 Estos resultados indican que Venezuela posee una diversidad del pat geno que contribuye en forma sig nificativa con la conformaci n de la referencia internacional que permitir la selecci n de fuentes de resistencia para re giones productoras de arroz del mundo El conocimiento sobre la caracterizaci n de las familias gen ticas de P grisea presen tes en el pa s contribuir de manera significativa al esta blecimiento de la estrategia de mejoramiento basada en la teor a de exclusi n de linajes tomando en cuenta que en cada regi n donde se cultiva arroz existen grupos de linajes diferentes y por lo tanto se deber n seleccionar progenito res que aporten genes de re sistencia a dichos grupos La determinaci n del hot spot site o la localidad con mayor presi n y diversidad de linajes adquiere importancia a la hora de emprender un pro grama de mejoramiento en la zona arrocera venezolana ya que las localidades estudiadas presentan condiciones am bientales similares caracteri zadas por altas temperaturas humedad relativa y diferencia entre temperaturas diurnas y TABLA I FRECUENCIAS DE LOS LINAJES Y EQUIDADES AJUSTADAS POR LOCALIDAD Y ANO Linajes ndice de equidad A o Localidad 1 2 3 4 3 6 7 ajustado 1998 Barinas 10 2 0 0 0 0 O 0 6244 Cojedes 16 1 0 0 0 O 0 6191 Gu rico 50 2 3 1 0 0 O 0 4462 Portuguesa 18 2 1 0 5 1 0 0 8830 1999 Barinas
13. hen DH Va lent B Nelson RJ 1995 The relationship between lineage and virulence in Pyricularia grisea in the Philippines Phy topathology 85 443 451 JAN 2006 VOL 31 N 1 IVERCIENCIA
14. l Colombia Correa Victora FJ Zeigler RS 1994 Pathogenic variability in Pyricularia grisea at a rice blast hot spot breeding site in Eastern Colombia Plant Dis 77 1029 1035 Correl JC Harp TL Guerber JC Zeigler RS Liu B Cartwright RD Lee EN 2000 Character ization of Piricularia grisea in the United States using inde pendent genetic and molecular markers Ecol Popul Biol 901 398 14 04 Demey JR Zambrano AY Fuen mayor F Segovia V 2003 Relaci n entre las carac ter sticas moleculares y morfo l gicas en una colecci n de Yuca Interciencia 28 684 689 Dice LR 1945 Measures of the amount of ecologic association between species Ecology 26 297 302 Felsenstein J 1985 Confidence limits on phylogenies An ap proach using the bootstrap Evolution 39 783 791 Filippi MC Prabhu AS Levy EM 1999 Differential compatibil ity of Pyricularia grisea iso lates with some Brazilian irri gated rice cultivars Fitopatol Bras 24 447 450 George MLC Nelson RJ Zeigler RS Leungh H 1998 Rapid population analysis of Magna porthe grisea by using rep PCR and endogenous repetitive DNA sequences Phytopathol ogy 88 223 229 Guimaraes EP Ospina P Correa Victoria E 1996 Empleo del concepto de linajes de Pyri cularia grisea para escoger germoplasma de arroz resisten te Fitopatol Venez 9 2 6 Guimaraes EP Am zquita MC Lema G Correa Victoria F 1998 Determination of
15. lamientos monos p ricos de P grisea dentro de los diferentes linajes y permi te confrontar las localidades y determinar el sitio m s calien te o hot spot site bajo el su puesto que el menor valor del ndice de equidad esta asocia do a una menor diversidad o mayor concentraci n en algu no de los linajes presentes Todos los an lisis se realiza ron utilizando Info Gen ver 1 Balzarini et al 2003 Info Stat ver Profesional InfoStat 2004 Resampling Stats ver 5 02 Resampling 1999 FreeTree ver 0 9 1 50 Pavli cek et al 1999 y Treeview ver 1 6 0 Page 1996 Resultados y Discusi n El m todo de extracci n de ADN fue simple r pido y eficiente produciendo entre 200 y 300ng ul de ADN de buena calidad Los iniciadores Pot2 1 y Pot2 2 detectaron siete linajes identificados como Ven 1 Ven 2 Ven 3 Ven 4 Ven 5 Ven 6 y Ven 7 El patr n electrofor tico y la identidad gen tica en pares de bases de los linajes venezola nos de P grisea se muestran en la Figura 1 El contenido de informaci n polim rfica PIC promedio fue de 0 2518 0 1191 con un valor m nimo de 0 2149 y un m ximo de 0 3698 este valor m ximo de PIC correspondi a los loci Pot2 125 Pot2 2008 Pot2 2019 Pot2 2322 y Pot2 2428 lo que representa m s del 50 del contenido de infor maci n polim rfica del inter valo te rico de 0 01 a 0 50 por lo que estos fragmentos de amplificaci n pueden ser usados como refere
16. makrishna W Lagu WD Gupta VS Ranjekar PK 1994 DNA fingerprinting in rice using oli gonucleotide probes specific for simple repetitive DNA se quences Theor Appl Genet 88 402 406 Resampling 1999 Resampling Stats ver 5 02 Resampling Stats Inc Arlington EEUU Roca W Correa Victora FJ Mart nez C Tohme J Lentini Z Levy M 1996 Developing durable resistance to rice blast Productivity and environmental considerations Biotechnology Seminar Paper Isnar Biotech nology Service pp 74 78 Roumen E Levy M Nottegehem JL 1997 Characterisation of the European pathogen popula tion of Magnosporthe grisea by DNA fingerprinting and pathotype analysis Eur J Plant Pathol 103 361 371 Saitou N Nei N 1987 The neigh bor joining method a new method for reconstructing phy logenetic trees Mol Biol Evol 4 406 425 Tan YF Sun M Xing YZ Hua JP Sun XL 2001 Mapping quan titative trait loci for milling quality protein content and color characteristics of rice us ing a recombinant inbred line population derived from an elite rice hybrid Theor Appl Genet 103 1037 1045 Wang Z Mackill DJ Bonman JM 1989 Inheretance of partial resistance to blast in indica rice cultivars Crop Sci 29 848 853 Wetton JH Carter RE Parkin DT Walters D 1987 Demographic study of a wild House Sparrow population by DNA finger printing Nature 327 147 149 Zeigler RS Cuoc LX Scott RP Bernardo MA C
17. mini mum number of growing sea sons for assessment of disease resistance stability in rice Crop Sci 38 67 71 InfoStat 2004 InfoStat software Estad stico Versi n 1 1 C rdoba Argentina IRRI 2005 Recent trends in the rice economy Rice production area and yield www irri org science ricestat index asp Javan Nikkhah M McDonald B Banke S Hedjaroude GA 2004 Genetic structure of Ira nian Pyricularia grisea popula tions based on rep PCR finger printing Eur J Plant Pathol 110 909 919 Kiyosawa S Mackill DJ Bonman JM Tanaka Y Ling ZZ 1986 An attempt of classification of world s rice varieties based on reaction pattern to blast fungus strains Bull Nat Inst Agro biol Resour 2 13 39 Levy M Romano J Marchetti MA Hamer JE 1991 DNA finger printing with dispersed re peated sequence resolves pathotype diversity in the rice blast fungus Plant Cell 3 95 102 Levy M Correa Victoria F Zeigler R Xu S Hamer J 1993 Ge netic diversity of rice blast fungus in a disease nursery in Colombia Phytopathology 83 1427 1433 Lin SC 1986 Genetic analysis of minor gene resistance to blast in japonica rice En Rice Ge netics International Rice Re search Institute Manila Fili pinas pp 451 469 Mu oz L Gamboa P 1998 Intro ducci n al manejo integrado de enfermedades fungosas en arroz Manual T cnico Agro isle a Aragua Venezuela 95 pp Navas M Gamboa C Torr
18. ncia en subsecuentes investigaciones El ndice de similaridad pro medio fue de 0 2006 0 0323 La probabilidad de que dos diferentes linajes venezolanos de P grisea usando los ini ciadores Pot 2 tengan igual identidad es de 2 51x10 lo que indica un alto grado de confianza en la identificaci n hasta de 10 linajes compara dos simult neamente permi tiendo detectar el linaje espe c fico de cada uno de los 448 aislamientos monosp ricos de P grisea provenientes de las muestras de hojas de las va riedades comerciales l neas experimentales variedades for neas y l neas diferencia doras internacionales sembra das entre los a os 1998 y 2000 La Figura 2 muestra las re laciones gen ticas entre los linajes de P grisea El rbol genera tres grupos homog neos el primero formado por el linaje Ven 5 el segundo lo forman los linajes Ven 2 Ven 3 Ven 4 y Ven 7 y el JAN 2006 VOL 31 N1 IVERCIENCIA 21226 bp 5148 bp 4973 bp 4628 bp 3330 bp 2027 bp 1904 bp 1584 bp 1375 bp Identidad Gen tica Ven 1 Pot2 118 Pot2 2008 Pot2 2019 Pot2 2310 Pot2 2405 Pot2 2484 Pot2 2525 Ven 2 Pot2 125 Pot2 138 Pot2 2322 Pot2 2436 Ven 3 Pot2 125 Pot2 140 Pot2 2008 Pot2 2019 Pot2 2322 Pot2 2428 Ven 4 Pot2 102 Pot2 125 Pot2 2019 Pot2 2035 Pot2 2428 Ven 5 Pot2 125 Pot2 1988 Pot2 2008 Pot2 2028 Pot2 2603 Ven 6 Pot2 120 Pot2 405 Pot2 1080 Pot2 2008 Pot2 2027 Pot2
19. oras internaciona les sembradas durante las cosechas de los a os 1998 1999 y 2000 y se afijo pro porcionalmente sobre el rea sembrada por locali dad a raz n de 25 19 47 y 9 para los estados Bari nas Cojedes Gu rico y Portuguesa respectivamente que representan el 98 del rea total sembrada de arroz en Venezuela Las fuentes de aislamiento del hongo se obtuvieron de 27 cultivares de los cuales ARAURE 1 ARAURE 2 ARAURE 3 ARAURE 4 CIMARRON FONAIAP 1 FONAIAP 2 CT 15 y PAL MAR son variedades comer ciales que han sido sembra das en Venezuela durante los ltimos 20 a os CMCEPA FD9702 FD9706 LINEA 6 y PN97A004 son l neas ex perimentales BLUEBON NET 50 CAPI 93 FANNY IR8 IRGA416 MUDGO ORYZICA LLANO 5 ORY ZICA 1 UFI y UF4 son va riedades for neas y CA LORO DULAR y SHA TIA TSAO l neas diferenciadoras internacionales 63 Aislamiento y multiplicaci n del hongo La recolecci n de las hojas infectadas en el campo el aislamiento y la multiplica ci n del hongo en el laborato rio fueron realizadas seg n metodolog a descrita por Guimaraes ef al 1996 Los aislamientos fueron obtenidos en campo de hojas enfermas de los diferentes cultivares sembrados a partir de seccio nes de hojas con una sola le si n lavada previa colocaci n en c mara h meda Los aisla mientos fueron incubados por 24 a 48h en ambiente de la boratorio con el objeto de in ducir la esporulaci n
20. rinting del ADN del hongo y de su espectro de vi rulencia en pruebas de inver nadero reduce la complejidad del manejo del gran n mero de razas del hongo Guima raes et al 1996 1998 George et al 1998 per mitiendo establecer programas de mejoramiento basados en la teor a de exclusi n de lina jes Levy et al 1991 Para el estudio de la estruc tura gen tica e identificaci n de linajes de P grisea se han utilizado dos metodolog as Levy et al 1991 agrupan la poblaci n del hongo en fami lias gen ticas a trav s de la utilizaci n de la secuencia repetitiva de ADN conocida como MGR586 o finger printing del ADN Esta sonda que utiliza la t cnica RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism restringiendo el ADN del hongo con la enzima EcoRI detecta entre 50 y 60 perfiles geon micos George et al 1998 desarrollaron la t c nica rep PCR Repetitive Element Based Polymerase INERDIENCIA JAN 2006 VOL 31 N 1 Chain Reaction usando los iniciadores Pot 2 la cual po see la misma sensibilidad para discriminar los aislamientos de P grisea que la t cnica RFLP pero es m s simple y econ mica demostr ndose la corres pondencia entre los linajes de finidos por rep PCR y por RFLP Se han realizado numerosos estudios moleculares de diver sidad gen tica de P grisea con aislamientos del hongo provenientes de diferentes re giones del mundo detect ndo se que est n compuestos de
21. ron en una mezcla de reacci n final de 25ul constituida por 2 5mM de tamp n 10X 10mM tris HCl pH 9 0 50mM KCI 0 1 Triton X 100 1 5mM de MgCl 750uM de sulfato de amonio 0 185mM de dNTPs A C G y T 2 5U de Taq polimerasa Prome ga 100ng de ADN y 0 5uM de cada uno de los iniciadores Pot2 1 5 CGG AAG CCC TAA AGC TGT TT 3 y Pot2 2 5 CCC TCA TTC GTC ACA CGT TC 3 Se adicion 20ul de aceite mineral para cubrir la reac ci n La amplificaci n fue reali zada en un termociclador mo delo GeneE TECHNES9 bajo los siguientes perfiles de tem peratura 1 ciclo de desnatura lizaci n a 95 C por 2 5min 4 ciclos cada uno con un seg mento de desnaturalizaci n a 94 C por 1min uno de ali neamiento de iniciadores a 62 C por 1min y uno de ex tensi n a 65 C por 10min Ello fue seguido por 26 ciclos cada uno con 30s a 95 C de desnaturalizaci n lmin a 62 C de alineamiento de pri mer y 10min a 65 C de ex tensi n con un ciclo de ex tensi n final a 65 C por 10min Los productos de PCR fue ron separados electrofor tica mente en geles de agarosa al 1 0 y buffer TBE 1X corri dos por 4h a 120V visuali zando los fragmentos de am plificaci n con bromuro de et dio y se fotografiaron con una pel cula tipo Polaroid 667 An lisis de los datos Para el an lisis molecular de los linajes los fragmentos de amplificaci n obtenidos fueron codificados como 0 y 1 para fragmentos ausente
22. ryza sativa Pyricularia oryzae Sitio caliente Recibido 25 01 2005 Modificado 15 11 2005 Aceptado 16 11 2005 Asia Y Zambrano Doctora en Ciencias Agr colas Universi dad Central de Venezuela UCV Investigador Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias INIA CENIAP Venezuela Direc ci n Apartado 4521 Mara 62 cay 2101 Venezuela e mail azambrano inia gob ve Ariadne Vegas Doctora en Cien cias Agr colas UCV Venezue la Investigador INIA CENIAP Maracay Venezuela Reinaldo Cardona Master en Fito patolog a Universidad Centro 0378 1844 06 01 062 05 3 00 0 Occidental Lisandro Alvarado Venezuela Investigador INIA Portuguesa Venezuela Zulay Guti rrez T cnico Superior Instituto Tecnol gico Alonso Gamero Venezuela T cnico Aso ciado a la Investigaci n INIA CENIAP Maracay Venezuela Jhonny R Demey Master en Es tad stica UCV Venezuela Bioestad stico Centro de Bio tecnolog a Fundaci n Instituto de Estudios Avanzados IDEA Venezuela e mail jdemey Oreacciun ve JAN 2006 VOL 31 N1 IVERCIENCIA RESUMO Caracterizou se a estrutura gen tica e a diversidade de li nhagens de Pyricularia grisea na zona arrozeira venezuelana Se empregaram 448 isolamentos monosp ricos de P grisea proveni entes de variedades comerciais linhas experimentais variedades for neas e linhas diferenciadoras internacionais durante as co lheitas dos anos 1998 1999 e 200
23. s y presentes respectivamente El contenido de informaci n po lim rfica PIC y el error est ndar Bootstrap asociado a este se utilizaron para evaluar la capacidad del iniciador en detectar el polimorfismo del locus en los linajes de P grisea caracterizados Ander son et al 1993 Se calcul la probabilidad de obtener pa rejas id nticas de alelos por cambio de alelo en los linajes seg n metodolog a descrita por Wetton et al 1987 y Ramakrishna et al 1994 modificada por Demey et al 2003 Con los patrones generados se estudiaron las relaciones gen ticas entre los linajes de P grisea a trav s de la repre sentaci n gr fica generada por el m todo no jerarquico del Neighbor Joining Saitou y Nei 1987 y la disimilitud debida al coeficiente de Dice Dice 1945 La estabilidad de la agrupaci n se estudi a trav s del rbol de consenso generado por remuestreo n 1000 Felsenstein 1985 Nei y Kumar 2000 La equidad calculada como ndice de diversidad de Shannon Ln n mero de es pecies Pielou 1975 ajusta da por remuestreo para n 1000 seg n metodolog a descrita por Pla 2004 es utilizada para estimar la di versidad de los linajes de P grisea por localidad a os y para el total en estudio El n dice de equidad derivado de los vectores de frecuencias por linaje remuestreados con reemplazo proporciona una medida relativa de la homoge neidad en que se distribuyen los 448 ais
24. uperada des pu s de que los cultivares son liberados debido a los conti nuos cambios y evoluci n del pat geno los cuales dan ori gen a nuevos patotipos en el ecosistema compatibles con los cultivares resistentes La li beraci n de variedades resis tentes requiere la implementa ci n de pr cticas agr colas in tegrales que tomen en cuenta la interacci n entre los genes de resistencia y las poblacio nes del pat geno la din mica de virulencia del hongo y el flujo de genes a las malezas y a especies silvestres relaciona das al arroz Roca et al 1996 Los aspectos de mayor im portancia a ser considerados en el desarrollo de variedades con resistencia duradera a la enfermedad causada por el hongo piricularia son la iden tificaci n del sitio hot spot site donde se realizar la se lecci n de progenitores y l neas y la identificaci n fiable de las razas del hongo En el primer aspecto Correa Victo ria y Zeigler 1994 indican que un sitio ser considerado m s caliente o hot spot site si existe una alta presi n de la enfermedad y diversidad del pat geno asociada a condicio nes ambientales favorables al desarrollo del hongo En el segundo la gran variabilidad patog nica del hongo es una de las mayores limitantes en el mejoramiento gen tico Ahn 1994 por lo que la utilizaci n del concepto de li naje o familias gen ticas con caracter sticas similares e identificadas a trav s de fingerp
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