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1. 10 1 Especificidad y Sensibilidad La microplaca est revestida con c lulas HEp2 lisadas No se han encontrado reactividades cruza das con otros autoantigenos Los ANA no son especificos para el LES pero se encuentran en una variedad de enfermedades reum ticas La detecci n de ANA es un marcador muy sensible para un LES activo y es positivo en gt 99 de todos los casos Los datos se obtuvieron con AESKULISA ANA HEp2 REF7115 La correlaci n La equivalencia de estos datos se evalu tanto en AESKULISA 7115 como en AESKULISA 3115 con 50 sueros El an lisis de regresi n lineal de los dos productos mostr que ambos son equivalentes En estos sueros est incluidos los sueros 43 cerca del limite ANA HEp2 comparison 30 30 30 vs 30 15 15 30 15 15 30 30 30 P gina 6 de 9 002 2007 08 28 REF 3115 ANA HEp 2 10 2 Linealidad Se han analizado con este equipo sueros seleccionados y se encontr que deb an diluirse linealmente No obstante debido a la naturaleza heterog nea de los autoanticuerpos humanos pueden haber mue stras que no sigan esta regla concentraci n concentraci n medida esperada Recuperaci n Ratio DO Ratio DO 10 3 Precisi n Para determinar la precisi n del ensayo se valor la variabilidad intra e inter ensayo a trav s del an lisis de su reproducibilidad en tres muestras de suero Estas muestras fueron seleccionadas para representar un rango por encima de la curva standard2. Inter Ensayo Media CV Ratio DO 7 3 1 Intra Ensayo Media CV Ratio DO 1 4 6 10 4 Calibraci n El equipo AESKULISA ANA HEp2 est calibrado contra sueros de referencia del CDC Centers for Disease Control and Prevention en Atlanta 11 Bibliografia 1 Peter JB Shoenfeld Y 1996 Autoantibodies Elsevier Sciences B V Amsterdam Froelich CH Wallmann H Skosey JL and Teodorescu M 1990 Clinical value of an integrated ELISA system for the detection of 6 autoantibodies The Journal of Rheumatology 17 2 192 200 Mierau R Genth E 1998 Autoantik rper bei systemischem Lupus erythematodes und verwandten Erkrankungen In Thomas L Hrsg Labor und Diagnose TH Books Frankfurt 15 Auflage 843 851 Schmolke M Oppermann M Helmke K Guder WG 2000 Antibody determination against ENA a challenge for the routine laboratory Poster P59 5 th Dresden Symposium on Autoantibodies Tan EM 1989 Antinuclear antibodies diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology Adv Immunol 44 93 151 P gina 7 de 9 002 2007 08 28 REF 3115 ANA HEp 2 ANEXO A Esquema de dispensaci n Se sugiere dispensar los calibradores controles y muestras como sigue Para una interpretaci n cuantitativa utilice calibradores para establecer una curva standard Para una interpretaci n cualitativa utilice el calibradore cut off P gina 8 de 9 CC Cut off calibrator PC positi
3. Fabriqu par 4 Hergestellt von Fabricado por Calibratore cut off Etalon Seuil Grenzwert Kalibrator 4 Calibrador de cut off 4 Controllo positivo 4 Contr le Positif Positiv Kontrolle Controlo positivo Controllo negativo 4 Contr le N gatif Negativ Kontrolle 4 Controlo negativo 4 Calibratore Etalon Kalibrator 4 Calibrador Recupero Corr lation Wiederfindung Recuperac o Coniugato Conjuge Konjugat Conjugad Micropiastra rivestita Microplaque sensibilis e Beschichtete Mikrotiterplatte Microplaca revestida 4 Piastra ad aghi rivestita 4 Pinplate sensibilis e Beschichtete Pinplatte Pinplate revestida Tampone di lavaggio Tampon de Lavage Waschpuffer Soluc o de lavagem Tampone substrato Substrat Substratpu Substrato Reagente bloccante 4 Solution d Arr t Stopreagenz Soluc o de paragem Tampone campione Tampon Echantillons Probenpuffer 4 Diluente de amostra For in vitro diagnostic use Para uso diagn stico in vitro In Vitro AlayvwoTIK go 4 Cataloge number Numero de cat logo Ap du g Trapayyekiag Lot Lote Xapaktnpicpi s TTAPTI AG EC Declaration of Conformity Declaraci n CE de Conformidad Eupwfrraikr ouupwvia 96 tests 96 pruebas 96 TTPOO IOPIONOI See instructions for use 4 Ver las instrucciones de uso M pete urr un TIG O NVIEG xo on 4 Use b
4. AESKULISA ANA HEp 2 REF 3115 Manual de Instrucciones Contenido 1 Utilizaci n Aplicaciones cl nicas y principio del ensayo Contenido del equipo Almacenamiento y caducidad Precauciones Toma de muestra manipulaci n y almacenamiento Procedimiento del ensayo Interpretaci n semicuantitativa Datos t cnicos Datos de funcionamiento Bibliograf a Esquema de dispensaci n Procedimiento del test 002 2007 08 28 REF 3115 ANA HEp 2 1 Utilizaci n AESKULISA ANA HEp2 es un enzimoinmunoensayo en fase s lida para la detecci n cualitativa y combinada de anticuerpos IgG contra c lulas HEp2 en suero humano Cada pocillo est revestido con c lulas HEp2 lisadas El test detecta de modo colectivo en un pocillo los ANA totales contra el DNA de doble cadena dsDNA histonas SS A Ro SS B La Sm snRNP Sm Scl 70 PM Scl Jo 1 y ant genos centrom ricos junto con sueros positivos para el test de inmunofluorescencia con HEp2 IFT El ensayo es una herramienta para el diagn stico de las enfermedades reum ticas sistemicas como el lupus eritematoso sist mico LES enfermedades mixtas del tejido conectivo MCTD escleroderma s ndrome de Sj gren polimiositis y dermatomiositis 2 Aplicaci n cl nica y principio del ensayo Los anticuerpos anti nucleares ANA dirigidos contra una variedad de ant genos nucleares y citoplasm ticos se dan en elevada frecuencia en enfermedades reum ticas si
5. Cut off Muestra de paciente Ratio DO Interpretation 0 35 DO 0 25 DO Indeterminado 0 35 DO 0 56 DO 0 35 DO 1 75 DO No utilice este ejemplo para interpretar resultados de los pacientes Recomendamos analizar de nuevo las muestras gue den un resultado en el limite Para conocer los datos especificos de lote consulte el documento de control de calidad adjunto Los laboratorios deber an realizar un Control de Calidad interno utilizando controles propios y o un pool de sueros interno tal y como contemplan las regulaciones de la UE Cada laboratorio deberia establecer su rango normal propio basado en sus propias tecnicas contro les equipamiento y poblaci n seg n sus propios procedimientos establecidos Para la semicuantificaci n de los resultados cada valor de DO de paciente puede ser expresado a trav s del Indice El Indice se calcula dividiendo la DO del paciente por la DO del cut off DO muestra de paciente indice DO calibradore cut off Negativo ndice lt 0 8 Indeterminado 0 8 lt ndice lt 1 2 Positivo ndice gt 1 2 P gina 5 de 9 002 2007 08 28 REF 3115 ANA HEp 2 9 Datos T cnicos Muestra suero Volumen de muestra 10 ul de muestra diluida a 1 101 con tamp n de muestra 1x Tiempo total de incubaci n 90 minutos a temperatura 20 32 C 68 89 6 F Almacenamiento a 2 8 C 35 46 F utilice solo los viales originales N mero de determinaciones 96 tests 10 Datos de funcionamiento
6. e 20 ml de tamp n de lavado diluido 1x para 8 pocillos o 200 ml para 96 pocillos p e 4 ml de concentrado en 196 ml de agua destilada Lavado autom tico Tenga en cuenta los vol menes de exceso requeridos para purgar el instrumento y el volumen muerto en el dispensador del aparato Lavado manual Descarte el l quido de los pocillos invertiendo la placa Golpee vigorosamente el marco con los micropocillos sobre papel absorbente limpio manteniendo la placa invertida Dispense 300 ul de tamp n de lavado diluido dentro de cada pocillo y espere 20 segundos Repita el procedimiento entero dos veces m s Microplacas Calcule el n mero de pocillos necesarios para el ensayo Saque los pocillos no utlizados del marco p ngalos de nuevo en la bolsa de pl stico suministrada junto con el desecante y s llela bien 2 8 C 35 46 F 7 2 Esquema de trabajo Vea Anexo A para el esquema de dispensaci n vea Anexo B para el procedimiento Recomendamos la medici n de pipeta de las muestras y calibradores por duplicado Dispense 100 ul de cada suero diluido de paciente dentro del pocillo correspondiente Dispense 100 ul de calibradore cut off y controles positivo y negativo dentro de los pocillos designados Incube durante 30 minutos a temperatura 20 32 C 68 89 6 F Lave 3x con 300 ul de tamp n de lavado diluido 1 50 Dispense 100 ul de conjugado dentro de cada pocillo Incube durante 30 minutos a temperatura 20 32 C 68 89 6 F Lave 3
7. econstituidas son estables durante 1 mes a 4 C por lo menos Los reactivos y la microplaca deben ser utilizados solamente dentro del margen de caducidad indicado en cada componente Evite la exposici n de la soluci n TMB a la luz intensa Guarde las microplacas en su sobre correspondiente incluyendo el desecante y s llelo bien P gina 2 de 9 002 2007 08 28 REF 3115 ANA HEp 2 5 Precauciones 5 1 Datos de riesgo para la salud ESTE PRODUCTO ES SOLO PARA EL USO EN DIAGN STICO IN VITRO Por lo tanto solamente el personal formado y especialmente asesorado en los m todos de diagn stico in vitro puede realizar el ensayo Aunque no se considera este producto como particularmente t xico o peligroso en condiciones de uso normales rem tase a lo siguiente para una m xima seguridad Recomendaciones y precauciones Este equipo contiene componentes potencialmente peligrosos Aunque los reactivos del equipo no est n clasificados como irritantes de los ojos y la piel recomendamos evitar el contacto de los mismos con los ojos y con la piel y utilizar guantes desechables jAVISO Los calibradores controles y agentes contienen zida de sodio NaN como conservante El NaN puede ser t xico si se ingiere o se absorbe por medio de la piel o de los ojos El NaN puede reaccionar con la fontaner a de plomo y de cobre y formar zida met lica muy explosiva Al tirar tirarla deje correr una gran cantidad de agua para evitar que la zida tome consis
8. ida con el ant geno espec fico Los anticuerpos de los pacientes si est n presentes en la muestra se unen al ant geno La fracci n no unida es eliminada por el lavado en el paso siguiente Despu s las inmunoglobulinas anti humanas conjudagas con peroxidasa conjugado se incuban y reaccionan con el complejo ant geno anti cuerpo de las muestras dentro de la microplaca El conjugado no unido es retirado a trav s del lavado en el paso siguiente La adici n del substrato TMB genera una reacci n colorim trica azul enzim tica que se detiene a trav s de cido diluido el color cambia a amarillo La tasa de formaci n de color por parte del crom geno va en funci n de la cantidad de conjugado unido al complejo antigeno anticuerpo y esto es proporcional a la concentraci n inicial de los respectivos anticuerpos en la muestra del paciente P gina 1 de 9 002 2007 08 28 REF 3115 ANA HEp 2 3 Contenido del equipo Para ser reconstituido Tamp n de Muestra 5x 1 vial 20 ml concentrado 5x tap n blanco soluci n amarilla Contiene Tris NaCI BSA azida s dica lt 0 1 conservante Tamp n de Lavado 50x 1 vial 20 ml concentrado 50x tap n blanco soluci n verde Contiene Tris NaCl Tween 20 azida s dica lt 0 1 conservante Listo para el uso Control Negativo 2 vials 1 8 ml tap n verde soluci n incolora Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Control Positivo 1
9. ivos Un diagn stico clinico definitivo no debe estar basado solamente en los resultados del ensayo realizado Debe ser elaborado por el m dico despu s de haber evaluado todos los hallazgos cli nicos y de laboratorio Es necesario verificar el diagn stico por medio de distintos m todos 6 Toma manipulaci n y almacenamiento de las muestras Utilice preferentemente muestras de suero reci n extra das La extracci n de sangre debe seguir los requerimientos de protocolo de su pa s No utilice muestras ictericas lipemicas hemolizadas o contaminadas por bacterias Los sueros con part culas deben ser purificados por centrifugaci n a baja velocidad lt 1000 x g Las muestras de sangre deben ser recogidas en tubos limpios secos y vac os Despu s de la separaci n las mues tras de suero deben ser utilizadas inmediatamente Pueden guardarse bien cerradas a 2 8 C 35 46 F hasta tres d as o congelarse a 20 C 4 F para per odos m s largos P gina 3 de 9 002 2007 08 28 REF 3115 ANA HEp 2 7 Procedimiento del ensayo 7 1 Preparativos antes de dispensar Diluya los reactivos concentrados Diluya el tamp n de muestra concentrado a 1 5 con agua destilada p e 20 ml en 80 ml Diluya el tamp n de lavado concentrado a 1 50 con agua destilada p e 20 ml en 980 ml Muestras Diluya las muestras de suero a 1 101 con tamp n de muestra 1x p e 1000 ul tamp n de muestra 1x 10 ul suero Mezcle bien la diluci n Lavado Prepar
10. st micas y por lo tanto son una herramienta importante para el diagn stico diferencial Por ejemplo los anticuerpos SS A Ro y SS B La est n asociados con el LES y el sindrome de Sj gren SS los anticuerpos anti dsDNA y anti Sm con el LES los anticuerpos anti histona con el LES y el lupus inducido por drogas los anticuerpos anti RNP con la enfermedad mixta del tejido conectivo MCTD y el LES los anticuerpos anti Scl 70 con el escleroderma eslcerosis sist mica progresiva PSS los anticuerpos anti Jo 1 con la polimiositis y la dermatomiositis y los anticuerpos anti centr mero con el sindrome de CREST El test de inmunofluorescencia indirecta IFT en c lulas eucariotas como HeLa y HEp2 ha sido el m todo establecido para la detecci n de los ANA Aunque el IFT es un test sensible es laborioso cuando se analiza un gran n mero de muestras de pacientes y est sujeto a errores de interpretaci n humana y de variabilidad en cuanto al microscopio de fluorescencia El test ELISA es una excelente alternativa al IFT en cuanto al cribaje del suero del paciente en busca de la presencia de ANAs de importancia clinica Las especificidades particulares de los anticuerpos deben ser determinadas a trav s de un an lisis m s espec fico y utilizando ELISAs que emplean ant genos diana espec ficos se consigue una diferenciaci n de los ANAs sencilla y fiable Principio del test Las muestras de suero diluidas 1 101 se incuban en la microplaca revest
11. tencia Por favor consulte los procesos de descontaminaci n del CDC u otras directrices locales o nacionales No fume coma o beba mientras manipule el equipo No pipetee con la boca Todo el material de fuente humana utilizado en algunos reactivos de este equipo por ejemplo con troles standards ha sido analizado a trav s de m todos aprobados y ha resultado ser negativo para HbsAg Hepatitis C y HIV 1 No obstante ning n test puede completamente garantizar la ausencia de agentes virales en ese tipo de material Por lo tanto manipule los controles standards y muestras de los pacientes como si se trataran de aut nticos transmisores de enfermedades infecciosas y seg n los requerimientos de manipulaci n de su pa s 5 2 Instrucciones generales para la utilizaci n No mezcle o sustituya reactivos o microplacas de n meros de lote diferentes Esto podr a llevar a una variaci n de los resultados Deje que todos los componentes alcancen la temperatura ambiente 20 32 C 68 89 6 F antes de utilizarlos Agitelos bien y siga el esquema de incubaci n recomendado para una ptima realizaci n del ensayo Incubaci n se recomienda realizar las pruebas a 30 C 86 F para sistemas automatizados No exponga nunca los componentes a temperaturas m s altas de 37 C 98 6 F Pipetee siempre la soluci n de substrato con puntas nuevas Protega este reactivo de la luz Nunca pipetee el conjugado con puntas previamente utilizadas con otros react
12. ve control NC negative control P1 patient 1 P2 patient 2 P3 patient 3 002 2007 08 28 REF 3115 ANA HEp 2 Anexo B Procedimiento del test Samples 1 101 Controls 3x 300 l P gina 9 de 9 002 2007 08 28 REF 3115 ANA HEp 2 z ddH VNV LTLT96 YEL9 6Y XA 0 Z296 F L09 6F 9U0Y4 UBULIIO 7 Burg UINIOJODIIJA tutt us pu o AA hETSS Hqtup sonsouseiq NAS TV TU A 001 011407 SATHSOd TU A 001 Jonuoo VATISOJ IU N ST Joyeiqiyes Ho 10 qu N ST IOJE IGI 8O Ho MO qu N 0 01140 VDANLSIN qu N 0 01140 SUN J UYDOSIIJU JINEUSIS me1odur r measodur unq 1eq I GNU uonegnou s9 Aessy Diagnosi in vitro 4 Pour diagnostic in vitro In Vitro Diagnostikum Para uso Diagn stico in vitro Numero d ordine Reference Catalogue Bestellnummer N mero de cat logo Descrizione lotto Lot Chargen Bezeichnung 4 Lote Conformit europea D claration CE de Conformit Europ ische Konformit t Declarac o CE de Conformidade 96 determinazioni 96 tests 96 Bestimmungen 96 Testes Rispettare le istruzioni per l uso 4 Voir les instructions d utilisation Gebrauchsanweisung beachten 4 Ver as instruc es de uso Da utilizzarsi entro Utilise avant le Verwendbar bis Utilizar antes de Conservare a 2 8 C Conserver 2 8 C Lagerung bei 2 8 C 4 Conservar entre 2 8 C Prodotto da
13. vial 1 5 ml tap n rojo soluci n amarilla Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Calibradore Cut off 1 vial 1 5 ml tap n azul soluci n amarilla Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Conjugado 1 vial 15 ml IgG tap n azul soluci n azul Contiene Inmunoglobulinas anti humanas conjugadas con peroxidasa Substrato TMB 1 vial 15 ml tap n negro Contiene TMB H202 estabilizado Soluci n de Paro 1 vial 15 ml tap n blanco soluci n incolora Contiene cido Clorh drico 1M Placa Microtiter 12x8 tiras rompibles de pocillos Revestimiento ver p rrafo 1 Material necesario pero no suministrado Filtro de lectura de 450 nm del lector de tiras microtiter y filtro de referencia opcional de 620 nm 600 690 nm Equipo de cristal cilindro 100 1000ml tubos de ensayo para disoluciones Mezclador espiral pipetas de precisi n 10 100 200 500 1000 ul o pipeta m ltiple ajustable 100 1000ul Dispositivo de lavado de la microplaca pipeta de repetici n o microcanal de 300 ul o sistema automatizado papel absorbente Nuestras pruebas se han dise ado para el uso con agua destilada seg n la definici n de la farmaco pea de los Estados Unidos USP 26 NF 21 y la europea Eur Ph 4 ed 4 Almacenamiento y Caducidad Guarde todos los reactivos y la microplaca a 2 8 C 35 46 F en sus envases originales Una vez preparadas las soluciones r
14. x con 300 ul de tamp n de lavado diluido 1 50 Dispense 100 ul de substrato TMB dentro de cada pocillo Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente 20 32 C 68 89 6 F protegido de la luz directa Dispense 100 ul de soluci n de paro dentro de cada pocillo siguiendo el mismo orden de pocillos que cuando dispens el substrato Incube un m nimo de 5 minutos Agite la placa cuidadosamente durante 5 segundos Lea la absorbancia a 450 nm opcionalmente a 450 620 nm dentro de los 30 minutos siguientes P gina 4 de 9 002 2007 08 28 REF 3115 ANA HEp 2 8 Interpretaci n Semicuantitativa Lea la densidad ptica del control cut off y de las muestras de pacientes Compare las DO de los pacientes con la DO del calibradore cut off Para la interpretaci n cualitativa recomendamos que establezca un rango del 20 al rededor del valor del cut off como zona indeterminada Todas las muestras que tengan DO superior a este rango se consideran positivas y las muestras con valores de DO inferiores a este rango se consideran negativas Negativo DO paciente 0 8 x DO cut off Indeterminado 0 8 x DO ut orr lt DO patient lt 1 2 x DO ut off Positivo DO paciente gt 1 2 x DO cut off Calibradores D O 450 620 nm CV Variaci n Control Negativo 0 081 Calibradore cut off 0 350 Control Positivo 1 259 Ejemplo de interpretaci n Recomendamos dispensar el calibradore cut off en paralelo para cada tanda Calibradore
15. y Utilizar antes de Xp on p xpl Store at 2 8 C 35 46 F Conservar a 2 8 C DUAGOOETAI orou 2 8 C Manufactured by Fabricado por Karaokev eTaI ATTO Cut off Calibrator 4 Calibrador de cut off Opiok op s Avri6paoT pio BaBduov unons Positive Control Control Positivo OETIK G op EAEyXOU Negative Control Control Negativo Apvntik c opdc ehEyxou Calibrator Calibrador Avri poor pio BaBduov unons Recovery Recuperado Av xtnon Coated microtiter plate Microplaca sensibilizada ETTIKOAUHJEVI HIKPOTT KA 4 Coated pinplate 4 Pinplate sensibilizada EmkaAupnevn TT ka Pin Wash buffer Soluci n de lavado PuBniotik IG ULA TTA ONG Substrate buffer Tamp n sustrato PuOLIIOTIK IG UA UTTOOTPUHATOG Stop solution Soluci n de parada Avri poor pio diakoTT S avTi paong Sample buffer Tampon Muestras Pu8uioTIK i dupa OEIYyp TWV
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