CAPILLARYS IMMUNOTYPING
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1. 1 i EE gt 4 L Albumin e Alphai Alpha2 Beta Abumin e Alphai Alpha2 Beta i i i i i i i f i i H i gt A i gt lt 1 Interpretation Suspicion de cha ne l g re libre Kappa confirmer Kappa free light chain suspected to confirm 262 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 SCH MAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES D URINES ELECTROPHORETIC PATTERNS OF URINE SAMPLES Proteine monoclonale Monoclonal component mode de dilution Hypergamma Hypergamma dilution program Figure 9 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta Gamma Albumin e Alpha 1 Albumin e Alpha 12. CAPILLARYS IMMUNOTYPING Ref 2100 2009 04 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 UTILIZACI N El kit CAPILLARYS IMMUNOTYPING permite la detecci n y caracterizaci n en medio alcalino pH 9 9 de las proteinas monoclonales inmunotipado en el suero y la orina humanos mediante electroforesis capilar en el sistema autom tico CAPILLARYS Debe usarse con el kit CAPILLARYS PROTEIN E 6 SEBIA que permite separar las proteinas en seis fracciones principales El sistema CAPILLARYS permite realizar todas las etapas de la electroforesis hasta la obtenci n de los perfiles proteicos para su an lisis cualitativo Cada muestra de suero orina que se analiza se mezcla con antisueros de diferentes especificidades anti cadenas pesadas gamma lg alfa Ig A y mu Ig M y anti cadenas ligeras kappa y lambda libres y ligadas Todas las prote nas separadas en capilares de s lice fundido son detectadas directamente en una burbuja existente en el capilar mediante espectrofotometr a de absorbancia a 200 nm Despu s los perfiles electrofor ticos son analizados visualmente para detectar las anomal as y caracterizar las prote nas monoclonales detectadas Para uso en diagn stico In Vitro PRINCIPIO DEL TEST La electroforesis de prote nas de la orina o el suero humanos es un an lisis muy til en el laboratorio de an lisis cl nicos para investigar las modificaciones del perfil proteico Paralelamente a las t cnicas de electrofores
3. 261 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 SCH MAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES D URINES ELECTROPHORETIC PATTERNS OF URINE SAMPLES Proteine monoclonale Monoclonal component mode de dilution Hypogamma Hypogamma dilution program Figure 8 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta Gamma i Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta Gamma 1 H i i i i 1 i i i H i i i i 1 i i i i H i i i H i H i i 1 uai d uud om NI j Albumin e r Alpha 1 Alpha 2 Beta i Gamma Albumin e i Alpha 1 Alpha 2 Beta Gamma A i 1 i
4. DILUCI N MIGRACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS 1 Lectura de los c digos de barras del cargador y de la muestra de orina correspondiente 2 Diluci n de la orina dializada con el diluyente contenido en el pocillo doble del segmento seguido de la dispensaci n de la muestra diluida en los 6 pocillos restantes soluci n ELP anti lg G anti Ig A anti Ig M anti Kappa y anti Lambda con limpieza de la c nula de muestras entre cada diluci n El modo de diluci n seleccionado previamente para esa muestra se aplicar autom ticamente Si no se ha definido el modo de diluci n se aplicar el modo de diluci n HIPOGAMMA Lavado de los capilares Inyecci n de las muestras diluidas en los capilares Migraci n a voltaje constante con temperatura controlada por efecto Peltier durante unos 4 minutos Lectura a 200 nm y aparici n simult nea de los perfiles proteicos en la pantalla del ordenador NOTA Estas etapas se realizan consecutivamente para el primer cardador de muestras introducido los perfiles correspondientes a la primera muestra analizada se obtienen despu s de 10 minutos Para el cargador de muestras siguiente las fases 1 y 2 lectura de los c digos de barras y diluci n de la orina dializada se realizan durante la etapa 5 del cargador de muestras anterior Dos I AN LISIS DE LOS RESULTADOS Al acabar el an lisis cada uno de los perfiles obtenidos con los antisueros Ig lg A lg M Kappa y Lambda
5. LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL CAPILLARYS 69 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 I PREPARACI N DEL AN LISIS ELECTROFOR TICO 1 Seleccione las muestras cuyo perfil proteico obtenido con la t cnica CAPILLARYS URINE ha permitido detectar un pico anormal despu s del an lisis cualitativo 2 Encienda el CAPILLARYS y el ordenador de control 3 Abra el programa de gesti n PHORESIS CAPILLARYS y valide el nivel de los reactivos tras lo cual el aparato se iniciar autom ticamente Despu s de unos 10 minutos el sistema CAPILLARYS estar listo para trabajar 4 Para cada muestra en el perfil proteico obtenido con el programa de an lisis URINE determine el valor del Ratio orina del pico anormal que quiera caracterizar vea el p rrafo Tratamiento de los datos de las instrucciones del kit CAPILLARYS URINE El Ratio orina se define a partir del cociente entre la superficie del pico anormal y la superficie total de las prote nas del Suero Control Normal 5 Seleccione el modo de diluci n que se aplicar autom ticamente seg n el valor del Ratio orina HIPOGAMMA si el valor del Ratio orina es inferior a 0 55 EST NDAR si el valor del Ratio orina est comprendido entre 0 55 y 1 55 HIPERGAMMA si el valor del Ratio orina es superior a 1 55 NOTA Cuando el Ratio orina est situado a un 10 del valor l mite 0 55 1 55 se recomienda seleccionar el modo de diluci n en funci
6. analizadas con una sensibilidad del 100 y una especificidad del 100 respecto a la t cnica de referencia calculadas seg n el m todo recomendado Wendling 1986 Sensibilidad Se diluyeron serialmente tres sueros con una gammapat a monoclonal en un suero normal y se analizaron usando la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING Los resultados obtenidos se indican en la tabla siguiente BANDA MONOCLONAL MUESTRA N L MITE DE DETECCI N TIPO CONCENTRACI N g L CCI N 9 1 on Alfa a 0 25 0 25 0 25 2 Ig G L Gamma 2 0 Lambda 0 25 M 25 3 lg M K 3 9 Kappa 0 25 El limite de detecci n de un pico monoclonal es por tanto del orden de 0 25 g L NOTA El l mite de detecci n de un pico monoclonal puede variar en funci n de la posici n del pico monoclonal y del fondo policlonal de la zona de las gamma y beta globulinas 67 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 AN LISIS DE ORINAS T CNICA CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS 1 KIT CAPILLARYS PROTEIN E 6 SEBIA referencia 2003 Presentaci n conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Vea las instrucciones del kit ATENCI N No use los segmentos de diluci n contenidos en el kit CAPILLARYS PROTEIN E 6 para la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE 2 KIT CAPILLARYS URINE SEBIA referencia 2012 Presentaci n conservaci n estabilidad y se ales
7. 12 Landers JP Clinical Capillary Electrophoresis Clin Chem 41 495 509 1995 13 Le Bricon T 2002 Identification et dosage des proteines urinaires au laboratoire d analyses Ann Biol Clin 60 525 540 14 Le Carrer D 1990 Prot inuries Mise au point sur leur exploration biologique en 1990 L Eurobiologiste 190 395 405 15 Le Carrer D Nicolas A Ducasse L 1992 L analyse des prot inuries au laboratoire de biologie en 1992 Revue francaise des laboratoires 225 41 47 16 Le Carrer D Chopin N 1994 Profil prot ique urinaire Proposition d un protocole d exploration biologique des prot inuries Revue francaise des laboratoires 269 29 37 17 Philipon C 1989 Prot ines urinaires Int r t clinique et interpr tation Technique et Biologie 6 239 249 18 Oda RP et al Capillary electrophoresis as a clinical tool for the analysis of protein in serum and other body fluids Electrophoresis 18 1715 1723 1997 19 Waller KV Ward KM Mahan JD Wismatt DK 1989 Current concepts in proteinuria Clin Chem 35 755 765 20 Westermeier R Electrophoresis in Practice A Guide to Theory and Practice VCH Publishers New York NY 1993 21 Wendling A Proc dures de diagnostic ou de d pistage Justification et validit d un test de diagnostic ou de d pistage sensibilit sp cificit Impact Internat 1986 Sept 93 97 254 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 SCH MAS FIGURES PROFILS
8. LECTROPHOR TIQUES DE S RUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES Figure 1 S rum Normal Normal serum lg G 255 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 SCH MAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES DE S RUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES S rum Hypergamma Hypergamma serum Figure 2 Immun complexe Immune complex P ELP lg G Ig A lg M Immun complexe Immune complex Immun complexe Immune complex p 256 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 SCH MAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES DE S RUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES Prot ine monoclonale 0 5 g L Monoclonal component 0 5 g L Figure 3 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein 1 Je No Lis Interpretation lg G Lambda 257 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 SCH MAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES DE S RUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES 19 G Kappa mode de dilution Hypergamma Hypergamma dilution program Figure 4 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein ELP lg G Ig A
9. adsorbidas a la c nula Vea las instrucciones de uso del CAPILLARYS SEBIA Use el cargador espec fico para el mantenimiento n 100 Coloque en el cargador en la posici n 1 un tubo de hem lisis con 2 mL de la soluci n de hipoclorito de sodio preparada anteriormente Introduzca el cargador n 100 de mantenimiento en el sistema CAPILLARYS En el men de la ventana MANTENIMIENTO que aparece en la pantalla seleccione la opci n Iniciar el lavado de la c nula soluci n de hipoclorito de sodio o soluci n de lavado CDT y luego confirme la selecci n Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro La soluci n de hipoclorito de sodio de 9 puede conservarse 3 meses a temperatura ambiente en un recipiente de pl stico cerrado herm ticamente protegido de la luz solar y de cualquier fuente de calor o ignici n y alejado de los cidos y el amoniaco 5 SOLUCI N DE LAVADO CAPILLARYS Preparaci n Cada vial de soluci n de lavado concentrada SEBIA referencia n 2052 2 viales de 75 mL debe completarse hasta 750 mL con agua destilada o desionizada ATENCI N La soluci n de lavado contiene sosa c ustica Soluci n corrosiva Provoca quemaduras graves Cons rvela alejada del alcance de los ni os En caso de contacto con los ojos l velos inmediatamente con agua en abundancia y consulte a un especialista Qu tese inmediatamente cualquier prenda manchada o salpicada Use guantes apropiados y un sistema de protecc
10. agarosa HYDRAGEL 9 BENCE JONES SEBIA t cnica de referencia para investigar la presencia de paraprote nas y cadenas ligeras libres Los resultados obtenidos mostraron una correlaci n perfecta entre los dos sistemas de an lisis con una sensibilidad del 100 y una especificidad del 100 respecto a la t cnica de referencia calculadas seg n el m todo recomendado Wendling 1986 En las 6 muestras de orina normales correlaci n perfecta En las 22 muestras de orina con perfil policlonal correlaci n perfecta En las 33 muestras patol gicas correlaci n perfecta Se detect la presencia de paraprote nas o de cadenas ligeras libres en todas las muestras patol gicas con los dos sistemas de an lisis Sensibilidad La sensibilidad o l mite de detecci n m nimo de la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE para la detecci n de las cadenas ligeras libres Kappa y Lambda obtenida mediante diluci n serial de muestras de orina con prote nas de Bence Jones es del orden de 25 mg L para las muestras analizadas con los antisueros anti Kappa y anti Lambda del kit CAPILLARYS IMMUNOTYPING 72 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 BIBLIOGRAPHIE BIBLIOGRAPHY 1 Cameron JS 1987 The nephrotic syndrome Am Kidney Dis 10 157 171 2 Chopin N 1991 tude de la prot inurie Inf Tech Biol 1 23 28 3 Clark R et al Rapid capillary electrophoretic analysis of human serum proteins qualitative comparison with high throughp
11. capilares en paralelo con la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING seg n las etapas siguientes lectura de los c digos de barras de los tubos primarios y del cargador de muestras diluci n de las muestras a partir del tubo primario mezcla del suero con la soluci n ELP y con los antisueros de las diferentes especificidades lavado de los capilares inyecci n de las muestras diluidas separaci n y detecci n directa de las prote nas en los capilares Las etapas manuales son las siguientes colocaci n de los tubos primarios en los cargadores de muestras colocaci n de un segmento de antisueros destapado en cada cargador introducci n en el sistema CAPILLARYS recuperaci n de los cargadores despu s del an lisis Un an lisis electrofor tico previo efectuado en el sistema CAPILLARYS con el kit CAPILLARYS PROTEIN E 6 habr permitido seleccionar las muestras en las que el perfil proteico presenta un pico anormal mediante un examen visual LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL CAPILLARYS I PREPARACI N DEL AN LISIS ELECTROFOR TICO 1 Seleccione las muestras cuyo perfil proteico obtenido usando la t cnica CAPILLARYS PROTEIN E 6 ha permitido detectar un pico anormal despu s del an lisis cualitativo 2 Encienda el CAPILLARYS y el ordenador de control 3 Abra el programa de gesti n PHORESIS CAPILLARYS y valide el nivel de los reactivos tras lo cual el aparato se iniciar autom ticamente D
12. de deterioro Vea las instrucciones del kit Uso Permite preparar las muestras de orina para el an lisis de las prote nas urinarias humanas mediante electroforesis capilar en el sistema autom tico CAPILLARYS 3 AGUA DESTILADA O DESIONIZADA Uso Para la limpieza de los capilares del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA Se recomienda usar agua destilada o desionizada filtrada con un filtro de poro lt 0 45 Renueve el agua cada d a para evitar contaminaciones microbianas En caso de conservaci n prolongada a ada 35 pL L de ProClin 300 IMPORTANTE Se recomienda lavar el contenedor de limpieza con agua destilada o desionizada en abundancia antes de llenarlo 4 CAPICLEAN Presentaci n El vial de la soluci n enzim tica concentrada CAPICLEAN SEBIA referencia n 2058 1 vial de 25 mL contiene enzimas proteol ticos surfactantes y componentes inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo ATENCI N La soluci n CAPICLEAN puede producir irritaci n o quemaduras cut neas oculares o de las mucosas Uso Para la limpieza semanal de los capilares y la c nula de muestras del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA Vea las instrucciones de uso del CAPICLEAN SEBIA IMPORTANTE No vuelva a usar el segmento de diluci n despu s de limpiar los capilares y la c nula Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro CAPICLEAN deb
13. ligeras libres kappa lambda La desaparici n de un pico con uno de los antisueros anti cadenas pesadas sin desaparici n del mismo con los anti cadenas ligeras es rara Habr que confirmar la presencia de una enfermedad de cadenas pesadas gamma alfa o mu Presencia de varias prote nas monoclonales En presencia de varias prote nas monoclonales se aplica la misma interpretaci n Estos casos menos frecuentes corresponden a la proliferaci n de varios clones de c lulas B Una gammapat a biclonal ser detectada por la presencia de dos cadenas pesadas id nticas o diferentes y de dos cadenas ligeras id nticas o diferentes es decir por la desaparici n de los 2 picos con uno de los antisueros anti cadenas pesadas id nticas o diferentes y con uno de los antisueros anti cadenas ligeras id nticas o diferentes La desaparici n de varios picos con uno de los antisueros anti cadenas pesadas y con uno de los antisueros anti cadenas ligeras es caracter stica de una polimerizaci n de las inmunoglobulinas Para confirmar la presencia de un componente monoclonal en la muestra ser necesario realizar un tratamiento reductor con beta mercaptoetanol y repetir el an lisis tras el mismo En este caso prepare una soluci n reductora a adiendo un 1 de beta mercaptoetanol al Fluidil SEBIA referencia n 4587 1 vial de 5 mL Estando el sistema CAPILLARYS preparado para analizar muestras a ada 100 LL de soluci n reductora a 300 pL de suero
14. muestra se aplicar autom ticamente Si no se ha definido el modo de diluci n se aplicar el modo de diluci n EST NDAR Lavado de los capilares Inyecci n de las muestras diluidas en los capilares Migraci n a voltaje constante con temperatura regulada por efecto Peltier durante unos 4 minutos Lectura a 200 nm y aparici n simult nea de los perfiles proteicos en la pantalla del ordenador NOTA Estas etapas se realizan consecutivamente para el primer cargador de muestras introducido los perfiles correspondientes a la primera muestra analizada se obtienen despu s de 10 minutos Para el cargador de muestras siguiente las etapas 1 y 2 lectura de los c digos de barras y diluci n del suero se realizan durante la etapa 5 del cargador anterior Dop ow I AN LISIS DE LOS RESULTADOS Al acabar el an lisis cada uno de los perfiles obtenidos con los antisueros 19 G lg A lg M Kappa y Lambda se superpone al perfil ELP En caso de reacci n entre la prote na monoclonal y el antisuero espec fico el pico correspondiente desaparecer del perfil electrofor tico del antisuero El an lisis del suero diluido con el diluyente contenido en el segmento de antisueros es realizado durante el inmunotipado y permite obtener el perfil proteico de la muestra nativa perfil Ref Esta curva suplementaria permite comprobar la concordancia entre el an lisis de prote nas y el inmunotipado Estas comparaciones permiten identificar y caracteri
15. n del pico proteico anormal que se quiera caracterizar con la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE para mejorar la sensibilidad de detecci n de un pico de intensidad d bil diluya menos la muestra es decir seleccione el modo de diluci n HIPOGAMMA en lugar del EST NDAR o el EST NDAR en lugar del HIPERGAMMA para mejorar el inmunotipado de un pico de intensidad fuerte aumente la diluci n de la muestra es decir seleccione el modo de diluci n EST NDAR en lugar del HIPOGAMMA o el HIPERGAMMA en lugar del EST NDAR 6 Para el an lisis de use el kit CAPILLARYS IMMUNOTYPING con el programa de an lisis I MMUNOTYPING URINE y el tamp n de an lisis CAPILLARYS PROTEIN E 6 Para seleccionar el programa de an lisis IMMUNOTYPING URINE y colocar el contenedor de tamp n CAPILLARYS PROTEIN E 6 lea detenidamente el manual de instrucciones del CAPILLARYS NOTA El paso de la t cnica modo de trabajo CAPILLARYS URINE a la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE e inversamente no requiere cambiar el contenedor de tamp n 7 Ponga 1 tubo de hem lisis vac o que servir de soporte en la posici n 1 de cada cargador y luego coloque el microtubo que contiene la muestra de orina dializada en el tubo de hem lisis asegur ndose de haber cortado el tap n del microtubo 8 Conserve el tap n de cada microtubo para la conservaci n posterior de la muestra en caso de que sea necesario IMPORTANTE Se recomienda ide
16. puro Agite en el v rtex y deje que incube durante 15 minutos como m ximo y luego siga con el procedimiento habitual IMPORTANTE Despu s del tratamiento reductor con beta mercaptoetanol la muestra debe ser analizada inmediatamente no debe haber ning n otro cargador en espera de ser analizado en el sistema CAPILLARYS Despu s del tratamiento reductor con B mercaptoetanol la transformaci n de este perfil bi o tri clonal en perfil monoclonal permite concluir que s lo hay un clon Por otra parte hay que tener presente que el tratamiento del suero con B mercaptoetanol implica una degradaci n del complemento C3 visualizaci n de grandes deformaciones en la zona beta y la posible aparici n de un pico ancho entre las fracciones alfa 1 y alb mina La desaparici n de varios picos m ltiples con uno o varios antisueros anti cadenas pesadas y con los dos antisueros anti cadenas ligeras es caracter stica de un perfil oligoclonal Casos especiales En caso de desaparici n incompleta de un pico monoclonal en los perfiles de antisueros Repita el an lisis diluyendo m s el suero Seleccione el modo de diluci n EST NDAR en lugar del modo HIPOGAMMA e HIPERGAMMA en lugar de EST NDAR Muestras que contengan una o m s prote nas monoclonales de concentraci n muy elevada en modo de diluci n HIPERGAMMA En este caso el complejo formado con los antisueros aparece en forma de un pico ancho y grande entre las fracciones alb m
17. t cnicas HYDRAGEL BENCE JONES o HYDRAGEL IF SEBIA con los antisueros espec ficos anti cadenas ligeras libres kappa o lambda La desaparici n de un pico con uno de los anti cadenas pesadas sin desaparici n del mismo con los anti cadenas ligeras es rara Habr que confirmar la presencia de una cadena pesada gamma alfa o mu Presencia de varias prote nas monoclonales La desaparici n de varios picos con uno de los antisueros anti cadenas ligeras puede observarse en caso de polimerizaci n de las cadenas ligeras libres Casos especiales En caso de desaparici n incompleta de un pico monoclonal en los perfiles de los antisueros repita el an lisis diluyendo m s la orina Seleccione el modo de diluci n EST NDAR en lugar del modo HIPOGAMMA e HIPERGAMMA en lugar de EST NDAR Muestras que contienen una o m s prote nas monoclonales de concentraci n muy elevada en modo de diluci n HIPERGAMMA En este caso el complejo formado con los antisueros aparece en forma de un pico ancho y grande en las zonas alb mina y alfa 1 la desaparici n del o de los pico s monoclonal es puede no ser completa en los perfiles de antisueros La desaparici n de 2 picos con uno de los antisueros anti cadenas ligeras y de un solo pico con uno de los antisueros anti cadenas pesadas es debida a la presencia de una inmunoglobulina completa asociada a una cadena ligera libre Se recomienda seleccionar el modo de diluci n en funci n de
18. tica concentrada CAPICLEAN SEBIA referencia n 2058 1 vial de 25 mL contiene enzimas proteoliticos surfactantes y componentes inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo ATENCI N La soluci n CAPICLEAN puede producir irritaci n o quemaduras cut neas oculares o de las mucosas Uso Para la limpieza semanal de los capilares y de la c nula de muestras del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA Vea las instrucciones del CAPICLEAN SEBIA IMPORTANTE No vuelva a usar el segmento de diluci n despu s de limpiar los capilares y la c nula Conservaci n estabilidad y sefiales de deterioro El CAPICLEAN debe conservarse en nevera entre 2 y 8 C Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial NO LO CONGELE Debe estar exento de precipitados Deseche el CAPICLEAN si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana 4 SOLUCI N DE HIPOCLORITO DE SODIO para la limpieza de la c nula de muestras Preparaci n Prepare una soluci n de hipoclorito de sodio lej a con 9 de cloro entre 2 y 3 de cloro a partir de una dosis concentrada de 250 mL con 36 de cloro 9 6 de cloro diluida hasta 1 litro volumen final con agua destilada o desionizada fr a Uso Para la limpieza de la c nula de muestras del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA mantenimiento semanal para eliminar prote nas
19. Alpha2 Beta Gamma Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta Gamma i i i i H H i i i i H i i i i H i i i i MEME i I 1 H i H es 2 d Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta i Albumin e Alpha 1 Apha2 Beta Gamma f i i i i i pp H i i 1 i 1 i 1 1 1 1 i 1 1 1 1 1 1 H i j Interpretation Suspicion de cha ne l g re libre Lambda confirmer Lambda free light chain suspected to confirm 263 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 SCH MAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES D URINES ELECTROPHORETIC PATTERNS OF URINE SAMPLES Profil biclonal Biclonal pattern mode de dilution Hypogamma Hypogamma dilution program Figure 10 gt Par
20. a azul oscuro inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas pesadas mu verde amarillento inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas ligeras kappa libres y ligadas verde claro inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas ligeras lambda libres y ligadas azul claro un diluyente espec fico para la diluci n de los sueros y las orinas dializadas que contiene un marcador que permite superponer los perfiles de forma ptima Cada reactivo tiene un color espec fico Los segmentos tienen una forma caracter stica y un saliente que evita colocarlos al rev s en los cargadores de muestras del sistema CAPILLARYS 6 INSTRUCCIONES SEBIA Espa ol CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 Uso Segmentos de un solo uso para el inmunotipado de las proteinas mediante electroforesis en el sistema autom tico CAPILLARYS Deben colocarse en el cargador de muestras despu s de haber retirado la l mina que los recubre IMPORTANTE Antes de sacar la l mina que cubre el segmento compruebe que no haya gotas de reactivo en lo alto de los 6 pocillos y si se observan gotas gire el segmento con un movimiento r pido para que las gotas se re nan con el resto de la soluci n en el fondo del pocillo ATENCI N Manipule con precauci n los segmentos de antisueros que contengan muestras biol gicas Conservaci n estabilidad y sefiales de deterioro Los segmentos de antisueros deben conservarse en nevera entre 2 y 8 C Son
21. aprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta Albumin e Alpha 1 Alpha2 Beta i i i i Albumin e Alpha 2 Beta Gamma Albumine Alpha Alpha2 Beta Gamma i MEM PP i i i 1 i i i 1 i 1 i 1 1 i 1 i i i ME NE i i 1 Albumin e Alpha 1 Alpha 2 Beta Gamma i Albumin e Alpha 1 Alpha 2 Beta Gamma i i Eod dg i i i i i Interpretation Lambda suspicion de cha ne l g re libre Lambda confirmer G ig G Lambda Lambda free light chain suspected to confirm 264
22. as con gammapat a monoclonal o biclonal y no detect ning n pico en la muestra normal Reproducibilidad interserial e interlotes Se analizaron siete muestras patol gicas con una gammapat a monoclonal o biclonal y una muestra normal que presentaban concentraciones proteicas diferentes con la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE usando el modo de diluci n HIPOGAMMA para 4 muestras cuyo ratio orina era lt a 0 55 con el modo de diluci n EST NDAR para 2 muestras cuyo ratio orina estaba comprendido entre 0 55 y 1 55 y con el modo de diluci n HIPERGAMMA para 2 muestras cuyo ratio orina era gt a 1 55 Este an lisis se repiti 4 veces con 3 lotes diferentes de segmentos de antisueros Todas las muestras analizadas proporcionaron los mismos resultados con los 3 lotes de segmentos probados y los perfiles obtenidos eran los caracter sticos de cada una de las muestras analizadas En la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE el inmunotipado detect los picos monoclonales esperados en cada una de las 7 muestras patol gicas El an lisis de la muestra normal permiti detectar un fondo policlonal sin presencia de pico anormal Exactitud Se analizaron en paralelo treinta y tres 33 muestras de orina patol gicas diferentes con paraprote nas o con cadenas ligeras libres Kappa o Lambda 22 muestras con un perfil policlonal y 6 muestras normales usando la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE y la t cnica de inmunofijaci n en gel de
23. b mina o m s an dico que la alb mina El innunotipado se realiza en cuatro etapas 1 Diluci n del suero o de la orina dializada con un diluyente espec fico contenido en el pocillo doble del segmento de antisueros La diluci n se adapta a la concentraci n de inmunoglobulinas de la muestra 2 Mezcla de la muestra diluida con los diferentes antisueros El complejo antigeno anticuerpo se forma r pidamente en el medio l quido sin etapa de incubaci n ni de precipitaci n 3 Inyecci n de las muestras tratadas por aspiraci n en 6 capilares en la parte an dica seguida de separaci n electrofor tica de las prote nas en medio alcalino mediante la aplicaci n de una diferencia de potencial de varios miles de voltios en los extremos de los capilares La detecci n directa de las prote nas se efect a a 200 nm en el lado cat dico 4 Superposici n del perfil ELP en los perfiles de los antisueros lg lg A lg M Kappa y Lambda lo que permite la caracterizaci n de la prote na monoclonal REACTIVOS SUMINISTRADOS EN EL KIT CAPILLARYS IMMUNOTYPING SEGMENTOS DE ANTISUEROS Preparaci n Los 60 segmentos de antisueros est n listos para usar y permiten analizar una muestra cada uno Est n compuestos por 7 pocillos que contienen respectivamente un medio de base soluci n ELP amarilla inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas pesadas gamma rosa inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas pesadas alf
24. cia el contenedor de limpieza antes de llenarlo LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL CAPILLARYS RESULTADOS Interpretaci n para el an lisis de sueros Ausencia de prote na monoclonal La desaparici n de las inmunoglobulinas policlonales en los perfiles de los antisueros con disminuci n de las fracciones gamma y beta sin desaparici n de otros picos proteicos se observa en el an lisis de un suero normal o que presente una hipergammaglobulinemia Presencia de una prote na monoclonal Una gammapat a presencia de una inmunoglobulina monoclonal se caracteriza por la desaparici n de un pico con uno de los antisueros anti cadenas pesadas gamma alfa o mu y con uno de los antisueros anti cadenas ligeras kappa o lambda La fracci n monoclonal detectada debe estar situada en la misma posici n de migraci n que la banda detectada en el perfil ELP 65 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 La desaparici n de un pico con uno de los antisueros anti cadenas ligeras kappa o lambda sin desaparici n de ese pico con uno de los antisueros anti cadenas pesadas puede significar a la presencia de una gammapat a de Ig D lg E que habr que confirmar con las t cnicas HYDRAGEL IF SEBIA con los antisueros anti cadenas pesadas delta o psilon b la presencia de una cadena ligera libre que habr que confirmar con las t cnicas HYDRAGEL BENCE JONES HYDRAGEL IF SEBIA con los antisueros espec ficos anti cadenas
25. e conservarse en nevera entre 2 y 8 C Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial NO LO CONGELE Debe estar exento de precipitados Deseche el CAPICLEAN si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana 5 SOLUCI N DE HIPOCLORITO DE SODIO para la limpieza de la c nula de muestras Preparaci n Prepare una soluci n de hipoclorito de sodio lej a con 9 de cloro entre 2 y 3 de cloro a partir de una dosis concentrada de 250 mL con 36 de cloro 9 6 de cloro diluida hasta 1 litro volumen final con agua destilada o desionizada fr a Uso Para la limpieza de la c nula de muestras del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA mantenimiento semanal para eliminar prote nas adsorbidas a la c nula Vea las instrucciones de uso del CAPILLARYS SEBIA Use el cargador n 100 espec fico para el mantenimiento Coloque en el cargador en la posici n 1 un tubo de hem lisis que contenga 2 mL de soluci n de hipoclorito de sodio preparada con anterioridad Introduzca el cargador n 100 de mantenimiento en el sistema CAPILLARYS En el men de la ventana MANTENIMIENTO que aparece en la pantalla seleccione la opci n Iniciar el lavado de la c nula soluci n de hipoclorito de sodio o soluci n de lavado CDT y luego confirme la selecci n Conservaci n estabilidad y sefiales de deterioro La soluci n de hipoclorito de sodio de 9 puede conser
26. edor de desechos ATENCI N No use agua destilada o desionizada comercial como por ejemplo el agua para planchar riesgo de deterioro importante de los capilares Use exclusivamente agua de calidad ultrapura como el agua para inyecci n IMPORTANTE Se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el contenedor de limpieza antes de llenarlo LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL CAPILLARYS RESULTADOS Interpretaci n para el an lisis de orinas Ausencia de prote na monoclonal La desaparici n de las inmunoglobulinas policlonales en los perfiles de los antisueros con disminuci n de las fracciones gamma y beta sin la desaparici n de otros picos proteicos se observa en el an lisis de una orina normal o que presente una proteinuria glomerular con paso a la orina de inmunoglubulinas policlonales Presencia de una prote na monoclonal La presencia de una inmunoglobulina monoclonal completa se caracteriza por la desaparici n de un pico con uno de los anti cadenas pesadas gamma alfa o mu y con uno de los anti cadenas ligeras kappa o lambda La fracci n monoclonal detectada debe estar situada en la misma posici n de migraci n que la banda detectada en el perfil ELP La desaparici n de un pico con uno de los anti cadenas ligeras kappa o lambda sin desaparici n de ese pico con uno de los anti cadenas pesadas puede significar la presencia de una cadena ligera libre que habr que confirmar con las
27. ente se presenta como un diagn stico de gammapat a biclonal cuando en realidad s lo hay una gammapat a monoclonal En cualquier caso la literatura indica que no hay diferencias entre los tratamientos de una gammapat a monoclonal y una gammapat a biclonal Kyle et al 1981 En caso de duda sobre un perfil biclonal se recomienda confirmar el resultado con las t cnicas de inmunofijaci n HYDRAGEL En ocasiones pueden observarse leves desplazamientos entre el perfil ELP y los perfiles de antisueros superpuestos especialmente en la zona beta 1 No deben confundirse con la desaparici n de un pico monoclonal en uno o varios perfiles de antisueros Use nicamente los antisueros espec ficos para la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING Teniendo en cuenta los principios anal ticos de las t cnicas actuales principios de la electroforesis de zona resoluci n y sensibilidad no hay garant as en cuanto a la detecci n total de todos los componentes monoclonales Ver MUESTRAS PARA EL AN LISIS Cuando una prote na monoclonal es detectada mediante las t cnicas de an lisis de prote nas en el CAPILLARYS t cnicas CAPILLARYS PROTEIN E 5 y 6 y no es caracterizada mediante la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING se recomienda repetir el inmunotipado de la muestra trat ndola previamente con beta mercaptoetanol vea el p rrafo anterior y si persiste la duda confirmar el resultado obtenido usando una t cnica de inmunofijaci n en gel de agarosa Res
28. espu s de unos 10 minutos el sistema CAPILLARYS estar listo para trabajar 4 Debe seleccionar el modo de diluci n que se aplicar autom ticamente a cada muestra seg n su concentraci n de inmunoglobulinas HIPERGAMMA si la concentraci n de inmunoglobulinas es superior a 20 g L caso de hipergammaglobulinemia HIPOGAMMA si la concentraci n de inmunoglobulinas es inferior a 8 g L caso de hipogammaglobulinemia EST NDAR en el resto de casos es el modo de diluci n seleccionado por defecto 5 Paraelan lisis de sueros use el kit CAPILLARYS IMMUNOTYPING con el programa de an lisis IMMUNOTYPING 6 y el tamp n de an lisis CAPILLARYS PROTEIN E 6 Para seleccionar el programa de an lisis IMMUNOTYPING 6 y colocar en su sitio el contenedor del tamp n CAPILLARYS PROTEIN E 6 lea detenidamente el manual de instrucciones del CAPILLARYS NOTA El paso de la t cnica CAPILLARYS PROTEIN E 6 a la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING e inversamente no requiere cambiar el contenedor del tamp n 6 Coloque 1 solo tubo primario en la posici n 1 de cada cargador de muestras de forma que el c digo de barras del tubo est orientado hacia la ventana de lectura Si la muestra colocada en el cargador no forma parte de los sueros seleccionados previamente se aplicar el modo de diluci n EST NDAR 64 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 7 Para cada muestra que vaya a analizar coja un segmento de antisueros nuevo saque la l m
29. estables hasta la fecha de caducidad indicada en el kit NO LOS CONGELE NOTA Durante el transporte los segmentos de antisueros pueden permanecer a temperatura ambiente entre 15 y 30 C durante 15 dias sin que la calidad del test se vea afectada ATENCI N No use agua destilada o desionizada comercial como por ejemplo el agua para planchar riesgo de deterioro importante de los capilares Use exclusivamente agua de calidad ultrapura como el agua para inyecci n 62 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 AN LISIS DE SUEROS TECNICA CAPILLARYS IMMUNOTYPING REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS 1 KIT CAPILLARYS PROTEIN E 6 SEBIA referencia 2003 Presentaci n conservaci n estabilidad y sefiales de deterioro Vea las instrucciones del kit ATENCI N No use los segmentos de diluci n contenidos en el kit CAPILLARYS PROTEIN E 6 para la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2 AGUA DESTILADA O DESIONIZADA Uso Para la limpieza de los capilares del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA Se recomienda usar agua destilada desionizada filtrada con un filtro de poro lt 0 45 Renueve el agua cada d a para evitar contaminaciones microbianas En caso de conservaci n prolongada a ada 35 uL L de ProClin 300 IMPORTANTE Se recomienda lavar el contenedor de limpieza con agua destilada o desionizada en abundancia antes de llenarlo 3 CAPICLEAN Presentaci n El vial de la soluci n enzim
30. i n ocular facial Uso Para lavar los capilares del CAPILLARYS Reactivo adicional necesario en caso de realizar series inferiores a 40 an lisis IMPORTANTE Antes de llenar el contenedor de soluci n de lavado se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el cuello del contenedor el conector y el tubo para evitar la acumulaci n de sales Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Las soluciones de lavado concentrada y diluida deben conservarse a temperatura ambiente o en nevera en contenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial La soluci n diluida es estable durante 3 meses Deseche la soluci n de lavado diluida si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana 63 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS 1 Sistema de electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA referencias n 1220 6 n 1222 2 Cargadores de muestras suministrados con el sistema CAPILLARYS 3 Contenedores de pl stico suministrados con el sistema CAPILLARYS contenedor para la limpieza de los capilares debe llenarse con agua destilada o desionizada contenedor de soluci n de lavado y contenedor de desechos MUESTRAS PARA EL AN LISIS Extracci n y conservaci n de las muestras El an lisis se hace con sueros frescos Los sueros deben obtenerse seg n los
31. ina de pl stico que lo precinta y col quelo en el mismo cargador que el tubo primario en caso de ausencia de segmento aparecer un mensaje de advertencia NOTA Los segmentos tienen una forma caracteristica con un saliente que evita colocarlos al rev s en los cargadores de muestras del sistema CAPILLARYS 8 Introduzca el o los cargador es con un tubo primario y el segmento de antisueros en el sistema CAPILLARYS por el orificio de entrada situado en medio del aparato Se pueden introducir hasta trece cargadores de muestras a la vez pudi ndose a adir nuevos cargadores de forma continua a medida que se vaya completando el an lisis de los cargadores ya introducidos 9 Saque de la cinta de salida situada a la izquierda del aparato los cargadores ya analizados 10 Coja con precauci n el segmento de antisueros usado y des chelo ATENCI N Manipule con precauci n los segmentos de antisueros que contengan muestras biol gicas DILUCI N MIGRACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS 1 Lectura de los c digos de barras de cada tubo primario de muestra y del cargador correspondiente 2 Diluci n del suero con el diluyente contenido en el pocillo doble del segmento seguido de la dispensaci n de la muestra diluida en los 6 pocillos restantes soluci n ELP anti lg G anti Ig A anti Ig M anti Kappa y anti Lambda con limpieza de la c nula de muestras entre cada diluci n El modo de diluci n seleccionado previamente para esa
32. ina y alfa 1 la desaparici n del o de los pico s monoclonal es puede no ser completa en los perfiles de antisueros Muestras que contengan una o m s prote nas monoclonales polimerizadas En este caso el complejo formado con los antisueros puede aparecer en forma de un pico ancho y grande entre las fracciones alb mina y beta 1 Prote nas monoclonales que migran en las zonas beta 1 o beta 2 Encaso de ausencia de prote na monoclonal en la zona gamma seleccione el tipo de diluci n adaptado a la concentraci n de inmunoglobulinas de la muestra Encaso de sospecha de que haya una prote na monoclonal adicional en la zona gamma seleccione el tipo de diluci n adaptado a la intensidad de esta prote na monoclonal Presencia de biclonales Las biclonales pueden ser debidas a inmuncomplejos o a gammapat as biclonales o lo que es extremadamente raro a reacciones cruzadas ver Interferencias y limitaciones Interferencias y limitaciones Numerosos estudios han mostrado que la reacci n ant geno anticuerpo en fase l quida es diferente a la reacci n que ocurre en un gel La t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING se desarrolla totalmente en medio l quido y puede suceder que algunos antisueros den lugar a reacciones cruzadas con algunas prote nas monoclonales presentes en la muestra No hay ning n riesgo de falsos negativos es decir de no detectar una gammapat a pero esta reacci n cruzada extremadamente poco frecu
33. is en diferentes soportes entre los que est el gel de agarosa se ha desarrollado la t cnica de la electroforesis capilar que ofrece las ventajas de una automatizaci n completa del an lisis separaciones r pidas y una buena resoluci n Se define como una t cnica de separaci n electrocin tica realizada en un tubo de di metro interno inferior a 100 lleno de un tamp n compuesto por electrolitos Se considera una tecnolog a intermedia entre la electroforesis de zona en soporte y la cromatograf a l quida El sistema CAPILLARYS usa el principio de la electroforesis capilar en soluci n libre que representa la forma m s corriente de electroforesis capilar Permite la separaci n de mol culas cargadas en funci n de su movilidad electrofor tica propia en un tamp n de un pH dado y seg n el pH del electrolito de un flujo electroendosm tico m s o menos importante Las inmunoglobulinas monoclonales marcadores de gammapat as son detectadas durante la electroforesis de prote nas En la electroforesis capilar se presentan en forma de picos anormales situados esencialmente en las zonas beta o gamma del perfil electrofor tico En las t cnicas CAPILLARYS IMMUNOTYPING y CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE el inmunotipado se realiza usando antisueros monoespec ficos y permite la identificaci n de los picos monoclonales detectados en la electroforesis El sistema CAPILLARYS posee 8 capilares en paralelo En este sistema la muestra que se va a ana
34. it o en la etiqueta del vial La soluci n diluida es estable durante 3 meses Deseche la soluci n de lavado diluida si cambia de aspecto aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS 1 Sistema de electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA referencias n 1220 6 n 1222 2 Cargadores de muestras suministrados con el sistema CAPILLARYS 3 Contenedores de pl stico suministrados con el sistema CAPILLARYS contenedor para la limpieza de los capilares debe llenarse con agua destilada o desionizada contenedor de soluci n de lavado y contenedor de desechos 4 Tubos de hem lisis de 75 mm de altura y 13 mm de di metro MUESTRAS PARA EL AN LISIS Extracci n y conservaci n de las muestras El an lisis se hace preferentemente con orinas frescas de 24 horas Las orinas deben obtenerse seg n los procedimientos establecidos de uso en el laboratorio cl nico Las muestras de orina puede conservarse una semana en nevera entre 2 y 8 C Para conservaciones m s prolongadas se recomienda congelar las muestras a 70 las orinas congeladas son estables 1 mes como m nimo IMPORTANTE No congele las orinas a 20 C Las muestras degradadas o descongeladas pueden presentar fracciones deformadas con aparici n de peque os picos suplementarios como consecuencia de la degradaci n de las prote nas NOTA No conserve las muestras de orina a temperatura ambiente Preparaci n de las
35. la intensidad del pico proteico anormal que quiera caracterizar para mejorar la sensibilidad de detecci n de un pico de intensidad d bil o el inmunotipado de un pico de intensidad fuerte ver el p rrafo Preparaci n del an lisis electrofor tico Interferencias y limitaciones Numerosos estudios han mostrado que la reacci n antigeno anticuerpo en fase liquida es diferente de la reacci n que ocurre en un gel La t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE se desarrolla totalmente en medio liquido y puede suceder que algunos antisueros den lugar a reacciones cruzadas con algunas prote nas monoclonales presentes en la muestra No hay ning n riesgo de falsos negativos es decir de no detectar una gammapatia pero esta reacci n cruzada extremadamente poco frecuente se presenta como un diagn stico de gammapat a biclonal cuando en realidad s lo hay una gammapat a monoclonal En cualquier caso la literatura indica que no hay diferencias entre los tratamientos de una gammapat a monoclonal y una gammapat a biclonal Kyle et al 1981 En caso de duda sobre un perfil biclonal se recomienda confirmar el resultado con las t cnicas de inmunofijaci n HYDRAGEL En ocasiones pueden observarse leves desplazamientos entre el perfil ELP y los perfiles de antisueros superpuestos especialmente en la zona beta 1 No deben confundirse con la desaparici n de un pico monoclonal en uno o varios perfiles de antisueros Use nicamente los antisuer
36. lg M Fo Interpretation lg G Kappa 258 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 SCH MAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES DE S RUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES Profil biclonal Biclonal pattern lg G Kappa lg M Kappa Figure 5 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein S ELP lg G ie lg A Interpretation lg G Kappa Ig M Kappa 259 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 SCH MAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES DE S RUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES Profil biclonal Biclonal pattern lg G Kappa lg G Lambda Figure 6 gt Paraprot ine limin e Decreased paraprotein gt Paraprot ine non affect e Not affected paraprotein ELP lg G To Ig A lg M Interpretation lg G Kappa lg G Lambda 260 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 SCH MAS FIGURES PROFILS LECTROPHOR TIQUES DE S RUMS ELECTROPHORETIC PATTERNS OF SERUM SAMPLES Profil oligoclonal Oligoclonal pattern Figure 7 ELP IgG JV Iw 94 lgM
37. lizar es inyectada por aspiraci n en el nodo simult neamente en seis capilares Para el inmunotipado el perfil proteico de referencia perfil ELP se obtiene mediante inyecci n de la muestra en presencia de la soluci n ELP en el capilar n 1 Los perfiles de los antisueros se obtienen por inyecci n de la misma muestra en presencia de los antisueros de diferentes especificidades anti lg G anti Ig A anti Ig M anti Kappa y anti Lambda en los cinco capilares siguientes n 2 a 6 La separaci n se realiza a continuaci n aplicando una diferencia de potencial de varios miles de voltios en los extremos de cada capilar y la detecci n directa de las prote nas se efect a a 200 nm en el lado cat dico Los capilares se lavan entre cada an lisis con una soluci n de lavado y luego con tamp n de an lisis La superposicion de uno de los perfiles de antisuero con el perfil ELP permite visualizar la desaparici n y o la disminuci n de un pico monoclonal en el perfil del antisuero y tipar una gammapatia NOTA Con el tamp n de pH alcalino usado el orden de migraci n de las prote nas es el siguiente del c todo al nodo gamma globulinas beta 2 globulinas beta 1 globulinas alfa 2 globulinas alfa 1 globulinas y alb mina Cada fracci n contiene uno o varios constituyentes El complejo inmunoglobulinas de la muestra orina o suero inmunoglobulinas del antisuero espec fico aparece en una posici n muy an dica en la zona entre alfa 1 al
38. lt a 8 g L con el modo de diluci n EST NDAR en 3 sueros cuya concentraci n de lg estaba comprendida entre 8 y 20 g L y con el modo de diluci n HIPERGAMMA en 3 sueros cuya concentraci n de lg era gt a 20 g L Este an lisis se repiti 4 veces con 3 lotes diferentes de segmentos de antisueros Todas las muestras analizadas proporcionaron los mismos resultados con los 3 lotes de segmentos probados y los perfiles obtenidos eran los caracter sticos de cada una de las muestras analizadas En la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING el inmunotipado detect los picos monoclonales esperados en cada muestra Exactitud Se analizaron 135 muestras de suero 119 muestras patol gicas diferentes y 16 sueros normales en paralelo usando la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING y la t cnica de inmunofijaci n en gel de agarosa HYDRAGEL 9 IF SEBIA Los resultados obtenidos mostraron una correlaci n del 95 entre las dos t cnicas En los 16 sueros normales correlaci n perfecta los 119 sueros patol gicos 112 sueros mostraron una correlaci n perfecta 4 sueros que presentaban una prote na monoclonal en muy baja cantidad sobre un fondo policlonal importante mostraron una correlaci n parcial 3 sueros con un perfil oligoclonal con bandas m ltiples tambi n mostraron una correlaci n parcial En todos los casos el diagn stico cl nico obtenido muestra una correlaci n perfecta entre los dos sistemas de an lisis en todas las muestras
39. muestras Prepare previamente las muestras de orina seg n el protocolo de preparaci n di lisis y concentraci n indicado en las instrucciones del kit CAPILLARYS URINE vea el p rrafo Reactivos necesarios no suministrados Use directamente las muestras de orina preparadas IMPORTANTE Para analizar las orinas mediante electroforesis capilar es necesario dializar y concentrar las muestras usando el sistema de di lisis CAPILLARYS SEBIA tubos de 20 mL Use un tubo por muestra La muestra dializada y concentrada con este sistema puede ser analizada a continuaci n con las t cnicas CAPILLARYS URINE y CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE Las muestras deben analizarse como mucho al d a siguiente de su preparaci n Para limitar la adsorci n de las prote nas urinarias a la membrana del dispositivo de di lisis y concentraci n sistema de di lisis CAPILLARYS se recomienda no conservar la muestra dentro del sistema de di lisis tras la centrifugaci n sino dentro de un microtubo que puede guardarse en nevera entre 2 y 8 C Muestras a descartar No use muestras de orina antiguas o mal conservadas ya que las fracciones estar an muy modificadas debido a la degradaci n de las prote nas urinarias Se recomienda observar el aspecto de la orina despu s de la primera centrifugaci n 10 minutos a 5 000 r p m por si hay hem lisis o turbidez No use muestras conservadas en un dispositivo de di lisis y concentraci n ya que algunas p
40. ntificar los tubos de hem lisis que sirven de soporte a los microtubos que contienen las muestras de orina a analizar con los c digos de barras correspondientes a las muestras de orina 9 Coloque el c digo de barras del tubo orientado hacia la ventana de lectura En caso de que la muestra colocada en el cargador no forme parte de las orinas seleccionadas previamente se aplicar el modo de diluci n HIPOGAMMA 10 Para cada muestra que vaya a analizar coja un segmento de antisueros nuevo saque la l mina que la precinta y col quelo en el mismo cargador en el que est el tubo de hem lisis que sirve de soporte al microtubo con la muestra preparada en caso de ausencia de segmento aparecer un mensaje de advertencia NOTA Los segmentos tienen una forma caracter stica con un saliente que evita colocarlos al rev s en los cargadores del sistema CAPILLARYS 11 Introduzca el o los cargador es en el sistema CAPILLARYS por el orificio de entrada situado en medio del aparato Se pueden introducir hasta trece cargadores de muestras a la vez pudi ndose a adir nuevos cargadores de forma continua a medida que se vaya completando el an lisis de los cargadores ya introducidos 12 Saque de la cinta de salida situada a la izquierda del aparato los cargadores ya analizados 13 Coja con precauci n el segmento de antisueros usado y des chelo ATENCI N Manipule con precauci n los segmentos de antisueros que contengan muestras biol gicas
41. oluci n de problemas Contacte con el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA en caso de que el an lisis sea defectuoso Las fichas de datos de seguridad de los diferentes reactivos del kit as como las informaciones relativas a la eliminaci n de los desechos est n disponibles en el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA 66 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 CARACTERISTICAS T CNICAS Reproducibilidad intraserial Se analizaron cinco muestras de suero patol gicas con gammapatia monoclonal y un suero normal usando la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING con el modo de diluci n est ndar con 2 lotes diferentes de segmentos de antisueros cada segmento conten a el mismo reactivo en todos los pocillos soluci n ELP anti Ig G anti Ig A anti Ig M anti Kappa y anti Lambda Todas las muestras analizadas proporcionaron los mismos resultados con los 2 lotes de segmentos probados y los perfiles obtenidos fueron los caracter sticos de cada una de las muestras En la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING el inmunotipado detect s lo un componente monoclonal en las 5 muestras patol gicas y no detect ning n pico en el suero normal Reproducibilidad interserial e interlotes Se analizaron nueve muestras de suero patol gicas con gammapat a monoclonal que presentaban concentraciones de inmunoglobulinas lg diferentes con la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING usando el modo de diluci n HIPOGAMMA en 3 sueros cuya concentraci n de lg era
42. os espec ficos para la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE Teniendo en cuenta los principios anal ticos de las t cnicas actuales principios de la electroforesis de zona resoluci n y sensibilidad no hay garant as en cuanto a la detecci n total de todos los componentes monoclonales Vea MUESTRAS PARA EL AN LISIS Resoluci n de problemas Contacte con el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA en caso de que el an lisis sea defectuoso Las fichas de datos de seguridad de los diferentes reactivos del kit as como las informaciones relativas a la eliminaci n de los desechos est n disponibles en el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA Ma CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 CARACTERISTICAS T CNICAS Reproducibilidad intraserial Se analizaron cinco muestras patol gicas con una gammapat a monoclonal o biclonal y una muestra normal usando la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE con el modo de diluci n HIPOGAMMA con 2 lotes diferentes de segmentos de antisueros cada segmento conten a el mismo reactivo en todos los pocillos soluci n ELP antisueros anti lg G anti Ig A anti lg M anti Kappa y anti Lambda Todas las muestras analizadas proporcionaron los mismos resultados con los 2 lotes de segmentos probados y los perfiles obtenidos fueron los caracter sticos de cada una de las muestras En la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE el inmunotipado detect los componentes monoclonales en las 5 muestras patol gic
43. procedimientos establecidos de uso en el laboratorio clinico Las muestras pueden conservarse un m ximo de 10 dias en nevera entre 2 y 8 C Para conservaciones m s prolongadas congele las muestras r pidamente como m ximo durante las 8 horas siguientes a su obtenci n Los sueros congelados son estables 1 mes NOTA No conserve los sueros a temperatura ambiente Las prote nas de los sueros conservados entre 2 y 8 C se degradan en particular el complemento C3 Preparaci n de las muestras Use directamente muestras de suero sin diluir Despu s de conservarlos en nevera entre 2 y 8 C o congelarlos algunos sueros especialmente aquellos que contengan una crioglobulina o un criogel se vuelven viscosos o turbios Una vez que hayan alcanzado el estado l quido se pueden analizar directamente Igualmente los sueros que contengan una inmunoglobulina polimerizada pueden analizarse directamente sin ning n tratamiento previo Se recomienda observar el aspecto del suero antes del an lisis por si hay hem lisis presencia de crioglobulinas o turbidez Muestras a descartar No use muestras de suero antiguas o mal conservadas ya que las fracciones beta estar an muy modificadas No use muestras de plasma El fibrin geno migra en posici n beta 2 pico adicional contenido en beta 2 PROCEDIMIENTO El sistema CAPILLARYS es un instrumento multiparam trico autom tico que permite realizar el an lisis de las prote nas s ricas en 6
44. rote nas podr an haberse adsorbido a la membrana PROCEDIMIENTO El sistema CAPILLARYS es un instrumento multiparam trico autom tico que permite realizar el an lisis de las prote nas urinarias en 6 capilares en paralelo con la t cnica CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE seg n las etapas siguientes lectura de los c digos de barras del cargador y de la muestra de orina que se va a analizar diluci n de la muestra mezcla de la orina con la soluci n ELP y con los antisueros de las diferentes especificidades lavado de los capilares inyecci n de la muestra diluida separaci n y detecci n directa de las prote nas en los capilares Las etapas manuales son las siguientes colocaci n de los microtubos sin tap n que contienen las muestras de orina preparadas que se van a analizar en tubos de hem lisis que sirven de soporte y permiten colocar las muestras en los cargadores cada tubo de soporte debe estar identificado con el c digo de barras correspondiente a la muestra que se vaya a analizar colocaci n de un segmento de antisueros destapado en cada cargador de muestras introducci n en el sistema CAPILLARYS recuperaci n de los cargadores despu s del an lisis Un an lisis electrofor tico previo realizado en el sistema CAPILLARYS con el kit CAPILLARYS URINE habr permitido seleccionar las muestras en las que el perfil proteico presenta un pico anormal mediante examen visual de los resultados
45. se superpone sobre el perfil ELP En caso de reacci n entre la prote na monoclonal y el antisuero espec fico el pico correspondiente desaparecer del perfil electrofor tico del antisuero Estas comparaciones permiten identificar y caracterizar el o los componentes monoclonales En el an lisis de orinas las posiciones de las diferentes zonas proteicas Alb mina Alfa 1 Alfa 2 Beta y Gamma son indicadas en la pantalla de edici n y en el informe de resultados FIN DE LA SECUENCIA DEL AN LISIS Hay que realizar un procedimiento de extinci n al acabar la sesi n de trabajo para conservar los capilares en condiciones ptimas IV LLENADO DE LOS CONTENEDORES DE REACTIVO El aparato autom tico CAPILLARYS permite una gesti n autom tica de los reactivos IMPORTANTE Es necesario seguir el procedimiento previsto para el cambio de los contenedores si no se hace correctamente los contenedores pueden despresurizarse y los an lisis pueden verse afectados y respetar el c digo de colores contenedor conector en cada cambio de contenedor 70 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 La aparici n de la ventana de gesti n de los reactivos indica que es necesario cambiar uno varios reactivos colocar un nuevo contenedor de tamp n de an lisis y o llenar el contenedor de lavado con la soluci n de lavado reconstituida y o llenar el contenedor de limpieza con agua destilada o desionizada filtrada y o vaciar el conten
46. ut agarose gel electrophoresis J Chromatogr A 744 205 213 1996 4 Gay Bellile C Bengoufa D Houze P Le Carrer D Benlakehal M Bousquet B Gourmel B Le Bricon T Automated multicapillary electrophoresis for analysis of human serum proteins Clin Chem 49 1909 1915 2003 5 Henskens Y et al Detection and identification of monoclonal gammopathies by capillary electrophoresis Clin Chem 44 1184 1190 1998 6 Jellum E et al Journal of Chromatography Biomedical Applications Diagnostic applications of chromatography and capillary electrophoresis J Chromatogr B 689 155 164 1997 7 Jenkins MA and Guerin MD Journal of Chromatography Biomedical Applications Capillary electophoresis procedures for serum protein analysis comparison with established techniques J Chromatogr B 699 257 268 1997 8 Joachim GR Cameron JS Chwartz M Belker EL 1964 Selectivity of protein excretion in patients with the nephrotic syndrome J Clin Invest 43 2332 2346 9 Katzmann JA et al Identification of monoclonal proteins in serum A quantitative comparison of acetate agarose gel and capillary electrophoresis Electrophoresis 18 1775 1780 1997 10 Keren DF Detection and characterization of monoclonal components in serum and urine Clin Chem 44 6 1143 1145 1998 11 Kyle RA Robinson RA Katzmann JA The clinical aspects of biclonal gammopathies Review of 57 cases Am J Med 71 6 999 1008 1981
47. varse 3 meses a temperatura ambiente en un recipiente de pl stico cerrado herm ticamente protegido de la luz solar y de cualquier fuente de calor o ignici n y alejado de los cidos y el amoniaco 6 SOLUCI N DE LAVADO CAPILLARYS Preparaci n Cada vial de soluci n de lavado concentrada SEBIA referencia n 2052 2 viales de 75 mL debe completarse hasta 750 mL con agua destilada o desionizada ATENCI N La soluci n de lavado contiene sosa c ustica Soluci n corrosiva Provoca quemaduras graves Cons rvela alejada del alcance de los nifios En caso de contacto con los ojos l velos inmediatamente con agua en abundancia y consulte a un especialista Qu tese inmediatamente cualquier prenda manchada o salpicada Use guantes apropiados y un sistema de protecci n ocular facial Uso Para lavar los capilares del CAPILLARYS Reactivo adicional en caso de realizar series inferiores a 40 an lisis IMPORTANTE Antes de llenar el contenedor de soluci n de lavado se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el cuello del contenedor el conector y el tubo para evitar la acumulaci n de sales 68 CAPILLARYS IMMUNOTYPING 2009 04 Conservaci n estabilidad y sefiales de deterioro Las soluciones de lavado concentrada y diluida deben conservarse a temperatura ambiente o en nevera en contenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el k
48. zar el o los componentes monoclonales IMPORTANTE EI perfil proteico nativo perfil Ref no se superpone ni tampoco puede superponerse sobre ning n perfil de antisueros del inmunotipado FIN DE DE LA SECUENCIA DEL AN LISIS Hay que realizar un procedimiento de extinci n al acabar la sesi n de trabajo para conservar los capilares en condiciones ptimas IV LLENADO DE LOS CONTENEDORES DE REACTIVO El aparato autom tico CAPILLARYS permite una gesti n autom tica de los reactivos IMPORTANTE Es necesario seguir el procedimiento previsto para el cambio de los contenedores si no se hace correctamente los contenedores pueden despresurizarse y los an lisis pueden verse afectados y respetar el c digo de colores del contenedor conector en cada cambio de contenedor La aparici n de la ventana de gesti n de los reactivos indica que es necesario cambiar uno o varios reactivos colocar un nuevo contenedor de tamp n de an lisis y o llenar el contenedor de lavado con la soluci n de lavado reconstituida y o llenar el contenedor de limpieza con agua destilada o desionizada filtrada y o vaciar el contenedor de desechos ATENCI N No use agua destilada o desionizada comercial como por ejemplo el agua para planchar riesgo de deterioro importante de los capilares Use exclusivamente agua de calidad ultrapura como el agua para inyecci n IMPORTANTE Se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundan
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