Inserto BIOZIMA CHAGAS RECOMBINANTE
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1. PRINCIPIO DEL ENSAYO Es un ensayo inmunoenzim tico heterog neo no competitivo basado en el m todo indirecto de tercera generaci n debido al uso de ant genos recombinantes para la detecci n de anticuerpos contra el T cruzi en muestras de suero plasma humano Los ant genos se obtienen por t cnica de ADN recombinante y representan epitopes inmunodominantes correspondientes a los estad os epimastigote y trypomastigote de diferentes cepas del Trypanosoma cruzi Una diluci n apropiada de las muestras se incuba en pocillos de poliestireno recubiertos con ant genos purificados de T cruzi Los anticuerpos contra T cruzi son especificamente capturados por esos ant genos quedando unidos a la fase s lida Luego de varios lavados a fin de eliminar las inmunoglobulinas no capturadas el sistema se incuba con un anticuerpo anti inmunoglobulina humana conjugado a peroxidasa Este conjugado reacciona espec ficamente con los anticuerpos contra T cruzi inmunocapturados El conjugado no unido se desecha por lavado y se revela la presencia de peroxidasa mediante el agregado de per xido de hidr geno tetrametilbencidina como sustrato cromog nico Esta incubaci n da como resultado la aparici n de un color azul cuya intensidad depende de la concentraci n y de la afinidad de los anticuerpos contra T cruzi de la muestra La reacci n enzim tica puede ser detenida mediante el agregado de cido sulf rico lo que produce un viraje de color hacia el amari2. 0 ml Conjugado 10X Soluci n proteica buffereada que contiene un anticuerpo anti inmunoglobulina humana conjugado con peroxidasa HRP concentrado 10X Contiene estabilizadores de prote nas y conservadores Diluir 1 10 antes de usar con el Diluente de Conjugado provisto Volumen Cod R96 2 5 ml Cod R192 3 5ml Diluente de Conjugado Suspensi n proteica para la diluci n del conjugado concentrado 10X estabilizada buffereada con P B S con conservadores Agitar antes de usar Volumen Cod R96 15ml Cod R192 30 ml Sustrato Soluci n que contiene per xido de hidr geno tamponado Para mezclar con el Crom geno Volumen Cod R96 9 ml Cod R192 15 ml Crom geno Soluci n que contiene 3 3 5 5 Tetrametilbenzidina TMB con estabilizadores Para mezclar con el Sustrato Advertencia Almacenar y manipular protegida de la luz Volumen Cod R96 9 ml Cod R192 15 mil Soluci n Stop Soluci n de Acido Sulf rico 1M Reactivo corrosivo Listo para usar Volumen Cod R96 15ml Cod R192 30 ml Manual de Instrucciones El presente documento Nota Control Positivo y Negativo se preparan a partir de suero humano no reactivo para HBsAg y para anticuerpos contra HCV y HIV adecuadamente inactivado Sin embargo por ser derivados de la sangre humana deben manejarse con precauci n MATERIALES NECESARIOS NO PROVISTOS Micropipetas de 10 20 100 200 y 1000 pl con puntas descartables Material volum trico de vidrio Cron metro y papeles absorben
3. CIONES T CNICAS e Coloque todos los reactivos a temperatura ambiente al menos 1 hora antes de comenzar con la prueba e Saque del marco s lo los pocillos necesarios para la prueba programada y guarde los restantes en su propio envase que contiene el desecante Obture firmemente el envase con cinta antes de guardarlas entre 2 y 8 C e Los tiempos de distribuci n e incubaci n deben ser los mismos para todos los pocillos evite interrupciones entre los pasos del ensayo e En el procedimiento de lavado use s lo la Soluci n para Lavado proporcionada con el equipo y siga cuidadosamente las indicaciones expresadas en la secci n Instrucciones de Lavado e Elimine el exceso de Soluci n de lavado de los pocillos golpe ndolos en forma invertida sobre papel absorbente e El color desarrollado en la ltima incubaci n es estable como m ximo 30 minutos en la oscuridad RECOLECCI N Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Puede utilizarse suero fresco o plasma EDTA Heparina Citrato humano La sangre se extraer de un paciente preferentemente en ayunas siguiendo las normas generales Las muestras deben ser l mpidas Ante la presencia de turbiedad precipitados o co gulos recomendamos centrifugar a 2000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente o filtrar con membranas de 0 22u No utilizar muestras con contaminaci n bacteriana dado que pueden producir falsos resultados Muestras altamente lip micas ict ricas o hemolizadas no deber an se
4. Manual de Instrucciones BIOZIMA CHAGAS RECOMBINANTE Enzimoinmunoensayo ELISA de tercera generaci n para la detecci n de anticuerpos espec ficos contra el Trypanosoma cruzi en suero o plasma humano S lo para uso diagn stico in vitro PRESENTACIONES Equipos por 96 determinaciones Cod R96 Equipos por 192 determinaciones Cod R192 ASPECTO CL NICO Y USO AL QUE ESTA DESTINADO La Enfermedad de Chagas es causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi afectando principalmente a los pa ses de Latinoam rica Las v as de transmisi n del Trypanosoma cruzi pueden ser vectorial a trav s del las heces infectadas del insecto vector del g nero Triatominae cong nita por la ruta transplacentaria transfusional por contacto con sangre infectada por trasplante de rganos o por accidente laboral Se reconocen tres per odos evolutivos de la enfermedad El per odo agudo generalmente visto en ni os es usualmente asintom tico La mayor a de los casos agudos se resuelve en dos a tres meses Le sigue el per odo indeterminado donde la seropositividad es la evidencia de la existencia de la enfermedad La enfermedad cr nica se manifiesta principalmente por la falla card aca que puede conducir a la muerte s bita Los tests basados en la detecci n de anticuerpos espec ficos son los m s com nmente usados como ensayos de rutina para inferir la infecci n por el Trypanosoma cruzi desarrollandose principalmente t cnicas de HAI IFI y ELISA
5. Posici n Controles Muestras A1 B1 Control Negativo Ci Control Positivo Dl H12 Muestras Reactivos Controles Muestras Diluente de Muestras Ver 200ul 200ul Preparaci n de los Reactivos Controles 10ul Muestras 10ul Homogeneizar 10 segundos e incubar durante 30 minutos a 37 C Lavar 6 veces con Soluci n para Lavado diluida Ver Preparaci n de los Reactivos Diluir cantidad necesaria de Conjugado 10X Conjugado diluido Ver 100ul 100ul Preparaci n de los Reactivos Homogeneizar 10 segundos e incubar durante 30 minutos a 37 C Lavar 6 veces con Soluci n para Lavado diluida Ver Preparaci n de los Reactivos Preparar cantidad necesaria de Sustrato Crom geno Sustrato Crom geno Ver 100ul 100ul Preparaci n de los Reactivos Homogeneizar 10 segundos e incubar durante 30 minutos a 37 C y oscuridad Leer inmediatamente los resultados en forma visual o frenar la reacci n Soluci n Stop 100ul 100ul Homogeneizar 10 segundos y leer espectrofotom tricamente a 450 nm contra blanco de aire dentro de los 30 minutos de agregada la Soluci n INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS EN FORMA VISUAL El Control Negativo debe ser incoloro o puede presentar una coloraci n celeste tenue El Control Positivo debe ser de color celeste o azul diferenciable del Control Negativo Las muestras incoloras o con coloraci n celeste tenue similar a la del Control Negativ
6. amiento Normalmente 6 ciclos de lavado autom tico de 300 400 yl pocillo cada uno con un reposo de 30 segundos entre cada ciclo son suficientes para remover falsos positivos y ruido de fondo Recomendamos calibrar el sistema de lavado sobre el propio equipo para tener reproducibilidad en el desarrollo anal tico En caso de lavado manual se sugiere realizar 6 ciclos distribuyendo y aspirando 300 400 yul pocillo por ciclo En todos los casos los desechos potencialmente infectivos del lavado de las microplacas tienen que ser inactivados con Hipoclorito de Sodio al 2 5 en concentraci n final durante 24 horas y desechados seg n la legislaci n vigente como residuos patog nicos PROCEDIMIENTO DE ENSAYO Por lo menos 1 hora antes de usar coloque todos los reactivos necesarios para la prueba a temperatura ambiente Agite antes de usar el Diluente de Muestras y el Diluente de Conjugado 1 Extraer del envase la cantidad de Pocillos de Reacci n necesarios para el ensayo considerando como m nimo dos Controles Negativos y uno Positivo Agregar a cada pocillo 200 ul de Diluente de Muestras ver Preparaci n de los Reactivos Dispensar 10ul de cada Muestra y los Controles en el Diluente de Muestras anteriormente agregado Luego de cada dispensado homogeneizar bien por carga y descarga de la micropipeta Aplicar sobre los pocillos movimientos circulares o peque os golpes laterales durante 10 segundos Incubar a 37 C durante 30 minutos Descart
7. ar el contenido total de los pocillos por aspiraci n y lavarlos 6 veces con la Soluci n para Lavado diluida ver Preparaci n de los Reactivos seg n las instrucciones indicadas en nstrucciones de lavado Por ltimo invertir los pocillos y golpearlos sobre papel absorbente para eliminar el l quido residual Durante la incubaci n y minutos antes de usar preparar la soluci n de conjugado diluido ver Preparaci n de los Reactivos Dispensar en cada pocillo 100ul de la soluci n de conjugado diluido Aplicar sobre los pocillos movimientos circulares o peque os golpes laterales durante 10 segundos Incubar a 37 C durante 30 minutos Descartar la soluci n de conjugado y lavar 6 veces como se indic en el punto 6 Prepara la soluci n de Sustrato Crom geno ver Preparaci n de los Reactivos Agregar 100 jul de Substrato Crom geno a todos los pocillos Homogeneizar bien durante 10 segundos aplicando sobre los pocillos movimientos circulares o peque os golpes laterales Incubar a 37 C y oscuridad durante 30 minutos Retirar del incubador y leer los resultados en forma visual inmediatamente alternativamente frenar la reacci n enzim tica con el agregado de 100 ul de Soluci n Stop homogeneizar bien durante 10 segundos y medir la Densidad Optica a 450 nm con un lector de ELISA empleando blanco de aire dentro de los 30 minutos de agregada la soluci n Esquema del procedimiento de ensayo
8. ctividad cruzada con otras parasitosis mujeres embarazadas y factor reumatoideo obteni ndose una especificidad superior al 99 sobre suero y plasma REPRODUCIBILIDAD Se ha calculado con el Control Positivo y el Control Negativo repetidamente probados en d as diferentes Se obtuvieron CV intraensayos e interensayos menores que el 20 para ambos Controles LIMITACIONES DEL M TODO La serolog a s lo constituye un dato auxiliar para el diagn stico La t cnica de ELISA como cualquier otra t cnica serol gica no puede ser concebida como un m todo de diagn stico definitivo ya que ste debe basarse en la correlaci n de los resultados de m s de un test con los datos cl nicos y epidemiol gicos En ese sentido todo resultado debe ser interpretado como una probabilidad mayor o menor de acierto en relaci n al caso estudiado dentro de la poblaci n normal o parasitada Toda muestra reactiva para ELISA tiene que ser confirmada por un m todo alternativo Un resultado no reactivo no excluye la posibilidad de exposici n o infecci n por el Trypanosoma cruzi En infecciones muy recientes menos de 30 45 d as de evoluci n la t cnica puede presentar resultados no reactivos o reactividades muy bajas BIBLIOGRAF A 1 Franco da Silveira J Umezawa E and Luquetti A Chagas disease recombinant Trypanosoma cruzi antigens for serological diagnosis Review Trends in Parasitology Vol 17 NO 6 June 2001 2 Houghton R Benson D Reynold
9. inaci n cruzada de una muestra no reactiva con una muestra reactiva adyacente Contaminaci n del Sustrato y Crom geno con agentes oxidantes como por ejemplo cloro Contaminaci n de la Soluci n Stop Contaminaci n de la Soluci n para Lavado diluida Conservaci n inadecuada de los pocillos de reacci n no utilizados Mal dispensado y homogeneizado de las muestras Incorrecto funcionamiento de los equipos y materiales utilizados para el desarrollo de la reacci n Usar materiales no provistos potencialmente contaminados o mal lavados Usar recipientes para la preparaci n de los reactivos potencialmente contaminados o mal lavados e Insuficiente atemperado del equipo al retirarlo de su temperatura de conservaci n antes de realizar la prueba e Inobservancia del procedimiento especialmente en la temperatura y tiempo de incubaci n e Otras CARACTER STICAS DE DESEMPE O DEL PRODUCTO SENSIBILIDAD La sensibilidad se ha determinado en ensayos cl nicos empleando muestras comprobadamente reactivas del Centro Nacional de Referencia para la Enfermedad de Chagas de Argentina Tambi n el equipo fue enfrentado con miembros de un panel interno reactivo para anticuerpos contra el Trypanosoma cruzi por los m todos de HAI IFI y otros ELISA En todos los estudios se obtuvo una concordancia del 100 ESPECIFICIDAD Se ha calculado empleando paneles de muestras no reactivas pertenecientes a hemodadores y de muestras que presentan potencialmente rea
10. izarse cuidadosamente para obtener resultados e interpretaciones cl nicas fiables 4 Evite cualquier contaminaci n de los reactivos al sacarlos de sus recipientes Nosotros recomendamos utilizar pipetas autom ticas con puntas descartables Cuando dispense los reactivos no toque las paredes y el fondo de los pocillos 5 No mezcle reactivos de lotes diferentes No intercambie la tapa entre los diferentes reactivos componentes del equipo 6 Aseg rese que el Sustrato Crom geno no entre en contacto con agentes oxidantes o con superficies met licas evite su exposici n a la luz durante la etapa de incubaci n o en su manipulaci n Cuando utilice el reactivo h galo s lo en recipientes y materiales pl sticos descartables perfectamente limpios o est riles 7 Muestras y materiales potencialmente infecciosos tienen que ser manejados con cuidado siguiendo las normas de bioseguridad vigentes 8 Todos los objetos en contacto directo con las muestras y los residuos del ensayo deben tratarse como potencialmente infecciosos Los procedimientos m s efectivos para la inactivaci n son el tratamiento con autoclave a 121 C durante 30 minutos o con Hipoclorito de Sodio a una concentraci n final de 2 5 durante 24 horas 9 Evite cualquier contacto de l quidos con la piel y mucosas Siempre use para su protecci n guantes lentes etc seg n las normas de bioseguridad 10 La Soluci n Stop es Irritante por lo tanto manip lela con cuidado PRECAU
11. llo espectrofotom tricamente cuantificable CONTENIDO DEL EQUIPO Microplaca con tiras de pocillos Microplaca s de 12x8 tiras con pocillos rompibles sensibilizados con ant genos recombinantes de Trypanosoma cruzi La microplaca est envasada en una bolsa tipo aluminio sellada con silicagel como desecante en su interior Llevar a temperatura ambiente antes de abrir para prevenir la formaci n de humedad NO de microplacas Cod R96 1 Cod R192 2 Control Positivo Diluci n de suero humano reactivo para anticuerpos contra el Trypanosoma cruzi con estabilizadores proteicos inactivado qu micamente con conservadores Material potencialmente infectivo Listo para usar Volumen Cod R96 0 6 ml Cod R192 0 8 ml Control Negativo Diluci n de suero humano no reactivo para anticuerpos contra el Trypanosoma cruzi con estabilizadores proteicos inactivado qu micamente con conservadores Material potencialmente infectivo Listo para usar Volumen Cod R96 0 6 ml Cod R192 0 8 ml Diluente de Muestras Suspensi n proteica para la diluci n de las muestras estabilizada buffereada con P B S con inhibidores de inespecificidad con conservadores Agitar antes de usar Volumen Cod R96 25ml Cod R192 50 ml Soluci n para Lavado 25X Soluci n para lavado de los pocillos concentrada 25X para ser diluida con Agua Destilada o Desionizada antes de usar Contiene un buffer fosfato concentrado y un agente surfactante Volumen Cod R96 50ml Cod R192 10
12. mible de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi debe ser analizada teniendo en cuenta el L mite de Decisi n Cut off value Calcule el valor promedio de densidad ptica DO del Control Negativo verifique la validez del ensayo como se describi y aplique la f rmula siguiente L mite de Decisi n o Cut off value DO promedio del Control Negativo 0 100 Muestras con un valor de DO 450nm dentro del valor del Cut off 10 se considerar an en zona gris Las muestras con un valor de DO 450nm por debajo del l mite inferior de la zona gris se considerar an no reactivas para anticuerpos contra Trypanosoma cruzi Muestras con un valor de DO 450nm m s alto que el l mite superior de la zona gris se considerar an reactivas para anticuerpos contra Trypanosoma cruzi Ejemplo de c lculo Control Negativo promedio DO 450nm 0 160 Control Positivo DO 450nm 1 700 Cut off CN 0 100 0 260 Zona gris Entre 0 234 y 0 286 Muestra 1 DO 450nm 0 085 No reactiva Muestra 2 DO 450nm 1 158 Reactiva CONCLUSIONES Toda muestra que ha sido reactiva y las correspondientes a la zona gris en una primera prueba deber an ser ensayadas nuevamente para su confirmaci n Si el resultado es negativo en el segundo ensayo la muestra se considerar a no reactiva Resultados no reproducibles en la reactividad de las muestras o de los controles podr an deberse a algunas de las siguientes causas Lavado incorrecto de los pocillos de reacci n Contam
13. o se considerar an presumiblemente no reactivas para anticuerpos contra T cruzi Las muestras que evidencien una coloraci n azul o celeste claramente distinguible del Control Negativo se considerar an presumiblemente reactivas para anticuerpos contra T cruzi INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS CON UN LECTOR DE ELISA Luego del agregado de la Soluci n Stop homogeneizar durante 10 segundos y medir la densidad ptica D O de cada pocillo con un lector fotom trico de ELISA lineal con filtro de 450nm o alternativamente bicrom tico provisto con filtros de 450nm y 620 630 nm empleando blanco de aire dentro de los 30 minutos de agregada la soluci n VALIDEZ DEL ENSAYO El ensayo es considerado v lido si 1 El valor de DO 450nm promedio del Control Negativo CN es lt 0 250 Valores anormales se observan si el sistema de lavado es defectuoso o no se observaron las Instrucciones de Lavado descriptas en la secci n correspondiente 2 El valor de DO 450nm del Control Positivo CP es gt 0 500 Valores diferentes se observan en caso de mantenimiento incorrecto del equipo En caso de que no se cumpla alguna de las especificaciones mencionadas anteriormente antes de repetir el test verifique la fecha de vencimiento del equipo el correcto funcionamiento de los instrumentos usados en el ensayo el procedimiento de distribuci n de Controles y Muestras o cualquier falla operativa C LCULO DE RESULTADOS La presencia o ausencia presu
14. r T cnico Jorge O Carradori Bioqu m y Farm Producci n Administraci n y Ventas Santiago del Estero 1162 C1075AAX Buenos Aires Argentina Telefax 5411 4304 2204 2374 E mail lemostbiotica com ar Producto para Diagn stico de uso In Vitro uso profesional exclusivo autorizado por la Administraci n Nacional de Medicamentos Alimentos y Tecnolog a M dica Certificado NO 006159 07 Industria Argentina
15. r usadas ya que pueden dar falsos resultados en el ensayo No utilice muestras inactivadas por calor Si las muestras no son usadas inmediatamente pueden guardarse entre 2 y 8 C durante 1 semana En caso de almacenamiento prolongado cong lelas a 20 C Evite congelamientos y descongelamientos reiterados Muestras congeladas deben ser homogeneizadas y centrifugadas antes de usar PREPARACI N DE LOS REACTIVOS Diluente de Muestras y Diluente de Conjugado Agitar antes de usar Soluci n para Lavado La Soluci n para Lavado concentrada 25X tiene que ser diluida 1 25 con Agua Destilada o Desionizada antes de usar Homogeneizar bien La Soluci n para Lavado diluida es estable a temperatura ambiente durante 1 semana Conjugado 10X Minutos antes de usar diluya el Conjugado concentrado 1 10 con el Diluente de Conjugado provisto Homogeneizar la soluci n suavemente Preparar s lo la cantidad necesaria para las pruebas en curso Sustrato Crom geno Aproximadamente 5 minutos antes de usar mezcle un volumen de Sustrato con un volumen de Crom geno en un recipiente de pl stico descartable en cantidad necesaria de acuerdo a las necesidades Esta soluci n es estable durante 1 hora a temperatura ambiente protegido de la luz INSTRUCCIONES DE LAVADO Un buen procedimiento de lavado es esencial para obtener datos anal ticos correctos y precisos Recomendamos que utilice un equipo lavador autom tico de microplacas de Elisa calibrado y en buen funcion
16. s L and col Multiepitope Synthetic Peptide and Recombinant Protein for the detection of Antibodies to Trypanosoma cruzi in Patients with Treated or Untreatd Chagas Disease Journal of Infectious Diseases 181 325 30 2000 3 Houghton R Benson D Reynolds L and col A multi Epitope Synthetic Peptide and Recombinant Protein for the Detection of Antibodies to Trypanosoma cruzi in Radioimmunoprecipitation Confirmed and Consensus PositiveSera Journal of Infectious Diseases 179 1226 34 1999 4 Venkatesan P and Wakelin D Techniques Elisas for parasitologists or Lies Damned Lies and Elisas Parasitology Today 9 6 228 232 1993 5 Cantarero L A Butler J E and Osborne J W The adsorptive characteristics of proteins for polystyrene and their significance in solid phase immunoassays Analytical Biochemistry 105 375 382 1980 6 Hillyer G V and Kagan I G New advances in the immunodiagnosis of parasitic infections I The enzyme linked immunosorbent assay Bol Asoc Med P Rico 71 10 366 377 Octubre 1979 7 Voller A Bidwell D E and Bartlett A The enzyme linked immunosorbent assay ELISA a guide with abstracts of microplate applications Fowline Press Guernsey Channel Islands 1 125 1979 8 Engvall E Perlmann P Quantitation of specific antibodies by enzyme labeled anti immunoglobulin in antigen coated tubes The Journal of Immunology 109 1 129 135 July 1972 LABORATORIO LEMOS S R L Directo
17. tes Agua Destilada o Desionizada Incubador de microplacas de ELISA termostatizado a 37 1 C Sistema lavador microplacas autom tico o manual capaz aspirar y dispensar vol menes de 300 400 pul con recipiente colector de desechos potencialmente infectivos Lector fotom trico de ELISA lineal con filtro de 450nm o bicrom tico provisto con filtros de 450nm y 620 630 nm de uso alternativo 8 Materiales de bioseguridad DEBAN ES N ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD 1 El equipo tiene que ser conservado entre 2 y 8 C siempre en posici n vertical y usarse antes de la fecha de vencimiento declarada en los r tulos No congelar 2 La microplaca debe ser llevada a temperatura ambiente antes de abrir su envase Saque del marco s lo los pocillos necesarios para la prueba programada y guarde los restantes en su propio envase en presencia del desecante Ci rrelo herm ticamente y col quelas nuevamente entre 2 y 8 C 3 La Soluci n de Lavado diluida es estable a temperatura ambiente durante 1 semana 4 Todos los otros reactivos son estables entre 2 y 8 C siempre que se hayan manipulado cuidadosamente para evitar la contaminaci n PRECAUCIONES DE SEGURIDAD 1 Todos los reactivos contenidos en el equipo son s lo para uso diagn stico in vitro 2 No utilice el equipo o los reactivos despu s de la fecha del vencimiento declarada en los r tulos El equipo tiene que ser conservado entre 2 y 8 C 3 Los procedimientos deben real
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