(LISTOS)ESManual de instrucciones HMPV
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1. EXRIAGENIE CE MOLECULAR RealCycler HMPV G v 1 1 Uso previsto RealCycler HMPV G es un kit de reactivos que permite la detecci n cualitativa por PCR a tiempo real del ARN de Metapneumovirus humano hMPV en muestras cl nicas El sistema incluye un control interno de amplificaci n para prevenir los falsos negativos debidos a la inhibici n de la reacci n 2 Especificaciones Sensibilidad 100 copias uL Especificidad Metapneumovirus humano gen nucleoprote na N 3 Estabilidad y almacenamiento Todos los componentes del kit RealCycler HMPV G deben ser almacenados a 20 C El kit es estable a 20 C hasta la fecha de caducidad ver etiqueta externa del kit 4 Descripci n del m todo La reacci n en cadena de la polimerasa PCR est basada en la amplificaci n de una regi n espec fica del genoma del pat geno usando primers y sondas espec ficos En la PCR a tiempo real se utilizan sondas marcadas con fluorocromos Hay una emisi n de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de ARN presente en la muestra El Cycle threshold Ct es el ciclo de la PCR en el que se detecta inicialmente un aumento en la se al de fluorescencia La amplificaci n de hMPV se detecta en TxR y la del control interno en Alx532 5 Composici n RealCycler HMPV G incluye la mezcla de reacci n Amplimix una retrotranscriptasa y un Control Positivo ARN hMPV Todos los reactivos est n listos para su uso sin a adir ni recon2. G 0 00 POS 27 31 NEG 0 00 NEG 0 00 oK NEG 0 00 POS 27 40 POS 25 74 NEG 0 00 Gr fica 2 Canal Alx532 control interno Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos y un control positivo hMPV Control negativo A12 en azul se observa se al con Ct 27 42 Control negativo A13 en gris se observa se al con Ct 27 31 Control positivo hMPV A14 en naranja se observa se al con Ct 27 40 10 Control de calidad Se recomienda que se lleven a cabo controles positivos y negativos cada vez que se realice un an lisis Cada lote del kit RealCycler HMPV G ha sido testado seg n las especificaciones de la PCR a tiempo real utilizando el equipo SmartCycler Cepheid 11 Observaciones Tabla de compatibilidad de fluor foros Fluor foro Fluor foro alternativo FAM TET CAL Fluor Gold 540 HEX JOE VIC CAL Fluor Orange 560 Alexa 532 Texas Red ROX LC Red 610 CAL Fluor Red 610 Fecha de publicaci n Marzo 2012
3. o y libre de inhibidores de la PCR 9 Procedimiento a Extracci n de ARN b Protocolo Stage 3 Repeat 45 times 3 Temperature Cycle T 9450 15 60 0 30 zo 30 Advance to Next Stage Selecci n de fluor foros TxR detecta hMPV AIx532 detecta el control interno c Preparaci n de la reacci n Descongelar la AmpliMix y el Control Positivo hMPV Tomar una al cuota de 17 5 uL de Amplimix a adir 0 25 uL de retrotranscriptasa y 7 25 uL del ARN de cada muestra o control a cada tubo Colocar los tubos en el equipo Seleccionar el protocolo HMPV G Iniciar el programa de amplificaci n d Interpretaci n de los resultados Un Alx532 Interpretaci n Std Res Std Res p POS Indiferente POSITIVO hMPV ND POS NO SE DETECTA ND ND NO VALORABLE e Ejemplo de resultado Fluorescence Status FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR TXR Ct Alx647 Alx647 Ct Std Res Std Res Std Res Res 27 40 POS Gr fica 1 Canal TxR hMPV Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos y un control positivo hMPV Control negativo A12 en azul ausencia de se al Control negativo A13 en gris ausencia de se al Control positivo hMPV A14 en naranja se observa se al con Ct 25 74 Fluorescence Status FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR TXR Ct Alx647 Alx647 Ct Std Res Std Res Std Res Std Res oK NEG 0 00 POS 27 42 NEG 0 00 NEG 0 00 oK NE
4. stituir ning n componente Componente Viales N m Volumen Conserv AmpliMix 1 850 uL 15 25 OC NEU Otan i 335p 15 250 criptasa Control Positivo ARN hMPV 2 60 uL 15 7259 Progenie molecular Artes y Oficios 37 Valencia 46021 Espa a Tel 902 91 05 05 Fax 902 91 05 06 www progenie molecular com 6 Material y equipamiento adicional requerido y no suministrado Equipo de PCR a tiempo real Kit de extracci n de ARN Guantes desechables Pipetas calibradas Puntas de pipeta con filtro Congelador 20 C 7 Advertencias y precauciones Todos los componentes del kit deben mantenerse en fr o mientras se est n manipulando Despu s de a adir el ARN minimizar el tiempo necesario para iniciar el programa de amplificaci n Los tubos con la mezcla de amplificaci n no deben exponerse a la luz durante un periodo de tiempo prolongado Descongelar y congelar repetidas veces los reactivos puede disminuir la sensibilidad del kit Usar guantes desechables Usar pipetas calibradas y puntas de pipeta con filtro Los ensayos deben llevarse a cabo por personal cualificado y siguiendo las buenas pr cticas de laboratorio No usar el kit despu s de la fecha de caducidad Uso para diagn stico in vitro 8 Muestras cl nicas Recoger las muestras en tubos est riles Almacenarlas y transportarlas congeladas a 20 C hasta su uso Utilizar ARN bien purificad
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