HYDRAGEL 3 CSF HYDRAGEL 6 CSF
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1. HYDRAGEL 3 CSF Ref 4350 HYDRAGEL 6 CSF Ref 4351 Masque dynamique Dynamic mask 2008 12 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask ESPECIFICACIONES DE USO Los kits HYDRAGEL 3 CSF e HYDRAGEL 6 CSF est n dise ados para la detecci n e identificaci n de bandas oligoclonales en los patrones electrofor ticos de l quido cefaloraquideo LCR o CSF cerebrospinal fluid El procedimiento compara los patrones de inmunofijaci n de las inmunoglobulinas lg G A y M y o inmunoglobulinas con cadenas ligeras Kappa o Lambda unidas en el LCR y suero del mismo paciente El an lisis se realiza normalmente con LCR no concentrado Dependiendo de la selecci n de los antisueros de detecci n se pueden analizar de una a tres parejas de muestra LCR suero en cada gel de HYDRAGEL 3 CSF y de dos a seis parejas de muestra LCR suero en cada gel de HYDRAGEL 6 CSF Para uso en Diagn stico In Vitro PRINCIPIO DEL TEST 11 14 17 Muchas dolencias del sistema nervioso central est n asociadas con una concentraci n aumentada de las prote nas del LCR debida o bien a un aumento de la permeabilidad de la barrera sangre LCR o bien a la s ntesis de inmunoglobulinas principalmente lg G dentro del sistema nervioso central En este ltimo caso la s ntesis intratecal de inmunoglobulinas est a menudo asociado con heterogeneidad de las Ig que se manifiesta en forma de bandas oligoclonales que se2. INCUBACION INMUNOFIJACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Incubaci n a 20 C controlados por efecto Peltier durante 10 minutos Suena un pitido y la tapa del m dulo de migraci n se desbloquea En la pantalla aparece el mensaje Y PAP que indica que hay que aplicar un papel de filtro grueso NOTA La tapa del m dulo de migraci n permanece bloqueada durante la incubaci n IV ABSORCI N CON PAPEL i 2 3 4 Abra la tapa del m dulo de migraci n Aplique un papel de filtro grueso sobre el gel Incline el papel de filtro grueso unos 45 Alinee el borde inferior del papel de filtro con el borde inferior del gel Coloque el papel encima del gel Presione sobre toda la superficie del papel de filtro para asegurar que se adhiere bien al gel Cierre la tapa del m dulo de migraci n Inicie el procedimiento apretando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado ABSORCI N CON PAPEL DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Absorci n a 20 C controlados por efecto Peltier durante 3 minutos En pantalla aparece el mensaje siguiente ABSORCI N Suena un pitido En la pantalla aparece el siguiente mensaje intermitente 4 PAP Y REHID1 que indica que hay que sacar el papel de filtro grueso y aplicar la soluci n rehidratante V REHIDRATACI N DEL GEL la 2 3 Abra la tapa del m dulo de migraci n Deje el gel colocado en la placa del m dulo de migraci
3. n Ponga la plantilla de aplicaci n de reactivos R1 para el HYDRAGEL 3 CSF 6 la ENZ 2 mL para el HYDRAGEL 6 CSF Fig 12 60 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask 4 Aplique 2 mL de soluci n rehidratante en el HYDRAGEL 3 CSF 4 mL en el HYDRAGEL 6 CSF a trav s del agujero de la plantilla en el espacio que hay por debajo Fig 13 Compruebe que la soluci n que est debajo de la plantilla est extendida uniformemente por la superficie rectangular centrada en el agujero de la plantilla 5 Pipetee la soluci n rehidratante sin que se formen burbujas de aire en la punta de la pipeta Sostenga la pipeta verticalmente Apoye ligeramente la punta de la pipeta en el agujero de la plantilla Inyecte la soluci n con cuidado y progresivamente sin introducir burbujas de aire por debajo de la plantilla 6 Cierre la tapa del m dulo de migraci n 7 Inicie inmediatamente la incubaci n apretando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado REHIDRATACI N DEL GEL DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Incubaci n a 20 C controlados por efecto Peltier durante 5 minutos Suena un pitido En la pantalla aparece el siguiente mensaje intermitente 4 REHID1 Y PAP que indica que hay eliminar la soluci n rehidratante y aplicar un papel de filtro grueso VI ELIMINACI N DE LA SOLUCI N REHIDRATANTE 1 Abra la tapa del m dulo de migraci n 2 Elimine la soluci n rehidrat
4. 1 caja de 10 Papeles de filtro Finos 1 paquete de 10 1 paquete de 10 Papeles de filtro Gruesos 4 paquetes de 10 4 paquetes de 10 PARA OBTENER RESULTADOS PTIMOS Los reactivos de un mismo kit deben ser usados conjuntamente y seg n las instrucciones suministradas LEA DETENIDAMENTE LA HOJA DE INSTRUCCIONES 1 GELES DE AGAROSA Preparaci n Los geles de agarosa est n listos para su uso Cada gel contiene agarosa 0 8 g dL tamp n tris barbital pH 8 8 0 1 aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo ATENCI N Los geles de agarosa contienen un 0 31 de barbital y un 0 34 de barbital s dico No los ingiera En caso de ingesti n consulte a un m dico inmediatamente Uso Medio de soporte para la electroforesis e inmunofijacion de las prote nas Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Conserve los geles horizontalmente en el estuche protector a temperatura ambiente 15 a 30 C o en nevera 2 a 8 C La flecha de la parte frontal del kit debe apuntar hacia arriba NO LOS CONGELE No almacene los geles cerca de una ventana o de una fuente de calor Evite variaciones de temperatura importantes 54 INSTRUCCIONES SEBIA Espa ol HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask Los geles son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit y en las etiquetas de sus recipientes protectores Des chelos cuando i haya c
5. 8 12 Masque dynamique Dynamic mask Puede congelarse en al cuotas y conservarse un m ximo de 6 meses a 20 C IMPORTANTE Despu s de la conservaci n a 2 8 C 6 a 20 C homogenice el antisuero reconstituido antes de preparar la soluci n de trabajo antisuero diluido El antisuero descongelado debe conservarse a 2 8 C y usarse ese mismo d a No congele y descongele el antisuero m s de 2 veces Deseche el antisuero si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana 2 ANTISUERO ANTI Ig A PER Preparaci n El vial de antisuero SEBIA referencia n 4742 contiene inmunoglobulinas totales de mam fero anti lg A humanas conjugadas a la peroxidasa Un procedimiento de estabilizaci n permite conservar el antisuero en forma liofilizada El reactivo tiene un color espec fico para evitar errores al usarlo El color es el mismo que el de la etiqueta del vial Reconstituya el vial de antisuero liofilizado con exactamente 0 7 mL de agua destilada o desionizada Deje reposar 5 minutos y agite suavemente evite la formaci n de espuma Despu s prepare la soluci n de trabajo del antisuero justo antes de usarla mezclando para cada pareja LCR suero qye vaya a analizar 6 pL de antisuero anti lg A PER reconstituido y 34 pL de diluyente de antisuero Homogenice bien la mezcla Uso Para la inmunofijacion y visualizaci n de las prote nas separadas mediante electroforesis Conservaci n estabilidad y se
6. ATENCI N No cierre la tapa del aparato si los soportes est n elevados 4 Seleccione el programa de migraci n 3 CSF ME MD para el HYDRAGEL 3 CSF o el programa de migraci n 6 CSF ME MD para el HYDRAGEL 6 CSF en el men del instrumento lado izquierdo del teclado 5 Saque las esponjas tamponadas de su envoltorio c jalas por las leng etas de pl stico Coloque las esponjas en el soporte de los electrodos enganchando los extremos perforados de las leng etas de pl stico en las clavijas el lado de la esponja fijado sobre la leng eta debe quedar encarado al soporte Fig 2 6 Saque el gel HYDRAGEL de su estuche Elimine r pidamente el exceso de l quido de la superficie del gel colocando un papel de filtro fino encima del mismo Saque el papel inmediatamente ATENCI N No deje que el papel de filtro fino contacte con el gel durante mucho rato para evitar que se deshidrate Dispense 120 pL de agua destilada para el HYDRAGEL 3 CSF 6 200 pL para el HYDRAGEL 6 CSF en el tercio inferior del marco serigrafiado en la Placa de Control de la Temperatura del m dulo de migraci n Ponga el gel con el lado de agarosa hacia arriba en la placa apoyando su parte inferior en la barrita de pl stico situada en la base del cuadro serigrafiado Fig 3 Doble el gel y haga que contacte con el agua Fig 3 Compruebe que no se hayan formado burbujas de aire que el agua se haya extendido por debajo de todo el gel y que ste est a
7. H Retrovirus 1990 5 34 42 Christenson RH Russell ME Gubar KT Silverman LM Ebers GC Oligoclonal banding in cerebrospinal fluid assessed by electrophoresis on agarose after centrifugal sample concentration through a microconcentrator membrane Clin Chem 1985 31 1734 1736 Davenport RD Keren DF Oligoclonal bands in cerebrospinal fluids significance of corresponding bands in serum for diagnosis of multiple sclerosis Clin Chem 1988 34 764 765 Ford HC Abnormalities of serum and plasma components in patients with multiple sclerosis Clin Chem 1985 18 3 13 Gerson B Cohen SR Gerson IM Guest GH Myelin basic protein oligoclonal bands and lg G in cerebrospinal fluid as indicators of multiple sclerosis Clin Chem 1981 27 1974 1977 Guessain A Caudie C Gout O et al Intrathecal synthesis of antibodies to human T lymphotropic Virus Type and the presence of lg G oligoclonal bands in the cerebrospinal fluid of patients with endemic tropical spastic paraparesis J Inf Dis 1988 157 6 1226 1234 Kabat EA Landow H Moore DH An electrophoretic study of the protein components in cerebrospinal fluid and their relationship to the serum proteins J Clin Invest 1942 21 571 577 Keren DF High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation Butterworth Heinemann Woburn MA USA 1994 397 pp Keshgegian AA Coblentz J Lisak RP Oligoclonal immunoglobulins in cerebrospinal fluid in mult
8. Kappa y anti Lambda la segunda pareja se incub s lo con anti Ig G en un gel Se aplicaron dos sueros con paraprote nas en todos los carriles de un nico gel de HYDRAGEL 6 CSF y se incubaron con antisueros anti lg A y anti lg M respectivamente Reproducibilidad interserial Se aplicaron dos parejas de muestra LCR suero en diez geles de HYDRAGEL 6 CSF procedentes del mismo lote y se incubaron con antisueros anti lg G anti Kappa y anti Lambda Resultados Los resultados obtenidos con el procedimiento HYDRAGEL 6 CSF indican una muy buena reproducibilidad intra e interserial con los antisueros anti lg G anti lg A anti lg M anti Kappa y anti Lambda Tras examinar visualmente los resultados en todos los estudios de reproducibilidad se identificaron las bandas oligoclonales correctamente en cada muestra y en todos los geles no hab a falsos positivos negativos y no se observaron diferencias entre las r plicas Exactitud Detecci n e identificaci n de las bandas oligoclonales Se analizaron treinta y ocho 38 muestras de LCR y suero procedentes de pacientes con varias enfermedades del sistema nervioso central 30 muestras presentaban s ntesis intratecal usando el procedimiento HYDRAGEL 6 CSF y un sistema comercial de electroforesis En ambas procedimientos las muestras de LCR y suero se diluyeron para que tuvieran 1 mg dL de lg G Las separaciones electrofor ticas se evaluaron visualmente para determinar la presencia de bandas oli
9. a fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en la bolsa de las esponjas NO LAS CONGELE Deseche las esponjas tamponadas si la bolsa est abierta y las esponjas secas NOTA Durante el almacenamiento las esponjas tamponadas pueden adquirir un tono amarillento sin que la calidad del test se vea afectada 3 DILUYENTE DE MUESTRA CSF Preparaci n El diluyente de muestra est listo para su uso Contiene soluci n salina complementada con alb mina s rica bovina azida s dica y aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Uso Para diluir las muestras de LCR y suero Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Conserve el diluyente de muestra en nevera 2 a 8 C Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en la etiqueta del vial de diluyente El diluyente debe estar exento de precipitados 4 DILUYENTE DE ANTISUERO CSF Preparaci n El diluyente de antisuero est listo para su uso Contiene aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Uso Para diluir los antisueros justo antes de usarlos Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro El diluyente de antisuero puede conservarse a temperatura ambiente o en nevera Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en la etiqueta del vial de diluyente de antisuero El diluyente de antisuero debe estar exento de precipitados NOTA Dura
10. ajo justo antes de usarla A ada los reactivos en el siguiente orden 2 mL de disolvente de TTF3 50 yL de TTF3 y 2 pL de per xido de hidr geno H 0 al 30 ATENCI N El TTF3 contiene dimetilformamida Perjudicial por inhalaci n Si la ventilaci n es insuficiente use un equipo de respiraci n adecuado No lo ingiera En caso de ingesti n consulte a un m dico inmediatamente Da ino en contacto con la piel Lleve ropa protectora apropiada Irrita los ojos Si contacta con los ojos o la piel lave inmediatamente la zona afectada con agua en abundancia y consulte a un m dico Evite exponerse al producto y obtenga formaci n especializada antes de usarlo Puede causar c ncer Si se encuentra mal consulte a un m dico inmediatamente muestre la etiqueta siempre que sea posible Uso Para la visualizaci n de las inmunoglobulinas inmunofijadas Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Conserve el TTF3 a temperatura ambiente o en nevera Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en la etiqueta del vial La soluci n de TTF3 debe estar exenta de precipitados 8 APLICADORES Uso Aplicadores precortados de un solo uso para la aplicaci n de la muestra en el gel Conservaci n Conserve los aplicadores en un lugar seco a temperatura ambiente o en nevera 9 SEGMENTOS PARA ANTISUEROS Uso Segmentos coloreados de un solo uso para la aplicaci n de los antisueros sobre el gel para realizar la inm
11. ales de deterioro Antes de reconstituirlo el antisuero liofilizado debe conservarse en nevera entre 2 y 8 C protegido de la luz siendo estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial de antisuero o en su caja El antisuero reconstituido debe conservarse a 2 8 C protegido de la luz y usarse en el plazo de una semana para evitar que se contamine o desnaturalice Puede congelarse en al cuotas y conservarse un m ximo de 6 meses a 20 C IMPORTANTE Despu s de la conservaci n a 2 8 C 6 a 20 C homogenice el antisuero reconstituido antes de preparar la soluci n de trabajo antisuero diluido El antisuero descongelado debe conservarse a 2 8 C y usarse ese mismo d a No congele y descongele el antisuero m s de 2 veces Deseche el antisuero si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana 3 ANTISUERO ANTI Ig M PER Preparaci n El vial de antisuero SEBIA referencia n 4744 contiene inmunoglobulinas totales de mam fero anti lg M humanas conjugadas a la peroxidasa Un procedimiento de estabilizaci n permite conservar el antisuero en forma liofilizada El reactivo tiene un color espec fico para evitar errores al usarlo El color es el mismo que el de la etiqueta del vial Reconstituya el vial de antisuero liofilizado con exactamente 0 7 mL de agua destilada o desionizada Deje reposar 5 minutos y agite suavemente evite la formaci n de espuma Despu s prepare la s
12. ante Sostenga la pipeta en posici n vertical y apoye ligeramente la punta de la pipeta en el pocillo Fig 13 Retire el reactivo cuidadosa y progresivamente 3 Coja la plantilla de aplicaci n de reactivos por la solapa el vela y s quela El rea del gel debe estar rehidratada VII ABSORCI N CON PAPEL 1 Aplique un papel de filtro grueso en el area rehidratada del gel como se ha descrito en el p rrafo IV 2 Presione sobre toda la superficie del papel de filtro grueso para que se adhiera bien al gel 3 Cierre la tapa del m dulo de migraci n 4 Inicie el procedimiento apretando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado ABSORCI N CON PAPEL DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Absorci n a 20 C controlados por efecto Peltier durante 3 minutos Suena un pitido En la pantalla aparece el siguiente mensaje intermitente 4 PAP Y REHID2 que indica que hay que sacar el papel de filtro grueso y aplicar soluci n rehidratante VIII REHIDRATACI N DEL GEL Abra la tapa del m dulo de migraci n Deje el gel en la placa del m dulo de migraci n Ponga la plantilla de aplicaci n de reactivos R1 para el HYDRAGEL 3 CSF la ENZ 2 mL para el HYDRAGEL 6 CSF Fig 12 Aplique 2 mL de soluci n rehidratante en el HYDRAGEL 3 CSF 4 mL en el HYDRAGEL 6 CSF en el espacio que hay por debajo de la plantilla Fig 13 Compruebe que la soluci n que hay debajo de la plantilla est distribuida uniformemen
13. ara limpiar las plantillas de aplicaci n de reactivos R1 6 ENZ 2 mL despu s de la etapa de visualizaci n con el TTF3 an 8 D ABSORCI N CON PAPEL DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Absorci n a 30 C controlados por efecto Peltier durante 3 minutos Suena un pitido En la pantalla aparece el siguiente mensaje intermitente 4 PAP Y REHID3 que indica que hay que sacar el papel de filtro grueso y aplicar la soluci n rehidratante XIII REHIDRATACI N DEL GEL Abra la tapa del m dulo de migraci n Deje el gel en la placa del m dulo de migraci n Coloque la plantilla de aplicaci n de reactivos R1 para el HYDRAGEL 3 CSF la ENZ 2 mL para el HYDRAGEL 6 CSF Fig 12 Aplique 2 mL de soluci n rehidratante en el HYDRAGEL 3 CSF 4 mL en el HYDRAGEL 6 CSF en el espacio que hay por debajo de la plantilla Fig 13 Compruebe que la soluci n que est por debajo de la plantilla est distribuida uniformemente en la superficie rectangular centrada en el agujero de la plantilla Pipetee la soluci n rehidratante sin que se formen burbujas de aire en la punta de la pipeta 5 Cierre la tapa del m dulo de migraci n 6 Inicie inmediatamente la incubaci n apretando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado REHIDRATACI N DEL GEL DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Incubaci n a 30 C controlados por efecto Peltier durante 5 minutos En la pantalla aparece el siguiente mensaje inte
14. as correspondientes muestras de LCR y suero IMPORTANTE En el HYDRAGEL 6 CSF no use los pocillos del segmento para antisueros que est n en las posiciones 1 8 y 15 Aspire los reactivos sin que se formen burbujas de aire en la punta de la pipeta 6 Aplique los reactivos Fig 8 Sostenga la pipeta inclinada y apoye ligeramente su punta en un lado del pocillo sin tocar el fondo del pocillo Dispense el reactivo en el pocillo Ill INMUNOFIJACI N 1 Despu s de la migraci n abra la tapa el mensaje de la pantalla deja de ser intermitente 2 Saque el aplicador de muestras y des chelo 3 Eleve ambos soportes saque las esponjas tamponadas cogi ndolas por las leng etas y t relas Saque los soportes de los electrodos y el aplicador Limpie los electrodos con un pa uelo de papel humedecido Deje el gel en su lugar en el m dulo de migraci n 4 Prepare la plantilla din mica para la aplicaci n de los reactivos de la forma siguiente Fig 9 Coloque la barra met lica que se usa para fijar la plantilla con ayuda de los pernos de anclaje una vez colocada la barra met lica puede permanecer en el m dulo de migraci n Coloque las muescas de la plantilla en las marcas de la barra cogiendo la plantilla por la leng eta 5 Haga descender la plantilla din mica sobre la placa del HYDRASYS IMPORTANTE Ajuste previamente la posici n de la plantilla din mica para obtener una correspondencia perfecta entre los perfiles e
15. ca que hay que abrir la tapa Abra la tapa Saque le gel seco Si es necesario elimine las pelusas del gel con un papel suave Limpie el respaldo el lado de soporte de pl stico del gel seco con un pa uelo de papel suave humedecido NOTA La temperatura de la placa desciende hasta 20 C en menos de 5 minutos Cuando se alcanzan los 20 C se puede iniciar una nueva migraci n Ponga el soporte de los electrodos y el aplicador en el m dulo de migraci n Limpie la placa de control de la temperatura con un pa uelo de papel suave humedecido CONTROL DE CALIDAD Se recomienda incluir un suero control en cada serie de an lisis Control CSF SEBIA referencia n 4794 62 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask INTERPRETACI N 2 1 16 La s ntesis intratecal en el sistema nervioso central es detectada por las siguientes observaciones comparativas El patr n de inmunofijaci n del LCR es diferente al del suero del mismo paciente Las bandas oligoclonales est n presentes en la mayor a de casos pero no en todos Una banda m s intensa una banda adicional incluso una nica banda d bil de inmunofijaci n observada en el patr n del LCR pero no en el del suero son indicadores de la s ntesis intratecal de Ig En algunas ocasiones no se observan bandas de lg oligoclonales o monoclonales aunque las observaciones cl nicas sugieran esclerosis m ltiple En estos casos el tipo
16. el an lisis de tres o seis parejas LCR suero en un gel con un solo tipo de anticuerpo por ejemplo anti lg G se pueden realizar asimismo otras combinaciones por ejemplo se pueden analizar las lg G lg A e lg M de dos parejas LCR suero Paciente n 1 2 3 Pocillo n CSF 1 3 5 aplicador 6 pocillos Suero 2 4 6 Paciente n 1 2 3 4 5 6 Pocillo n CSF 2 4 6 9 11 13 aplicador 15 pocillos Suero 3 5 7 10 12 14 IMPORTANTE En el HYDRAGEL 6 CSF los pocillos n 1 8 y 15 no se usan se recomienda identificarlos previamente con un rotulador para evitar aplicar muestra en ellos por error Aplique 15 pL de diluyente de muestra en los pocillos n 1 8 y 15 del aplicador de 15 pocillos Coja el aplicador por la protecci n de pl stico de los dientes y p ngalo con los dientes hacia arriba en la c mara seca previamente reactivada Consulte la hoja de instrucciones de la c mara seca para m s detalles Cierre la tapa de la c mara seca Deje el aplicador en la c mara seca a temperatura ambiente durante 15 minutos Las prote nas de la muestra se focalizar n en la punta de los dientes del aplicador y se concentrar n por evaporaci n parcial Cuando hayan pasado 15 minutos proceda inmediatamente a realizar el paso n 8 aplicaci n de las muestras en el gel Prepare la migraci n mientras las muestras est n siendo concentradas 3 Abra la tapa del m dulo de migraci n y eleve los soportes de los electrodos y el aplicador
17. ervioso central tales como 70 a 95 de casos de esclerosis m ltiple 100 de casos de neuros filis no tratadas 100 de casos de leucoencefalitis esclerosante subaguda El diagn stico no debe estar basado nicamente en los resultados de la inmunofijaci n Estos resultados deben ser tenidos en cuenta junto con las observaciones cl nicas y el historial y complementados mediante pruebas bioqu micas y microbiol gicas Limitaciones El uso de antisueros distintos a los indicados por el fabricante puede afectar a los resultados Debido a los l mites de resoluci n y sensibilidad de la electroforesis de zona es posible que algunos componentes monoclonales no sean detectados por este m todo Resoluci n de problemas Contacte con el Servicio de Asistencia T cnica de su distribuidor cuando la prueba no funcione pese a haber seguido cuidadosamente las instrucciones para la preparaci n y conservaci n de los materiales y para realizar el procedimiento Puede solicitar las fichas de seguridad de los diferentes reactivos y las informaciones relativas a la eliminaci n de los productos de desecho al Servicio de Asistencia T cnica de su distribuidor CARACTER STICAS T CNICAS Reproducibilidad Reproducibilidad intraserial Se aplicaron muestras de LCR y suero procedentes de dos pacientes en todos los carriles de un nico gel de HYDRAGEL 6 CSF La primera pareja analizada en tres geles se incub con antisueros anti lg G anti
18. globulinas totales de mam fero anti lg G humanas conjugadas a la peroxidasa Un procedimiento de estabilizaci n permite conservar el antisuero en forma liofilizada El reactivo tiene un color espec fico para evitar errores al usarlo El color es el mismo que el de la etiqueta del vial Reconstituya el vial de antisuero liofilizado con exactamente 0 7 mL de agua destilada o desionizada Deje reposar 5 minutos y agite suavemente evite la formaci n de espuma Despu s prepare la soluci n de trabajo del antisuero justo antes de usarla mezclando para cada pareja LCR suero que vaya a analizar 6 pL de antisuero anti lg G PER reconstituido y 34 LL de diluyente de antisuero Homogenice bien la mezcla NOTA Para analizar seis parejas LCR suero en un gel de HYDRAGEL 6 CSF diluya el antisuero con diluyente de antisuero 30 yL de anti lg G PER y 170 yL de diluyente de antisuero Mezcle bien Uso Para la inmunofijaci n y visualizaci n de las prote nas separadas mediante electroforesis Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Antes de reconstituirlo el antisuero liofilizado debe conservarse en nevera entre 2 y 8 C protegido de la luz siendo estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial de antisuero o en su caja El antisuero reconstituido debe conservarse a 2 8 C protegido de la luz y usarse en el plazo de una semana para evitar que se contamine o desnaturalice 56 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 200
19. goclonales de lg Hab a una coincidencia general entre las dos pruebas en la detecci n de bandas oligoclonales Sensibilidad La sensibilidad del procedimiento HYDRAGEL 6 CSF es la siguiente el l mite de detecci n de una banda monoclonal del tipo lg G est comprendido entre 3 1 y 12 5 ug dL alrededor de 12 5 g dL para una del tipo Ig A alrededor de 25 jig dL para una del tipo Ig M y alrededor de 3 1 y 12 5 ug dL para paraprote nas con cadenas ligeras Kappa o Lambda unidas respectivamente 63 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask BIBLIOGRAPHIE BIBLIOGRAPHY 10 11 12 13 14 15 16 Tf 18 Ali S Sun T Narukar L Oligoclonal banding in cerebrospinal fluids of Lyme disease patients Am J Clin Pathol 1993 100 335 Anderson M Alvarez Cermeno J Bernardi G et al Cerebrospinal fluid in the diagnosis of multiple sclerosis a consensus report Journal of Neurology Neurosurgery and Psychiatry 1994 57 897 902 Blennow K Fredman P Wallin A Gottfries CG Frey H Skoog I Svennerholm L Formulas for the quantitation of intrathecal Ig G production Their validity in the presence of blood brain barrier damage and their utility in multiple sclerosis J Neurol Sci 1994 121 90 96 Caudie C Vergne A Saint Marc T Touraine F Livrozer JM Confraveux C Quincy CL Touraine JL Profil biologique du LCR chez 48 patients infect s par le virus de l immunod ficience humaine VI
20. hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial de antisuero o en su caja El antisuero reconstituido debe conservarse a 2 8 C protegido de la luz y usarse en el plazo de una semana para evitar que se contamine o desnaturalice Puede congelarse en al cuotas y conservarse un m ximo de 6 meses a 20 C IMPORTANTE Despu s de la conservaci n a 2 8 C 6 a 20 C homogenice el antisuero reconstituido antes de preparar la soluci n de trabajo antisuero diluido El antisuero descongelado debe conservarse a 2 8 C y usarse ese mismo d a No congele y descongele el antisuero m s de 2 veces Deseche el antisuero si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana NOTA Los antisueros pueden proceder de diferentes especies de animales No mezcle dos viales de antisueros diferentes incluso si son de la misma especificidad y cambie SIEMPRE la punta de la pipeta al cambiar de vial de antisuero Durante el transporte los antisueros pueden permanecer a temperatura ambiente 15 a 30 C durante 15 d as sin ning n efecto adverso en su funcionamiento 5 PER XIDO DE HIDR GENO H 0 30 MUESTRAS PARA EL AN LISIS Extracci n y conservaci n de las muestras El suero y el LCR de un mismo paciente deben obtenerse a la vez de acuerdo con los procedimientos establecidos de uso en el laboratorio cl nico Se recomienda realizar los an lisis con sueros y LCR frescos Las muestras pueden conservarse en
21. ima de 1 0 mg dL Obtenga x LL de LCR y a ada x A 1 de diluyente de muestra valor aconsejado para x 10 pL Si A est por debajo de 1 0 mg dL use LCR neto Para el suero B mg dL concentraci n de la Ig de inter s Diluya el suero 20 veces con diluyente de muestras por ejemplo 5 yL de suero y 95 pL de diluyente de muestras Obtenga y pL de suero diluido y a ada y B 20 1 de diluyente de muestras valor aconsejado para y 2 pL PROCEDIMIENTO El sistema HYDRASYS es un instrumento multiparam trico semiautom tico en el que los geles de agarosa HYDRAGEL son tratados seg n las etapas siguientes aplicaci n de las muestras migraci n electrofor tica incubaci n con los antisueros y el sustrato parada de la reacci n enzim tica absorci n y secado final del gel Las etapas manuales incluyen el manejo de las muestras y los geles la aplicaci n de los reactivos y la preparaci n del instrumento para el funcionamiento LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL HYDRASYS 58 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask I PREPARACI N DE LA MIGRACI N 1 Encienda el HYDRASYS 2 Coloque un aplicador de 6 pocillos para el HYDRAGEL 3 CSF o un aplicador de 15 pocillos para el HYDRAGEL 6 CSF en una superficie plana con los n meros de los pocillos hacia arriba Aplique 15 pL de muestra en cada pocillo Fig 1 Cargue el aplicador en menos de 2 minutos El ejemplo siguiente muestra
22. iple sclerosis Clin Chem 1980 26 1340 1345 Olsson JE Link H Immunoglobulin abnormalities in multiple sclerosis Arch Neurol 1973 28 392 399 Papadopoulos NM Costello R Kay AD Cutler NR Rapoport SL Combined immunochemical and electrophoretic determinations of proteins in paired serum and cerebrospinal fluid samples Clin Chem 1984 30 1814 1816 Reiber Liquor diagnostik Diagnose and Labor 1987 37 63 72 Sharief MK Thompson EJ Intrathecal immunoglobulins M synthesis in multiple sclerosis Relationship with clinical and cerebrospinal fluid parameters Brain 1991 114 181 195 Winfield JB Shaw M Silverman LM Eisenberg RA Wilson HA Koffler D Intrathecal lg G synthesis and blood brain barrier impairment in patients with systemic lupus erythematosus and central nervous system dysfunction Am J Med 1983 74 837 844 Wendling A Proc dures de diagnostic ou de d pistage Justification et validit d un test de diagnostic ou de d pistage sensibilit sp cificit Impact Internat 1986 Sept 93 97 219 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask SCH MAS FIGURES Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 220 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask SCH MAS FIGURES Figure 5 Barrette antis rums Antisera Segment Bossage Boss Ergot Pin Puit
23. l de antisuero contiene inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas ligeras ligadas Kappa humanas conjugadas a la peroxidasa Un procedimiento de estabilizaci n permite conservar el antisuero en forma liofilizada El reactivo tiene un color espec fico para evitar errores al usarlo El color es el mismo que el de la etiqueta del vial Reconstituya el vial de antisuero liofilizado con exactamente 0 7 mL de agua destilada o desionizada Deje reposar 5 minutos y agite suavemente evite la formaci n de espuma Despu s prepare la soluci n de trabajo del antisuero justo antes de usarla mezclando para cada pareja LCR suero que vaya a analizar 6 pL de antisuero anti Kappa PER reconstituido y 34 pL de diluyente de antisuero Homogenice bien la mezcla Uso Para la inmunofijacion y visualizaci n de las prote nas separadas mediante electroforesis Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Antes de reconstituirlo el antisuero liofilizado debe conservarse en nevera entre 2 y 8 C protegido de la luz siendo estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial de antisuero o en su caja El antisuero reconstituido debe conservarse a 2 8 C protegido de la luz y usarse en el plazo de una semana para evitar que se contamine o desnaturalice Puede congelarse en al cuotas y conservarse un m ximo de 6 meses a 20 C IMPORTANTE Despu s de la conservaci n a 2 8 C 6 a 20 C homogenice el antisuero reconsti
24. l l mite de concentraci n de s lo 0 5 mg dL la lg puede ser detectada y su distribuci n distinguida sin concentrar la muestra de LCR El an lisis se realiza en dos etapas electroforesis de alta resoluci n en gel de agarosa para fraccionar las prote nas de las muestras de LCR y suero inmunofijaci n con antisueros marcados con enzimas dirigidos contra lg G Ig A lg M y o inmunoglobulinas con cadenas Kappa o Lambda unidas para detectar e identificar las bandas oligoclonales en el LCR y para demostrar diferencias o no en la distribuci n de las lg en el LCR y el suero El sistema semiautom tico HYDRASYS realiza todas las etapas necesarias para obtener geles listos para la interpretaci n REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS EN LOS KITS HYDRAGEL 3 CSF E HYDRAGEL 6 CSF COMPONENTES REF N 4350 REF N 4351 Geles de agarosa listos para usar 10 geles 10 geles Esponjas tamponadas listas para usar 10 bolsas de 2 10 bolsas de 2 Diluyente de muestras CSF listo para usar 1vial 85 mL 1vial 85 mL Diluyente de antisuero CSF listo para usar 1 vial 2 5 mL 1 vial 2 5 mL Soluci n rehidratante CSF lista para usar 1 vial 70 mL 2 viales 70 mL Disolvente de TTF3 listo para usar 1 vial 20 mL 1 vial 20 mL TTF3 soluci n stock 1 vial 0 5 mL 1 vial 0 5 mL Aplicadores listos para usar 1 caja de 10 6 dientes 1 caja de 10 15 dientes Segmentos para antisueros listos para usar 1 caja de 10
25. lectrofor ticos del gel y los pocillos de la plantilla 6 Ponga el soporte del segmento en el punto m s bajo de la gu a de la plantilla dirigido hacia el operario Sostenga el conjunto soporte segmento por el asa situada a la derecha y presione en el punto de apoyo central de forma que el segmento para antisueros contacte con el gel Deje de presionar entonces los reactivos se extender n bajo cada carril Fig 10 7 Inmediatamente con ayuda del asa situada a la derecha reparta los reactivos efectuando un movimiento lento y regular de ida y vuelta de la plantilla din mica por encima del gel Repita este paso dos veces en cada movimiento de la plantilla la aplicaci n debe durar aproximadamente 5 segundos Fig 11 ATENCI N Durante este paso coja la plantilla s lo por el asa No toque la gu a No vuelva a presionar en el punto de apoyo central ya que los reactivos podr an mezclarse 8 Saque la gu a y la plantilla din mica Saque el soporte del segmento cogi ndolo por el asa 10 Saque el segmento para antisueros del soporte y des chelo ATENCI N Manipule con precauci n el segmento con los antisueros cargados 11 Puede quedar reactivo residual en los pocillos despu s de la aplicaci n Esto no afecta a los resultados 12 Cierre la tapa del HYDRASYS 13 Inicie inmediatamente el procedimiento de incubaci n presionando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado En pantalla aparece el mensaje
26. lineado con el cuadro serigrafiado Baje ambos soportes En esta posici n las esponjas tamponadas no tocan el gel NO FUERCE LOS SOPORTES HACIA ABAJO 8 Despu s de que las muestras se hayan concentrado en el aplicador Rompa la protecci n de pl stico de los dientes del aplicador Ponga el aplicador en la posici n n 8 del soporte IMPORTANTE Los n meros de los pocillos del aplicador deben quedar de cara al operario Fig 4 Cierre la tapa del m dulo de migraci n 10 Inicie el procedimiento inmediatamente apretando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado IMPORTANTE Compruebe que la rejilla de ventilaci n del lado derecho del instrumento no est bloqueada s MIGRACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Los dos soportes descienden para que las esponjas tamponadas y el aplicador contacten con la superficie del gel El soporte del aplicador se eleva La migraci n se realiza a 10 W constantes en el HYDRAGEL 3 CSF a 20 W constantes en el HYDRAGEL 6 CSF a 20 C controlados por efecto Peltier hasta que se hayan acumulado 80 Vh durante unos 17 minutos El soporte de los electrodos se eleva para desconectarlos Suena un pitido y la tapa se desbloquea Esta se al se mantendr hasta que el operario abra la tapa En la pantalla aparece el mensaje intermitente y AS indicando que hay que aplicar los antisueros NOTA La tapa del m dulo de migraci n permanece cerrada durante t
27. nevera 2 a 8 C hasta una semana Para per odos de conservaci n m s prolongados congele las muestras El suero y LCR congelados son estables durante un mes por lo menos Preparaci n de las muestras Mida las concentraciones de Ig en el LCR y el suero usando procedimientos apropiados La concentraci n de cualquier Ig en particular en las muestras de LCR y suero que van a compararse debe estar siempre ajustada al mismo nivel en ambas muestras El ajuste depende de la concentraci n original de Ig en el LCR use el diluyente de muestras para realizar todas las diluciones 1er caso La concentraci n de la lg de inter s est por encima de 1 mg dL Diluya el LCR y el suero con el diluyente de muestras para obtener una concentraci n de la lg de inter s de 1 mg dL 2 caso La concentraci n en el LCR de la lg de inter s est entre 0 5 y 1 mg dL Use LCR neto Diluya el suero para obtener la misma concentraci n de lg que en la muestra de LCR 3er caso La concentraci n de la lg de inter s en el LCR est por debajo de 0 5 mg dL Concentre el LCR con cualquier dispositivo apropiado para obtener una concentraci n de la Ig de inter s entre 0 5 y 1 mg dL Diluya el suero para obtener la misma concentraci n de lg que en la muestra de LCR Ejemplo de las diluciones s lo para muestras con una concentraci n de la lg de inter s por encima de 1 0 mg dL Para el LCR A mg dL concentraci n de la Ig de inter s por enc
28. nte el almacenamiento el diluyente de antisuero puede volverse amarillo sin ning n efecto adverso en su funcionamiento 5 SOLUCI N REHIDRATANTE CSF Preparaci n La soluci n rehidratante est lista para su uso Contiene una soluci n acuosa pH 6 0 y aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Uso Para rehidratar el gel de agarosa antes y despu s de la etapa de visualizaci n basada en la peroxidasa Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro La soluci n rehidratante puede conservarse a temperatura ambiente o en nevera y es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en la etiqueta del vial La soluci n rehidratante debe estar exenta de precipitados 6 DISOLVENTE DE TTF3 Preparaci n El disolvente de TTF3 est listo para su uso Contiene una soluci n cida pH 2 5 y aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Uso Para preparar la soluci n de visualizaci n TTF3 como se describe en el n 7 Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro El disolvente de TTF3 puede conservarse a temperatura ambiente o en nevera y es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en la etiqueta del vial El disolvente de TTF3 debe estar exento de precipitados 55 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask 7 TTF3 Preparaci n Prepare la soluci n de revelado de trab
29. observan en los patrones de migraci n electrofor ticos de alta resoluci n Las bandas de la fracci n de gammaglobulinas no son siempre las verdaderas bandas oligoclonales es decir inmunoglobulinas G A 6 M y por lo tanto no tienen la misma importancia diagn stica que las bandas oligoclonales de lg La inmunofijaci n es la t cnica elegida ya que puede probar que las bandas oligoclonales corresponden a lg y puede identificar la Ig implicada Para confirmar la s ntesis intratecal de Ig el suero y el LCR del paciente deben ser analizados en paralelo para demostrar diferencias entre ellos en los patrones de distribuci n de las Ig La confirmaci n de la s ntesis intratecal de Ig es una informaci n importante que permite sospechar la existencia de una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central como la causada por la esclerosis m ltiple Una inmunofijaci n est ndar que use antisueros no marcados necesita una concentraci n de Ig G de alrededor de 0 05 g dL Como la concentraci n de la Ig G en el LCR est generalmente entre 1 y 5 mg dL se necesita un volumen total de LCR entre 2 y 5 mL para obtener suficiente cantidad de concentrado Comparada con la inmunofijaci n est ndar se ha conseguido aumentar la sensibilidad de detecci n alrededor de 100 veces en las t cnicas HYDRAGEL 3 CSF HYDRAGEL 6 CSF mediante el uso de anticuerpos marcados con enzimas Por lo tanto si la concentraci n de la lg de inter s coincide o est por encima de
30. odas las etapas de la migraci n I PREPARACI N DE LA INMUNOFIJACION La plantilla din mica contiene un segmento para antisueros un soporte del segmento una gu a de la plantilla din mica y un dispositivo reductor de superficie Fig 5 Durante la migraci n monte la plantilla din mica de la manera siguiente 1 Ponga la gu a de la plantilla din mica en una superficie plana 2 Coloque el reductor de superficie en la gu a de la plantilla din mica 59 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask 3 Ponga un segmento para antisueros en el soporte del segmento Fig 6 Incline el segmento para antisueros 45 y col quelo en las patillas del soporte del segmento Apoy ndose en estos resortes gire el segmento para fijarlo en las muescas del soporte del segmento ATENCI N Compruebe que el segmento est bien colocado en el soporte los salientes situados en los extremos del segmento deben estar bien encajados en las muescas del soporte 4 Coloque el conjunto soporte segmento en la gu a de la plantilla din mica Fig 7 5 Aplique los reactivos de la forma siguiente En el HYDRAGEL 3 CSF aplique 15 pL de antisuero en cada pocillo del segmento para antisueros de 6 pocillos En el HYDRAGEL 6 CSF aplique 15 pL de antisuero en los pocillos n 2 a 7 y 9 a 14 del segmento para antisueros de 15 pocillos Use antisueros con especificidad para las inmunoglobulinas de inter s y aplique el mismo antisuero a l
31. oluci n de trabajo del antisuero justo antes de usarla mezclando para cada pareja LCR suero que vaya a analizar 6 pL de antisuero anti lg M PER reconstituido y 34 yL de diluyente de antisuero Homogenice bien la mezcla Uso Para la inmunofijaci n y visualizaci n de las prote nas separadas mediante electroforesis Antes de reconstituirlo el antisuero liofilizado debe conservarse en nevera entre 2 y 8 C protegido de la luz siendo estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial de antisuero o en su caja El antisuero reconstituido debe conservarse a 2 8 C protegido de la luz y usarse en el plazo de una semana para evitar que se contamine o desnaturalice Puede congelarse en al cuotas y conservarse un m ximo de 6 meses a 20 C IMPORTANTE Despu s de la conservaci n a 2 8 C 6 a 20 C homogenice el antisuero reconstituido antes de preparar la soluci n de trabajo antisuero diluido El antisuero descongelado debe conservarse a 2 8 C y usarse ese mismo d a No congele y descongele el antisuero m s de 2 veces Deseche el antisuero si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana 4 CAJA DE ANTISUEROS ANTI KAPPA LAMBDA PER La caja de antisueros ANTI KAPPA LAMBDA PER SEBIA referencia n 4745 contiene 1 vial de antisuero liofilizado anti Kappa PER y 1 vial de antisuero liofilizado anti Lambda PER 4 1 ANTISUERO ANTI KAPPA PER Preparaci n El via
32. policlonal de banda de inmunoglobulina en el patr n del LCR puede ser m s cat dico que en el patr n del suero En la mayor a de casos las inmunoglobulinas intratecales son de la clase lg G muy raramente son Ig A Ig M La s ntesis intratecal de lg A se manifiesta a menudo como una migraci n m s cat dica de la lg A del LCR comparada con la Ig A del suero Para garantizar una interpretaci n comparativa correcta es imperativo cumplir lo siguiente Las muestras de LCR y suero deben obtenerse a la vez del mismo paciente Debe evitarse cualquier tratamiento de las muestras que pueda alterar la concentraci n de las inmunoglobulinas Las concentraciones de las inmunoglobulinas del LCR y el suero deben determinarse de forma precisa de manera que despu s del ajuste se apliquen en el gel cantidades iguales en el LCR y el suero de la lg de inter s La detecci n de la s ntesis de Ig intratecal mediante inmunofijaci n sensible es un indicador m s espec fico y sensible que la informaci n proporcionada por los diversos cocientes calculados a partir de las concentraciones totales de inmunoglobulinas y otras prote nas del LCR y el suero La confirmaci n de la s ntesis de lg intratecal es una informaci n importante para sospechar la existencia de una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central El perfil oligoclonal u otros indicios de la s ntesis intratecal de Ig s pueden encontrarse en diferentes enfermedades del sistema n
33. ristales o precipitados en la superficie el gel o su textura sea muy blanda consecuencias de la congelaci n del gel ii se observe crecimiento bacteriano o f ngico iii haya una cantidad anormal de l quido en el estuche del gel como resultado de la exudaci n del tamp n del gel debido a condiciones de conservaci n inadecuadas 2 ESPONJAS TAMPONADAS Preparaci n Las esponjas tamponadas est n listas para su uso Cada una contiene tamp n tris barbital pH 9 0 0 3 azida s dica aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo ATENCI N El tamp n de las esponjas contiene un 1 54 de barbital un 1 71 de barbital s dico y un 0 50 de azida s dica Perjudicial en caso de ingesti n No las ingiera En caso de ingesti n consulte a un m dico inmediatamente Al desechar el producto evite que contacte con cidos plomo o cobre ya que forman compuestos explosivos o t xicos en contacto con la azida s dica Si contacta con la piel lave la zona afectada inmediatamente con agua en abundancia Uso Las esponjas tamponadas funcionan como reservorio del tamp n para la electroforesis y aseguran el contacto entre el gel y los electrodos Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Conserve las esponjas tamponadas horizontalmente en sus bolsas protectoras a temperatura ambiente o en nevera La flecha de la parte frontal del kit debe apuntar hacia arriba Son estables hasta l
34. rmitente 4 REHID 3 Y PAP que indica que hay que eliminar la soluci n rehidratante y aplicar un papel de filtro grueso Pon XIV ELIMINACI N DE LA SOLUCI N REHIDRATANTE 1 Abra la tapa del m dulo de migraci n 2 Elimine la soluci n rehidratante como se ha descrito previamente en el p rrafo VI 3 Coja la plantilla de aplicaci n de reactivos por la solapa el vela y s quela XV ABSORCI N CON PAPEL Y SECADO DEL GEL 1 Aplique un papel de filtro grueso sobre el gel 2 Presione sobre toda la superficie del papel de filtro grueso para que se adhiera bien al gel 3 Cierre la tapa del m dulo de migraci n 4 Inicie el procedimiento apretando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado ABSORCI N CON PAPEL DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Absorci n con papel a 30 C controlados por efecto Peltier durante 3 minutos Suena un pitido En la pantalla aparece el siguiente mensaje intermitente 4 PAP que indica que hay que sacar el papel de filtro grueso XVI SECADO DEL GEL 1 Abra la tapa del m dulo de migraci n 2 Saque el papel de filtro grueso y deje el gel en la placa de migraci n 3 Cierre la tapa del HYDRASYS 4 Inicie el secado apretando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado En la pantalla aparece el mensaje siguiente SECADO SECADO DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Secado del gel a 50 C durante 3 minutos Suena un pitido que indi
35. s wells Support barrette Segment Holder Poign e Flap Encoche notch Point d appui central Central Pressure Point Ressorts Springs R ducteur de course Length Reducing Device Guide du masque dynamique Dynamic Mask Guide no SS 221 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask SCH MAS FIGURES Figure 6 Figure 8 Figure 7 Figure 9 Figure 10 Figure 11 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask SCH MAS FIGURES Figure 12 223 Figure 13
36. te por la superficie rectangular centrada en el agujero de la plantilla 5 Pipetee la soluci n rehidratante sin que se formen burbujas de aire en la punta de la pipeta 6 Cierre la tapa del m dulo de migraci n 7 Inicie la incubaci n inmediatamente apretando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado REHIDRATACION DEL GEL DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Incubaci n a 20 C controlados por efecto Peltier durante 30 minutos Despu s del per odo de incubaci n suena un pitido y la temperatura de la placa aumenta de 20 a 30 C En la pantalla aparece el siguiente mensaje intermitente 4 REHID2 Y TTF3 que indica que hay que eliminar la soluci n rehidratante y aplicar la soluci n de visualizaci n IX ELIMINACI N DE LA SOLUCI N REHIDRATANTE 1 Abra la tapa del m dulo de migraci n 2 Elimine la soluci n rehidratante como se ha descrito previamente en el p rrafo VI 3 Deje puesta la plantilla X VISUALIZACI N 1 Aplique 1 mL de soluci n de visualizaci n en el HYDRAGEL 3 CSF 2 mL en el HYDRAGEL 6 CSF preparada justo antes de usarla en el espacio que hay por debajo de la plantilla 2 Compruebe que la soluci n que hay por debajo de la plantilla est distribuida uniformemente en la superficie rectangular centrada en el agujero de la plantilla Pipetee la soluci n de visualizaci n TTF3 sin que se formen burbujas de aire en la punta de la pipeta 3 Cierre la tapa del m d
37. tuido antes de preparar la soluci n de trabajo antisuero diluido El antisuero descongelado debe conservarse a 2 8 C y usarse ese mismo d a No congele y descongele el antisuero m s de 2 veces Deseche el antisuero si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana 57 HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask 4 2 ANTISUERO ANTI LAMBDA PER Preparaci n El vial de antisuero contiene inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas ligeras ligadas Lambda humanas conjugadas a la peroxidasa Un procedimiento de estabilizaci n permite conservar el antisuero en forma liofilizada El reactivo tiene un color espec fico para evitar errores al usarlo El color es el mismo que el de la etiqueta del vial Reconstituya el vial de antisuero liofilizado con exactamente 0 7 mL de agua destilada o desionizada Deje reposar 5 minutos y agite suavemente evite la formaci n de espuma Despu s prepare la soluci n de trabajo del antisuero justo antes de usarla mezclando para cada pareja LCR suero que vaya a analizar 6 pL de antisuero anti Lambda PER reconstituido y 34 pL de diluyente de antisuero Homogenice bien la mezcla Uso Para la inmunofijaci n y visualizaci n de las prote nas separadas mediante electroforesis Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Antes de reconstituirlo el antisuero liofilizado debe conservarse en nevera entre 2 y 8 C protegido de la luz siendo estable
38. ulo de migraci n 4 Inicie inmediatamente la incubaci n apretando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado INCUBACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Incubaci n a 30 C controlados por efecto Peltier durante 15 minutos Suena un pitido En la pantalla aparece el siguiente mensaje intermitente 4 TTF3 Y PAP que indica que hay que eliminar la soluci n de visualizaci n y aplicar un papel de filtro grueso XI ELIMINACI N DE LA SOLUCI N DE VISUALIZACI N 1 Abra la tapa del m dulo de migraci n 2 Elimine la soluci n de visualizaci n como se ha descrito previamente en el p rrafo VI 3 Coja la plantilla de aplicaci n de reactivos por la solapa el vela y s quela IS bli HYDRAGEL 3 amp 6 CSF 2008 12 Masque dynamique Dynamic mask XII ABSORCI N CON PAPEL 1 Aplique un papel de filtro grueso en la parte revelada del gel como se ha descrito previamente en el p rrafo IV Presione sobre toda la superficie del papel de filtro grueso para que se adhiera bien al gel Cierre la tapa del m dulo de migraci n Inicie el procedimiento de absorci n apretando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado Limpie la plantilla con agua destilada o alcohol y s quela bien con un papel absorbente suave Antes de volver a usarla compruebe que la plantilla est completamente seca elimine las gotitas de agua dando golpecitos en un papel suave NOTA Se puede usar alcohol p
39. unofijaci n ATENCI N Manipule con cuidado los segmentos con los antisueros ya cargados 10 PAPELES DE FILTRO FINOS Uso Papeles de filtro finos precortados de un solo uso para absorber el exceso de humedad de la superficie del gel antes de la aplicaci n de las muestras Conservaci n Conserve los papeles de filtro finos en un lugar seco a temperatura ambiente o en nevera 11 PAPELES DE FILTRO GRUESOS Uso Papeles de filtro gruesos de un solo uso para absorber las prote nas no precipitadas del gel despu s de la inmunofijaci n y la rehidrataci n Conservaci n Conserve los papeles de filtro gruesos en un lugar seco a temperatura ambiente o en nevera EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS 1 Sistema HYDRASYS SEBIA referencia n 1210 6 n 1211 2 Pipeteador manual o autom tico como el HYDRAPLUS SEBIA referencia n 1216 HYDRAPLUS 2 SEBIA referencia n 1217 para la carga de los aplicadores o de los segmentos para antisueros 3 C mara Seca para concentrar las muestras SEBIA referencia n 1271 4 Gu a met lica de la plantilla SEBIA suministrada con el HYDRASYS 5 Plantilla din mica SEBIA referencia n 1255 6 Kit de accesorios para CSF HYDRASYS CON PLANTILLA DIN MICA SEBIA referencia n 1259 7 Pipetas 2 pL 20 pL 100 pL 200 uL y 5 mL REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS 1 ANTISUERO ANTI lg G PER Preparaci n El vial de antisuero SEBIA referencia n 4743 contiene inmuno
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