Osmoacondicionamiento
Contents
1. drico ce lular el que a su vez se correlaciona con cambios en los niveles hormonales celulares De esta manera los pro motores de estos genes podr an imponer patrones de re gulaci n transcripcional complejos Se podr a argumentar que la conducta de las semillas de ma z se debe simplemente a un potencial osm tico m s negativo durante el OSMA que dispara una respuesta de estr s en las c lulas No obstante las semillas debe r an sentir este estr s desde el primer d a de OSMA y no es sino hasta despu s de varios d as en OSMA que la res puesta molecular al estr s se establece De esta manera A B 18 kDa gt lt lt 26 kDa lt 20 kDa 1234556 12345 Figura 4 An lisis por western blot de las prote nas PvLEA 18 y Rab 17 A prote nas totales de embriones secos de frijol carril 1 de embriones despu s de 7 d as de OSMA ca rril 2 o despu s de 5 carril 3 10 carril 4 y 24 horas carril 5 de germinaci n post OSMA B prote nas to tales de ejes embrionarios secos de ma z carril 1 de ejes embrionarios despu s de 3 carril 2 y de 10 d as carril 3 de OSMA o bien de 5 carril 4 10 carril 5 y 24 horas carril 6 de germinaci n despu s de OSMA Figure 4 Analysis by western blot of the accumulation patterns of Pvlea 18 and Rab 17 proteins A Total proteins isolated from dry seed embryos lane 1 and 7 days osmoprimed lane 2 or 5 lane 3 10 lane 4 and 24 h lane 5 germination after2. which were then maintained in the cabinet at 30 C for 1 h Then maize or bean seeds 25 seeds each in duplicate were put into Petri dishes containing two discs of Sterile Whatman No 1 paper and 40 ml of PEG solution at 2 0 MPa for maize seeds or 1 0 MPa for bean seeds Incubation of seeds was at 25 C for the periods of time indicated in Results Water potential measurements Water potential was determined following the dew point and psychrometric methods as described in the instruction manual for the HR 33T Dew Point Microvoltimeter Wescor using a soil psychometer model PST 55 15 Extraction of RNA and northern blot analysis Total RNA was prepared from the frozen powdered material by the hot phenol method following the procedure of De Vries et al 1991 RNA was extracted from dry seed embryos beans or dry embryo axes maize from 1 3 and 7 days osmoprimed bean embryos or 3 5 and 10 days osmoprimed maize embryo axes and from 5 10 and 24 h germinated bean embryos or maize embryo axes after osmopriming RNA 30 ug sample was electrophoresed through a 1 formaldehyde agarose gel and then blotted on to Hybond N membranes Sambrook et al 1988 Probes used for hybridization were labeled using a Random Primer kit and a 2P dCTP 30 uCi Pre hybridization and hybridization solutions at a temperature range between 58 65 C depending on the probe used contained 0 3 M sodium phosphate pH 7 2 7 SDS and 1 mM EDTA The
3. 19 from bean seeds and of genes rab 17 and Zmhsp 17 4 from maize seeds was analyzed As expected the transcripts for the three bean genes were present in dry seeds However in all cases transcript accumulation levels decreased during osmopriming although with different rates The Pvhsp 17 19 transcript Figure 2 slowly declined to very low levels by 7 day osmopriming and only traces were detected by 24 h germination post osmopriming Reduction in the levels of the Pvlea 4 25 transcript was faster during osmopriming and it was no longer detected by 24h germination post osmopriming Figure 2 In the case of Pvlea 18 transcript this was not detected by 3 days osmopriming nor during germination post osmopriming Figure 2 These results suggest that the PEG treatment stops germination since it imposes a water deficit However on the other hand the PEG treatment to dry seeds provides 466 AGROCIENCIA VOLUMEN 36 N MERO 4 JULIO AGOSTO 2002 alcanzaron valores de 1 2 MPa durante el OSMA Es tos valores se incrementaron en ambas especies de semi llas seg n germinaron Los valores del potencial osm tico en frijol fueron inicialmente mayores que los de ma z durante OSMA lo que implica que frijol puede ser osmoacondicionado con un mayor contenido de agua No obstante ambas especies de semillas mostraron tasas de germinaci n y actividad metab lica muy semejantes despu s del OSMA independientemente de las diferen cias en el conten
4. Random Primer y a P dCTP 30 Ci Las soluciones de pre hibridaci n y de hibridaci n en un rango de temperatura de 58 a 65 C dependiendo de la sonda a usarse conte n an fosfato de sodio 0 3M pH 7 2 SDS a 7 y EDTA 1 mM La membrana se lav dos veces a 55 C con SSC 2X NaCl 0 3M citrato de sodio 30 mM pH 7 0 SDS a 0 1 y una vez con SSC 0 2 X SDS a 0 1 por 15 minutos cada uno Las membranas se expusieron a pel cula Kodak XAR a 80 C usando una pantalla intensificadora de la se al Extracci n de prote nas y an lisis por inmunodetecci n Western blot Los embriones de frijol o los ejes embrionarios de ma z se homo geneizaron a 4 C en amortiguador de extracci n Tris HCl 70 mM pH 7 5 MgCl 1 mM KCI 25 mM sacarosa 0 25 mM b mercaptoetanol 15 mM Trit n X 100 0 1 EDTA 5 mM y mezcla de inhibidores de proteasas Los extractos celulares se centrifugaron 30 minutos a 150 000 X g a 4 C y se determin la cantidad de prote na por el m todo de Bradford 1976 Las prote nas se extrajeron de embriones o ejes embrionarios se cos de frijol y ma z respectivamente de embriones de semillas de frijol osmoacondicionadas por siete d as de ejes embrionarios de se millas de ma z osmoacondicionadas por tres y diez d as y de embrio nes o ejes embrionarios de semillas germinadas por 5 10 6 24 horas post OSMA Las prote nas se separaron por electroforesis en geles de acrilamida SDS los geles se lavaron
5. a 30 C por una hora Luego las semillas de ma z o frijol 25 semillas en cada caso por duplicado se pusieron en cajas de Petri que conten an dos discos de papel Whatman No 1 est ril y 40 mL de la soluci n de PEG a 2 0 MPa para ma z o a 1 0 MPa para semillas de frijol La incubaci n de las semillas fue a 25 C por los per odos indicados en la secci n de Resultados Medici n del potencial de agua El potencial de agua se determin siguiendo los m todos de pun to de roc o y psicrom tricos descritos en el manual de instrucciones para el Dew Point Microvoltimeter HR 33T Wescor usando un psicr metro de suelo modelo PST 55 15 Extracci n de ARN y an lisis por Northern Blot El ARN total se prepar al tratar el material vegetal pulverizado por congelaci n por el m todo del fenol caliente siguiendo el proce dimiento reportado por De Vries et al 1991 El ARN fue extra do de embriones secos frijol o de ejes embrionarios secos ma z de embriones de semillas osmoacondicionadas por 1 3 y 7 d as frijol de ejes embrionarios de semillas osmoacondicionadas por 3 5 y 10 Seed Osmopriming Seed osmopriming was performed as described before Cruz Garc a et al 1995 S nchez Jim nez et al 1997 Briefly maize or bean seeds were disinfected by rinsing with sterile water and then soaking in a 0 25 Captan solution for 10 min Excess water was removed by blotting the seeds with sterile Whatman paper
6. al 1994 were used RESULTS AND DISCUSION One of the characteristics of seed osmopriming is that water availability is maintained at a suboptimal level so that the germination process initiates but it is halted at some point A complete germination taken as radicle protrusion never takes place The osmotic potential of maize and bean seeds was measured during both osmopriming and germination post osmopriming Figure 1 shows that the osmotic potential in maize seeds was 2 0 MPa during osmopriming Bean seeds had values around 1 2 MPa all along the osmopriming process These values were further increased in both types of seeds as they germinated Osmotic potential values in bean seeds were initially higher than those in maize seeds during osmopriming implying that bean seeds can be osmoprimed with a higher water content However both types of seeds showed very similar post osmopriming germination rates and metabolic activity regardless of the differences in water content during osmopriming Cruz Garcia et al 1995 Sanchez Jim nez et al 1997 Lea protein transcripts accumulate during late seed development when the desiccation period is established and their levels decrease during seed germination Many lea genes are also expressed under water deficit conditions Colmenero Flores et al 1999 To understand response of lea genes during osmopriming the transcript accumulation pattern of genes Pvlea 18 Pvlea 4 25 and Pvhsp 17
7. an inert osmotic agent such as poly ethylene glycol PEG which reduces water availability Cells in seeds can reactivate metabolism but germination i e radicle protrusion will not ensue The beneficial effect of osmopriming is manifested as a fast and uniform germination after PEG removal Heydecker and Coolbear 1977 Bradford 1986 462 AGROCIENCIA VOLUMEN 36 N MERO 4 JULIO AGOSTO 2002 pre imbibir semillas en una soluci n que contiene un agente osm tico inerte como lo es el polietil n glicol PEG el cual reduce la disponibilidad de agua Las c lulas en las semillas pueden reactivar su metabolismo pero el proceso germinativo definido como el brotamiento radicular no ocurre El efecto ben fico del OSMA se manifiesta en forma de una germinaci n r pi da y uniforme despu s de la remoci n del PEG Heydecker y Coolbear 1977 Bradford 1986 Las condiciones para osmoacondicionar semillas va r an de acuerdo con la especie vegetal que corresponda El ma z Zea mays L una semilla monocotiled nea re quiere un potencial osm tico de 1 7 MPa de hecho en un rango de 1 7 a 2 0 MPa se logra un OSMA estable Cruz Garc a et al 1995 mientras que una semilla dicotiled nea como el frijol Phaseolus vulgaris L re quiere un potencial osm tico cercano a 1 0 MPa un potencial m s negativo reduce considerablemente la via bilidad de las semillas de frijol S nchez Jim nez et al 1997 Bajo condiciones ap
8. and high percentage of glycine residues Baker et al 1988 Dure 1993 Lea protein families have been identified in a wide range of plant species to the extent that they can be considered ubiquitous throughout the plant kingdom Ingram and Bartels 1996 Close 1997 Although a precise function CAMPOS ALVAREZ et al EXPRESI N DE GENES ABUNDANTES EN EMBRIOG NESIS TARD A 463 en algunos casos en respuesta a la aplicaci n de cido absc sico Galau et al 1986 Mundy y Chua 1988 Harada et al 1989 Ingram y Bartels 1996 Close 1997 Las proteinas LEA se han agrupado en al menos seis fa milias sobre la base de la similitud en secuencias Ingram y Bartels 1996 Colmenero Flores et al 1997 Aunque no se ha detectado una similitud significativa entre los miembros de las diferentes familias una caracteristica unificadora y sobresaliente de estas prote nas es su alta hidrofilicidad y su alto porcentaje de residuos de glicina Baker et al 1988 Dure 1993 Las prote nas LEA se han identificado en un amplio rango de especies vegeta les al grado que se han considerado ubicuas en el Reino Vegetal Ingram y Bartels 1996 Close 1997 Aunque no se ha demostrado una funci n precisa para ninguna de las prote nas LEA evidencia circunstancial e indirec ta apuntar a a que estas prote nas cumplen una funci n como protectoras de estructuras y prote nas celulares durante lapsos de estr s por sequ a o congelamiento Ingram y B
9. cionadas por 3 y 5 y 10 d as carriles 2 4 o de ejes embrionarios de semillas germinadas por 5 10 y 24 ho ras carriles 5 7 Figure 3 Analysis by northern blot of transcripts accumulation patterns of dehydrin rab 17 and Zmhsp 17 4 genes Total RNA was extracted from dry embryo axes lane 1 from embryo axes of maize seeds osmoprimed for 3 5 and 10 days lanes 2 4 or from embryo axes of seeds germinated for 5 15 and 24 h lanes 5 7 Opposite to the situation observed in bean seeds maize seeds with a lower water content accumulate transcripts during osmopriming In fact maize seeds seem to transit between two molecular stages during osmopriming during the first days of treatment transcripts are stable or they are partially degraded perhaps the consequence of a signal produced by a germination process that has started However prolonging the priming conditions changes the signal to a stress alarm indicating that germination conditions were not established after all and seeds respond accumulating these products To determine whether the variations found in transcripts levels between bean and maize seeds also influenced the next expression level that is at the level of translation level of the proteins codified by some of these genes was determined An antibody against PVLEA 18 protein from beans and an antibody against maize Rab 17 protein were used The anti PvLEA 18 antibody identified a protein of 14 kDa in dry seed
10. filter was washed twice at 55 C with 2X SSC 0 3 M NaCl 30 mM sodium citrate pH 7 0 0 1 SDS and once with 0 2 x SSC 0 1 SDS for 15 min each Filters were exposed to Kodak XAR films at 80 C using an intensifying screen Extraction of proteins and western blot analysis Embryos beans or embryo axes maize were homogenized at 4 C in extraction buffer 70 mM Tris HCl pH 7 5 1 mM MgCl 25 mM KCI 0 25 mM sucrose 15 mM b mercaptoethanol 0 1 Triton X 100 5 mM EDTA and protease inhibitor cocktail Extracts were centrifuged 30 min at 150 000 x g at 4 C and protein was determined by the method of Bradford 1976 Proteins were extracted from dry maize embryo axes or dry bean seed embryos and from 7 days osmoprimed bean embryos or 3 and 10 days osmoprimed maize embryo axes and from 5 10 and 24 h germinated bean embryos or maize embryo axes after osmopriming Proteins were separated by SDS PAGE the gels were washed with transference buffer 20 mM Tris HCl 150 mM glycine and 20 CAMPOS LVAREZ ef al EXPRESI N DE GENES ABUNDANTES EN EMBRIOG NESIS TARD A 465 d as ma z y de embriones o ejes embrionarios germinados por 5 10 y 24 horas despu s del OSMA El ARN 30 ug muestra se separ por electroforesis a trav s de geles de agarosa formaldehido 1 y enton ces fue transferido a membranas Hybond N Sambrook et al 1988 Las sondas de ADNCc a usarse en la hibridaci n se marcaron usando el kit para marcaje al azar
11. osmopriming bean seed embryos B Total proteins from dry seed embryo axes lane 1 3 lane 2 and 10 days lane 3 osmoprimed or 5 lane 4 10 lane 5 and 24 h lane 6 germination after osmopriming maize seed embryo axes 6 A similar behavior was observed for the 26 kDa protein These results indicate that the levels of the proteins codified by the genes used in this work correlate with the accumulation levels of the corresponding transcripts suggesting that modulation of protein levels during osmopriming mostly occurs at the level of transcription Explanations to the differential behavior between these two seed species could be a different sensitivity to water availability or a difference in the water deficit reached in tissues of both seed species due to a different biochemical composition Furthermore it may be that the genes used in this study respond differently in maize and bean seeds so that bean seeds could be detecting the stress condition through mechanisms deriving from detention of germination that do not involve the expression of the genes measured here It should be stressed that for beans the water deficit conditions by which the osmopriming is established is almost extreme since beans cannot be osmoprimed at values below 1 2 MPa without causing loss of viability and death S nchez Jim nez et al 1997 The regulation of late embryogenesis genes is complex since they respond to a developmental condition tha
12. patrones de acumulaci n de su transcrito y en algunos casos de la prote na correspondien te de diferentes genes tipo lea o bien genes codificantes para pro te nas de choque t rmico PvLEA 4 25 PvLEA 18 Pvhsp 17 19 Zmhsp 17 4 y de dehidrina en semillas de una variedad de frijol y otra de ma z osmoacondicionadas Se encontr una respuesta con trastante de las semillas a la condici n de OSMA los respectivos transcritos en semillas de frijol desaparecieron durante el per odo de siete d as de OSMA una respuesta semejante a como ocurrir a durante la germinaci n Por otro lado los transcritos en semillas de ma z se acumularon hacia el final del per odo de 10 d as de OSMA mostrando una conducta semejante a una respuesta de estr s Se discute sobre el posible significado de esta respuesta di ferencial entre ma z y frijol al OSMA Palabras clave Phaseolus vulgaris Zea mays genes lea genes shsp INTRODUCCI N a p rdida de vigor durante el almacenamiento de semillas provoca una reducci n en la germina bilidad y en el establecimiento en campo de la pl ntula Se han desarrollado varias metodolog as para revigorizar semillas y una de stas es la de osmoacondicionamiento OSMA que consiste en Recibido Enero 2001 Aprobado Junio 2002 Publicado como ART CULO en Agrociencia 36 461 470 2002 461 ABSTRACT Osmopriming maize Zea mays L and bean Phaseolus vulgaris L seeds blocks germination and see
13. ATERIALES Y M TODOS Semillas Se usaron semillas de la variedad Chalque o de ma z y semillas de frijol variedad Negro Jamapa Las semillas mostraron una viabili dad de 90 a 95 despu s de la imbibici n has not been demonstrated for any Lea protein circumstantial and indirect evidence indicates that they play a role as protectors of cellular structures and proteins during drought and freezing stress Ingram and Bartels 1996 Xu et al 1996 Imai et al 1995 Close 1997 Swire Clark and Marcotte 1999 Dry seeds contain a considerable store of Lea proteins and their messages most of which are degraded during germination very likely providing the seeds of precursors that will be used to build the new information and structures necessary for the following developmental process Bewley and Black 1994 Since osmoprimed seeds are metabolically active but do not germinate it is important to know the mechanisms involved in this process As lea type transcripts and proteins generally accumulate during late seed development and are degraded in the early germination stages the experimental approach taken to characterize osmopriming consisted in determining the patterns of transcript and protein accumulation of different lea type genes in two seeds species a monocotiledoneous and a dicotiledoneous The hypothesis is that if osmopriming represents an early germination stage there will be a gradual Lea transcripts degradation with osmo
14. EXPRESI N DE GENES CODIFICANTES PARA PROTE NA ABUNDANTES EN EMBRIOGENESIS TARDIA LEA DURANTE EL OSMOACONDICIONAMIENTO DE SEMILLAS DE MAIZ Y FRIJOL EXPRESSION OF LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT LEA PROTEIN CODIFYING GENES DURING OSMOPRIMING OF MAIZE AND BEAN SEEDS Francisco Campos lvarez Felipe Cruz Garcia Alma Torres Espinosa Marypaz S nchez Jim nez Jos M Colmenero Flores Claudia Smith Espinoza Alejandra A Covarrubias Robles y Jorge M V zquez Ramos Departamento de Biolog a Molecular de Plantas Instituto de Biotecnolog a UNAM Apartado Pos tal 510 3 Cuernavaca Morelos 62250 y Departamento de Bioqu mica Facultad de Qu mica UNAM Av Universidad y Copilco M xico 04510 D F M xico jorman Oservidor unam mx Ambos autores contribuyeron igualmente en este trabajo RESUMEN El osmoacondicionamiento OSMA bloquea la germinaci n de semillas de ma z Zea mays L y de frijol Phaseolus vulgaris L y las semillas pueden permanecer en este estado por m s de dos se manas sin que emerja la ra z Aparentemente bajo estas condicio nes el proceso germinativo de las semillas se detiene en una etapa temprana Los genes tipo lea late embryogenesis abundant o de expresi n abundante durante la embriog nesis tard a se expresan tanto durante la embriog nesis tard a como en respuesta a condi ciones de d ficit h drico Con la finalidad de conocer su comporta miento durante OSMA se determin los
15. The wheat LEA protein Em functions as an osmoprotective molecule in Sacharomyces cerevisiae Plant Mol Biol 39 117 128 Vilardell J A Goday M A Freire M Torrent M C Mart nez J M Torn and M Pag s 1990 Gene sequence developmental expression and protein phosphorylation of Rab 17 in maize Plant Mol Biol 14 423 432 Xu D X Duan B M Wang B Hong D T H Ho and R Wu 1996 Expression of a late embryogenesis abundant protein gene HVA1 from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice Plant Physiol 110 249 257
16. V zquez Ramos 1995 Biochemical and cytological studies on osmoprimed maize seeds Seed Sci Res 5 15 23 Davison P A and C M Bray 1991 Protein synthesis during osmopriming of leek Allium porrum L seeds Seed Sci Res 1 29 35 De Vries S H Hoge and T Bisseling 1991 Isolation of total and polysomal RNA from plant tissues Jn Gelvin S B Schilperoort R A and Verma D P S eds Plant Molecular Biology Manual 86 1 13 Kluwer Academic Dordrecht Netherlands Dell Aquila A and P Spada 1992 Regulation of protein synthesis in germinating wheat embryos under polyethylene glycol and salt stress Seed Sci Res 2 75 80 Dure MI L 1993 Structural motifs in LEA proteins In Close T J and E A Bray eds Plant Responses to Cellular Dehydration During Environmental Stress Am Soc Plant Physiol Rockville MD pp 91 103 Galau G A D W Hughes and L Dure III 1986 Abscisic acid induction of cloned cotton late embryogenesis abundant LEA mRNAs Plant Mol Biol 7 155 170 Goday A A B Jensen F A Culianez Macia M M Alba M Figueras J Serratosa M Torrent and M Pag s 1994 The maize abscisic acid responsive protein rab 17 is located in the nucleus and interacts with nuclear localization signals Plant Cell 6 351 360 Harada J A De Lisle C Baden and M Crouch 1989 Unusual sequence of an abscisic acid inducible mRNA wich accumulates late in Brassica napus development Pla
17. artels 1996 Xu et al 1996 Imai et al 1995 Close 1997 Swire Clark y Marcotte 1999 Las semillas secas almacenan una considerable can tidad de prote nas LEA y de sus respectivos mensajes la mayor a de los cuales son degradados durante la germi naci n lo que muy probablemente provee a la semilla de precursores que ser n usados para sintetizar la nueva in formaci n y las estructuras necesarias para el proceso de desarrollo siguiente la formaci n de una pl ntula Bewley y Black 1994 Dado que las semillas osmoacondicionadas son me tab licamente activas pero no germinan es necesario co nocer los mecanismos involucrados en este proceso Pues to que los transcritos y prote nas de genes tipo lea gene ralmente se acumulan durante la fase tard a del desarro llo de la semilla y se degradan al inicio del proceso germinativo como un acercamiento a la caracterizaci n del mismo en este trabajo se determin los patrones de acumulaci n de los transcritos y de las prote nas de dife rentes genes tipo lea en semillas de dos especies durante el osmoacondicionamiento una monocotiled nea y una dicotiled nea Como hip tesis se plantea que si el OSMA representa un estado de germinaci n incipiente se ten dr que ver la gradual degradaci n de las prote nas LEA con el paso del tiempo de OSMA por el contrario si durante el OSMA las semillas no han encendido el pro ceso germinativo las prote nas LEA ser n estables M
18. con buffer de transferencia Tris HCl 20 mM glicina 150 mM y metanol a 20 y las prote nas se transfirieron a filtros PVDF con poro de 0 2 mm mediante un apara to Transblot LKB por 90 minutos a una corriente de 1 mA cm Para esto se us el sistema de amortiguador semi discontinuo recomenda do por los proveedores Para la inmunodetecci n se usaron los anticuerpos contra la prote na PVLEA18 Colmenero Flores et al 1997 y contra la prote na Rab 17 donado por M Pag s Goday et al 1994 RESULTADOS Y DISCUSI N Una de las caracter sticas del osmoacondicionamiento de semillas es que la disponibilidad de agua se mantiene en un nivel sub ptimo de tal forma que el proceso germinativo se inicia pero es detenido en alguna etapa Una germinaci n completa definida como brotamiento radicular nunca ocurre El potencial osm tico de las semillas de frijol y ma z se midi tanto durante el OSMA como durante la germi naci n subsiguiente La Figura 1 muestra que el poten cial osm tico en las semillas de ma z alcanz valores de 2 0 MPa durante el OSMA Las semillas de frijol methanol and proteins were transferred to PVDF filters 0 2 mm pore size by means of a LKB Transblot apparatus for 1 5 h at 1 mA cm The semi discontinuous buffer system recommended by the manufacturers was used Antibodies against the PvLEA 18 protein Colmenero Flores et al 1999 and against the Rab 17 protein kindly provided M Pag s Goday et
19. d allowing transcript accumulation resembling a pre germinative state This behavior may not simply be the perception of a stress state and rather may be influenced by the differential metabolic state that osmopriming represents for maize and bean seeds End of the English version H Biochemical changes during osmopriming of leek seeds Ann Bot 63 185 193 Bray E A 1993 Molecular responses to water deficit Plant Physiol 103 1035 1040 Close T 1997 Dehydrins a commonalty in the response of plants to dehydration and low temperature Physiol Planta 100 291 296 Colmenero Flores J M F Campos A Garciarrubio and A A Covarrubias 1997 Characterization of Phaseolus vulgaris CDNA clones responsive to water deficit identification of a novel late embryogenesis abundant like protein Plant Mol Biol 35 393 405 Colmenero Flores J M L P Moreno C E Smith and A A Covarrubias 1999 Pvlea 18 a member of a new Late Embryogenesis Abundant protein family that accumulates during 470 AGROCIENCIA VOLUMEN 36 N MERO 4 JULIO AGOSTO 2002 water stress and in the growing regions of well irrigated bean seedlings Plant Physiol 120 93 103 Coolbear P and D Grierson 1979 Studies on the changes in the major nucleic acid components of tomato seeds Lycopersicon esculentum Mill resulting from osmotic presowing treatment J Exp Bot 30 1153 1162 Cruz Garc a F L F Jim nez and J M
20. ds can remain in this stage more than two weeks without root emergence Apparently under these conditions seed germination seems to be halted at an early stage As part of the characterization of the osmopriming process of bean and maize seeds we have studied the transcript accumulation patterns of genes encoding proteins which are abundant during late embryogenesis and responsive to water deficit conditions This study includes some of the so called lea genes PvLEA4 25 PvLEA18 rab17 and those corresponding to a particular gene family encoding small heat shock proteins Pvhsp17 19 Zmshsp17 4 In some cases the accumulation patterns of the corresponding proteins were also obtained Results show a contrasting response of seeds to the osmoprimed condition transcripts in bean seeds disappear during the 7 days osmopriming period a response similar to that of a germination On the contrary transcripts in maize seeds accumulated by the end of the 10 days osmopriming period with a response similar to that of a stress response The possible meaning of this contrasting response between maize and bean is discussed Key words Phaseolus vulgaris Zea mays lea genes hsp genes INTRODUCTION oss of vigor during seed storage causes a reduction in germinability and seedling establishment Several methodologies have been developed to re invigorate seeds and one of these is osmopriming which consists of pre imbibing seeds in a solution containing
21. i n post OSMA Figura 2 Lo anterior sugiere que el tratamiento con PEG es capaz de detener la germinaci n ya que en efecto impo ne una situaci n de d ficit h drico para este proceso Sin embargo por otro lado el tratamiento de las semillas se cas con PEG resulta en proporcionar una cantidad limi tada de agua lo cual se refleja en un incremento en el potencial h drico de la semilla tratada y por tanto en una disminuci n en los niveles de los transcritos para los genes lea analizados Una conducta contrastante se observ en la expre si n de genes lea en semillas de ma z ya que en semilla seca se detectaron altos niveles del transcrito del gen rab 17 dehidrina y hacia los tres d as de OSMA se obser v una disminuci n de los niveles del mensaje Figura 3 Sin embargo hacia los cinco d as de OSMA se de tect una elevaci n en los niveles del transcrito por arri ba de su nivel en la semilla seca Este nivel se mantuvo constante hasta los diez d as de OSMA Durante la 3 0 2 5 T 20 o 2 E 15 E 2 10 T S E i a 0 5 0 3d Sd 10h 24 h OSMA Germinaci n post OSMA Figura 1 Potencial osm tico de las semillas de ma z y de frijol durante el OSMA y la germinaci n post OSMA Las se millas se colocaron en una soluci n de PEG a 2 0 MPa ma z barras oscuras o a 1 0 MPa frijol barras cla ras El potencial de agua se determin siguiendo los m todos de punt
22. ido de agua durante el OSMA Cruz Garc a et al 1995 S nchez Jim nez et al 1997 Los transcritos de las prote nas LEA se acumulan durante el estado tard o del desarrollo de las semillas cuando se inicia el periodo de desecaci n en tanto que sus niveles disminuyen durante el proceso de germina ci n Por otro lado la expresi n de muchos genes LEA se induce durante situaciones de d ficit h drico Colme nero Flores et al 1999 Con la finalidad de conocer la respuesta de estos genes durante el proceso de OSMA se hizo un an lisis de los patrones de acumulaci n de los transcritos correspondientes a los genes de frijol Pvlea 18 Pvlea 4 25 y Pvhsp 17 19 y de maiz rab 17 y Zmhsp 17 4 Como se esperaba los transcritos para los tres genes de frijol estuvieron presentes en la semilla seca Sin em bargo en todos los casos los niveles de los transcritos descendieron durante el OSMA aunque con velocidades diferentes El transcrito del gen Pvhsp 17 19 Figura 2 declin lentamente hasta alcanzar niveles muy bajos ha cia los siete d as de OSMA y s lo se detectaron trazas del transcrito a las 24 horas de germinaci n post OSMA La reducci n de los niveles del transcrito del gen Pvlea 4 25 fue m s r pida durante el OSMA y no se pudo detectar el transcrito a las 24 horas de germinaci n post OSMA Figura 2 En el caso del transcrito para el gen Pvlea 18 ste no se detect desde los tres d as de OSMA ni duran te la germinac
23. lar or repair type Coolbear and Grierson 1979 Ashraf and Bray 1993 Cruz Garc a et al 1995 Besides evidence of some replicative DNA synthesis has also been reported Bino et al 1992 Lanteri et al 1993 in different seeds In leak maize an common beans germination post osmopriming rapidly triggers DNA replication and cell division and this occurs hours before this takes place under non stimulated germination conditions Ashraf and Bray 1993 Cruz Garc a et al 1995 S nchez Jim nez et al 1997 During development and maturation when natural desiccation takes place seeds accumulate transcripts and proteins at a relatively high concentration for this reason when first found proteins were named Late Embryogenesis Abundant LEA proteins Bewley and Black 1994 These proteins not only accumulate during the last stage of seed formation Galau et al 1986 Baker et al 1988 Bray 1993 but also in vegetative tissues in response to dehydration or upon exogenous application of abscisic acid ABA Galau et al 1986 Mundy and Chua 1988 Harada et al 1989 Ingram and Bartels 1996 Close 1997 Lea proteins have been grouped into at least six families on the basis of sequence similarity Ingram and Bartels 1996 Colmenero Flores et al 1997 Although significant similarity has not been detected among members of the different classes an unifying and outstanding feature of these proteins is their high hydrophilicity
24. ns It could be argued that the behavior of maize seeds is simply due to the more negative osmotic potential required for osmopriming that triggers a stress response in cells Nonetheless seeds should sense this stress state since the first day of osmopriming and it is not until after several days of osmopriming that the molecular response to stress 1s established Thus results cannot solely be explained by a stress effect The answer may reside in the complexity of the regulatory processes that control gene expression during late embryogenesis between monocot and dicot seeds It would be very important to validate the generality of this proposal that is if this phenomenon applies equally well to different mono and dicotiledoneous seed species CONCLUSIONS Seeds of maize Chalque o variety and beans Negro Jamapa variety show different osmopriming conditions since in beans the germination process is inhibited even though their seeds contain a higher water content than maize seeds This difference is also noticeable in the way both seed species interpret water deficit when the expression of late embryogenesis genes is measured In bean embryos transcripts of lea genes are gradually degraded during osmopriming similarly as they are degraded during germination On the contrary maize embryo axes initially promote degradation of the transcripts of lea genes but as the osmopriming condition is prolonged the degradation signal is reverte
25. nt Mol Biol 12 395 401 Heydecker W and P Coolbear 1977 Seed treatments for improved performance survey and attempted prognosis Seed Sci Technol 5 353 425 Imai R L Chang A Ohta E A Bray and M Takagi 1995 A lea class gene of tomato confers salt and freezing tolerance when expressed in Sacharomyces cerevisiae Gene 170 243 248 Ingram J and D Bartels 1996 The molecular basis of dehydration tolerance in plants Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47 377 403 Lanteri S H L Kraak C H Ric de Vos and R J Bino 1993 Effects of osmotic preconditioning on nuclear replication activity in seeds of pepper Capsicum annuum Physiol Planta 89 433 440 Mundy J and N H Chua 1988 Abscisic acid and water stress induce the expression of a novel rice gene EMBO J 7 2279 2286 Sambrook J E F Fritsch and T Maniatis 1988m Molecular Cloning A Laboratory Manual 2 ed Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor NY S nchez Jim nez M P F Cruz Garc a A Covarrubias Robles y J M V zquez Ramos 1997 Osmoacondicionamiento de semillas de fri jol establecimiento y caracterizacion Agrociencia 31 305 311 Shen Q P Zhang and T HD Ho 1996 Modular nature of abscisic acid ABA response complexes composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley Plant Cell 8 1107 1119 Swire Clark G A and R W Marcotte 1999
26. o de roc o y psicrom tricos usando un psicr metro de suelo OSMA tratamiento de osmoacondicionamiento post OSMA germinaci n des pu s del OSMA La barra representa la desviaci n stan dard n 3 Figure 1 Osmotic potential of bean and maize seeds during osmopriming and germination post osmopriming Seeds were placed in a PEG solution of 2 0 MPa maize dark bars or 1 0 MPa beans empty bars Water potential was determined following the dew point and psychrometric methods using a soil psychometer Osma osmopriming treatment post osma germination after osmopriming Standard deviation n 3 of a limited amount of water that causes an increase in the water potential of seeds and thus a decrease in the transcript levels of the lea genes analyzed A contrasting behavior was observed for the expression of lea genes in maize seeds The dehydrin transcript gen rab 17 was highly accumulated in dry seeds and by three days osmopriming messenger levels decreased figure 3 However by 5 days osmopriming transcript levels rose above those seen in dry seeds and remained around those levels until 10 days osmopriming During germination post osmopriming the transcript levels were maintained for at least 5 hours and then declined precipitously figure 3 Although for Zmhsp 17 4 higher transcript levels as compared to rab 17 levels were detected a similar accumulation pattern was observed present in dry seeds the levels of transcrip
27. o que puede estar influenciada por el estado metab lico diferencial que representa el OSMA para las semillas de frijol y de ma z AGRADECIMIENTO Este trabajo fue financiado por el proyecto DGAPA PAPIIT IN 209895 LITERATURA CITADA Ashraf M and C M Bray 1993 DNA synthesis in osmoprimed leek Allium porrum L seeds and evidence for repair and replication Seed Sci Res 3 15 23 Baker J C Steele and L Dure III 1988 Sequence and characterization of 6 LEA proteins and their genes from cotton Plant Mol Biol 11 277 291 Bewley J D and M Black 1994 Seeds Physiology of Development and Germination 2 ed New York Plenum Press Bino R J J M De Vries H L Kraak and J G Van Pijlen 1992 Flow cytometric determination of nuclear replication stages in tomato seeds during priming and germination Ann Bot 69 231 236 Bradford K J 1986 Manipulation of seed water relations via osmotic priming to improve germination under stress conditions HortScience 59 672 676 Bradford M M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein dye binding Anal Biochem 72 248 254 Bray C M P A Davison M Ashraf and R M Taylor 1989 coincides with changes in the water status of cells which in turn correlates with changes in hormonal levels Thus promoters in these genes could impose complex transcriptional regulation patter
28. og nesis Tard a Late Embriogenesis Abundant o LEA y alos genes co rrespondientes genes lea Bewley y Black 1994 Estas prote nas no s lo se acumulan durante la ltima etapa en la formaci n de la semilla Galau et al 1986 Baker et al 1988 Bray 1993 sino que tambi n se encuentran en tejidos vegetativos en respuesta a la deshidrataci n y Conditions for osmopriming seeds vary according to the type of plant species Maize Zea mays L a monocotiledoneous seed requires an osmotic potential of 1 7 MPa stable osmopriming can be achieved in the range of 1 7 to 2 0 MPa Cruz Garc a et al 1995 while dicotiledoneous seeds as common beans Phaseolus vulgaris L require an osmotic potential close to 1 0 MPa since a more negative osmotic potential importantly reduces bean seeds viability Sanchez Jim nez et al 1997 Under the appropriate conditions maize and bean seeds can remain in the inert osmotic solution for at least two weeks without any apparent loss of the benefits acquired by osmopriming During osmopriming seeds are in a metabolically active stage Protein and RNA synthesis can be detected within a few hours after imbibition in the PEG solution and this synthesis may continue for several days Bray et al 1989 Davison and Bray 1991 Dell Aquila and Spada 1992 Cruz Garc a et al 1995 A low level DNA synthesis can also be detected during osmopriming and this has been regarded as of organel
29. on gradualmente hasta alcanzar un m ximo hacia los 10 d as de OSMA Figura 3 A pesar de que no se observ la reducci n a los tres d as de OSMA detectada para el transcrito del gen rab 17 durante la germinaci n post OSMA la cantidad del transcrito disminuy progresivamente hasta las 24 horas de germinaci n Contrario a lo que sucede en frijol las semillas de ma z con un contenido de agua menor acumulan los transcritos durante el OSMA De hecho las semillas pa recen transitar entre dos estados moleculares durante el OSMA en los primeros d as del tratamiento los transcritos se estabilizan o son parcialmente degradados quiz s como consecuencia de una se al producida por un pro ceso germinativo que ha comenzado Sin embargo al pro longarse las condiciones de OSMA cambia la se al a una de estr s que indica que las condiciones para la ger minaci n no se establecieron despu s de todo y entonces las semillas responden re acumulando los transcritos Para determinar si las variaciones a nivel transcripcional encontradas entre ma z y frijol tambi n influencian el siguiente nivel de expresi n esto es a nivel de traducci n se determinaron los niveles de las Rab 17 Zmhsp 17 4 ARNr Figura 3 An lisis por northern blot de la acumulaci n de los transcritos de rab 17 dehidrina y de Zmhsp17 4 El ARN total se extrajo de ejes embrionarios secos de ma z carril 1 de ejes embrionarios de semillas osmoacondi
30. priming time On the contrary if during osmopriming the germination process is not triggered Lea transcrips will be stable MATERIALS AND METHODS Plant material Seeds from maize Zea mays L cv Chalquefio and common beans Phaseolus vulgaris L cv Negro Jamapa were used They showed 90 95 germination after imbibition Chemicals Polyethylene glycol 8000 PEG and Tris tris hydroxymethyl amino methane were from Sigma Aldrich Chemicals Co Hybond N membranes enhanced chemiluminescence ECL kit and P dCTP 3000 Ci mmol were from Amersham International Random Primer kit was from Gibco BRL Protease inhibitor cocktail was from Boehringer All other reagents were of analytical grade cDNA probes Complementary DNA cDNA probes from common beans were group 4 Lea cDNA Pvlea4 25 group 6 Lea Pvlea18 and class I heat shock protein cDNA Pvhsp17 19 All encode for transcripts and proteins highly accumulated during late embryogenesis in bean seeds Colmenero Flores et al 1997 Probes for maize seeds were a partial cDNA clone coding for a class I heat shock protein Zmhsp 17 4 Shen et al 1996 and a cDNA coding for a group 2 Lea protein also called dehydrins rab 17 Goday et al 1994 464 AGROCIENCIA VOLUMEN 36 N MERO 4 JULIO AGOSTO 2002 Sustancias qu micas El polietil n glicol 8000 y el Tris tris hidroximetil amino meta no se adquirieron de Sigma Aldrich Chemicals Co las membranas Hybond N el ki
31. ropiadas las semillas de ma z y frijol pueden permanecer en la soluci n osm tica iner te hasta por dos semanas sin p rdida aparente de los be neficios adquiridos durante el OSMA Las semillas se encuentran en un estado metab lica mente activo en condiciones de OSMA La s ntesis de prote nas y ARN se detecta unas pocas horas despu s de la imbibici n en PEG y esta s ntesis puede continuar por varios dias Bray et al 1989 Davison y Bray 1991 Dell Aquila y Spada 1992 Cruz Garc a et al 1995 Un bajo nivel de s ntesis de ADN tambi n se detecta y ste se ha considerado como de tipo reparativo u organelar Coolbear y Grierson 1979 Ashraf y Bray 1993 Cruz Garc a et al 1995 Adicionalmente existe evidencia de duplicaci n del ADN en semillas de diferentes especies Bino et al 1992 Lanteri et al 1993 La germinaci n post OSMA de semillas de poro Allium porrum L ma z y frijol causa una r pida activaci n de la duplicaci n del ADN y de la divisi n celular y esto ocurre horas antes de cuando sucede durante la germinaci n no estimulada de este tipo de semillas Ashraf y Bray 1993 Cruz Garc a et al 1995 S nchez Jim nez et al 1997 Durante los procesos de desarrollo y maduraci n cuando ocurre la desecaci n natural las semillas acumu lan transcritos y prote nas en una concentraci n relativa mente alta por esta raz n las prote nas encontradas fue ron denominadas Abundantes en Embri
32. s figure 4a lane 1 the amount of Pvlea 18 was strongly reduced by 7 days osmopriming lane 2 and the protein disappeared by 24 h germination post osmopriming lane 5 The antibody against maize Rab 17 as expected recognized two polypeptides of around 20 and 26 kDa Vilardell et al 1990 in dry seeds figure 4b lane 1 The amount of the 20 kDa protein decreased at 3 days osmopriming lane 2 and then recovered by 10 days osmopriming lane 3 to disappear by 24 h germination post osmopriming lane 468 AGROCIENCIA VOLUMEN 36 prote nas codificadas por algunos de estos genes Se usa ron anticuerpos contra la prote na PVLEA 18 de frijol y contra la prote na Rab 17 de ma z El anticuerpo anti PvLEA 18 identific una prote na de 18 kDa en semilla seca de frijol Figura 4a carril 1 la cantidad de PVLEA 18 se redujo significativamente a los siete d as de OSMA carril 2 y la prote na desapareci hacia las 24 horas de germinaci n post OSMA carril 5 El anticuerpo contra la prote na Rab 17 de ma z como se esperaba detect dos bandas de 20 y 26 kDa Vilardell et al 1990 en semilla seca Figura 4b carril 1 La cantidad de la pro te na de 20 kDa decreci a los 3 d as de OSMA carril 2 y se recuper hacia los 10 d as de OSMA carril 3 para desaparecer hacia las 24 horas de germinaci n carril 6 Una conducta semejante se observa para la prote na de 26 kDa Estos resultados indican que los niveles de las pro
33. t CAMPOS LVAREZ ef al EXPRESI N DE GENES ABUNDANTES EN EMBRIOG NESIS TARD A 469 los resultados no se pueden explicar solamente como una respuesta al estr s La respuesta podr a residir en la com plejidad de los procesos regulatorios que controlan la expresi n g nica durante la embriog nesis tard a en se millas monocotiled neas y dicotiled neas Por tanto se r a sumamente importante validar la generalidad de la propuesta esto es si el fen meno se aplica a especies diferentes de semillas mono y dicotiled neas CONCLUSIONES Las semillas de ma z variedad Chalque o y frijol variedad Negro Jamapa presentan condiciones de OSMA diferentes dado que en frijol el proceso germinativo es inhibido habiendo un mayor contenido de agua Esta diferencia se hace visible tambi n en la forma en que ambas especies interpretan el d ficit de agua cuando se mide la expresi n de genes de embriog nesis tard a durante el OSMA Los embriones de las semillas de frijol degradan gradualmente los transcritos de los genes lea durante el OSMA de manera semejante a como lo har an durante la germinaci n Por otro lado los ejes embrionarios de semillas de ma z al principio promue ven la degradaci n de los mensajes de los genes lea pero posteriormente revierten la se al y permiten su acumula ci n semejando un estado pre germinativo Esta conducta probablemente no sea un simple reflejo de la percepci n de un estado de estr s sin
34. t gradually rose to reach a maximum by 10 days osmopriming Figure 3 Even though no reduction in its amount was observed by 3 days osmopriming as was the case of the dehydrin message during germination post osmopriming the amount of the transcript progressively decreased until 24 h germination CAMPOS ALVAREZ et al EXPRESI N DE GENES ABUNDANTES EN EMBRIOG NESIS TARD A 467 PvLEA 4 25 PvLEA 18 Pvhsp 17 19 ARNr Figura 2 An lisis por northern blot de la acumulaci n de los transcritos de PyLEA 4 25 PvLEA 18 y Pvhsp 17 19 El ARN total se extrajo de embriones secos de frijol carril 1 de embriones de semillas osmoacondicionadas por 1 3 y 7 d as carriles 2 4 o de embriones de semillas ger minadas por 5 10 y 24 horas carriles 5 7 Figure 2 Analysis by northern blot of transcripts accumulation patterns of Pvhsp 17 19 PVLEA 4 25 and PvLEA 18 genes Total RNA was extracted from dry embryos lane 1 from embryos of bean seeds osmoprimed for 1 3 and 7 days lanes 2 4 or from embryos of seeds germinated for 5 15 and 24 h lanes 5 7 germinaci n post OSMA el nivel del transcrito se man tuvo por al menos 5 horas y posteriormente se redujo en forma precipitada Figura 3 Aunque los niveles detec tados para el transcrito del gene Zmhsp 17 4 fueron ma yores a los niveles de rab 17 el patr n de acumulaci n observado fue similar presente en la semilla seca los niveles del transcrito se incrementar
35. t para quimioluminiscencia ECL y el P dCTP 3000 Ci mmol se adquirieron de Amersham International el kit para marcaje por Random Primer se adquiri de Gibco BRL La mezcla de inhibidores de proteasas se adquiri de Boehringer Todos los dem s reactivos utilizados fueron de grado anal tico Sondas de ADNc Las sondas de ADN complementario ADNc correspondientes a genes de frijol son ADNc codificante para una LEA del grupo 4 PvLEA 4 25 ADNC codificante para una LEA del grupo 6 PVLEA 18 y ADNc codificante para una prote na de choque t rmico de clase I Pvhsp 17 19 Estos ADNc codifican para transcritos y prote nas que se acumulan abundantemente durante la embriog nesis tard a en frijol Colmenero Flores et al 1997 Para ma z se usaron una clona parcial de ADNc codificante para una prote na de choque t rmico de clase I Zmhsp 17 4 Shen et al 1996 y un ADNc codificante para prote nas LEA del grupo 2 tambi n llamadas dehidrinas rab 17 Goday et al 1994 Osmoacondicionamiento de semillas El osmoacondicionamiento se realiz seg n lo describen Cruz Garc a et al 1995 y S nchez Jim nez et al 1997 En forma breve las semillas fueron desinfectadas lav ndolas con agua destilada est ril y sumergi ndolas en una soluci n de Capt n a 0 25 por 10 minutos El exceso de agua se elimin al frotar las semillas contra papel What man est ril posteriormente las semillas se colocaron en una incuba dora
36. te nas codificadas por los genes utilizados en este estudio se correlacionan con los niveles de acumulaci n de los transcritos respectivos lo cual sugiere que durante este proceso los niveles de estas prote nas se modulan princi palmente a nivel transcripcional Explicaciones al com portamiento diferencial entre estas dos especies de semi llas pudieran ser una diferente sensibilidad a situaciones similares de disponibilidad de agua o bien que el d ficit h drico que se alcanza en los tejidos de la semilla no es comparable entre ambas semillas dada la diferencia en la composici n de los tejidos que las conforman Adicio nalmente es posible que los genes que se utilizaron en este estudio sean diferencialmente sensibles en frijol y ma z de tal manera que las semillas de frijol pudieran estar detectando la condici n de estr s a trav s de otros mecanismos que derivan en la detenci n de la germina ci n pero que no involucran la inducci n de la expre si n de los genes en cuesti n En el caso de frijol cabe mencionar que la condici n de d ficit h drico con la cual se logra el OSMA es casi extrema ya que las semillas de frijol no pueden ser osmoacondicionadas a valores me nores de 1 2 MPa pues empiezan a perder la viabilidad y mueren S nchez Jim nez et al 1997 La regulaci n de los genes de la embriog nesis tard a es compleja ya que responden a una condici n de desa rrollo que coincide con cambios en el status h
Download Pdf Manuals
Related Search
Osmoacondicionamiento