CAPILLARYS HEMOGLOBIN(E)
Contents
1. Determinaci n cuantitativa de la Hb S Se analizaron cuarenta y tres muestras de sangre con hemoglobina S en paralelo con la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E y un sistema comercial de cuantificaci n de la hemoglobina S mediante HPLC La correlaci n entre estas dos t cnicas respecto al valor de Hb S se determin usando herramientas estad sticas media y coeficiente de regresi n ineal Los par metros de correlaci n entre estos 2 sistemas de an lisis y CAPILLARYS HEMOGLOBIN E se muestran en la tabla siguiente m a iz L mites de los valores en Fracci n Coeficiente de correlaci n Punto de corte en y Pendiente CAPILLARYS HEMOGLOBIN E Hb S 0 994 1 769 0 005 9 1 92 7 Detecci n de hemoglobinas anormales Se analizaron setenta y cinco muestras de sangre que presentaban diferentes variantes de la hemoglobina como las hemoglobinas S C y E en paralelo con la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E y un sistema comercial de an lisis de las hemoglobinas mediante HPLC Los resultados obtenidos mostraron una correlaci n perfecta entre los dos sistemas con respecto a la detecci n de hemoglobinas anormales una sensibilidad del 100 y una especificidad del 100 respecto a la t cnica de referencia calculadas seg n el m todo recomendado Wendling 1986 En efecto todas las hemoglobinas anormales as como los valores normales de hemoglobinas normales se detectaron usando la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOB2. 6 Coloque un segmento de diluci n nuevo en cada cargador en caso de ausencia del segmento aparecer un mensaje de advertencia 7 Introduzca el los cargador es completo s en el sistema CAPILLARYS por el orificio de entrada situado en medio del aparato Se pueden introducir hasta trece cargadores a la vez pudi ndose a adir nuevos cargadores de forma continua a medida que se vaya completando el an lisis de los cargadores ya introducidos Cuando quiera analizar una sangre control use el cargador espec fico n 0 previsto a este efecto 8 Saque de la cinta de salida situada a la izquierda del aparato los cargadores ya analizados 9 Coja con precauci n el segmento de diluci n usado y des chelo ATENCI N Manipule con cuidado los segmentos de diluci n que contengan muestras biol gicas DILUCI N MIGRACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Lectura de los c digos de barras de los tubos primarios de muestra y del cargador Diluci n de las sangres con la soluci n hemolizante con limpieza de la c nula de muestras entre cada diluci n Lavado de los capilares Inyecci n de las muestras diluidas en los capilares Migraci n a voltaje constante con temperatura controlada por efecto Peltier durante unos 8 minutos Lectura a 415 nm y aparici n simult nea del perfil de las hemoglobinas en la pantalla del ordenador NOTA Estas etapas se realizan consecutivamente para el primer cargador introducido los perfiles cor
3. CAPILLARYS HEMOGLOBIN E Ref 2007 2009 04 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 USO El kit CAPILLARYS HEMOGLOBIN E permite la separaci n en medio alcalino pH 9 4 de las hemoglobinas normales de la sangre humana A F y A2 y la detecci n de las principales hemoglobinas anormales especialmente las hemoglobinas S C E y D mediante electroforesis capilar en el Sistema autom tico CAPILLARYS El sistema CAPILLARYS permite realizar todas las etapas de la electroforesis hasta la obtenci n del perfil de las hemoglobinas para el an lisis cualitativo o cuantitativo El an lisis puede realizarse usando el hemolizado de gl bulos rojos sedimentados centrifugados o lavados el lavado de los gl bulos rojos no es indispensable Las hemoglobinas separadas en capilares de s lice fundido son detectadas directamente en una burbuja existente en el capilar mediante espectrofotometr a de absorbancia a 415 nm que es la longitud de onda de absorci n espec fica de las hemoglobinas Los perfiles electrofor ticos son analizados visualmente para detectar las anomal as La detecci n directa proporciona autom ticamente una cuantificaci n relativa precisa de cada fracci n individual de las hemoglobinas que presenta un inter s particular como la hemoglobina A2 en el diagn stico de las B talasemias Adem s la buena separaci n de las diferentes fracciones permite confirmar la identificaci n de las variantes de la hemoglobina y en particular
4. capilares en paralelo permitiendo realizar 7 an lisis simult neos En este sistema la inyecci n en los capilares de las muestras diluidas con soluci n hemolizante se realiza en el nodo por aspiraci n La separaci n se realiza a continuaci n aplicando una diferencia de potencial de varios miles de voltios en los extremos de cada capilar La detecci n directa de las hemoglobinas se efect a a 415 nm en el lado cat dico Los capilares se lavan antes de cada an lisis con una soluci n de lavado y luego con el tamp n de an lisis Con el tamp n de pH alcalino usado el orden de migraci n de las principales hemoglobinas normales y anormales es el siguiente del c todo al nodo 8A variante de A2 C A2 O Arab E S D G Filadelfia F A Hope Bart J N Baltimore y H Hay que tener en cuenta que la anhidrasa carb nica no se detecta en el perfil electrofor tico de las hemoglobinas en la electroforesis capilar lo que permite identificar algunas variantes de la hemoglobina A2 en su zona de migraci n REACTIVOS SUMINISTRADOS EN EL KIT CAPILLARYS HEMOGLOBIN E COMPONENTES REF N 2007 Tamp n listo para usar 2 viales de 700 mL Soluci n hemolizante lista para usar 1 vial de 440 mL Soluci n de lavado soluci n concentrada 1 vial de 75 mL Segmentos de diluci n 1 bolsa de 90 Filtros 3 filtros PARA OBTENER RESULTADOS PTIMOS Los elementos de un mismo kit deben ser usados conjuntamente y seg n las
5. de la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E para que el aparato realice la diluci n de las muestras de sangre Deben colocarse en el cargador de muestras ATENCI N Manipule con precauci n los segmentos de diluci n que contengan muestras biol gicas 5 FILTROS Uso Filtros de un solo uso para el filtrado del tamp n de la soluci n de lavado reconstituida y del agua destilada o desionizada usada para la limpieza de los capilares IMPORTANTE Cambie sistem ticamente los tres filtros al empezar un kit nuevo Enrosque un filtro al final de cada tubo que cuelga de los tapones de los contenedores de tamp n de soluci n de lavado y agua destilada o desionizada Al cambiar los filtros lave los conectores y los tubos con agua destilada o desionizada Los filtros usados tambi n deben lavarse con agua antes de su eliminaci n El filtro destinado al tamp n de an lisis debe usarse para la filtraci n de la totalidad de los dos contenedores de tamp n listo para usar los otros dos filtros est n destinados a la filtraci n de la soluci n de lavado reconstituida y del agua destilada o desionizada soluci n de limpieza Conservaci n Antes de usarlos los filtros deben conservarse en su embalaje original herm ticamente cerrado en un lugar seco a temperatura ambiente o en nevera 56 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS 1 CONTROL Hb A2 NORMAL Composici n El Control Hb A2 Normal SEBIA referenci
6. diferenciar la hemoglobina S de la hemoglobina D y la hemoglobina E de la hemoglobina C La cuantificaci n de la hemoglobina A2 tambi n se puede realizar en presencia de hemoglobina E Para uso en diagn stico n Vitro PRINCIPIO DEL TEST La hemoglobina es una mol cula compleja compuesta por cuatro cadenas polipept dicas id nticas dos a dos estando cada cadena ligada al hemo que es un n cleo tetrapirr lico porfirina ligado a un tomo de hierro El hemo es com n a todas las hemoglobinas La parte proteica responsable del tipo de hemoglobina se denomina globina Se conocen principalmente las cadenas polipept dicas B y y En humanos podemos encontrar las hemoglobinas normales siguientes Hemoglobina A a282 Hemoglobina A2 22282 Hemoglobina fetal F a2y2 La cadena a es com n a estas tres hemoglobinas La estructura espacial de la hemoglobina como la del resto de las prote nas depende de la naturaleza y de la secuencia de amino cidos que forman las cadenas Las uniones que se forman entre los diferentes amino cidos son responsables de la forma de la mol cula de su estabilidad y de sus propiedades Situadas en un campo el ctrico las hemoglobinas se desplazan en funci n de su carga del tamafio de la mol cula de la fuerza i nica del pH del tamp n y de la naturaleza del soporte empleado Las variantes de la hemoglobina son debidas a mutaciones de algunos amino cidos que implican cargas de superficie
7. hasta la edad de 6 9 meses se recomienda analizar varias muestras por ejemplo obtenidas mensualmente para controlar la concentraci n de Hb F Esto permitir comprobar la disminuci n de Hb F y la eventual presencia de una variante En caso de duda se aconseja confirmar el resultado con una t cnica complementaria y realizar un an lisis a los padres Caso en que la hemoglobina F Hb F puede estar aumentada excepto en los reci n nacidos en caso de embarazo pacientes con drepanocitosis con m s de 2 a os de edad tratados con Hydrea hidroxicarbamida y o transfusionados y o que presenten naturalmente una cantidad incrementada de Hb F debido a un fen meno de compensaci n pacientes con m s de 2 a os de edad con el desorden PHHF persistencia hereditaria de Hb F hay entre un 20 y un 40 de Hb F en los heterocigotos pacientes con m s de 2 afios de edad que presenten leucemia de cualquier tipo anemia hemol tica hereditaria diabetes enfermedad tiroidea hiperactividad de la m dula sea mieloma m ltiple o un c ncer en fase de met stasis Si desea obtener m s informaci n visite la p gina web http www answers com topic fetal hemoglobin test Al analizar sangres de pacientes con drepanocitosis anemia falciforme que hayan recibido transfusiones y que presenten un porcentaje bajo de Hb A lt 10 la fracci n Hb S puede aparecer desplazada de la zona Z5 hacia la zona Z6 Es indispensable confrontar este resulta
8. hemolisante antes de colocarlo en el cargador Inicio del an lisis Introduzca el cargador n 0 en el sistema CAPILLARYS seleccione en la ventana que aparece en pantalla Diluci n autom tica y valide Despu s de cada cambio del contenedor del tamp n de an lisis incluso si el lote es el mismo o del modo de trabajo despu s de un ciclo de limpieza de los capilares con el CAPICLEAN despu s de una actualizaci n del programa o despu s de una activaci n de los capilares realice una segunda serie de an lisis con el control volviendo a introducir inmediatamente el mismo cargador n 0 con el mismo segmento de diluci n que contiene el Control Hb A2 Normal diluido en el primer an lisis y con el tubo de hem lisis vac o identificado con el c digo de barras del Control Hb A2 Normal en la posici n 1 En la ventana que aparece en pantalla con el t tulo Control Hb A2 Normal seleccione Diluci n manual y valide Los resultados obtenidos son entonces tenidos en cuenta autom ticamente por el programa para el an lisis de los resultados IMPORTANTE El pico de hemoglobina A del Control Hb A2 Normal debe presentar una densidad ptica DO m nima de 0 12 Por debajo de este valor el centrado del perfil electrofor tico no se puede hacer correctamente Durante el an lisis de las muestras la identificaci n de las fracciones de la hemoglobina Hb A Hb F Hb A2 y Hb C as como la determinaci n de la zona de migraci n de otras va
9. incluir el Control Hb A2 Normal en cada serie de an lisis Los valores obtenidos deben estar comprendidos entre los valores espec ficos de cada lote IMPORTANTE Para un uso ptimo del Control Hb A2 Normal colocado en un cargador cualquiera es indispensable usar una etiqueta con c digo de barras destinada a identificar el tubo de hem lisis que servir de soporte al microtubo que contenga el Control Hb A2 corte el tap n del microtubo antes de usarlo Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Antes de la reconstituci n el Control Hb A2 Normal debe conservarse en nevera 2 8 C hasta la fecha de caducidad indicada en los viales o en la caja El Control Hb A2 Normal reconstituido debe conservarse en nevera 2 8 C y usarse en el plazo de una semana para evitar que se contamine o desnaturalice Puede congelarse en al cuotas y conservarse como m ximo 6 meses a 20 C IMPORTANTE Despu s de conservarlo a 2 8 C a 20 C homogenice el Control Hb A2 Normal reconstituido antes de analizarlo en el CAPILLARYS NOTA Para un uso ptimo en el CAPILLARYS se recomienda repartir al cuotas del Control en microtubos antes de congelarlo El Control Hb A2 Normal descongelado debe conservarse en nevera 2 8 C y usarse ese mismo d a No congele y descongele el control m s de 15 veces El Control Hb A2 Normal hemolisado debe conservarse en nevera 2 8 C y usarse ese mismo d a El segmento de diluci n que conten
10. instrucciones suministradas LEA DETENIDAMENTE LAS INSTRUCCIONES ATENCI N No use agua destilada o desionizada comercial como por ejemplo el agua para planchar riesgo de deterioro importante de los capilares Use exclusivamente agua de calidad ultrapura como el agua para inyecci n 55 INSTRUCCIONES SEBIA Espa ol CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 1 TAMP N Preparaci n El tamp n est listo para usar Contiene tamp n alcalino pH 9 4 aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Uso Tamp n para el an lisis de las hemoglobinas mediante electroforesis capilar Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro El tamp n debe conservarse en nevera entre 2 y 8 C Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de tamp n No almacene el tamp n a temperatura ambiente cerca de una ventana o de una fuente de calor NO LO CONGELE IMPORTANTE Despu s de conservarlo a 2 8 C y antes de usarlo conviene dejar que el tamp n se atempere lo que requiere unas 3 horas si el contenedor de tamp n est lleno Si esta indicaci n no se respeta el funcionamiento de la t cnica puede verse afectado ATENCI N No caliente el tamp n al ba o mar a Un contenedor de tamp n empezado instalado en el CAPILLARYS es estable un m ximo de 1 mes acumulado a temperatura ambiente de 15 a 30 C Despu s de cada uso el tamp n debe conserv
11. metros de integraci n por defecto del programa alisado 0 e integraci n autom tica de las fracciones de hemoglobina con la t cnica HEMOGLOBIN E Repetibilidad intraserial Se analizaron cinco sangres diferentes sangre A normal sangre B con Hb A2 aumentada sangres C y E con Hb F y sangre F con Hb A2 aumentada con Hb F y S en el sistema CAPILLARYS con el kit CAPILLARYS HEMOGLOBIN E y 2 lotes diferentes de tamp n de an lisis Cada sangre se analiz simult neamente en los 7 capilares del sistema CAPILLARYS Se calcularon las medias desviaciones t picas SD y coeficientes de variaci n CV n 7 de cada muestra con cada lote de tamp n Le tabla siguiente presenta los valores medios en 96 desviaciones t picas SD y coeficientes de variaci n CV obtenidos para cada fracci n de hemoglobina de las 5 sangres analizadas NOTA No se ha detectado ninguna discordancia en ninguna de las muestras Muestra con valor normal de Hb A2 todos los valores son normales Muestras con valores aumentados de Hb A2 todos los valores est n aumentados Muestras con hemoglobinas anormales se han detectado todas las hemoglobinas anormales 63 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 Fracci n de hemoglobina HbA Hb A2 Hb F Hb S Sangre A lote n 1 lote n 2 MEDIA 97 3 97 3 2 7 2 7 7 SD 0 05 0 05 0 05 0 05 CV 0 170 1 18 18 T 7
12. n 8 del cargador colocaci n de un segmento de diluci n nuevo en el cargador introducci n en el sistema CAPILLARYS recuperaci n de los cargadores despu s del an lisis LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL CAPILLARYS I PREPARACI N DEL AN LISIS ELECTROFOR TICO 1 Encienda el CAPILLARYS y el ordenador de control 2 Abra el programa de gesti n PHORESIS CAPILLARYS y valide el nivel de los reactivos tras lo cual el aparato se iniciar autom ticamente 3 Use el kit CAPILLARYS HEMOGLOBIN E con el programa de an lisis HEMOGLOBIN E Para seleccionar el programa de an lisis HEMOGLOBIN E y conectar el contenedor de tamp n CAPILLARYS HEMOGLOBIN E al aparato lea detenidamente el manual de instrucciones del CAPILLARYS 4 El cargador de muestras posee 8 posiciones para tubos Coloque hasta 7 tubos primarios sin plasma en cada cargador posiciones 1 a 7 destapando cada tubo y de forma que el c digo de barras de cada tubo quede encarado hacia la ventana de lectura del mismo IMPORTANTE Si el n mero de tubos que va a analizar es inferior a 7 complete el cargador poniendo tubos con agua destilada o desionizada 5 Dispense 4 mL de soluci n hemolizante CAPILLARYS HEMOGLOBIN E en un tubo de hem lisis sin que se formen burbujas de aire y coloque este tubo en la posici n 8 del cargador de muestras IMPORTANTE Compruebe que no haya espuma en el tubo de soluci n hemolizante antes de colocarlo en el cargador
13. of 60 000 samples in a clinical diagnostic laboratories Clin Chem 50 10 1736 1747 8 J S Krauss P A Drew Jonah M Trinh S Shell L Black and Baisden 1986 Densitometry and microchromatography compared for determination of the hemoglobin C and A2 proportions in hemoglobin C and hemoglobin SC disease and in hemoglobin C trait Clin Chem 32 5 860 863 9 Landers JP Clinical Capillary Electrophoresis Clin Chem 41 495 509 1995 10 C Livingstone 1986 The hemoglobinopathies Edit London 11 M Maier Redelsberger R Girot 1989 Diagnostic biologique des maladies de l h moglobine Feuillets de biologie 170 12 Oda RP et al Capillary electrophoresis as a clinical tool for the analysis of protein in serum and other body fluids Electrophoresis 18 1715 1723 1997 13 R G Schneider 1978 Methods for detection of hemoglobin variants and hemoglobinopathies in the routine clinical laboratory CRC Crit Rev Clin Lab Sci 9 243 271 14 L Vovan D Lara Russo A Orsini 1985 Diagnostic biologique des h moglobinoses Ann P diat 32 9 780 789 15 http globin cse psu edu hbvar menu html Hbvar A Database of Human Hemoglobin Variants and Thalassemias 16 Wendling A Proc dures de diagnostic ou de d pistage Justification et validit d un test de diagnostic ou de d pistage sensibilit sp cificit Impact Internat 1986 Sept 93 97 224 CAPILLARYS HEMOGL
14. 24 FRACCI N Hb MEDIA SD CV 26 CV MEDIO Hb 53 1 97 3 0 00 0 65 00 1 1 0 3 Hb A2 24 50 0 00 0 10 0 0 2 7 1 5 HbF 0 7 8 7 0 04 0 07 0 7 8 8 45 Hb S 30 8 42 7 0 19 0 63 0 5 1 6 0 9 Reproducibilidad interlotes Se analizaron ocho sangres id nticas a las del estudio de reproducibilidad interserial en el sistema CAPILLARYS con el kit CAPILLARYS HEMOGLOBIN E y 3 lotes de tamp n de an lisis Estas sangres se analizaron simult neamente en todos los capilares del sistema CAPILLARYS y el an lisis se repiti 10 veces con cada lote Se calcularon las medias desviaciones t picas SD y coeficientes de variaci n CV n 30 de cada muestra La tabla siguiente presenta los l mites de los valores medios SD y CV 96 obtenidos para las 8 muestras analizadas con los 3 lotes de tamp n de an lisis y un coeficiente de variaci n medio calculado a partir de todos los coeficientes de variaci n n 3 FRACCI N Hb MEDIA 20 SD CV 26 CV MEDIO Hb 53 2 97 3 0 04 0 77 004 14 0 5 Hb A2 24 50 0 03 0 09 10 22 18 HbF 0 7 86 0 06 0 08 0 9 8 5 49 Hb S 31 1 42 0 0 29 0 71 09 17 13 NOTA No se ha detectado ninguna discordancia en los an lisis de reproducibilidad interserial e interlotes en ninguna de las muestras Muestra con valor normal de Hb A2 todos los valores son normales Muestra con valor aumentado de Hb A2 todos los va
15. FILS ELECTROPHORETIQUES ELECTROPHORETIC PATTERNS Figure 2 Figure 1 215 w Sang b ta thalass mique Sang normal Blood sample with beta thalassemia Normal blood sample Figure 4 Figure 3 715 Sang avec variant h t rozygote Hb S Sang avec variant Hb C Blood sample with Hb S heterozygote variant Blood sample with Hb C variant 226 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 SCHEMAS FIGURES PROFILS ELECTROPHORETIQUES ELECTROPHORETIC PATTERNS Figure 6 Figure 5 715 19 Sang de b b avec Hb Bart s Sang de b b ag de 3 semaines Baby blood sample 3 weeks old Baby blood sample with Hb Bart s Figure 8 Figure 7 2715 Hb H w N Sang avec Hb H Sang avec Hb F jeune enfant Blood sample with Hb H Blood sample with Hb F young child 227 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 SCHEMAS FIGURES PROFILS ELECTROPHORETIQUES ELECTROPHORETIC PATTERNS Figure 10 Figure 9 215 o EE Ait iiic po A II E 8 S 8 SES T SSSS SSS A E E FC feu A L AA IM L c A ci
16. IN E concordando con la t cnica de HPLC con la que se comparaba los resultados hospitalarios y el diagn stico cl nico No se ha detectado ninguna discordancia entre las t cnicas sea cual sea la muestra como la presencia de falsos positivos detecci n de una Hb anormal inexistente o de una Hb con valor normal detectada como valor anormal 65 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 BIBLIOGRAPHIE BIBLIOGRAPHY 1 Bardakdjian Michau J L Dhondt R Ducrocq Galact ros A Guyard F X Huchet A Lahary D Lena Russo P Maboudou M L North C Prehu A M Soummer M Verschelde H Wajcman 2003 Bonnes pratiques de l tude de l h moglobine Ann Biol Clin 61 401 409 V F Fairbanks ed 1980 Hemoglobinopathies and thalassemia Laboratory methods and case studies Brian C Decker New York F Galacteros 1986 Thalass mie dr panocytose et autres h moglobinopathies Techniques et Biologie 3 174 178 JM Hempe JN Granger and RD Craver 1997 Capillary isoelectric focusing of hemoglobin variants Electrophoresis 18 1785 1795 T H J Huisman and J H P Jonxis 1977 The hemoglobinopathies techniques of identification Marcel Dekker New York Jellum E et al Diagnostic applications of chromatography and capillary electrophoresis J Chromatogr B 689 155 164 1997 Joutovsky A Hadzi Nesic J and Nardi MA 2004 HPLC retention time as a diagnostic tool for hemoglobin variants and hemoglobinopathies a study
17. OBIN E 2009 04 TABLEAU TABLE VARIANTS POTENTIELS PR SENTS DANS CHAQUE ZONE POTENTIAL VARIANTS LOCATED IN EACH ZONE Zone H moglobines Hemoglobins Hb Hb 8A2 Hb A2 variants de Hb A2 Hasharon de Hb A2 Winnipeg de Hb A2 Q India et de Hb A2 Q Thailand autres variants de Hb A2 Hb 6A2 Hb A2 Hasharon Hb A2 variant Winnipeg Hb A2 variant Q India Hb A2 variant Q Thailand Hb A2 variant other Hb A2 variants zi Hb C Hb Constant Spring variant de Hb A2 Setif 72 Hb C Hb Constant Spring Setif Hb A2 variant Hb A2 Hb O Arab 23 Hb A2 Hb O Arab Hb E Hb K ln variant de Hb A2 M lwate variants de Hb A2 Hb C d grad e Z4 Hb E Hb K ln M Iwate Hb A2 variant Hb A2 variants denatured Hb C Hb S Hb Hasharon Hb Handsworth Hb O Arab d grad e Z5 Hb S Hb Hasharon Hb Handsworth denatured Hb O Arab Hb D Punjab D Los Angeles Hb Stanleyville Il Hb Osu Christiansborg Hb D Ouled Rabah Hb Lepore Lepore BW Hb G Philadelphie Hb Q India Hb Q Iran Hb Korle Bu G Accra Hb K ln Hb G Taipei Hb Winnipeg Hb D Iran Hb Setif Hb P Nilotic variant de Hb A2 J Toronto variant de Hb A2 J Rovigo Hb E d grad e Hb D Punjab D Los Angeles Hb Stanleyville Il Hb Osu Christiansborg Hb D Ouled Rabah Hb Lepore Lepore BW Hb G Philadelphia Hb Q India Hb Q Iran Hb Korle Bu G Accra Hb K ln Hb G Taipei Hb Winnipeg Hb D lra
18. Sangre B lote n 1 lote n 2 MEDIA 94 3 94 5 5 7 15 5 I SD 0 06 0 08 0 06 0 08 CV 0 1 0 1 111 15 Sangre C lote n 1 lote n 2 MEDIA 96 80 5 80 4 2 3 2 3 17 2 1 17 3 50 0 14 0 12 0 00 0 05 0 14 0 08 CV 0 2 0 1 0 0 2 0 0 8 0 5 Sangre E lote n 1 lote n 2 MEDIA 96 8 96 9 2 4 2 3 0 8 0 8 SD 0 09 0 11 0 05 0 03 0 05 0 08 CV 0 1 0 1 19 1 5 6 7 10 2 Sangre F lote n 1 lote n 2 MEDIA 53 4 53 7 5 0 4 9 9 0 8 8 32 6 32 6 SD 0 17 0 24 0 05 0 07 0 05 0 07 0 17 0 20 CV 0 3 0 4 1 1 1 4 0 6 0 8 0 5 0 6 Reproducibilidad interserial Se analizaron ocho sangres en el sistema CAPILLARYS con el kit CAPILLARYS HEMOGLOBIN E Entre las muestras analizadas hay 4 muestras con un valor de Hb A2 normal y 4 muestras con hemoglobinas anormales Hb F o Hb S entre las que hay 1 sangre con la Hb A2 aumentada Estas sangres se analizaron simult neamente en todos los capilares del sistema CAPILLARYS y este an lisis se repiti 10 veces con 3 lotes de tamp n de an lisis Se calcularon las medias desviaciones t picas SD y coeficientes de variaci n CV n 10 de cada muestra de cada fracci n de hemoglobina y de cada lote La tabla siguiente presenta los l mites de los valores medios SD y CV 96 obtenidos para las 8 muestras analizadas y un coeficiente de variaci n medio calculado a partir de todos los coeficientes de variaci n n
19. a n 4778 se obtiene a partir de una mezcla de sangres humanas normales Un procedimiento de estabilizaci n permite conservar el Control Hb A2 Normal en forma liofilizada Aplicaci n El Control Hb A2 Normal est destinado al control de la migraci n antes de realizar una nueva serie de an lisis as como al control de calidad del m todo de determinaci n de la hemoglobina humana A2 mediante la t cnica electrofor tica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E Reconstituya con precisi n cada vial liofilizado de Control Hb A2 Normal con el volumen de agua destilada o desionizada indicado en las instrucciones del Control Hb A2 Normal D jelo en reposo 30 minutos y despu s ag telo suavemente evite la formaci n de espuma Control de migraci n El Control Hb A2 Normal debe ser usado de la forma siguiente Dispense el Control Hb A2 Normal reconstituido en un microtubo Corte el tap n del microtubo Ponga el microtubo colocado en un tubo de hem lisis nuevo que servir de soporte e identificado con la etiqueta de c digos de barras del Control Hb A2 Normal en la posici n 1 del cargador espec fico n O del CAPILLARYS previsto a tal efecto y coloque un segmento de diluci n verde nuevo en el cargador Dispense 4 mL de soluci n hemolisante CAPILLARYS HEMOGLOBIN E en un tubo de hem lisis sin que se formen burbujas de aire y coloque este tubo en la posici n 8 del cargador n 0 IMPORTANTE Compruebe que no haya espuma en el tubo de soluci n
20. adada en la zona de migraci n de la Hb F zona Z7 vea la tabla del p rrafo Interpretaci n en presencia de Hb A aparece una fracci n correspondiente a Hb A degradada en posici n an dica respecto a la Hb A zona Z11 vea la tabla del p rrafo Interpretaci n En presencia de Hb F en el caso de sangres de reci n nacidos aparece una fracci n en la zona de migraci n de la Hb A zona 29 vea la tabla del p rrafo Interpretaci n como consecuencia de una degradaci n de la muestra Si la muestra se ha conservado m s de 10 d as en nevera se observa la presencia de aglomerados viscosos en los gl bulos rojos es indispensable eliminarlos antes de realizar el an lisis Preparaci n de las muestras Deje sedimentar los gl bulos rojos de la sangre total durante varias horas en nevera 2 8 C o centrifugue la sangre total durante 5 minutos a 5 000 r p m Elimine con cuidado el m ximo de plasma en las muestras recogidas en heparina elimine los aglomerados viscosos presentes en la interfase plasma gl bulos rojos Agite en el v rtex durante 5 segundos IMPORTANTE No use muestras que contengan una altura m xima de plasma residual superior a 3 mm si hay m s de 3 mm de plasma el an lisis puede verse afectado Casos especiales An lisis de muestras sin Hb A Hb A2 estas muestras pueden ser cuantificadas pero no caracterizadas mediante las zonas de identificaci n Para identificar las fracciones de hemogl
21. ario debe realizar el procedimiento de extinci n al final de la sesi n de trabajo para conservar los capilares en condiciones ptimas IV LLENADO DE LOS CONTENEDORES DE REACTIVO El aparato autom tico CAPILLARYS permite una gesti n autom tica de los reactivos IMPORTANTE Es necesario seguir el procedimiento previsto para el cambio de los contenedores de reactivo si no se hace correctamente los contenedores pueden despresurizarse y los an lisis pueden verse afectados y respetar el c digo de colores contenedor conector en cada cambio de contenedor La aparici n de la ventana de gesti n de los reactivos indica que es necesario cambiar uno o varios reactivos colocar un nuevo contendor de tamp n de an lisis y o llenar el contenedor de lavado con la soluci n de lavado reconstituida y o llenar el contenedor de limpieza con agua destilada o desionizada filtrada y o vaciar el contenedor de desechos ATENCI N No use agua destilada o desionizada comercial como por ejemplo el agua para planchar riesgo de deterioro importante de los capilares Use exclusivamente agua de calidad ultrapura como el agua para inyecci n IMPORTANTE Se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el contenedor de limpieza antes de llenarlo Consulte el manual de instrucciones del CAPILLARYS CONTROL DE CALIDAD Despu s de cada cambio de lote del tamp n de an lisis o de modo de trabajo o despu s de un ciclo de limpieza
22. arse imperativamente en nevera 2 8 C lo antes posible siendo entonces estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial de tamp n IMPORTANTE El tiempo total acumulado que el tamp n puede estar a temperatura ambiente no debe exceder 1 mes Esta duraci n de conservaci n de 1 mes tiene en cuenta la duraci n de los tiempos de atemperamiento del tamp n Deseche el tamp n si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana a un precipitado o a part culas en suspensi n 2 SOLUCI N HEMOLIZANTE Preparaci n La soluci n hemolizante est lista para usar Es un tamp n con aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Uso Para la diluci n y la hem lisis de los gl bulos rojos Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro La soluci n hemolisante debe conservarse en nevera entre 2 y 8 C Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de soluci n hemolisante No conserve la soluci n hemolisante a temperatura ambiente cerca de una ventana o de una fuente de calor NO LA CONGELE Deseche la soluci n hemolisante si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana a un precipitado o a part culas en suspensi n IMPORTANTE Despu s de cada uso cierre herm ticamente el vial de soluci n hemolisante de inmediato y cons rvelo en nevera NOTA El color amarillo de la soluci n he
23. centrada SEBIA referencia n 2052 2 viales de 75 mL debe completarse hasta 750 mL con agua destilada o desionizada ATENCI N La soluci n de lavado contiene sosa c ustica Soluci n corrosiva Provoca quemaduras graves Cons rvela lejos del alcance de los ni os En caso de contacto con los ojos l velos inmediatamente con agua en abundancia y consulte a un especialista Qu tese inmediatamente cualquier prenda manchada o salpicada Use guantes adecuados y un aparato de protecci n ocular facial Uso Para lavar los capilares del CAPILLARYS Reactivo adicional necesario en caso de realizar series inferiores a 40 an lisis IMPORTANTE Antes de llenar el contenedor de soluci n de lavado se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el cuello del contenedor el conector y el tubo para evitar la acumulaci n de sales Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Las soluciones de lavado concentrada y diluida deben conservarse a temperatura ambiente o en nevera en contenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial La soluci n diluida es estable durante 3 meses Deseche la soluci n de lavado diluida si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana 6 SALINA Preparaci n Soluci n de NaCl 0 15 M 9 g L en agua destilada o desionizada Uso Para lavar los gl bulos rojos ante
24. cta entre los dos sistemas con respecto a la cuantificaci n de la hemoglobina A2 una sensibilidad del 88 9 y una especificidad del 95 8 respecto a la t cnica de referencia calculadas seg n el m todo recomendado Wendling 1986 La correlaci n entre estas dos t cnicas respecto al valor de Hb A2 se determin usando herramientas estad sticas media y coeficiente de regresi n ineal Los par metros de correlaci n entre estos 2 sistemas de an lisis y CAPILLARYS HEMOGLOBIN E se muestran en la tabla siguiente T L mites de los valores en Fracci n Coeficiente de correlaci n Punto de corte en y Pendiente CAPILLARYS HEMOGLOBIN E Hb A2 0 947 0 146 0 908 1 6 60 Determinaci n cuantitativa de la Hb F Se analizaron setenta y cuatro muestras de sangre que presentaban valores normales o elevados de Hb F en paralelo con la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E y con un sistema comercial de cuantificaci n de la hemoglobina F mediante HPLC La correlaci n entre estas dos t cnicas respecto al valor de Hb F se determin usando herramientas estad sticas media y coeficiente de regresi n Los par metros de correlaci n entre estos 2 sistemas de an lisis y CAPILLARYS HEMOGLOBIN E se muestran en la tabla siguiente ls m L mites de los valores en Fracci n Coeficiente de correlaci n Punto de corte en y Pendiente CAPILLARYS HEMOGLOBIN E Hb F 0 995 0 339 0 968 0 0 44 9
25. de los capilares con CAPICLEAN y antes de iniciar una nueva serie de an lisis es necesario realizar dos series de an lisis con el Control Hb A2 Normal SEBIA referencia n 4778 usando el cargador n 0 espec fico previsto a este efecto vea el cap tulo REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS Tambi n se recomienda incluir una sangre de control en cada serie de an lisis por ejemplo una muestra de control que contenga las hemoglobinas A F S y C como el Control Hb AFSC SEBIA referencia n 4792 o una sangre normal el Control Hb A2 Normal SEBIA referencia n 4778 o el Control Hb A2 Patol gico SEBIA referencia n 4779 RESULTADOS Valores La detecci n directa en el capilar a 415 nm permite definir las concentraciones relativas porcentajes de cada fracci n Los valores normales de cada fracci n de hemoglobina han sido establecidos a partir de una poblaci n de 113 adultos hombres y mujeres en buen estado de salud que presentan valores normales en HPLC Hemoglobina A comprendida entre 96 8 y 97 8 Hemoglobina 0 5 Hemoglobina A2 comprendida entre 2 2 y 3 2 Vea Interferencias y limitaciones Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores normales NOTA Los valores normales han sido obtenidos con los par metros de integraci n por defecto del programa alisado 0 e integraci n autom tica de las fracciones de la hemoglobina con la t cnica HEMOGLOBIN E ATENCI N Los valores norma
26. diferentes en la hemoglobina y por consiguiente movilidades diferentes en la electroforesis Las anomal as de la hemoglobina son de dos tipos anomal as cualitativas o de estructura que se denominan hemoglobinopat as anomal as cuantitativas o de regulaci n que se denominan talasemias La electroforesis de las hemoglobinas de la sangre humana es un an lisis muy til en el laboratorio de an lisis cl nicos para investigar las anomal as cualitativas y cuantitativas de la hemoglobina Paralelamente a las t cnicas de electroforesis en diferentes soportes entre los que est el gel de agarosa se ha desarrollado la t cnica de electroforesis capilar que ofrece las ventajas de una automatizaci n competa del an lisis separaciones r pidas y una excelente resoluci n Se define como una t cnica de separaci n electrocin tica realizada en un tubo de di metro interno inferior a 100 um lleno de un tamp n compuesto por electrolitos Se considera una tecnolog a intermedia entre la electroforesis de zona en soporte y la cromatograf a l quida El sistema CAPILLARYS usa el principio de la electroforesis capilar en soluci n libre que representa la forma m s corriente de electroforesis capilar Permite la separaci n de mol culas cargadas en funci n de su movilidad electrofor tica propia en un tamp n de pH dado y seg n el pH del electrolito de un flujo electroendosm tico m s o menos importante El sistema CAPILLARYS posee una serie de
27. do con el an lisis hematol gico y realizar an lisis complementarios para confirmar la presencia de Hb S Interferencias y limitaciones Vea MUESTRAS PARA EL AN LISIS No use muestras de sangre total no sedimentada No use muestras de sangre hemolizada No use muestras de sangre antiguas o mal conservadas ya que la presencia de hemoglobinas degradadas puede observarse en el perfil electrofor tico en forma de artefactos m s o menos numerosos despu s de 7 d as de conservaci n Si las muestras se han conservado m s de 10 d as se observa la presencia de aglomerados viscosos en los gl bulos rojos es indispensable eliminarlos antes de realizar el an lisis Cuando se detecta la presencia de una hemoglobina anormal se recomienda usar otras t cnicas de identificaci n por ejemplo electroforesis de las cadenas de globina o consultar a un laboratorio especializado para un tipaje preciso de la variante IMPORTANTE Es indispensable realizar el an lisis hematol gico como resultado complementario La migraci n de una variante de la hemoglobina con una movilidad muy cercana a la fracci n Hb A implica una subestimaci n de la fracci n Hb A y de la variante por lo que se produce una sobrestimaci n de la fracci n Hb A2 Para obtener una cuantificaci n correcta de la fracci n Hb A2 es necesario eliminar la integraci n de los picos de la variante y de la Hb A para integrar conjuntamente esos 2 picos a continuaci n Las muestras de a
28. e la c nula de muestras Preparaci n Prepare una soluci n de hipoclorito de sodio lej a de 9 clorom trica entre 2 y 3 de cloro a partir de una dosis concentrada de 250 mL de 36 clorom trica 9 6 de cloro diluida hasta 1 litro volumen final con agua destilada o desionizada fr a Uso Para limpiar la c nula de muestras del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA mantenimiento semanal para eliminar cualquier prote na que se haya adsorbido a la c nula Consulte las instrucciones de uso del CAPILLARYS SEBIA Use el cargador de muestras espec fico para el mantenimiento n 100 Coloque en este cargador en la posici n 1 un tubo de hem lisis que contenga 2 mL de soluci n de hipoclorito de sodio preparada anteriormente Introduzca el cargador n 100 de mantenimiento en el sistema CAPILLARYS Enel men de la ventana MANTENIMIENTO que aparece en pantalla seleccione Iniciar la limpieza de la c nula soluci n de hipoclorito de sodio o soluci n de lavado CDT y luego confirme la selecci n Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro La soluci n de hipoclorito de sodio de 9 puede conservarse 3 meses a temperatura ambiente en un recipiente de pl stico cerrado herm ticamente protegido de la luz solar y de cualquier fuente de calor o ignici n y alejado de los cidos y el amoniaco 5 SOLUCI N DE LAVADO CAPILLARYS Preparaci n El vial de la soluci n de lavado con
29. e recomienda lavarlo con agua destilada o desionizada 3 CAPICLEAN Presentaci n El vial de la soluci n enzim tica concentrada CAPICLEAN SEBIA referencia n 2058 1 vial de 25 mL contiene enzimas proteol ticos surfactantes y aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo ATENCI N La soluci n CAPICLEAN puede causar irritaci n o quemaduras cut neas oculares o de las mucosas Uso Para la limpieza semanal de los capilares y la c nula de muestras del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA Cuando use para ello segmentos de diluci n de 100 pL espec ficos de la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E dispense 50 pL de soluci n concentrada CAPICLEAN 50 pL de agua destilada o desionizada a temperatura ambiente en cada c pula del segmento de diluci n evitando la formaci n de espuma y luego siga el procedimiento habitual Consulte las instrucciones de uso del CAPICLEAN SEBIA IMPORTANTE No reutilice el segmento de diluci n usado para la limpieza de los capilares y la c nula Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro El CAPICLEAN debe conservarse en nevera entre 2 y 8 C Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial NO LO CONGELE Debe estar exento de precipitados Deseche el CAPICLEAN si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana 4 SOLUCI N DE HIPOCLORITO DE SODIO para la limpieza d
30. files obtenidos anteriormente en el mismo capilar y ning n pico es identificado excepto cuando se detecta Hb C en este caso los picos de Hb A2 y de Hb C son identificados 60 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 en caso de presencia de Hb F en un perfil sin detecci n de Hb A el s mbolo amarillo de alerta no aparece y el centrado del perfil se realiza entonces respecto a la posici n del pico de Hb F y los picos de Hb F y o Hb A y o Hb A2 son identificados en caso de imposibilidad de centrado del perfil aparece un s mbolo rojo de alerta y los picos de Hb F y de Hb A2 no son identificados en este caso contacte con el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA En estos tres casos las diferentes zonas de variantes Z1 a Z15 no aparecen ni el la ventana de edici n ni en el informe de resultados En el perfil electrofor tico las curvas de las hemoglobinas A2 y C calculadas por triangulaci n son redibujadas o ajustadas y superpuestas a la curva nativa Esta representaci n permite la cuantificaci n de la fracci n Hb A2 en presencia de Hb C ATENCI N En algunos casos de hemoglobina C homozigosis o debido a un problema t cnico las fracciones de Hb A2 y Hb C no son ajustadas lo que implica una infravaloraci n de estas fracciones Se recomienda entonces cuantificar la fracci n Hb A2 usando otra t cnica LEA DETENIDAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL CAPILLARYS III FIN DE LA SECUENCIA DE AN LISIS El usu
31. ga el Control Hb A2 Normal hemolisado puede congelarse a 20 C No congele y descongele el segmenfo que contenga el control hemolisado m s de 2 veces IMPORTANTE No deje a temperatura ambiente el segmento de diluci n que contenga el control hemolisado NOTA Durante el transporte el Control Hb A2 Normal liofilizado puede permanecer a tamperatura ambiente entre 15 y 30 C durante 15 d as sin que la calidad del test se vea afectada Como ninguna prueba de an lisis puede probar la ausencia de los virus VIH virus de la hepatitis B virus de la hepatitis C o de cualquier otro agente infeccioso el Control Hb A2 Normal debe ser manipulado con las precauciones habituales para evitar contaminarse Esta sangre control analizada usando t cnicas aceptadas por una autoridad competente FDA AFSSaPS es negativa para la presencia del ant geno de superficie de la hepatitis B para la presencia de anticuerpos anti VHC para la presencia de anticuerpos anti VIH 1 y anti VIH 2 257 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 2 AGUA DESTILADA O DESIONIZADA Uso Para lavar los capilares del aparato autom tico para electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA Se recomienda usar agua destilada o desionizada filtrada con un filtro de porosidad 0 45 um Renueve el agua cada d a para evitar contaminaciones microbianas En caso de conservaci n prolongada a ada 35 uL L de ProClin 300 IMPORTANTE Antes de llenar el contenedor de agua s
32. i Sang avec variant delta Hb A 2 Sang avec variant Hb D Punjab Blood sample with delta Hb A 2 variant Blood sample with Hb D Punjab variant Figure 12 Figure 11 Hb C Hb E Hb S Hb A2 HbF dk Sang avec variant homozygote Hb E et fraction Hb F lev e Sang avec variants h t rozygotes Hb S et Hb C Blood sample with Hb S amp Hb C heterozygote variants Blood sample with homozygote Hb E variant and elevated Hb F 228 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 SCHEMAS FIGURES PROFILS ELECTROPHORETIQUES ELECTROPHORETIC PATTERNS Figure 14 Figure 13 215 HbS Sang avec Hb A d grad e Hb A3 et Hb F faible Sang avec variant homozygote Hb S et Hb F Blood sample with degradated Hb A Hb and faint Hb F Blood sample with Hb S homozygote variant and Hb F Figure 15 215 Sang avec variant Hb Lepore Bood sample with Hb Lepore variant 229
33. l en la gama de concentraciones estudiadas para la Hb F hasta un m ximo del orden de 20 7 g dL entre 0 y 88 de Hb F 64 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 Linealidad estudio n 3 con Hb A2 El an lisis de una mezcla en proporciones variables de dos muestras diferentes de sangre una con 14 3 g dL de hemoglobina y un 0 1 de Hb A2 y la otra con 13 7 g dL de hemoglobina y un 9 5 de Hb A2 ha mostrado que el porcentaje de cada fracci n de la hemoglobina estudiada Hb A y Hb A2 est perfectamente correlacionado con la proporci n de cada una de las fracciones de esa mezcla y que cualquier variaci n es detectada de forma lineal con la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E La t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E es perfectamente lineal en la gama de concentraciones de Hb A2 estudiadas hasta un m ximo del orden de 1 3 g dL entre 0 1 y 9 5 de Hb A2 Exactitud NOTA Las muestras usadas en los tres estudios de exactitud que aparecen a continuaci n han sido suministradas por un centro hospitalario acompa adas de su diagn stico cl nico establecido usando HPLC y o electroforesis en gel alcalino y en gel cido Determinaci n cuantitativa de Hb A2 Se analizaron sesenta y seis muestras de sangre que presentaban valores normales o elevados de Hb A2 en paralelo con la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E y con un sistema comercial de cuantificaci n de la hemoglobina A2 mediante HPLC Los resultados obtenidos mostraron una correlaci n perfe
34. les valores de referencia s lo deben ser tenidos en cuenta en ausencia de variantes de la hemoglobina Interpretaci n Vea PERFILES ELECTROFOR TICOS figuras 1 15 Las diferentes zonas de migraci n de las variantes identificadas como Z1 a Z15 aparecen en la ventana de edici n de las curvas y en el informe de resultados Al pasar el cursor del rat n sobre el nombre de una zona aparece una burbuja informativa que indica las variantes posibles de la hemoglobina que migran en esa zona Para cada fracci n la posici n del m ximo define la zona de migraci n Vea la tabla que muestra las variantes potenciales presentes en cada zona ATENCI N La graduaci n del eje de abscisas no puede en ning n caso usarse para la identificaci n de una variante de la hemoglobina 61 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 1 Anomal as cualitativas Hemoglobinopat as La mayor a son anomal as estructurales debidas a una sustituci n por mutaci n de un amino cido por otro en una de las cadenas Las consecuencias de la mutaci n var an en funci n de la posici n del amino cido mutado y del que le remplaza siendo particularmente necesaria la integridad de algunas partes de la mol cula para que sea viable y funcione correctamente Se han definido y descrito m s de 900 variantes de la hemoglobina adulta Las primeras hemoglobinas anormales estudiadas y las m s numerosas son debidas a una modificaci n de la carga el ctrica global de la mol c
35. lgunos pacientes que presentan una hemoglobina S homozigota y son tratados con Hydrea hidroxicarbamida pueden presentar una hemoglobina F cuya s ntesis ha sido inducida por el tratamiento En la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E no se han observado diferencias netas de movilidad entre esta hemoglobina F inducida y la hemoglobina F nativa Teniendo en cuenta los principios anal ticos de las t cnicas actuales principios de la electroforesis de zona resoluci n no hay garant as en cuanto a la detecci n total de todas las variantes de la hemoglobina Resoluci n de problemas Contacte con el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA en caso de que el an lisis sea defectuoso Las fichas de datos de seguridad de los diferentes reactivos del kit as como las informaciones relativas a la eliminaci n de los desechos est n disponibles en el Servicio de Asistencia T cnica de SEBIA CARACTER STICAS T CNICAS Los resultados siguientes obtenidos con el kit CAPILLARYS HEMOGLOBIN E en el sistema CAPILLARYS mediante an lisis cuantitativo indican una muy buena repetibilidad y reproducibilidad del kit CAPILLARYS HEMOGLOBIN E en todos los aspectos probados con un coeficiente de variaci n medio del orden del 1 7 en los porcentajes de cada fracci n de hemoglobina estudiada Adem s los perfiles electrofor ticos han sido interpretados cualitativamente a simple vista Los porcentajes de las diferentes fracciones han sido obtenidos con los par
36. lores est n aumentados Muestras con hemoglobinas anormales se detectan todas las hemoglobinas anormales Linealidad El an lisis de una mezcla de dos muestras diferentes en proporciones variables ha mostrado que el porcentaje de cada fracci n de hemoglobina estudiada correlaciona perfectamente con la proporci n de cada una de las fracciones en la mezcla y que toda variaci n es detectada de forma lineal en la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E Adem s el an lisis de dos sangres caracter sticas diferentes provenientes de pacientes con anemia diluidas en serie con salina ha mostrado que la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E es perfectamente lineal en la gama de concentraciones estudiadas entre 2 1 y 12 6 g dL y que los porcentajes de las fracciones de hemoglobina son independientes de la concentraci n de hemoglobina Linealidad estudio n 2 con Hb F El an lisis de una mezcla en proporciones variables de dos muestras diferentes de sangres de cord n umbilical una con 15 9 g dL de hemoglobina y un 88 2 de Hb F y la otra con 25 4 g dL y un 81 6 de Hb F con una sangre de control normal ha mostrado que el porcentaje de cada fracci n de la hemoglobina estudiada Hb A Hb A2 y Hb F est perfectamente correlacionado con la proporci n de cada una de las fracciones en esa mezcla y que todas las variaciones son detectadas de manera lineal en la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E La t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E es perfectamente linea
37. molisante es normal 3 SOLUCI N DE LAVADO Preparaci n El vial de soluci n de lavado concentrada debe completarse hasta 750 mL con agua destilada o desionizada ATENCI N La soluci n de lavado contiene sosa c ustica Soluci n corrosiva Provoca quemaduras graves Cons rvela lejos del alcance de los ni os En caso de contacto con los ojos l velos inmediatamente con agua en abundancia y consulte a un especialista Qu tese inmediatamente cualquier prenda manchada o salpicada Use guantes adecuados y un sistema de protecci n ocular facial Uso Para lavar los capilares despu s de la separaci n electrofor tica de las hemoglobinas IMPORTANTE Antes de llenar el contenedor de soluci n de lavado se recomienda lavar con agua destilada o desionizada en abundancia el cuello del contenedor el conector y el tubo para evitar la acumulaci n de sales Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Las soluciones de lavado concentrada y diluida deben conservarse a temperatura ambiente o en nevera en contenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de soluci n de lavado La soluci n diluida es estable durante 3 meses Deseche la soluci n de lavado diluida si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana 4 SEGMENTOS DE DILUCI N Uso Segmentos de diluci n coloreados de un solo uso espec ficos
38. n Hb Setif Hb P Nilotic J Toronto Hb A2 variant J Rovigo Hb A2 variant denatured Hb E Z6 b F Hb Q Thailand G Taichung Hb Richmond Hb G San Jos Hb Geldrop Santa Anna Hb Porto Alegre Hb Presbyterian b S d grad e Hb F Hb Q Thailand G Taichung Hb Richmond Hb G San Jose Hb Geldrop Santa Anna Hb Porto Alegre Hb Presbyterian denatured Hb S H H Z7 b F ac tyl e Hb Atlanta Hb Athens GA Waco Z8 H Acetylated Hb F Hb Atlanta Hb Athens GA Waco Hb A Hb Phnom Penh Hb Toulon Hb Okayama Hb Fontainebleau Hb Raleigh Hb Hekinan Hb Mosella Hb Dallas Hb Aztec Hb Little Rock Hb Frankfurt Hb Camperdown Hb A Hb Phnom Penh Hb Toulon Hb Okayama Hb Fontainebleau Hb Raleigh Hb Hekinan Hb Mosella Hb Dallas Hb Aztec Hb Little Rock Hb Frankfurt Hb Camperdown 79 Hb Hope Hb M lwate 210 Hb Hope Hb M Iwate b A d grad e Hb Kaohsiung New York Hb Himeji 211 H Denatured Hb A Hb Kaohsiung New York Hb Himeji Hb Bart Hb J Providence Hb J Broussais Hb J Toronto Hb Ube 2 Hb J Meinung J Bangkok Hb J Mexico Hb J Baltimore Z12 Hb Bart s Hb J Providence Hb J Broussais Hb J Toronto Hb Ube 2 Hb J Meinung J Bangkok Hb J Mexico Hb J Baltimore Hb J Rovigo Hb N Baltimore 213 Hb J Rovigo N Baltimore Hb H 715 HbH 225 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 SCHEMAS FIGURES PRO
39. na F y la hemoglobina dA 2 variante de la A2 incluso dentro de las zonas de migraci n habituales de las hemoglobinas Si est presente una variante de la hemoglobina A2 3A 2 o cualquier otra variante de la A2 se recomienda sumar el porcentaje de esta variante al de la hemoglobina A2 para un mejor diagn stico de las beta talasemias Algunas variantes de la hemoglobina Hb Camperdown y Hb Okayama por ejemplo migran muy cerca de la Hb A y pueden ser confundidas con esta ltima Algunas variantes de la hemoglobina Hb Porto Alegre y Hb S degradada migran muy cerca de la Hb F y pueden ser confundidas con esta ltima Las fracciones d biles que migran en la zona Z12 son a veces mal integradas Hb Bart demasiado asim tricas por ejemplo Es necesario entonces suprimir la integraci n autom tica e integrarlas manualmente 62 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 Al analizar sangres de reci n nacidos las muestras que contengan Hb F en concentraciones elevadas pueden presentar una fracci n Hb A perturbada especialmente a causa de la migraci n de la Hb F degradada en esta zona El porcentaje de Hb A indicado por el programa puede estar entonces sobreestimado Adem s en caso de presencia de variantes de la hemoglobina 4 96 S C E D Punjab por ejemplo en una sangre que contenga una concentraci n elevada de Hb F gt 60 96 es necesario realizar an lisis complementarios para confirmar la presencia Hb A En los reci n nacidos
40. obina E Un cido glut mico de la cadena B est sustituido por una lisina En la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E la hemoglobina E migra justo despu s de la hemoglobina A2 de la que est totalmente separada En presencia de la hemoglobina E la fracci n A2 puede por tanto ser cuantificada para detectar una b talasemia Hemoglobina O Arab Un cido glut mico de la cadena B est sustituido por una lisina En la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E la hemoglobina O Arab migra con la fracci n A2 En este caso la cuantificaci n de la hemoglobina A2 es imposible Cuando esta fracci n es superior a un 9 puede sospecharse la presencia de la hemoglobina O Arab Esta ltima no puede ser confundida con las hemoglobinas C y E ya que stas est n separadas de la fracci n A2 Hemoglobina D Un cido glut mico de la cadena B est sustituido por una glutamina En la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E la hemoglobina D denominada D Punjab D Los Angeles D Chicago D Portugal migra en posici n an dica respecto a la hemoglobina S lo que permite distinguirla de sta 2 Anomal as cuantitativas Talasemias Constituyen un grupo bastante heterog neo de afecciones gen ticas caracterizadas por la reducci n de la tasa de s ntesis de una o varias cadenas de la hemoglobina El mecanismo de esta reducci n a escala molecular todav a no es bien conocido Existen diferentes s ndromes talas micos Alfa talasemias Se caracterizan por la di
41. obina presentes en una muestra sin hemoglobina A o hemoglobina A2 se recomienda preparar la muestra Siguiendo uno de los dos m todos siguientes Diluci n autom tica En microtubo mezcle un volumen 80 pL de gl bulos rojos de la muestra a analizar un volumen de Control Hb A2 Normal 80 uL Agite en el v rtex durante 5 segundos Corte el tap n del microtubo Ponga el microtubo en un tubo de hem lisis nuevo que servir de soporte y despu s col quelo en un cargador de muestras del CAPILLARYS Realice el an lisis de la muestra siguiendo el procedimiento habitual Diluci n manual Mezcle directamente en los pocillos de un segmento de diluci n verde nuevo 9 uL de Control Hb A2 Normal reconstituido con 9 uL de la muestra a analizar y 90 pL de soluci n hemolizante CAPILLARYS HEMOGLOBIN E Agite la mezcla mediante pipeteos sucesivos Ponga este segmento en el cargador n 0 del CAPILLARYS Introduzca el cargador en el sistema CAPILLARYS y luego seleccione en la ventana que aparece en pantalla la opci n Sample en diluci n manual y valide Los resultados obtenidos son entonces tenidos en cuenta autom ticamente por el programa para el tratamiento de los datos IMPORTANTE En una muestra sin Hb A Hb A2 preparada seg n estos dos m todos la cuantificaci n de las fracciones indicada en el perfil electrofor tico no tiene ning n significado y los valores obtenidos no deben ser tenidos en cuenta este p
42. otal durante 5 minutos a 5 000 r p m elimine el plasma lave 2 veces los gl bulos rojos con 10 vol menes de salina centrifugue despu s de cada lavado y elimine el exceso de salina de la superficie del co gulo globular lavado agite en el v rtex antes de congelarlo Las sangres congeladas a 80 C son estables un m ximo de 3 meses IMPORTANTE Para una conservaci n ptima de las muestras no las conserve a 20 C sino a 80 C vea la BIBLIOGRAF A J Bardakdjian Michau et al 2003 NOTA No conserve las sangres a temperatura ambiente Las hemoglobinas Hb de las muestras conservadas entre 2 y 8 C se degradan progresivamente En una muestra conservada m s de 7 d as en nevera como consecuencia de la degradaci n de la muestra aparece una fracci n d bil correspondiente a metahemoglobina en la zona de migraci n de la Hb S en presencia de Hb C aparece una fracci n correspondiente a la Hb C degradada en posici n an dica respecto a la Hb A2 pero sin ninguna interferencia con sta zona Z4 vea la tabla del p rrafo Interpretaci n en presencia de Hb O Arab aparece una fracci n correspondiente a Hb O Arab degradada en la zona de migraci n de la Hb S zona Z5 vea la tabla p rrafo Interpretaci n en presencia de Hb E aparece una fracci n correspondiente a Hb E degradada en la zona Z6 vea la tabla del p rrafo Interpretaci n en presencia de Hb S aparece una fracci n correspondiente a Hb S degr
43. respondientes a los tubos analizados se obtienen al cabo de unos 20 minutos Para el cargador de muestras siguiente las fases 1 y 2 lectura de los c digos de barras y hem lisis de las sangres se realizan durante la etapa 5 migraci n del cargador anterior use Il ANALISIS DE LOS RESULTADOS Al final del an lisis se realiza autom ticamente la cuantificaci n relativa de las fracciones y los perfiles pueden ser interpretados Los picos de hemoglobina A Hb A F Hb F y A2 Hb A2 son identificados de forma autom tica y el pico de Hb A es situado en el centro de la ventana de edici n de las curvas Los perfiles electrofor ticos obtenidos deben ser analizados visualmente para detectar las anomal as Las posiciones potenciales de las diferentes variantes de la hemoglobina identificadas por las zonas Z1 a Z15 se muestran en la ventana de edici n y aparecen en el informe de resultados La tabla del p rrafo Interpretaci n presenta las variantes conocidas que pueden estar presentes en cada zona Cuando el programa identifica una fracci n de hemoglobina en una zona determinada el nombre de esa zona es enmarcado Los perfiles son centrados autom ticamente respecto al pico de Hb A para facilitar su interpretaci n en caso de ausencia de detecci n de los picos de Hb A y o Hb A2 en un perfil aparece un s mbolo de alerta amarillo y el centrado del perfil se realiza entonces usando la posici n del pico de Hb A de los dos ltimos per
44. riantes corren el riesgo de ser imposibles o err neas vea el p rrafo AN LISIS DE LOS RESULTADOS IMPORTANTE Para un uso ptimo del Control Hb A2 Normal es indispensable usar las etiquetas con c digos de barras destinadas a identificar el tubo de hem lisis que servir de soporte al microtubo que contiene el Control Hb A2 corte el tap n del microtubo antes de usarlo NOTAS Al usar por primera vez el programa de an lisis HEMOGLOBIN E en el autom tico para electroforesis CAPILLARYS se recomienda realizar 3 series de an lisis sucesivas con el Control Hb A2 Normal Despu s de instalar el instrumento autom tico CAPILLARYS al realizar la primera serie de an lisis de sangres aparecer un s mbolo de alerta rojo en caso de ausencia de hemoglobina A en una de las muestras que indica que no es posible centrar el perfil vea el p rrafo An lisis de los resultados Se aconseja entonces analizar una muestra que contenga hemoglobina A en el capilar afectado y volver a analizar la muestra sin hemoglobina A coloc ndola en un capilar que ya haya detectado la presencia de hemoglobina A Control de calidad El Control Hb A2 Normal debe ser usado como una sangre humana normal Despu s de la reconstituci n use directamente el Control Hb A2 Normal como una muestra de sangre a analizar o como control de la migraci n con el cargador n 0 vea el p rrafo anterior Ser tratado autom ticamente con la soluci n hemolisante Se recomienda
45. rocedimiento s lo permite la identificaci n de la o las variantes presentes en la muestra mediante las zonas de identificaci n gracias a que migrar n en la zona correcta La cuantificaci n de las fracciones se obtiene en este caso analizando la muestra inicial no mezclada antes de diluirla con la sangre control 59 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 Muestras a descartar No use muestras de sangre total no sedimentadas No use muestras de sangre antiguas o mal conservadas ya que la hem lisis autom tica de las muestras puede ser perturbada por la presencia de aglomerados viscosos entre los gl bulos rojos el perfil electrofor tico puede tambi n ser afectado por los productos de degradaci n de las hemoglobinas o por artefactos PROCEDIMIENTO El sistema CAPILLARYS es un instrumento multiparam trico autom tico que permite realizar el an lisis de las hemoglobinas en 7 capilares en paralelo seg n las etapas siguientes lectura de los c digos de barras de los tubos primarios hasta 7 y del cargador hem lisis y diluci n de las muestras a partir de tubos primarios sin plasma lavado de los capilares inyecci n de las muestras hemolizadas separaci n y detecci n directa de las hemoglobinas en los capilares Las etapas manuales son las siguientes colocaci n de los tubos primarios destapados en los cargadores en las posiciones 1 a 7 colocaci n del tubo de soluci n hemolizante en la posici
46. s de conservarlos a 80 C si es necesario Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro La soluci n salina puede conservarse a temperatura ambiente o en nevera Deseche la soluci n al cabo de 3 meses o si cambia de aspecto o aparece turbidez debido a contaminaci n microbiana Para una conservaci n prolongada a ada 1 g L de azida s dica 58 CAPILLARYS HEMOGLOBIN E 2009 04 EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS 1 Sistema de electroforesis capilar CAPILLARYS SEBIA referencias n 1220 o n 1222 2 Cargadores de muestras suministrados con el sistema CAPILLARYS 3 Contenedores de pl stico suministrados con el sistema CAPILLARYS contenedor para la limpieza de los capilares debe llenarse con agua destilada o desionizada contenedor de soluci n de lavado y contenedor de desechos MUESTRAS PARA EL AN LISIS Extracci n y conservaci n de las muestras El an lisis se realiza con sangres frescas recogidas en anticoagulante EDTA citrato o heparina No use anticoagulantes que contengan yodoacetato Las sangres deben ser obtenidas seg n los m todos establecidos de uso en el laboratorio cl nico Las sangres pueden conservarse un m ximo de siete d as en nevera entre 2 y 8 C Para conservaciones prolongadas congele r pidamente las muestras a 80 C como m ximo durante las 8 horas siguientes a su obtenci n despu s de haber lavado los gl bulos rojos seg n el procedimiento siguiente centrifugue la sangre t
47. sminuci n de la s ntesis de las cadenas a afectando por consiguiente a la s ntesis de las hemoglobinas fisiol gicas El exceso de s ntesis de las cadenas B y y respecto a las cadenas a provoca la formaci n de tetr meros sin cadenas a Hemoglobina Bart y 4 Hemoglobina H B 4 La hemoglobina H posee un punto isoel ctrico relativamente bajo En la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E migra en una posici n mucho m s an dica que la hemoglobina A y puede estar presente en forma de una o varias fracciones Beta talasemias Se caracterizan por la disminuci n de la s ntesis de las cadenas B S lo se ve afectada la s ntesis de la hemoglobina A Les porcentajes de las hemoglobinas F y A2 est n por tanto aumentados respecto a la hemoglobina A En la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E los valores de las diferentes hemoglobinas normales obtenidos permiten detectar los casos de beta talasemias 3 Notas En caso de ausencia de la hemoglobina A se puede observar una fracci n d bil en la zona de migraci n de esta ltima Se trata de una hemoglobina F acetilada que representa de un 15 a un 25 de la hemoglobina F El sistema CAPILLARYS est programado autom ticamente para evitar confundir esta fracci n acetilada con la hemoglobina A Puede sospecharse la presencia de una variante de la hemoglobina A2 si una fracci n que presenta un porcentaje d bil de 0 5 a 3 es observada en una zona de migraci n comprendida entre la hemoglobi
48. ula lo que permite detectarlas f cilmente por electroforesis Cinco hemoglobinas anormales principales presentan un inter s particular desde un punto de vista antropol gico y m dico S C E O Arab y D El kit CAPILLARYS HEMOGLOBIN E est destinado a la detecci n de las hemoglobinopat as y las talasemias Hemoglobina S Es la variante m s frecuente y es debida a una sustituci n por mutaci n de un cido glut mico de la cadena amino cido cido por una valina amino cido neutro presenta pues un punto isoel ctrico aumentado respecto a la hemoglobina A Su carga negativa global est por tanto disminuida en el pH de an lisis esta hemoglobina migra m s r pidamente que la hemoglobina A En la t cnica CAPILLARYS HEMOGLOBIN E en tamp n alcalino la hemoglobina S migra entre las fracciones A y A2 a m s o menos 1 8 de la distancia A A2 de lado de la A2 Hemoglobina C La mutaci n es debida a un cido glut mico de la cadena B sustituido por una lisina amino cido alcalino presenta pues un punto isoel ctrico aumentado respecto a la hemoglobina A Su carga negativa global est por tanto disminuida en el pH del an lisis esta hemoglobina migra m s r pidamente que las hemoglobinas A y A2 de las que est parcialmente separada lo que mejora netamente el diagn stico m dico Adem s las hemoglobinas C E y O Arab no se superponen en el perfil electrofor tico y pueden por tanto ser distinguidas f cilmente Hemogl
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