(LISTOS)ESManual de instrucciones GRHI
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1. FluA UNKN POS 27 33 NEG 4 C F GRIP luB UNKN POS 26 90 POS Gr fica 2 Canal TxR FluB Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo FluA y un control positivo FluB Control negativo A1 en azul ausencia de se al Control negativo A2 en gris ausencia de se al Control positivo FluA A3 en naranja ausencia de se al Control positivo FluB A4 en verde se observa se al con Ct 27 64 C FluA C FluB Q 8 E E E a E 8 E Site Protocol Sample ID Sample Status FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR Std Res TXR Ct Alx647 Alx647 Ct ID Std Res Std Res Std Res GRIP UNKN NEG 0 00 POS 26 74 NEG 0 00 NEG 0 00 2 GRIP UNKN NEG 0 00 POS 27 16 NEG 0 00 NEG 0 00 A3 GRIP UNKN POS 29 28 POS 27 33 NEG 0 00 NEG 0 00 Ad GRIP UNKN NEG 0 00 POS 26 90 POS 27 64 NEG 0 00 Gr fica 3 Canal Alx532 control interno Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo FluA y un control positivo FluB Control negativo A1 en azul se observa se al con Ct 26 74 Control negativo A2 en gris se observa se al con Ct 27 16 Control positivo FIuA A3 en naranja se observa se al con Ct 27 33 Control positivo FluB A4 en verde se observa se al con Ct 26 90 HINI Protocol Sample ID 1 C H1N1 C Fluorescence Site Protocol SamplelD Sample Notes Status FAM FAMCt Ax532 Ax532Ct TXR TXR Ct o e StiRes StdRes2. StdRes UNKN OK NEG 0 00 POS 26 27 NEG 0 00 OK POS 29 50 POS 26 26 NEG 0 00 Gr fica 1 Canal FAM FluA H1N1 Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo FluA H1N1 Control negativo A13 en azul ausencia de se al Control positivo FluA H1N1 A14 en gris se observa se al con Ct 29 50 Fluorescence Sample Status FAM FAMCt Alx532 Alx532 Ct TXR TXR Ct Type StdiRes Std Res StdiRes UNKN NEG 0 00 POS 26 27 NEG 0 00 POS 29 50 POS 26 26 NEG 0 00 Gr fica 2 Canal Alx532 control interno Resultado obtenido al amplificar un control negativo y un control positivo FluA H1N1 Control negativo A13 en azul se observa se al con Ct 26 27 Control positivo FluA H1N1 A14 en gris se observa se al con Ct 26 26 10 Control de calidad Se recomienda que se lleven a cabo controles positivos y negativos cada vez que se realice un an lisis Para validar los resultados los valores de Ct obtenidos en los controles positivos y en los controles internos deben encontrarse dentro de los rangos especificados en la etiqueta interna del kit Cada lote del kit RealCycler GRHI ha sido testado seg n las especificaciones de la PCR a tiempo real utilizando el equipo SmartCycler Cepheid Fecha de publicaci n Marzo 2012
3. ptica Colocar los tubos en el equipo Create Run gt Dye Set gt FATA25 Add Remove Sites asignar el protocolo HINI a las posiciones correspondientes a las muestras y los controles Start Run iniciar el programa de amplificaci n d Interpretaci n de los resultados FAM Alx532 Alx532 Std Res Std Res Ct Interpretaci n POS Indiferente Indiferente POSITIVO FluA HiN1 Ct dentro de ND POS NO SE DETECTA rango ND POS Ct fuera de NO VALORABLE rango ND ND 0 00 NO VALORABLE e Ejemplo de resultado GRIP Fluorescence Site Protocol SamplelD Sample FAM FAM Ct Alx532 Alx532 Ct TXR Std Res TXR Ct Alx647 Alx647 Ct ID Type Std Res Res Std Res GRIP UNKN NEG 0 00 POS 26 74 NEG 0 00 2 GRIP NEG 0 00 POS 27 16 NEG 0 00 A3 GRIP Flu POS 29 28 POS 27 33 NEG 0 00 4 GRIP Flu NEG 0 00 POS 26 90 POS 27 64 Gr fica 1 Canal FAM FluA Resultado obtenido al amplificar dos controles negativos un control positivo FluA y un control positivo FluB Control negativo A1 en azul ausencia de se al Control negativo A2 en gris ausencia de se al Control positivo FluA A3 en naranja se observa se al con Ct 29 28 Control positivo FluB A4 en verde ausencia de se al Fluorescence ET SUENO Site Protocol SamplelD Sample Alx532 Alx532 Ct ID Type S Std Res GRIP C UNKN POS 26 74 NEG 2 GRIP C UNKN POS 27 16 NEG A3 GRIP C
4. EXEIAGENIE CE MOLECULAR Progenie molecular Artes y Oficios 37 Valencia 46021 Espa a Tel 902 91 05 05 Fax 902 91 05 06 www progenie molecular com RealCycler GRHI v 3 1 Uso previsto RealCycler GRHI es un kit de reactivos que permite la detecci n cualitativa por PCR a tiempo real del ARN de Influenza A B y del gen H1 de la nueva variante de gripe H1N1 en muestras cl nicas utilizando un equipo SmartCycler Cepheid El sistema incluye un control interno de amplificaci n para prevenir los falsos negativos debidos a la inhibici n de la reacci n 2 Especificaciones Sensibilidad 100 copias uL Influenza A 100 copias uL Influenza B y 500 copias uL Influenza A H1N1 Especificidad Influenza A gen M1 y M2 matrix protein Influenza B gen M1 y M2 matrix protein e Influenza A H1N1 gen hemaglutinina 3 Estabilidad y almacenamiento Todos los componentes del kit RealCycler GRHI deben ser almacenados a 20 C El kit es estable a 20 C hasta la fecha de caducidad ver etiqueta externa del kit 4 Descripci n del m todo La reacci n en cadena de la polimerasa PCR est basada en la amplificaci n de una regi n espec fica del genoma del pat geno usando primers y sondas espec ficos En la PCR a tiempo real se utilizan sondas marcadas con fluorocromos Hay una emisi n de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de ADN ARN presente en la muestra El Cycle threshold Ct es el ciclo de la
5. PCR en el que se detecta inicialmente un aumento en la se al de fluorescencia En la amplificaci n GRIP Influenza A se detecta en FAM Influenza B se detecta en TxR y el control interno en Alx532 En la amplificaci n de H1N1 H1N1 se detecta en FAM y el control interno en Alx532 5 Composici n RealCycler GRHI incluye las mezclas de reacci n Amplimix GRIP y Amplimix HINI dispensadas en tubos de amplificaci n una retrotranscriptasa un Control Positivo ARN FluA y un Control Positivo ARN FluA H1N1 Todos los reactivos est n listos para su uso sin a adir ni reconstituir ning n componente Componente Viales N mero Volumen Conservaci n AmpliMix Rip 12 22 8 uL 15 22596 AmpliMix 15 25 0 HINI 12 22 02 uL 15 425 9C Control Positivo ARN FluA 1 60 uL 15 259C Control Positivo 15 7 250 ARN FluA 1 60 uL 15 250C HiN1 Componente Viales N mero Volumen Conservaci n Retrotrans criptasa 8 5 uL 15 25 C 6 Material y equipamiento adicional requerido y no suministrado Equipo de PCR a tiempo real SmartCycler Cepheia Microcentr fuga para tubos SmartCycler Gradillas para tubos SmartCycler Kit de extracci n de ADN ARN Guantes desechables Pipetas calibradas Puntas de pipeta con filtro Congelador 20 C 7 Advertencias y precauciones Todos los componentes del kit deben mantenerse en fr o mientras se est n manipula
6. forman burbujas en la zona ptica Colocar los tubos en el equipo Create Run gt Dye Set gt FATA25 Add Remove Sites asignar el protocolo GRIP a las posiciones correspondientes a las muestras y los controles Start Run iniciar el programa de amplificaci n d Interpretaci n de los resultados FAM TXR Alx532 Alx532 intemretaci n Std Res Std Res Std Res Ct p POS ND Indiferente Indiferente POSITIVO Influenza A ND POS Indiferente Indiferente POSITIVO Influenza B POS POS Indiferente Indiferente POSITIVO Influenza A y B Ct dentro de ND ND POS NO SE DETECTA rango ND ND POS Ct fuera de yo VALORABLE rango ND ND ND 0 00 NO VALORABLE Procedimiento HINI tubo rojo b Protocolo Stage 1 Stage 2 Stage 3 Hold y Hold v Repeat 45 times Temp Secs Optics Temp Secs Optics 3 Temperature Cycle 50 0 1200 off 95 0 900 of Deg Sec Temp Sects Optics NA 95 0 115 off NA 55 0 130 On NA 72 0 130 off _ Advance to Next Stage c Preparaci n de la reacci n Descongelar los tubos AmpliMix HINI necesarios para amplificar las muestras y el Control Positivo ARN FluA H1N1 A adir 0 3 uL de Retrotranscriptasa tap n azul A adir 10 uL del ARN de cada muestra o control a cada tubo Centrifugar los tubos para que la reacci n pase a la zona ptica del tubo Verificar que no se forman burbujas en la zona
7. ndo Despu s de a adir el ADN ARN minimizar el tiempo necesario para iniciar el programa de amplificaci n Los tubos con la mezcla de amplificaci n no deben exponerse a la luz durante un periodo de tiempo prolongado Descongelar y congelar repetidas veces los reactivos puede disminuir la sensibilidad del kit Usar guantes desechables Usar pipetas calibradas y puntas de pipeta con filtro Los ensayos deben llevarse a cabo por personal cualificado y siguiendo las buenas pr cticas de laboratorio No usar el kit despu s de la fecha de caducidad Uso para diagn stico in vitro Cepheid y SmartCycler son marcas registradas de Cepheid Corporation 8 Muestras cl nicas Recoger las muestras en tubos est riles Almacenarlas y transportarlas congeladas a 20 C hasta su uso Utilizar ADN ARN bien purificado y libre de inhibidores de la PCR 9 Procedimiento a Extracci n de ARN Procedimiento GRIP tubo blanco b Protocolo Stage 3 Repeat l45 times 3 Temperature Cycle 95 0 115 650 0 30 720 30 Advance to Next Stage c Preparaci n de la reacci n Descongelar los tubos AmpliMix GRIP necesarios para amplificar las muestras y el Control Positivo ARN FluA A adir 0 3 uL de Retrotranscriptasa tap n azul A adir 7 5 uL del ARN de cada muestra o control a cada tubo Centrifugar los tubos para que la reacci n pase a la zona ptica del tubo Verificar que no se
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