el papel del diacilglicerol en el trèfico de membranas en la zona
Contents
1. Ester de forbol que es an logo al PDBu Phorbol 12 13 diacilglicerol Permeable a la membrana 250 nM Sigma dibutirate plasm tica St Louis MO Ester de forbol que es an logo al PMA Phorbol 12 myristate diacilglicerol Poco permeable a la 250 nM Sigma 13 acetate membrana plasm tica St Louis MO Inhibidor de la fosfatasa de cido Calbiochem Propanolol fosfat dico PAP LPP 60 uM San Diego CA Antibi tico que selecciona c lulas Sigma Puromicina eucari ticas que son positivas para la 3 ug ml St Louis MO puromicina acetiltransferasa U73122 1 6 17f8 3 Inhibidor de la activaci n de la Methoxyestra 1 3 5 10 fosfolipasa C PLC espec fica para los 6 uM Calbiochem trien 17 yl amino hexyl fosfoinos tidos San Diego CA 1H pyrrole 2 5 dione Toxina que permeabiliza las membranas Sigma SLO Estreptolisina O celulares animales 5 ug ml St Louis MO Subunidad B de la toxina de Toxina de Shigela que se internaliza Dr L Johanes Shigela hasta el RE Se utiliza como marcador de 4 ug ml Instituto Curie toxin Shiga B la v a retr grada Paris Francia 47 2 Anticuerpos 2 1 Anticuerpos primarios Materiales y M todos Antigeno Fuente Peso Procedencia detectado especie MOTELE OOED ArfGAP1 Conejo 50 Acris Antibodies GmbH 1 2000 BD Transduction Calnexina Conejo 90 Laboratories 1 1000 COP B Rat n 110 Sigma St Louis MO 1 100 1 1002. grado de membrana en la zona RE Golgi Por un lado la BFA inhibe el transporte anter grado Por otro inhibe la activaci n de la GTPasa Arf1 impidiendo que se puedan generar las ves culas COPI Ver apartado II Esto desencadena un flujo de membrana unidireccional del Golgi al RE mediante t bulos lo que finalmente comporta la fusi n de las membranas del Golgi con el RE y tambi n la redistribuci n completa de las prote nas residentes en el Golgi Un bloqueo o retraso en el efecto de desensamblaje del Golgi inducido por la BFA representa una alteraci n en el flujo retr grado y sugiere tambi n una perturbaci n en el transporte retr grado de prote nas COPI dependiente Por otro lado aprovechando el efecto de la BFA sobre la redistribuci n del Golgi al RE se puede estudiar el flujo anter grado Al eliminar la BFA del medio se restablece el transporte anter grado as como la activaci n de Arf1 provocando la reconstituci n del Golgi 7 2 Ensayos de transporte con el virus de la estomatitis vesicular Para los experimentos de transporte del ts045 VSV G GFP las c lulas se incubaron durante 2 h a 40 C temperatura restrictiva para acumular la glicoprote na G del virus en el RE Posteriormente se a adi cicloheximida 100 ug mL en el medio para inhibir la s ntesis proteica y se incubaron 2 horas m s a 40 C Finalmente las c lulas se incubaron a 32 C temperatura permisiva para inducir el transporte de la prote na V
3. mediante el m todo Lowry y estaba entre 0 1 0 3 mg ml por cada gradiente 6 3 Cuantificaci n de los niveles de diacilglicerol Para determinar el contenido de diacilglicerol en las membranas de Golgi procedentes de c lulas Vero control o tratadas con propanolol 60 uM 15 min o U73122 6 uM 15 min y en las membranas totales celulares procendentes de c lulas Swiss 3T3 control o infectadas con el shRNA LPP3 se sigui una versi n modificada del protocolo establecido en la ref La extracci n l pidica se llev a cabo con cloroformo metanol HCI 100 200 1 en tubos de cristal El cloroformo que contiene los extractos de membranas de Golgi de membranas totales o las muestras de la curva patr n 1 estearoil 2 araquidonoil sn glicerol 30 500 pmol se evapor cuidadosamente bajo un flujo de nitr geno Los l pidos secos se solubilizaron en 7 5 octil B D gluc sido 5 mM cardiolipina y 1 mM DETAPAC mediante sonicaci n en el ba o 50 60 Hz durante 30 segundos seguida de una incubaci n de 10 min a temperatura ambiente A esta soluci n lip dica se le a adi el tamp n imidazol HCI 100 mM pH 6 6 que contene 100 mM NaCl 25 mM MgCl y 2 mM EGTA 20 mM DTT 1 mM DETAPAC pH 7 0 y 10 ul de la soluci n diacilglicerol quinasa 0 25 mg mL tamp n imidazol HCI 20 mM pH 6 6 que contene 2 mM DETAPAC La reacci n comenz cuando se le a adi 10 pl del tamp n imidazol HCI 100 mM pH 6 6 que contene 1 mM DET
4. se infectaron con 5 ml de DMEM con los lentivirus el volumen final fue 10ml Despu s de 24 h se cambi el medio por DMEM completo fresco que conten a puromicina 3 ug ml Los experimentos se realizaron a partir de las 96 h despu s de la infecci n post 59 Materiales y M todos infection Como control negativo de los efectos de la infecci n se utilizaron lentivirus que no contienen el shRNA LPP3 sino la envuelta y la c pside y lentivirus con una secuencia que no interfiere con la expresi n de la LPP3 non silencing sequence 6 6 Extractos celulares y western blotting Los extractos celulares se obtuvieron a partir de 5 x 10 de c lulas Swiss 3T3 control y silenciadas con los lentivirus shRNA LPP3 Una vez tripsinizadas se centrifugaron y el pellet se incub en hielo durante 10 min en 50 ul tamp n de lisis Tris ID NP40 pH 7 5 50 mM Tris 150 mM NaCl NP40 1 azida 0 02 Posteriormente las muestras se centrifugaron a 500 g durante 20 min a 4 C y el sobrenadante se cuantific por el m todo de Lowry Luego se a adi el buffer de carga y se hirvi durante 5 min Para la electroforesis 20 ug de prote nas se cargaron en un gel al 7 5 de acrilamida SDS PAGE A continuaci n las prote nas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y por ltimo se realiz la inmunodetecci n mediante la t cnica de western blotting Primero estas membranas se bloquearon con una soluci n de TBS T 150 mM NaCl 20 m
5. 0 BD Transduction CtBP Bars50 Rat n 48 Laboratories 1 50 1 2000 Dr M Bornens CTR433 Rat n Institute Curie Paris 1 5 Flag Rat n Sigma St Louis MO 1 1000 Dr E Berger Galactosiltransferasa Conejo 49 University of Zurich 1 100 Dr H P Hauri Giantina Rat n 372 Biozentrum Basel 1 1000 BD Transduction GM130 Rat n Rata 130 Laboratories 1 200 1 1000 Dra R M Rios GMAP210 Conejo 210 Cabimer Sevilla 1 1000 Molecular Probes Golgina 97 Rat n Humano 97 Invitrogen 1 3000 Dr H D Soling KDEL receptor Erd2 Conejo 23 University of Gottingen 1 500 KDEL receptor Rat n Bovino 23 Calbiochem 1 500 1 1000 KR 10 San Diego CA Dr A J Morris LPP3 PAP2b Conejo Humano 35 University of Kentucky 1 100 1 500 Lexington KY USA Dr K Moremen Manosidasa II Conejo 35 University of Georgia 1 1000 y Athens BD Transduction PKCe Rat n 90 Laboratories 1 100 1 1000 BD Transduction p PKCe Ser729 Conejo 90 Laboratories 1 100 1 1000 tubulina a Rat n Pollo 55 Sigma St Louis MO s 1 50000 tubulina B Rat n 55 Sigma St Louis MO 1 100 TGN 46 Oveja 46 Serotec Oxford UK 1 5000 1 500 48 Materiales y M todos 2 2 Anticuerpos secundarios IF Procedencia kra 488 Alexa conejo Molecular Probes 1 500 Jackson Cy2 rat n Laboratories 1 50 Jackson Cy3 conejo Laboratories 1 250 Jackson Cy3 rat n Laboratories 1 50 WB Procedencia A Anti rat n IgG HRP Promega 1 3000 Anti cone
6. APAC 10 mM ATP y 0 6 Ci y 32P ATP Amersham 3 Ci mmol 2 mCi mL y se incub 30 min a temperatura ambiente Las reacciones se pararon con 0 6 ml de cloroformo metanol HCl 100 200 1 por volumen seguido de la adici n 0 25 ml de agua y 0 25 ml de cloroformo para separar las dos fases La fase inferior cloroformo se lav con metanol saturado con cloroformo agua 1 1 se evapor con nitr geno y se disolvi en 20 ul de cloroformo metanol 4 1 Despu s se separaron en placas de silica gel 60 TLC usando cloroformo metanol cido ac tico agua 100 60 16 8 v v v v y se dejaron secar al aire El P cido fosfat dico se cuantific usando el PhosphorImager Molecular Dynamics Inc y el programa NIH Image 6 4 Transfecciones con ADN plasm dico Para las transfecciones se utilizaron los pl smidos C1b PKCO GFP ArfGAP1 GFP el mutante termosensible ts045 VSV G GFP PKCe GFP el mutante inactivo PKCe KD GFP LPP3 GFP y el mutante inactivo LPP3 S203T GFP aislados con 57 Materiales y M todos columnas comerciales de Sigma La concentraci n y pureza se determinaron con un espectrofot metro midiendo la absorbancia de la muestra a 260 nm El m todo de transfecci n utilizado para las c lulas COS HeLa y Vero fue el reactivo comercial Effectene Quiagen USA Las c lulas se sembraron el d a anterior a la transfecci n entre el 60 80 de confluencia en cubreobjetos est riles La transfecci n se realiz siguiendo el protoc
7. DEPARTAMENTO DE BIOLOG A CELULAR Y ANATOM A PATOL GICA FACULTAD DE MEDICINA EH UNIVERSITAT DE BARCELONA EL PAPEL DEL DIACILGLICEROL EN EL TR FICO DE MEMBRANAS EN LA ZONA ENTRE EL RET CULO ENDOPLASM TICO Y EL COMPLEJO DE GOLGI Tesis presentada por In s Fern ndez Ulibarri para optar al t tulo de Doctor por la Universidad de Barcelona Materiales y M todos Materiales y M todos MATERIALES 1 Reactivos Metabolito f ngico que desorganiza la Sigma Brefeldina A estructura y bloquea la funci n del 1 5 ug ml St Louis MO complejo de Golgi Sigma Cicloheximida Antibi tico que inhibe la s ntesis prote ca 100 ug ml St Louis MO D609 O tricyclo 5 2 1 0 4 dec 9 yl Inhibidor de la fosfolipasa C PLC 500 uM Sigma dithiocarbonate espec fica para la fosfatidilcolina St Louis MO potassium salt DOG 1 2 diacilglicerol sint tico con cidos 3 10 50 uM Sigma 2 dioctanoyl sn glycerol grasos de cadena corta St Louis MO Toxina que se une espec ficamente a la Sigma Faloidina F actina e inhibe la conversi n de F a G 10 ug ml St Louis MO actina Metabolito f ngico que inhibe la Sigma Fumonisina B1 bios ntesis de los esfingol pidos 25 ug ml St Louis MO Toxina marina que inhibe la Calbiochem Latrunculina B polimerizaci n de los filamentos de actina 500 nM San Diego CA Promotor de la despolimerizaci n de los Calbiochem Nocodazole microt bulos 30 uM San Diego CA
8. M Tris HCI pH 7 5 0 05 Tween 20 que contiene 5 de leche en polvo libre de grasas Una vez bloqueadas se incubaron durante toda la noche a 4 C con el anticuerpo primario Al d a siguiente tras varios lavados en TBS T las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario Para visualizar el reconocimiento del ant geno se utiliz el ECL Enhanced Chemiluminiscence Luminol Santa Cruz y la reacci n se revel mediante la exposici n sobre una pel cula fotogr fica dentro de un cassette protegido de la luz 6 7 Mutag nesis dirigida El mutante inactivo de la LPP3 GFP se gener mediante PCR usando el kit QuickChange Stratagene y siguiendo el manual de instrucciones Los oligos utilizados para cambiar la serina del residuo 203 por una treonina eran de Invitrogen y se describen a continuaci n oligos Secuencia S203T 5 ggccatgcctecttcaccatgtacactatgc 3 Antisense S203 5 gcatagtgtacatggtgaaggaggcatggcc 3 La nueva construcci n generada se secuenci para comprobar que se hab a producido la mutaci n S203T en la construcci n silvestre El oligo de secuenciaci n 5 ttctagccagatcaactgctc 3 proceden de la casa comercial Invitrogen 60 Materiales y M todos 7 Ensayos de flujo de membrana y transporte intracelular 7 1 Uso de la brefeldina A como herramienta para estudiar el flujo retr grado y anter grado de membrana La BFA es una herramienta muy til para estudiar el flujo retr
9. SV G del RE a la membrana plasm tica pasando por el Golgi Las c lulas se fijaron a distintos tiempos de transporte 15 min 30 min 1 h con paraformaldeh do 4 y se procesaron para inmunofluorescencia Ver subapartado 5 1 1 7 3 Ensayos de transporte con la Toxina Shiga En los experimentos de transporte de la STx se utiliz el fragmento B de la toxina que contiene una secuencia KDEL STx B KDEL para provoca su retenci n en RE al llegar a este compartimento Adem s la STx B KDEL est marcada con el fluorocromo Cy3 STx B KDEL Cy3 permitiendo su visualizaci n a trav s del microscopio de fluorescencia En los ensayos de transporte de la STx las c lulas se lavaron con PBS y se incubaron con DMEM sin FBS durante 30 min a 37 C A continuaci n se a adi la STx B KDEL Cy3 y las c lulas se incubaron 30 min a 4 61 Materiales y M todos OC Tras este tiempo se elimin la Stx no unida a la membrana plasm tica lavando con DMEM al 10 de suero Despu s las c lulas se incubaron a 19 5 C durante 1 h con el fin de acumular la toxina internalizada en el compartimento endosomal Una vez sincronizada la STx en los endosomas las c lulas se incubaron a 37 C para inducir su transporte al Golgi para alcanzar finalmente el RE Las c lulas se fijaron a distintos tiempos de transporte 2 4 6 h con paraformaldeh ido 4 y se procesaron para inmunofluorescencia Ver subapartado 5 1 1 62
10. a 37 oC 0 1 M pH 7 4 las c lulas se fijaron con 1 25 glutaraldeh do en tamp n PIPES que contiene sacarosa 2 y Mg 2S0 2 mM durante 60 min a 37 C Seguidamente las c lulas se lavaron con tamp n PIPES 3 x 5 min y se levantaron suavemente de la placa de cultivo con la ayuda de un raspador o scraper A continuaci n se centrifugaron a 100 g durante 5 min Posteriormente las c lulas se postfijaron en 1 OsOxz 1 K3Fe CN en tamp n PIPES durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad Luego se lavaron con PIPES 3 x 5 min y se incubaron con 0 1 cido t nico en tamp n PIPES durante 5 min para aumentar su contraste Tras varios lavados con PIPES 3 x 5 min las c lulas se deshidrataron con soluciones crecientes de etanol 80 90 95 y 3 x 100 y finalmente se incluyeron en resina Epon EMbed 812 polimerizando a 60 C durante 48 h Las secciones ultrafinas 40 60 nm se contrastaron con acetato de uranilo 30 min y citrato de plomo 10 min La observaci n de las secciones ultrafinas se realiz en un microscopio electr nico de transmisi n JEOL 1010 operando a 80 90 kV equipado con una c mara digital modelo Gatan BioScan 792 Para la captaci n digital de las im genes se utiliz el programa DigitalMicrograph 3 11 0 Gatan Inc Pleasanton CA USA 5 5 An lisis estereol gico El estudio estereol gico se realiz manualmente mediante la t cnica de recuento de puntos con una plantilla cuadriculada super
11. da del programa de an lisis de imagen Image J 1 33 NIH Bethesda MD Previamente se fijaron una serie de par metros para poder comparar las im genes entre s Para ello las im genes se tomaron en escala de grises a 8 bit y se eligieron aquellas c lulas que no ten an la fluorescencia saturada Para eliminar el ruido de fondo se cambi la escala de fluorescencia real 0 255 por otra en la que el valor m nimo de intensidad era 90 en lugar de ser 0 90 255 De esta manera el programa consider O la fluorescencia comprendida entre 0 90 Por cada c lula analizada se defini como Golgi aquellas estructuras que ten an un tama o mayor de 600 pixeles mientras que las estructuras con un tama o menor de 600 pixeles se consideraron estructuras citoplasm ticas puntiformes es decir aquellos ITs que viajan entre el RE y el Golgi Los datos obtenidos se analizaron estad sticamente mediante el an lisis ANOVA y el test de Bonferroni utilizando el programa Graphpad Prism 3 0 Graphpad Software San Diego CA 5 3 Microscop a confocal in vivo Los experimentos de microscopia a tiempo real time lapse se llevaron a cabo utilizando un sistema confocal l ser espectral denominado Leica TCS SL Leica Microsystems Heidelberg Manheim Alemania Este sistema est equipado con un 52 Materiales y M todos microscopio invertido Leica DMIREZ l seres de Arg n y Helio Ne n y una peque a c mara para mantener las condicione
12. ementado con suero bovino fetal FBS al 10 volumen volumen inactivado Tanto el DMEM como el FBS proceden de la casa comercial GIBCO Invitrogen Paisley UK Las c lulas HeLa S crecieron en medio RPMI 1640 Biochrom Berlin Germany suplementado con FBS al 7 5 Las c lulas Swiss 3T3 infectadas con los lentivirus que contienen el shRNA short hairpin RNA contra la LPP3 se seleccionaron con puromicina 3 ug ml Todos los medios llevaban antibi ticos penicilina 100 U ml y estreptomicina 100 ug ml piruvato s dico 100 mM y L glutamina 200 mM Las c lulas crecieron a 37 C en atm sfera saturada de agua y 5 de CO 50 Materiales y M todos 5 T cnicas morfol gicas 5 1 Inmunocitoqu mica y microscop a de epifluorescencia La inmunofluorescencia indirecta se realiz en c lulas con un grado de confluencia de entre el 50 70 sobre cubreobjetos de vidrio est riles Teniendo en cuenta el tipo de experimento que se quer a realizar se hicieron diferentes tipos de fijaci n y o permeabilizaci n 5 1 1 Permeabilizaci n con Saponina La fijaci n se realiz con paraformaldeh do al 4 en PBS durante 15 min A continuaci n las c lulas se lavaron con PBS y se bloquearon los grupos aldeh dos con una soluci n 50 mM de NH4 Cl en PBS durante 15 min Despu s se permeabilizaron durante 10 minutos con saponina 0 1 disuelta en PBS que conten a alb mina s rica bovina BSA al 0 1 soluci n de blo
13. ion de las series obtenidas a distintos ngulos y finalmente se realiz 55 Materiales y M todos el modelado manual tridimensional de los stacks del Golgi a partir de la fusi n de sendos tomogramas 6 T cnicas bioqu micas y de biolog a molecular 6 1 Fraccionamiento celular Las fracciones de membrana P16 y las fracciones solubles S16 procedentes de c lulas Vero control o tratadas con propanolol 60 uM se prepararon siguiendo una versi n modificada del protocolo establecido en la ref Las c lulas se cultivaron en una placa de 500 cm de superficie Triflask en DMEM completo hasta alcanzar una confluencia del 90 2 x 10 c lulas A continuaci n se tripsinizaron y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min para recoger las c lulas Seguidamente se resuspendieron en 500 ul de tam n de homogenizaci n fr o 20 mM HEPES pH 7 5 320 mM sacarosa 2 mM EDTA e inhibidores de proteasas y se pasaron 30 veces por una aguja de 21G acoplada a una jeringa de 5 ml Posteriormente se hizo una primera centrifugaci n de 1000 g durante 20 min y despu s otra a 16000 g durante otros 20 min m s El pellet corresponde a la fracci n P16 se resuspende en 50 100 ul de tam n de homogenizaci n y el sobrenadante a la fracci n S16 La concentraci n de prote na se determin mediante el m todo Lowry 6 2 Aislamiento de las membranas de Golgi de c lulas en cultivo Las membranas de Golgi procedentes de las c lulas HeLa S
14. jo IgG HRP Promega 1 3000 3 Pl smidos Pl smido Procedencia Dr H Gad ArfGAP1 CMNS Chiety Italy pEGFP Dr I Merida Cib PKCO CSIC Madrid Spain pEGFP Dr K Simons t045VSV G NIH Bethesda USA pEGFP Dr A J Morris University psPAX of Kentucky Lexington KY psPAX USA Dr A J Morris University pMD2 G of Kentucky Lexington KY pmMD2 G USA Dr A J Morris University shRNA LPP3 of Kentucky Lexington KY pKLO 1 clon TRC49 USA Dr A J Morris University shRNA LPP3 of Kentucky Lexington KY pKLO 1 clon TRC51 USA Dr C Larson PKCe Lund University Malm pEGFP Sweden Dr C Larson PKCe KD Lund University Malm pEGFP Sweden Dr A J Morris University LPP3 of sd alicia KY pEGFP Mutagenesis dirigida LPP3 S203T de la construcci n LPP3 pEGFP 49 Materiales y M todos M TODOS 4 L neas y cultivos celulares 293T Humana DMEM COS 1 COS 7 Mono DMEM HeLa GST Flag PKD KD Humana DMEM K618N HeLa YFP Galactosiltransferasa Humana DMEM YFP GalT HeLa S cultivadas en Humana RPMI 1640 suspensi n NRK Rata DMEM Swiss3T3 Rat n DMEM Vero Mono DMEM Donado por V Malhotra Centro de Regulaci n Gen mica CRG Barcelona Las c lulas COS Vero Swiss 3T3 NRK 293T HeLa y las HeLa que constitutivamente expresan YFP GalT o GST Flag PKD KD crecieron en medio DMEM Dulbecco s Modified Eagle s Medium supl
15. lcul ndose como Pg por la distancia d Por ltimo Vv es corresponde a los puntos de la cuadr cula encontrados el interior de los perfiles t bulovesiculares entre Pg Los valores obtenidos para los distintos par metros se analizaron estad sticamente mediante an lisis t test para muestras independientes con el programa estad stico SPSS 12 0 Chicago USA 5 6 Tomograf a electr nica y reconstrucci n tridimensional Las c lulas NRK se fijaron con la mezcla 2 aglutaraldeh do 1 formaldeh do en 0 1 M tamp n cacodilato pH 7 4 y procesadas seg n el procedimiento descrito para MET Las secciones seriadas de 250 nm se recogieron en rejillas de cobre de ojal recubiertas con una pel cula de butvar en las que previamente se evapor carbono para darle estabilidad frente al haz de electrones Las secciones se incubaron con oro coloidal de 10 nm que sirve para el enfoque y el alineamiento de la muestra durante la toma de im genes Se realizaron dos series ortogonales de im genes a distintos ngulos de inclinaci n o tilt series con un microscopio electr nico Tecnai20 FEI Philips Eindoven Holanda operando a 200 kV equipado con una c mara TemCAM F214 TVIPS GMBH Alemania y un goni metro motorizado Las im genes se tomaron desde 65 a 65 con incrementos de 1 Mediante el programa IMOD 3 5 5 Colorado USA se realiz la construcci n de sendos tomogramas ortogonales a partir de la proyecci n inversa o backproject
16. n A fr a y seguidamente con la soluci n B 25 mM HEPES pH 7 2 75 mM acetato pot sico 2 5 mM acetato magn sico 5 mM EGTA 1 8 mM CaCl tambi n en fr o Luego se incubaron con la soluci n B durante 5 min a 37 C 51 Materiales y M todos Finalmente se fijaron con paraformaldeh do al 4 y se procesaron para inmunofluorescencia ver subapartado 5 1 1 5 1 3 Fijaci n y permeabilizaci n celular con metanol Este m todo conjunto de fijaci n y permeabilizaci n se utiliz para visualizar bien el citoesqueleto de microt bulos Se realiz incubando las c lulas durante 5 min en metanol fr o 20 C Posteriormente las c lulas se lavaron con PBS y se procesaron para inmunofluorescencia ver subapartado 5 1 1 Las preparaciones se visualizaron con un microscopio de epifluorescencia Olimpus BX60 y las im genes se captaron con una c mara digital Olympus CCD Lake Success NY Para los estudios de cuantificaci n y colocalizaci n se utiliz un microscopio confocal Leica TCS NT Heerbrugg Switzerland o un microscopio Leica TCS SL Leica Microsystems Heidelberg Manheim Alemania El procesamiento y an lisis de las im genes se llev a cabo utilizando los programas Adobe PhotoShop CS Adobe Systems SanJose CA e Image J 1 33 NIH Bethesda MD 5 2 An lisis cuantitativo de las im genes La cuantificaci n de las estructuras citoplasm ticas puntiformes que contienen el receptor de KDEL se realiz con la ayu
17. nes se grabaron cada 10 s El procesamiento de las im genes la cuantificaci n de la fluorescencia y el montaje de los videos se realizaron con los programas de procesamiento y an lisis de imagen Image Processing Leica Confocal Leica Microsystems Heidelberg Manheim Alemania e Image J 1 33 NIH Bethesda MD En la cuantificaci n de los resultados de los experimentos se rest el ruido de fondo a todos los valores obtenidos los cuales posteriormente se corrigieron y normalizaron Para cada registro de fluorescencia se calcul la fluorescencia en el rea del Golgi F Golgi utilizando la ecuaci n descrita a continuaci n F Golgi ROI Totalm x ROI Total ROI Golgir ROI Golgimax Se defini como ROI a la regi n de inter s Region Of Interest donde ROI Totalms es la intensidad m xima registrada en el rea de la c lula ROI Total es la intensidad en cada registro del rea de la c lula ROI Golgi es la intensidad en cada registro del rea del Golgi y ROI Golgim x es la intensidad m xima registrada en el rea del Golgi Los datos obtenidos se analizaron estad sticamente mediante el an lisis ANOVA y el test de Bonferroni utilizando el programa Graphpad Prism 3 0 Graphpad Software San Diego CA 53 Materiales y M todos 5 4 Microscop a electr nica de transmisi n Las c lulas NRK Vero o Swiss 3T3 sembradas al 80 de confluencia se procesaron para MET Tras un lavado r pido con tamp n PIPES precalentado
18. olo adjunto con el producto Consiste en dos pasos en el primer paso se mezcl el enhancer con el ADN en las proporciones indicadas y se incub durante 2 5 min a temperatura ambiente En el segundo paso se a adi el reactivo effectene a la mezcla y se incub durante 5 10 min para que se formen los complejos entre el l pido y el ADN Mientras tanto las c lulas se lavaron con PBS y se les a adi el volumen de medio fresco indicado A continuaci n se a adi medio de cultivo a los complejos ADN y effectene y esta mezcla se a adi directamente a las c lulas Los experimentos se realizaron entre las 12 16 h despu s de la transfecci n y tras 1 h de tratamiento con cicloheximida 100 ug ml El m todo de transfecci n utilizado para las Swiss3T3 fue el kit Lipofectamine 2000 Invitrogen USA Las c lulas se sembraron al 60 80 de confluencia y crecieron en un medio sin antibi tico Aproximadamente 1 h antes de la transfecci n se lavaron las c lulas con PBS y se cambi el medio sin antibi tico por medio opti MEM La mezcla final de la transfecci n se prepar en dos mezclas iniciales soluci n A y soluci n B Para preparar la soluci n A se a adi el ADN en el opti MEM seg n las proporciones indicadas Paralelamente la soluci n B se prepar a adiendo la Lipofectamina en opti MEM seg n las proporciones indicadas Tanto la soluci n A como la B se incubaron por separado durante 7 min a temperatura ambiente Posteriormen
19. oras 293T para generar los lentivirus se realiz siguiendo el manual de instrucciones de la Lipofectamina 2000 Invitrogen La mezcla final de la transfecci n se prepar en dos mezclas iniciales soluci n A y soluci n B La soluci n A consisti en a adir los vectores lentivirales pMD2 G vector con los genes de la c pside pPAX vector con los genes de la envuelta y el vector con el shRNA LPP3 en 1 5 ml de opti MEM en el orden citado La cantidad de ADN corresponde a 4 5 ug 9 ug y 13 5 ug respectivamente La soluci n B se prepar a adiendo 60ul de Lipofectamina en 1 5 ml de opti MEM Tanto la soluci n A como la B se incubaron por separado durante 7 min a temperatura ambiente Posteriormente se mezclaron y se incub durante 20 min Mientras tanto las c lulas 293T que hab an sido previamente sembradas en placas p100 con DMEM sin antibi tico a una confluencia del 80 90 se lavaron con PBS y se a adi 6ml opti MEM Finalmente se a adi la mezcla al medio Al cabo de 6h se cambi el medio de transfecci n y se a adi 10 ml de DMEM completo sin antibi ticos Despu s de 48 h se recogi el medio que contiene los lentivirus se filtr cuidadosamente con un filtro de 45 um se alicuot y se guard a 80 C 6 4 2 Infecci n de las c lulas Swiss 3T3 con los lentivirus producidos Una vez obtenidos los lentivirus shRNA LPP3 se procedi a infectar las Swiss 313 Para ello se sembraron 6 x 10 de c lulas en una p100 y
20. puesta aleatoriamente sobre las micrograf as obtenidas en el microscopio electr nico a 50000 y 60000 aumentos El tama o m nimo de la muestra para el an lisis estereol gico se determin mediante la t cnica de la media progresiva con l mite de confianza del 95 Los par metros estereol gicos analizados son la densidad el volumen de las cisternas respecto al volumen del stack analizado VVist G la densidad de superficie de las cisternas respecto a la superficie del stack analizado SVast c y la densidad num rica de perfiles t bulovesiculares peri Golgi Nvyes G El c lculo de estos par metros se representa en la siguiente figura 54 Materiales y M todos Densidad de volumen Densidad num ri En el c lculo de la VvVoeistG Pes corresponde a los puntos de la cuadr cula encontrados el interior de las cisternas y Pg a los puntos de la cuadr cula encontrados el interior del rea delimitada como stack del Golgi En el c lculo de la SVeist a I corresponde al n mero de intersecciones de las membranas de las cisternas del stack del Golgi con la plantilla y d en um es la distancia entre l neas respecto a la estructura analizada calculada como la distancia correspondiente a la cuadr cula entre el n mero de aumentos de la micrograf a En el c lculo de la Nvyes c k es una constante con valor 1 5 y B es una constante de forma que en el caso de una esfera corresponde a 1 328 Na es el rea del stack del Golgi analizado ca
21. queo Los anticuerpos primarios se diluyeron en la soluci n de bloqueo y las c lulas se incubaron 1 hora a temperatura ambiente o bien toda la noche a 4 C Seguidamente se lavaron con PBS 3 x 5 min y despu s se incubaron con el anticuerpo secundario diluido en la soluci n de bloqueo durante 45 60 min a temperatura ambiente Finalmente se lavaron con PBS 3 x 5 min y los cubreobjetos se montaron en Mowiol 5 1 2 Permeabilizaci n con Estreptolisina O Este tipo de permeabilizaci n se utiliz para vaciar la mayor a del citosol y facilitar la visualizaci n de la prote na CtBP3 BARS en el Golgi Para ello las c lulas se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio est riles tratados con poli D lisina 1 mg ml Estos cubreobjetos se prepararon sumergi ndolos durante 60 min en polilisina y posteriormente se lavaron con abundante agua est ril Despu s se dejaron secar completamente a 37 C para poder sembrar las c lulas En el momento de la permeabilizaci n se prepar la soluci n de trabajo 2 U ml disuelta en la soluci n A 20 mM HEPES pH 7 2 100 mM acetato pot sico 2 mM acetato magn sico 1 mM DTT a partir de la soluci n stock 25 U ml disuelta en la soluci n A y se incub la mezcla a 37 C durante 5 min para activar la estreptolisina O SLO A continuaci n se lavaron las c lulas con la soluci n A fr a y despu s se incubaron con la SLO activa durante 20 minutos en hielo Despu s se lavaron con la soluci
22. s de temperatura y CO Para la visualizaci n de la GFP green fluorescence protein o la YFP yellow fluorescence protein se us el l ser con la l nea de excitaci n a 488 nm y un rango de detecci n de emisi n entre 500 600 nm La secuencia de im genes se grab en el mismo plano y a la misma profundidad cada 10 15 s durante 20 30 min dependiendo del tipo de experimento Las im genes se captaron utilizando un objetivo NA 0 8 de aceite inmersi n Zeiss Plan Neofluor x63 y con el pinhole a 150 correspondiente a una profundidad de 22 um El tama o de las im genes que se obtuvo era de 2024 x 2024 Los diferentes agentes farmacol gicos utilizados en los experimentos se a adieron al medio a distintos tiempos Por ejemplo el PMA se a adi a las c lulas justo despu s de la primera foto o frame y las im genes se tomaron cada 15 s Despu s del frame 41 se a adi el DOG o el PDBu al medio que conten a el PMA Los experimentos en el que las c lulas se trataron s lo con propranolol o s lo con DOG tambi n se a adieron despu s del primer frame En el caso de las c lulas tratadas con DOG m s propanolol primero se preincubaron con el DOG durante 15 min y pasado este tiempo comenz la grabaci n Justo despu s del primer frame se a adi el propanolol las im genes se tomaron cada 15 s En los experimentos del desensamblaje del Golgi los distintos tratamientos se a adieron despu s del primer frame pero en este caso las im ge
23. se prepararon a 4 C siguiendo una versi n modificada del protocolo establecido en la ref Para obtener el lisado celular las c lulas se cultivaron en suspensi n en 1 L de medio RPMI hasta llegar a las 5 x 10 c lulas A continuaci n se trataron con propanolol 60 uM o U73122 6 uM Posteriormente se centrifugaron a 500 g durante 10 min y se lavaron 2 veces con PBS 10 minutos a 500 g y otras 2 con tamp n de homogenizaci n 250 mM sacarosa en 10 mM Tris HCI pH 7 4 10 min a 1500 g El pellet celular se resuspendi en el tamp n de homogenizaci n en un volumen 4 veces superior al del pellet Despu s las c lulas se rompieron mec nicamente con un dispositivo denominado homogenizador de bolas Bal Balch homogenizer device Para hacer el gradiente discontinuo se a adi sacarosa al 67 10 mM Tris HCI pH 7 4 al lisado celular obtenido hasta conseguir una concentraci n final del 37 sacarosa Seguidamente se a adi 12 ml de esta soluci n en un tubo SW28 despu s 15 ml sacarosa al 35 y finalmente 9 ml de sacarosa al 29 Los gradientes se centrifugaron a 25000 rpm durante 2 5 h Tras la centrifugaci n se recogi entre 2 3 ml de la banda que queda en la interfase 29 56 Materiales y M todos 35 corresponde a las fracciones enriquecidas de membranas de Golgi Por ltimo las membranas se alicuotaron se congelaron en nitr geno l quido y se guardaron a 80 C La concentraci n de prote na se determin
24. te se mezclaron y se incub durante 20 min Finalmente se a adi la mezcla a las c lulas que contienen el opti MEM Al cabo de 6h se cambi el medio de transfecci n por DMEM completo con antibi ticos Despu s de 14 16 h se procesaron para inmunofluorescencia Ver subapartado 5 1 1 6 5 Producci n e infecci n lentiviral Para inhibir especificamente la expresi n de las LPP3 en las c lulas Swiss 3T3 se emple el sistema lentiviral que consiste en introducir dentro de las c lulas una secuencia de ARN complementaria al RNA codificante para la prote na de inter s usando los lentivirus como vector de internalizaci n y expresi n Para llevar a cabo esta t cnica se necesitaron los pl smidos lentivirales que codifican el ARN de interferencia contra la LPP3 Las secuencias de 21 nucle tidos del ARN de 58 Materiales y M todos interferencia que estaban clonadas en los pl smidos lentivirales pkKLO 1 se especifican en la siguiente tabla RNA interferencia contra LPP3 ShRNA LPP3 Secuencias TCR51 5 CCTGATTTCAGTCAGATCAAT 3 TCR49 5 CGGGTATCTGACTACAAGCAT 3 El protocolo const de dos pasos primero las c lulas empaquetadoras 293T se transfectaron con 3 vectores lentivirales para obtener los lentivirus shRNA LPP3 y despu s las c lulas Swiss 3T3 se infectaron para silenciar la expresi n de la LPP3 6 4 1 Producci n de los shRNA LPP3 lentivirus La transfecci n de las c lulas empaquetad
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