ImmunoBlot y ImmunoBlot XL
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1. O O O pozos muestra i n f n i i i n i y i f n n KNE Ep do EEEE ppp E E ON H WO H O O O D H O U U AH Le A e O H O H A H U L H A aae a Canales Blot en los pozos de muestreo Fig C El 25 as 1 0 mm peine PR511 25 1 0 tambi n se alinea con los 25 canales de el ImmunoBlot y se puede utilizar para sondear 25 muestras con una sonda por muestra p12 Paso 2 Despu s de que los geles son borrados las bandas en la membrana no son visibles Adici n de un colorante no reactivo har que sea f cil para alinear la membrana Esto puede hacerse en una de dos maneras A Para cargas de prote nas m s grandes gt 250 ng Ponceau S se pueden utilizar para te ir las prote nas de forma reversible en la membrana despu s de la transferencia electrofor tica Enjuague la membrana brevemente en agua y las manchas en un 0 2 Ponceau S por 1 a 2 minutos luego destain en varios cambios de agua destilada hasta que las bandas rojas aparecen sobre un fondo blanco Puesto que la mancha se pierde durante la etapa subsiguiente de bloqueo bandas de prote nas se debe marcar en esta etapa con agujeros o con un l piz punti agudo La transferencia tambi n puede ser fotocopiada Manchas te idas Ponceau S se pueden almacenar durante meses a 4 C se mantuvo h meda entre las hojas de parafina o tamp n saturado de papel de filtro Borrones tambi n puede congelarse en una bolsa de pl stico Po2. de 250 pl cada uno El ImmunoBlot XL cuenta con 45 canales que mantienen un volumen m ximo de 140 pl cada uno Desembalaje e inventario Quite el envoltorio de los paquetes cuidadosa mente y comparar el contenido con la lista de empaque asegur ndose de que todos los elemen tos llegaron Si falta alguna pieza comun quese con su oficina local de ventas Inspeccione todos los componentes de los da os que puedan haber ocurrido mientras la unidad estaba en tr nsito Si alguna parte est da ada p ngase en contacto de inmediato al transportista Aseg rese de guardar todo el material de embalaje para las reclamaciones por da os o utilizar en caso de ser necesario devolver la unidad W ase el Ap ndice A Nota 1 El bloqueo de la membrana V ase el Ap ndice A Nota 2 Alineaci n de la membrana Instrucciones El siguiente detalle los pasos para el sondeo de una membrana con el ImmunoBlot Seleccione y bloquear la membrana 0 Seleccionar una membrana de elecci n nitrocelulosa Hybond ECL PVDF Hybond P bajo PVDF fluores cente Hybond LFP para el ensayo y se corta a Longitud 15 cm Ancho Corte para dar cabida a los canales que se utilizar n la anchura m xima para todos los canales 15 cm 2 Membranas bloques con exceso no espec fica protein Nota Si las membranas bloqueadas han sido almace nados en una soluci n libre de prote nas las vuelve a bloquear durante 1 a 2 minutos en una b
3. ficos con una soluci n adecuada de bloqueo 9 El bloqueo es seguido por dos lavados r pidos en PBS 0 1 de Tween PBS T O Sumergir e incubar la membrana con un anticuerpo primario ant geno espec fica de concentraci n optimizado Q Quitar la membrana con dos lavados r pidos de PBS T seguido por 2 lavados m s largos 2 x 5 minutos con balanceo Incubar la membrana con una concentraci n ptima del anticuerpo secundario conjugado o Brevemente enjuague la membrana con dos cambios de tamp n de lavado seguido de 4 lavados m s con PBS T 4 x 5 min con balanceo O Detecci n de la soluci n A y B se mezclan y se pipe tearon sobre la membrana para una incubaci n corto O Escurrir el exceso de reactivo de detecci n y envolver la membrana en Saran Wrap antes de la exposici n a rayos X pel cula e p17 Informaci n para pedidos producto cantidad c digo ImmunoBlot para su uso con membrana est ndar gel 1 PR625 de tama o por ejemplo SE600 25 carriles sonda espaciados 5 3 mm Incluye la placa superior placa inferior 2 tornillos sistema de lavado 2 piezas 2 piezas de tuber a conectores de tubo y 5 pastillas de sellado ImmunoBlot XL para su uso con membrana est ndar 1 PR645 gel de tama o por ejemplo SE600 45 carriles sonda espaciados 3 0 mm Incluye la placa superior placa inferior 2 tornillos sistema de lavado 2 piezas 2 piezas de tube
4. soluci n a medida que aumenta la temperatura Llevar soluciones a temperatura ambiente antes de cargar las muestras Canales de contenidos residuales de gotas de l quido antes de las muestras se cargaron Incline la unidad y el l quido aspirado desde el extremo inferior de cada canal con una punta de pipeta de pl stico unido a un fuerte vac o T cnica de pipeteo inadecuado se utiliz Asiento la punta de la pipeta firme mente en el agujero numerados y dispensar la muestra con una suave acci n clave Almohadillas de sellado estaban h medos antes del montaje Aseg rese de que las almohadillas de sellado est n secos antes de su montaje en el ImmunoBlot La mala calidad o una pipeta mal mantenido introducido burbujas en los canales Trate de inyecci n de muestras con una pipeta u otra marca de la punta Las burbujas formadas en el tiempo Coloque una capa de pl stico entre la membrana y la almohadilla de sellado M ltiple es dif cil de insertar Las juntas t ricas pueden o sin lubricaci n Para lubricar e Quitar las juntas t ricas cuidadosa mente con la punta de una esp tula plana de pesaje e Aplique grasa de silicona a la ligera e Vuelva a instalar e p9 e p10 Ap ndice A Notas t cnicas Nota 1 El bloqueo de la membrana Membranas siempre deben ser bloqueadas antes de montar en el ImmunoBlot Por favor siga las instrucciones de bloqueo proporcio
5. O ual del usuario Espa ol ImmunoBlot y ImmunoBlot XL Manual de instrucciones mu PR645 IM Spanish Rev B0 08 12 Afro e fe r o E Tja de contenidos Introducci arar sas 1 Desembalaje e inventario oocccccccccncccnnccnoncnnnnos 2 INSTEUCCIONES coincida Lain 3 Seleccione y bloquear la membrana ocoooccccncccos 3 Carga de la Membrana occcocccccncccnncnnnncnnncnnnnaninns 3 Aspirar e introducir soluciones de anticuerpos 4 A e a EAE EE 4 Retire las soluciones primarias de anticuerpos y lavar la mancha oooocccccccnncccnnccnnno 5 Introducir anticuerpo secundario y se incuba 6 Retire y desarrollo de la Mancha 7 Limpie el ImmunoBlot oooccccnonccincnnnnnnnnonannnnnno 7 Soluci n de problemas ikaspen i 8 Ap ndice A Notas t cnicas cccoocccnccoconcccnnncnnnnnnn 10 Ap ndice B Detecci n utilizando ECL Western Blot los sistemas de detecci n 16 Informaci n para pedidOS sesiis 18 Introducci n La transferencia de prote nas o cidos nucleicos fraccionados mediante electroforesis en gel para una superficie de la membrana inmovilizar aumenta la sensibilidad de una amplia gama de m todos de detecci n reduce el tiempo de an lisis y hace posible secuencial de sondeo En particular se ha hecho posible utilizaci n de procedimientos inmunol gicos que no son pr c ticas para llevar a cabo en un gel Para material de ensayo en una hoja de membrana con sondas di
6. a trav s de los canales al quitar la mancha de la unidad Recomendaci n Una soluci n al 1 de soluci n de limpieza 7X Flow Laboratories 50 ml de concentrado en 5 litros de agua tibia Nota No esterilizar la unidad de ImmunoBlot o sistema de lavado No exponga la unidad de ImmunoBlot con el alcohol u otros solventes org nicos Retire y desarrollo de la mancha 0 Desenrosque el ImmunoBlot y separar las dos mitades 0 Eliminar la almohadilla de sellado utilizado y se lava la membrana en una bandeja con 3 a 5 cambios de tamp n para un total de 10 a 15 minutos O Desarrollar la mancha siguiendo las instrucciones de su kit de detecci n de Occidente V ase tambi n el Ap ndice B Limpie el ImmunoBlot Limpie la unidad despu s de cada uso mediante la realizaci n de los siguientes 0 Enjuague la unidad ImmunoBlot y sistema de lavado con agua destilada 0 Utilizar un no abrasivo agente alcalino de limpieza de laboratorio que no deja residuos despu s del enjuague tal como un detergente para la limpieza de art culos de vidrio destinado cultivo de tejidos Los agentes concentrados de limpieza debe diluirse a la fuerza normal Sumerja la unidad de ImmunoBlot y de lavado en la soluci n de limpieza y cepille suavemente con un cepillo suave teniendo cuidado de no rayar las superfi cies interiores Q Lavar la unidad ImmunoBlot y lavado a fondo con colector de agua del gri
7. abierto del tubo de la pieza segundo colector en un vaso de precipitados que conten a tamp n de lavado Al iniciar las soluciones de anticuerpo de vac o en los canales se eliminan y el tamp n de lavado se extrae desde el otro lado Por favor consulte a su protocolo de detecci n occidental para obtener instrucciones de lavado Para la detecci n occidental se recomienda al menos 2 lavados r pidos en el buffer seguido de dos lavados m s en el buffer 5 minutos mientras balanceo es suficiente antes de la introducci n de los anticuerpos secundarios SV ase el Ap ndice A Nota 6 La incubaci n del anticuerpo secundario Introducir anticuerpo secundario y se incuba La incubaci n del anticuerpo secundario puede realizarse tanto en la unidad o en una bandeja Para llevar a cabo la incubaci n en la unidad de ImmunoBlot 0 Se inyecta la soluci n secundaria de anticuerpos en los canales cuidadosamente con una pipeta de un solo o de varios canales 9 Incubar la unidad sobre una plataforma oscilante con los canales alineados en la direcci n de oscilaci n de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente O Aspirar la soluci n de anticuerpo secundario utili zando una fuente de vac o o una pipeta como se ha descrito antes p gina 5 paso 2 y lavar la mancha con tamp n de lavado durante unos pocos segundos El lavado de la mancha evita la contami naci n cruzada de canales de diferentes anticuer pos secundarios
8. andeja de soluci n de bloqueo Carga de la membrana 0 Retire la placa de acr lico de la ImmunoBlot y darle la vuelta 2 Con la cara de ant geno de soporte de la membrana frente a los canales de ImmunoBlot la posici n de la membrana que cubre todo el channels Colocar una almohadilla nuevo sellado en seco suministrado con la unidad sobre la membrana Q Coloque la placa inferior de la unidad en la placa superior invertido de forma que los pasadores de alineaci n caer en su lugar Aseg rese de que no hay un espacio entre las placas superior e inferior Recomendaci n Utili zar una punta de pipeta desechable conectado a un aspirador de vac o de agua para este fin Importante Tenga cuidado de no tocar la punta de la pipeta en cualquier parte de la unidad salvo en el agujero deseado de la muestra V ase el Ap ndice A Nota 3 La eliminaci n de las burbujas V ase el Ap ndice A Nota 4 Los vol menes ptimos Aspirar e introducir soluciones de anticuerpos 0 Aspirar el exceso de l quido de los canales a trav s de los agujeros numerados Nota Para evitar el secado de la membrana los canales deben ser cargados dentro de los cinco 5 minutos de aspiraci n 0 Pipeta soluci n de anticuerpo a trav s de los agujeros numerados Presione la punta de la pipeta con firmeza en cada hoyo y se inyecta el l quido r pidamente en una sola a
9. cci n suave hasta que el canal est lleno Tenga cuidado de no introducir burbujas O A adir tamp n a todos los canales no utilizados que cubren la membrana n mero de volumen del canal modelo canales aproximada ImmunoBlot 25 250 pl ImmunoBlot XL 45 140 pl Incubar 0 Coloque la unidad sobre una plataforma oscilante con los canales alineados en la direcci n de balanceo Nota Para obtener los mejores resultados utilice una velocidad de balanceo lento 5 a 6 ciclos de inclinaci n por minuto Una plataforma giratoria agitaci n no es eficaz para este prop sito 0 Incubar la unidad en la plataforma oscilante durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente V ase el Ap ndice A Nota 5 Montaje de las juntas t ricas en las ranuras Retire las soluciones primarias de anticuerpos y lavar la mancha Utilizar el sistema de lavado para eliminar la soluci n de anticuerpo y lavar la mancha 0 Posici n de las 2 partes id nticas del sistema de lavado en las ranuras de cada lado de la placa supe rior y presione firmemente hasta que las juntas t ricas est n sentados en la slots 9 Para aspirar todas las muestras simult neamente primero conectar partes de la tuber a suministrada con la unidad para las dos partes del colector medi ante una conexi n luer Ahora conecte el extremo abierto del tubo de la pieza de colector a una trampa conectado a una fuente de vac o Luego coloca el extremo
10. ferentes simult neamente com nmente requi ere primero el corte de la membrana en una serie de tiras paralelas Este procedimiento sin embargo destruye la correspondencia entre los carriles o posiciones diferentes sobre un gel El ImmunoBlot y ImmunoBlot XL mantener esta correspondencia y reducir al m nimo el volumen de los reactivos necesarios para la detecci n de carriles individuales Dos placas de pl stico transparente suave y una con los cana les sujetar un 15 x 15 cm membrana de trans ferencia para definir y separar los carriles de gel de originales en los canales individuales Estos canales separados permiten el uso de reactivos de detecci n diferentes anticuerpos primarios secundarios conjugados anticuerpos ant genos y o sustratos de reacci n en cada canal e pl Hay 2 aplicaciones principales de la ImmunoBlot blot y ImmunoBlot XL Antisueros m ltiple o sondas pueden ser probada contra una sola muestra de prote nas o cidos nucleicos La nica muestra se carga toda la parte superior de un gel de losa a continuaci n ejecute y se transfirieron a una membrana Cuando anclada en el ImmunoBlot la membrana puede ser probada contra antisue ros m ltiple o sondas Un antisuero sola o la sonda puede ser probada contra ant genos m ltiples o cidos nucleicos Los dos modelos difieren en el n mero y el volumen de los canales de reacci n El ImmunoBlot cuenta con 25 canales que mantienen un volumen m ximo
11. fo seguido de agua destilada Para enjuagar f cilmente los peque os agujeros numerados montar la unidad y las unidades m ltiples sin una membrana y la almohadilla de sellado y enjuague con agua destilada Soluci n de problemas problema causas posibles recomendaciones Fugas soluci n de anticuerpos se ha trasladado a los canales adyacentes Sensibilidad baja Las reas secas de la membrana para actuar como mechas fluido de las zonas adyacentes Siempre pre mojado de la membrana antes de montar en la unidad Llenar cada canal que cubre la membrana con tamp n Membrana no cubren toda la longitud del canal Asegurarse de que la membrana se corta al tama o apropiado El l quido en los canales sobrecargados se derram cuando la unidad fue sacudida provocando la contaminaci n de los canales adyacentes No llene en exceso canales Vuelva a utilizar las almo hadillas de sellado no se ha sellado correctamente No vuelva a usar almohadillas de sellado ya que comprime durante el uso Bandeja de incubaci n Considere la posibilidad de incubaci n de la mancha con el anticuerpo secundario en el ImmunoBlot en lugar de incubaci n de la bandeja V ase el Ap ndice A Nota 6 Membrana es despojado de bloqueo prote na Por favor tenga cuidado de no quitar la mancha de bloquear la prote na mientras que el lavado antes de la adici n de anticuerpos primari
12. ineados con los canales en el ImmunoBlot Los peines con separaciones as que coincidan con las separaciones de carriles de las unidades de ImmunoBlot se enumeran a continuaci n Tenga en cuenta que el n mero de pozos no siempre coincide con el n mero de carriles en una proporci n 1 1 9 pozos x 45 y el A O O O pozos muestra a E A E E A HU HU HA e HA e HA e U canales bot ATT IT RTA RIADA AAN a Canales Blot en los pozos de muestreo Canales Blot que no est n bajo los pozos de muestreo Fig A El peine 9 bien 1 0 mm PR511 9 1 0 se alinea con los 45 canales de la ImmunoBlot XL y se puede utilizar para sondear 9 muestras con hasta tres sondas por muestra epll 12 pozos x 25 y el canal O O O pozos muestra Els 22 HF oe oe y AE BH al EA delo BE NE a Na ye canales blot A 2 1 o N D Canales Blot en los pozos de muestreo Canales Blot que no est n bajo los pozos de muestreo Fig B Los 12 as 1 0 mm peine PR511 12 1 0 se alinea con los 25 canales de el ImmunoBlot y se puede utilizar para sondear 12 muestras con una sonda por muestra 25 pozos x 25 y el canal
13. lvo Ponceau S se debe disolver en agua destilada para obtener una soluci n de trabajo La soluci n se puede reutilizar para varias semanas o meses depen diendo del n mero de manchas membranas B Para cargas de prote nas menores lt 250 ng verde de metilo Y pironina o Deep Purple puede ser utilizado para marcar permanentemente la parte supe rior e inferior del gel para la alineaci n posterior con los ImmunoBlot canales Al cargar el gel a adir aproximadamente 5 pl de verde de metilo 0 1 de soluci n en 50 de glicerol o pironina Y 0 05 de soluci n en glicerol al 50 a los carriles deseados Estos colorantes migran justo por delante del frente de colorante azul de bromofenol en el gel y transferir permanentemente a la membrana Una segunda al cuota del colorante a adido al gel cerca del final de la electroforesis entrar en el gel de resoluci n dentro de 5 a 10 minutos y sirven para marcar la parte superior del gel Por favor tenga en cuenta que estos tintes fluorescentes pueden interferir con los m todos de detecci n de Western Blot y por lo tanto debe ser removido antes de la imagen Si se deja sobre la membrana que dar lugar a se ales no espec ficos en la detecci n fluorescente de Western Blot e p13 e p14 Nota 3 La eliminaci n de las burbujas Las peque as burbujas en los canales gener almente no afectan a la reacci n final y debe moverse adelante y atr s sobre la superficie de la memb
14. nado en el kit de detecci n de Western Blot En general 5 sin grasa de la leche seca o 5 de BSA se utilizan como agentes bloqueantes El bloqueo con detergentes Tween 20 u otro por s solas no se recomienda ya que puede causar la lenta difusi n lateral de prote nas a trav s de la membrana de nitrocelulosa Se recomienda realizar el paso inicial de bloqueo en una solu ci n que contiene prote nas tales como 5 de BSA sin detergente Evitar lavados extensos con soluciones que no contienen la prote na antes de montar la membrana en la inmunotransferencia En muchos casos el bloqueo satisfactorios pueden ser alcanzados por incubaci n con PBS 10 ternero reci n nacido serum 0 1 de Tween 20 para un m nimo de una hora a temperatura ambiente Sin embargo los agentes de bloqueo difieren en su eficacia dependiendo de las circunstancias Para borrones de lisados de c lulas enteras bloqueando con suero al 50 a 100 puede ser muy eficaz en la reducci n de la uni n no espec fica Nota 2 La alineaci n de la membrana Por Western Blot experimentos es importante que los carriles y las bandas de prote na en la membrana se alinean con los canales de la unidad de ImmunoBlot Esto se puede lograr en 2 pasos Paso 1 Utilice la especialmente dise ada ImmunoBlot peines en el momento de la electrofore sis Esto asegura que los carriles en el gel y posteriormente los carriles y las bandas de prote na en la mancha est n al
15. os Por favor siga las instrucciones de su kit de detecci n de Western Blot Un protocolo de la muestra se da en el Ap ndice B Canales sin lavar conten a anticuerpos que contamin el experimento Cuando baja afinidad o anticuerpos bajos de titulaci n se utilizan a alta diluci n 1 100 000 o mayor una cierta disminuci n en la inten sidad de se al puede ser observada Los anticuer pos pueden agotarse en el peque o volumen del canal de ImmunoBlot Limpie la unidad despu s de cada uso Para consejos de limpieza consulte la secci n Limpieza del ImmunoBlot en la p gina 7 Aumentar la concentraci n de anticuerpos doble 2 5 Aumentar el volumen de soluci n de anticuerpos por canal Para ello inserte el est ndar 200 pl puntas de pipeta de pl stico en los puertos de entrada tanto para cada canal Estos servir n como dep sitos para vol menes de muestra grandes que el volumen de la propia canal mientras que la incubaci n en el agitador Inyectar la muestra de anticuerpos con una punta que se queda en la puerta de entrada y se convierte en un dep sito Realice las incubaciones de secundaria de anticuerpos en una bandeja V ase el Ap ndice A la nota 6 problema causas posibles recomendaciones Burbujas Nota Las peque as burbujas se mueven generalmente cuando la unidad se balancea y no suelen afectar a los resultados Las soluciones son demasiado fr o Gas disuelto sale de la
16. r a conectores de tubo y 5 pastillas de sellado Almohadillas de sellado de pl stico 10 PR630 31 Kit de lavado del colector 1 PR630 32 Juntas t ricas 2 PR630 33 Colector de conectores Luer 4 PR630 34 Tornillo de sujeci n 1 PR630 36 Bandeja superior para PR625 1 PR625T Bandeja superior para PR645 dl PR645T Fondo de la placa 1 PR630 37 Peine 9 pozos 1 0 mm 1 PR511 9 1 0 Peine 12 pozos 1 0 mm 1 PR511 12 1 0 Peine 25 pozos 1 0 mm 1 PR511 25 1 0 e p18 Hoefer Inc 84 October Hill Road Holliston MA 01746 Llamada gratuita 1 800 227 4750 Tel fono 1 508 893 8999 Fax 1 508 893 0176 E mail supportOhoeferinc com Web www hoeferinc com Hoefer y el ImmunoBlot son marcas registradas de Hoefer Inc ECL es una marca comercial de GE Healthcare anteriormente Amersham Biosciences O 2012 Hoefer Inc Todos los derechos reservados Impreso en el USA Hoefer
17. r de firmeza en la ranura Nota 6 Incubaciones anticuerpo secundario Por favor siga las instrucciones incluidas con el sistema de detecci n de Western Blot Cuando el anticuerpo secundario se utiliza en la ImmunoBlot en una alta diluci n 1 100 000 o mayor una cierta disminuci n en la intensidad de se al puede ser observada Esto puede ser debido al agotamiento de los anticuerpos en el peque o volumen del canal El problema generalmente puede ser corregido por 1 Aumentando la concentraci n de anticuerpos 2 5 veces 2 Aumentando el volumen de anticuerpos o 3 La eliminaci n de la membrana de la unidad y la realizaci n de la incubaci n del anticu erpo secundario en una bandeja p15 e pl6 Ap ndice B Detecci n utilizando ECL Western Blot los sistemas de detecci n Hoefer le recomienda que realice el etiquetado y la detecci n de manchas de acuerdo con las instrucciones que aparecen en el etiquetado de Western Blot y un kit de detecci n A continuaci n se muestra un protocolo general basado en el de GE Healthcare anteriormente Amersham Biosciences ECL Western Blotting Kit de detecci n Hay varios ECL Western Blot sistemas de detec ci n disponibles El siguiente protocolo general se sugiere 0 Despu s de la electroforesis y la transferencia de prote nas separadas a nitrocelulosa o PVDF bajo Hybond LFP fluorescente para mayor sensibilidad de la membrana bloquear los sitios no espec
18. rana cuando la ImmunoBlot se sacudi Para eliminar las burbujas grandes retirar la soluci n desde el canal y volver a inyectar Para m s informaci n consulte la secci n Soluci n de problemas Nota 4 Vol menes ptimos El volumen ptimo para los canales ImmunoBlot variar ligeramente dependiendo del tipo de membrana utilizada La soluci n a adida debe casi 95 llenar todo el canal Reducir el volumen si la soluci n se derrama de la puerta de entrada cuando la unidad se incuba en una plataforma oscilante Nota Tenga precauci n al realizar las incubaciones de la bandeja ya que los anticuerpos de baja afinidad monoclonales pueden disociarse de sus respectivos ant genos a trav s del tiempo La incubaci n en una bandeja permite tales anti cuerpos para difundirse a trav s de la soluci n de incubaci n y volver a enlazar en otra parte de la mancha Tal rayas es detectable como tinci n entre los carriles de muestra o en los carriles de control negativo en la posici n de una o m s bandas fuertemente reactivos Nota 5 Montaje de las juntas t ricas en las ranuras Si las unidades de lavado m ltiples no encajan en las ranuras con facilidad aplique una peque a cantidad de grasa de silicona alrededor de las juntas t ricas Coloque la unidad del colector suelto en la ranura y presione hacia abajo en el lado del colector hacia usted A continuaci n pulse en el lado opuesto de usted para el asiento del colecto
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