HTLV BLOT 2.4
Contents
1. Pipetas y puntas del volumen adecuado e Aspirador con dep sito de hipoclorito s dico Ba o Mar a a 56 C optativo e Hipoclorito s dico para la descontaminaci n DESCRIPCI N DE LOS S MBOLOS A continuaci n figuran los s mbolos gr ficos que aparecen en los envases y productos de MP Diagnostics Estos s mbolos son los que se incluyen con m s frecuencia en los dispositivos m dicos y sus envases Se explican con mayor detalle en la Norma europea EN 980 2008 y la Norma Internacional ISO 1522312007 Dispositivo m dico Usar antes de os para diagn stico in Sin nimos Fecha de caducidad vitro C digo de serie N mero de Sin nimos cat logo N mero de lote N mero de serie o Precauci n L mite de temperatura Representante autorizado en la Fabrican Ania R Comunidad Europea Consultar las instrucciones de Contenido suficiente para lt n gt ensayos E k a EE uso N tili o reutilizar Nocivo Xn Irritante Xi ONT Indice Se dE E PRINCIPIOS QU MICOS Y BIOL GICOS DEL PROCEDIMIENTO En las tiras de nitrocelulosa se incluyen prote nas v ricas del HTLV I derivadas de part culas v ricas naturales modificadas e inactivadas y prote nas desarrolladas mediante ingenier a gen tica Las tiras de nitrocelulosa individuales se incuban con muestras de suero o plasma diluidos y controles Si las muestras contienen anticuerpos frente al HTLV I II dichos a2. E Diagnostics HTLV BLOT 2 4 ENSAYO DE WESTERN BLOT PARA HTLV C Manual de instrucciones 0123 FECHA DE REVISI N 03 10 MAK 0011 SPN 2 kit de 18 tests 11080 018 kit de 36 tests 11080 036 NOMBRE Y USO PREVISTO El ensayo HTLV BLOT 2 4 de MP Diagnostics MPD es un enzimoinmunoensayo cualitativo para la detecci n in vitro de anticuerpos frente a los virus HTLV I y HTLV II en suero o plasma humanos Su uso previsto es como an lisis complementario m s espec fico para las muestras de suero o plasma humanos que presenten reactividad repetida con procedimientos de detecci n selectiva como los ensayos de inmunoabsorci n ligada a enzimas ELISA Nota Cambios resaltados INTRODUCCI N Estudios epidemiol gicos recientes llevados a cabo en Estados Unidos y en Europa confirman la prevalencia mixta tanto del HTLV como del HTLV II en distintas poblaciones de alto riesgo como los consumidores de drogas por v a intravenosa Actualmente la disponibilidad de an lisis de detecci n selectiva para HTLV 1 1l es considerablemente alta Las muestras con reactividad repetida en los an lisis de detecci n selectiva requieren otras pruebas m s espec ficas para confirmar la seropositividad para el HTLV I o para el HTLV II Estas pruebas complementarias deben poder identificar los anticuerpos frente a las prote nas centrales del core gag y de la envoltura env de los virus HTLV I y HTLV II Uno de los a
3. Ruscetti FW Gazdar AF Bonn PA Minna JD And Gallo RC Detection and Isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T cell lymphoma Proc Natl Acad Sci U S A 1980 77 12 7415 7419 3 Kalyanaraman VS Sarngadharan MG Robert Guroff M Miyoshi l Blayney D Golde and Gallo RC A new subtype of human T cell leukemia virus HTLV II associated with a T cell variant of hairy cell leukemia Science 1982 218 571 573 4 William AE Fang CT Slamon DJ et al Seroprevalence and epidemiological correlates of HTLV I infection in U S blood donors Science 1988 240 643 646 5 Lee H Swanson P Shorty VS Zack JA Roseblatt JD and Chen ISY High rate of HTLV II infection in seropositive IV drug abusers in New Orleans Science 1989 244 471 475 FIGURA 1 Ei 5 y 18 i b Control reactivo fuerte reactivo s lo para el HTLV I c Control reactivo fuerte II reactivo s lo para el HTLV II d Control no reactivo 10 10 13 14 18 Lipka JJ Bui K Reyes GR Moeckli R Wiktor SZ Blatiner WA Murphy EL Hanson CV Shaw GM Shinsky JJ and Foung SKH Determination of a unique immunodominant epitope of HTLV I Infect Dis 1990 162 353 357 Wiktor SZ Alexandra SS Shaw GM et al Distinguishing between HTLV I and HTLV II by Western Blot Lancet 1990 335 1533 Samuel KP Lautenberger JA Jorcyk CL Josephs S Wo
4. fueron los siguientes i Inmunoensayo en l nea 1 M todo TNEG INDT POS 1 Total HTLV NEG IND 3 0 3 BLOT 2 4 POS 0 102 102 de MPD Total 3 102 105 El HTLV BLOT 2 4 de MPD present 2 resultados indeterminados y 1 resultado negativo que tambi n se detect como negativo con el inmunoensayo en l nea 1 El inmunoensayo en l nea 1 present 3 resultados negativos Los dos Blots presentaron las siguientes discriminaciones para las 102 muestras positivas de HTLV Interpretaci n M todo HTLV I HTLV II HTLV 18 No Total HTLV II tipable HTLV BLOT 45 53 4 0 102 2 4 de MPD LI 1 48 51 0 3 102 kk Marcadores espec ficos tanto de HTLV como de HTLV II han aparecido lo que indica co infecci n No es posible clasificar el tipo de HTLV debido a la ausencia de marcadores espec ficos Los resultados obtenidos con el HTLV BLOT 2 4 de MPD y con el Ll 1 fueron similares Los pocos resultados discordantes se deben a diferentes ant genos inmovilizados en los blots y a los diferentes m todos utilizados El kit HTLV BLOT 2 4 de MPD demostr una sensibilidad del 97 1 equivalente a la obtenida con el inmunoensayo en l nea 1 B Comparaci n con el inmunoensayo en l nea 2 Se evalu el panel de anti HTLV y anti HTLV I de la Sociedad Francesa de Transfusi n Sangu nea SFTS 94 que consiste en 26 muestras de HTLV I y 6 muestras de HTLV II Los res
5. 78 130 131 Hayes C G Burans JP and Oberst RB Antibodies to Human T Lymphotropic virus Type in a population from the Philippines Evidence for cross reactivity with Plasmodiun falciparum The J Infect Dis 1990 163 257 262 Gallo D Diggs JL and Hanson CV Evaluation of two commercial Human T Cell Lymphotropic Virus Western blot Immunoblot kits with problem specimens J Clin Microbiol 1994 32 2046 2049 Garin B Gosselin S de The G and Gessain A HTLV I II infection in a high viral endemic area of Zaire Central Africa Comparative evaluation of serology PCR and significance of indeterminate Western blot pattern J Med Virol 1994 44 104 109 Fujiyama C Fujiyoshi T Matsumoto D Yashiki S Tamashiro H and Sonoda S Re evaluation of anti HTLV I Western blot assay using HTLV I and HTLV II serum panels Clin amp Diag Virol 1995 4 149 161 Rouet F Meertens L Courouble G Herrmann Storck C Pabingui R Chancerel B Abid A Strobel M Mauclere P and Gessain A Serological epidemiological and molecular differences between human T cell lymphotropic virus type seropositive healthy carriers and persons with HTLV I gag indeterminate Western blot patterns from the Caribbean J Clin Microbiol 2001 39 1247 1253 Cesaire R Bera O Maier H Lezin A Martial J Ouka M Kerob Bauchet B Ould Amar AK and Vernant JC Seroindeterminate patterns and seroconversions to human T
6. el tamp n de blotting deben estar reci n preparados 12 La soluci n del conjugado de trabajo debe prepararse en un recipiente o vaso de precipitado de polipropileno 13 No exponga los reactivos ni realice el an lisis en un rea en la que exista un nivel elevado de vapores de desinfectantes qu micos p ej vapores de hipoclorito durante las etapas de almacenamiento y de incubaci n el contacto inhibe la reacci n de color Los reactivos tampoco deben exponerse a la luz intensa 14 Es preferible efectuar el ensayo a temperatura ambiente 25 C 3 C 15 Aseg rese de colocar las tiras con los n meros hacia arriba 16 En los ensayos de Western blot es importante utilizar un agitador con plato basculante el uso de un agitador rotativo podr a poner en peligro el rendimiento del kit La velocidad de agitaci n y el ngulo de inclinaci n recomendados son respectivamente de 12 a 16 ciclos por minuto y de 5 a 10 grados 17 Sise utiliza equipo automatizado debe verificarse que se ha validado antes de su uso 18 Aseg rese de a adir las muestras sin que toquen la tira Para ello puede inclinar la bandeja y a adir la muestra en la parte baja donde se acumula el tamp n De este modo se evitar la formaci n de puntos negros debidos a la adici n de muestra a la tira 19 No utilice congeladores con funci n de descongelaci n autom tica para conservar los reactivos y las muestras Aunque no es frecuente pue
7. para minimizar el riesgo de falsos negativos debidos a errores operativos El ensayo HTLV BLOT 2 4 de MP Diagnostics se dise como ensayo de anticuerpos complementario para la caracterizaci n de muestras que presenten reactividad repetida con los m todos iniciales de detecci n de los anticuerpos frente a HTLV 1 Il Los perfiles serol gicos posibles con el ensayo HTLV BLOT 2 4 de MP Diagnostics son los siguientes seropositivo para HTLV seropositivo para HTLV I seropositivo para HTLV II seronegativo o dudoso CONSERVACI N 1 Conserve el kit HTLV BLOT 2 4 de MPD y sus componentes a 2 C 8 C cuando no se est n utilizando 2 Todos los reactivos y tiras de an lisis conservados a una temperatura de entre 2 C a 8 C son estables hasta la fecha de caducidad que figura en el kit No congele los reactivos A Tiras de ant genos e Evite las exposiciones innecesarias de las tiras de ant genos a la luz B Reactivos e Conserve los reactivos en sus viales o frascos originales que deber n estar tapados e Dispense todos los reactivos cuando a n est n fr os y vu lvalos a guardar a una temperatura de entre 2 C y 8 C lo antes posible e Cuando el sustrato se conserva en un intervalo de 2 C a 8 C puede precipitar sin que ello afecte al funcionamiento del kit PRECAUCI N Evite las exposiciones innecesarias del sustrato a la luz RECOGIDA TRANSPORTE Y CONSERVACI N DE LAS MUESTRAS Se pueden utilizar
8. Blattner WA HTLV I and HTLV II worldwide distribution reanalysis of 4 832 immunoblot results Inte J Cancer 1993 54 2 255 260 World Health Organization s Global Programme on AIDS WHO Global Programme on AIDS Information Update Virus Information Exchange Newsletter 1990 7 2 54 55 Lal RB Rudolph DL Coligan JE Brodine SK and Roberts CR Failure to detect evidence of human T lymphotropic virus HTLV type I and type II in blood donors with isolated gag antibodies to HTLV 1 11 Blood 1992 80 544 550 Khabbaz RF Heneine W Grindon A Hartley TM Shulman G and Kaplan J Indeterminate HTLV serologic results in U S blood donors Are they due o HTLV I or HTLV 112 J Acquir Immune Defic Syndr 1992 5 400 404 Lipka JJ Young KK Kwok SY Reyes GR Sninsky JJ and Foung SK Significance of human T lymphotropic virus type indeterminant serological findings among healthy individuals Vox Sang 1991 61 171 176 11 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Zrein M Louwagie J Boeykens H Govers L Hendickx G Bosman F Sablon E Demarquilly C Boniface M and Saman E Assessment of a new immunoassay for serological confirmation and discrimination of human T cell lymphotropic virus infections Clin Diag Lab Immunol 1998 5 45 49 Witt DJ Kuramoto K Kemper M and Holland P Utility of prospective study of donors deferred as HTLV indeterminate Vox Sang 2000
9. NAL TICAS 1 Para obtener un rendimiento ptimo del ensayo es necesario un CUMPLIMIENTO ESTRICTO del procedimiento descrito en este Manual de instrucciones Cualquier modificaci n del procedimiento puede provocar resultados an malos 2 NO CAMBIE NI SUSTITUYA LOS REACTIVOS DE UN LOTE DEL KIT POR LOS DE OTRO Los controles el conjugado y las tiras de Western blot est n ajustados para un funcionamiento ptimo Use s lo los reactivos que se suministran con el kit 3 No utilice los componentes del kit despu s de la fecha de caducidad que figura en la caja INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS La banda del control de suero sirve para comprobar que se ha a adido el suero al an lisis La ausencia de esta banda indica que no se han dispensado en la tira del ensayo el suero del an lisis el conjugado o el sustrato o bien alg n otro error operativo Localice e identifique las bandas de las tiras analizadas con los controles reactivos fuertes Dichas tiras se usan para identificar las bandas presentes en las tiras utilizadas con las muestras del ensayo PATR N INTERPRETACI N 1 Sin reactividad a las prote nas SERONEGATIVA espec ficas del HTLV 2 Reactividad a GAG p19 con o SEROPOSITIVA sin p24 y dos ENV GD21 y para HTLV I rgp46 I 3 Reactividad a GAG p24 con o SEROPOSITIVA sin p19 y dos ENV GD21 y para HTLV II rgp46 11 4 Reactividad a GAG p19 y p24 SEROPOSITIVA y ENV GD21 para HTLV indica
10. SEROPOSITIVIDAD para HTLV I si p19 gt p24 indica SEROPOSITIVIDAD para HTLV II si p19 lt p24 5 Se detectan bandas espec ficas DUDOSA de HTLV pero el patr n no cumple los criterios de seropositividad para HTLV I HTLV II ni HTLV Sin embargo deben interpretarse como SERONEGATIVAS las muestras con los siguientes patrones de bandas dudosos Patrones dudosos del GAG del HTLV I HGIP HTLV I GAG indeterminate patterns de Western blot Presencia de p19 p26 p28 p32 p36 p53 pero ausencia de p24 y de todas las prote nas ENV Cualquier combinaci n de prote nas GAG p19 p26 p28 p32 p36 p53 pero ausencia de p24 y de todas las prote nas ENV Cualquier prote na GAG sola p19 p24 p26 p28 p32 p36 p553 En ausencia de rgp46 I y rgp46 Il se puede usar el algoritmo de Wiktor y cols para las muestras seropositivas para HTLV que no se puedan tipificar Este algoritmo que utiliza la reactividad relativa a p19 y p24 ha demostrado ser eficaz para diferenciar entre los dos serotipos 12 13 14 La interpretaci n de una muestra como dudosa se basa en las directrices de 1990 de la OMS Sin embargo diversos estudios han indicado que ciertos patrones de bandas dudosos los ya mencionados se pueden interpretar como seronegativos sobre todo en el caso de donantes de sangre sanos Por ejemplo un estudio en el que participaron 37 724 donantes de sangre sanos confirm que era seguro interpretar los HGIP co
11. ar reci n preparada b Prepare la SOLUCI N DEL CONJUGADO DE TRABAJO diluyendo CONJUGADO en TAMP N DE BLOTTING en proporci n de 1 1000 p ej 10 ul de CONJUGADO en 10 ml de TAMP N DE BLOTTING 4 SOLUCI N SUSTRATO lista para su uso a Dispense el volumen necesario directamente del frasco Use una pipeta limpia Cierre bien el frasco despu s de usarlo PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Notas a Aspire todos los productos qu micos y reactivos utilizados con un aspirador provisto de dep sito con hipoclorito s dico b Todas las incubaciones deben efectuarse en un plato basculante PRECAUCIONES Algunas muestras pueden causar manchas oscuras en el punto de la tira en el que se a adieron Para evitar este problema proceda de la forma siguiente i A ada siempre la muestra despu s de haber dispensado el TAMPON DE BLOTTING li Incline ligeramente la bandeja elevando su extremo superior o su fondo El tamp n de BLOTTING se desplazar hacia la zona m s baja de la bandeja A ada la muestra en la zona en la que se haya acumulado el tamp n de BLOTTING Cuando haya dispensado todas las muestras devuelva la bandeja a su posici n horizontal inicial Aseg rese siempre de que las tiras se mantengan h medas durante el proceso iii Otra opci n si no desea inclinar la bandeja es dispensar las muestras en el extremo superior o en el fondo del pocillo De esta forma si aparecen manchas oscuras la lectura de los resultad
12. asculante Aspire el SUSTRATO y aclare las tiras un m nimo de tres veces con agua de calidad reactivo para detener la reacci n Con unas pinzas extraiga con cuidado las tiras y col quelas sobre pa os de papel C bralas con pa os de papel y s quelas Otra posibilidad es dejar que las tiras se sequen en los pocillos de la bandeja Coloque las tiras en una hoja de trabajo papel blanco no absorbente No aplique cinta adhesiva sobre las bandas reveladas Observe las bandas v ase Interpretaci n de los resultados y califique los resultados Para el almacenamiento mantenga las tiras en la oscuridad Cantidad suministrada Disponible en 18636 tiras 1 vial 80 ul 1 vial 80 pl 1 vial 80 pl 1 2 frascos cada uno para reconstituir hasta 100 ml 1 frasco 70 ml 1 vial 120 pl 2 mil 5 minutos 2 mil 20 pl 60 minutos 3x2ml 2 mil 60 minutos 3x2ml 2 mil 15 minutos 3x2ml SUSTRATO 1 frasco Soluci n de 5 bromo 4 cloro 100 ml 3 indolil fosfato BCIP y nitroazul de tetrazolio NBT POLVO DE BLOTTING Leche desnatada 10 paquetes 1 g cada uno Bandejas de incubaci n 2 4 bandejas de 9 pocillos cada una Manual de instrucciones 1 copia Pinzas 1 par Nota se suministra un volumen de reactivos suficiente para 4 series de an lisis ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1 Para uso diagn stico in vitro nicamente 2 Para uso exclusivo por pro
13. atorio CL USULA DE EXENCI N DE RESPONSABILIDAD El fabricante garantiza exclusivamente que el kit de an lisis funcionar como ensayo diagn stico in vitro de acuerdo con las especificaciones y limitaciones descritas en el Manual de instrucciones del producto cuando se use de conformidad con las instrucciones citadas en el mismo El fabricante reh sa cualquier garant a expresa o impl cita incluida la garant a expresa o impl cita relativa a la comercializaci n adecuaci n para el uso o supuesta utilidad para cualquier otro fin El fabricante s lo se obliga a la sustituci n del producto o al reembolso del precio de compra del mismo El fabricante no ser responsable ante el comprador ni ante terceros de cualesquiera da os perjuicios o p rdidas econ micas provocados por la utilizaci n o la aplicaci n del producto PROBLEMAS T CNICOS Y RECLAMACIONES En caso de problemas t cnicos o si desea presentar una reclamaci n proceda de la siguiente manera 1 Anote el n mero de lote del kit y su fecha de caducidad 2 Conserve los kits y los resultados obtenidos 3 P ngase en contacto con la oficina de MP Biomedicals m s cercana o con su distribuidor local BIBLIOGRAF A 1 Towbin H Staehlin T and Gordan J Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad Sci U S A 1976 76 4350 4354 2 Poiesz BJ
14. cula que la sensibilidad global de los dos tipos rgp46 l y rgp46 1l es mayor del 97 El peque o porcentaje de muestras con HTLV I y HTLV II que resultan no reactivas con rgp46 1 o rgp46 1l son reactivas como m nimo a GD21 y a una o m s bandas de GAG p19 o p24 con lo cual cumplen los criterios de seropositiva para HTLV patr n 4 o de dudosa patr n 5 No se notific ninguna interpretaci n de falso negativo Las pruebas complementarias como la PCR para HTLV I y HTLV II pueden ser tiles para distinguir las muestras seropositivas para HTLV que no se pueden identificar como HTLV I ni como HTLV II con el ensayo HTLV BLOT 2 4 de MPD es decir el patr n 4 CARACTER STICAS ESPEC FICAS DEL FUNCIONAMIENTO El funcionamiento del kit HTLV BLOT 2 4 de MPD para la detecci n de anticuerpos frente a HTLV I y HTLV II se evalu utilizando muestras seropositivas y seronegativas para HTLV I II y se compar con dos inmunoensayos en l nea que incorporan ant genos de HTLV y HTLV II p ptidos o prote nas recombinantes Sensibilidad Especimenes positivos para anticuerpos frente a HTLV I o y HTLV II por tests de ELISA comerciales se utilizaron para determinar la sensibilidad del HTLV BLOT 2 4 de MPD A Comparaci n con el inmunoensayo en l nea 1 Los resultados del Blot para muestras positivas compradas de Boston Biomedica Inc USA BBI y ProMedDx comparando el HTLV BLOT 2 4 de MPD y el inmunoensayo en l nea 1 LI 1
15. de haber muestras de suero con infecci n doble que tambi n pueden diferenciarse con los criterios antes citados Los patrones de bandas de tales muestras indicar n seropositividad para HTLV I y para HTLV II Los datos disponibles demuestran que las serorreactividades para rgp46 y rgp46 1l son espec ficas respectivamente de HTLV I y de HTLV II por lo que los sueros reactivos a rgp46 l rgp46 1 GD21 p19 y p24 se clasificar n como muestras con infecci n doble LIMITACIONES DEL M TODO Para obtener un rendimiento ptimo del ensayo es necesario un cumplimiento estricto del procedimiento descrito cualquier modificaci n puede provocar resultados an malos Un resultado NEGATIVO no excluye la posibilidad de exposici n a los virus ni de infecci n por HTLV I o HTLV II Las tiras con resultado DUDOSAS no deben utilizarse como base para el diagn stico de infecci n por HTLV 1 11 Se han notificado casos de serorreactividad para p19 o p24 en individuos no infectados de poblaciones de bajo riesgo si bien los resultados dudosos de p24 son relativamente poco frecuentes Se ha informado de una sensibilidad del 95 para la rpg46 l en Francia siendo del 100 para las muestras confirmadas por PCR en Jamaica y Estados Unidos y del 98 de los donantes de sangre seropositivos para HTLV I Se ha demostrado que la sensibilidad a rgp46 1l es superior al 98 en las muestras confirmadas por PCR procedentes de Estados Unidos Se cal
16. fesionales 3 Consulte el prospecto del producto para obtener informaci n sobre los componentes potencialmente peligrosos INFORMACI N SANITARIA Y DE SEGURIDAD PRECAUCIONES Este kit contiene productos de origen humano Ning n m todo de an lisis permite A N ofrecer una garant a absoluta de que los hemoderivados humanos no transmitan una infecci n MANIPULE LAS MUESTRAS EL CONTROL REACTIVO FUERTE l EL CONTROL REACTIVO FUERTE ll Y LOS CONTROLES NO REACTIVOS COMO MATERIAL POTENCIALMENTE INFECCIOSO Se recomienda manipular los componentes del ensayo y las muestras de conformidad con las pr cticas correctas de laboratorio Asimismo deben desecharse siguiendo los procedimientos de seguridad establecidos El control reactivo fuerte l el control reactivo fuerte Ily el control no reactivo contienen timerosal y azida s dica el tamp n de reserva concentrado y el tamp n de lavado concentrado contienen timerosal el conjugado contiene azida s dica La azida s dica puede reaccionar con el cobre y el plomo que se utilizan en ciertas tuber as y formar sales explosivas Aunque las cantidades que se usan en este kit son peque as los materiales que contienen azida deben eliminarse con vol menes relativamente grandes de agua para evitar la acumulaci n de azidas met licas en las tuber as A continuaci n figuran las frases pertinentes relativas a los riesgos R correspondientes R20 21 22 Nocivo por inhalaci n en contacto con
17. la piel y por ingesti n El sustrato contiene 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato y nitroazul de tetrazolio clasificados como nocivos Xn por las directivas de la Comunidad Econ mica Europea CEE que son de aplicaci n A continuaci n figuran las frases pertinentes relativas a riesgos R R20 21 22 Nocivo por inhalaci n por ingesti n y en contacto con la piel RESUMEN DE LOS PROTOCOLOS DE ENSAYO Reactivos Cant Duraci n Tira de nitrocelulosa 1 Tamp n de lavado 2 ml 5 min Tamp n de blotting 2 mil Muestra 20 ul 60 min Tamp n de lavado 3x2ml 3x5 min Conjugado 2 ml 60 min Tamp n de lavado 3x2ml 3x5 min Sustrato listo para su uso 2 ml 15 min Agua destilada 3x2ml CANTIDADES DE REACTIVOS NECESARIAS PARA DIVERSOS NUMEROS DE TIRAS N MERO DE TIRAS 3 6 9 15 20 27 36 Tamp n de lavado 60 100 140 240 300 400 520 1X ml Tamp n de blotting 20 40 60 80 100 120 160 1X ml Conjugado ul 11 17 23 35 45 59 77 Sustrato ml 11 17 23 35 45 59 77 Polvo de blotting g 1 2 3 4 5 6 8 Reactivos CONTROL DE CALIDAD Es aconsejable realizar en todos los ensayos el control no reactivo y los dos controles reactivos fuertes independientemente del n mero de muestras que se analicen Para que los resultados obtenidos en cualquier ensayo se consideren v lidos se deben cumplir las siguientes co
18. lymphotropic virus type positivity in blood donors from Martinique French West Indies Transfusion 1999 39 1145 1149 Soldan SS Graf MD Waziri A Flerlage AN Robinson SM Kawaninshi T Leist TP Lehky TJ Levin MC and Jacobson S HTLV I II seroindeterminate western blot reactivity in a cohort of patients with neurological disease J Infect Dis 1999 180 685 694 MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd 2 Pioneer Place Singapore 627885 Tel 65 6775 0008 Fax 65 6774 6146 Correo electr nico enquiry_ap Wmpbio com Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D 66386 St Ingbert Alemania Tel 49 68 94 58 1020 Fax 49 68 94 58 1021 Correo electr nico info mt procons com Oficinas regionales MP Biomedicals SAS Parc d Innovation BP 50067 67402 Illkirch Cedex France Tel 33 388 67 4607 Fax 33 388 67 5420 Correo electr nico custserv eurOmpbio com Patente en EE UU 5 066 579 5 614 366 5 763 572 5 814 441 5 871 933 5 643 714 Patente en Australia 613350 667189 690540 Patente en Canad 1337799 Patente en Europa 0395634 Patente en Jap n 2559482 12
19. mo seronegativos No obstante resulta necesario extremar las precauciones cuando se obtengan patrones dudosos en muestras procedentes de consumidores de drogas por v a intravenosa donantes de sangre de zonas end micas o pacientes con enfermedades neurol gicas kk 4 Evite la contaminaci n microbiana de los reactivos al abrirlos y al extraer partes al cuotas de los viales o frascos originales ya que ello reducir a de forma prematura el periodo de validez de los kits y dar a lugar a resultados err neos Al extraer partes al cuotas de los viales utilice t cnicas as pticas como pipetas o puntas de pipeta desechables 5 Los controles del kit deben analizarse al mismo tiempo que las muestras cl nicas en cada serie de an lisis 6 Para evitar la contaminaci n cruzada use una punta de pipeta nueva para cada al cuota de la muestra 7 Para obtener resultados ptimos dispense todos los reactivos mientras todav a est n fr os y vu lvalos a guardar a una temperatura de entre 2 C y 8 C lo antes posible 8 Se aconseja lavar el material de vidrio que se vaya a utilizar para los reactivos con cido clorh drico 2 M y aclararlo bien con agua destilada o desionizada antes de usarlo 9 Utilice s lo agua destilada o desionizada de calidad reactivo para diluir los reactivos 10 Todos los reactivos deben mezclarse bien antes de su uso 11 Lasoluci n del conjugado de trabajo el tamp n de lavado diluido y
20. muestras de suero o plasma con EDTA heparina o citrato s dico Antes de guardar las muestras verifique que se hayan separado por centrifugaci n los co gulos O las c lulas sangu neas Las muestras deben conservarse a una temperatura de entre 2 C y 8 C si el an lisis se va a llevar a cabo en los 7 d as posteriores a la extracci n o congelarse a una temperatura de al menos 20 C si el an lisis se va a retrasar m s de 7 d as Es preferible utilizar muestras transparentes y no hemolizadas Las muestras muy lip micas ict ricas o contaminadas por part culas deben filtrarse 0 45 um o centrifugarse antes del ensayo Las muestras pueden estar inactivadas pero esto no es un requisito para el rendimiento ptimo del an lisis Para llevar a cabo la inactivaci n proceda como se explica a continuaci n 1 Afloje la tapa del recipiente que contiene la muestra 2 Desactive la muestra calent ndola a 56 C durante 30 minutos al ba o Mar a 3 Deje enfriar la muestra antes de volver a ajustar la tapa 4 La muestra puede conservarse congelada hasta el an lisis Se recomienda no someter la muestra a ciclos repetidos de congelaci n y descongelaci n MATERIAL ADICIONAL NECESARIO NO SUMINISTRADO e Agua destilada o desionizada e Guantes desechables Plato basculante con velocidad de balanceo de entre 12 y 16 oscilaciones por minuto e inclinaci n de 5 10 para lavar las membranas uniformemente
21. n lisis complementarios que se utilizan con frecuencia son las tiras de Western blot que incluyen ant genos v ricos naturales del HTLV I Sin embargo dada la ausencia de ant genos naturales de la envoltura en el Western blot para HTLV I cl sica suele ser necesario utilizar m todos de radioinmunoprecipitaci n para confirmar con mayor certeza la presencia de anticuerpos frente al HTLV I II Para distinguir entre las seropositividades para HTLV I y las seropositividades para HTLV II se deben realizar m s pruebas como p ptido espec fico ELISA o PCR Por tanto resulta clara la necesidad de disponer de an lisis serol gicos complementarios sencillos pero a la vez espec ficos y sensibles con los que sea posible obtener una confirmaci n r pida y adem s diferenciar entre las muestras seropositivas para el HTLV y las muestras seropositivas para el HTLV II En el ensayo HTLV BLOT 2 4 de MP Diagnostics se han mejorado la sensibilidad y la especificidad tanto para la confirmaci n como para la diferenciaci n de las seropositividades para HTLV I y para HTLV II Para ello hemos incorporado la MTA 1 una prote na recombinante exclusiva de la envoltura del HTLV I rgp46 la K55 una prote na recombinante exclusiva de la envoltura del HTLV II rgp46 11 y la GD21 una prote na recombinante epit pica com n pero espec fica de la envoltura de ambos virus Cada tira incluye tambi n un control interno de adici n de muestras
22. ndiciones 1 CONTROL NO REACTIVO No deben observarse bandas v ricas espec ficas de HTLV 1 11 rgp46 1 rgp46 II ni GD21 en la tira de control no reactivo La banda del control de suero anticuerpos anti IgG humana debe ser visible 2 CONTROL REACTIVO FUERTE I La banda del control de suero y todas las bandas relevantes del peso molecular del HTLV 1 Il deben ser evidentes Las bandas relevantes del HTLV I que deben estar presentes son p19 p24 gp46 rgp46 y GD21 Tenga en cuenta que la banda de la gp46 est esparcida 3 CONTROL REACTIVO FUERTE ll La banda del control de suero y todas las bandas relevantes del peso molecular del HTLV 1 Il deben ser evidentes Las bandas relevantes del HTLV que deben estar presentes son p24 GD21 y rgp46 l1 1 Evite la contaminaci n microbiana de los reactivos al abrirlos y al extraer partes al cuotas de los viales o frascos originales 2 No pipetee con la boca 3 Manipule las muestras las tiras de nitrocelulosa el control reactivo fuerte el control reactivo fuerte II y los controles no reactivos como si fueran potencialmente infecciosos 4 Use bata de laboratorio y guantes desechables mientras realiza el ensayo Deseche los guantes en bolsas para residuos biopeligrosos L vese bien las manos al finalizar 5 Es muy aconsejable que este ensayo se lleve a cabo en una c mara de bioseguridad 6 Mantenga el material alejado de alimentos y bebidas 7 En caso de accidente o c
23. ng Staal F and Papas TS Diagnostic potential for human malignancies of bacterially produced HTLV I envelope protein Science 1984 226 1094 1097 Hadlock KG Goh CJ Bradshaw PA Perkins S Lo J Habbaz RK Kaplan J and Foung SKH Delineation of an immunodominant and highly HTLV specific epitope within the HTLV I transmembrane glycoprotein Blood 1995 68 4 1392 1399 Varma M Rudolph D Knuchel M Switzer W Hadlock KG Velligan M Chan L Foung SKH Lal RB Enhanced specificity of truncated transmembrane protein for serologic confirmation of HTLV I and HTLV II infection by Western Blot assay containing recombinant envelope glycoproteins J Clin Micro 1995 33 12 3239 3244 Lillehoj EP Alexander SS Dubrule CJ Wiktor S Adams R Thi A Manns CC and Blattner WA Development and evaluation of a human T Cell leukemia virus type serologic confirmatory assay incorporating a recombinant envelope polypeptide J Clin Microbiol 1990 28 2653 2658 Lal RB Brodine SK Coligan JE and Roberts CR Differential antibody responsiveness to p19 gag results in serological discrimination between human T lymphotropic virus type and type Il J Med Virol 1991 1 232 236 Hjelle B Cyrus S Swenson S and Mills R Serologic distinction between human T lymphotropic virus HTLV type and HTLV type Il Transfusion 1991 31 731 736 Madeleine MM Wiktor SZ Goedert Jl Manns A Levine PH Biggar RJ
24. nticuerpos se unen a las prote nas del HTLV I II de las tiras Las tiras se lavan para eliminar los productos no unidos y los anticuerpos que se unen espec ficamente a las prote nas del HTLV se pueden visualizar mediante una serie de reacciones con anticuerpos de cabra anti IgG humana conjugados con fosfatasa alcalina y el sustrato BCIP NBT La sensibilidad de este m todo es suficiente como para detectar en el suero o el plasma cantidades nfimas de anticuerpos frente al HTLV PREPARACI N DE LOS REACTIVOS 1 TAMP N DE LAVADO DILUIDO a El TAMP N DE LAVADO DILUIDO debe estar reci n preparado b Diluya 1 volumen de TAMP N DE LAVADO CONCENTRADO 20X con 19 vol menes de agua de calidad reactivo Mezcle bien 2 TAMP N DE BLOTTING a Reconstituya cada frasco de TAMP N DE BLOTTING LIOFILIZADO con 100 ml de agua de calidad reactivo Mezcle bien para que se disuelva Este TAMP N DE BLOTTING RECONSTITUIDO es estable durante 6 semanas si se conserva a 2 C 8 C El TAMP N DE BLOTTING debe estar reci n preparado A ada 1 g de POLVO DE BLOTTING por cada 20 ml del TAMP N DE BLOTTING RECONSTITUIDO preparado en el paso anterior 2 a Agite hasta que el polvo se disuelva por completo c Agite de nuevo antes de dispensar la mezcla 3 3 SOLUCI N DEL CONJUGADO DE TRABAJO Nota prepare la soluci n en un recipiente o vaso de precipitado de polipropileno a LA SOLUCI N DEL CONJUGADO DE TRABAJO debe est
25. ontacto con los ojos l veselos inmediata y abundantemente con agua y acuda a un m dico 8 Acuda a un m dico de inmediato si se ingiere material contaminado o si ste entra en contacto con heridas abiertas u otras lesiones de la piel 9 Limpie de inmediato los vertidos de material potencialmente infeccioso con papel absorbente y lave la zona contaminada con una soluci n de hipoclorito s dico al 1 antes de reanudar el trabajo El hipoclorito s dico no debe utilizarse para vertidos que contengan cido a menos que se seque la zona previamente con papel absorbente Para su eliminaci n el material utilizado incluidos los guantes desechables debe tratarse como material potencialmente biopeligroso No utilice el autoclave para el material que contenga hipoclorito s dico 10 Esterilice en autoclave todos los materiales usados y contaminados a 121 C y 15 psi durante 30 minutos antes de desecharlos Otra opci n consiste en descontaminar los materiales con una soluci n de hipoclorito s dico al 5 durante 30 60 minutos antes de desecharlos en bolsas para residuos biopeligrosos 11 Descontamine todos los productos qu micos y reactivos usados a adi ndoles un volumen de hipoclorito s dico suficiente como para conseguir una concentraci n final de al menos el 1 D jelos apartados durante 30 minutos para lograr una descontaminaci n eficaz 12 Se desaconseja la reutilizaci n de las bandejas de incubaci n PRECAUCIONES A
26. os de la tira no se ver afectada COMPONENTES DEL KIT Descripci n del componente TIRAS DE NITROCELULOSA Incorporadas con lisado viral de HTLV I ant genos recombinantes de envuelta y una banda de control de adici n de suero anti IgG humana Mant ngalas secas y alejadas de la luz coNTROL CONTROL NO REACTIVO A Suero humano normal inactivado no reactivo para VHC VIH 1 2 HTLV I II ni HBsAg Contiene azida s dica y timerosal como conservantes conmo CONTROL REACTIVO FUERTE Suero humano inactivado con una concentraci n elevada de anticuerpos frente al HTLV I y no reactivo para VHC VIH 1 2 ni HBsAg Contiene azida s dica y timerosal como conservantes controL u CONTROL REACTIVO MA FUERTE II Suero humano inactivado con una concentraci n elevada de anticuerpos frente a HTLV II y no reactivo para VHC VIH 1 2 ni HBsAg Contiene azida s dica y timerosal como conservantes sur ryo stock TAMP N DE BLOTTING LIOFILIZADO Para reconstituir con agua de calidad reactivo Tamp n Tris con prote nas animales y no animales termoinactivadas Contiene timerosal como conservante sur wass zxx Y TAMP N DE LAVADO CONJUGATE CONCENTRADO 20x Tris con Tween 20 contiene timerosal como conservante CONJUGADO Anticuerpo de cabra anti IgG humana conjugado con fosfatasa alcalina Procedimiento 1 Utilizando unas pinzas y con sumo cuidado extraiga del t
27. ubo la cantidad de TIRAS necesaria y coloque cada tira en su pocillo con el n mero hacia arriba Incluya tiras para los controles reactivo fuerte reactivo d bil y no reactivo A ada 2 ml de TAMP N DE LAVADO DILUIDO a cada pocillo Incube las tiras durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente 25 3 C en un plato basculante velocidad 10 14 oscilaciones por minuto Extraiga el tamp n por aspiraci n A ada 2 ml de TAMP N DE BLOTTING a cada pocillo A ada 20 ul de suero de los pacientes o de controles seg n corresponda en cada uno de los pocillos Cubra la bandeja con la tapa suministrada e incube durante 1_hora a temperatura ambiente 25 3 C en el plato basculante Destape la bandeja con cuidado para evitar salpicaduras y el mezclado de las muestras Incline la bandeja para aspirar la mezcla de los pocillos Cambie las puntas del aspirador entre muestras para evitar la contaminaci n cruzada Lave 3 veces cada tira con 2 ml de TAMPON DE LAVADO DILUIDO dejando que se empapen durante 5 minutos en el plato basculante entre los lavados A ada 2 ml de SOLUCI N DEL CONJUGADO DE TRABAJO a cada pocillo Cubra la bandeja e incube durante 1 hora a temperatura ambiente 25 3 C en el plato basculante Aspire el CONJUGADO de los pocillos Lave como en el paso 8 A ada 2 ml de SOLUCI N SUSTRATO a cada pocillo Cubra la bandeja e incube durante 15 minutos en el plato b
28. ultados del HTLV BLOT 2 4 de MPD con este panel fueron comparados con los del inmunoensayo en l nea 2 LI 2 como sigue Interpretaci n M todo HTLV I HTLV II No Falso Total tipable NEG HTLV BLOT 26 6 0 0 32 2 4 de MPD LI 2 21 6 4 1 32 El HTLV BLOT 2 4 de MPD identifica correctamente las muestras positivas de HTLV dando una sensibilidad gt 99 9 con este panel Con el kit de comparaci n LI 2 la sensibilidad obtenida fue del 96 9 Especificidad Un total de 200 muestras de donantes de sangre fueron probadas resultando en una especificidad del 92 5 15 muestras fueron indeterminadas y no hubo resultados positivos falsos Suero de control 0 rgp46 l rgp46 ll IEH p53 gp46 0 G p36 p32 p28 p26 p24 p19 E E EI E l E TE MIL 1 GD21 Bandas v ricas espec ficas tal y como se ven con a Un suero con infecci n doble HTLV I II Si se incluyen 150 muestras cl nicas 50 muestras de embarazadas 50 potencialmente interferentes 10 de cada ict ricas hemolizadas triglic ridos lip micas prote nas totales y 73 muestras con riesgo potencial de reacci n cruzada TB Helicobactor pylori HEV Dengue HBV HCV HIV 1 HIV 2 la especificidad global fue del 89 2 461 517 56 muestras fueron indeterminadas y no hubo resultados positivos falsos 6 muestras fueron positivas confirmadas como verdaderas con otro test confirm
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