PapilloCheck® Manual de instrucciones
Contents
1. Otros consumibles necesarios e Agua grado PCR Agua destilada o desionizada Guantes de un solo uso Otro equipo necesario e Microcentr fuga para microtubos de 1 5 y 2 ml Centr fuga para tubos de polipropileno de 50 ml por ejemplo BeckmanCoulter centr fuga Allegra X 22 rotor de ngulo fijo C0650 o centr fuga para portaobjetos por ejemplo Labnet Slide Spinner VWR International centr fuga Galaxy MiniArray Microcentr fuga para microtubos individuales de 0 2 ml o bandas PCR de 8 tubos por ejemplo Labnet centr fuga Spectrafuge Mini e Termociclador de PCR GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems o Veriti 96 Well Thermal Cycler Applied Biosystems Ba o Mar a 50 C e Micropipetas diferentes tama os entre 1 y 1000 pl e Multipipeta de 8 canales rango 5 50 ul por ejemplo Brand Transferpette 8 Brand Pipeteador para pipetas de vidrio y pl stico Agitador Vortex Gradillas para diferentes microtubos Otro hardware necesario e PC consulte los requisitos del sistema en el Manual de instrucciones de CheckScanner y el software CheckReport Para realizar el procedimiento de lavado de PapilloCheck se necesitan tres recipientes de lavado oCheck gt Solamente necesario en combinaci n con n de cat logo 515 050 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 3 TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO El transporte del equipo de ensayo Pap2. SAS Tone TO HPV DNA Chip PapilloCheck Manual de instrucciones Equipo de diagn stico para la genotipificaci n de los tipos del virus del papiloma humano 6 11 16 18 31 33 35 39 40 42 43 44 55 45 51 52 53 56 58 59 66 68 70 73 82 en muestras cervicouterinas REF 465 060 Para uso diagn stico in vitro Revisi n BQ 013 07 nicamente por parte de personal de laboratorio profesional Agosto de 2011 Greiner Bio One GmbH Maybachstr 2 72636 Frickenhausen Alemania Tel fono 49 0 7022 948 0 Fax 49 0 7022 948 514 o info gde gbo com www gbo com bioscience g reiner b IO O0ne GLOSARIO DE S MBOLOS en de fr es pt nl da SV pl no el tr Store in the dark Im Dunkeln lagern stocker labri de la lumi re Conser var en un lugar oscuro Conserva re al buio Conservar num local escuro Donker bewaren Opbeva res m rkt F rvaras m rkt Przechow ywa w ciemno ci Oppbeva res m rkt ArroOnke eral OTA OKOTEIV Karanlik yerde saklayiniz Use by Mindes tens haltbar bis Date limite de conser vation jusqu au A utilizar preferi blemente antes de Da utilizzare entro e non oltre A utilizar prefer velmente antes de Tenminste houdbaar tot Anvendes senest Sista f r bruknings dag Termin zydatno ci holdbar til TO AY TEPO SIaTNpelTal Son kullanma tarihi
3. Consult Instruc tions For Use Vor Gebrauch Anwei sung lesen Lire les in structions avant utilisation Antes de usar lea las instruccio nes Leggere le istruzi oni prima dell uso Antes de usar leia as inst ruc es Gebruik saanwij zing lezen Lees brugsan visningen L s bruk sanvisnin gen f re anv nd ning Przed uzyciem przeczyta instrukcj Les bruksan visning f r bruk Trpiv TNV xprjon oiap ore TIG o ny gg Kullanma dan nce talimati okuyun PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 Catalog Number Katalog nummer Num ro de r f rence N mero de cat lo go Numero catalogo N mero de cat lo go Catalo gusnum mer Katalog nummer Katalog nummer Numer katalo gowy katalog nummer ApiOu G KaraA you Katalog numarasi Manufac turer Hersteller Fabricant Fabri cante Produt tore Fabri cante Fabrikant Producent Tillverkare Producent produsent Mapaywy s retici firma In Vitro Dianostic Medical Device In Vitro Diagnos tika Medi zinprodukt Produit m di cal de diagnostic in vitro Producto medicinal de diagn sti co in vitro Dispositivo medico diagnosti co in vitro Producto medicinal de diagn sti ca in vitro In vitro diag nostisch medisch product In vitro meskdicin doag
4. Petry KU Kjaer SK Iftner T J Med Virol 2010 Apr 82 4 605 15 40 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 12 PROTOCOLO BREVE DE PAPILLOCHECK 12 4 Sala 2 PCR Preparaci n de la mezcla de reacci n Diluya la uracil N glucosilasa 1 200 en agua grado PCR m gt Mezcle la diluci n de UNG con cuidado m Prepare la mezcla de reacci n para la cantidad necesaria de reacciones PCR 1 13 26 39 52 reacci n reacciones reacciones reacciones reacciones 1 2 3 4 microchip microchips microchips microchips PapilloCheck PCR MasterMix H 29 44 pl 112 2 yl 1029 6 yl Polimerasa HotStar Taq 0 2 ul 2 6 ul 5 U pl Uracil N glucosilasa diluci n de 1 200 0 005 U pl p M O T O C O L O Volumen total antes de a adir el ADN de muestra 21 yl 273 yl 819 ul 1092 ul Mezcle con cuidado la mezcla de reacci n Divida en al cuotas la mezcla de reacci n a ada 21 pl de la mezcla de reacci n para cada reacci n PCR en un microtubo para PCR de 0 2 ml de una banda PCR ul Mu PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 12 2 Sala 2 PCR Adici n de ADN mensajero reacci n PCR A ada 5 ul de ADN mensajero para cada reacci n PCR m M zclelo bien Inicie la reacci n PCR con el programa del termociclador preparado Tiempo Temp C N de ciclos 20
5. degradaci n mediante UNG La UNG divide el producto de la PCR en los sitios donde se ha incorporado un residuo de desoxiuridilato Los productos de la PCR divididos no se amplificar n en una reacci n subsiguiente Por tanto se puede utilizar un tratamiento de UNG para eliminar la contaminaci n cruzada de anteriores reacciones PCR Diluya la uracil N glucosilasa 1 200 en agua grado PCR Use una nueva diluci n de UNG para cada reacci n PCR PapilloCheck preparada consulte el cap tulo 8 2 3 No reutilice la UNG diluida mw Mezcle la diluci n de UNG con cuidado para hacerlo m zclela con un Vortex durante 2 segundos y despu s centrif guela o bien pipet ela arriba y abajo varias veces La concentraci n original de uracil N glucosilasa es 1 U ul Por consiguiente la concentraci n de la diluci n es 0 005 U yl El equipo de ensayo PapilloCheck se ha validado con uracil N glucosilasa de Fermentas consulte el cap tulo 2 Es obligatorio usar esta enzima para lograr el rendimiento establecido im A ada 1 ul de esta diluci n a cada reacci n PCR PapilloCheck consulte el cap tulo 8 2 3 Tabla 3 Esta cantidad es suficiente para eliminar la contaminaci n cruzada de PCR Tenga cuidado de no usar una soluci n de UNG con mayor concentraci n ya que esto podr a tener un efecto negativo sobre el rendimiento de la PCR lo que reducir a la sensibilidad de PapilloCheck En general para el tratamiento de UNG la mezcl
6. procesamiento del microchip lo que incluye la calidad de la muestra y la extracci n de ADN control de muestra la calidad de la reacci n PCR control de PCR la eficiencia de la hibridaci n control de hibridaci n as como la homogeneidad de las marcas y la calidad de impresi n control de orientaci n y control de impresi n Adem s de la presencia o ausencia de los tipos de VPH el software CheckReport muestra de forma autom tica tanto los valores correspondientes de los controles como los tipos de VPH detectados en un informe detallado Para la lectura de los diferentes controles se utilizan ambas longitudes de onda de excitaci n de CheckScanner Para el control del rendimiento del ensayo control de muestra y de PCR se usa el canal rojo longitud de onda de excitaci n de 635 nm mientras que la calidad de la hibridaci n y el microchip control de hibridaci n orientaci n e impresi n se eval a en el canal verde longitud de onda de excitaci n de 532 nm Control de muestra PapilloCheck controla la calidad de la muestra y o la extracci n de ADN mediante la amplificaci n de un fragmento de una copia del gen humano ADAT1 adenosina desaminasa espec fica del ARNt humano1 Si hay presente ADN humano en una cantidad adecuada en el ADN extra do de la muestra cervicouterina se genera una se al fluorescente en las marcas de control de muestra Si la amplificaci n de ADAT1 es insuficiente o inexistente el software Chec
7. a partir de citolog as cervicouterinas humanas con uno de los siguientes sistemas o medios de toma de muestras Equipo de toma de muestras PapilloCheck Greiner Bio One Frickenhausen Alemania e PreservCyt Hologic Bedford MA EE UU Surepath BD Franklin Lakes NJ EE UU e STM Qiagen Hilden Alemania Para obtener m s informaci n sobre los sistemas de extracci n de ADN o los medios de transporte adecuados p ngase en contacto con el distribuidor local de Greiner Bio One o visite el sitio web de Greiner Bio One www gbo com bioscience biochips download PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 Cap tulo 8 1 2 Extracci n de ADN ck oChe f action Kit DNA Ext Cap tulo 8 2 PCR Cap tulo 8 3 2 Hibridaci n Cap tulo 8 3 3 Lavado y secado Cap tulo 8 4 Escaneo y evaluaci n 9C Figura 4 Resumen de los diferentes pasos de trabajo de PapilloCheck PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 8 1 2 Extracci n de ADN La extracci n de ADN no forma parte del equipo de ensayo PapilloCheck La extracci n de ADN antes del an lisis PapilloCheck se debe realizar con el equipo de extracci n de ADN oCheck tambi n suministrado por Greiner Bio One consulte la informaci n sobre pedidos en el cap tulo 2 Siga las instrucciones de uso detenidamente cuando utilice el equipo de extracci n de ADN oChec
8. de humedad Greiner Bio One suministra una c mara de hibridaci n especializada para el an lisis PapilloCheck consulte el cap tulo 2 w Incube la cantidad necesaria de microchips PapilloCheck en la c mara de hibridaci n preparada a temperatura ambiente 20 25 C durante al menos 10 minutos El soporte de portaobjetos magn tico de la c mara de hibridaci n contiene un im n solamente en uno de sus extremos Si se van a hibridar en paralelo menos de cuatro microchips PapilloCheck tenga cuidado de llenar el soporte con microchips PapilloCheck empezando desde el lado opuesto al im n De lo contrario los microchips PapilloCheck no quedar n sumergidos durante el procedimiento de lavado Prepare las soluciones de lavado II y III seg n las siguientes instrucciones Preparaci n de las soluciones de lavado II y IIl Prepare la mezcla de soluci n de lavado para las soluciones de lavado l Il y Ill adecuadas para el n mero de microchips PapilloCheck que se vayan a analizar como se muestra en la tabla 4 Divida tres al cuotas con el mismo volumen de mezcla de soluci n de lavado en tres recipientes de lavado oCheck diferentes y etiqu telas como soluci n de lavado II y IIl Cada recipiente de lavado oCheck contiene una escala grabada que indica la cantidad correcta de soluci n de lavado necesaria para un m ximo de 4 microchips Use esta escala para comprobar la cantidad de tamp n Precaliente la s
9. del equipo de extracci n de ADN adecuado o agua de categor a PCR w Mezcle exhaustivamente la mezcla de reacci n para hacerlo m zclela con un Vortex durante 2 segundos y despu s centrif guela o bien pipet ela arriba y abajo varias veces Divida la mezcla de reacci n en al cuotas pipeteando 21 ul de la mezcla de reacci n para cada reacci n PCR en un microtubo para PCR fino de 0 2 ml Realice la adici n del ADN mensajero en una zona de trabajo diferente a la de la preparaci n de la mezcla de reacci n consulte el cap tulo 7 2 im A ada 5 pl del ADN extra do a cada reacci n PCR y m zclelo con un Vortex durante 2 segundos y despu s centrif guelo o bien pipet elo arriba y abajo varias veces El volumen total de una reacci n PCR es 26 ul m Coloque los microtubos en el termociclador e inicie la reacci n PCR con el programa del termociclador descrito en el cap tulo 8 2 1 Tabla 2 Una vez completada la PCR se deber an usar los productos de la amplificaci n inmediatamente para la hibridaci n o bien se deber an almacenar a oscuras a 20 C durante una semana PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 Tabla 3 Preparaci n de la reacci n PCR PapilloCheck 1 reacci n 13 reacciones 26 reacciones 39 reacciones 52 reacciones 1 microchip 2 microchips 3 microchips 4 microchips PapilloCheck PCR MasterMix 251 4 yl 514 8 yl 712 2 yl 1029 6 ul Polimera
10. en la soluci n de lavado en todo momento Lave el microchip durante 60 segundos en la soluci n de lavado ll a 50 C moviendo el soporte de portaobjetos arriba y abajo con fuerza Lave el microchip a temperatura ambiente 20 25 C en la soluci n de lavado Ill movi ndolo r pidamente arriba y abajo durante 10 segundos Inmediatamente retire el l quido de la superficie del microchip mediante centrifugado Si se utiliza una microcentr fuga especial para micromatrices centrif guelo durante 1 minuto Si se usa una centr fuga apta para tubos de 50 ml coloque cada microchip PapilloCheck lavado en un tubo de 50 ml y centrif guelo a temperatura ambiente durante 3 minutos a 500 g El microchip PapilloCheck est ahora listo para escanearse lo que se deber a hacer de inmediato Para limpiar los recipientes de lavado oCheck enju guelos varias veces en agua despu s de cada procedimiento completo de lavado y secado PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 29 Primer paso de lavado Retire con cuidado el soporte de portaobjetos magn tico de la c mara de hibridaci n m Coloque r pidamente el soporte de portaobjetos en el recipiente de lavado oCheck con la soluci n de lavado Encaje el asa oCheck Lave el microchip o los microchips PapilloCheck en la soluci n de lavado a temperatura ambiente durante 10 segundos subiendo y bajando el soporte de portaobjetos Segundo paso de l
11. for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older Int J Cancer 124 3 516 20 10 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 6 3 Principio del ensayo PapilloCheck es un equipo de ensayo basado en micromatrices para la detecci n y la genotipificaci n de un fragmento del gen E1 del genoma del virus del papiloma humano VPH El procedimiento del ensayo se resume en la figura 1 Antes del an lisis PapilloCheck se debe extraer ADN de una muestra de citolog a cervicouterina La toma de muestras y la extracci n de ADN no forman parte del equipo de ensayo PapilloCheck Greiner Bio One tambi n ofrece productos especializados para la toma de muestras equipo de toma de muestras PapilloCheck y la extracci n de ADN equipo de extracci n de ADN oCheck95 se deben adquirir por separado consulte la informaci n sobre pedidos en el cap tulo 2 Despu s de la extracci n de ADN gen mico humano y v rico de una muestra cervicouterina se amplifica un fragmento de 350 bp del gen E1 v rico mediante la reacci n en cadena de la polimerasa PCR en presencia de un conjunto de cebadores espec ficos del VPH En la misma reacci n se amplifica un fragmento de una copia del gen humano ADAT1 adenosina desaminasa espec fica del ARNt humano1 con el fin de controlar la presencia de material de muestra humano en la muestra cervicouterina control de m
12. min of C 1 15 min 95 C 1 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 p M O T O C O L O ul Uu Comience los preparativos al menos 30 minutos antes de la hibridaci n Disuelva los posibles precipitados en los tampones de lavado e hibridaci n y mezcle bien Prepare la mezcla de soluci n de lavado para la cantidad de microchips PapilloCheck que se vayan a analizar Agua destilada o desionizada 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml Tamp n A PapilloCheck 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml Tamp n B PapilloCheck 1 75 ml 3 5 ml 5 25 ml 7 ml Volumen total 155 7bml 311 50 mi 467 25 ml 623 ml Divida al cuotas de la mezcla de soluci n de lavado en tres recipientes de lavado oCheck Precaliente la soluci n de lavado Il en un ba o Mar a a 50 C Incube la cantidad de microchips PapilloCheck que se vayan a analizar en la c mara de hibridaci n preparada a temperatura ambiente Mezcle los productos de la PCR y centrif guelos brevemente Mezcle el tamp n de hibridaci n y centrif guelo brevemente DE mb m m m m Mezcle 30 ul de tamp n de hibridaci n PapilloCheck con 5 ul de producto de PCR M zclelo bien y centrif guelo brevemente Transfiera 25 pl de la mezcla de hibridaci n a cada pocillo del microchip PapilloCheck usando una multipipeta Evite la formaci n de burbujas de aire In
13. n BQ 013 07 Agosto de 2011 8 3 2 Hibridaci n La hibridaci n se debe realizar a temperatura ambiente 20 25 C Los pasos de trabajo del principio para hibridar los productos de PCR de la reacci n PCR PapilloCheck en el microchip PapilloCheck se muestran en la figura 5 mw Mezcle los productos de la PCR antes de usarlos Centrif guelo brevemente Si los productos de la PCR se almacenaron a 20 C hasta la hibridaci n primero descong lelos antes de mezclarlos y despu s contin e segun lo descrito mw Mezcle el tamp n de hibridaci n en el Vortex antes de usarlo Centrif guelo brevemente Mezcle 30 pl del tamp n de hibridaci n PapilloCheck en un microtubo nuevo de una banda PCR con 8 tubos con 5 ul del producto de la PCR mezcl ndolo con un Vortex o bien pipete ndolo arriba y abajo varias veces u Centrif guelo brevemente Transfiera 25 ul de la mezcla de hibridaci n a cada pocillo del microchip usando los seis canales de una multipipeta Evite la formaci n de burbujas de aire Se recomienda procesar seis muestras en paralelo usando una multipipeta de 8 canales y bandas PCR con 8 tubos consulte la figura 5 Esto aumenta la eficiencia y velocidad de la manipulaci n lo que reduce el riesgo de evaporaci n Si se va a procesar m s de un portaobjetos al mismo tiempo es obligatorio usar una multipipeta para lograr el tiempo correcto de hibridaci n Si es posible hibride los 12 pocillos del microchip Si
14. n de polvo y otras part culas en la superficie del microchip No toque la zona de hibridaci n en la superficie del microchip El nico lado del microchip destinado a la hibridaci n es el etiquetado No utilice rotuladores para identificar los microchips de ADN ya que pueden producir una fluorescencia no espec fica en el microchip Las matrices de ADN son exclusivamente de un solo uso No se pueden reutilizar los microchips hibridados Almacene los microchips sin usar en el envase original dentro de la bolsa con cierre que contiene el desecante 7 3 3 Precauciones generales Este equipo est destinado nicamente al diagn stico in vitro y debe ser utilizado exclusivamente por personal formado en las pr cticas de laboratorio para el diagn stico in vitro Cuando reciba el equipo compruebe que los componentes no est n da ados Si uno de los componentes estuviera da ado por ejemplo frascos de tamp n p ngase en contacto con su distribuidor local de Greiner Bio One No utilice los componentes da ados del equipo ya que podr a obtener unos resultados deficientes No utilice el equipo de ensayo PapilloCheck despu s de la fecha de caducidad No utilice reactivos caducados No mezcle reactivos procedentes de lotes diferentes Use nicamente los reactivos y el equipo proporcionados con el equipo y aquellos recomendados por el fabricante Se debe realizar la calibraci n y el mantenimiento de las micropipetas el ba o Mar a
15. nose apparat In vitro medicinsk doag nostisk apparatur Diag nostyka in vitro Produkt yw in vitro di agnostisk medisinsk utstyr In vitro OIQYVOJOTIK IATpIK TIpol vTa In vitro diagnostik tibbi tani r n Tempe rature limitation Tempera turbegren zung Limite de temp ra ture Limitaci n de tempera tura Limitazio ne tempe ratura Limita o de tempera tura Tempera tuurbeper king Tempera turbegra ens r Tempe ratur be gr nsning Ograni czenie tempera tury tempe raturbe grensning TTEpPIOpPIO O ppokpao ac Sicaklik s n rlamas Contents sufficient for lt n gt tests Inhalt ausrei chend f r lt n gt Tests Contenu suffisant pour lt n gt tests Contenido suficiente para lt n gt ensayos Contenuto sufficiente per test n Conte do suficiente para lt n gt ensaios Voldoen de inhoud voor lt n gt tests Indehol der nok til lt n gt test Inneh llet racker till lt n gt tester Zawarto wystarcza na lt n gt test w Innhold tilstrekke lig for lt n gt tester lepiex uevo APOKET y q lt n gt TEOT eri i lt n gt test i in yeter lidir Irritant Reizend irritant Irritante Irritante irritante Irriterend Lokalirri terende irriterande dra ni cy irriterende EPEBIOTIK Tahris edici Batch code Chargen b
16. y el bloque de calentamiento con regularidad El pipeteado de peque as cantidades de l quido en el intervalo de microlitros resulta dificultoso Por lo tanto realice el pipeteado con la mayor precisi n posible Para evitar la contaminaci n microbiana de los reactivos tenga cuidado al extraer al cuotas de los microtubos Todos los pasos de centrifugado deber an realizarse a temperatura ambiente 18 25 C PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 7 3 4 Seguridad en el trabajo e Extreme la precauci n al manipular las muestras biol gicas que contengan material de origen humano potencialmente infeccioso Para minimizar el riesgo de infecci n con material potencialmente infeccioso se recomienda trabajar en una cabina de flujo laminar hasta que complete la lisis de las muestras Manipule y elimine todas las muestras biol gicas como si pudieran transmitir agentes infecciosos No pipetee nunca las soluciones utilizando la boca No coma beba fume ni aplique productos cosm ticos en las zonas de trabajo e Evite el contacto directo con las muestras biol gicas y evite salpicarlas o pulverizarlas e Lleve siempre una bata de laboratorio guantes y gafas de seguridad cuando trabaje con muestras humanas L vese las manos de forma exhaustiva despu s de manipular muestras y reactivos PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 8 PROCEDIMIENTO DE PAPIL
17. 5 x 12 matrices Tamp n de hibridaci n 2 x 1000 yl 2 tampones A PapilloCheck 2x40 ml concentrado BUF A conc 1 tamp n B PapilloCheck 1x15ml concentrado BUF B conc 1 Un equipo de ensayo PapilloCheck es suficiente para el an lisis de 60 muestras 2 Contiene todos los componentes necesarios para PCR excepto Taq ADN polimerasa y uracil N glucosilasa 3 Un microchip PapilloCheck contiene 12 micromatrices PapilloCheck PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 2 CONSUMIBLES EQUIPO Y HARDWARE NECESARIOS Se recomienda el uso de PapilloCheck en combinaci n con los consumibles el equipo y el hardware enumerados nicamente por parte de personal profesional N de cat logo de Consumibles h Greiner Bio One Cantidad Equipo de ensayo PapilloCheck Equipo de toma de muestras PapilloCheck Equipo de extracci n de ADN Preparaci n con una columna oCheck Equipo de extracci n de ADN Preparaci n con banda de 8 columnas oCheck Puntas de filtro de micropipeta libres de desoxirribonucleasa est riles Puntas de filtro de 0 5 10 pl Puntas de filtro de 0 5 20 pl Puntas de filtro de 10 100 yl Puntas de filtro de 10 200 yl 465 060 465 070 515 040 515 050 765 288 174 288 172 288 739 288 Equipo de ensayo para 60 reacciones 10 muestras Equipo de ensayo para 50 preparaciones 12 x 8 preparaciones 96 960 96 960 96 960 96 960 Punt
18. A J van den Brule and C J Meijer 2004 POBASCAM a population based randomized controlled trial for implementation of high risk HPV testing in cervical screening design methods and baseline data of 44 102 women Int J Cancer 110 94 101 39 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 Con el fin de evaluar la prevalencia de los tipos de VPH detectados por PapilloCheck se cribaron citolog as cervicouterinas de 881 mujeres Todas las muestras cervicouterinas se tomaron en medio de toma de muestras STM Qiagen Hilden Alemania El m s com n fue el VPH 16 con una tasa de detecci n del 19 4 96 Los siguientes tipos m s frecuentes fueron VPH 31 VPH 39 VPH 51 y VPH 52 Las prevalencias para todos los tipos detectables se muestran en la tabla 7 Tabla 7 Prevalencia espec fica del tipo para tipos de VPH detectados por PapilloCheck Prevalencia con Genotipo de VPH PapilloCheck VPH 16 19 40 VPH 31 14 40 96 VPH 39 9 30 VPH 51 9 10 96 VPH 52 7 50 96 VPH 58 6 10 96 VPH 53 6 10 96 VPH 42 5 80 VPH 66 5 90 VPH 68 5 60 VPH 45 4 50 96 VPH 33 4 40 96 VPH 18 4 00 96 VPH 70 4 10 96 VPH 59 2 50 96 VPH 82 1 90 96 VPH 35 1 60 96 VPH 73 1 50 96 VPH 6 0 60 VPH 11 0 60 VPH 40 0 40 9 Evaluation of the performance of the novel PapilloCheck HPV genotyping test by comparison with two other genotyping systems and the HC2 test Schopp B Holz B Zago M Stubenrauch F
19. Biosystems e Veriti 96 Well Thermal Cycler Applied Biosystems Es absolutamente necesario usar uno de los termocicladores mencionados antes para lograr el rendimiento establecido El programa del termociclador de la PCR PapilloCheck se resume en la tabla 2 Tabla 2 Programa del termociclador para la PCR PapilloCheck Temp C N de ciclos 37 C 1 95 C 1 30s 45s Espera Adem s se deben establecer los siguientes par metros de ejecuci n en cada termociclador Para obtener una descripci n de c mo establecer estos par metros consulte el manual de instrucciones del termociclador en cuesti n GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems Establezca el volumen de reacci n en 26 pul la velocidad de incremento en 9600 y use la temperatura de tapa 103 C Veriti 96 Well Thermal Cycler Applied Biosystems Use la herramienta de conversi n de m todo Convert Method del termociclador Veriti 96 Well Thermal Cycler para introducir el programa de PCR PapilloCheck y elija el modo 9600 Emulation Mode Establezca el volumen de reacci n en 26 yl y la temperatura de tapa en 103 C PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 8 2 2 Tratamiento de uracil N glucosilasa UNG El PapilloCheck PCR MasterMix contiene dUTP que se incorpora a los productos de la amplificaci n durante la PCR PapilloCheck lo que convierte los productos de la PCR en susceptibles a la
20. HECKG 34 11 1 CARACTER STICAS DE RENDIMIENTO DE PapilloCheck eere 34 IR EE i1 E rm e 34 11 1 2 Especificidad anal tica Tipos de VPH ita 35 11 1 3 Especificidad anal tica Organismos no VPH oooooccnccnccnncncccncnnnnnnnnncnnonancnononnnnnnarnnonancnnnnnos 30 Tie oret sa 36 Que ROD QUINA e 37 TA A E ub n T E c RM M 38 11 5 Rendimiento cl nico de PapilloCheck 12seeeeeeeeee eene nnn nnne nnnm nnnm nns 39 12 PROTOCOLO BREVE DE PAPIEPOGHEGK Ta ra EE EI 41 12 1 Sala 2 PCR Preparaci n de la mezcla de reacci n eee eese eene enne 41 12 2 Sala 2 PCR Adici n de ADN mensajero reacci n PCR eeeseeeee eene eene nennen nns 42 12 3 Sala 3 Hibridaci n Preparaci n Reacci n de hibridaci n 43 12 4 Sala 3 Lavado y secado Escaneo y evaluaci n eeceeeeeeeeee eene eene nnne nnns Ad PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 1 CONTENIDO DEL EQUIPO Equipo de ensayo PapilloCheck Contenido Cantidad 5 PapilloCheck PCR MasterMix 5 x 300 yl PCR MasterMix 1 caja para portaobjetos PapilloCheck con 5 microchips PapilloCheck 2 PapilloCheck Caja para portaobjetos 5 x 12 matrices
21. LOCHECK En el siguiente cap tulo se describen con detalle los diferentes pasos de trabajo que dan como resultado un informe detallado que indica claramente la presencia o la ausencia de uno o varios de los 24 tipos de VPH detectables en cada muestra cervicouterina analizada La figura 4 muestra un resumen de los diferentes pasos de trabajo necesarios Tambi n indica el apartado correspondiente donde se describe el paso de ensayo espec fico Los pasos de trabajo se deben realizar en el orden indicado en este cap tulo Los pasos pr cticos espec ficos se indican con una flecha azul La toma de muestras la extracci n de ADN y el an lisis con el software CheckReport no forman parte del equipo de ensayo PapillloCheck Por tanto la descripci n de estos pasos de trabajo ofrecida en este cap tulo est abreviada Para obtener informaci n m s detallada consulte los manuales de instrucciones correspondientes por ejemplo del equipo de toma de muestras PapilloCheck el equipo de extracci n de ADN oCheck y el software CheckReport M 8 1 Toma de muestras y extracci n de ADN 8 1 1 Toma de muestras La toma de muestras no forma parte del equipo de ensayo PapilloCheck Greiner Bio One tambi n ofrece un equipo de toma de muestras especializado equipo de toma de muestras PapilloCheck 5 consulte la informaci n sobre pedidos en el cap tulo 2 PapilloCheck se ha validado con ADN preparado con el equipo de extracci n de ADN oCheck
22. Los siguientes organismos no VPH se han analizado con PapilloCheck 5 10 ng de ADN gen mico No se detectaron se ales positivas Acinetobacter baumannii Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter lwoffii Actinobacillus actinomycetemcomitans Serovar c Actinomyces odontolyticus Actinomyces viscosus Bacillus subtilis Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium breve Campylobacter concisus Campylobacter gracilis Campylobacter rectus Candida albicans Capnocytophaga gingivalis Capnocytophaga ochracea Capnocytophaga sputigena Citrobacter amalonaticus Citrobacter freundii Citrobacter freundii Citrobacter koseri Citrobacter koseri Clostridium difficile Clostridium perfringens Eikenella corrodens Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter sakazakii Enterococcus durans Enterococcus faecali Enterococcus faecium Escherichia coli Eubacterium nodatum Fusobacterium nucleatum Gardnerella vaginalis Hafnia alvei Kingella denitrificans Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Lactobacillus casei Lactobacillus crispatus Lactobacillus gasseri Lactobacillus iners Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus vaginalis Mogibacterium timidum Morganella morganii Mycoplama hominis Mycoplasma buccale Mycoplasma faucium Mycoplasma fermentans Mycoplasma genitalium Mycoplasma orale Mycoplasma pirum Mycoplasma salivrium Mycoplosma pneumoniae Neisseria elongata Neisseria gonorrhoeae Peptoniphilus asaccharolyticus X Pepto
23. a HotStarTag y la uracil N glucosilasa el PapilloCheck PCR MasterMix ya contiene todos los componentes necesarios para realizar la reacci n PCR tamp n de PCR MgCl dNTPs cebadores plantilla de control de PCR El equipo de ensayo PapilloCheck se ha validado con la polimerasa HotStarTaq de Qiagen consulte el cap tulo 2 Es obligatorio usar esta enzima para lograr el rendimiento establecido Idealmente la preparaci n de la mezcla de reacci n se debe realizar en un entorno con protecci n como una campana PCR para evitar la contaminaci n de la reacci n Prepare la mezcla de reacci n compuesta por PapilloCheck PCR MasterMix polimerasa HotStarTaq y uracil N glucosilasa para la cantidad necesaria de reacciones PCR seg n lo descrito en la Tabla 3 Para analizar varias muestras se debe preparar la mezcla de reacci n en un lote en la cantidad necesaria para todos los an lisis Para adaptarse a las variaciones de volumen durante el pipeteado se recomienda aumentar el n mero de reacciones n a tenor de 1 por cada microchip n 1 por ejemplo prepare un volumen de mezcla de reacci n para 13 reacciones de amplificaci n si se van a analizar 12 muestras consulte la tabla 3 Utilice siempre una ampolla de MasterMix para las reacciones de un microchip Se recomienda incluir un control negativo para cada lote de PapilloCheck PCR MasterMix preparado Se pueden usar como control negativo el tamp n de eluci n del ADN
24. a de la reacci n PCR se incuba durante 20 minutos a 37 C Despu s se inactiva la UNG con un paso de incubaci n adicional de 15 minutos a 95 C Estos dos pasos ya est n incorporados en la PCR PapilloCheck y se corresponden con los dos primeros pasos del programa del termociclador consulte la tabla 2 Durante el segundo paso 15 minutos a 95 C se producen tanto la inactivaci n de la uracil N glucosilasa como la activaci n de la polimerasa HotStarTag El sistema de UNG incorporado de la PCR PapilloCheck solamente eliminar la contaminaci n cruzada con productos de la PCR de reacciones PCR anteriores No se podr eliminar otro tipo de contaminaci n por ejemplo la que se produce durante la preparaci n de las muestras la extracci n de ADN o la adici n de la plantilla de PCR Por lo tanto es necesario seguir las instrucciones y las precauciones especiales para impedir la contaminaci n descritas en el cap tulo 7 5 La adquisici n de PapilloCheck va acompa ada de una licencia limitada bajo los n meros de patente de EE UU 5 035 996 5 683 896 5 945 313 6 287 823 y 6 518 026 y las patentes correspondientes en otros pa ses 6 Longo M C et al Use of uracil DNA glycosylase to control carry over contamination in polymerase chain reactions Gene 93 125 128 1990 22 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 8 2 3 Preparaci n de la reacci n PCR A excepci n de la polimeras
25. ada en el PC coincida con la indicada en el equipo PapilloCheck usado actualmente Si las versiones no coinciden actualice el software CheckReport La versi n m s reciente del software se puede descargar en el sitio web de Greiner Bio One www gbo com bioscience biochips download PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 31 9 SOLUCI N DE PROBLEMAS Si aparece uno de los siguientes mensajes de error durante el escaneo del microchip o si el an lisis PapilloCheck genera un error debido a controles espec ficos en el microchip proceda como se describe a continuaci n No dude en ponerse en contacto con el distribuidor local de Greiner Bio One si tiene alguna duda o experimenta dificultades al usar PapilloCheck PROBLEMA y causa Comentarios y sugerencias MENSAJE DE ERROR COULD NOT READ BARCODE NO SE PUDO LEER EL C DIGO DE BARRAS C digo de barras da ado Compruebe si hay da os en el c digo de barras Escriba el c digo de barras manualmente cuando aparezca la ventana correspondiente El microchip no se carg Compruebe la orientaci n del microchip y escan elo en la orientaci n correcta correctamente MENSAJE DE ERROR MISSING SPOTS FALTAN MARCAS ERROR EN EL CONTROL DE IMPRESI N O EN EL CONTROL DE ORIENTACI N Polvo en el microchip Repita la hibridaci n del producto o los productos de PCR en otro microchip Formaci n de burbujas de aire Repita la hibridaci n del produc
26. apilloCheck usando una multipipeta Cierre la c mara de hibridaci n e incube el microchip PapilloCheck durante exactamente 15 minutos a temperatura ambiente 20 25 C Figura 5 Pasos de trabajo del proceso de hibridaci n PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 28 8 3 3 Lavado y secado El equipo especializado suministrado por Greiner Bio One permite realizar el lavado en paralelo de hasta cuatro microchips PapilloCheck consulte el cap tulo 2 El equipo adicional necesario para procesar los microchips PapilloCheck se compone de tres recipientes de lavado oCheck y un asa para el soporte de portaobjetos magn tico de la c mara de hibridaci n Los diferentes pasos de trabajo se muestran en la figura 6 i gt i gt mi gt i gt IL i gt i gt Retire cuidadosamente el soporte de portaobjetos magn tico que contiene los portaobjetos hibridados de la c mara de hibridaci n Coloque el soporte de portaobjetos que contiene los portaobjetos directamente en el recipiente de lavado oCheck con la soluci n de lavado Aseg rese de que el lado magn tico est orientado hacia arriba Encaje el asa oCheck en el soporte de portaobjetos y comience el primero de los tres pasos de lavado Lave el microchip a temperatura ambiente 20 25 C en la soluci n de lavado movi ndolo r pidamente arriba y abajo durante 10 segundos Las matrices deben mantenerse sumergidas
27. as de filtro de 100 1000 pl 750 288 60 600 Microtubos libres de desoxirribonucleasa Microtubo de 1 5 ml 616 201 500 4000 Microtubo de 0 2 ml 683 201 500 1000 8 bandas PCR de 0 2 ml 673 210 125 1250 Tiras de tapa para 8 bandas PCR de 0 2 ml 373 270 125 1250 Tubo de polipropileno de 50 ml 210 261 25 450 Pipetas de pl stico para pipeteador Pipeta de 10 ml 607 180 o 607 160 Pipeta de 25 ml 760 180 o 760 160 Pipeta de 50 ml 786 180 o 768 160 1 Algunos de los tama os de puntas mencionados son opcionales seg n las micropipetas disponibles 2 En principio se recomienda el uso de las bandas PCR con 8 tubos Los microtubos individuales 0 2 ml son opcionales si no hay bandas disponibles Solamente necesario si no hay disponible una centr fuga para portaobjetos PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 N de cat logo de Greiner Bio One Cantidad CheckScanner 862 070 Equipo Software CheckReport b sico 862 080 Software CheckReport complemento para PapilloCheck 862 081 1 C mara de hibridaci n oCheck con soporte de portaobjetos 447 070 Asa para el soporte de portaobjetos 447 001 Recipiente de lavado oCheck 447 020 oCheck VacSet 863 080 oCheck VacPump 863 070 Enzimas necesarias Taq polimerasa Polimerasa ADN HotStarTaq 5 U ul Qiagen 203203 203205 203207 203209 e Uracil N glucosilasa Uracil ADN glucosilasa 1 U ul Fermentas ZENO361 4ENO0362
28. ases de riesgo R 21 22 Nocivo en contacto con la piel y por ingesti n R 20 21 22 Nocivo por inhalaci n por ingesti n y en contacto con la piel R 32 En contacto con cidos libera gases muy t xicos R 36 37 38 Irrita los ojos las v as respiratorias y la piel R 52 53 Nocivo para los organismos acu ticos puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acu tico Frases de seguridad S13 Mant ngase lejos de alimentos bebidas y piensos S26 En caso de contacto con los ojos l vese inmediatamente con agua abundante y acuda a un m dico S36 37 Utilizar indumentaria y guantes de protecci n adecuados S61 Evitar su liberaci n al medio ambiente Consulte las instrucciones especiales fichas de datos de seguridad La versi n actual de las fichas de datos de seguridad de este producto se puede descargar del sitio web de Greiner Bio One www gbo com bioscience biochips download PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 5 ELIMINACI N DE RESIDUOS Despu s de lavar y secar el microchip PapilloCheck se pueden desechar las soluciones de lavado Il y Ill sin precauciones especiales Deseche el microchip PapilloCheck usado los componentes del equipo sin utilizar y la mezcla de hibridaci n no utilizada con los desechos qu micos del laboratorio Respete todas las normativas locales provinciales y nacionales en lo referente al desecho de materiales PapilloCheck Manual de instr
29. avado ave el microchip o los microchips PapilloCheck en la soluci n de lavado Il en un ba o Mar a a 50 C durante 60 segundos subiendo y bajando el soporte de portaobjetos Tercer paso de lavado 5 ave el microchip o los microchips PapilloCheck en la soluci n de lavado Ill a temperatura ambiente durante 10 segundos subiendo y bajando el soporte de portaobjetos Secado Inmediatamente retire el l quido de la superficie de los microchips PapilloCheck mediante centrifugado 3 minutos 1 minuto 500 g m x velocidad Figura 6 Pasos de trabajo del proceso de lavado Diferentes pasos de lavado y procedimiento de secado antes del an lisis del microchip PapilloCheck con CheckScanner y el software CheckReport V 30 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 8 4 Escaneado y evaluaci n del microchip PapilloCheck Coloque el microchip o los microchips PapilloCheck en CheckScanner y realice el escaneado como se describe con m s detalle en el manual del usuario del software CheckReport Para obtener informaci n m s detallada sobre la instalaci n de CheckScanner y el software CheckReport M as como los requisitos del sistema inform tico consulte los manuales de instrucciones correspondientes de CheckScanner y el software CheckReport Siempre que se analicen datos con el software CheckReport aseg rese de que la versi n del software CheckReport instal
30. bla 11 Solidez de PapilloCheck Par metro Intervalo Temperatura de hibridaci n 20 25 C Tiempo de hibridaci n 13 17 minutos Temperatura de lavado 48 52 C Primer paso de lavado 10 15 segundos Segundo paso de lavado Tiempo de lavado 60 75 segundos Tercer paso de lavado 10 15 segundos 38 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 11 5 Rendimiento cl nico de PapilloCheck Para determinar el rendimiento cl nico del ensayo PapilloCheck en lo que respecta a especificidad y sensibilidad cl nicas se realiz un estudio comparativo con PapilloCheck y el ensayo GP5 6 PCR EIA Para este estudio se analizaron muestras de 1 437 mujeres representativas con citolog as normales grupo de control de m s de 40 a os de edad mediana de edad 49 a os intervalo de edades entre 40 y 60 a os y de 192 mujeres representativas mediana de edad 34 a os intervalo de edades entre 30 y 60 a os con lesiones CIN3 confirmadas mediante histolog a grupo de caso Todas las muestras usadas en este estudio se tomaron originariamente durante la ronda de referencia a mujeres en el grupo de intervenci n del ensayo de implementaci n controlado aleatorizado basado en poblaci n POBASCAM Despu s de restringir el an lisis PapilloCheck a los 14 tipos de VPHAR objetivo de GP5 6 PCR EIA PapilloCheck ten a una sensibilidad cl nica para 2 CIN3 del 95 8 96 184 192 IC del 95 96 92 8 98 8 y
31. cauciones cicle dO uU EO l o Tm Prevencion asta conta YacfOU sedi Modeste tnus aee Monate c rc e Ouen dantis peer 7 3 2 Instrucci n para la manipulaci n de microchips de ADN eeeeseeeeeeeeee 1 353 ec at clones ta necia a Me UD uA ES UI qw sogudademelabajoteecesnen eise M LIIS MIEL EM o PROCEDIMIENTO DE PAPILLOCHEQCNK esee nennen nnnm nnn nnn annuas 8 1 Toma de muestras y extracci n de ADN eeeeseeeeeee eene nennen nnn nnne nnn nnn nnn nnn cd ona ciemuuesidssesc e usua acn c jenem Le Mr dc a Ice to ee anti Sue2ccExtracciomuesDNC cU enc A E A EE 8 2 Reacci n en cadena de la polimerasa PCR 1eeeeeeeeeee cesse eene eene enn nnn S2 0PErepardctomcdelteniociliddepcsercccrec A 8 2 2 Tratamiento de uracil N glucosilasa UNG a 06 onte Uu actus Ou SoePrebonaactomidedadeadccl mib ectetur il did 9 5 Hibridacion ld O teet eiu c MEL DII EE NC MIN iz Ter zi To 0 1 AAA nn eo no A ocu soleil ELCIGIG HO o o a eo RE 0 aor lavado Vs eee ET 8 4 Escaneado y evaluaci n del microchip PapilloCheck ooononcccccnnnnnnccccccncccnncccncnnnnnnancnncnonnnannos PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 9 SOLUCI N DE PROBLEMASS eeeeeeeee eren nnn nennt tnter nsns 32 10 ASISTENCIA T CNICA ccoooocccccconocccononnccconnnncn conan cnn 33 11 CARACTER STICAS DE RENDIMIENTO DE PAPILLOC
32. centrifugue un m ximo de 1000 ul de la muestra durante 5 minutos a 11 000 g y resuspenda el pellet en 250 yl de agua destilada Despu s se pueden procesar los 250 yl con el equipo de extracci n de ADN oCheck Este paso de concentraci n solo es adecuado para las muestras de citolog as cervicouterinas que se tomaron con el equipo de toma de muestras PapilloCheck en el medio de toma de muestras PreservCyt o Surepath Si se us el medio de toma de muestras STM no es posible concentrar mediante centrifugado PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 8 2 Reacci n en cadena de la polimerasa PCR La PCR es un m todo muy sensible que puede detectar cantidades extremadamente reducidas de ADN Se deben extremar las precauciones para evitar la contaminaci n de la reacci n consulte el cap tulo 7 Se requieren polimerasa HotStarTaq y uracil N glucosilasa las cuales no se suministran con el equipo de ensayo PapilloCheck y deben adquirirse por separado consulte el cap tulo 2 El equipo de ensayo PapilloCheck se ha validado con polimerasa HotStarTaq de Qiagen y uracil N glucosilasa de Fermentas consulte la informaci n sobre pedidos en el cap tulo 2 Es obligatorio usar estas enzimas para lograr el rendimiento establecido 8 2 1 Preparaci n del termociclador El equipo de ensayo PapilloCheck se ha validado con los siguientes termocicladores e GeneAmp PCR System 9700 Applied
33. cube el microchip PapilloCheck durante exactamente 15 minutos a temperatura ambiente 20 25 C Retire el soporte de portaobjetos magn tico de la c mara de hibridaci n Coloque el soporte de portaobjetos en el recipiente de lavado oCheck con la soluci n de lavado Encaje el asa oCheck Lave el microchip o los microchips PapilloCheck en la soluci n de lavado a temperatura ambiente durante 10 segundos Lave el microchip o los microchips PapilloCheck en la soluci n de lavado ll precalentada en un ba o Mar a a 50 C durante 60 segundos Lave el microchip o los microchips PapilloCheck en la soluci n de lavado lll a temperatura ambiente durante 10 segundos Retire el l quido de la superficie del microchip PapilloCheck mediante centrifugado Escanee el microchip o los microchips PapilloCheck con CheckScanner Realice el escaneo y el an lisis seg n lo descrito en el manual del usuario del software CheckReport Cree los informes 3 minutos O 500 g 1 minuto m x velocidad m
34. e ADN humano En caso de variaci n respecto a los datos validados las concentraci n del pl smido concreto se aumentaron o redujeron y despu s se volvieron a analizar 6 repeticiones de dos series de diluci n independientes El l mite de detecci n fue la concentraci n m s baja en que las 6 repeticiones fueron positivas Analizado directamente sin consideraci n de la preparaci n del ADN La cantidad se refiere al ADN de VPH contenido en el pl smido 34 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 11 1 2 Especificidad anal tica Tipos de VPH Los pl smidos de referencia para los tipos de VPH enumerados se analizaron con 2 12 x 109 copias reacci n PCR VPH 6b VPH 11 VPH 13 VPH 16 VPH 18 VPH 26 VPH 30 VPH 31 VPH 33 VPH 34 VPH 35 VPH 39 VPH 40 VPH 42 VPH 43 VPH 44 VPH 45 VPH 51 VPH 52 VPH 53 VPH 54 VPH 55 VPH 56 VPH 58 VPH 59 VPH 61 VPH 66 VPH 67 VPH 68 VPH 69 VPH 70 VPH 71 VPH 73 VPH 74 VPH 81 VPH 82 VPH 84 VPH 85 VPH 91 Se detectaron las siguientes hibridaciones cruzadas VPH 55 da una se al en la sonda de VPH 44 Como resultado el software CheckReport muestra un resultado combinado de VPH 44 VPH 55 Es posible que VPH 13 tenga una reacci n cruzada con la sonda de VPH 11 pero no da como resultado una se al de falso positivo ya que VPH 13 no est presente en las muestras cervicouterinas 11 1 3 Especificidad anal tica Organismos no VPH
35. encia de trabajo clara y bien estructurada que impida la obtenci n de resultados err neos como consecuencia de la degradaci n o la contaminaci n del ADN por productos de la amplificaci n Para garantizar esto es necesario separar las zonas dedicadas a la extracci n la amplificaci n y la detecci n seg n se describe en el cap tulo 7 2 Cada zona debe estar provista de equipos consumibles batas de laboratorio y guantes diferentes No transfiera nunca las batas los guantes ni el equipo de una zona separada a otra 7 2 Separaci n de las salas La figura 3 muestra un ejemplo de c mo se puede dividir un laboratorio en tres secciones diferentes Una se utiliza nicamente para la extracci n de ADN otra se dedica a la preparaci n y generaci n de las reacciones PCR y la ltima se dedica a la hibridaci n y al an lisis Cada sala se debe utilizar exclusivamente para la aplicaci n o t cnica indicadas a fin de impedir la contaminaci n de las muestras El uso de diferentes colores puede ayudar a evitar un intercambio accidental de equipo y consumibles entre las zonas Figura 3 Separaci n de las salas Sala 1 se debe realizar el procedimiento de extracci n de ADN completo en esta sala Sala 2 en esta sala se prepara la mezcla de reacci n para PCR y se crean al cuotas idealmente bajo una campana PCR La adici n de las muestras de ADN extra das en la sala 1 se debe realizar en un espacio diferente en la sala 2 Sala 3 en la
36. ezeich nung N de lot C digo de lote Codice del lotto C digo do lote Lot nummer Lotnum mer Lot nummer Kod partii batch nr KW IK Trapridas Parti kodu Important Note Wichtiger Hinweis Note im portante Nota im portante Nota im portante Aviso im portante Belangri jke op merking Vigtig henvis ning Viktigt medde lande Wazne Viktig merknad npavrikii UTT DEIEN nemli Not TABLA DE CONTENIDO 1 CANIT ses Melle DU A CONSUMIBLES EQUIPO Y HARDWARE NECESARIOS TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO eeseene eene nenne nnne nnn nnne nnn nnn nnns INSTRUCCIONES DE SEGURIDAD 1 eeeseeeree enne enne nnn nnn nnne nnnm ELIMINACI N DE RESIDUOS ceeeeeenereennenennene nennen nnns nnn nitens tenias anneanne INTRODUCGION a bna A Iud M E SUSO DVI O oo 6 2 Tipos de VPH detectables con PapilloChecke coococcccncncccoconccononcconcncncnnncononancnnanancnnnnnnnnnnnnenananens 56 35 oPrncipio A eue E LTEM MERE DE 64 Diseno del microchip PapiloCheck suere Lu MA eie d E 6 4 1 Distribuci n del microchip PapilloCheck eoo asas cc Mut ctn cM ceu AA 047 vu oDnmdoles delimierocbilpusteee E eo ico roh orum ont INSTRUCCIONES PARA LA SECUENCIA DE TRABAJO DE PAPILLOCHECK 1 ou o AMAS MI MI Cet 7 2 Sepnaracilon delas salas oec um LLL M i eI EE La Advertencias y pre
37. ido a la reacci n PCR Error de preparaci n del ADN Material de muestra insuficiente LOS CONTROLES DE MUESTRA Y O DE PCR NO GENERAN ERROR PERO MUESTRAN UN VALOR DE SNR 0 Comentarios y sugerencias Repita el an lisis PapilloCheck a partir de la preparaci n de la reacci n PCR Repita el an lisis PapilloCheck a partir de la preparaci n de la reacci n PCR Repita el an lisis PapilloCheck a partir de la preparaci n de la reacci n PCR Repita el an lisis PapilloCheck a partir de la reacci n PCR Aseg rese de mezclar bien la mezcla de reacci n Repita la extracci n de ADN y el an lisis PapilloCheck Repita la hibridaci n Repita la hibridaci n Compruebe el funcionamiento del termociclador as como la programaci n correcta del mismo pasos de PCR incremento t rmico volumen Atenci n use el termociclador GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems o Veriti V 96 Well Thermal Cycler Applied Biosystems en combinaci n con PapilloCheck Repita el an lisis PapilloCheck a partir de la reacci n PCR Repita la extracci n de ADN Toma de muestras incorrecta La muestra est muy poco concentrada Conc ntrela de acuerdo con la descripci n en el cap tulo 9 1 y repita la extracci n de ADN o la toma de muestras Este resultado se considera v lido si el software CheckReport detecta como m nimo un tipo de VPH en la muestra con una se al por encima de un umbral definido Entonces es po
38. illoCheck se realiza a temperatura ambiente No obstante es preciso almacenar el equipo inmediatamente despu s de recibirlo a 4 8 C y protegerlo de la luz Si se almacenan correctamente el equipo de ensayo PapilloCheck y sus componentes se pueden utilizar hasta la fecha de caducidad indicada Asimismo en estas condiciones la vida util no se desv a de la fecha de caducidad una vez abiertos el equipo y sus componentes 4 INSTRUCCIONES DE SEGURIDAD El equipo de ensayo PapilloCheck est destinado nicamente para el uso en un laboratorio y no como f rmaco para uso dom stico ni otros fines Lleve siempre una bata de laboratorio adecuada guantes desechables y gafas de seguridad y siga las instrucciones de seguridad proporcionadas en esta secci n Los siguientes componentes del equipo de ensayo PapilloCheck contienen elementos nocivos o peligrosos S mbolo de S mbolo de Frases de Frases de Frases de Componente peligroso peligro riesgo riesgo seguridad hibridaci n Tanponde Tiocianato de R 20 21 22 513 p guanidina Nocivo R 32 S61 25 60 R 52 53 S36 37 20 de A R 21 22 S26 Tamp n B ipe iue de x Peligroso R 36 37 38 336 37 La etiqueta de peligro no es necesaria para paquetes peque os de un m ximo de 125 g o ml seg n 67 548 CEE Art 25 1999 45 CE Art 12 y las normas alemanas GefStoffV 8 20 3 y TRGS 200 7 1 Para obtener m s informaci n consulte las fichas de datos de seguridad Fr
39. iva y la genotipificaci n de 24 tipos del virus del papiloma humano en preparaciones de ADN a partir de citolog as cervicouterinas humanas Este equipo nicamente puede ser utilizado por personal cualificado PapilloCheck cumple los requisitos de la directiva sobre productos sanitarios para diagn stico in vitro 98 78 CE y por tanto presenta la marca de conformidad CE Todos los resultados diagn sticos generados con PapilloCheck se deben interpretar en combinaci n con otros hallazgos cl nicos o de laboratorio 6 2 Tipos de VPH detectables con PapilloCheck PapilloCheck permite identificar los 18 tipos de alto riesgo L y los 6 tipos de bajo riesgo del virus del papiloma humano VPH Tabla 1 Tabla 1 Tipos de VPH detectables con PapilloCheck VPH 16 VPH 45 VPH 59 VPH 6 VPH 18 VPH 51 VPH 66 VPH 11 VPH 31 VPH 52 VPH 68 VPH 40 VPH 33 VPH 53 VPH 70 VPH 42 VPH 35 VPH 56 VPH 73 VPH 43 VPH 39 VPH 58 VPH 82 VPH 44 VPH 55 PapilloCheck no permite diferenciar entre el VPH 44 y el VPH 55 1 Walboomers J et al 1999 Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide J Pathol 189 1 12 9 2 Burd EM Human papillomavirus and cervical cancer Clin Microbiol Rev 2003 16 1 17 3 Bosch F X et al 2008 Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type specific implications in cervical neoplasia Vaccine 26 Suppl 10 K1 16 4 Meijer C J et al 2009 Guidelines
40. k Para la extracci n de ADN con el equipo de extracci n de ADN oCheck se deben utilizar 250 ul de soluci n de muestra Las muestras de citolog as cervicouterinas humanas que se tomen e con el equipo de toma de muestras PapilloCheck Greiner Bio One n de cat logo 465 070 e en medio de toma de muestras PreservCyt Hologic Bedford MA EE UU se pueden procesar directamente Las muestras de citolog as cervicouterinas que se tomen en e el medio de toma de muestras Surepath BD Franklin Lakes NJ EE UU se deben lavar antes de usarlas centrifugue 250 ul de la muestra durante 5 minutos a 11 000 g y resuspenda el pellet en 250 ul de agua destilada Despu s se pueden procesar los 250 pl con el equipo de extracci n de ADN oCheck Las muestras de citolog as cervicouterinas que se tomen en e el medio de toma de muestras STM Qiagen Hilden Alemania se deben diluir use 100 pl de la muestra y a ada 150 ul de agua destilada Despu s se pueden procesar los 250 pl de la muestra diluida con el equipo de extracci n de ADN oCheck En general si la muestra de la citolog a cervicouterina parece estar muy concentrada y ya agregada es necesario diluir y homogeneizar la muestra antes de comenzar el proceso de extracci n de ADN Las muestras de citolog as cervicouterinas que est n muy diluidas y no presenten c lulas visibles deben concentrarse a fin de obtener un mayor volumen de c lulas para la extracci n de ADN
41. kReport indicar el error en el control de muestra Failed y se deber repetir el an lisis como consecuencia de una cantidad insuficiente de c lulas en la muestra cervicouterina y o el rendimiento insuficiente de la extracci n consulte el cap tulo 9 Control de PCR PapilloCheck tambi n controla la calidad de la reacci n PCR La amplificaci n de una plantilla de control interna presente en el PapilloCheck PCR MasterMix genera una se al en las marcas de control de PCR en el microchip PapilloCheck Adem s se eval a la calidad de la reacci n de amplificaci n autom ticamente en el software CheckReport M Si el rendimiento de la PCR es inferior a un umbral predefinido el software CheckReport indicar el error en el control de PCR Failed y se deber repetir el an lisis consulte el cap tulo 9 Si la cantidad de ADN de VPH en la muestra es muy elevada la sefial fluorescente de las marcas de control de PCR puede ser d bil o incluso no aparecer como consecuencia de la competici n durante la reacci n PCR En este caso la se al fluorescente de al menos una sonda especifica de VPH debe superar un umbral predefinido para que el ensayo se considere v lido Control de hibridaci n PapilloCheck controla la eficiencia de la hibridaci n mediante una sonda marcada con fluorescencia en el tamp n de hibridaci n PapilloCheck que hibrida seg n secuencias de ADN espec ficas en el microchip PapilloCheck Una hibridaci n co
42. ma autom tica los valores correspondientes tanto de los tipos de VPH detectados como de los controles en un informe detallado El informe indica claramente la presencia o la ausencia de uno o varios de los 24 tipos de VPH detectables y los completos controles en el microchip garantizan la elevada fiabilidad del an lisis PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 1 Reacci n PCR HILHIIIDE NAAA 4 2 Hibridaci n Figura 1 Procedimiento del ensayo PapilloCheck 1 Reacci n PCR despu s de la extracci n del ADN se amplifican un fragmento de 350 bp del gen E1 v rico y fragmentos de dos objetivos de control mediante PCR A continuaci n los productos de la amplificaci n se hibridan seg n sondas de ADN complementario en el microchip 2 Hibridaci n se detecta cada tipo de VPH mediante una sonda de ADN espec fica presente en cinco r plicas Durante la hibridaci n se introduce el marcado fluorescente 3 Lavado y secado se elimina el ADN sin unir en los pasos de lavado subsiguientes 4 Escaneo y an lisis se escanea analiza y eval a el microchip PapilloCheck utilizando CheckScanner y el software CheckReport Se crea un informe que indica claramente la presencia o la ausencia de uno o varios de los 24 tipos de VPH detectables PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 6 4 Dise o del microchip PapilloCheck 6 4 1 Distribuci n del
43. microchip PapilloCheck Cada microchip PapilloCheck contiene 12 micromatrices designadas como pocillos del A1 al B6 Cada micromatriz PapilloCheck se compone de 28 sondas diferentes y tiene un reborde elevado Cada sonda se marca en cinco r plicas La distribuci n de la micromatriz PapilloCheck se ilustra en la figura 2 y los controles del microchip se explican con m s detalle en el cap tulo 6 4 2 0000000000 9000000000 9000000000 9000000000 9000000000 9000000000 9000000000 9000000000 9000000000 ceee ere LLES 0000000000 erererereererere 0000000000 erereree eere 0000000000 0000000000 0000000000 0000000000 00000000E 0000000000 eere eere o e e CO canal rojo 635 nm canal verde 532 nm Figura 2 Disefio del microchip PapilloCheck a Dibujo esquem tico del microchip PapilloCheck b y c Im genes mostradas por el software CheckReport para las dos longitudes de onda de excitaci n diferentes usadas para el escaneo b canal rojo 635 nm c canal verde 532 nm y dibujos esquem ticos de la distribuci n de la micromatriz PapilloCheck Se indican las sondas espec ficas del tipo de VPH y los controles del microchip PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 6 4 2 Controles del microchip El dise o del microchip de ADN PapilloCheck incorpora unos completos controles integrados en el microchip Varios sistemas de control supervisan todos los pasos cr ticos del ensayo y el
44. n la eficiencia adecuada da como resultado se ales fluorescentes en cada marca de la matriz Los resultados de cinco marcas de control de hibridaci n en el microchip PapilloCheck tambi n se eval an mediante el software CheckReport Control de orientaci n y de impresi n Las marcas de control de orientaci n del microchip PapilloCheck generan se ales fluorescentes con independencia de la eficiencia del proceso de hibridaci n Estas marcas se usan en el software CheckReport M como puntos de gu a para la b squeda de marcas correctas que es un requisito previo para analizar las se ales correctamente Adem s se controla la calidad del proceso de impresi n mediante la presencia de una se al fluorescente verde en cada marca del microchip control de impresi n PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 7 INSTRUCCIONES PARA LA SECUENCIA DE TRABAJO DE PAPILLOCHECK 7 1 Instrucciones generales Al implementar en un laboratorio t cnicas de vanguardia de uso actual en la biolog a molecular se deben tener en cuenta las siguientes instrucciones para garantizar la m xima seguridad del personal del laboratorio y la elevada calidad de los resultados En general la ejecuci n de t cnicas de biolog a molecular tales como la extracci n de ADN la amplificaci n y la detecci n de productos de la amplificaci n requiere de personal con la formaci n adecuada Adem s es preciso contar con una secu
45. oluci n de lavado ll a 50 C en un ba o Mar a con temperatura controlada durante al menos 20 minutos antes de usarla Aseg rese de que el nivel de llenado del ba o Mar a sea equivalente al de la soluci n de lavado ll PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 Tabla 4 Preparaci n de la mezcla de soluci n de lavado Los vol menes resumidos en esta tabla son suficientes para los tres pasos de lavado soluciones de lavado II y III para el n mero indicado de microchips PapilloCheck N mero de microchips PapilloCheck Componentes 2 3 Agua destilada o desionizada 140 ml 280 ml 420 ml Tap n A PapilloCheck 14 ml 28 ml 42 ml Tap n B PapilloCheck 1 75 ml 3 5 ml 5 25 ml Volumen total 155 75 ml 311 50 ml 467 25 ml No reutilice nunca las soluciones de lavado ya que esto podr a resultar en una acumulaci n del producto de PCR eliminado lo que podr a interferir con los resultados de PapilloCheck Use soluciones de lavado nuevas para cada ensayo La mezcla de soluci n de lavado preparada se puede almacenar durante un m ximo de una semana a temperatura ambiente Compruebe si hay precipitados de dodecilsulfato de sodio De haberlos caliente la mezcla de soluci n de lavado hasta que se disuelvan y equil brela de nuevo a temperatura ambiente A continuaci n realice los preparativos para el siguiente experimento de hibridaci n 26 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi
46. personal en diferentes laboratorios con instrumental diferente Los resultados se clasificaron de acuerdo con las muestras positivas si se detectaron tipos de VPH id nticos en infecciones nicas o dobles o bien si se detectaron dos o tres tipos de VPH id nticos en infecciones m ltiples con tres o cuatro tipos respectivamente Tabla 10 Resultados de los an lisis de reproducibilidad N de muestra Resultado de laboratorio 1 Resultado de laboratorio 2 Concordancia Se obtuvieron resultados concordantes para todas las muestras cl nicas Las se ales de tipos adicionales detectados por el laboratorio 2 para muestras con infecciones m ltiples 7 VPH 82 y 15 VPH 68 quedaron justo por encima del umbral definido y los resultados discordantes se clasificaron como no problem ticos PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 11 4 Solidez Con el fin de evaluar la solidez del sistema de ensayo PapilloCheck se consideraron variaciones de los siguientes par metros Temperatura de hibridaci n Tiempo de hibridaci n Temperatura de lavado Tiempo de lavado Todos los an lisis se realizaron en r plicas de 3 con concentraciones elevadas de plantilla 1 ng de pl smido de referencia de VPH o aproximadamente 200 x 109 copias por muestra Los intervalos de valores de par metros determinados en los que es posible una detecci n robusta de VPH con PapilloCheck se resumen en la tabla 11 Ta
47. s r plicas las analiz el mismo t cnico en un plazo de tres d as Tabla 9 Composici n de las muestras para el an lisis de repetibilidad Id de muestra muestra 1 muestra 2 muestra 3 muestra 4 muestra 5 Tipo de VPH VPH 16 VPH 18 VPH 31 ADN gen mico humano VPH 16 VPH 18 VPH 31 ADN gen mico humano VPH 16 VPH 18 VPH 45 ADN gen mico humano VPH 16 VPH 18 VPH 45 ADN gen mico humano VPH 18 VPH 31 VPH 45 ADN gen mico humano Cantidad de ADN mensajero 180 copias 1 500 copias 1 400 copias 1 ng 180 copias 1 500 copias 1 400 copias o ng 1 800 copias 450 copias 300 copias o ng 10 000 copias 5 000 copias 20 000 copias 2 5 ng 4 500 copias 500 copias 90 copias 2 5 ng M ltiplo del l mite de Para las cinco muestras y cada an lisis repetido se detectaron los tres tipos de VPH correctos y el an lisis fue negativo para el tipo no incluido Por tanto 75 de los 75 resultados de an lisis individuales 5 muestras x 5 r plicas x 4 plantillas de VPH diferentes usadas fueron correctos PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 11 3 Reproducibilidad La reproducibilidad del equipo de ensayo PapilloCheck se determin usando 22 muestras cl nicas consulte la tabla 10 con concentraciones de VPH pr ximas al l mite de detecci n La determinaci n se realiz mediante el mismo m todo con material de muestra id ntico por diferente
48. sa HotStarTaq 5 U pl Uracil N glucosilasa diluci n de 1 200 0 005 U l Volumen total antes de afiadir el ADN de muestra 1092 yl ADN extra do de muestra cervicouterina ADN mensajero Volumen total por reacci n 24 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 8 3 Hibridaci n y lavado 8 3 1 Preparaci n La hibridaci n se debe realizar a temperatura ambiente 20 25 C Comience con los preparativos necesarios para la hibridaci n y los pasos de lavado al menos 30 minutos antes de iniciar el procedimiento de hibridaci n Para disolver los potenciales precipitados en los tampones de lavado e hibridaci n exp ngalos a temperatura ambiente 20 25 C durante 30 minutos y m zclelos bien antes de usarlos El almacenamiento del equipo de ensayo PapilloCheck a 4 8 C puede dar como resultado la precipitaci n de dodecilsulfato de sodio en los tampones B y de hibridaci n Deje que las soluciones se equilibren a temperatura ambiente y despu s mezcle el tubo en el Vortex o agite el frasco hasta que se disuelvan los precipitados w Prepare la c mara de hibridaci n oCheck coloque una nueva toallita de papel humedecida en la c mara de hibridaci n y cierre la tapa para crear una atm sfera saturada de humedad Para evitar la evaporaci n del peque o volumen de mezcla de hibridaci n utilizada en el microchip es necesario realizar la hibridaci n en una atm sfera saturada
49. sible que el control de muestra y o de PCR muestre sefiales fluorescentes d biles o no las muestre en absoluto debido a competici n durante la PCR 10 ASISTENCIA T CNICA Greiner Bio One cuenta con un departamento de servicio t cnico compuesto por cient ficos con amplia experiencia tanto pr ctica como te rica en biolog a molecular y en los productos oCheck Si se tiene alguna duda o experimenta dificultades con los productos oCheck no dude en ponerse en contacto con el distribuidor local de Greiner Bio One 33 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 11 CARACTER STICAS DE RENDIMIENTO DE PAPILLOCHECK 9 11 4 Rendimiento anal tico de PapilloCheck 11 1 4 Sensibilidad anal tica El l mite de detecci n LD se estableci usando pl smidos de referencia para cada tipo de VPH detectable que contenga la regi n E1 que es el objetivo de PapilloCheck Los LD se resumen en la tabla 8 Tabla 8 L mites de detecci n de los tipos de VPH detectables Genotipo de Copias VPH reacci n pg ml VPH 6 30 0 052 VPH 11 0 26 VPH 16 50 0 086 VPH 18 0 516 VPH 31 VPH 33 VPH 35 VPH 39 VPH 40 VPH 42 La concentraci n validada de cada pl smido de referencia de VPH se prepar en dos series de diluci n independientes y se midi en tres repeticiones de la concentraci n analizada es decir un total de 6 repeticiones por concentraci n Adem s cada an lisis conten a 10 ng d
50. streptococcus anaerobius Peptostreptococcus micros Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia Prevotella nigrescens Proteus hauseri Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Serratia marcescens Staphylococcus aureus ssp aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus saprophyticus Stenotrophomonas maltophilia Streptococcus agalactiae Streptococcus constellatus Streptococcus criceti Streptococcus cristatus Streptococcus gordonii Streptococcus intermedius Streptococcus mitis Streptococcus mutans Streptococcus oralis Streptococcus parasanguinis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius Streptococcus sanguinis Streptococcus sobrinus Tannerella forsythensis antes Bacteroides forsythus Treponema denticola Ureaplasma uralyticum Veillonella parvula 35 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 11 2 Repetibilidad Como evaluaci n de la repetibilidad del ensayo se analizaron cinco muestras cada una con tres plantillas de referencia de VPH diferentes y ADN gen mico humano con PapilloCheck Se variaron los n meros de copias de los diferentes objetivos de VPH presentes en las muestras as como el ADN humano de fondo consulte la tabla 9 Cada muestra se analiz con PapilloCheck en cinco r plicas independientes La
51. tercera sala del laboratorio se llevan a cabo la reacci n de hibridaci n los pasos de lavado y el secado del microchip Adem s se usa CheckScanner junto con el software CheckReport para realizar el an lisis final del ensayo PapilloCheck No se deben intercambiar equipo ni consumibles entre las diferentes salas y espacios del laboratorio Por tanto la duplicaci n del equipo y los consumibles es necesaria y se debe tener en cuenta al equipar el laboratorio PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 7 3 Advertencias y precauciones 7 3 1 Prevenci n de la contaminaci n Se debe llevar una bata de laboratorio durante el procedimiento y utilizar una bata diferente para cada sala del laboratorio Se deben llevar guantes durante cada paso del an lisis y se deben cambiar con frecuencia especialmente durante la extracci n de ADN El lugar de trabajo se debe descontaminar con un limpiador adecuado No toque nunca la parte interior de la tapa del microtubo Para evitar la contaminaci n cruzada abra solamente un tubo cada vez Utilice puntas de filtro de micropipeta anti aerosol adecuadas libres de desoxirribonucleasa ribonucleasa y ADN humano Es preciso cambiar siempre las puntas de pipeta tras una transferencia de l quido 7 3 2 Instrucci n para la manipulaci n de microchips de ADN Los microchips de ADN se deben utilizar en un entorno libre de polvo Se debe evitar la sedimentaci
52. to o los productos de PCR en otro microchip durante la transferencia de Pipetee con cuidado para evitar la formaci n de burbujas de aire l quido en el microchip ERROR DEL CONTROL DE HIBRIDACI N Temperatura incorrecta de la El segundo paso de lavado se debe realizar a 50 C Aseg rese de que la soluci n de lavado ll soluci n de lavado ll se caliente a 50 C Temperatura incorrecta del El segundo paso de lavado se debe realizar a 50 C Compruebe la temperatura ba o Mar a del ba o Mar a Aseg rese de que el ba o Mar a est a una temperatura de 50 C Si es necesario confirme la temperatura con un term metro Preparaci n incorrecta de la Repita la preparaci n de la mezcla de hibridaci n con los vol menes correctos mezcla de hibridaci n e hibride los productos de la PCR en otro microchip 32 PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 PROBLEMA y causa ERROR DEL CONTROL DE PCR Polimerasa de ADN HotStarTaq no a adida al MasterMix Adici n de una polimerasa de ADN HotStarTaq con funcionamiento incorrecto al MasterMix Adici n de uracil N glucosilasa sin diluir al MasterMix Mezclado insuficiente de la mezcla de reacci n Inhibidores de PCR presentes en la muestra Hibridaci n realizada sin a adir el producto de PCR Mezclado insuficiente de la mezcla de hibridaci n Problemas con el termociclador ERROR DEL CONTROL DE MUESTRA ADN de muestra no a ad
53. ucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 6 INTRODUCCI N En pr cticamente todos los casos de c ncer del cuello uterino el segundo c ncer m s com n en mujeres en todo el mundo se encuentra una infecci n persistente con un virus del papiloma humano VPH carcin geno Hasta la fecha se han identificado m s de 100 tipos de VPH 40 de los cuales son de transmisi n sexual e infectan la mucosa genital Los tipos de VPH cervicouterino se clasifican en un grupo de alto riesgo VPH de alto riesgo o VPHAR o en uno de bajo riesgo VPH de bajo riesgo o VPHBR Mientras que los tipos de VPH de alto riesgo se asocian a una mayor posibilidad de padecer c ncer cervicouterino los tipos de bajo riesgo causan principalmente condilomas genitales benignos No obstante incluso dentro del grupo de alto riesgo el riesgo relativo de desarrollar c ncer o lesiones cervicales intraepiteliales NIC depende del tipo Alrededor del 70 9o de todos los casos de c ncer cervicouterino est n vinculados a una infecci n persistente de VPH 16 o 18 Los tipos de bajo riesgo con mayor prevalencia son VPH 6 y 11 Partiendo de la base de un v nculo etiol gico pr cticamente absoluto entre el VPH carcin geno y el c ncer cervicouterino en la actualidad se est teniendo en cuenta la realizaci n de pruebas del VPHAR para la detecci n primaria del c ncer cervicouterino 6 1 Uso previsto PapilloCheck es un equipo de diagn stico para la detecci n cualitat
54. uestra y una plantilla de control interna presente en el PapilloCheck PCR MasterMix para controlar el rendimiento de la PCR control de PCR Adem s el PapilloCheck PCR MasterMix contiene dUTP Por tanto se puede eliminar la contaminaci n cruzada de reacciones PCR anteriores mediante el uso del tratamiento con uracil N glucosilasa UNG consulte el cap tulo 8 2 2 A continuaci n los productos de la PCR se hibridan seg n sondas de ADN espec ficas y controles en el microchip enlazados a la superficie del microchip de PapilloCheck Cada microchip contiene 12 micromatrices de ADN lo que permite el an lisis simult neo de 12 muestras cervicouterinas Durante la hibridaci n el ADN unido se marca de forma fluorescente y el no unido se elimina en los pasos de lavado subsiguientes Se supervisa la eficiencia de la hibridaci n control de hibridaci n Finalmente el microchip PapilloCheck se escanea analiza y eval a de forma autom tica mediante CheckScanner y el software CheckReport respectivamente consulte la informaci n sobre pedidos en el cap tulo 2 CheckScanner es un esc ner l ser bicolor longitudes de onda de excitaci n de 532 nm y 635 nm que permite la detecci n de la se al fluorescente generada por la presencia de productos de la amplificaci n espec ficos de VPH as como los controles consulte el cap tulo 6 4 2 El software CheckReport permite visualizar analizar y evaluar los resultados y muestra de for
55. una especificidad cl nica para 2 CIN2 del 96 7 96 IC del 95 96 95 7 97 7 En comparaci n estas cifras fueron 96 4 185 192 IC del 95 96 93 9 98 9 y 97 7 IC del 95 96 9 98 5 respectivamente para GP5 6 PCR EIA consulte las tablas 5 y 6 Tabla 5 Comparaci n de los resultados de PapilloCheck 14 tipos de VPHAR y GP5 6 PCR EIA estratificados para controles y casos PapilloCheck GP5 6 PCR ElA 14 tipos de VPHAR Controles 1 386 96 5 4 0 3 1 390 96 7 18 1 3 96 29 2 0 47 3 3 1 404 97 7 36 2 3 1 437 4 2 1 8 4 2 181 94 3 184 95 8 185 96 4 192 Tabla 6 Especificidad y sensibilidad cl nicas de PapilloCheck y GP5 6 PCR EIA resultados de uno o varios de los 14 tipos de VPHAR VPH 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 o 68 14 VPHAR PapilloCheck GP5 6 Sensibilidad cl nica para 2 CIN3 Especificidad cl nica para 2 CIN2 96 7 97 7 7 Comparison of the clinical performance of PapilloCheck human papillomavirus detection with that of the GP5 6 PCR enzyme immunoassay in population based cervical screening Hesselink AT Heideman DA Berkhof J Topal F Pol RP Meijer CJ Snijders PJ J Clin Microbiol 2010 Mar 48 3 797 801 Epub 2009 Dec 30 8 Bulkmans N W L Rozendaal P J Snijders F J Voorhorst A J Boeke G R Zandwijken F J van Kemenade R H Verheijen K Groningen M E Boon H J Keuning M van Ballegooijen
56. va a procesar menos de 12 muestras deje vac os los pocillos sin usar Los pocillos sin usar de un microchip procesado no se pueden usar para muestras futuras Manipule el microchip con cuidado para no derramar la mezcla de hibridaci n Los derrames pueden ocasionar la contaminaci n cruzada de muestras y resultados falsamente positivos Incube el microchip durante exactamente 15 minutos a temperatura ambiente 20 25 C dentro de la c mara de hibridaci n preparada en una atm sfera oscura y saturada de humedad Tenga cuidado de no mover la c mara de hibridaci n durante el proceso No cambie nunca el tiempo ni la temperatura de incubaci n de la reacci n de hibridaci n ya que podr a causar una p rdida de intensidad en la sefial fluorescente o un aumento de la fluorescencia no espec fica No deje que los microchips hibridados entren en contacto directo con la luz del sol PapilloCheck Manual de instrucciones Revisi n BQ 013 07 Agosto de 2011 n D D D a D Prepare una atm sfera saturada de humedad en la c mara de hibridaci n Incube la cantidad necesaria de microchips PapilloCheck en la c mara de hibridaci n a temperatura ambiente 20 25 C consulte el cap tulo 8 3 1 Mezcle 30 yl del tamp n de hibridaci n PapilloCheck en un microtubo de 0 2 ml de una banda PCR con 5 yl del producto de la PCR M zclelo bien Transfiera 25 ul de la mezcla de hibridaci n a cada pocillo del microchip P
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