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PowerPlex® Fusion System

1. Picos adicionales visibles en un todos los canales de color Contaminaci n con ADN de otra plantilla o previamente o ADN amplificado La contaminaci n cruzada puede ser un problema Utilice puntas para pipetas resistentes al aerosol y c mbiese los guantes con frecuencia Las muestras no se desnaturalizaron por completo Desnaturalice las muestras por calor para el tiempo recomendado y enfr e sobre hielo picado o en un ba o de hielo de inmediato antes de cargar el capilar El ADN de doble cadena migra m s r pido que el ADN de una cadena durante la electroforesis capilar La aparici n de picos sombra que migran por delante de los picos principales especialmente si los picos sombra est n separados por la misma distancia que los picos principales en Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 56 Impreso en Estados Unidos 9 12 Sintomas Causas y comentarios los heterocigotas puede indicar la presencia de ADN de doble cadena debido a una desnaturalizaci n incompleta o recocci n posterior a la inyecci n Artefactos de amplificaci n de STR La amplificaci n de STR puede dar como resultado artefactos que aparecen como picos de una base m s peque a que el alelo debido a la incorporaci n incompleta en el residuo de 3 A Aseg rese de
2. DC8271 contiene reactivos para la r pida preparaci n de ADN de hisopos bucales antes de la amplificaci n El procedimiento lisa las c lulas contenidas en el extremo del hisopo y se libera en un soluci n suficiente de ADN para la amplificaci n de las STR Una peque a cantidad de extracto final de hisopo se agrega a la reacci n del PowerPlex El kit PunchSolution es id neo para procesar perforaciones a partir de tarjetas de almacenamiento no FTA que contienen muestras de sangre o bucales antes de la amplificaci n directa Para trabajar en casos o muestras que requieren purificaci n de ADN recomendamos El DNA IQ System N de Cat DC6700 que es un sistema de aislamiento de ADN dise ado espec ficamente para muestras forenses 26 Este sistema utiliza part culas paramagn ticas para preparar muestras limpias con el fin de analizar f cil y eficientemente las STR y se puede utilizar para extraer ADN de manchas o muestras l quidas como por ejemplo sangre o soluciones El DNA IQ Resin elimina los inhibidores y los contaminantes de la PCR que se encuentran frecuentemente en las muestras de casos Con muestras ricas en ADN el DNA IQ System ofrece una cantidad homog nea de ADN total El sistema se ha utilizado para aislar el ADN de los tipos de muestras de rutina que incluyen hisopos bucales manchas en papel FTA y sangre l quida Adicionalmente el ADN se ha aislado de muestras de casos como por ejemplo tejidos muest
3. Descongele por completo la mezcla maestra PowerPlex Fusion 5X Master Mix la mezcla para par de imprimaci n PowerPlex Fusion 5X Primer Pair Mix y el agua grado de amplificaci n Nota Centrifugue brevemente los tubos para que el contenido se desplace hacia el fondo luego agite los reactivos durante 15 segundos antes de cada uso No centrifugue la 5X Primer Pair Mix 0 5X Master Mix despu s de agitar ya que esto puede provocar que los reactivos se concentren en el fondo del tubo Determine el n mero de reacciones que se configurar n Este n mero debe incluir las reacciones de control positivo y negativo Agregue 1 0 2 reacciones a este n mero para compensar el error de pipeteado Si bien este enfoque consume una peque a cantidad de cada reactivo asegura que usted tenga suficiente mezcla de amplificaci n de la PCR para todas las muestras Adem s garantiza que cada reacci n contenga la misma mezcla de amplificaci n de la PCR Utilice una placa limpia MicroAmp para reunir la reacci n y etiquete de forma apropiada Agregue el volumen final de cada reactivo enumerado en la Tabla 3 a un tubo est ril Tabla 3 Mezcla de amplificaci n de la PCR para amplificaci n directa de ADN de los hisopos Componente de la mezcla de Volumen N merode _ Volumen amplificaci n de la PCR por reacci n reacciones final Agua grado de amplificaci n 13 ul x PowerPlex Fusion 5X Master Mix 5 0 ul x PowerPlex Fusion 5X
4. 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 y 500 Consulte la secci n 9 C figura 24 Seleccione OK Aceptar Promega Corporation 2200 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 45 E 6 H C mo crear un est ndar de tama o con el software GeneMapper ID X J Versi n 3 2 J4 Size Standard Editor Edt Size Standard Desoription Name CCS ILS 60 to 500 Description Size Standard Dye Size Standard Table Size in Basepaits 60 0 1 2 3 4 5 D 7 reo o 2000 10 2250 Ya 250 0 2 2750 13 300 0 14 325 0 ACT 16 375 0 17 900 0 18 4250 19 950 0 8199TA Figura 18 El Size Standard Editor Editor de est ndar de tama o 6 1 C mo crear un m todo de an lisis de casos con el software GeneMapper ID X Versi n 3 2 Estas instrucciones siguen ligeramente el tutorial del software GeneMapper ID de Applied Biosystems p ginas 5 11 1 Seleccione Tools Herramientas luego GeneMapper Manager Administrador de GeneMapper 2 Seleccione la pesta a Analysis Methods M todos de an lisis 3 Seleccione New Nuevo y se abrir un nuevo cuadro de di logo de m todo de an lisis 4 Seleccione HID y seleccione OK Aceptar Nota Si no visualiza
5. 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 12 Impreso en Estados Unidos 9 12 3 Despu s de finalizado el protocolo del ciclo t rmico almacene las muestras amplificadas a 20 C en una caja protegida de la luz Nota El almacenamiento a largo plazo de las muestras amplificadas a 4 C o m s puede producir artefactos Optimizaci n de la PCR El n mero de ciclos se debe optimizar en funci n de los resultados de un experimento inicial para determinar la sensibilidad con su m todo de recolecci n tipos de muestras n mero de perforaciones e instrumentos 1 Elija varias muestras que representen tipos de muestras t picas que encuentra en el laboratorio Prep relas como lo har a habitualmente con su proceso de trabajo normal 2 Seg n su protocolo preferido coloque una o dos perforaciones de tarjeta de almacenamiento de 1 2 mm que contengan una muestra bucal o una perforaci n de 1 2 mm de una tarjeta de almacenamiento que contenga sangre entera en cada pocillo de una placa de reacci n Aseg rese de tratar preliminarmente las muestras no FTA con el PunchSolution Kit Nro de cat DC9271 3 Prepare cuatro placas de reacci n id nticas con perforaciones de las mismas muestras 4 Amplifique muestras utilizando el protocolo de ciclo t rmico proporcionado anteriormente pero someta cada placa a un n mero de ciclos diferente 25 28 ciclos 5 Desp
6. Biosystems Los instrumentos de amplificaci n y detecci n pueden variar Es posible que deba optimizar protocolos incluida la cantidad de ADN de plantilla el n mero de ciclos las condiciones de inyecci n y de volumen de carga para la instrumentaci n de su laboratorio Debe realizarse una validaci n interna Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 2 Impreso en Estados Unidos 9 12 Configuraci n de la amplificaci n El PowerPlex Fusion System proporciona todos los materiales necesarios para amplificar las regiones de las STR del ADN gen mico humano incluida una polimerasa de ADN termoestable de arranque en caliente que es un componente de la mezcla maestra PowerPlex Fusion 5X Master Mix Este manual contiene protocolos para el uso del PowerPlex Fusion System con el termociclador GeneAmp PCR system 9700 adem s de los protocolos para separar los productos amplificados y detectar el material separado figura 1 Los protocolos para operar los instrumentos de detecci n por fluorescencia se deben obtener del fabricante del instrumento Puede solicitar informaci n sobre otros sistemas de STR fluorescentes a las oficinas de Promega o en l nea en www promega com emt 4 Ciclo t rmico Seccion 4 GeneAmp PCR System 9700 V Y An lisis
7. CC5 ILS 500 son sensibles a la luz y se deben almacenar en un sitio oscuro Es altamente recomendable que los reactivos anteriores y posteriores a la amplificaci n se almacenen y se utilicen por separado con diferentes pipetas gradillas de tubos etc Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 4 Impreso en Estados Unidos 9 12 Disponibles por separado Los archivos de texto de los paneles intervalos y repeticiones adecuados para el software GeneMapper ID y el ID X estan disponibles para su descarga en www promega com resources tools genemapper id software panels and bin sets Se requieren est ndares para matrices para la configuraci n inicial de la matriz de separaci n de colores Los est ndares para matrices se suministran por separado y est n disponibles para los ABI PRISM 3100 y 3100 Avant Genetic Analyzers y los Applied Biosystems 3130 3130x1 3500 y 3500xL Genetic Analyzers PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 3100 3130 No de cat DG4700 Antes de comenzar 3 A Precauciones La aplicaci n de la tipificaci n en funci n de la PCR para casos forenses o casos de paternidad requiere estudios de validaci n y medidas de control de calidad que no est n contenidas en este manual 10 11 Las pautas para el proceso de validaci n est n publicadas
8. Configuraciones de SQ amp GQ de Analysis Method M todo de an lisis son predeterminados y afectar n los valores de calidad mostrados en las configuraciones de gr ficos Recomendamos que modifique los valores en estas pesta as para ajustarse a los protocolos de an lisis de datos de su laboratorio C mo importar archivos de texto de paneles y bin de PowerPlex Fusion con software GeneMapper ID Versi n 3 2 Para facilitar el an lisis de los datos generados con el PowerPlex Fusion System hemos creados archivos de texto de paneles e intervalos para permitir la asignaci n autom tica de los genotipos con el software GeneMapper ID X versi n 3 2 Recomendamos que los usuarios del software GeneMapper ID versi n 3 2 completen el tutorial de an lisis de identificaci n humana del software GeneMapper ID de Applied Biosystems para familiarizarse con el funcionamiento correcto del software Para el software GeneMapper ID versi n 3 1 recomendamos a los usuarios que actualicen a la versi n 3 2 Para realizar an lisis con el software GeneMapper ID versi n 3 2 necesitar tener los archivos de texto de paneles e intervalos correctos Los archivos PowerPlex_Fusion_Panels_vX x txt y PowerPlex_Fusion_Bins_vX x txt donde Xx se refiere a la versi n m s reciente de los archivos de texto de paneles e intervalos Inicio 1 Para obtener los archivos de texto de paneles e intervalos para el PowerPlex Fusion Syste
9. El CC5 Internal Lane Standard 500 El est ndar de carril interno CC5 Internal Lane Standard 500 contiene 21 fragmentos de ADN de bases de 60 65 80 100 120 140 160 180 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 y 500 de largo Figura 24 Cada fragmento se etiqueta con un tinte CC5 y se puede detectar por separado como un quinto color en presencia del material amplificado del PowerPlex Fusion El CC5 ILS 500 est dise ado para utilizar en cada inyecci n de CE para aumentar la precisi n en los an lisis cuando se utiliza el PowerPlex Fusion System Los protocolos para preparar y utilizar este est ndar de carril interno se proporcionan en la secci n 5 Nota El tama o de los alelos Penta E y DYS391 de bases gt 475 no utilizar el M todo local del sur Para Penta E los alelos gt 24 se etiquetar n como OL 7004 600 5004 4004 3004 1004 Ad Mirad EE rl UE Noia LEE Nica El x 100 0 120 0 x 140 0 x T T x T T x x x x 160 0 180 0 200 0 225 0 250 0 275 0 300 0 325 0 350 0 375 0 400 0 425 0 450 0 475 0 500 0 8248TA Figura 24 El CC5 Internal Lane Standard 500 Un electroferograma que muestra los fragmentos del CC5 Internal Lane Standard 5
10. P gina 48 9 12 Nota Para los pasos 11 y 12 consulte el manual de usuario de E GeneMapper ID para obtener informaci n A 12 Seleccione la pesta a Quality Flags Indicadores de calidad Puede Promega cambiar estas configuraciones 13 Seleccione OK Aceptar para guardar sus configuraciones 6 I C mo crear un m todo de an lisis de casos con el software GeneMapper ID X Versi n 3 2 continuaci n C mo procesar los datos para las muestras de casos 1 Seleccione File Archivo luego New Project Nuevo proyecto 2 Seleccione Edit Editar luego Add Samples to Project Agregar muestras al proyecto 3 Busque la ubicaci n de los archivos de ejecuci n Resalte los archivos deseados luego seleccione Add to list Agregar a la lista seguido por Add Agregar 4 En la columna Sample Type Tipo de muestra utilice el men desplegable para seleccionar Ladder Escalera Sample Muestra Positive Control Control positivo o Negative Control Control negativo seg n sea lo apropiado para la muestra Cada carpeta en el proyecto debe contener al menos una inyecci n de escalera al lica designada como Ladder Escalera en la columna Sample Type Tipo de muestra para la determinaci n del genotipo correcto Nota El ADN de control positivo definido en el archivo del panel GeneMapper ID es el ADN de control 2800M Redefina el ge
11. fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos Nro de pieza TMD039 9 12 P gina 1 Resoluci n de problemas gue denger dE paa 56 A Amplificaci n y detecci n de Hagmentosnc isicisssnessasrseoedsvnweessnsnossisescarstuonsainnsensesves 58 B Ampliicaci n de ADN extraido sisi ona 58 C Amplificaci n directa de ADN de los perforadores de tarjetas de AIA CSM ATT CTO ANO AAA o E aeiee 59 D Amplificaci n directa de ADN de los hisopos is ccssesonissesssssrivieneersesinnsenieionninniess 61 E Software GeneMapper IDA napa ata 63 E Solares GeneMapper Disnei 65 Referencias ee 68 PPM nutrias arid nina ible 69 A Ventajas de utilizar los locus en el PowerPlex Fusion System e 69 B M todos de extracci n y cuantificaci n de ADN y apoyo de automatizaci n 73 C BECCA Internal Lane Standard 00 airis 74 D e E 75 E TProduciostelacionados sincietinanmcatactcangaicienlcioraisb debia 75 Descripci n Los locus de las repeticiones cortas en t ndem STR consisten en elementos de secuencia breve y repetitiva de pares de bases de 3 7 de largo 1 4 Estas repeticiones est n bien distribuidas en todo el genoma humano y son una fuente rica de marcadores altamente polim rficos que se pueden detectar utilizando la reacci n en cadena de la polimerasa PCR 5 9 Los alelos de los locus de las STR se diferencian por el n mero de copias de la secuencia repetida que contiene la regi n amplificada y se d
12. geno Si la plantilla de ADN est almacenada en un buffer TE que no tiene pH 8 0 o contiene una concentraci n de EDTA m s alta el volumen de ADN agregado no debe superar el 20 del volumen total de la reacci n La eficiencia y la calidad de la amplificaci n de la PCR pueden ser ampliamente alteradas por los cambios en el pH debido al Tris HCl agregado la concentraci n de magnesio disponible debido a la quelaci n provocada por el EDTA u otros inhibidores de la PCR que pueden estar presentes en bajas concentraciones que dependen de la fuente de la plantilla de ADN y del procedimiento de extracci n utilizado 3Las concentraciones de ADN aparente pueden diferir y dependen del m todo de cuantificaci n de ADN utilizado 13 La cantidad de la plantilla de ADN recomendada aqu est basada en las concentraciones de ADN determinadas al medir la absorbancia a 260 nm Recomendamos firmemente que realice experimentos para determinar la cantidad ptima de ADN de acuerdo con su m todo de cuantificaci n de ADN Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 7 4 A Amplificaci n de ADN extra do continuaci n 5 Agite la mezcla de amplificaci n de la PCR durante 5 10 segundos luego agregue la mezcla de amplificaci n
13. mero de ciclos aumenta Aumente o disminuya al doble la masa de ADN de control de 2800M para cada disminuci n o incremento de un ciclo respectivamente Almacenamiento inadecuado del ADN de control 2800M Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos Nro de pieza TMD039 9 12 P gina 61 7 D Amplificaci n directa de ADN de los hisopos continuaci n S ntomas Causas y comentarios Picos adicionales visibles en uno o todos los canales de color El extracto del hisopo estaba contaminado Re na una reacci n que contenga el extracto de hisopo preparado a partir de un hisopo vac o o re na una reacci n en donde el SwabSolution Reagent se procese e incube como vac o sin hisopo Artefactos de amplificaci n de STR La amplificaci n de extractos de hisopo con altas concentraciones de ADN puede causar picos de artefactos debido a exceso de amplificaci n lo que derivar a en saturaci n de la se al en el instrumento CE Utilice 2 ul del extracto del hisopo recomendado por cada reacci n de 25 ul El uso de m s de 2 ul en una reacci n de 25 ul o el uso de 2 ul con un volumen de reacci n menor puede derivar en exceso de amplificaci n y saturaci n de la se al Si se satura la se al repita la amplificaci n con menos extracto de hispo o un
14. ndar de tama o seleccione el est ndar de tama o que se import en la secci n 6 B o se cre en la secci n 6 C Seleccione Analyze Analizar el bot n de flecha verde para comenzar el an lisis de datos Nota De manera predeterminada el software muestra las ventanas de Analysis Requirement Summary Resumen de requisitos de an lisis Allelic Ladder Analysis Summary Resumen de an lisis de escalera al lica y Analysis Summary Resumen de an lisis despu s de que el software lleva a cabo una revisi n de calidad Aseg rese de que se cumplan todos los requisitos a medida que aparezca cada ventana Si no tiene la ventana de resumen de requisitos de an lisis activada es posible que deba hacer una resoluci n de problemas manual adicional Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Nro de pieza TMD039 P gina 38 Impreso en Estados Unidos 9 12 6 E 9 Di se cumplen todos los requisitos de an lisis se abrir la ventana Save Project Guardar proyecto figura 15 Save Project Name Security Group GeneMapper ID X Security Group e Figura 15 La ventana Save Project Guardar proyecto 9430TA 10 Ingrese el nombre del proyecto 11 Elija el grupo de seguridad correspondiente desde el men desplegable lue
15. realizar un paso de extensi n 10 minutos para las muestras de ADN purificado a 60 C despu s del ciclo t rmico secci n 4 Picos adicionales visibles en un o todos los canales de color continuaci n Artefactos relacionados con CE puntas Los cambios menores de voltaje o los cristales de urea que pasan por el l ser pueden provocar puntas o picos inesperados Las puntas a veces aparecen en un color pero a menudo son identificadas f cilmente por su presencia en m s de un color Reinyecte las muestras para confirmar El espectral G5 incorrecto estuvo activo Vuelva a ejecutar las muestras y confirme que el espectral G5 de 5 tintes PowerPlex est configurado para G5 Consulte las instrucciones sobre la preparaci n del instrumento en la secci n 5 Levante o sangrado El levante puede ocurrir cuando las alturas de los picos son demasiado altas o si una matriz insuficiente o incorrecta se aplica a las muestras Realice una nueva calibraci n espectral y vuelva a ejecutar las muestras e Las sensibilidades del instrumento pueden variar Optimice las condiciones de inyecci n Consulte la secci n 5 Artefactos relacionados con CE contaminantes Los contaminantes en el agua utilizada con el instrumento o para diluir el buffer 10X del analizador gen tico pueden generar picos en el canal de fluoresce na y el canal JOE Utilice agua desionizada en autoclave cambie los viales y lave el reservorio del buffer
16. 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos Nro de pieza TMD039 9 12 P gina 69 O Promega 9 A Ventajas de utilizar los locus en el PowerPlex Fusion System continuaci n Tabla 4 Informaci n espec fica del locus del PowerPlex Fusion System Secuencia repetida Locus de las STR Etiqueta Ubicaci n cromos mica 5 3 Amelogenina Fluoresceina Xp22 1 22 3 e Y NA D351358 Fluoresce na 3p21 31 45 557 Mb Complejo TCTA D1S1656 Fluoresceina 1q42 228 972 Mb Complejo TAGA D25441 Fluoresce na 2p14 68 214 Mb TCTA D10S1248 Fluoresceina 10q26 3 130 567 Mb GGAA D135317 Fluoresce na 13q31 1 81 62 Mb TATC Penta E Fluoresce na 15q26 2 95 175 Mb AAAGA D168539 JOE 16q24 1 84 944 Mb GATA D18551 JOE 18q21 33 59 1 Mb AGAA 19 D251338 JOE 2q35 218 705 Mb TGCC TTCC CSF1PO JOE 5q33 1 149 436 Mb AGAT Penta D JOE 21q22 3 43 88 Mb AAAGA THO1 TMR ET 11p15 5 2 149 Mb AATG 19 vWA TMR ET 12p13 31 5 963Mb Complejo TCTA 19 D21S11 TMR ET 21q21 1 19 476 Mb Complejo TCTA 19 D75820 TMR ET 7q21 11 83 433 Mb GATA D58818 TMR ET 5q23 2 123 139 Mb AGAT TPOX TMR ET 2p25 3 1 472 Mb AATG DYS391 TMR ET Y TCTA D8S1179 CXR ET 8q24 13 125 976 Mb Complejo TCTA 19 D128391 CXR ET 12p12 12 341 Mb Complejo AGAT AGAC D195433 CXR ET 19q12 35 109 Mb Complejo AAGG FGA CXR ET 4q28 155 866 Mb Complejo TITC 19 D2251045 CXR ET 22q12 3 35 779 Mb ATT y 22 y en www cstl nist g
17. HS System 100 reactivos DC2101 400 reactivos DC2100 PowerPlex CS7 System Custom 100 reactivos X6613 No debe ser utilizado para diagn stico m dico Componentes accesorios Producto Tama o Nro de Cat PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 3100 3130 25 ul cada tinte DG4700 PunchSolution Kit 100 preparaciones DC9271 SwabSolution Kit 100 preparaciones DC8271 CC5 Internal Lane Standard 500 300 ul DG1521 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 75 9 E Productos relacionados continuaci n Componentes accesorios Producto Tama o Nro de Cat PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 3100 3130 25 ul cada tinte DG4700 PunchSolution Kit 100 preparaciones DC9271 SwabSolution Kit 100 preparaciones DC8271 CC5 Internal Lane Standard 500 300 ul DG1521 ADN de control 2800M 10 ng ul 25 ul DD7101 ADN de control 2800M 0 25 ng ul 500 pl DD7251 Agua grado de amplificaci n 6250 ul 5 x 1250 ul DW0991 No debe ser utilizado para diagn stico m dico Preparaci n de muestras y sistemas de cuantificaci n de ADN Producto Tama o Nro de Cat Sistema DNA IQ System 100 reactivos DC6701 400 reactivos DC6700 Plexor HY System 800 reactivos DC1000 200 reactivos DC1001 No debe ser
18. de la PCR a cada pocillo de la reacci n Si no se agita lo suficiente la mezcla de amplificaci n de la PCR puede provocar una amplificaci n escasa o falta de equilibrio entre locus Agregue la plantilla de ADN 0 25 0 5 ng para cada muestra al pocillo respectivo con la mezcla de amplificaci n de la PCR Para el control positivo de la amplificaci n agite el tubo de ADN de control 2800M luego diluya una al cuota hasta 0 5 ng en el volumen de plantilla de ADN deseado Agregue 0 5 ng de ADN diluido a un pocillo de reacci n con la mezcla de amplificaci n de la PCR Para el control negativo de amplificaci n pipetee agua grado de amplificaci n o buffer TE en vez de la plantilla de ADN en el pocillo de reacci n que contiene una mezcla de amplificaci n de PCR Selle la placa o cierre los tubos Opcional Centrifugue brevemente la placa para llevar el contenido hasta el fondo de los pocillos y retire cualquier burbuja de aire Ciclo t rmico Los instrumentos de amplificaci n y detecci n pueden variar Es posible que deba optimizar protocolos incluida la cantidad de ADN de plantilla el n mero de ciclos las condiciones de inyecci n y de volumen de carga para la instrumentaci n de su laboratorio Las pruebas realizadas en Promega demuestran que 30 ciclos funcionan bien para 0 5 ng de plantillas de ADN purificadas 1 2 Coloque una placa o tubos de reacci n MicroAmp en el termociclador Seleccione y ejecute el p
19. de usuario de GeneMapper ID X para obtener informaci n Seleccione la pesta a SQ amp GQ Settings Configuraciones de SQ y GQ Puede cambiar estas configuraciones Seleccione Save Guardar para guardar el nuevo m todo de an lisis Seleccione Done Realizado para salir del administrador de GeneMapper ID X C mo procesar datos para la base de datos o muestras de paternidad 1 2 Seleccione File Archivo luego New Project Nuevo proyecto Seleccione Edit Editar luego Add Samples to Project Agregar muestras al proyecto Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 41 6 E C mo crear una base de datos o m todo de an lisis de paternidad con el software GeneMapper ID X Versi n 1 2 continuaci n de 9 10 Explore hasta la ubicaci n de los archivos de ejecuci n Resalte los archivos deseados luego seleccione Add to list Agregar a la lista seguido por Add Agregar En la columna Sample Type Tipo de muestra utilice el men desplegable para seleccionar Allelic Ladder Escalera al lica Sample Muestra Positive Control Control positivo o Negative Control Control negativo seg n sea lo apropiad
20. el contenido se desplace hacia el fondo luego agite durante 15 segundos antes de cada uso No centrifugue despu s de agitar ya que esto puede provocar que el est ndar de tama o se concentre en el fondo del tubo 2 Prepare un c ctel de carga combinando y mezclando el est ndar de carril interno CC5 Internal Lane Standard 500 y la formamida Hi Di de la siguiente manera 1 0 ul CC5 ILS 500 x Nro de muestras 10 0 ul de formamida Hi Di x Nro de muestras Nota El volumen del est ndar de carril interno utilizado en el c ctel de carga puede ser aumentado o disminuido para ajustar la intensidad de los picos de est ndar de tama o seg n las preferencias del laboratorio Mantenga el volumen de la formamida a 10 0 ul y ajuste el volumen agregado a los pocillos en el paso 4 de manera acorde 3 Agite durante 10 15 segundos para mezclar 4 Pipetee 11 ul de formamida mezcla de est ndar de carril interno en cada pocillo Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 28 Impreso en Estados Unidos 9 12 Agregue 1 ul de la muestra amplificada o 1 ul de PowerPlex Fusion Allelic Ladder Mix Cubra los pocillos con la septa apropiada Nota Los limites de detecci n del instrumento var an por lo tanto el tiempo de inyecci n el voltaje de inye
21. muestras en el instrumento y cierre las puertas del instrumento En el visor espectral seleccione el conjunto de tintes G5 y confirme que el conjunto de tintes activo es el archivo generado para la qu mica de 5 tintes del PowerPlex Es fundamental seleccionar el espectral G5 correcto para la qu mica de 5 tintes del PowerPlex Si la qu mica de 5 tintes del PowerPlex no es el conjunto de tintes activos localice el espectral de 5 tintes del PowerPlex en la lista de calibraciones para el conjunto de tintes G5 y seleccione set configurar En el programador de ejecuci n localice el registro de placas que cre en los pasos 3 y 4 y haga clic una vez en el nombre para resaltarlo Una vez que el registro de placas est resaltado haga clic en el gr fico de placas que corresponde a la placa en el extractor autom tico que contiene sus muestras amplificadas Cuando el registro de placas est vinculado a la placa el gr fico de placas cambiar de amarillo a verde y se habilitar la fecha verde de Run Instrument Ejecutar instrumento Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Nro de pieza TMD039 P gina 30 Impreso en Estados Unidos 9 12 6 10 Haga clic en la flecha verde de Run Instrument Ejecutar instrumento en la barra de herramientas para comenza
22. n mero menor de ciclos Artefactos de amplificaci n de STR La amplificaci n de STR puede dar como resultado artefactos que aparecen como picos de una base m s peque a que el alelo debido a la incorporaci n incompleta en el residuo de 3 A Aseg rese de realizar el paso de extensi n de 20 minutos a 60 C despu s del ciclo t rmico secci n 4 C e Utilice 2 ul del extracto del hisopo en una reacci n de 25 pl del PowerPlex Fusion Un volumen mayor de extracto del hisopo puede contener m s de la cantidad recomendada de plantilla de ADN lo que da como resultado una adenilaci n incompleta e Disminuya el n mero de ciclos e Aumente el tiempo de extensi n final Falta de equilibrio de la altura de picos El exceso de ADN en la reacci n de amplificaci n puede derivar en una falta tal de equilibrio de locus a locus dentro de un canal de tinte que las alturas de picos en los locus m s peque os sean mayores que las de los locus m s grandes efecto de pendiente de esqu Use menos extracto de hisopo o reduzca el n mero de ciclos SwabSolution Reagent activo arrastrado desde los extractos de hisopo hacia la reacci n de amplificaci n Los locus m s grandes son los m s susceptibles al arrastre del reactivo y se dejar n fuera antes que los locus m s peque os Aseg rese de que el calentador est calentando a 70 C 90 C si se usan placas profunda para pocillo cuadrado de 2 2 ml y que las muestras
23. reacci n de amplificaci n Aseg rese de que el calentador est calentando a 70 C 90 C si se usa una placa profunda para pocillo cuadrado de 2 2 ml y que las muestras se hayan incubado durante el periodo total de 30 minutos La incubaci n durante periodos m s cortos puede derivar en inactivaci n incompleta del reactivo No use una incubadora colocada a 70 C para incubar tubos o placas la transferencia de calor es ineficiente y ocasionar mal desempe o Use nicamente un calentador para mantener una transferencia de calor eficaz Hemos sometido a pruebas los tiempos de incubaci n de 60 minutos y no observamos diferencia alguna en el desempe o en comparaci n con una incubaci n de 30 minutos El ADN no era accesible o material no l tico Materiales no FTA previamente tratados con SwabSolution Reagent para garantizar que se libre el ADN de las proteinas celulares Picos d biles o ausentes para Si falla en amplificarse la reacci n de control positivo revise la reacci n de control positivo para asegurarse de que se haya agregado la cantidad correcta de ADN de control 2800M a la reacci n Debido a los n meros de ciclo menores utilizados con extractos de hisopos es necesario aumentar la masa de ADN de control 2800M para obtener un perfil Recomendamos 10 ng de ADN de control 2800M por reacci n de amplificaci n de 25 pl Esta masa de ADN debe reducirse si el n mero de ciclos utilizados se aumenta y se debe disminuir si el n
24. se hayan incubado durante el periodo total de 30 minutos La incubaci n durante periodos m s cortos puede derivar en inactivaci n incompleta del reactivo No use una incubadora colocada a 70 C para incubar tubos o placas La transferencia de calor es ineficiente y derivar en un mal desempe o Use nicamente un calentador para mantener una transferencia de calor eficaz SwabSolution Reagent inactivo Descongele el SwabSolution Reagent por completo en ba o Mar a a 37 C y mezcle al invertirlo suavemente Almacene el SwabSolution Reagent a 2 10 C No almacene los reactivos Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 62 Impreso en Estados Unidos 9 12 Sintomas Causas y comentarios en la puerta del refrigerador en donde puede fluctuar la temperatura No vuelva a refrigerar evite varios ciclos de congelamiento descongelamiento ya que esto puede reducir la actividad El ADN no era accesible o material no l tico Los locus peque os pueden amplificarse preferencialmente y descartar los locus grandes Materiales no FTA previamente tratados con PunchSolution Reagent para garantizar que se libre el ADN de las prote nas celulares 7 E Software GeneMapper ID X S ntomas Causas y comentarios Los picos de las repeticiones El archivo de
25. una resoluci n de problemas manual adicional Si se cumplen todos los requisitos de an lisis se abrir la ventana Save Project Guardar proyecto figura 15 Ingrese el nombre del proyecto Elija el grupo de seguridad correspondiente desde el men desplegable luego seleccione OK Aceptar Nota El tama o de los alelos Penta E y DYS391 de bases gt 475 no utilizar el M todo local del sur Para Penta E los alelos gt 24 se etiquetar n como OL Cuando finalice el an lisis aparecer la pantalla de resumen de an lisis Recomendamos que revise cualquier barra de encabezamiento del marcador amarilla o roja en la vista de gr ficos y que la maneje de forma acorde a los Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 42 Impreso en Estados Unidos 9 12 6 F procedimientos operativos est ndar del laboratorio Navegue hacia la pesta a Genotype Genotipo o la pesta a Samples Muestras Para ayudar a la revisi n de cualquier muestra de baja calidad utilice las configuraciones predeterminadas del gr fico de interpretaci n de datos y revise el contenido en la tabla Quality Value Details Detalles de valor de calidad Los valores mostrados en las pesta as Peak Quality Calidad de picos y SQ amp GQ Settings
26. 00 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de p P gina 74 ieza TMD039 Impreso en Estados Unidos 9 12 9 D Composicion de buffers y soluciones Buffer TE 10 mM Tris HCl 0 1 mM EDTA pH 8 0 121g Base Tris 0 037 g EDTA Na EDTA 2H 0 Disuelva la base Tris y el EDTA en 900 ml de agua desionizada Ajuste hasta un pH de 8 0 con HCI Lleve el volumen final hasta 1 litro con agua Buffer TE con 20 pg ml de gluc geno 121g Base Tris 0 037 g EDTA Na EDTA 2H 0 20 ug ml gluc geno Disuelva la base Tris y el EDTA en 900 ml de agua desionizada Ajuste hasta un pH de 8 0 con HCI desionizada Agregue gluc geno Lleve el volumen final hasta 1 litro con agua desionizada 9 E Productos relacionados Sistemas de STR Producto Tama o Nro de Cat PowerPlex Y23 System 50 reactivos DC2305 200 reactivos DC2320 PowerPlex 21 System 200 reactivos DC8902 4 x 200 reacciones DC8942 PowerPlex 18D System 200 reactivos DC1802 800 reactivos DC1808 PowerPlex ESX 16 System 100 reactivos DC6711 400 reactivos DC6710 PowerPlex ESX 17 System 100 reactivos DC6721 400 reactivos DC6720 PowerPlex ESI 16 System 100 reactivos DC6771 400 reactivos DC6770 PowerPlex ESI 17 Pro System 100 reactivos DC7781 400 reactivos DC7780 PowerPlex 16
27. 16 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 68 Impreso en Estados Unidos 9 12 23 24 25 26 27 Bar W et al 1997 DNA recommendations Further report of the DNA Commission of the ISFH Si regarding the use of short tandem repeat systems Int J Legal Med 110 175 6 o Gill P et al 1997 Considerations from the European DNA Profiling Group EDNAP concerning STR nomenclature Forensic Sci Int 87 185 92 Promega Fr geau C J et al 1995 Characterization of human lymphoid cell lines GM9947 and GM9948 as intra and interlaboratory reference standards for DNA typing Genomics 28 184 97 Mandrekar P V Krenke B E and Tereba A 2001 DNA IQ The intelligent way to purify DNA Profiles in DNA 4 3 16 Krenke B E et al 2005 Development of a novel fluorescent two primer approach to quantitative PCR Profiles in DNA 8 1 3 5 9 Ap ndice 9 A Ventajas de utilizar los locus en el PowerPlex Fusion System Una sola reacci n del PowerPlex Fusion System amplifica todos los locus b sicos requeridos para las bases de datos de CODIS EE UU y europeas Tablas 4 ay 5 La tabla 6 enumera los alelos del PowerPlex Fusion System revelados en las plantillas de ADN est ndar habitualmente disponibles Adem s el locus DYS391 espec ficos para sexo masculino se incluye para identificar los resultados nulos de Y para amelogenina Hemos seleccionado cuidadosamente las imprimaciones par
28. 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 60 Impreso en Estados Unidos 9 12 Sintomas Causas y comentarios CG Falta de equilibrio de la altura El ADN no era accesible o material no l tico Los locus de KE picos continuaci n peque os pueden amplificarse preferencialmente y descartar los locus grandes Materiales no FTA previamente tratados Promega con PunchSolution Reagent para garantizar que se libre el ADN de las prote nas celulares 7 D Amplificaci n directa de ADN de los hisopos La siguiente informaci n es espec fica para la amplificaci n directa de ADN de los hisopos despu s del pretratamiento con el SwabSolution Kit Para obtener informaci n adicional sobre la amplificaci n y la detecci n generales consulte la secci n 7 A S ntomas Causas y comentarios Picos de alelos d biles o ausentes Acumulaci n insuficiente de la muestra El desprendimiento y recolecci n de las c lulas fue variable Aumente el n mero de ciclos del donante SwabSolution Reagent inactivo Descongele el SwabSolution Reagent por completo en ba o Mar a a 37 C y mezcle al invertirlo suavemente Almacene el SwabSolution Reagent a 2 10 C No almacene los reactivos en la puerta del refrigerador en donde puede fluctuar la temperatura No vuelva a refrigerar evite varios ciclos de congelamiento descongelamiento ya que esto puede reducir la actividad SwabSolution Reagent activo arrastrado hacia la
29. 87 Slipped strand mispairing A major mechanism for DNA sequence evolution Mol Biol Evol 4 203 21 Schl tterer C and Tautz D 1992 Slippage synthesis of simple sequence DNA Nucleic Acids Res 20 211 5 Smith J R et al 1995 Approach to genotyping errors caused by nontemplated nucleotide addition by Taq DNA polymerase Genome Res 5 312 7 Magnuson V L et al 1996 Substrate nucleotide determined non templated addition of adenine by Taq DNA polymerase Implications for PCR based genotyping BioTechniques 21 700 9 Walsh P S Fildes N J and Reynolds R 1996 Sequence analysis and characterization of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vWA Nucleic Acids Res 24 2807 12 Griffiths R et al 1998 New reference allelic ladders to improve allelic designation in a multiplex STR system Int J Legal Med 111 267 72 Butler J M 2006 Genetics and genomics of core STR loci used in human identity testing J Forensic Sci 51 253 65 Hill C R et al 2008 Characterization of 26 miniSTR loci for improved analysis of degraded DNA samples J Forensic Sci 53 73 80 Lu D J Liu Q L and Zhao H 2011 Genetic data of nine non CODIS STRs in Chinese Han population from Guangdong Province Southern China Int J Legal Med 125 133 7 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 25
30. GeneMapper ID X No est n destinadas a ser una gu a exhaustiva para utilizar el software GeneMapper ID X Recomendamos que los usuarios se comuniquen con Applied Biosystems para obtener capacitaci n sobre el software Lk Seleccione Tools Herramientas luego GeneMapper ID X Manager Administrador de GeneMapper ID X Seleccione la pesta a Analysis Methods M todos de an lisis Seleccione New Nuevo y se abrir un nuevo cuadro de di logo de m todo de an lisis En la ventana Analysis Method Editor Editor de m todo de an lisis seleccione GeneMapper ID X Security Group como el grupo de seguridad Esto permite el acceso a todos los usuarios del software Se pueden utilizar otros grupos de seguridad Ingrese un nombre descriptivo para el m todo de an lisis como por ejemplo PowerPlex Fusion Seleccione la pesta a Allele Alelo figura 13 Seleccione el archivo de texto de intervalos que se import en la secci n 6 A Aseg rese de que la casilla Use marker specific stutter ratio and distance if available Utilizar proporci n de repeticiones de marcador espec fico y distancia si est disponible est marcada Recomendamos los valores mostrados en la figura 13 para un correcto filtrado de los picos de las repeticiones cuando se utiliza el PowerPlex Fusion System Es posible que deba optimizar estas configuraciones Debe realizarse una validaci n inter
31. IDFragmentAnalysis36_POP4 en la lista desplegable Template Plantilla Confirme que el tiempo de inyecci n sea de 5 segundos el voltaje de inyecci n sea de 3 kV y el tiempo de ejecuci n sea de 1500 segundos Proporcione un nombre descriptivo a su m dulo de ejecuci n y seleccione OK Aceptar Nota Las sensibilidades del instrumento pueden variar El tiempo y el voltaje de inyecci n se pueden ajustar en el administrador de m dulos Un rango sugerido para el tiempo de inyecci n es de 3 22 segundos y para el voltaje de inyecci n es de 1 3 kV En el administrador de protocolos seleccione New Nuevo Tipee un nombre para su protocolo Seleccione Regular en la lista desplegable Type Tipo y seleccione el m dulo de ejecuci n que cre en el paso anterior en la lista desplegable Run Module Ejecutar m dulos Por ltimo seleccione G5 de la lista desplegable de conjunto de tintes Seleccione OK Aceptar Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 29 5 B Detecci n de fragmentos amplificados utilizando ABI PRISM 3100 o Avant Genetic Analyzer 3100 con el software de recolecci n de datos Versi n 2 0 o el 3130 o 3130x1 Genetic Analyzer de Applied Biosystems con el
32. Mix 5 0 ul x volumen total de la reacci n 25 ul Agregue agua grado de amplificaci n al primer tubo luego agregue la PowerPlex Fusion 5X Master Mix y la PowerPlex Fusion 5X Primer Pair Mix Para perforaciones de tarjeta FTA la plantilla de ADN se agregar en el paso 6 Agite la mezcla de amplificaci n de la PCR durante 5 10 segundos luego pipetee 25 ul de la mezcla de amplificaci n de la PCR en cada pocillo de reacci n Si no se agita lo suficiente la mezcla de amplificaci n de la PCR puede provocar una amplificaci n escasa o falta de equilibrio entre locus Para tarjetas de almacenamiento FTA agregue una o dos perforaciones de 1 2 mm de una tarjeta que contenga una muestra bucal o una perforaci n de 1 2 mm de una tarjeta que contenga una muestra de sangre entera a los pocillos apropiados de la placa de reacci n Para perforaciones de tarjetas no FTA agregue la mezcla de amplificaci n PCR a las perforaciones tratadas preliminarmente con PunchSolution Nota Tambi n es aceptable agregar primero la perforaci n de la tarjeta FTA luego agregue la mezcla de amplificaci n de PCR Para el control positivo de amplificaci n agregue 1 pl de ADN de control 2800M 10 ng a un pocillo de reacci n con 25 pl de mezcla de amplificaci n de la PCR Notas 1 No incluya perforaciones de tarjetas de almacenamiento en blanco en las reacciones de control positivo 2 Puede ser necesaria la optimizaci n d
33. Primer Pair Mix 5 0 pl x Extracto del hisopo 2 0 pl volumen total de la reacci n 25 ul lAgregue agua grado de amplificaci n al primer tubo luego agregue la PowerPlex Fusion 5X Master Mix y la PowerPlex Fusion 5X Primer Pair Mix El extracto del hisopo se agregar en el paso 6 6 Agite la mezcla de amplificaci n de la PCR durante 5 10 segundos luego pipetee 23 ul de la mezcla de amplificaci n de la PCR en cada pocillo de reacci n Si no se agita lo suficiente la mezcla de amplificaci n de la PCR puede provocar una amplificaci n escasa o falta de equilibrio entre locus Pipetee 2 0 ul del extracto de hisopo para cada muestra en el pocillo apropiado de la placa de reacci n Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 14 Impreso en Estados Unidos 9 12 7 Para el control positivo de amplificaci n agite el tubo del ADN de control 2800M luego diluya una al cuota hasta 5 0 ng pl Agregue 2 pl 10 ng a un pocillo de reacci n que contenga 23 pl de mezcla de amplificaci n de la PCR 8 Para el control negativo de amplificaci n pipetee 2 0 ul de agua grado de amplificaci n o buffer TE en vez del extracto de hisopo en un pocillo de reacci n que contenga la mezcla de amplificaci n de PCR 9 Gelle la placa Opcional Cent
34. Repita la preparaci n de la muestra utilizando formamida nueva El almacenamiento a largo plazo de la muestra amplificada en formamida puede provocar su degradaci n El pol mero CE excedi su fecha de vencimiento o el pol mero estuvo almacenado a una temperatura ambiente durante m s de una semana Realice un mantenimiento diario o semanal de los instrumentos como lo recomienda el fabricante Artefactos relacionados con POP 7 Este sistema no se desarroll para usarse con el pol mero POP 7 si se usa con el pol mero POP 7 se requiere optimizaci n y validaci n interna El uso del pol mero CE POP 7 puede cambiar la migraci n y ubicaci n por tama o de los artefactos en comparaci n con las ubicaciones de POP 4 A un artefacto se le puede ver con el pol mero POP 7 en 88 90bp en el canal JOE y en 74 76 85 87 o 99 101bp en el canal de fluoresce na Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 57 7 A Amplificaci n y detecci n de fragmentos continuaci n S ntomas Causas y comentarios No funciona la escalera al lica Falta de equilibrio de la altura de picos La escalera al lica y la mezcla de par de imprimaci n no eran compatibles Compruebe la misma que las muestras que l
35. Se utiliz una escalera al lica de mala calidad durante el an lisis Aseg rese de que s lo se utilicen escaleras al licas de alta calidad para el an lisis Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 65 7 F Software GeneMapper ID continuaci n S ntomas Causas y comentarios El est ndar de tama o no se denomin El punto de partida de los datos no fue correcto para el rango parcial elegido correctamente en la Secci n 6 1 Ajuste el punto de partida de los datos en el m todo de an lisis Alternativamente utilice un rango completo para el an lisis Picos adicionales en el est ndar de tama o en modo avanzado Abra el Size Match Editor Editor de coincidencia de tama o Resalte el pico adicional seleccione Edit Editar y delete size label Eliminar la etiqueta de tama o Seleccione auto adjust sizes tama os de ajuste autom tico La ejecuci n fue demasiado breve y los picos m s grandes en el est ndar de carril interno no se capturaron No todos los picos CC5 ILS 500 definidos en el est ndar de tama o se detectaron durante la ejecuci n e Cree un nuevo est ndar de tama o utilizando los fragmentos del est ndar de carril interno presentes en la muestra e
36. Technical Manual PowerPlex Fusion System INSTRUCCIONES PARA UTILIZAR LOS PRODUCTOS DC2402 Y DC2408 IMPRESO EN ESTADOS UNIDOS 9 12 Nro de pieza TMD039 PowerPlex Fusion System O Toda la bibliograf a t cnica est disponible en Internet en el sitio www promega com protocols Visite el sitio web para asegurarse de estar utilizando la versi n m s actualizada de este manual t cnico Comun quese con el servicio t cnico de Promega si tiene alguna pregunta acerca del uso de este sistema Correo electr nico genetic promega com Lk DeSCrip cron e EE Eege 2 2 Componentes y condiciones de almacenamiento del producho ue 4 Se Antes de COMECHZ AL EE ere B Calibraci n espectral 4 Protocolos para la amplificaci n del ADN al utilizar el Powerr lex ern Vte simios 6 A Amplificaci n de ADN exo nta 6 B Amplificaci n directa de ADN de los perforadores de tarjetas de Al a A vg aces E A ant ena 9 C Amplificaci n directa de ADN de los hisoposivscsssssiciassssessnssavorsinsusonnueshvensssenssnvosiunss 13 5 Configuraci n del instrumento y preparaci n de la muestra EN 16 A Detecci n de fragmentos amplificados al utilizar el 3500 o el 3500xL Genetic Analyzer de Applied Dios Vote Wise ai di 16 B Detecci n de fragmentos amplificados al utilizar ABI PRISM 3100 o 3100 Avant Genetic Analyzer con el software de recolecci n de datos Versi n 2 0 o el 3130 o 3130x Genetic Analyzer de Applied Biosystems con s
37. Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 Impreso en Estados Unidos P gina 22 9 12 9228TA 5 Para crear un nuevo ensayo navegue hacia la biblioteca Seleccione CG Assays Ensayo luego seleccione Create Crear Alternativamente Ya se puede utilizar un ensayo previamente creado En la ventana Create New Assay Crear un nuevo ensayo figura 6 g seleccione el Protocolo de instrumento creado en el paso 2 y el Protocolo de control de calidad creado en el Paso 4 Asigne un nombre descriptivo de ensayo Seleccione el tipo de aplicaci n HID Se requiere un ensayo para todas las muestras nombradas en una placa L Dashboard Edit Li 9 Library Resources x Manage File Name Conventions Results Group Setup an Assay E Analyze Instrument Protocols o Assay Name 1L5500_65 E Locked Color Size Standards Basecaling Protocols Application Type Sizecalling Protocols Protocols QC Protocols Do you wish to assign multiple instrument protocols to this assay No Yes Sequencing Analysis Protocols Instrument Protocol HID36_POP4 PromegaG5 24sec LI Y eege 11 qc procot Fragment Analysis Protocols ot Analysis Protocols Ed H S GeneMapper IDX Protocol E it BP E 5 g E gt Figura 6 Ventana de creaci n de nuevos ensayos Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU N mero gratui
38. Vuelva a ejecutar las muestras utilizando un tiempo de ejecuci n m s prolongado Faltan picos en el est ndar de tama o Si los picos est n por debajo del umbral disminuya el umbral Mensaje de error Either panel size standard or analysis method is invalid El panel el est ndar de tama o o el m todo de an lisis es inv lido No se definieron alelos pero no apareci ning n de amplitud de picos en el m todo de an lisis para el canal de color naranja con el fin de incluir los picos Si los picos son de mala calidad vuelva a definir el est ndar de tama o para la muestra para saltarse estos picos El est ndar de tama o y el m todo de an lisis no estaban en el mismo modo Classic vs Basic o Advanced Cl sico versus B sico o avanzado Aseg rese de que ambos archivos est n configurados en el mismo modo ya sea en el modo cl sico b sico o avanzado El archivo de texto de paneles no se seleccion para la muestra En la columna Panel mensaje de error Panel seleccione el archivo de texto de paneles apropiado para el sistema de STR que se utiliz No se seleccion ning n est ndar de tama o En la columna Size Standard Est ndar de tama o aseg rese de seleccionar el est ndar de tama o apropiado El est ndar de tama o no se defini correctamente o faltan los picos de mayor tama o Vuelva a definir el est ndar de tama o para incluir solo los picos presentes en su m
39. WA 16 19 17 18 17 17 D21511 29 31 2 30 30 29 30 D7S820 8 11 10 11 1111 161 D5S818 12 12 11 11 11 13 TPOX 11 11 8 8 8 9 DYS391 10 10 D8S1179 14 15 18 15 1 113 D125391 18 23 18 20 18 24 D195433 13 14 14 15 13 14 FGA 20 23 23 24 24 26 D2251045 16 16 11 14 16 18 La informaci n sobre las cadenas 9947A y 9948 est disponible en l nea en http ccr coriell org Sections Search Sample_Detail aspx Ref GM09947 and http ccr coriell org Sections Search Sample_Detail aspx Ref GM09948 La informaci n sobre el uso del ADN 9947A y 9948 como plantillas de ADN est ndar se puede encontrar en la referencia 25 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 72 Impreso en Estados Unidos 9 12 9 B M todos de extracci n y cuantificaci n de ADN y apoyo de automatizaci n Promega ofrece una amplia variedad de reactivos y m todos automatizados para la preparaci n de muestras purificaci n de ADN y cuantificaci n de ADN antes de la amplificaci n de las STR Para an lisis de bases de datos referencia y otras muestras de una sola fuente recomendamos la amplificaci n directa de perforaciones FTA o el procesamiento preliminar de hisopos y perforaciones no FTA con el SwabSolution Kit o el PunchSolution Kit El SwabSolution Kit Cat
40. a intensidad de las repeticiones pueden diferir levemente entre los conjuntos de imprimaci n para los mismos locus En cada locus el promedio m s tres desviaciones est ndar es la medida utilizada tanto en el archivo de texto de paneles del PowerPlex Fusion para el filtrado espec fico del locus en el software GeneMapper ID versi n 3 2 como en el archivo de texto de repeticiones PowerPlex Fusion para el filtrado espec fico del locus en el software GeneMapper ID X Adem s de los picos de las repeticiones se pueden observar otros picos de artefactos en algunos lugares del PowerPlex Fusion System Se pueden ver productos de nivel bajo en las posiciones n 2 y n 2 con algunos locus como por ejemplo D1S1656 D135317 D18551 D21511 D75820 D5S818 D125391 y D195433 A veces aparecen picos N 1 en la amelogenina y en D25441 A veces aparecen picos N 3 en D125391 Se pueden ver picos de distorsi n en el canal de fluoresce na en bases de 64 65 en el canal JOE en bases de 70 en el canal TMR en bases de 65 67 y en el canal CXR en bases de 58 65 El PowerPlex Fusion System est optimizado para usarse con pol mero POP 4 Este sistema no se desarroll para usarse con el pol mero POP 7 si se usa con el pol mero POP 7 se requiere optimizaci n y validaci n interna No se han notado algunos artefactos independientes de ADN espec ficos para el PowerPlex Fusion System con pol mero POP 7 Los filtros globales utilizados p
41. a de ADN puede afectar negativamente a la PCR Un cambio en el pH Promega tambi n puede afectar a la PCR Almacene el ADN en un buffer TE 10 mM Tris HCl pH 8 0 0 1 mM EDTA o buffer TE con 20 ug ml de gluc geno El volumen de la reacci n fue demasiado bajo Este sistema se optimiz para un volumen final de reacci n de 25 pl La disminuci n del volumen de la reacci n puede dar como resultado un rendimiento de calidad inferior Picos adicionales visibles en un Artefactos de amplificaci n de STR La amplificaci n de o todos los canales de colores cantidades excesivas de ADN purificado puede dar como resultado un n mero m s alto de picos de artefacto Utilice la cantidad recomendada de plantilla de ADN Consulte la secci n 6 L para obtener informaci n adicional sobre repeticiones y artefactos Falta de equilibrio de la Cantidad excesiva de ADN La amplificaci n de gt 0 5 ng de altura de picos plantilla puede dar como resultado una falta de equilibrio con locus m s peque os que muestran m s producto que los locus m s grandes Disminuya el n mero de ciclos Muestra de ADN degradado La plantilla de ADN se degrad y locus m s grandes mostraron una producci n disminuida Plantilla de ADN insuficiente Utilice la cantidad recomendada de plantilla de ADN si est disponible Puede haber efectos estoc sticos cuando se amplifican cantidades bajas de plantilla Plantilla de ADN impuro Los inhibidores que pueden estar presen
42. a de encabezamiento del marcador de un locus al color verde anule el GQ en la ventana de gr ficos Alelos no definidos Para analizar las muestras con el software GeneMapper ID X se debe definir al menos una escalera al lica Se defini un n mero insuficiente de fragmentos CC5 ILS 500 Aseg rese de definir al menos dos fragmentos CC5 ILS 500 m s peque os que el menor pico de muestra y al menos dos fragmentos CC5 ILS 500 m s grandes que el mayor pico de muestra En estas circunstancias la escalera al lica debe haber fallado en la instancia de verificaci n de calidad La ejecuci n fue demasiado breve y los picos m s grandes en el est ndar de carril interno no se capturaron No todos los picos CC5 ILS 500 definidos en el est ndar de tama o se detectaron durante la ejecuci n e Cree un nuevo est ndar de tama o utilizando los fragmentos del est ndar de carril interno presentes en la muestra e Vuelva a ejecutar las muestras utilizando un tiempo de ejecuci n m s prolongado Se utiliz una escalera al lica de mala calidad durante el an lisis Aseg rese de que s lo se utilicen escaleras al licas de alta calidad para el an lisis Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 63 7 E Software Ge
43. a escalera al lica proviene del mismo kit que la mezcla de par de imprimaci n Formamida de mala calidad Utilice s lo formamida Hi Di cuando analice muestras Aseg rese de que la escalera al lica y las muestras provienen de la misma ejecuci n del instrumento La migraci n de las muestras cambi levemente durante el curso de una ejecuci n de CE con varias muestras Esto puede deberse a los cambios en la temperatura o en la columna de CE con el tiempo Utilice una inyecci n diferente de escalera al lica para determinar los tama os Inyecci n insuficiente de escalera al lica Incluya m s de una escalera por ejecuci n del instrumento El est ndar de tama o interno no se asign correctamente Eval e los r tulos de tama o en el CC5 ILS 500 y corrija de ser necesario El volumen de la reacci n fue demasiado bajo Este sistema est optimizado para un volumen final de reacci n de 25 pl con el fin de superar los inhibidores presentes en las muestras de ADN La disminuci n del volumen de la reacci n puede dar como resultado un rendimiento de calidad inferior Problemas de equilibrio varios Descongele las mezclas 5X Primer Pair Mix y 5X Master Mix por completo y agite durante 15 segundos antes de usar Tenga en cuenta que la 5X Master Mix tardar m s en descongelarse que la 5X Primer Pair Mix No centrifugue la 5X Primer Pair Mix ni la 5X Master Mix despu s de mezclar Calibre los termocicladores y las pipetas de la m
44. a evitar o minimizar los artefactos que incluyen aquellos asociados con las polimerasas de ADN como por ejemplo la disminuci n repetida y la incorporaci n de nucle tidos terminales 14 15 La disminuci n repetida a veces denominada bandas n 4 repeticiones o bandas sombra se debe a la p rdida de una unidad de repetici n durante la amplificaci n de ADN variaci n som tica dentro del ADN o ambos La cantidad de este artefacto observado depende principalmente del locus y de la secuencia de ADN que se amplificar La incorporaci n de nucle tidos terminales 16 17 ocurre cuando una polimerasa termoestable no comparable de ADN agrega un nucle tido generalmente adenina a los extremos de 3 de fragmentos de ADN amplificados de manera independiente de la plantilla La eficiencia con lo que esto ocurre var a con diferentes secuencias de imprimaci n De esta manera se observa a veces un pico de artefacto de una base m s corta que lo esperado por ej falta la incorporaci n terminal Hemos modificado las secuencias de imprimaci n y agregado un paso de extensi n final a 60 C 18 a los protocolos de amplificaci n para proporcionar condiciones para completar esencialmente la incorporaci n de nucle tidos terminales cuando se utilizan las cantidades de plantilla de ADN recomendadas Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono
45. al 1991 Tetranucleotide repeat polymorphism at the human b actin related pseudogene 2 actbp2 detected using the polymerase chain reaction Nucleic Acids Res 19 6980 Ausubel F M et al 1996 Unit 15 The polymerase chain reaction In Current Protocols in Molecular Biology Vol 2 John Wiley and Sons NY Sambrook J Fritsch E F and Maniatis T 1989 Chapter 14 In vitro amplification of DNA by the polymerase chain reaction In Molecular Cloning A Laboratory Manual Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification 1989 Erlich H A ed Stockton Press New York NY PCR Protocols A Guide to Methods and Applications 1990 Innis M A et al eds Academic Press San Diego CA Butler J M 2005 Forensic DNA Typing 2nd ed Elsevier Academic Press London Presley L A et al 1992 The implementation of the polymerase chain reaction PCR HLA DQ alpha typing by the FBI laboratory In The Third International Symposium on Human Identification 1992 Promega Corporation 245 69 Hartmann J M et al 1991 Guidelines for a quality assurance program for DNA analysis Crime Laboratory Digest 18 44 75 Internal Validation of STR Systems Reference Manual GE053 Promega Corporation Kline M C et al 2005 Results from the NIST 2004 DNA quantitation study J Forensic Sci 50 571 8 Levinson G and Gutman G A 19
46. almacenamiento a largo plazo a 4 C pueden provocar la descomposici n de la formamida La formamida de mala calidad puede contener iones que compitan con el ADN durante la inyecci n lo que provoca alturas de pico inferiores y sensibilidad reducida Un mayor tiempo de inyecci n no puede aumentar la se al La formamida es un agente irritante y terat geno evite la inhalaci n y el contacto con la piel Lea la etiqueta de advertencia y tome las precauciones apropiadas cuando maneje esta sustancia Use siempre guantes y anteojos de seguridad cuando trabaje con formamida Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 16 Impreso en Estados Unidos 9 12 Preparacion de la muestra CG 2 1 Descongele el CC5 Internal Lane Standard 500 Nota Centrifugue brevemente el tubo para que el contenido se desplace Promega hacia el fondo luego agite durante 15 segundos antes de cada uso No centrifugue despu s de agitar ya que esto puede provocar que el est ndar de tama o se concentre en el fondo del tubo 2 Prepare un c ctel de carga combinando y mezclando el est ndar de carril interno CC5 Internal Lane Standard 500 y la formamida Hi Di de la siguiente manera 1 0 ul CC5 ILS 500 x Nro de muestras 10 0 pl de formamida Hi Di x Nro de muestras No
47. anera habitual La mezcla de amplificaci n de la PCR preparada en la secci n 4 no se mezcl bien Agite la mezcla de amplificaci n de la PCR durante 5 10 segundos antes de distribuirla en los tubos o en la placa de reacci n 7 B Amplificaci n de ADN extra do La siguiente informaci n es espec fica para la amplificaci n de ADN extra do Para obtener informaci n sobre la amplificaci n y la detecci n generales consulte la secci n 7 A S ntomas Picos de alelos d biles o ausentes Causas y comentarios Plantilla de ADN impuro Debido a la peque a cantidad de plantilla utilizada esto es rara vez un problema Seg n el procedimiento de extracci n de ADN utilizado y la fuente de la muestra podr an aparecer inhibidores en la muestra de ADN Plantilla insuficiente Utilice la cantidad recomendada de plantilla de ADN si est disponible Alta concentraci n de sal o pH alterado Si la plantilla de ADN est almacenada en un buffer TE que no tiene pH 8 0 o contiene una concentraci n de EDTA m s alta el volumen de ADN no Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 58 Impreso en Estados Unidos 9 12 Sintomas Causas y comentarios CG debe superar el 20 del volumen total de la reacci n El o arrastre de K Nat Mg o EDTA de la muestr
48. ara an lisis de base de datos filtrar n generalmente estos picos de artefactos Los picos de artefactos pueden verse en el canal de fluoresce na en bases de 74 76 bases de 85 87 y bases de 99 101 En el canal JOE a los artefactos se les puede ver en bases de 88 90 La fuerza de la se al del artefacto de canal JOE aumenta con el almacenamiento de la placa de amplificaci n a 4 C m s com nmente cuando se dejan las placas a 4 C durante algunos dias Recomendamos almacenar los productos de amplificaci n a 20 C Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos Nro de pieza TMD039 9 12 P gina 53 00S p1epuejs ap eua G90 Jap dq pos A dq 09 aqua soyvawsey eysanut anb eure1301930 939 9 UN 3 J9UP A SHOTSZZA A VOA EEPSGLA L6 SZLC 6LTIS8A 173 10d sopeyanbya sns0 so ap sod soy eys nu anb eurerSosayoxjoaJ9 UN 0 aued T6ESAA A XOdL 818580 0785 41 TISIZA VMA TOHL SLAW 10d sopeyanbya sno soy ap soo1d soy eysanut anb eure1301930 939 9 UN D pued q Pag A OdLASD SEETSZA TSS8TA 6ESS9LC HO 10d sopejanbya snao so ap sord soy esonur anb ewer8orajoroaja Uf 9 Jaueg 2 eyuad A ZTESETA SFZISOLC THPSZA 9S9TSTA 8SETSEA euTUesojaty eujaosa1on y 10d sopeyanbya sn 0 so ap sootd so eys nur anb eure1301930 399 9 UN Y ag ZC UQISISA CH giaddep
49. atro placas de reacci n id nticas con al cuotas de los mismos extractos de hisopos 3 Amplifique muestras utilizando el protocolo de ciclo t rmico proporcionado anteriormente pero someta cada placa a un n mero de ciclos diferente 25 28 ciclos 4 Despu s de la amplificaci n utilice los protocolos de separaci n y detecci n validados del laboratorio para determinar el n mero ptimo de ciclos para cada tipo de muestra 5 Configuraci n del instrumento y preparaci n de la muestra 5 A Detecci n de fragmentos amplificados al utilizar el 3500 o el 3500xL Genetic Analyzer de Applied Biosystems Materiales que deber suministrar el usuario calentador en seco de 95 C ba o de agua o termociclador hielo picado o ba o de hielo centrifugador compatible con placas de 96 pocillos puntas para pipetas resistentes al aerosol serie capilar de 3500 3500xL 36 cm ret n de 96 pocillos y conjunto de base Est ndar Applied Biosystems N de Cat 4410228 e pol mero POP 4 en una bolsa para el 3500 o el 3500xL Genetic Analyzer de Applied Biosystems e recipiente de buffer de nodo e recipiente de buffer de c todo e placa ptica de 96 pocillos y septa MicroAmp o equivalente e formamida Hi Di Applied Biosystems Nro de Cat 4311320 La calidad de la formamida es fundamental Use formamida Hi Di Congele la formamida en al cuotas a 20 C Los m ltiples ciclos de congelaci n descongelaci n o el
50. auary aremyjos Ja opuezpyn uoIezITeue as sopeyNsal so sopunSas q ap AX ap UO eun opuezipyn Joz euy 943490 QETE esutaysAsorg paddy un uo uorezreur as A pps prepueys au euaju g P uo UOIeIZaUT as uo nNesyrdwe ap sojonpold SOT SOP QE A waysdG UOISN X9 I9MO Ja TezIHN Te ootd as 3u q ajuany eorun eun ap NAY ap e ppuejd eun magie uoIsny X9 L19MOJ T4 ZZ MSI VLO80LL Impreso en Estados Unidos Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWWw promega com Nro de pieza TMD039 P gina 54 9 12 O VL8POLL seor9 e sauoreu3rsap sns q yXD 10d sopeyanbya vez eng TL avs use zzz Set Ca er D Tu zee Z i 3012 2081 ZS lesb zt SL g ileuUauUeuUzu 01 ee e zr zve 63 zz sz ez vz 61 21 sv SU au po zt for Za zz sz ez vz Estr SU SU 21 S0 fev ur Gb zv svj ev by s e z rer eso eer zze os 8z 9z vz zz oz 81 91 Pt zv sv et tE 6 8 Zs 92 pz zz 0z Ezust ei Sb 31 Pt Zt 016 8 Z oos mmm NA A N TM Use zos erezze zez 2 sz esere esz 7 DG su FU EU or su FU En et SU 57 EU EU 57 St E IO ze gl ee za Er Ez Il EU DU EU EN IO qa sr Pcie aaa aaa aaa
51. cci n o la cantidad de muestra mezclada con el c ctel de carga pueden necesitar ser ajustados Utilice el administrador de m dulos en el software de recolecci n de datos para modificar el tiempo o el voltaje de inyecci n en el m dulo de ejecuci n consulte la secci n Preparaci n de instrumentos que figura abajo Si se reduce el tiempo o el voltaje de la inyecci n se puede requerir un umbral de amplitud de pico reducido para el canal naranja para un tama o correcto Centrifugue brevemente la placa para eliminar las burbujas de aire de los pocillos Desnaturalice las muestras a 95 C durante 3 minutos luego enfr e de inmediato sobre hielo picadoo en un ba o de hielodurante 3 minutos Desnaturalice las muestras justo antes de cargar el instrumento Preparaci n del instrumento Consulte el manual de usuario del instrumento para obtener las instrucciones de limpieza e instalaci n de la serie capilar realizar una calibraci n espacial y agregar un pol mero Analice las muestras como se describe en el manual de usuario para el ABI PRISM 3100 o el 3100 Avant Genetic Analyzer con el software de recolecci n de datos Versi n 2 0 y el 3130 o el 3130x Genetic Analyzer de Applied Biosystems con el software de recolecci n de datos Versi n 3 0 con las siguientes excepciones d En el administrador de m dulos seleccione New Nuevo Seleccione Regular en la lista desplegable Type Tipo y seleccione H
52. condiciones de inyecci n predeterminadas Sin embargo los laboratorios individuales deben determinar los umbrales de amplitud de pico seg n los estudios de validaci n interna Las alturas de pico para el CC5 ILS 500 son generalmente inferiores a las de los otros tintes Por lo tanto el umbral del tinte naranja puede ser inferior al de los otros tintes La casilla de normalizaci n puede estar marcada independientemente de si la normalizaci n se aplic o no durante la recolecci n de datos 11046TA Figura 14 La pesta a Peak Detector Detector de picos del GeneMapper ID X 11 Seleccione la pesta a Peak Quality Calidad de picos Puede cambiar las configuraciones para la calidad de picos Nota Para los pasos 11 y 12 consulte el manual de usuario de GeneMapper ID X para obtener informaci n 12 Seleccione la pesta a SQ amp GQ Settings Configuraciones de SQ y GQ Puede cambiar estas configuraciones 13 Seleccione Save Guardar para guardar el nuevo m todo de an lisis 14 Seleccione Done Realizado para salir del administrador de GeneMappeer ID X Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 Pagina 37 O 6 D C mo crear un m todo de an lisis de casos con el software GeneMappe
53. conjunto de amplificaciones No almacene ADN diluido por ej 0 25 ng pl o menos 4 A Amplificaci n de ADN extra do cia que deber suministrar el usuario termociclador GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems e microcentrifugadora e placa ptica de reacci n de 96 pocillos MicroAmp o tubos de reacci n de 0 2 ml MicroAmp Applied Biosystems e puntas para pipetas resistentes al aerosol consulte la secci n 9 E Amplificamos de manera rutinaria 0 25 0 5 ng de plantilla de ADN en un volumen de reacci n de 25 ul utilizando el protocolo que se detalla abajo Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 6 Impreso en Estados Unidos 9 12 Configuraci n de la amplificaci n 1 Descongele por completo la mezcla maestra PowerPlex Fusion 5X Master Mix la mezcla para par de imprimaci n PowerPlex Fusion 5X Primer Pair Mix y el agua grado de amplificaci n Nota Centrifugue brevemente los tubos para que el contenido se desplace hacia el fondo luego agite los reactivos durante 15 segundos antes de cada uso No centrifugue la 5X Primer Pair Mix o 5X Master Mix despu s de agitar ya que esto puede provocar que los reactivos se concentren en el fondo del tubo 2 Determine el n mero de reacciones que se configurar n Este n mero debe incluir las
54. dder Escalera Sample Muestra Positive Control Control positivo o Negative Control Control negativo seg n sea lo apropiado para la muestra Cada carpeta en el proyecto debe contener al menos una inyecci n de escalera al lica designada como Ladder Escalera en la columna Sample Type Tipo de muestra para la determinaci n del genotipo correcto Nota El ADN de control positivo definido en el archivo del panel GeneMapper ID es el ADN de control 2800M Redefina el genotipo en el archivo del panel si utiliza un ADN de control positivo diferente En la columna Analysis Method M todo de an lisis seleccione el m todo de an lisis creado anteriormente en esta secci n En la columna Panel seleccione el archivo de texto de paneles que se import en la Secci n 6 F En la columna Size Standard Est ndar de tama o seleccione el est ndar de tama o que se import en la Secci n 6 G o se cre en la Secci n 6 H Seleccione Analyze Analizar bot n de flecha verde para comenzar el an lisis de datos Nota El tama o de los alelos Penta E y DYS391 de bases gt 475 no utilizar el M todo local del sur Para Penta E los alelos gt 24 se etiquetar n como OL 6 K Controles Observe los resultados para el control negativo Con los protocolos definidos en este manual el control negativo debe quedar exento de productos de amplificaci n Observe los res
55. de datos Configuraci n del instrumento y preparaci n de la muestra Secci n 5 Applied Biosystems 3500 o 3500xL Genetic Analyzer Secci n 5 A Applied Biosystems 3130 o ABI PRISM 3100 o 3130x Genetic Analyzer con 3100 Avant Genetic Analyzer software de recolecci n de con software de recolecci n datos Versi n 3 0 de datos Versi n 2 0 Secci n 5 B Secci n 5 B Secci n 6 Software GeneMapper ID X Software GeneMapper ID Versi n 1 2 Versi n 3 2 Figura 1 Una descripci n general del protocolo del PowerPlex Fusion System Promega Corporation 2200 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 3 Componentes del producto y condiciones de almacenamiento Producto Tama o Nro de Cat PowerPlex Fusion System 200 reactivos DC2402 No debe ser utilizado para diagn stico m dico Este sistema contiene los reactivos necesarios para 200 reacciones de 25 ul cada una Incluye Caja de componentes anteriores a la amplificaci n 1ml PowerPlex Fusion 5X Master Mix 1ml PowerPlex Fusion 5X Primer Pair Mix 25 ul ADN de control 2800M 10 ng ul 5x 1250 ul Agua grado de amplificaci n Caja de componentes posteriores a la amplificaci n 100 ul PowerPlex Fusion Allelic Ladder Mix 2 x 300 ul CC5 Internal Lane Standard 500 Product
56. de muestra desde una tarjeta de almacenamiento Coloque la punta cerca del centro del lugar de la muestra y con una acci n de torsi n o presi n corte un disco de muestra de 1 2 mm Utilice el mbolo para expulsar el disco en el pocillo apropiado de una placa de reacci n Tambi n se pueden utilizar perforadoras autom ticas para crear discos de muestra Consulte la gu a de usuario de su instrumento con el fin de obtener asistencia con generaci n de discos de 1 2 mm consejos t cnicos e informaci n sobre resoluci n de problemas Nota La est tica puede ser problem tica a la hora de agregar una perforaci n a un pocillo Para perforaciones de tarjetas FTA agregar la mezcla de amplificaci n de la PCR al pocillo antes de agregar la perforaci n puede aliviar los problemas de est tica Para perforaciones de tarjetas no FTA agregar PunchSolution Reagent al pocillo antes de agregar la perforaci n durante el tratamiento preliminar puede aliviar los problemas de est tica Configuraci n de la amplificaci n 1 Descongele por completo la mezcla maestra PowerPlex Fusion 5X Master Mix la mezcla para par de imprimaci n PowerPlex Fusion 5X Primer Pair Mix y el agua grado de amplificaci n Nota Centrifugue brevemente los tubos para que el contenido se desplace hacia el fondo luego agite los reactivos durante 15 segundos antes de cada uso No centrifugue la 5X Primer Pair Mix o 5X Master Mix despu s de agitar ya que esto pue
57. de pieza TMD039 9 12 P gina 59 O 7 C Amplificaci n directa de ADN de las tarjetas perforadas de almacenamiento v continuaci n Promega S ntomas Causas y comentarios Demasiada muestra en la reacci n Utilice una o dos perforaciones de tarjetas de almacenamiento de 1 2 mm Siga las recomendaciones del fabricante cuando deposite la muestra en la tarjeta de almacenamiento Con las tarjetas FTA reducir los vol menes de la reacci n por debajo de 25 ul puede provocar una falla en la amplificaci n El control positivo no amplific No incluya una perforaci n de almacenamiento en blanco en las reacciones de control positivo La presencia de perforaciones en blanco puede inhibir la amplificaci n del ADN de control 2800M Picos adicionales visibles en un o todos los canales de color Falta de equilibrio de altura de picos La perforaci n puede estar contaminada Tome las perforaciones de un papel en blanco entre muestras Artefactos de amplificaci n de STR La amplificaci n directa de gt 20 ng de la plantilla puede dar como resultado un n mero m s alto de picos de artefacto Utilice el tama o y el n mero de perforaci n recomendados Consulte la secci n 6 L para obtener informaci n adicional sobre repeticiones y artefactos Artefactos de amplificaci n de STR La amplificaci n de STR puede dar como resultado artefactos que aparecen como picos de una base m s peque a que el alelo debido a la incor
58. de provocar que los reactivos se concentren en el fondo del tubo 2 Determine el n mero de reacciones que se configurar n Este n mero debe incluir las reacciones de control positivo y negativo Agregue 1 0 2 reacciones a este n mero para compensar el error de pipeteado Si bien este enfoque consume una peque a cantidad de cada reactivo asegura que usted tenga suficiente mezcla de amplificaci n de la PCR para todas las muestras Adem s garantiza que cada reacci n contenga la misma mezcla de amplificaci n de la PCR 3 Utilice una placa limpia MicroAmp para reunir la reacci n y etiquete de forma apropiada o como alternativa determine el n mero de tubos de reacci n de 0 2 ml limpios requeridos y etiquete de forma apropiada Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 10 Impreso en Estados Unidos 9 12 4 Agregue el volumen final de cada reactivo enumerado en la Tabla 2 a un tubo est ril Tabla 2 Mezcla de amplificacion de la PCR para amplificacion directa de ADN de las tarjetas perforadas de almacenamiento Componente de la mezcla de Volumen Nomerg de _ Volumen amplificaci n de la PCR por reacci n reacciones final Agua grado de amplificaci n 15 ul x PowerPlex Fusion 5X Master Mix 5 0 ul x PowerPlex Fusion 5X Primer Pair
59. desa N 0743987 y 0851867 la patente espa ola N 2197193 y 2173310 la patente sueca N 0743987 y 0851867 la patente suiza N 0743987 y 0851867 la patente brit nica N 0743987 y 0851867 la estadounidense N 5 654 419 5 688 648 5 869 255 6 177 247 5 707 804 6 028 190 6 544 744 7 015 000 y 5 728 528 y otras solicitudes de patentes extranjeras y que se encuentran pendientes End User Terms and Conditions Acceptance These terms and conditions shall govern the purchase use transfer and acceptance of the products described in the purchase order quotation or invoice which products are sold and distributed by Promega to the buyer transferee of such products the End User The transfer sale of products to the End User is expressly conditional upon End User s acceptance of these terms and conditions Restrictions on Use End Users are specifically not authorized to and are forbidden from reselling transferring or distributing any products either as a stand alone product or as a component of another product The right to use the products does not in and of itself include or carry any right of the End User to any GE Healthcare Bio Sciences Corp s technology or intellectual property other than expressly provided herein End Users may not use sequence s in an attempt to reverse engineer parameters of any of GE Healthcare Bio Sciences Corp proprietary products or services Disclaimer of Warranties GE Healthcare Bio Scienc
60. e na 161 208 9 14 14 3 15 15 3 16 16 3 17 17 3 18 18 3 19 19 3 20 3 D25441 Fluoresce na 214 250 8 17 D10S1248 Fluoresceina 256 280 8 19 D135317 Fluoresceina 302 350 5 17 Penta E Fluoresceina 371 466 5 24 D165539 JOE 84 132 4 16 D18551 JOE 134 214 7 10 10 2 11 13 13 2 14 27 D251338 JOE 224 296 10 12 14 28 CSF1PO JOE 318 362 5 16 Penta D JOE 377 450 DS SM TH01 TMR ET 72 115 3 9 9 3 10 11 13 3 vWA TMR ET 127 183 10 24 D21S11 TMR ET 203 259 24 24 2 25 25 2 26 28 28 2 29 29 2 30 30 2 31 31 2 32 32 2 33 33 2 34 34 2 35 35 2 36 38 D75820 TMR ET 269 313 5 16 D55818 TMR ET 321 369 6 18 TPOX TMR ET 393 441 4 16 DYS391 TMR ET 442 486 5 14 16 D8S1179 CXR ET 76 124 7 19 D128391 CXR ET 133 185 14 17 17 3 18 18 3 19 27 D195433 CXR ET 193 245 5 2 6 2 8 12 12 2 13 13 2 14 14 2 15 110 22 Wo 16 2 117 19 22 Vs As 2 FGA CXR ET 265 411 14 18 18 2 19 19 2 20 20 2 21 21 2 22 22 2 23 23 2 24 24 2 25 25 2 26 30 31 2 32 2 33 2 42 2 43 2 44 2 45 2 46 2 48 2 50 2 D2251045 CXR ET 425 464 7 20 1La longitud de cada alelo en la escalera al lica ha sido confirmada por el an lisis de secuencias 2Cuando se utiliza un est ndar de carril interno como por ejemplo el CC3 Internal Lane Standard 500 los tama os estimados de los componentes de la escalera al lica pueden diferir de aquellos que se enumeran Esto ocurre porque las diferentes secuencias en
61. e la cantidad de ADN de control seg n las condiciones del ciclo y las preferencias del laboratorio Reserve un pocillo que contenga mezcla de amplificaci n de la PCR como control negativo de amplificaci n Nota Se puede realizar un control negativo adicional con una perforaci n en blanco para detectar la contaminaci n de la tarjeta de almacenamiento o dispositivo perforador Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 11 4 B Amplificaci n directa de ADN de las tarjetas perforadas de almacenamiento continuaci n 9 Gelle la placa y centrif guela brevemente para que las perforaciones de la tarjeta de almacenamiento se desplacen hacia el fondo de los pocillos Ciclo t rmico Los instrumentos de amplificaci n y detecci n pueden variar Deber optimizar protocolos incluida la cantidad de perforaciones de la tarjeta de almacenamiento el n mero de ciclos 25 28 ciclos el tiempo de inyecci n y el volumen de carga para la instrumentaci n de su laboratorio Las pruebas efectuadas en Promega Corporation demuestran que 27 ciclos funcionan bien para una variedad de tipos de muestra Las muestras bucales pueden requerir m s ciclos de amplificaci n que las muestras de sangre Se deber a optimizar el n mero de c
62. ee ise is fz eg fez sz fre Pz ealon en en enen Fey aa j ii i oog zer by TE SU EU bb 23 sz ez vz 61 21 so 23 sz ez vz 61 vc ll ii zor A EL __ BURUSEESeUe Wl z 3 Es BO fr e elfella llts ez sz vz ler Buky EI RI Leal fre lez oe EH TTT t air one i ooz t i Leet E on E 33 Y CT d 135 EXC GE ZV n ie ease Ez SU oU Pr bb DU Sb ev by SH 21 Sb eu Fr ZU Su Et by Su iere ve SU 21 51 eu Fr pz zz vz oz e1 21 sv Erz ore 8 2 9 S au eu SU 01 6 8 2 9 s 81 91 e Su 01 6 8 91 Ft e v1 04 6 8 ees Iesel Su ug oz s1 31 rb Z1 016 7 p lt oog Pe A aor 8Pz1SOIA KA 00 mme pap P19 e9s9 e ap sajuauodulo so7 q JauRY sp2talp sauomeu3rsap sns A A YLL 10d sopeyanbya Gate esapeosa e ap sajusuodwiod so7 D pued svoiaye sauoeu3isop sns FO 10d sopeyanbya earje esapeosa e ap sayuauoduiod so7 9 pueg sedate sauomeu3isa
63. en click the Add Size s gt gt button to add them to the current size stondard definition Bacecaling Protocole Strecaliing Protocols Enter new See Standard defintion e g LLO 342 55 Current Sze Standard definition Delete Selected Siz we 55 0 GE 100 0 100 140 0 160 0 150 0 200 0 nsa noe nsa 300 0 325 0 350 0 375 0 400 0 435 0 450 0 475 0 500 0 OC Protocols Sequencing Analysis Protocols Mocegf Protocols Fragmeet Analysis Protocets HO Anatyses Protocols Figura 4 Ventana de creaci n de nuevos est ndares de tama o 4 Para crear un nuevo protocolo de control de calidad navegue hacia la biblioteca Seleccione QC Protocols Protocolos de control de calidad luego seleccione Create Crear Alternativamente se puede utilizar un protocolo de control de calidad previamente creado Asigne un nombre descriptivo de protocolo Seleccione el est ndar de tama o creado en el paso 3 Las configuraciones para el protocolo de control de calidad se deben basar en las condiciones internamente validadas para el PowerPlex Fusion System en el 3500 o el 3500xL Genetic Analyzer de Applied Biosystems La figura 5 muestra una opci n para estas configuraciones Nota Las alturas de pico para el CC5 Internal Lane Standard 500 son generalmente inferiores a las de los otros tintes Por lo tanto el umbral del tinte naranja puede ser inferior al de los otros tintes 9227TA Promega Co
64. en la Validaci n interna del Manual de referencia de los sistemas de STR 12 La calidad del ADN purificado o las muestras de amplificaci n directa los peque os cambios en los buffers la resistencia i nica las concentraciones de imprimaci n el volumen de reacci n la elecci n de termociclador y las condiciones de ciclo t rmico pueden incidir en el xito de la PCR Sugerimos una estricta observancia de los procedimientos recomendados para la amplificaci n y la detecci n por fluorescencia Se requieren investigaci n y validaci n adicionales si se realiza cualquier modificaci n a los protocolos recomendados El an lisis de las STR en funci n de la PCR puede resultar contaminado por cantidades muy peque as de ADN humano Debe tenerse extremo cuidado para evitar la contaminaci n cruzada cuando se prepara una muestra de ADN se manipulan pares de imprimaci n se re nen reacciones de amplificaci n y se analizan productos de amplificaci n Los reactivos y los materiales utilizados antes de la amplificaci n PowerPlex Fusion 5X Master Mix PowerPlex Fusion 5X Primer Pair Mix ADN de control 2800M y agua grado de amplificaci n se proporcionan en una caja separada y se deben almacenar separados de aquellos materiales que se utilizan despu s de la amplificaci n PowerPlex Fusion Allelic Ladder Mix y CC5 Internal Lane Standard 500 Incluya siempre una reacci n de control negativo por ej sin plantilla para detectar la co
65. erPlex Fusion System El PowerPlex Fusion System se desarroll para amplificaci n de ADN extra do y de muestras de amplificaci n directa Se recomiendan variaciones leves del protocolo para un rendimiento ptimo para cada fuente de plantilla Los protocolos para amplificaci n que usan ADN extra do Secci n 4 A perforadores de tarjetas de almacenamiento FTA y no FTA Secci n 4 B e hisopos Secci n 4 C se incluyen en las siguientes secciones de amplificaci n El PowerPlex Fusion System est optimizado para el termociclador GeneAmp PCR System 9700 Es altamente recomendable el uso de guantes y puntas para pipetas resistentes al aerosol para evitar la contaminaci n cruzada Mantenga todos los reactivos anteriores a la amplificaci n y posteriores a la amplificaci n en habitaciones separadas Prepare las reacciones de amplificaci n en una habitaci n dedicada a la configuraci n de la reacci n Utilice equipo y suministros dedicados a la configuraci n de la reacci n Se debe dedicar un cuidado minucioso para asegurar que la amplificaci n se realice correctamente Se proporciona una pauta para la resoluci n de problemas de amplificaci n en la secci n 7 La concentraci n del ADN de control de 2800 M se determin midiendo la absorbencia a 260 nm La cuantificaci n de este ADN de control por otros m todos como por ejemplo qPCR puede dar como resultado un valor diferente Prepare una diluci n nueva de ADN para cada
66. es Navegue hacia el archivo de texto de paneles importado en la secci n Getting Started Inicio mencionada anteriormente Seleccione el archivo luego Import Importar En el panel de navegaci n resalte la carpeta de paneles del PowerPlex Fusion que import en el paso 5 Seleccione File Archivo luego Import Bin Set Importar conjunto de intervalos Navegue hacia el archivo de texto de intervalos importado en la secci n Getting Started Inicio mencionada anteriormente Seleccione el archivo luego Import Importar Al final de la ventana del administrador de paneles seleccione OK Aceptar La ventana del administrador de paneles se cerrar autom ticamente 6 G C mo importar el est ndar de tama o CC5 ILS 500 en el software GeneMapper ID Versi n 3 2 Hay dos opciones cuando se crea un est ndar de tama o Utilice este protocolo o el protocolo alternativo en la secci n 6 H El archivo CC5_ILS_500 xml est disponible para descargar en www promega com resources tools genemapper id software panels and bin sets Guarde el archivo CC5_ILS_500 xml en un lugar conocido en su computadora i D D EF YS N Seleccione Tools Herramientas luego GeneMapper Manager Administrador de GeneMapper Seleccione la pesta a Size Standar Est ndar de tama o Seleccione Import Importar Busque la ubicaci n del archivo CC5_ILS_500 xml Selecci
67. es Corp provides no warranties to end user statutory or implied including without limitation as to product quality condition description merchantability or fitness for a particular purpose and all such warranties are hereby expressly disclaimed GE Healthcare Bio Sciences Corp hereby expressly disclaims any warranty regarding results obtained through the use of the products including without limitation any claim of inaccurate invalid or incomplete results Exclusion of Liability GE Healthcare Bio Sciences Corp and its affiliates shall have no liability to an End User including without limitation for any loss of use or profits business interruption or any consequential incidental special or other indirect damages of any kind regardless of how caused and regardless of whether an action in contract tort strict product liability or otherwise O 2012 Promega Corporation All Rights Reserved Plexor and PowerPlex are registered trademarks of Promega Corporation DNA IQ Identity Automation PunchSolution and SwabSolution are trademarks of Promega Corporation ABI PRISM and MicroAmp are registered trademarks of Applera Corporation Applied Biosystems and GeneMapper are registered trademarks of Applied Biosystems ART is a registered trademark of Molecular Bio Products Inc Bode Buccal DNA Collector is a trademark of the Bode Technology Group Inc EasiCollect is a trademark of Whatman FTA is a registered trademark of Flinders Technol
68. eto o un rango parcial para el rango de an lisis Cuando se utiliza un rango parcial elija un rango de an lisis apropiado seg n sus datos Elija un punto de inicio despu s del pico de imprimaci n y antes del primer pico del est ndar de carril interno definido para ayudar a asegurar el tama o correcto del est ndar de carril interno Los umbrales de amplitud del pico son las alturas del pico m nimas a las que el software considerar pico Los valores para los umbrales de amplitud de pico son generalmente de 50 150 RFU en el ABI PRISM 3100 y el 3100 Avant Genetic Analyzers as como el 3130 y 3130x Genetic Analyzers de Applied Biosystems Para el 3500 y el 3500xL Genetic Analyzer de Applied Biosystems Life Technologies sugiere un umbral de an lisis de 175 RFU seg n sus condiciones de inyecci n predeterminadas Sin embargo los laboratorios individuales deben determinar los umbrales de amplitud de pico seg n los estudios de validaci n interna Las alturas de pico para el CC5 ILS 500 son generalmente inferiores a las de los otros tintes Por lo tanto el umbral del tinte naranja puede ser inferior al de los otros tintes La casilla de normalizaci n puede estar marcada independientemente de si la normalizaci n se aplic o no durante la recolecci n de datos Seleccione la pesta a Peak Quality Calidad de picos Puede cambiar las configuraciones para la calidad de picos Nota Para los pasos 10 y 11 consulte el manual
69. go seleccione OK Aceptar Nota El tama o de los alelos Penta E y DYS391 de bases 2 475 no utilizar el M todo local del sur Para Penta E los alelos gt 24 se etiquetar n como OL Cuando finalice el an lisis aparecer la pantalla de resumen de an lisis Recomendamos que revise cualquier barra de encabezamiento del marcador amarilla o roja en la vista de gr ficos y que la maneje de forma acorde a los procedimientos operativos est ndar del laboratorio Navegue hacia la pesta a Genotype Genotipo o la pesta a Samples Muestras Para ayudar a la revisi n de cualquier muestra de baja calidad utilice las configuraciones predeterminadas del gr fico de interpretaci n de datos y revise el contenido en la tabla Quality Value Details Detalles de valor de calidad Los valores mostrados en las pesta as Peak Quality Calidad de picos y SQ amp GQ Settings Configuraciones de SQ amp GQ de Analysis Method M todo de an lisis son predeterminados y afectar n los valores de calidad mostrados en las configuraciones de gr ficos Recomendamos que modifique los valores en estas pesta as para ajustarse a los protocolos de an lisis de datos de su laboratorio C mo crear una base de datos o m todo de an lisis de paternidad con el software GeneMapper ID X X Versi n 1 2 Estas instrucciones tienen el prop sito de servir como gu a para comenzar a analizar los datos en el software Ge
70. go seleccione las casillas en los ensayos convenciones sobre nombre de archivo y grupos de resultados que corresponden a aquellas muestras 16 Seleccione Link Plate for Run Vincular placa para ejecutar 17 Aparecer la ventana Load Plate Cargar placa Seleccione Yes S 18 En la ventana Run Information Ejecutar informaci n figura 11 asigne un nombre de ejecuci n Seleccione Start Run Comenzar ejecuci n no se muestra Dashboard Edt Library Maintenance Tools Man L Plate Name Run Information You can edit the Run Name by entering text we Setup T Run Name Connection Status Connected User Name Adm Define Piste Properties Assign Plate Contents Plates on Instrument E Rum testrumont Plate A 96 wells Link Plate Unlink 1 Plate B Link Plate Unb A ne Preview Run Type HID EE Barcode WW Review Resuts View Sequencing Results lt o View FregmentHID Results E A Figura 11 C mo asignar un nombre de ejecuci n Promega Corporation 2200 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos Nro de pieza TMD039 P gina 27 5 B Detecci n de fragmentos amplificados utilizando ABI PRISM 3100 o Avant Genetic Analyzer 3100 con el software de recolecci n de datos Versi n 2 0 o el 3130 o 3130x1 Genetic Analyzer de Ap
71. iclos en cada laboratorio para cada tipo de muestra que se amplifique 1 Coloque la placa MicroAmp en el termociclador 2 Seleccione y ejecute el protocolo recomendado Aseg rese de haber seleccionado el modo Max M x como la velocidad de rampa El protocolo preferido para utilizar con el termociclador GeneAmp PCR System 9700 se proporciona abajo El tiempo de ciclo total estimado es 1 5 horas Protocolo del ciclo t rmico 96 C durante 1 minuto luego 94 C durante 10 segundos 59 C durante 1 minutos 72 C durante 30 segundos para 27 ciclos luego 60 C durante 20 minutos inmersi n a 4 C Cuando utilice el termociclador del GeneAmp PCR System 9700 el programa se debe ejecutar con la velocidad de rampa configurada en el modo m ximo Esto requiere un bloque de muestra de plata o plata dorada La velocidad de la rampa se configura despu s de que comienza la ejecuci n del ciclo t rmico Aparece la pantalla Select Method Options Seleccionar opciones de m todo Seleccione Max M ximo para la velocidad de la rampa e ingrese el volumen de la reacci n Nota La extensi n final para amplificaci n directa se ampli a 20 minutos comparada con 10 minutos para el protocolo de ADN extra do con el fin de permitir suficiente tiempo para la adenilaci n de grandes cantidades de amplic n Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU
72. ida de los datos no fue correcto para el rango parcial elegido correctamente en la Secci n 6 E Ajuste el punto de partida de los datos en el m todo de an lisis Alternativamente utilice un rango completo para el an lisis Picos adicionales en el est ndar de tama o Abra el Size Match Editor Editor de coincidencia de tama o Resalte el pico adicional seleccione Edit Editar y delete size label Eliminar la etiqueta de tama o Seleccione auto adjust sizes tama os de ajuste autom tico La ejecuci n fue demasiado breve y los picos m s grandes en el est ndar de carril interno no se capturaron No todos los picos CC5 ILS 500 definidos en el est ndar de tama o se detectaron durante la ejecuci n e Cree un nuevo est ndar de tama o utilizando los fragmentos del est ndar de carril interno presentes en la muestra e Vuelva a ejecutar las muestras utilizando un tiempo de ejecuci n m s prolongado Faltan picos en el est ndar de tama o Si los picos est n por debajo del umbral disminuya el umbral de amplitud de picos en el m todo de an lisis para el canal de color naranja con el fin de incluir los picos Si los picos son de mala calidad vuelva a definir el est ndar de tama o para la muestra para saltarse estos picos Estado basal significativamente elevado Calibraci n espectral insuficiente Realice una nueva calibraci n espectral y vuelva a ejecutar las muestras E
73. ific stutter ratio if available Marker Repeat Type Tri Tetra Penta Hexa Cut off Value 0 0 0 0 0 0 0 0 Minus Ratio 0 0 0 0 0 0 00 MinusA Distance From 0 0 00 0 0 0 0 To 00 0 0 0 0 00 Minus Stutter Ratio 0 0 0 0 0 0 00 Minus Stutter Distance From 275 3 25 3 75 0 0 To 375 475 575 0 0 Plus Stutter Ratio 01 0 0 0 0 0 0 Plus Stutter Distance From 275 00 00 0 0 To 1375 00 0 0 0 0 Amelogenin Cutoff 00 Range Filter Factory Defaults Figura 19 La pesta a Alelle Alelo del GeneMapper ID 11052TA Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 Pagina 47 6 1 C mo crear un m todo de an lisis de casos con el software GeneMapper ID X Versi n 3 2 10 Seleccione la pesta a Peak Detector Detector de picos Recomendamos las configuraciones mostradas en la figura 20 Notas 1 Seleccione el rango completo o un rango parcial para el rango de an lisis Cuando se utiliza un rango parcial elija un rango de an lisis apropiado seg n sus datos Elija un punto de inicio despu s del pico de imprimaci n y antes del primer pico del est ndar de carril interno definido para ayudar a asegurar el tama o correcto del est ndar de carril interno 2 Los umbrales de amplitud del pico son las alturas del
74. ilizando los fragmentos del est ndar de carril interno presentes en la muestra e Vuelva a ejecutar las muestras utilizando un tiempo de ejecuci n m s prolongado Se utiliz una escalera al lica de mala calidad durante el an lisis Aseg rese de que s lo se utilicen escaleras al licas de alta calidad para el an lisis Alelos fuera de la escalera Se utiliz una escalera al lica de una ejecuci n diferente a las muestras Vuelva a analizar las muestras con una escalera al lica de la misma ejecuci n El software GeneMapper ID requiere que la escalera al lica se importe de la misma carpeta donde se encuentra la muestra Aseg rese de que la escalera al lica est en la misma carpeta donde se encuentra la muestra Cree un nuevo proyecto y vuelva a analizar como se describe en la secci n 6 1 o 6 El archivo de texto de paneles seleccionado para el an lisis no fue correcto para el sistema de STR utilizado Asigne el archivo de texto de paneles correcto que corresponde al sistema de STR utilizado para la amplificaci n La escalera al lica no se identific como una escalera al lica en la columna de tipo de muestra Se eligi el tipo de an lisis incorrecto para el m todo de an lisis Aseg rese de utilizar el tipo de an lisis HID El est ndar de carril interno no se identific correctamente en la muestra Vuelva a definir manualmente los tama os de los fragmentos de est ndar de tama o en la muestra
75. imaci n y antes del primer pico del est ndar de carril interno definido para ayudar a asegurar el tama o correcto del est ndar de carril interno Los umbrales de amplitud del pico son las alturas del pico m nimas a las que el software considerar pico Los valores para los umbrales de amplitud de pico son generalmente de 50 150 RFU para los datos generados en el ABI PRISM 3100 y el 3100 Avant Genetic Analyzers y el 3130 y 3130x1 Genetic Analyzers de Applied Biosystems Para el 3500 y el 3500xL Genetic Analyzer de Applied Biosystems Life Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 36 Impreso en Estados Unidos 9 12 Peak Detection Algorithm Advanced Ranges Peak Detection Analysis Peak Amplitude Thresholds Full Range SS B 175 R 175 Start Pt 0 Stop Pt 10000 0 a see Y 175 0 175 Smoothing and Baselining Min Peak Half Width 2 pts Smoothing Polynomial Degree 3 Peak Window Size 15 pts Baseline Window are Peak Start 0 0 Size Calling Method Peak End 0 0 2nd Order Least Squares 3rd Order Least Squares Normalization Cubic Spline Interpolation Y Use Normalization if applicable Local Southern Method Global Southern Method Eactory Defaults save Cancel Help Technologies sugiere un umbral de an lisis de 175 RFU seg n sus
76. ins_IDX_vX x txt and PowerPlex_Fusion_Stutter_IDX_vX x txt donde X x se refiere a la versi n m s reciente de los archivos de texto de paneles intervalos y repeticiones en un lugar conocido en su computadora C mo importar archivos de texto de paneles intervalos y repeticiones 1 Abra el software GeneMapper ID X 2 Seleccione Tools Herramientas luego Panel Manager Administrador de paneles 3 Resalte el icono Panel Manager Administrador de paneles en el panel de navegaci n superior izquierdo 4 Seleccione File Archivo luego Import Panels Importar paneles Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 31 6 A Como importar archivos de texto de paneles intervalos y repeticiones de 6 B PowerPlex Fusion con software GeneMapper ID X Versi n 1 2 continuaci n 5 Navegue hacia el archivo de texto de paneles importado en la secci n Getting Started Inicio Seleccione el archivo luego Import Importar 6 Enel panel de navegaci n resalte la carpeta de paneles del PowerPlex Fusion que import en el paso 5 7 Seleccione File Archivo luego Import Bin Set Importar conjunto de intervalos 8 Navegue hacia el archivo de
77. istinguen entre s mediante la detecci n por fluorescencia seguida de la separaci n electrofor tica El PowerPlex Fusion Systeme es un multiplex de 24 locus para las aplicaciones de identificaci n humana incluido el an lisis forense las pruebas de parentesco y el uso en investigaci n El sistema de cinco colores permite la coamplificaci n y la detecci n por fluorescencia de los locus de CODIS EE UU de 13 n cleos CSF1PO FGA TH01 TPOX vWA D351358 D5S818 D75820 D8S1179 D135317 D165539 D18551 y D21511 los locus de la Norma europea de 12 n cleos TH01 vWA FGA D21S11 D351358 D8S1179 D18551 D1051248 D2251045 D25441 D1S1656 y D125391 y de amelogenina para determinaci n del g nero Adem s el locus DYS391 espec ficos para sexo masculino se incluye para identificar los resultados nulos de alelos Y para amelogenina Los locus Penta D y Penta E se incluyen para aumentar la discriminaci n y permitir la b squeda de bases de datos que incluyen perfiles con estos locus Penta Finalmente los locus D251338 y D195433 que son locus populares incluidos en una serie de bases de datos se incorporaron para aumentar m s la potencia de discriminaci n Este panel ampliado de marcadores STR est previsto para satisfacer las recomendaciones tanto de CODIS como de ESS El PowerPlex Fusion System es compatible con los ABI PRISM 3100 y 3100 Avant Genetic Analyzers y los 3130 3130x1 3500 y 3500xL Genetic Analyzers de Applied
78. l Use marker specific stutter ratio if available Marker Repeat Type Tri Tetra Penta Hexa Cut off Value 0 2 0 2 02 0 0 Minus amp Ratio 0 0 0 0 0 0 00 Minus Distance From 0 0 0 0 0 0 0 0 To 0 0 0 0 00 00 Minus Stutter Ratio 0 0 0 0 0 0 0 0 Minus Stutter Distance From 2 75 3 25 3 75 00 To 3 75 4 75 5 75 0 0 Plus Stutter Ratio 01 0 0 0 0 0 0 Plus Stutter Distance From 2 75 0 0 0 0 0 0 To 3 75 00 00 00 Amelogenin Cutoff 02 Range Filter Factory Defaults d 11053TA Figura 21 La pesta a Allele Alelo del GeneMapper ID con las configuraciones para utilizar un filtro de picos del 20 10 Seleccione la pesta a Peak Detector Detector de picos Recomendamos las configuraciones mostradas en la figura 20 Notas L Seleccione el rango completo o un rango parcial para el rango de an lisis Cuando se utiliza un rango parcial elija un rango de an lisis apropiado seg n sus datos Elija un punto de inicio despu s del pico de imprimaci n y antes del primer pico del est ndar de carril interno definido para ayudar a asegurar el tama o correcto del est ndar de carril interno Los umbrales de amplitud del pico son las alturas del pico m nimas a las que el software considerar pico Los valores para los umbrales de amplitud de pico son generalmente de 50 150 RFU y deben ser determinados por los laboratorios individuales Las alturas de pico para el CC5 ILS 500 son generalmente inferiores a las de lo
79. l espectral G5 incorrecto estuvo activo Vuelva a ejecutar las muestras y confirme que el espectral G5 de 5 tintes PowerPlex est configurado para G5 Consulte las instrucciones sobre la preparaci n del instrumento en la secci n 5 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 64 Impreso en Estados Unidos 9 12 7 F Software GeneMapper ID Sintomas Causas y comentarios Alelos no definidos Para analizar las muestras con el software GeneMapper ID tanto los par metros del an lisis como el est ndar de tama o deben tener seleccionado el tipo de an lisis Basic or Advanced B sico o avanzado Si son diferentes se puede obtener un error Para analizar las muestras con el software GeneMapper ID se debe definir al menos una escalera al lica Se defini un n mero insuficiente de fragmentos CC5 ILS 500 Aseg rese de definir al menos dos fragmentos CC5 ILS 500 m s peque o que el menor pico de muestra y al menos dos fragmentos CC5 ILS 500 m s grande que el mayor pico de muestra La ejecuci n fue demasiado breve y los picos m s grandes en el est ndar de carril interno no se capturaron No todos los picos CC5 ILS 500 definidos en el est ndar de tama o se detectaron durante la ejecuci n e Cree un nuevo est ndar de tama o ut
80. la ejecuci n del ciclo t rmico Aparece la pantalla Select Method Options Seleccionar opciones de m todo Seleccione Max M ximo para la velocidad de la rampa e ingrese el volumen de la reacci n Nota La extensi n final para amplificaci n directa se ampli a 20 minutos comparada con 10 minutos para el protocolo de ADN extra do con el fin de permitir suficiente tiempo para la adenilaci n de grandes cantidades de amplic n 3 Despu s de finalizado el protocolo del ciclo t rmico almacene las muestras amplificadas a 20 C en una caja protegida de la luz Nota El almacenamiento a largo plazo de las muestras amplificadas a 4 C o m s puede producir artefactos CH Promega Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos Nro de pieza TMD039 P gina 15 O 4 C Amplificaci n directa de ADN de los hisopos continuaci n w Optimizaci n de la PCR El n mero de ciclos se debe optimizar en funci n de los resultados de un experimento inicial para determinar la sensibilidad con su m todo de recolecci n tipos de muestras e instrumentos 1 Elija varias muestras que representen tipos de muestras t picas que encuentra en el laboratorio Prep relas como lo har a habitualmente con su proceso de trabajo normal 2 Prepare cu
81. la escalera al lica y los componentes del est ndar de carril interno pueden provocar diferencias en la migraci n La etiqueta de tinte y el enlazador tambi n afectan la migraci n de los alelos Para obtener una lista actual de microvariantes consulte el Informe de alelos variantes publicado en el sitio web del Instituto Nacional de Normas y Tecnolog a NIST de Estados Unidos en www cstl nist gov div831 strbase 4La amelogenina no es una STR pero muestra una banda espec fica X de bases de 89 y una banda espec fica Y de bases de 95 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos Nro de pieza TMD039 9 12 P gina 71 9 A Ventajas de utilizar los locus en el PowerPlex Fusion System continuaci n Tabla 6 Las determinaciones de alelos del PowerPlex Fusion System en las plantillas de ADN estandar habitualmente disponibles Plantillas de ADN est ndar Locus de las STR 2800 M 9947A 9948 Amelogenina X Y X X X Y D3S1358 17 18 14 15 ils 17 D1S1656 12 13 18 3 18 3 14 17 D25441 10 14 10 14 iil 112 D10S1248 13 15 13 15 12 15 D138317 9 11 1111 111 1151 111 Penta E 7 14 12 13 11 11 D165539 9 13 Ail 1192 11 11 D18551 16 18 15 19 15 18 D2S1338 I 5 19 23 DADO CSF1PO 12 12 10 12 10 11 Penta D 1213 112 119 8 12 THO01 6 9 3 8 9 3 6 9 3 v
82. la opci n HID usted no tiene el software GeneMapper ID Comun quese con Applied Biosystems 5 Ingrese un nombre descriptivo para el m todo de an lisis como por ejemplo PowerPlex Fusion 6 Seleccione la pesta a Allele Alelo figura 19 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 Impreso en Estados Unidos P gina 46 9 12 7 Seleccione el archivo de texto de intervalos que se import en la secci n 6 F 8 Aseg rese de que la casilla Use marker specific stutter ratio if available Utilizar proporci n de repeticiones de marcador espec fico si est disponible est marcada 9 Ingrese los valores mostrados en la figura 19 para un correcto filtrado de los picos de las repeticiones cuando se utiliza el PowerPlex Fusion System Para obtener una explicaci n del uso correcto y los efectos de estas configuraciones consulte el bolet n del usuario de Applied Biosystems denominado Procedimientos de instalaci n y nuevas caracter sticas para el software GeneMapper ID 3 2 Nota Algunas configuraciones se optimizaron y son diferentes de las configuraciones recomendadas en el bolet n del usuario Analysis Method Editor HID EN 5 Peak Detector Peak Quality Quality Flags Bin Set PowerPlex_Fusion_Bins_y1 0 EN V Use marker spec
83. leccione Import Importar 4 Navegue hacia la ubicaci n del archivo CC5_ILS_500_IDX xml en su computadora Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 32 Impreso en Estados Unidos 9 12 5 6 Seleccione el archivo luego seleccione Import Importar Seleccione Done Realizado para guardar los cambios y cierre el administrador de GeneMapper ID X 6 C C mo crear un est ndar de tama o con el software GeneMapperr ID X Versi n 1 2 L Seleccione Tools Herramientas luego GeneMapper ID X Manager Administrador de GeneMapper ID X Seleccione la pesta a Size Standar Est ndar de tama o Seleccione New Nuevo En la ventana del Size Standard Editor Editor de est ndar de tama o figura 12 seleccione GeneMapper ID X Security Group como el grupo de seguridad Esto permite el acceso a todos los usuarios del software Se pueden utilizar otros grupos de seguridad Ingrese un nombre detallado como CC5_ILS_500_IDX Elija Orange Naranja para el Size Standard Dye Tinte de est ndar de tama o Ingrese los tama os de los fragmentos de est ndar de carril interno bases de 60 65 80 100 120 140 160 180 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475
84. m visite www promega com resources tools genemapper id software panels and bin sets 2 Seleccione el PowerPlex System que est usando seleccione GeneMapper ID as como el ADN de control que utiliza Ingrese su informaci n de contacto y seleccione Submit Enviar 3 Guarde los archivos PowerPlex_Fusion_Panels_IDX_vX x txt y PowerPlex_Fusion_Bins_IDX_vX x txt donde X x se refiere a la versi n m s reciente de los archivos de texto de paneles e intervalos en un lugar conocido en su computadora C mo importar archivos de texto de paneles e intervalos Estas instrucciones siguen ligeramente el tutorial del software GeneMapper ID de Applied Biosystems p ginas 1 4 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 43 O 6 F C mo importar archivos de texto de paneles y bin de PowerPlex Fusion con Ya software GeneMapper ID Versi n 3 2 continuaci n Promega 1 2 Abra el software GeneMapper ID versi n 3 2 Seleccione Tools Herramientas luego Panel Manager Administrador de paneles Resalte el icono Panel Manager Administrador de paneles en el panel de navegaci n superior izquierdo Seleccione File Archivo luego Import Panels Importar panel
85. mpo de inyecci n 24 segundos Voltaje de inyecci n 12 kV Tiempo de ejecuci n 1 210 1 500 segundos TE tiempo de inyecci n se puede modificar 2 24 segundos para aumentar o disminuir las alturas de los picos Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos Nro de pieza TMD039 9 12 P gina 19 E 5 A Detecci n de fragmentos amplificados al utilizar el 3500 o el 3500xL Genetic o Analyzer de Applied Biosystems continuaci n Promega Cuando cree un protocolo de instrumentos aseg rese de seleccionar el mismo conjunto de tintes que se utiliz para realizar la calibraci n espectral de 5 tintes de Promega Recomendamos utilizar un tiempo de ejecuci n de 1210 1500 segundos y las condiciones de inyecci n predeterminadas O El tiempo de ejecuci n y otras configuraciones de instrumentos se deben optimizar y validar en su laboratorio Cuando se optimizan las condiciones de inyecci n en su laboratorio puede elegir crear protocolos de instrumentos espec ficos para cada condici n evaluada Si se utiliza un nico protocolo de instrumentos siga las instrucciones en la Gu a de usuarios de Applied Biosystems 3500 3500xL Genetic Analyzers para editar una entrada de biblioteca Asigne un nombre descriptivo de protocolo Nota Para obtener informaci n m s detallada c
86. na Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 35 6 D C mo crear un m todo de an lisis de casos con el software GeneMapper ID X Versi n 1 2 continuaci n General Allele Peak Detector Peak Quality SQ amp GQ Settings Bin Set PowerPlex_Fusion_Bins_IDX_v1 0 V Use marker specific stutter ratio and distance if available Marker Repeat Type Tri Tetra Global Cut off Value 0 0 0 0 MinusA Ratio 0 0 0 0 MinusA Distance 0 0 0 0 0 0 0 0 Global Minus Stutter Ratio 0 0 0 0 Global Minus Stutter Distance 2 25 3 25 4 75 Global Plus Stutter Ratio 0 0 Global Plus Stutter Distance 0 0 0 0 Amelogenin Cutoff Range Fier Eactory Defauks 11050TA Figura 13 La pesta a Allele Alelo del GeneMapper ID X 10 Seleccione la pesta a Peak Detector Detector de picos La figura 14 muestra un ejemplo de las configuraciones utilizadas en Promega Es posible que deba optimizar estas configuraciones Debe realizarse una validaci n interna Notas 1 Seleccione el rango completo o un rango parcial para el rango de an lisis Cuando se utiliza un rango parcial elija un rango de an lisis apropiado seg n sus datos Elija un punto de inicio despu s del pico de impr
87. nage Preferences Help Log Out l Plate Name PPiex EE New Plate CT Open Plate Cl Save Plate v Close Plate E Import 2 Export P Find Replace E View Plate Grid Report Qy Print 7 Setup E Show In Wells y E Select Wells EE Array Selection fH Row E Column Ezom EZomon mrt D 2 3 4 D D 7 Ts E 10 m R Define Plate Properties lili Review Resuts View Sequencing Results Figura 9 C mo definir propiedades de placas 10 Seleccione Assign Plate Contents Asignar contenido de la placa figura 10 11 Asigne nombres de muestra a los pocillos 12 En la parte inferior izquierda de la pantalla bajo el titulo Assays Ensayos utilice la opci n Add Agregar de la biblioteca para seleccionar el ensayo Dashboard Edit Library Maintenance Tools Y Manage Y Preferences Help Y Log Out l Plate Name PPiex EE New Plate CT Open Plate pE Save Plate LS Close Plate Be Import F Export P Find Replace E View Plate Grid Report Gy Print D setup ETEA E Show In Wells Select Wells EI Array Selection ro Column Zoomin EjZoom Out EFt ssign Plate Contents 1 2 3 4 5 6 7 Je D 10 u 2 E Run instrument A Load Plates for Run B Preview Run c Monitor Run S LL Review Resuts P View Sequencing Results F View Fragment HID Results 6 aL 4 Sei Name PPlex Barcode a ef Hm
88. ncias de tama o utilizando la escalera al lica Promega recomienda utilizar el software GeneMapper ID para analizar las reacciones del PowerPlex Si utiliza el software GeneMapper ID versi n 3 2 aseg rese de que el m todo de an lisis seleccionado sea un m todo HID Esto puede verificarse abriendo el m todo de an lisis con el administrador de GeneMapper y seleccionando luego la pesta a General El tipo de an lisis no se puede cambiar Si el m todo no es HID se debe eliminar y se debe crear un nuevo m todo de an lisis Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 67 E 8 Referencias A Promega 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Edwards A et al 1991 DNA typing with trimeric and tetrameric tandem repeats Polymorphic loci detection systems and population genetics In The Second International Symposium on Human Identification 1991 Promega Corporation 31 52 Edwards A et al 1991 DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats Am J Hum Genet 49 746 56 Edwards A et al 1992 Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups Genomics 12 241 53 Warne D et
89. neMapper ID X No est n destinadas a ser una gu a exhaustiva para utilizar el software GeneMapper ID X Recomendamos que los usuarios se comuniquen con Applied Biosystems para obtener capacitaci n sobre el software 1 Seleccione Tools Herramientas luego GeneMapper ID X Manager Administrador de GeneMapper ID X 2 Seleccione la pesta a Analysis Methods M todos de an lisis Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 39 6 E C mo crear una base de datos o m todo de an lisis de paternidad con el software GeneMapper ID X Versi n 1 2 continuaci n de Seleccione New Nuevo y se abrir un nuevo cuadro de di logo de m todo de an lisis En la ventana Analysis Method Editor Editor de m todo de an lisis seleccione GeneMapper ID X Security Group como el grupo de seguridad Esto permite el acceso a todos los usuarios del software Se pueden utilizar otros grupos de seguridad Ingrese un nombre descriptivo para el m todo de an lisis como por ejemplo PowerPlex Fusion 20 Filter Seleccione la pesta a Allele Alelo figura 16 Seleccione el archivo de texto de intervalos que se import en la secci n 6 A Recomendamos los valores mostrado
90. neMapper ID X continuaci n Sintomas Alelos fuera de la escalera Causas y comentarios Se utiliz una escalera al lica de una ejecuci n diferente a las muestras Vuelva a analizar las muestras con una escalera al lica de la misma ejecuci n El software GeneMapper ID X requiere que la escalera al lica se importe de la misma carpeta donde se encuentra la muestra Aseg rese de que la escalera al lica est en la misma carpeta donde se encuentra la muestra Cree un nuevo proyecto y vuelva a analizar como se describe en la secci n 6 D o 6 E El archivo de texto de paneles seleccionado para el an lisis no fue correcto para el sistema de STR utilizado Asigne el archivo de texto de paneles correcto que corresponde al sistema de STR utilizado para la amplificaci n La escalera al lica no se identific como una escalera al lica en la columna de tipo de muestra El est ndar de carril interno no se identific correctamente en la muestra Vuelva a definir manualmente los tama os de los fragmentos de est ndar de tama o en la muestra El est ndar de tama o no se denomin Se utiliz una escalera al lica de mala calidad durante el an lisis Aseg rese de que s lo se utilicen escaleras al licas de alta calidad para el an lisis Se utiliz una escalera al lica de una ejecuci n diferente a las muestras Vuelva a analizar las muestras con una escalera al lica de la misma ejecuci n El punto de part
91. notipo en el archivo del panel si utiliza un ADN de control positivo diferente 5 En la columna Analysis Method M todo de an lisis seleccione el m todo de an lisis creado anteriormente en esta secci n 6 En la columna Panel seleccione el archivo de texto de paneles que se import en la Secci n 6 F 7 En la columna Size Standard Est ndar de tama o seleccione el est ndar de tama o que se import en la Secci n 6 G o se cre en la Secci n 6 H 8 Seleccione Analyze Analizar el bot n de flecha verde para comenzar el an lisis de datos Nota El tama o de los alelos Penta E y DYS391 de bases gt 475 no utilizar el M todo local del sur Para Penta E los alelos gt 24 se etiquetar n como OL Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos Nro de pieza TMD039 9 12 P gina 49 6 J C mo crear una base de datos o m todo de an lisis de paternidad con el software GeneMapper ID Versi n 3 2 1 Seleccione Tools Herramientas luego GeneMapper Manager Administrador de GeneMapper Seleccione la pesta a Analysis Methods M todos de an lisis Seleccione New Nuevo y se abrir un nuevo cuadro de di logo de m todo de an lisis Seleccione HID y seleccione OK Acepta
92. ntaminaci n de los reactivos Es altamente recomendable el uso de guantes y puntas para pipetas resistentes al aerosol por ej puntas ARTS secci n 9 E Algunos reactivos utilizados en el an lisis de productos de las STR son potencialmente peligrosos y se deben manejar de manera acorde La formamida es un agente irritante y terat geno evite la inhalaci n y el contacto con la piel Lea la etiqueta de advertencia y tome las precauciones apropiadas cuando maneje esta sustancia Use siempre guantes y anteojos de seguridad cuando trabaje con formamida Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 5 AR Calibraci n espectral La generaci n correcta de un archivo de matriz es fundamental para evaluar los sistemas multicolores con los ABI PRISM 3100 y 3100 Avant Genetic Analyzers y los Applied Biosystems 3130 3130x1 3500 y 3500xL Genetic Analyzers Se debe generar una matriz para cada instrumento individual Para obtener los protocolos e informaci n adicional sobre la calibraci n espectral en estos instrumentos consulte el bolet n t cnico PowerPlex 5 Dye Matrix Standards 3100 3130 TBD024 Este manual est disponible en linea en www promega com protocols Protocolos para la amplificaci n del ADN al utilizar el Pow
93. o FE ae E Ze am lt o e LIN Assays File Name Conventions Results Groups eS 2 Actions y Actions v Actions y 4 lt 2 Sa y d Add from Library Add from Library Add from Library D Create New Assay Create New File Name Convention Create New Results Group H E 3 5 Link Plate for Run Figura 10 C mo asignar contenido a las placas Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Nro de pieza TMD039 Impreso en Estados Unidos P gina 26 9 12 9255TA creado en el paso 5 o uno previamente creado Haga clic en el bot n Add CG to Plate Agregar a la placa y cierre la ventana A 13 Bajo el t tulo File Name Convention Convenci n sobre nombre de Promega archivo utilice la opci n Add from Library Agregar de la biblioteca para seleccionar la convenci n sobre nombre de archivo creada en el paso 6 o una previamente creada Haga clic en el bot n Add to Plate Agregar a la placa y cierre la ventana 14 Bajo el t tulo Results Groups Grupos de resultados utilice la opci n Add from Library Agregar de la biblioteca para seleccionar los grupos de resultados creados en el paso 7 u otros previamente creados Haga clic en el bot n Add to Plate Agregar a la placa y cierre la ventana 15 Resalte los pocillos de muestra lue
94. o Tama o Nro de Cat PowerPlex Fusion System 800 reactivos DC2408 No debe ser utilizado para diagn stico m dico Este sistema contiene los reactivos necesarios para 800 reacciones de 25 ul cada una Incluye Caja de componentes anteriores a la amplificaci n 4x1ml PowerPlex Fusion 5X Master Mix 4x1ml PowerPlex Fusion 5X Primer Pair Mix 25 ul ADN de control 2800M 10 ng ul 10x 12501 Agua grado de amplificaci n Caja de componentes posteriores a la amplificaci n 4 x 100 ul PowerPlex Fusion Allelic Ladder Mix 8 x 300 ul CC5 Internal Lane Standard 500 El componente PowerPlex Fusion Allelic Ladder Mix viene en una bolsa sellada y separada para el envio Este componente debe ser trasladado a la caja posterior a la amplificaci n despu s de abrirlo El agua grado de amplificaci n se proporciona en una bolsa sellada y separada para el env o Este componente debe ser trasladado a la caja anterior a la amplificaci n despu s de abrirlo Condiciones de almacenamiento Para el almacenamiento a largo plazo guarde todos los componentes excepto el ADN de control 2800M a una temperatura de 30 C a 10 C en un congelador antiescarcha Almacene el ADN de control 2800M a una temperatura de 2 10 C Para uso diario los componentes del PowerPlex Fusion System se pueden almacenar hasta 1 semana a 2 10 C Los productos PowerPlex Fusion 5X Primer Pair Mix PowerPlex Fusion Allelic Ladder Mix y CC5 Internal Lane Standard 500
95. o para la muestra Cada carpeta en el proyecto debe contener al menos una inyecci n de escalera al lica designada como Allelic Ladder Escalera al lica en la columna Sample Type Tipo de muestra para la determinaci n del genotipo correcto Nota El ADN de control positivo definido en el archivo del panel GeneMapper ID X es el ADN de control 2800M Redefina el genotipo en el archivo del panel si utiliza un ADN de control positivo diferente En la columna de Analysis Method M todo de an lisis seleccione el m todo de an lisis creado anteriormente En la columna Panel seleccione el archivo de texto de panel que se import en la secci n 6 A En la columna Size Standard Est ndar de tama o seleccione el est ndar de tama o que se import en la secci n 6 B o se cre en la secci n 6 C Seleccione Analyze Analizar el bot n de flecha verde para comenzar el an lisis de datos Nota De manera predeterminada el software muestra las ventanas de Analysis Requirement Summary Resumen de requisitos de an lisis Allelic Ladder Analysis Summary Resumen de an lisis de escalera al lica y Analysis Summary Resumen de an lisis despu s de que el software lleva a cabo una revisi n de calidad Aseg rese de que se cumplan todos los requisitos a medida que aparezca cada ventana Si no tiene la ventana de resumen de requisitos de an lisis activada es posible que deba hacer
96. oftware de recolecci n de datos Versi n A eersten 28 6 An lisis de da irnos atera tie 31 A Como importar archivos de texto de paneles intervalos y repeticiones de PowerPlex Fusion con el software GeneMapper ID X Versi n ll 31 B C mo importar el CC5 ILS 500 IDX Size Standard en el software CeneMapper ID X Version ebe eeieie eeneg 31 C Como crear un est ndar de tama o con el software GeneMapper ID X Ves loa oa 33 D C mo crear un m todo de an lisis de casos con el software GeneMapper ID X Vernon vsaisnia nin aiii onto iia 35 E Como crear una base de datos o m todo de an lisis de paternidad con el software GeneMapper ID X Versi n TZ suecia tocan 39 F C mo importar archivos de texto de paneles intervalos y repeticiones de PowerPlex Fusion con el software GeneMapper ID Versi n 37 43 G C mo importar el CC5 ILS 500 Size Standard en el software CeneMapper ID Versi n ata hadnmuninmmmn iin gamdaieinandie 44 H C mo crear un est ndar de tama o con el software GeneMapper ID X WEES E 45 I Como crear un m todo de an lisis de casos con el software GeneMapper ID Versi n S Zrii di 48 J C mo crear una base de datos o m todo de an lisis de paternidad con el software GeneMapper ID Versi n 3 2 cssiorarccinicioniscianciisoirrisi eii 50 K EE ee 52 A A PA 53 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel
97. ogies Pty Ltd and is licensed to Whatman GeneAmp is a registered trademark of Roche Molecular Systems Inc Hi Di POP 4 and POP 7 are trademarks of Applera Corporation OmniSwab is a trademark of Whatman Sampact is a trademark of Fitzco Vacutainer is a registered trademark of Becton Dickinson and Company Products may be covered by pending or issued patents or may have certain limitations Please visit our Web site for more information All prices and specifications are subject to change without prior notice Product claims are subject to change Please contact Promega Technical Services or access the Promega online catalog for the most up to date information on Promega products Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 77
98. one el archivo luego seleccione Import Importar Seleccione Done Realizado para guardar los cambios y cierre el administrador de GeneMapper Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 44 Impreso en Estados Unidos 9 12 6 H C mo crear un est ndar de tama o con el software GeneMapper ID X Version 3 2 1 Seleccione Tools Herramientas luego GeneMapper Manager Administrador de GeneMapper Seleccione la pesta a Size Standar Est ndar de tama o Seleccione New Nuevo Seleccione Basic o Advanced B sico o avanzado figura 17 El tipo de m todo de an lisis seleccionado debe coincidir con el tipo de m todo de an lisis creado anteriormente Seleccione OK Aceptar Select Dye and Analysis Method 5725TA Figura 17 Ventana Select Dye and Analysis Method Seleccionar tinte y m todo de an lisis 5 Ingrese un nombre detallado como por ejemplo CC5 ILS 60 a 500 en el Size Standard Editor Editor de est ndar de tama o Figura 18 Elija Orange Naranja para el Size Standard Dye Tinte de est ndar de tama o Ingrese los tama os de los fragmentos de est ndar de carril interno bases de 60 65 80 100 120 140 160 180 200 225
99. onsulte la Gu a de usuarios de Applied Biosystems 3500 3500xL Genetic Analyzers 3 Para crear un nuevo est ndar de tama o para el protocolo de control de calidad QC navegue hacia la biblioteca Seleccione Size Standards Est ndares de tama o luego seleccione Create Crear Alternativamente se puede utilizar un est ndar de tama o previamente creado Asigne al est ndar de tama o el nombre ILS500 u otro nombre apropiado Elija Orange Naranja como el color de tinte Los fragmentos en el est ndar de tama o son bases de 60 65 80 100 120 140 160 180 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 y 500 Consulte la figura 4 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 Impreso en Estados Unidos P gina 20 9 12 E 3500 Data Collection Software Sey Dashboard Edt Library Maintenance Tools Manage Preferences Help Log Ou Libray Resources S Create 4 Ede E Duplicate FI Delete Import ZB Geo fy View Audit History EZE Setup n Size Standard mae Anon File Namo Conventions Results Group Sue Qandard 1 5500 ii Anatyze Description Ad e Si Pir rpnent Protocots Dye Color Orange gt Oye Sete a Enter sizes in the fieid below seperated by a comma space or return th
100. otras patentes que se emitieron a Max Planck Gesellschaft zur F rderung der Wissenschaften e V Alemania Autorizado por la patente estadounidense N 5 338 671 y 5 587 287 y las patentes correspondientes en otros pa ses Unicamente para su uso en investigaci n No debe ser utilizado en procedimientos de diagn stico Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 76 Impreso en Estados Unidos 9 12 Las secuencias al licas para uno o m s de los locus vWA FGA D8S1179 D21S11 y las mezclas de escalera al lica D18551 est n autorizadas por la patente estadounidense N 7 087 380 7 645 580 la patente australiana N 2003200444 y los reclamos de patentes correspondientes fuera de Estados Unidos SJLos tintes TMR ET CXR ET y CC5 son marcas patentadas Este producto o partes de l se fabrican y venden con autorizaci n de GE Healthcare seg n la patente australiana N 692230 la patente austr aca N E236994 la patente belga N 0743987 la patente canadiense N 2231475 la patente europea N 0743987 y 0851867 la patente francesa N 0743987 y 0851867 la patente alemana N 19581489 69530286 8 y 0851867 la patente italiana N 0743987 y 0851867 la patente japonesa N 3066984 la patente liechtensteiniana N 0743987 y 0851867 la patente holan
101. ov biotech strbase chrom htm 2El informe de agosto de 1997 23 24 de la Comisi n de ADN de la Sociedad Internacional de Hemogen tica Forense ISFH afirma 1 para los locus de STR dentro de los genes que codifican se utilizar la cadena que codifica y el motivo de la secuencia de repetici n definida con el primer nucle tido de 5 posible de un motivo de repetici n y 2 para los locus de STR no asociadas con un gen que codifica se utilizar la primera entrada de la base de datos o la descripci n de la literatura original 1La informaci n sobre la ubicaci n cromos mica de estos locus se puede encontrar en las referencias 20 21 La amelogenina no es una STR pero muestra una banda espec fica X de bases de 89 y una banda espec fica Y de bases de 95 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 70 Impreso en Estados Unidos 9 12 9 A Ventajas de utilizar los locus en el PowerPlex Fusion System continuaci n O Tabla 5 Informaci n sobre la escalera al lica del PowerPlex Fusion System Rango de tama o de los Locus de las componentes de la N meros repetidos de los componentes de STR Etiqueta escalera al lica bases la escalera al lica Amelogenina Fluoresce na 89 95 X Y D3S1358 Fluoresceina 103 147 9 20 D1S1656 Fluoresc
102. p sns A euraosalon y 1od sopeyanbyja eoraye e19 e9sa e ap sajusuodulo soq y aueg uorsny oX9 J19MOJ Jap SO eAIayuT a sajaued ap 04x9 ap soatypre soy A T E UOISIAA qI taddepjauasy aremyjos Ja U02 OzITeUR as PISINUI LJ ap OATYIe D sopuNsas ap AJ ap UOTI aAUT eun opuezyiyn JazATeuy 943039 QETE esura3s sorg parddy un uod zjeue as XIN Jappey Ney UOISNH gXa Gamo Y XIN I9PPPT HOT Y Voten oXa qIamog epZaul Y Ez LMS 009 D0CL oor 008 ag 009 oor 008 D0CL 009 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Nro de pieza TMD039 Impreso en Estados Unidos 9 12 Pagina 55 7 Resoluci n de problemas Si tiene preguntas que no se hayan resuelto aqu comun quese con su oficina local de Promega o con su distribuidor La informaci n de contacto est disponible en www promega com Correo electr nico genetic promega com 7 A Amplificaci n y detecci n de fragmentos Esta secci n proporciona informaci n sobre la amplificaci n y la detecci n generales Si tiene preguntas sobre amplificaci n de ADN extra do consulte la Secci n 7 B Para obtener informaci n sobre la amplificaci n directa consulte las Secciones 7 C y 7 D S ntomas Causas y comentarios Picos de alelos d biles o ausentes La mezcla PowerPlex Fusion 5X Master Mi
103. pico m nimas a las que el software considerar pico Los valores para los umbrales de amplitud de pico son generalmente de 50 150 RFU y deben ser determinados por los laboratorios individuales Las alturas de pico para el CC5 ILS 500 son generalmente inferiores a las de los otros tintes Por lo tanto el umbral del tinte naranja puede ser inferior al de los otros tintes Analysis Method Editor H General Allele Peak Detector Peak Quality Quality Flags Peak Detection Algorithm Advanced el Ranges Peak Detection Analysis Sizing Peak Amplitude Thresholds Full Range Al Sizes v B 50 R 50 G 50 O 50 Y 50 Smoothing and Baselining Min Peak Half Width 2 pts Smoothing O None Light Polynomial Degree 3 O Heavy Peak Window Size 15 pts Baseline Window 51 pts Select Peak Start 0 0 Size Calling Method Peak Ee 00 2nd Order Least Squares 3rd Order Least Squares Cubic Spline interpolation Local Southern Method Global Southern Method 11047TA Figura 20 La pestafia Peak Detector Detector de picos del GeneMapper ID 11 Seleccione la pestafia Peak Quality Calidad de picos Puede cambiar las configuraciones para la calidad de picos Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 Impreso en Estados Unidos
104. plied Biosystems con el software de recolecci n de datos Versi n 3 0 Materiales que deber suministrar el usuario calentador en seco de 95 C ba o de agua o termociclador hielo picado o ba o de hielo centrifugador compatible con placas de 96 pocillos puntas para pipetas resistentes al aerosol serie capilar de 3100 o 3130 36 cm pol mero de rendimiento optimizado 4 POP 4 para el 3100 o 3130 buffer 10X con EDTA para el analizador gen tico placa ptica de 96 pocillos y septa MicroAmp o equivalente formamida Hi Di Applied Biosystems Nro de Cat 4311320 La calidad de la formamida es fundamental Use formamida Hi Di Congele la formamida en al cuotas a 20 C Los m ltiples ciclos de congelaci n descongelaci n o el almacenamiento a largo plazo a 4 C pueden provocar la descomposici n de la formamida La formamida de mala calidad puede contener iones que compitan con el ADN durante la inyecci n lo que provoca alturas de pico inferiores y sensibilidad reducida Un mayor tiempo de inyecci n no puede aumentar la se al La formamida es un agente irritante y terat geno evite la inhalaci n y el contacto con la piel Lea la etiqueta de advertencia y tome las precauciones apropiadas cuando maneje esta sustancia Use siempre guantes y anteojos de seguridad cuando trabaje con formamida Preparaci n de la muestra 1 Descongele el CC5 Internal Lane Standard 500 Nota Centrifugue brevemente el tubo para que
105. poraci n incompleta en el residuo de 3 A Aseg rese de realizar un paso de extensi n de 20 minutos a 60 C despu s del ciclo t rmico secci n 4 B e Disminuya el n mero de ciclos e Aumente el tiempo de extensi n final Cantidad excesiva de ADN La amplificaci n de gt 20 ng de la plantilla puede dar como resultado una falta de equilibrio con locus m s peque os que muestran m s producto que los locus m s grandes e Utilice una o dos perforaciones de 1 2 mm de una tarjeta de almacenamiento que contenga una muestra bucal o una perforaci n de una tarjeta de almacenamiento de 1 2 mm que contenga sangre entera Siga las recomendaciones del fabricante cuando deposite la muestra en la tarjeta de almacenamiento e Disminuya el n mero de ciclos El volumen de la reacci n fue demasiado bajo Este sistema est optimizado para un volumen final de reacci n de 25 pl con el fin de superar los inhibidores presentes en las tarjetas FTA y el PunchSolution Reagent La disminuci n del volumen de la reacci n puede dar como resultado un rendimiento de calidad inferior La amplificaci n se inhibi cuando se utiliz m s de una perforaci n de tarjeta de almacenamiento con sangre Utilice s lo una perforaci n de 1 2 mm de tarjeta de almacenamiento con sangre Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax
106. pos de muestras en soporte FTA incluyen e C lulas bucales recolectadas en las tarjetas FTA con dispositivos Whatman EasiCollect o Fitzco Sampact e C lulas bucales recolectadas con hisopos est riles y transferidas a tarjetas FTA o tarjetas que indican FTA Sangre l quida proveniente de los tubos Vacutainer de recolecci n o almacenamiento o pinchazos en los dedos almacenada en las tarjetas FTA Los tipos de muestras que no son FTA incluyen e Muestras bucales en dispositivos Bode Buccal DNA Collector Muestras de sangre y bucales en perforaciones de tarjetas no FTA por ejemplo S amp S 903 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 9 O Promega 4 B Amplificaci n directa de ADN de las tarjetas perforadas de almacenamiento continuaci n Trate preliminarmente tipos de muestras no FTA con el PunchSolution Kit Nro de cat DC9271 para lisar muestras no FTA antes de agregar la mezcla de amplificaci n PCR Para obtener m s informaci n consulte el Manual t cnico Nro TMD038 del PunchSolution Kit Al no tratar preliminarmente estas muestras se pueden obtener perfiles incompletos Utilice una herramienta de perforaci n manual con una punta de 1 2 mm para crear manualmente discos
107. r Nota Si no visualiza la opci n HID usted no tiene el software GeneMapper ID Comun quese con Applied Biosystems Ingrese un nombre descriptivo para el m todo de an lisis como por ejemplo PowerPlex_Fusion_20 filter Seleccione la pesta a Allele Alelo figura 21 Seleccione el archivo de texto de intervalos que se import en la secci n 6 F Aseg rese de que la casilla Use marker specific stutter ratio if available Utilizar proporci n de repeticiones de marcador espec fico si est disponible est marcada Ingrese los valores mostrados en la figura 21 para un correcto filtrado de los picos cuando se utiliza el PowerPlex Fusion System Para obtener una explicaci n del uso correcto y los efectos de estas configuraciones consulte el bolet n del usuario de Applied Biosystems denominado Procedimientos de instalaci n y nuevas caracter sticas para el software GeneMapper ID 3 2 Nota Aseg rese de que el filtro de 20 apropiado se aplique en este m todo de an lisis ingresando 0 20 para el valor global l mite para las repeticiones de Tri Tetra y Penta Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Nro de pieza TMD039 P gina 50 Impreso en Estados Unidos 9 12 Analysis Method Editor HID Bin Set PowerPlex_Fusion_Bins_v1 D e
108. r ID X KE Versi n 1 2 continuaci n Promega C mo procesar los datos para las muestras de casos k 2 Seleccione File Archivo luego New Project Nuevo proyecto Seleccione Edit Editar luego Add Samples to Project Agregar muestras al proyecto Busque la ubicaci n de los archivos de ejecuci n Resalte los archivos deseados luego seleccione Add to list Agregar a la lista seguido por Add Agregar En la columna Sample Type Tipo de muestra utilice el men desplegable para seleccionar Allelic Ladder Escalera al lica Sample Muestra Positive Control Control positivo o Negative Control Control negativo seg n sea lo apropiado para la muestra Cada carpeta en el proyecto debe contener al menos una inyecci n de escalera al lica designada como Allelic Ladder Escalera al lica en la columna Sample Type Tipo de muestra para la determinaci n del genotipo correcto Nota El ADN de control positivo definido en el archivo del panel GeneMapper ID X es el ADN de control 2800M Redefina el genotipo en el archivo del panel si utiliza un ADN de control positivo diferente En la columna de Analysis Method M todo de an lisis seleccione el m todo de an lisis creado anteriormente En la columna Panel seleccione el archivo de texto de panel que se import en la secci n 6 A En la columna Size Standard Est
109. r la ejecuci n de la muestra 11 Controle la electroforesis observando la ventana del visor de la ejecuci n la vista el ensayo o los capilares en el software de recolecci n de datos Cada inyecci n durar aproximadamente 40 minutos An lisis de datos 6 A C mo importar archivos de texto de paneles intervalos y repeticiones de PowerPlex Fusion con software GeneMapper ID X Versi n 1 2 Para facilitar el an lisis de los datos generados con el PowerPlex Fusion System hemos creados archivos de texto de paneles e intervalos para permitir la asignaci n autom tica de los genotipos con el software GeneMapper ID X Recomendamos que los usuarios reciban capacitaci n de Applied Biosystems sobre el software GeneMapper ID X para familiarizarse con el funcionamiento correcto del software Nota Los archivos de texto de paneles intervalos y repeticiones mencionados aqu son compatibles con las versiones anteriores del software GeneMapper ID X Inicio 1 Para obtener los archivos de texto de paneles intervalos y repeticiones para el PowerPlex Fusion System visite www promega com resources tools genemapper id software panels and bin sets 2 Seleccione el PowerPlex System que est usando seleccione GeneMapper ID X as como el ADN de control que utiliza Ingrese su informaci n de contacto y seleccione Submit Enviar 3 Guarde los archivos PowerPlex_Fusion_Panels_IDX_vX x txt PowerPlex_Fusion_B
110. ras de agresi n sexual separadas de manera diferenciada y manchas en materiales de apoyo El DNA IQ System ha sido evaluado con los PowerPlex Systems para garantizar un proceso m s eficiente Para aplicaciones que requieren cuantificaci n de ADN espec ficamente humano se desarroll el sistema Plexor HY System N de Cat DC1000 27 Este m todo basado en qPCR proporciona cuantificaci n total de ADN espec ficamente humano y masculino en una reacci n Adicionalmente el Plexor HY System proporciona un an lisis de fusi n posterior a la amplificaci n para confirmar los resultados positivos y el control de PCR interno IPC para confirmar los resultados negativos La informaci n adicional de pedido est disponible en la secci n 9 E Para obtener informaci n sobre la automatizaci n de los m todos qu micos en las estaciones de trabajo automatizadas utilizando soluciones Identity Automation comun quese con su oficina local de Promega o con su distribuidor la informaci n de contacto est disponible en www promega com support worldwide contacts correo electr nico genetic promega com o visite www promega com idautomation Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 73 Promega O 200 100 9 C
111. reacciones de control positivo y negativo Agregue 1 0 2 reacciones a este n mero para compensar el error de pipeteado Si bien este enfoque consume una peque a cantidad de cada reactivo asegura que usted tenga suficiente mezcla de amplificaci n de la PCR para todas las muestras Adem s garantiza que cada reacci n contenga la misma mezcla de amplificaci n de la PCR 3 Utilice una placa limpia MicroAmp para reunir la reacci n y etiquete de forma apropiada o como alternativa determine el n mero de tubos de reacci n de 0 2 ml limpios requeridos y etiquete de forma apropiada 4 Agregue el volumen final de cada reactivo enumerado en la Tabla 1 a un tubo est ril Tabla 1 Mezcla de amplificaci n de la PCR para la amplificaci n del ADN extra do Componente de la mezcla de Volumen por N merode _ Volumen final amplificaci n de la PCR reacci n reacciones ul hasta un volumen Agua grado de amplificaci n final de 25 0 ul x PowerPlex Fusion 5X Master Mix 5 0 ul x PowerPlex Fusion 5X Primer Pair Mix 5 0 ul x plantilla de ADN 0 25 0 5ng 4 hasta 15 pul volumen total de la reacci n 25 ul Agregue agua grado de amplificaci n al primer tubo luego agregue la PowerPlex Fusion 5X Master Mix y la PowerPlex Fusion 5X Primer Pair Mix La plantilla de ADN se agregar en el paso 6 2Almacene las plantillas de ADN en un buffer TE 10 mM Tris HCl pH 8 0 0 1 mM EDTA o buffer TE con 20 ug ml de gluc
112. rifugue brevemente la placa para llevar el contenido hasta el fondo de los pocillos y retire cualquier burbuja de aire Ciclo t rmico Los instrumentos de amplificaci n y detecci n pueden variar Deber optimizar protocolos incluida la cantidad de ADN de plantilla el n mero de ciclos 25 28 ciclos el tiempo de inyecci n y el volumen de carga para la instrumentaci n de su laboratorio Las pruebas efectuadas en Promega demuestran que 27 ciclos funcionan bien para una variedad de tipos de muestra Se deber optimizar el n mero de ciclos en cada laboratorio para cada tipo de muestra que se amplifique 1 Coloque la placa MicroAmp en el termociclador 2 Seleccione y ejecute el protocolo recomendado Aseg rese de haber seleccionado el modo Max M x como la velocidad de rampa El protocolo preferido para utilizar con el termociclador GeneAmp PCR System 9700 se proporciona abajo El tiempo de ciclo total estimado es 1 5 horas Protocolo del ciclo t rmico 96 C durante 1 minuto luego 94 C durante 10 segundos 59 C durante 1 minuto 72 C durante 30 segundos para 27 ciclos luego 60 C durante 20 minutos inmersi n a 4 C Cuando utilice el termociclador del GeneAmp PCR System 9700 el programa se debe ejecutar con la velocidad de rampa configurada en el modo maximo Esto requiere un bloque de muestra de plata o plata dorada La velocidad de la rampa se configura despu s de que comienza
113. rotocolo recomendado Aseg rese de haber seleccionado el modo Max M x como la velocidad de rampa El protocolo preferido para utilizar con el termociclador GeneAmp PCR System 9700 se proporciona abajo El tiempo de ciclo total estimado es 1 5 horas Protocolo del ciclo t rmico 96 C durante 1 minutos luego 94 C durante 10 segundos 59 C durante 1 minutos 72 C durante 30 segundos para 30 ciclos luego 60 C durante 10 minutos inmersi n a 4 C Cuando utilice el termociclador del GeneAmp PCR System 9700 el programa se debe ejecutar con la velocidad de rampa configurada en el modo maximo Esto requiere un bloque de muestra de plata o plata dorada La velocidad de la rampa se configura despu s de que comienza la ejecuci n del ciclo t rmico Aparece la pantalla Select Method Options Seleccionar opciones de m todo Seleccione Max M ximo para la velocidad de la rampa e ingrese el volumen de la reacci n Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 8 Impreso en Estados Unidos 9 12 3 Despu s de finalizado el protocolo del ciclo t rmico almacene las muestras amplificadas a 20 C en una caja protegida de la luz Nota El almacenamiento a largo plazo de las muestras amplificadas a 4 C o m s puede producir artefacto
114. roup Attributes Preview of Results Group Name lt Results Group Name gt Available Attributes E Selected Attributes Assay Name Add Results Group Name Injection Number v Delimiters Remove Move Up Select a delimiter Move Down F Add between attributes Enter a custom value as either the Prefix or Suffix optional Prefoc Select Remjection Folder Option Store remjection sample files in a separate Reinjection folder same level as Injection folders D Sore remyection sample files with original sample files same level Select Folder Option Default file location DA Applied Beosysterms 3590 Data lt IR Folder gt Results Group Name Folder gt lt Inj Folder gt Custom file location Y Include an Instrument Run Name folder Y include a Result Group Name folder I Include an Injection folder 9253TA Figura 8 Ventana de creaci n de nuevos grupos de resultados Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos Nro de pieza TMD039 P gina 25 O 5 A Detecci n de fragmentos amplificados al utilizar el 3500 o el 3500xL Genetic Ke Analyzer de Applied Biosystems continuaci n Promega 9 Asigne un nombre descriptivo de placa Seleccione el tipo de placa HID del ment desplegable figura 9 Dashboard Edit Library Maintenance Tools Ma
115. rporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU N mero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 Pagina 21 CG 5 A Detecci n de fragmentos amplificados al utilizar el 3500 o el 3500xL Genetic A Analyzer de Applied Biosystems continuaci n Dashboard Edt gt Library Maintenance Tools Manage Pref 9 Library Resources S Create 2 Edit E Duplicate Zi Ociete i Import F bport fy E Sign ture View Audit History View Setup a QC Protocol x Manage Dages Protocol Name File Name Convertions Description Results Group Size Standard TL ger Instrumert Protocols Dye Sets Size Standards Basecaling Protocols Sizecalling Protocols MESES ro song tange aa Sequencing Analysis Protocols Analysis Start Point 0 Sring Start See 60 MicroSeq Protocols Analysis Stop Point 1000000 Sting Stop Sze 500 Prammer Analysis Protocols HID Analysis Protocots 7 a Green Yellow EE E E Peak Amplitude Threshold 175 BE os Ima Common Settings Use Baselining Baseline Window Pts t gt vas y Minimum Peak Half Width ir gt ek d Peak Window Size Slope Threshold Peak End Figura 5 Ventana de creaci n de nuevos protocolos de QC Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526
116. s 4 B Amplificaci n directa de ADN de los perforadores de tarjetas de almacenamiento Materiales que deber suministrar el usuario termociclador GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems e microcentrifugadora e placa ptica de reacci n de 96 pocillos MicroAmp o tubos de reacci n de 0 2 ml MicroAmp Applied Biosystems e puntas para pipetas resistentes al aerosol consulte la secci n 9 e PunchSolution Kit Nro de cat DC9271 para perforadores de tarjetas no FTA e perforador Harris Micro Punch de 1 2 mm o un perforador manual equivalente y soporte para cortar o bien un sistema de perforador automatizado Esta secci n contiene un protocolo para la amplificaci n directa de ADN de las tarjetas perforadas de almacenamiento utilizando el PowerPlex Fusion System y el termociclador GeneAmp PCR System 9700 Recomendamos amplificar una o dos perforaciones de 1 2 mm de una tarjeta de almacenamiento que contiene una muestra bucal o una perforaci n de 1 2 mm de una tarjeta de almacenamiento que contiene una muestra de sangre entera en un volumen de reacci n de 25 wl utilizando los protocolos que se detallan abajo El PowerPlex Fusion System est optimizado para el termociclador GeneAmp PCR System 9700 Nota Deber optimizar y validar el n mero de perforaciones de tarjetas de almacenamiento por reacci n en su laboratorio Vea las recomendaciones de optimizaci n de PCR al final de la secci n Los ti
117. s 30 minutos antes de la primera inyecci n para precalentar el horno Library Maintenance Tools Manage Y Preferences Help Log Out Common Operations a wi Create Create Plate Edit basting New Plate from Template Plate Quick View o Gauges POPS Polymer ABC Anode CBC Cathode 36cm 24 cap Array M cd A gp r 2 5 D 1 kk qn SCH d Ki 7 no o po D a at re 14 e PET D qa q a Ao 48 Samples Remang 7 Days Remaining 7 Days Remaining 66 Injections Performed 6 Injections Remameng 46 Injections Remaining 46 Injections Remaining Instrument 3500 Instrument State Idle f STI ee Pre Heat the Oven Laser On Oven On AAA Set Temperature to EP ON rinda a Oven Temperature C 60 0 d en lose z Detection Cell Temperature C 49 96 60 52 00 Start PreHeat Instrument Door Close Consumables Information Refresh O Consumable Name Status Daya on Instrument reegen Date tor Number Par Number Polymer popa 48 Samples Remaining 5 O6 Jan 2011 06 1006009 4393715 Anode Buffer ABC 7 Days Remaining 0 18 Mar 2011 07 1006014 4393927 Cathode Butter CBC 7 Days Remaining 0 23 Mar 201107 1007021 4408256 Capillary Array Zem 24 cap 94 Injections Remaining 51 03 Feb 201102 08 4404687 Serial M309K0803 y Maintenance Notifications o Name pm Notification Date Descnption Action 9247TA Figura 2 El tablero 2 Para crear un nuevo Protocolo de instrumentos navegue hacia la biblioteca
118. s dee F Add between attributes LAA Add a custom value to available attributes optional RK Custom Text 1 Custom Text 2 Custom Test 3 Select File Location Default File Location D Applied Beosystems 3500 Data Custom File Location 9252TA Figura 7 Ventana de creaci n de nuevas convenciones sobre nombre de archivo Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 Impreso en Estados Unidos P gina 24 9 12 7 Para crear un nuevo Grupo de resultados figura 8 navegue hacia la O Biblioteca Seleccione Results Group Grupo de resultados luego Ya seleccione Create Crear Alternativamente se puede utilizar un grupo de resultados previamente creado g Seleccione los atributos de grupo de resultados de acuerdo con las pr cticas del laboratorio Guarde con un nombre descriptivo 8 Para crear una nueva placa navegue hacia la biblioteca y desde el men Manage Administrar seleccione Plates Placas luego Create Crear Data Software Dashboard Edit y Library Maintenance Tools Manage Preferences H ED Create A Edt E Duplicate Gl Delete ME import Mi Epot fy Setup a Results Group Name is a required field Provide a unique value Name Tetecied Ge Select Results G
119. s en la figura 16 para un correcto filtrado de los picos de las repeticiones cuando se utiliza el PowerPlex Fusion System Es posible que deba optimizar estas configuraciones Debe realizarse una validaci n interna Y Use marker specific stutter ratio and distance if available Marker Repeat Type Tri Tetra Global Cut off Value 0 2 0 2 MinusA Ratio 0 0 0 0 MinusA Distance 0 0 0 0 0 0 0 0 Global Minus Stutter Ratio 0 0 0 0 Global Minus Stutter Distance From 3 25 To 5 4 75 Global Plus Stutter Ratio r 0 0 Global Plus Stutter Distance From 4 0 0 To 0 0 Amelogenin Cutoff 0 2 Range Filter Factory Defaults J 11051TA Figura 16 La pesta a Allele Alelo del GeneMapper ID X Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Nro de pieza TMD039 Pagina 40 Impreso en Estados Unidos 10 11 12 13 Nota Aseg rese de que el filtro de 20 apropiado se aplique en este m todo de an lisis ingresando 0 20 para el valor global l mite para las repeticiones de Tri Tetra y Penta Seleccione la pesta a Peak Detector Detector de picos La figura 14 muestra un ejemplo de las configuraciones utilizadas en Promega Es posible que deba optimizar estas configuraciones Debe realizarse una validaci n interna Notas le Seleccione el rango compl
120. s otros tintes Por lo tanto el umbral del tinte naranja puede ser inferior al de los otros tintes 11 Seleccione la pesta a Peak Quality Calidad de picos Puede cambiar las configuraciones para la calidad de picos Nota Para los pasos 11 y 12 consulte el manual de usuario de GeneMapper ID para obtener informaci n Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 51 O 6 J C mo crear una base de datos o m todo de an lisis de paternidad con el v software GeneMapper ID Versi n 3 2 continuaci n Promega 12 Seleccione la pesta a Quality Flags Indicadores de calidad Puede 1 cambiar estas configuraciones 13 Seleccione OK Aceptar para guardar sus configuraciones C mo procesar datos para la base de datos o muestras de paternidad 1 2 Seleccione File Archivo luego New Project Nuevo proyecto Seleccione Edit Editar luego Add Samples to Project Agregar muestras al proyecto Busque la ubicaci n de los archivos de ejecuci n Resalte los archivos deseados luego seleccione Add to list Agregar a la lista seguido por Add Agregar En la columna Sample Type Tipo de muestra utilice el men desplegable para seleccionar La
121. seleccione Instrument Protocol Protocolo de instrumentos luego seleccione Create Crear Alternativamente se puede utilizar un protocolo de instrumentos previamente creado Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Nro de pieza TMD039 Impreso en Estados Unidos Pagina 18 9 12 La Figura 3 muestra las configuraciones utilizadas en Promega para el CG 3500xL Genetic Analyzer de Applied Biosystems para el tipo de A aplicaci n conjunto de tintes longitud del capilar pol mero m dulo de ejecuci n e informaci n sobre el protocolo apropiada La nica Pro mega configuraci n que se cambi de las configuraciones predeterminadas es el conjunto de tintes Fina oe almer amm 3 ugeet um fb Me TE mn HMR ur ch IA Z d n eT d EH A Ets A vg d P ee A maist km ons p Har Med SH vru Bannen Pe A TES ef Proa A A Ip A kb ui wh ro dier A D n ei ef si 5s Le Tense L Is eel E male rn Lt ro TUE TEE A rm e OS A Oe ei sharin wade S Ki EREI ze e I e be ix 7 Ke ss Is zb H I Figura 3 Ventana de creaci n de nuevos protocolos de instrumento Las configuraciones recomendadas son Tipo de aplicaci n HID Longitud del capilar 36 cm Pol mero POP 4 Conjunto de tintes G5 Promega G5 spectral M dulo de ejecuci n HID36_POP4 xl Tie
122. software de recolecci n de datos Versi n 3 0 continuaci n 3 En el administrador de placas cree un nuevo registro de placas como se describe en el manual de usuario del instrumento En el cuadro de di logo que aparece seleccione GeneMapper Generic GeneMapper gen rico en la lista desplegable Application Aplicaci n y seleccione el tipo de placa apropiado 96 pocillos Agregue entradas en las ventanas del propietario y operador y seleccione OK Aceptar Nota Si desea realizar el autoan lisis de los datos de muestra consulte el manual de usuario del instrumento para obtener instrucciones En el registro de placas de GeneMapper ingrese los nombres de las muestras en las celdas apropiadas Despl cese hacia la derecha En la columna de grupo de resultados 1 seleccione el grupo de resultados deseado Fn la columna de protocolo de instrumentos 1 seleccione el protocolo que cre en el paso 2 Aseg rese de que la informaci n est presente en cada hilera que contiene un nombre de muestra Seleccione OK Aceptar Nota Para crear un nuevo grupo de resultados seleccione New Nuevo en el men desplegable en la columna de grupo de resultados Seleccione la pesta a General e ingrese un nombre Seleccione la pesta a Analysis An lisis y seleccione GeneMapper Generic GeneMapper gen rico en la lista desplegable Analysis Type Tipo de an lisis Coloque las
123. ta El volumen del est ndar de carril interno utilizado en el c ctel de carga puede ser aumentado o disminuido para ajustar la intensidad de los picos de est ndar de tama o seg n las preferencias del laboratorio Mantenga el volumen de la formamida a 10 0 pl y ajuste el volumen agregado a los pocillos en el paso 4 de manera acorde 3 Agite durante 10 15 segundos para mezclar 4 Pipetee 11 pl de formamida mezcla de est ndar de carril interno en cada pocillo 5 Agregue 1 pl de muestra amplificada o 1 pl de PowerPlex Fusion Allelic Ladder Mix Cubra los pocillos con la septa apropiada Nota Los l mites de detecci n del instrumento var an por lo tanto el tiempo de inyecci n el voltaje de inyecci n o la cantidad de muestra mezclada con el c ctel de carga pueden necesitar ser aumentados o disminuidos Para modificar el tiempo de inyecci n o el voltaje de inyecci n en el m dulo de ejecuci n seleccione Instrument Protocol Protocolo de instrumentos del men Library Biblioteca en el software de recolecci n de datos Si las alturas de picos son m s elevadas que lo deseado utilice menos plantilla de ADN en las reacciones de amplificaci n o reduzca el n mero de ciclos en el programa de amplificaci n para logar la intensidad de se al deseada Si se reduce el tiempo o el voltaje de la inyecci n se puede requerir un umbral de amplitud de pico reducido para el canal naranja para un tama o correcto 6 Centrif
124. tes en las muestras forenses pueden provocar que el alelo se retire o no tenga equilibrio 7 C Amplificaci n directa de ADN de los perforadores de tarjetas de almacenamiento La siguiente informaci n es espec fica para la amplificaci n directa del ADN de las tarjetas perforadas de almacenamiento Para obtener informaci n adicional sobre la amplificaci n y la detecci n generales consulte la secci n 7 A S ntomas Causas y comentarios Picos de alelos d biles o ausentes El volumen de la reacci n fue demasiado bajo Este sistema est optimizado para un volumen final de reacci n de 25 pl con el fin de superar los inhibidores presentes en las tarjetas FTA y las muestras de ADN La disminuci n del volumen de la reacci n puede dar como resultado un rendimiento de calidad inferior Transferencia de muestra insuficiente a la tarjeta de almacenamiento o muestra variable de la tarjeta de almacenamiento Tome las perforaciones de una parte diferente de la tarjeta Aumentar el n mero de ciclos puede mejorar las alturas de los picos bajos El ADN no era accesible o material no l tico Materiales no FTA previamente tratados con PunchSolution Reagent para garantizar que se libre el ADN de las prote nas celulares Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos Nro
125. texto de intervalos importado en la secci n Getting Started Inicio Seleccione el archivo luego Import Importar 9 Enel panel de navegaci n resalte la carpeta de paneles del PowerPlex Fusion que import en el paso 5 10 Seleccione File Archivo luego Import Marker Stutter Importar marcador de repeticiones Aparecer una casilla de advertencia preguntando si desea sobrescribir los valores actuales Seleccione Yes S 11 Navegue hacia el archivo de texto de repeticiones importado en la secci n Getting Started Inicio Seleccione el archivo luego Import Importar 12 Al final de la ventana del administrador de paneles seleccione OK Aceptar Esto guardar los archivos de texto de paneles intervalos y repeticiones luego cierre la ventana C mo importar el CC5 ILS 500 IDX Size Standard en el software GeneMapper ID X Versi n 1 2 Hay dos opciones cuando se crea un est ndar de tama o Utilice este protocolo o el protocolo alternativo en la secci n 6 C El archivo CC5_ILS_500_IDX xml est disponible para descargar en www promega com resources tools genemapper id software panels and bin sets Guarde el archivo CC5_ILS_500_IDX xml en un lugar conocido en su computadora 1 Seleccione Tools Herramientas luego GeneMapper ID X Manager Administrador de GeneMapper ID X 2 Seleccione la pesta a Size Standar Est ndar de tama o 3 Se
126. texto de repeticiones no se import en el no se filtraron administrador de paneles cuando se importaron los archivos de texto de paneles e intervalos Aseg rese de que la casilla Use marker specific stutter ratio and distance if available Utilizar proporci n de repeticiones de marcador espec fico y distancia si est disponible est marcada La distancia de las repeticiones no se defini en la pesta a Allele Alelo de Analysis Method M todo de an lisis Las muestras en el proyecto La ventana Analysis Requirement Summary Resumen de no se analizaron requisitos de an lisis no estaba activada y no se cumpli con un requisito de an lisis Active esa opci n en el men Options Opciones y corrija los requisitos de an lisis necesarios para continuar el an lisis Las ediciones en el visor de la edici n Para visualizar las ediciones realizadas a un proyecto de etiquetas no se pueden primero se debe guardar Cierre la ventana de visualizar el proyecto visualizaci n de gr ficos regrese a la p gina principal de GeneMapper ID X y guarde el proyecto Muestre la ventana de gr ficos de nuevo luego visualice la tabla de edici n de etiquetas La barra de encabezamiento del Cuando se realiza una edici n a un locus los indicadores de marcador para algunos lugares calidad y la barra de encabezamiento del marcador son grises cambian autom ticamente al color gris Para cambiar el GQ y la barr
127. to en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Impreso en Estados Unidos Nro de pieza TMD039 9 12 Pagina 23 O 5 A Detecci n de fragmentos amplificados al utilizar el 3500 o el 3500xL Genetic Ke Analyzer de Applied Biosystems continuaci n Promega 6 Para crear una nueva convenci n sobre nombre de archivo Figura 7 navegue hacia la biblioteca Seleccione File Name Conventions Convenciones sobre nombre de archivo luego seleccione Create Crear Alternativamente se puede utilizar una convenci n sobre nombre de archivo previamente creada Seleccione los atributos de nombre de archivo de acuerdo con las pr cticas del laboratorio y guarde con un nombre descriptivo E 00 Data Collection Software o z Dashboard Edt e Library Maintenance Tools Manage Prefe Library Resources XK Manage Setup a File Name Convention Pates Name is a required field Provide a unique value Assays Results Group Name Locke WW m Select File Name Attributes instrument Protocols Preview of File Name lt Sample Name gt Dye Sets Available Attributes Selected Attributes Size Standards Amplicon Name Add Sample Name Bos g Protocols Analysis Protocol Name ae Assay Name each Stzecaling Protocols Capillary Number QC Protocols Custom Text L S Prot Custom Text Move Up Custom Text3 MeroSeqD Protocols Pista af Orie Move Down Fr RRE Ee Delimiters reaver set
128. u s de la amplificaci n utilice los protocolos de separaci n y detecci n validados del laboratorio para determinar el n mero ptimo de ciclos para el tipo de muestra y el n mero de perforaciones de tarjetas de almacenamiento 4 C Amplificaci n directa de ADN de los hisopos Materiales que deber suministrar el usuario termociclador GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems e microcentrifugadora e placa ptica de reacci n de 96 pocillos MicroAmp o tubos de reacci n de 0 2 ml MicroAmp Applied Biosystems e puntas para pipetas resistentes al aerosol consulte la secci n 9 e SwabSolution Kit Nro de cat DC8271 Esta secci n contiene un protocolo para la amplificaci n de ADN a partir de extractos de hisopos al emplear el PowerPlex Fusion System y el termociclador GeneAmp PCR System 9700 Trate preliminarmente el OmniSwab GE Healthcare o los hisopos de algod n con la SwabSolution Kit Nro de cat DC8271 seg n se describe en el Manual t cnico Nro TMD037 del SwabSolution Kit para generar un extracto de hisopo Promega Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 CH Promega 4 C Amplificaci n directa de ADN de los hisopos continuaci n Configuraci n de la amplificaci n i
129. uestra Finalizar antes el an lisis o utilizar tiempos breves de ejecuci n har que falten los picos de escalera mayores Esto causar una calidad de tama o que se indicar con el color rojo y no se definir ning n tama o de alelo Mensaje de error m todo de an lisis Both the Bin Set used in the Analysis Method and the Panel must belong to the same Chemistry Kit Tanto el conjunto de intervalos utilizado en el m todo de an lisis como el panel deben pertenecer al mismo kit de qu mica Se elimin el archivo de texto de intervalos asignado al En el GeneMapper Manager seleccione la pesta a Analysis Methods M todos de an lisis y abra el m todo de an lisis de inter s Seleccione la pesta a Allele Alelo y seleccione un archivo de texto de intervalos apropiado Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 66 Impreso en Estados Unidos 9 12 Sintomas Causas y comentarios Se eligi el archivo de texto de intervalos incorrecto en la pesta a Allele Alelo del m todo de an lisis Aseg rese de elegir el archivo de texto de intervalos apropiado como se muestra en la figura 19 Estado basal significativamente Calibraci n espectral insuficiente Realice una nueva elevado calibraci n espectral y vuelva a ejec
130. ugue brevemente la placa para eliminar las burbujas de aire de los pocillos 7 Desnaturalice las muestras a 95 C durante 3 minutos luego enfr e de inmediato sobre hielo picado o en un ba o de hielo durante 3 minutos Desnaturalice las muestras justo antes de cargar el instrumento Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos Nro de pieza TMD039 9 12 P gina 17 5 A Detecci n de fragmentos amplificados al utilizar el 3500 o el 3500xL Genetic Analyzer de Applied Biosystems continuaci n O Promega Preparaci n del instrumento Consulte la Gu a de usuarios del Applied Biosystems 3500 3500xL Genetic Analyzer para el cronograma de mantenimiento del instrumento y las instrucciones para instalar la serie capilar los buffers y la bolsa de pol mero y realizar la calibraci n espacial Las muestras se pueden analizar como se describe en la Gu a de usuarios del Applied Biosystems 3500 3500xL Genetic Analyzer 1 Abra el software de recolecci n de datos 3500 Data Collection Software Se iniciar la pantalla del tablero figura 2 Aseg rese de que la informaci n sobre los art culos de consumo y las notificaciones de mantenimiento sean aceptables Configure la temperatura del horno a 60 C luego seleccione Start Pre Heat Comenzar precalentamiento al meno
131. ultados para el ADN de control 2800M Compare los tama os de repetici n al lica del ADN de 2800M con la escalera al lica espec fica del locus Las designaciones al licas del ADN de 2800M esperadas para cada locus est n enumeradas en la tabla 6 secci n 9 A Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Nro de pieza TMD039 P gina 52 Impreso en Estados Unidos 9 12 6 L Resultados E o Los resultados representativos del PowerPlex Fusion System aparecen en la P figura 22 La mezcla para escalera al lica PowerPlex Fusion Allelic Ladder Mix mega se muestra en la figura 23 Artefactos y repeticiones Los productos de las repeticiones son un artefacto de amplificaci n com n asociado con el an lisis de las STR Los productos de las repeticiones a menudo presentan una unidad de repetici n por debajo del pico verdadero del alelo y ocasionalmente dos unidades de repetici n m s peque as o una unidad de repetici n m s grande que el pico verdadero del alelo Frecuentemente los alelos con un mayor n mero de unidades de repetici n exhibir n una repetici n de porcentaje m s elevado Un locus repetido tirinucle tido como el D2251045 tendr una repetici n m s pronunciada tanto en la posici n n 3 como en la n 3 de lo que tiene un locus repetido tetranucle tido t pico El patr n y l
132. utar las muestras Utilice el m todo de an lisis en el modo cl sico Utilizar el an lisis en el modo cl sico en las muestras puede dar como resultado estados basales con m s ruido que aquellos analizados con el m todo de an lisis en el modo b sico o avanzado Se recomiendan los m todos de an lisis y los est ndares de tama o del modo avanzado El espectral G5 incorrecto estuvo activo Vuelva a ejecutar las muestras y confirme que el espectral G5 de 5 tintes PowerPlex est configurado para G5 Consulte las instrucciones sobre la preparaci n del instrumento en la secci n 5 Mensaje de error despu s de intentar Hubo un conflicto entre los diferentes conjuntos de importar los archivos de texto paneles e intervalos para importar los archivos de texto de Unable to save panel data paneles e intervalos archivos de texto Verifique para java SOLEException asegurarse de que los archivos de intervalos se instalaron ORA 00001 restricci n nica correctamente Si no fue as elimine todos los archivos de IFA CKP_NNN violada texto de paneles e intervalos y vuelva a importar los archivos en orden diferente Picos de la escalera al lica No se utiliz el software GeneMapper ID o se utilizaron las configuraciones de an lisis de microsat lites en lugar de las configuraciones de an lisis HID El software GeneMapper no utiliza los mismos algoritmos que el software GeneMapper ID y no puede corregir las difere
133. utilizado para diagn stico m dico Puntas resistentes al aerosol ARTS Producto VolumenTama o puntas paquetes Nro de Cat ART 10 Ultramicro Pipet Tip 0 5 10 pl 960 DY1051 ARTS 20E Ultramicro Pipet Tip 0 5 10 pl 960 DY1061 ARTS 20P Pipet Tip 20 ul 960 DY1071 ART GEL Gel Loading Pipet Tip 100 ul 960 DY1081 ARTS 100 Pipet Tip 100 pl 960 DY1101 ART 100E Pipet Tip 100 pl 960 DY1111 ART 200 Pipet Tip 200 pl 960 DY1121 ART 1000E Pipet Tip 1000 ul 800 DY1131 Patente estadounidense N 6 242 235 patente australiana N 761757 patente canadiense N 2 335 153 patente china N ZL99808861 7 patente de Hong Kong N HK 1040262 patente japonesa N 3673175 patente europea N 1088060 y otras patentes m s que se encuentran pendientes Patente estadounidense N 5 843 660 6 479 235 6 221 598 y 7 008 771 patente australiana N 724531 patente canadiense N 2 118 048 y 2 251 793 patente coreana N 290332 patente de Singapur N 57050 patente japonesa N 3602142 and 4034293 patente china N ZL99813729 4 y ZL97194967 0 patente europea N 0960207 y otras patentes m s que se encuentran pendientes Patente estadounidense N 6 238 863 patente europea N 1058727 patente china N ZL99802696 4 patente japonesa N 4494630 y otras patentes m s que se encuentran pendientes Los locus de las STR est n sujetos a la patente estadounidense N RE 37 984 patente alemana N DE 38 34 636 C2 y
134. x no se agit bien antes de utilizarla Agite la mezcla 5X Master Mix durante 15 segundos antes de distribuirla en la mezcla de amplificaci n de la PCR Se form una burbuja de aire en el fondo del tubo de reacci n Utilice una pipeta para retirar la burbuja de aire o centrifugue brevemente las reacciones antes del ciclo t rmico Problemas del termociclador placa o tubo Revise el protocolo del termociclador en la secci n 4 No hemos evaluado otros tubos de reacci n placas ni termocicladores Calibre el calentador del termociclador si es necesario La concentraci n de la imprimaci n fue demasiado baja Utilice la concentraci n de la imprimaci n recomendada Agite la mezcla PowerPlex Fusion 5X Primer Pair Mix durante 15 segundos antes de utilizarla Inyecci n de electroforesis capilar insuficiente los picos CC5 ILS 500 tambi n se vieron afectados Reinyecte la muestra Verifique el sistema de bombeo de la jeringa para comprobar si hay fugas Verifique la potencia del l ser Las muestras no se desnaturalizaron por completo Desnaturalice las muestras por calor para el tiempo recomendado luego enfr e sobre hielo picado o en un ba o de hielo de inmediato antes de la electroforesis capilar No enfr e las muestras en un termociclador configurado a 4 C ya que puede conducir a artefactos debidos a la recocci n del ADN Se utiliz formamida de mala calidad Utilice s lo formamida Hi Di cuando analice muestras
135. y 500 Consulte la secci n 9 C figura 24 Seleccione OK Aceptar Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 WWW promega com Impreso en Estados Unidos 9 12 Nro de pieza TMD039 P gina 33 6 C C mo crear un est ndar de tama o con el software GeneMapperr ID X Versi n 1 2 continuaci n Size Standard Editor Edit rSize Standard Description Name Security Group Description Size Standard Dye CC5_ILS_500_IDX GeneMapper ecurity Group Orange Size Standard Table 2 65 0 3 80 0 4 100 0 5 120 0 6 140 0 7 160 0 a 180 0 9 200 0 10 225 0 11 250 0 12 275 0 ra 300 0 14 325 0 15 350 0 16 375 0 mm 400 0 18 425 0 19 450 0 20 475 0 Size in Basepairs UU a 500 0 8257TA Figura 12 El GeneMapper ID X Size Standard Editor Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 EE UU Numero gratuito en EE UU 800 356 9526 Tel fono 608 274 4330 Fax 608 277 2516 www promega com Nro de pieza TMD039 Pagina 34 Impreso en Estados Unidos 9 12 6 D Como crear un m todo de anilisis de casos con el software GeneMapper ID X Version 1 2 Estas instrucciones tienen el prop sito de servir como gu a para comenzar a analizar los datos en el software

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