MycAssay™ Aspergillus
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1. Analysis Open amp Report Template 4 Run Macro i had 2 5 Seleccione el archivo de plantilla Macro MAA SERUM v1 ixo y pulse Open 030 177 Versi n 1 1 05MAR12 Spanish 10 Para el uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Suero Roche LightCycler 2 0 2 6 Siga las instrucciones del asistente Seleccione la casilla Perform Self Test si se trata de la primera serie anal tica del d a zj Welcome to the Experiment Kit Wizard The Experiment Kit Wizard helps you run a new experiment using the provided kit The first step is to create the new experiment To start the wizard and create a new experiment click Next If you don t want to create a new experiment at this time click Cancel l Back Cancel Experiment Kit Wizard ES Select the instrument you want to run the experiment on If the instrument is not in the list click Search LC_16937 LC 1 305 on COM1 LC_16937 E Search 1 lt Back Next gt Cancel 2 7 Asigne un nombre al archivo de la serie anal tica y gu rdelo en la ubicaci n deseada 2 8 Vaya a la secci n Samples haciendo clic en la ficha situada a la izquierda de la pantalla Edite el n mero de la muestra en la casilla Samples Count y los nombres en la ficha Capillary view Asigne a las muestras el nombre indicado en el plan del experimento correspondiente a la posici n en el carrusel de muestras Sample data Analisis Type 7 Selected Channels 530 560 610 640 670 702. adido el reactivo de los Tubos 1 2 a la PCR o se ha a adido una cantidad dos veces mayor del Tubo 2 Repita la serie anal tica teniendo cuidado en la fase de preparaci n Estos errores pueden detectarse si se observan niveles m s altos o m s bajos de l quido en un tubo capilar de reacci n en comparaci n con los otros No se ha aplicado el archivo CC correcto a los datos Cree un archivo CC mediante el kit Myconostica MycAssay CC apl quelo a los resultados y vuelva a realizar el an lisis Para informaci n detallada sobre el kit consulte a su distribuidor local Spanish 14 Para el uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Suero Roche LightCycler 2 0 4 3 El control positivo es negativo gt Las condiciones de conservaci n del kit no cumpl an las instrucciones presentadas en el apartado Conservaci n de estas instrucciones de uso o el kit ha caducado Compruebe que se hayan seguido las condiciones de conservaci n correctas del kit Compruebe la fecha de caducidad de los reactivos en la etiqueta de la bolsa caja del kit y repita el proceso con un kit que no haya caducado en caso necesario Se produjo un error durante el paso 1 11 1 13 y la plantilla de control positivo Tubo 4 se coloc en el tubo de reacci n err neo Repita la serie anal tica teniendo extremo cuidado durante la fase de preparaci n Estos errores pueden detectarse si se observa un nivel m s alto de l quido en un tubo de rea
3. 2 0 1 19 Contin e en la Secci n 2 inmediatamente Las reacciones del ensayo MycAssay Aspergillus son estables en el banco durante un m ximo de 60 minutos 1 20 Despu s de la preparaci n de la PCR aseg rese de que se limpie meticulosamente el rea de trabajo usando reactivos descontaminantes de DNA Spanish 9 030 177 Versi n 1 0 24NOV10 MycAssay Aspergillus Para el uso diagn stico in vitro Roche LightCycler 2 0 Suero 2 Procesamiento de la serie anal tica 2 1 Inserte el CD ROM MycAssay Aspergillus Myconostica Protocol 2 2 Vaya a File seleccione Import y seleccione Object ixo files Importe el archivo Macro MAA SERUM v1 ixo del CD en su base de datos Eile Edit view Tools Window Help A New CtrN Run A Analysis 3 Open Ctrl O Glose Etrl S Logout Export COF Std Curve Files Batch import Object ixo files Batch export Report GER My Documents My Computer File name Macio MAA CC ixo Files of type Object ixo files xo 2 3 Vaya a File seleccione Save y guarde el macro en la ubicaci n deseada de su base de datos 25 Save Experiment Kit br gt 5 Root System Admin E Experiments E Preferences E Special Data L Analysis Templates C Experiment Macros C Report Templates Run Templates C Sample List Templates Name Macro MAA y 1 2 2 4 Seleccione la opci n Run Macro de la barra de herramientas z New a Run
4. CD ROM MycAssay Aspergillus Myconostica Protocol Protocolo del ensayo MycAssay Aspergillus de Myconostica Instrucciones de uso Certificado de an lisis Conservaci n El kit debe guardarse congelado a una temperatura de 15 C a 25 C hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta de la caja del kit momento en el cual debe desecharse de acuerdo con la normativa local Una vez abierta una bolsa debe usarse su contenido inmediatamente no se puede volver a congelar ni a reutilizar m s adelante 030 177 Versi n 1 1 05MAR12 Spanish 4 Para el uso diagn stico n vitro MycAssay Aspergillus Suero Roche LightCycler 2 0 Equipo y materiales necesarios pero no incluidos Sistema de PCR en tiempo real Roche LightCycler 2 0 incluyendo el manual de usuario ordenador asociado y software LightCycler v4 1 Centrifugadora de carrusel LightCycler 2 00 opcionalmente adaptadores para tubos capilares para minicentrifugadora Carrusel de muestras para tubos capilares de 20 uL Tubos capilares LightCycler 2 0 de 20 uL con tapones Gradilla de soporte para tubos capilares Liberador de tubos capilares Herramienta de taponamiento Microcentrifugadora Agitadora vorticial v rtex Micropipetas vol menes requeridos 7 5 20 uL Puntas con filtro de baja retenci n est riles Guantes desechables sin polvo Soluci n comercial descontaminante de DNA Kit de aislamiento de DNA v ase
5. Tenga cuidado de no dejar ninguna marca en el vidrio Siempre debe prepararse primero el control negativo seguido de las muestras de paciente El control positivo debe prepararse siempre en ltimo lugar 030 177 Versi n 1 1 05MAR12 Spanish 8 Para el uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Suero Roche LightCycler 2 0 1 11 En la siguiente tabla se muestran los vol menes de reactivo y de DNA Reacci n Reactivo Control negativo Muestras de Control positivo paciente Tubo 1 tap n naranja 7 5 uL 7 5 UL 7 5 uL Tubo 2 tap n verde 7 5 uL 7 5 uL 7 5 uL Tubo 3 tap n transparente 10 uL Muestras de paciente 10 uL Tubo 4 tap n negro E Volumen total 25 uL 1 12 A ada los reactivos en el orden mostrado en la tabla anterior Tubo 1 y luego el Tubo 2 seguidos de la plantilla control negativo muestra de paciente o control positivo Tenga cuidado al tomar muestras parciales del Tubo 1 ya que el l quido es viscoso y puede adherirse al borde interno del tubo Si sucediese esto vuelva a centrifugar para acumular el contenido final en la base del tubo antes de intentar extraer las muestras parciales finales 1 13 Use una nueva punta de pipeta para cada transferencia de l quido Vuelva a cerrar los tubos de reactivos despu s de usarlos y des chelos inmediatamente as como el contenido restante en un recipiente de cierre herm tico para residuos cl nicos Los reactivos no usados
6. de la polimerasa PCR polymerase chain reaction en tiempo real con baliza molecular El procedimiento completo del ensayo incluida la extracci n de DNA de la muestra cl nica puede realizarse en aproximadamente 21 2 horas mientras que el cultivo de hongos puede requerir varios d as para generar resultados positivos Este ensayo ofrece ventajas sobre los m todos de diagn stico actualmente disponibles para la aspergilosis pulmonar invasiva aguda y para la aspergilosis pulmonar cr nica Estas ventajas incluyen una detecci n m s r pida de Aspergillus spp y la posibilidad de un aumento en la sensibilidad para Aspergillus spp en pacientes con el sistema inmune altamente comprometido que se sospecha que tienen aspergilosis invasiva Principios del procedimiento Despu s de mezclar los reactivos del kit MycAssay Aspergillus con una muestra que contenga la secuencia diana de DNA de Aspergillus una secci n del gen ribos mico 18S de Aspergillus se producir la amplificaci n del DNA mediante un proceso de termociclado El ensayo tambi n contiene un control de amplificaci n interno IAC internal amplification contro que es un fragmento de DNA que no est presente en el genoma de Aspergillus ni en otros genomas f ngicos ni tampoco en genomas bacterianos ni humanos y cuya finalidad es detectar sustancias inhibidoras de la PCR y confirmar la funcionalidad de los reactivos del ensayo Las dianas de DNA amplificadas se detectan por me
7. e interpretaci n de los datos 3 1 Recuerde se debe aplicar un objeto de compensaci n de color antes de analizar los resultados de MycAssay Aspergillus en el LightCycler 2 0 Si todav a no ha creado un objeto de compensaci n h galo ahora antes de continuar con el an lisis y la interpretaci n de los datos Cuando haya finalizado la serie anal tica compruebe el contenido del informe visualizado e impr malo si lo desea 3 2 Los resultados de Aspergillus se pueden visualizar en la secci n ASP 530 y los resultados IAC en la secci n de an lisis IAC 560 3 3 En las dos secciones ASP 530 e IAC 560 seleccione el archivo correcto de compensaci n del color MycAssay CC file que se debe aplicar al experimento Channel 530 Color Compensation On _ Select Color Compensation Include Color Pos 030 177 Versi n 1 1 05MAR12 Spanish 12 Para el uso diagn stico in vitro Suero MycAssay Aspergillus Roche LightCycler 2 0 3 4 Analice cada muestra comenzando con los controles como se muestra en la gr fica de flujo a continuaci n tambi n encontrar detalles en la tabla que aparece bajo la gr fica de flujo Es el ASP Cp 38 0 o se ha registrado La serie anal tica est contaminada ACCION Repetir la serie anal tica Fallo de la serie anal tica ACCI N Repetir la serie anal tica Positivo para DNA de Aspergillus Negativo para DNA de Aspergillus Spanish 13 Comprobar el co
8. 3 2 Al aplicar el objeto CC algunos valores en el canal 560 IAC se reducen y aparecen valores Cp que se encuentran fuera del rango aceptable Amplification Curves Esto es totalmente normal para las reacciones que contienen concentraciones elevadas de DNA diana y no interferir en la interpretaci n de los resultados del paciente Siga el procedimiento de an lisis normal ver que para las muestras positivas para Aspergillus el resultado IAC no es necesario para decidir acerca del resultado para el paciente No se obtienen resultados para ning n canal con ninguna muestra ni control Las condiciones de conservaci n del kit no cumpl an las instrucciones presentadas en el apartado Conservaci n de estas instrucciones de uso o el kit ha caducado Compruebe que se hayan seguido las condiciones de conservaci n correctas del kit Compruebe la fecha de caducidad de los reactivos en la etiqueta de la bolsa caja del kit y repita el proceso con un kit que no haya caducado en caso necesario El equipo usado no tiene un funcionamiento ptimo Compruebe que el instrumento de PCR en tiempo real tiene el historial de mantenimiento actualizado y que ha sido totalmente calibrado seg n se describe en su Gu a de instalaci n y mantenimiento Se ha utilizado un protocolo incorrecto durante la preparaci n del software Consulte la Secci n 2 y elija el archivo del protocolo correcto seg n se especifica para cada tipo versi n del so
9. 5 Pint Sangles IN Sample Count 16 LC Carousel ID MPLC Batch ID Assay Cat No Assay Lot No Color Comp ID z Pi Repl Of Sample Note 1 Neeem r 2 Repl of Negative Control 1 J F Repl of Negative Control 1 Asp 10e3 copies Repl of Asp 10e3 copies 4 Repl of Asp 10e3 copies 4 Asp 10e4 copies Repl of Asp 1084 copies 7 3 Repl of Asp 10e4 copies 7 10 Asp 1085 copies ACKSON 41 Repl of Asp 1085 copies 10 12 Repl of Asp 10e5 copies 10 13 Asp 10e6 copies 14 Repl of Asp 10e6 copies 13 15 Repl of Asp 10e6 copies 13 16 Positive Control alo lalo lalo lalo 3 4 5 6 7 8 lalola lola iria alo lalo lal lal lal tajo la 2 9 Introduzca el carrusel de centrifugado de muestras en el instrumento LightCycler 2 Aseg rese de que la ranura debajo de la posici n 1 de la muestra en el carrusel encaje en la clavija de la c mara t rmica Aseg rese de que el carrusel est firmemente insertado en la c mara y cierre la tapa 2 10 Cuando haya terminado pulse el bot n Start Run Aseg rese de que el instrumento haya detectado todos los tubos capilares en el carrusel y que se haya iniciado el programa Spanish 11 030 177 Versi n 1 0 24NOV10 MycAssay Aspergillus Para el uso diagn stico in vitro Roche LightCycler 2 0 Suero Experiment Kit Wizard xl The experiment is ready to run Before starting edit the sample information and run protocol as necessary Cancel lt Back 3 An lisis
10. Para el uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Roche LightCycler 2 0 my con osjfi ca Suero MycAssay Aspergillus Roche LightCycler 2 0 Suero REF 080 045 Uso previsto MycAssay Aspergillus est indicado para su uso por profesionales de laboratorio cualificados para la detecci n cualitativa del DNA gen mico de Aspergillus spp extra do del suero como ayuda para el diagn stico de la aspergilosis invasiva MycAssay Aspergillus Suero ha sido validada para usarse con el Roche LightCycler 2 0 Resumen y explicaci n El g nero Aspergillus est constituido por mohos oportunistas ubicuos que causan s ndromes tanto al rgicos como invasivos Este g nero comprende aproximadamente 300 especies de las cuales 41 se han asociado a enfermedades humanas La mayor a de las patolog as son causadas por A fumigatus A flavus A terreus y A niger menos frecuentemente por A nidulans y otras especies poco comunes como A sydowii A versicolor A lentulus y A pseudofischeri tambi n se han implicado La mayor a de las patolog as causadas por Aspergillus spp afectan al tracto respiratorio La aspergilosis invasiva Al se desarrolla en grupos de pacientes de riesgo entre los que se incluyen aqu llos pacientes que est n recibiendo tratamiento contra la leucemia y el linfoma los que han recibido un trasplante de c lulas progenitoras hematopoy ticas TCPH o de rganos s lidos as como aqu llos pacientes trata
11. a Cepheid SmartCycler Selectividad anal tica La selectividad anal tica se analiz usando DNA extra do de diversas especies f ngicas y no f ngicas Las especies siguientes fueron analizadas durante la validaci n inicial para muestras respiratorias y no produjeron un resultado positivo Alternaria alternata Blastomyces capitatus Candida albicans C glabrata C parapsilosis C tropicalis especies de Cladosporium Cryptococcus neoformans Doratomyces microsporus Fusarium solani Histoplasma capsulatum Pneumocystis jirovecii Rhizomucor pusillus Rhodotonila rubra Saccharomyces cerevisiae Scedosporium apiospermum S prolificans Sporothrix schenkii Trichosporon capitatum Las siguientes especies bacterianas no presentaron un resultado positivo Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Haemophilus influenzae Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae S pyogenes S salivarius Se analizaron espec ficamente las especies siguientes para detectar su posible presencia en el suero sin obtener un resultado positivo Acinetobacter baumannii Aeromonas hydrophilia Burkholderia cepacia Citrobacter koseri Enterobacter cloacae Enterococcus faecium Klebsiella pneumoniae Morganella morganii Proteus mirabilis Salmonela enterica Serratia marcescens Stenotrophmonas
12. a contaminaci n podr a provenir de aire contaminado con Aspergillus de una t cnica experimental deficiente con respecto al control positivo o de contaminaci n externa especialmente de la pipeta con DNA de Aspergillus Dado que se puede obtener un resultado positivo verdadero en pacientes con una colonizaci n transitoria o persistente por el g nero Aspergillus se requiere aplicar el criterio cl nico para interpretar los resultados de la prueba en el contexto de la enfermedad Spanish 19 030 177 Versi n 1 0 24NOV10 MycAssay Aspergillus Para el uso diagn stico in vitro Roche LightCycler 2 0 Suero AUTORIZACI N DE COMERCIALIZACI N TopTaq Hot Start es suministrado por QIAGEN QIAGEN es una marca registrada de Qiagen GmbH Hilden Alemania Este producto se vende bajo autorizaci n del Public Health Research Institute Newark New Jersey Estados Unidos y puede usarse bajo los derechos de la patente del PHRI exclusivamente para diagn stico in vitro en seres humanos SmartCycler es una marca registrada de Cepheid 904 Caribbean Drive Sunnyvale CA 94089 Estados Unidos High Pure es una marca registrada de Roche Diagnostics GmbH 68298 Mannheim Alemania Parte de este producto est cubierta por una licencia exclusiva a una solicitud de patente propiedad del Fred Hutchinson Cancer Centre Seattle Estados Unidos LightCycler es una marca registrada de Roche Diagnostics GmbH Lab21 184 Cambridge Science Pa
13. ados n 1 n 2 o n 3 4 2 030 177 Versi n 1 1 05MAR12 Resoluci n de problemas El control negativo ha generado una se al positiva en el canal ASP 530 gt Se produjo contaminaci n durante la preparaci n No pueden considerarse precisos los resultados de toda la serie anal tica Repita toda la serie anal tica teniendo gran cuidado al a adir las plantillas en particular el control positivo Tubo 4 para asegurarse de que no se produzca una contaminaci n cruzada Aseg rese de que el rea de trabajo y los instrumentos sean debidamente descontaminados antes y despu s de su uso Se ha colocado incorrectamente el control negativo en el instrumento Anote correctamente los tubos capilares en el software El valor de Cp del IAC del control negativo se encuentra fuera del intervalo aceptable gt Se ha inhibido la PCR Aseg rese de que el rea de trabajo y los instrumentos est n completamente secos despu s de usar agentes descontaminantes antes de proceder a la preparaci n para la PCR Las condiciones de conservaci n del kit no cumpl an las instrucciones presentadas en el apartado Conservaci n de estas instrucciones de uso o el kit ha caducado Compruebe que se hayan seguido las condiciones de conservaci n correctas del kit Compruebe la fecha de caducidad de los reactivos en la etiqueta de la bolsa caja del kit y repita el proceso con un kit que no haya caducado en caso necesario No se ha a
14. amente secos despu s de usar agentes descontaminantes antes de proceder a la preparaci n para la PCR Analice de nuevo la muestra de paciente Si el problema reaparece el inhibidor de la PCR est presente en la muestra Identifique la muestra como Indeterminada Resultado 3 4 6 Los resultados en la secci n IAC 560 coinciden casi exactamente con los resultados en la secci n ASP 530 No se ha aplicado ning n archivo de compensaci n de color o se ha aplicado un archivo de compensaci n de color incorrecto a los resultados del experimento gt Compruebe en las dos secciones de an lisis si la compensaci n de color est activada y si se ha aplicado el mismo archivo MycAssay CC en los dos canales Spanish 15 030 177 Versi n 1 0 24NOV10 MycAssay Aspergillus Para el uso diagn stico in vitro Roche LightCycler 2 0 Suero 4 7 La l nea base para determinadas muestras coincide con el control negativo indicando que no se ha producido ninguna amplificaci n No obstante el software ha presentado un valor Cp positivo como muestra la figura inferior 4 8 4 9 La emisi n de un valor Cp positivo para una gr fica de amplificaci n negativa s lo se ha producido dos veces en 154 reacciones negativas realizadas durante los estudios de validaci n gt Si esto ocurre repita el an lisis de la s muestra s para confirmar el resultado Negativo Amplification Curves 11 37 1 2 no Cp reported 213 3
15. cci n y un nivel m s bajo en otro en comparaci n con el nivel normal No se ha a adido el reactivo de los Tubos 1 2 a la reacci n Repita la serie anal tica teniendo cuidado en la fase de preparaci n Estos errores pueden detectarse si se observan niveles m s bajos de l quido en este tubo capilar de reacci n que en los otros Se ha colocado incorrectamente el control positivo en el instrumento Anote correctamente los tubos capilares en el software 4 4 La s muestra s de paciente son negativas y el IAC est fuera de rango Resultado n 3 gt gt Es probable que la s muestra s de paciente contengan inhibidores de la PCR Para lograr una extracci n ptima del DNA de las muestras recomendamos utilizar el kit High Pure seg n el m todo modificado que se indica en Procedimientos de uso y no seg n las instrucciones del fabricante Determinados tubos de recogida para el suero pueden contener inhibidores de PCR que todav a no se han estudiado 4 5 La muestra de paciente es negativa en la secci n ASP 530 y la gr fica IAC 560 se aleja de forma significativa de la l nea base normal como se muestra en la imagen de ejemplo inferior las flechas indican gr ficas an malas Amplification Curves 123456 78 910111213144516 17181920 21 222324 252627 28293031 323334 35363738 3940 Cycles Se ha inhibido la reacci n de PCR Aseg rese de que el rea de trabajo y los instrumentos est n complet
16. culares tienen un grado de conservaci n alto entre Aspergillus y Penicillium Por consiguiente debe se alarse que un resultado positivo con este ensayo puede deberse a una infecci n por Penicillium en lugar de a una infecci n por Aspergillus Generaci n de informes cl nicos El kit MycAssay Aspergillus se ha dise ado para ser utilizado como ayuda para el diagn stico Los resultados deben considerarse en el contexto del estado cl nico del paciente y de los resultados de otras pruebas diagn sticas Los siguientes son informes recomendados que dependen de la interpretaci n del resultado del ensayo Resultado n 1 Especies de Aspergillus no detectadas Resultado n 2 Especies de Aspergillus detectadas resultado positivo Este ensayo tambi n detecta especies de Penicillium Resultado n 3 La prueba fracas inhibidores u otra sustancia desconocida presentes Limitaciones del procedimiento La principal limitaci n de este procedimiento es la calidad de la muestra primaria Si las concentraciones s ricas de DNA de Aspergillus son bajas la eficacia de extracci n puede afectar al resultado y la prueba puede proporcionar un resultado falso negativo Los datos preliminares indican que la congelaci n y el almacenamiento de las muestras de suero puede afectar a la cantidad de DNA viable para el ensayo No se dispone de datos sobre la estabilidad del DNA de Aspergillus en suero Por ello se recomienda
17. dio de la tecnolog a de balizas moleculares Las balizas moleculares son sondas de hibridaci n compuestas de un oligonucle tido de cadena sencilla que forma una estructura de horquilla La porci n curva de la horquilla contiene una secuencia sonda que es complementaria de una secuencia diana y la porci n recta de la horquilla est formada por hibridaci n de secuencias de brazo complementarias que se encuentran a cada lado de la secuencia sonda Un extremo del brazo est unido de forma covalente a un fluor foro que emite fluorescencia cuando es excitado por una luz de la longitud de onda apropiada mientras que el otro extremo del brazo est unido de forma covalente a un extintor de fluorescencia que suprime la fluorescencia del fluor foro cuando se encuentra en estrecha proximidad f sica Las balizas moleculares no emiten fluorescencia cuando est n libres en soluci n Sin embargo cuando se hibridan con una cadena de cido nucleico que contiene una secuencia diana experimentan un cambio conformacional que las separa f sicamente del fluor foro y del extintor de fluorescencia lo cual les permite emitir fluorescencia al ser excitadas La cantidad de fluorescencia en cualquier ciclo dado o despu s del ciclo depende de la cantidad de amplicones espec ficos que est n presentes en ese momento El sistema de PCR en tiempo real mide simult neamente la fluorescencia emitida por las balizas Precauciones El kit est dise ado para ser usad
18. dor 15 a 25 C Las concentraciones bajas de DNA pueden ser inestables si no se conservan correctamente Se recomienda almacenar las extracciones de DNA de muestras cl nicas a una temperatura de 80 C para preservar su integridad Siempre que sea posible debe evitarse tambi n realizar varias secuencias de descongelaci n y congelaci n Spanish 3 030 177 Versi n 1 0 24NOV10 MycAssay Aspergillus Para el uso diagn stico in vitro Roche LightCycler 2 0 Suero Contenido del kit Descripci n El kit consta de cinco bolsas selladas de aluminio con 3 compartimentos cada una que se pueden sacar de la caja y usar por separado Cada bolsa contiene reactivos suficientes para 8 reacciones Volumen Tubo 1 dNTPs 66 uL tap n naranja MgCl Soluci n amortiguadora del complejo de la DNA polimerasa Tubo 2 lt 0 01 de cebadores 66 uL tap n verde lt 0 01 de balizas moleculares lt 0 0001 de control de amplificaci n interno IAC El control de amplificaci n interno es un pl smido de DNA recombinante que contiene una secuencia no infecciosa no relacionada con la secuencia diana Aspergillus Amortiguador Tris HCI Tubo 3 Control negativo 25 uL tap n Agua transparente Tubo 4 Control positivo 25 uL tap n negro lt 0 0001 de DNA de control positivo La mol cula de control positivo es un pl smido recombinante que contiene la secuencia diana de Aspergillus Amortiguador Tris HCI El kit tambi n contiene
19. dos con corticosteroides y los que presentan neutropenia o disfunci n fagoc tica por ejemplo la enfermedad granulomatosa cr nica y la infecci n por el VIH Los ndices de infecci n f ngica invasiva IFI son casi siete veces mayores en los pacientes que han recibido un trasplante TCPH alog nico que en los pacientes que han recibido un trasplante aut logo y la aspergilosis invasiva Al es responsable de aproximadamente la mitad de las infecciones La mayor a de las veces la aspergilosis se limita a la fase neutrop nica post trasplante temprana en pacientes TCPH aut logos Los pacientes TCPH alog nicos presentan un riesgo mayor durante per odos m s largos no s lo hasta sino m s all de los 100 d as debido a la mayor frecuencia de aparici n de la EICH y a la recuperaci n lenta de las c lulas T En los pacientes sometidos a quimioterapia para el tratamiento de la leucemia aguda o a tratamientos de ltimo recurso para la leucemia o el linfoma recidivante la Al es una de las causas principales de mortalidad La Organizaci n Europea para la Investigaci n y el Tratamiento del C ncer EORTC y el Grupo de Estudio de las Micosis MSG han revisado y publicado definiciones de consenso sobre las infecciones f ngicas invasivas incluyendo criterios definidos para el diagn stico de la Al probada probable y posible en pacientes con malignidad hematol gica o tras un TCPH Actualmente los criterios para una Al probable incluy
20. en un factor del hu sped m s un criterio cl nico y una prueba microbiol gica El diagn stico de una Al probable no requiere un criterio microbiol gico Las pruebas microbiol gicas aceptadas en los criterios de una Al probable incluyen una prueba ELISA basada en suero que detecta la presencia del galactomanano GM Se recomienda realizar dos pruebas de galactomanano GM positivas consecutivas para mejorar la precisi n diagn stica En un metaan lisis realizado por Mengoli et al se examinaron gt 10 000 muestras de sangre suero y plasma procedentes de 1 618 pacientes con riesgo de padecer Al Se calcul que la sensibilidad y especificidad de una nica muestra de sangre positiva a la PCR era respectivamente de 88 IC del 95 75 94 y de 75 IC del 95 63 84 y que el cociente de posibilidades diagn stico diagnostic odds ratio para casos probados y probables era de 16 41 IC del 95 6 43 41 88 1 Base de datos de especies en www aspergillus org uk E Kontoyiannis DP et al Clin Infect Dis 2010 50 8 1091 1100 3 Ascioglu S et al Clin Infect Dis 2002 34 7 14 Mengoli C et al The Lancet ID 2009 9 86 96 Spanish 1 030 177 Versi n 1 1 05MAR12 MycAssay Aspergillus Para el uso diagn stico in vitro Roche LightCycler 2 0 Suero MycAssay Aspergillus es un kit de diagn stico molecular para la detecci n del DNA gen mico del g nero Aspergillus mediante la tecnolog a de la reacci n en cadena
21. ente Introduzca el nombre de usuario y la contrase a requeridos y seleccione la base de datos diagn stica Si se trata de la primera serie anal tica del d a realice primero una autocomprobaci n del instrumento antes de iniciar una serie anal tica Recuerde se debe realizar una serie anal tica de compensaci n de color antes de analizar los resultados de MycAssay Aspergillus en el LightCycler 2 0 No obstante no es necesario realizar la serie anal tica antes de utilizar este producto y podr realizarla y aplicarla a este archivo de series anal ticas m s tarde Aseg rese de que se haya limpiado el rea de trabajo con reactivos descontaminantes de DNA y de que se haya dejado secar completamente evite usar estos productos durante la preparaci n del ensayo ya que un exceso de soluci n limpiadora puede inhibir la PCR Una bolsa contiene un tubo de cada tipo Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 y Tubo 4 Hay suficientes reactivos en una bolsa para realizar 8 reacciones Deben realizarse al menos una reacci n de control positivo y una reacci n de control negativo en cada serie anal tica en la que los reactivos sean del mismo lote del kit Por lo tanto con una bolsa se pueden analizar 6 muestras de paciente Si es necesario analizar m s de 6 muestras se puede usar m s de una bolsa si las bolsas usadas proceden del mismo kit No obstante en una serie anal tica el LightCycler 2 0 s lo puede contener un m ximo de 32 muestras Por consiguiente se p
22. ftware del CD ROM Myconostica Protocol S lo puede cargarse el archivo apropiado para el software Repita la serie anal tica usando el archivo del protocolo correcto Si tiene m s preguntas o experimenta cualquier problema p ngase en contacto con el servicio de atenci n al cliente productsupportOlab21 com 030 177 Versi n 1 1 05MAR12 Spanish 16 Para el uso diagn stico n vitro MycAssay Aspergillus Suero Roche LightCycler 2 0 Caracter sticas de rendimiento y limitaciones El kit se valid inicialmente para usarse con suero junto con el sistema Cepheid SmartCycler La sensibilidad anal tica l mite de blanco se estableci con la plataforma LightCycler 2 0 utilizando tubos capilares de vidrio de 20 uL Roche n de cat logo 04929292001 11909339001 y se describe a continuaci n En los casos en los que no se esperaba que las diferencias entre las plataformas afectaran al rendimiento del ensayo y por consiguiente a la afirmaci n relativa al rendimiento los dem s estudios no se repitieron Estos resultados obtenidos utilizando la plataforma SmartCycler se consideran transferibles a la plataforma LightCycler 2 0 Sensibilidad anal tica Mediante el protocolo LighiCyclerO 2 0 arriba descrito y las plantillas PCR generadas en Myconostica se determin un valor Cp de 38 0 para el LoB de MycAssay Aspergillus Se establecieron las siguientes afirmaciones sobre el rendimiento para suero utilizando el sistem
23. ir 400 uL de tamp n de uni n y 80 uL de proteinasa K mezclar inmediatamente e incubar durante 10 minutos a 70 C 0 5 mL de suero A adir 200 uL de isopropanol mezclar bien y aplicar al tubo de filtro High Pure adici n repetida centrifugar durante 1 min a 8 000xg A adir 500 uL de tamp n para Desechar el l quido que atraviese eliminar el inhibidor el filtro y el tubo de recogida Centrifugar durante 1 minuto a 8 000xg A adir 500 uL de tamp n de lavado Desechar el l quido que atraviese l el filtro y el tubo de recogida Centrifugar durante 1 minuto a 8 000xg A adir 500 uL de tamp n de mpe lavado Desechar el l quido que atraviese l el filtro y el tubo de recogida Centrifugar durante 1 minuto a 8 000xg Desechar el l quido que atraviese el filtro y conservar el tubo de recogida Centrifugar durante 1 minuto a 10 000xg Va A adir nuevo tubo est ril de 1 5 mL y 65 uL de tamp n de Desechar el tubo de recogida l eluci n 70 C Centrifugar durante 1 minuto a 8 000xg DNA purificado Spanish 7 030 177 Versi n 1 0 24NOV10 MycAssay Aspergillus Para el uso diagn stico in vitro Roche LightCycler 2 0 Suero 1 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 Preparaci n del sistema de PCR en tiempo real Para comenzar encienda el sistema de PCR en tiempo real LightCycler 2 0 el instrumento el ordenador asociado y la centrifugadora e inicie el software correspondi
24. m s adelante KitMycAssay CC v ase m s adelante Muestra La muestra para el ensayo MycAssay Aspergillus es DNA gen mico total extra do de muestras de suero Se recomienda con este fin el siguiente equipo y kit de extracci n de DNA utilizados durante la validaci n Kit High Pure PCR Template Preparation Roche Diagnostics n de cat logo 11 796 828 001 Soluci n de proteinasa K Sigma Aldrich Chemicals n de cat logo P4850 5ML 2 Propanol Sigma Aldrich Chemicals n de cat logo 19516 25ML Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc Nueva York EE UU Kit MycAssay Colour Compensation CC El an lisis preciso de los datos producidos con el ensayo MycAssay Aspergillus requiere la aplicaci n de un archivo de compensaci n del color generado mediante el kit Myconostica MycAssay CC Cuando se haya creado el archivo se puede aplicar a m ltiples series anal ticas en el mismo aparato Para m s detalles p ngase en contacto con su distribuidor local Notas del procedimiento Lea el protocolo completo antes de comenzar El proceso completo del ensayo MycAssay Aspergillus incluida la extracci n de DNA dura aproximadamente 21 2 horas seg n el n mero de muestras analizadas La preparaci n de la prueba debe realizarse en una zona de trabajo espec fica para PCR o en un laboratorio de procedimientos previos a la PCR Si no se dispone de una zona de trabajo espec fica para PCR la p
25. maltophila El DNA gen mico humano no presenta un resultado positivo con este ensayo L mite de Detecci n El l mite de detecci n fue lt 25 copias de DNA diana utilizando la cepa AF293 de A fumigatus Sustancias que producen interferencia contraindicaciones de uso Los siguientes compuestos fueron analizados a concentraciones cl nicamente relevantes y se comprob que no inhiben el ensayo acetilciste na anfotericina dipropionato de beclometasona budesonida colistimetato s dico propionato de fluticasona fumarato de formoterol dihidrato bromuro de ipratropio lidoca na manitol sulfato de salbutamol salmeterol cloruro s dico cromoglicato s dico terbutalina y tobramicina Se realiz un an lisis para detectar la posible presencia de las siguientes sustancias en el suero Se analizaron concentraciones cl nicamente relevantes y se descubri que no inhib an la reacci n de PCR Amoxicilina con cido clavul nico atovaquona azathioprine aztreonam ceftazidima ciprofloxacina maleato de clorfenamina fosfato de clindamicina cotrimoxazol creatinina dapsone fosfato s dico de dexametasona fluconazol meropenem metoclopramida hidrocloruro paracetamol fosfato de primaquina fosfato s dico de prednisolona prednisona proclorperazina vamcomicina y voriconazol Se determin que las sustancias siguientes inhiben las reacciones de PCR cefuroxima heparina metilprednisolona succinato s dico transaminasa y urea C
26. no pueden guardarse para un uso posterior 1 14 Tome precauciones especiales al pipetear el Tubo 4 DNA de control positivo para asegurarse de que no contamine ninguna otra reacci n Cierre los tapones de los otros tubos capilares antes de abrir el Tubo 4 para reducir el riesgo de contaminaci n cruzada 1 15 Utilice la herramienta de taponamiento para cerrar cuidadosamente los tubos capilares con los tapones suministrados en la caja de tubos capilares Aseg rese de que los tubos capilares est n firmemente cerrados Si se desea los tubos capilares se pueden cerrar cuando se haya a adido la plantilla a la reacci n para reducir la posibilidad de una contaminaci n cruzada ambiental 1 16 Sino dispone de una centrifugadora de carrusel LightCycler 2 0 centrifugue las muestras con los adaptadores para tubos capilares suministrados en una gradilla de soporte para tubos capilares mediante una minicentrifugadora En caso contrario contin e con el paso 1 17 1 17 Transfiera con sumo cuidado todos los tubos capilares al carrusel de muestras en exactamente el mismo orden que se encuentran en la gradilla de soporte para tubos capilares comenzando por el primer tubo capilar en la posici n 1 y contin e en orden ascendente sin dejar huecos Presione cada tubo capilar hacia abajo hasta que est firmemente insertado 1 18 Si todav a no ha centrifugado las muestras en la secci n 1 16 centrif guelas mediante la centrifugadora de carrusel LightCycler
27. ntrol negativo como Sin Cp Fallo de la serie anal tica ACCI N Repetir la serie anal tica Comprobar el control negativo Est el IAC Cp entre 30 3 y 33 9 Comprobar el control positivo Est el ASP Cp entre 15 0 y 20 0 Comprobar la muestra de an lisis Es el ASP Cp lt 38 0 Comprobar la muestra de an lisis Est el IAC Cp entre 30 3 y 33 9 Fallo del IAC ACCI N Repetir la muestra Si se produce el mismo resultado presencia de inhibidor sospechoso en la muestra 030 177 Versi n 1 0 24NOV10 MycAssay Aspergillus Roche LightCycler 2 0 Para el uso diagn stico in vitro Suero Muestra Pat geno 530 Cp IAC 560 Cp Interpretaci n Acci n que debe realizarse Control negativo Los resultados del Control negativo 38 0 o Sin Cp Entre 30 3 33 9 aceptable paciente son v lidos Fallo en el control Repetir toda la serie Control negativo 38 0 o Sin Cp lt 30 3 o gt 33 9 negativo Analitica Control negativo lt 38 0 Entre 30 3 33 9 Contaminaci n eta sone Control positivo Entre 15 0 20 0 ND Control positivo Los resultados del aceptable paciente son v lidos Control positivo lt 15 0 o gt 20 0 ND We e aie seng Muestra de paciente 238 0 o Sin Cp Entre 30 3 33 9 Erei S Peo a Muestra de paciente lt 38 0 ND Aae A ei Muestra de paciente lt 38 0 o Sin Cp lt 30 3 o gt 33 9 o la e Consulte Generaci n de informes cl nicos Result
28. o exclusivamente por profesionales de laboratorio Es preciso poner en pr ctica procedimientos para la manipulaci n de muestras que no generen aerosoles Deben seguirse las precauciones habituales y las directrices del centro para la manipulaci n de todas las muestras Myconostica Ltd tiene a su disposici n una Hoja de datos sobre la seguridad de los materiales Este ensayo es solamente para diagn stico in vitro En estudios de validaci n anal ticos se mostr que los niveles de transaminasa de 22 2 U por 0 5 mL de suero ten an un posible efecto de degradaci n sobre el DNA de Aspergillus Este ensayo se ha validado con suero recogido en tubos para la recogida de suero Greiner Red Top Otros tubos para la recogida de suero o de sangre pueden contener sustancias inhibidoras o competidoras que todav a no se han estudiado Este ensayo se ha validado para las muestras de suero No se dispone de datos de validaci n para plasma o sangre completa Este ensayo se debe utilizar exclusivamente con el Roche LightCycler 2 0 y el software LightCycler v4 1 No use los reactivos ni los controles si las bolsas protectoras llegan abiertas o rotas Los reactivos y los controles no son intercambiables entre kits con n meros de lote diferentes Nunca mezcle reactivos ni controles de tubos diferentes aunque sean del mismo lote Nunca use los reactivos ni los controles despu s de su fecha de caducidad Los reactivos y los controle
29. ondientes de identificaci n de las muestras en el plan del experimento El an lisis preciso de los datos requiere la aplicaci n de un archivo de compensaci n del color generado mediante el kit Myconostica MycAssay CC Procedimiento de uso El procedimiento est dividido en dos fases extracci n del DNA del suero y despu s PCR en tiempo real La extracci n del DNA se realiza mediante el kit High Pure PCR Template Preparation kit High Pure El kit High Pure est dise ado para purificar los cidos nucleicos de diversos tipos de muestras El protocolo de extracci n detallado en estas instrucciones de uso ha sido optimizado para aislar el DNA de Aspergillus spp del suero y es adecuado para el uso con el kit MycAssay Aspergillus Suero NOTA IMPORTANTE Se han modificado las instrucciones del fabricante para mejorar el rendimiento del DNA recuperado de una muestra de suero y la sensibilidad de la prueba Determinados reactivos especificados en los pasos 1 y 2 de la Secci n 2 3 de las instrucciones de uso del kit High Pure se agotar n antes que otros y se deber n sustituir Durante el proceso de validaci n se utiliz la proteinasa K de Sigma Aldrich 030 177 Versi n 1 1 05MAR12 Spanish 6 Para el uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Suero Roche LightCycler 2 0 Protocolo de extracci n las reas sombreadas identifican los pasos que se han modificado con respecto a las instrucciones del fabricante A ad
30. que las muestras se procesen lo m s r pidamente posible tras la recogida No se dispone de datos sobre el rendimiento del suero recogido en tubos para la recogida de sangre diferentes a los tubos de recogida de suero Greiner Red Top recomendados No se dispone de datos sobre las caracter sticas de rendimiento del ensayo iniciado con DNA de Aspergillus extra do del plasma o de sangre completa Pueden producirse resultados positivos falsos si el agente infeccioso pertenece al g nero Penicillium que no puede distinguirse del g nero Aspergillus con este kit Aunque el m todo con el kit High Pure PCR Template Preparation puede eliminar los inhibidores de la PCR no se han evaluado todos los f rmacos ni poblaciones de pacientes 030 177 Versi n 1 1 05MAR12 Spanish 18 Para el uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Suero Roche LightCycler 2 0 Durante los estudios de validaci n anal tica se detect que la transaminasa en concentraciones de 22 2 U 0 5 mL de suero podr a haber causado la degradaci n del DNA de Aspergillus antes de la extracci n Durante la validaci n se obtuvieron y se utilizaron lotes de proteinasa K que despu s resultaron estar contaminados en la fuente con Aspergillus Seleccione cuidadosamente las fuentes de los materiales y utilice fuentes recomendadas siempre que sea posible Pueden obtenerse resultados positivos falsos por contaminaci n externa de la muestra original o de la prueba Est
31. rk Cambridge CB4 OGA United Kingdom Telephone 44 0 1638 552 882 Facsimile 44 0 1638 552 375 Email productsupportOlab21 com 030 177 Versi n 1 1 05MAR12 Spanish 20
32. rueba debe realizarse en un rea del laboratorio dedicada separada de las reas utilizadas para la extracci n de DNA y que se limpie peri dicamente con agentes descontaminantes de DNA No obstante evite el uso de reactivos descontaminantes de DNA cuando est realizando la preparaci n del sistema de PCR en tiempo real ya que pueden inhibir el ensayo Utilice micropipetas para transferir l quidos Deben utilizarse micropipetas de uso exclusivo para la preparaci n de estas reacciones estas micropipetas deben descontaminarse con regularidad Se recomienda utilizar puntas con filtro de baja retenci n para asegurarse de que no se pierda DNA durante el procedimiento de preparaci n Deben tomarse precauciones al manipular el Tubo 4 Este tubo contiene material de DNA de control positivo y la contaminaci n podr a dar lugar a resultados positivos falsos en la prueba Use guantes en todo momento Todos los tubos de reactivos deben cerrarse despu s de usarlos y antes de desecharlos 7 Por ejemplo v ase Mifflin T E 2003 Setting up a PCR Laboratory In PCR Primer 2nd Ed eds Dieftenbach and Dveksler Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour NY USA Spanish 5 030 177 Versi n 1 0 24NOV10 MycAssay Aspergillus Para el uso diagn stico in vitro Roche LightCycler 2 0 Suero Anote con exactitud las posiciones de los tubos capilares en el carrusel de 32 posiciones con los n meros corresp
33. s no deben volver a congelarse ni a utilizarse una vez abiertos Use ropa protectora y guantes desechables cuando manipule los reactivos del kit Aseg rese de que todos los reactivos no incluidos no est n contaminados por hongos Para evitar la contaminaci n con amplicones del IAC o Aspergillus no abra los tubos de reacci n despu s de la amplificaci n 5 Tyagi S Kramer FR 1996 Molecular beacons Probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14 303 308 030 177 Versi n 1 1 05MAR12 Spanish 2 Para el uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Suero Roche LightCycler 2 0 Evite la contaminaci n microbiana y con desoxirribonucleasa DNAasa de los reactivos cuando tome muestras parciales de los tubos Se recomienda usar puntas de pipeta de desplazamiento positivo o con filtro desechables de baja retenci n libres de DNAasa y est riles Use una nueva punta para cada muestra o reactivo Deseche los reactivos no usados y el material de desecho de acuerdo con las normativas nacionales federales estatales y locales Pueden analizarse controles adicionales de acuerdo con las directrices o las normativas locales estatales provinciales y federales o de las organizaciones responsables de la acreditaci n No coma beba ni fume en reas donde se manipulen las muestras o los reactivos del kit Puede almacenar el suero durante un m ximo de 48 horas en una nevera 2 a 8 C o en un congela
34. uando se a adieron estas sustancias inhibidoras en concentraciones Spanish 17 030 177 Versi n 1 0 24NOV10 MycAssay Aspergillus Para el uso diagn stico in vitro Roche LightCycler 2 0 Suero cl nicamente relevantes al suero que conten a DNA de Aspergillus y se realiz la extracci n con el kit modificado High Pure no se observ ninguna inhibici n No obstante la transaminasa pareci degradar el DNA de Aspergillus antes de la extracci n ya que el 25 de los duplicados fueron negativos para Aspergillus Especificidad anal tica La especificidad anal tica se determin inicialmente durante los estudios de validaci n para la utilizaci n con muestras respiratorias y no se ha repetido La especificidad anal tica se estudi usando DNA extra do de 15 especies diferentes de Aspergillus entre las que se inclu an varias cepas de cada una de las siguientes especies A fumigatus A niger A terreus y A nidulans Las se ales detectadas por encima del LoB se registraron como un resultado positivo Las 15 especies de Aspergillus tuvieron un resultado positivo con el ensayo Adem s de las especies anteriormente mencionadas se incluyen A flavus A versicolor A glaucus A sclerotiorum A niveus A lentulus A unguis A candidus A wentii A tubingensis y A foetidus El DNA gen mico extra do de especies de Penicillium tambi n gener resultados positivos Esto se debe al hecho de que las secuencias de las dianas mole
35. ueden procesar un m ximo de 30 muestras de paciente en una serie anal tica 4 bolsas Calcule el n mero de reacciones necesarias para ello consulte la tabla siguiente N mero de bolsas N mero m ximo de muestras de paciente 6 Saque el n mero apropiado de bolsas del congelador No use ninguna bolsa que ya no est sellada Si se congelaron las muestras de paciente despu s de la extracci n s quelas tambi n del congelador Rasgue el n mero de bolsas necesarias para abrirlas y saque los tubos Si se va a usar m s de una bolsa pero solamente se va a procesar un conjunto de controles positivo y negativo s lo es necesario extraer los Tubos 3 y 4 de una bolsa Deben tomarse precauciones al manipular el Tubo 4 Este tubo contiene material de DNA de control positivo y la contaminaci n podr a dar lugar a resultados positivos falsos del paciente Deje que se descongele el contenido de los tubos coloc ndolos en el banco de laboratorio durante 5 10 minutos asegur ndose de que se haya descongelado totalmente el contenido de todos los tubos antes de continuar Mezcle en la agitadora vorticial el contenido de los tubos y las muestras de paciente y a continuaci n centrif guelos en una microcentrifugadora mediante un ciclo corto para asegurarse de que todo el contenido se acumule en el fondo de los tubos antes de usarlos Coloque el n mero requerido de tubos capilares de 20 uL en una gradilla de soporte para tubos capilares
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