II RB5 Detection - Annar Diagnóstica Import
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1. RES Rest RES Reak Curve Summary ote E L Quantitabion Results tsx 1 m 1 t E EJ Hex E Calfied610 Qusa G 1 2 3 4 m Aerial RES_Rewuk al Aerial RES Quartitation Plate Vis EN Surmenary 20 15 FA mu Cal Red Urkn 33 5101 57 50 Red 611 Urkn40 MP_2x10 6300 Red 611 Urkn 4 MP_2x10 62350 Cal Red 611 Urkn 54 2401 54 00 Red 511 Urkn 61 2401 6350 Red 611 Urkn 8 2401 64 00 Red 611 Urkn 8 2404 57 50 Red 611 06 _1071 5750 3 CP_I0 64 00 3 0 101 57 50 Scan Mode Al Channels Plate Type BR White Analysis Mode Baseline Subtracted Curve Fit gt Fig 12 Archivos de los resultados exportados 6 Regrese al paso 3 y seleccione el paso numero 14 Repita los pasos 4 y 5 y guarde los datos en la carpeta 2 Luego vuela al paso 3 y seleccione el paso numero 20 Repita los pasos 4 y 5 y guarde los datos en la carpeta 3 Los datos de cada paso es guardado como se muestra a continuacion Numero de paso Carpeta designada 8 1 14 2 20 3 Seegene Anyplex 1 RB5 Detection B Ajustes para el an lisis de datos en el Seegene Viewer 1 Abra en pantalla el programa Seegene Viewer haga2. Seegene Anyplex RB5 Detection T RB5 Detection Cat No RB7500Y Anyplex Sistema Anyplex II PCR para detection de Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Bordetella pertussis Bordetella parapertussis a partir de aspirado nasofaringeo hisopado nasofaringeo lavado broncoalveolar y esputo Para uso con el 1 CFX96 Real time PCR System Bio Rad Seegene Anyplex 1 RB5 Detection TABLE OF CONTENTS cnn 3 INTENDED USE nm 4 PRINCIPLES AND PROCEDURE OVERVIEW 4 BACKGROUND INFORMATION 6 REAGENTS meei e 7 STORAGE AND HANDLING 8 MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED 8 Mee OOO 9 REAL TIME PCR INSTRUMENT SET UP AND RESULTS ANALYSIS 16 Ann AA eens eet 26 TROUBLESHOOTING cnn 30 PERFORMANCE secetei EE E 32 REFERENCES cme 36 EXPLANATION OF SYMBOLS aia 37 ORDERING INFORMATION _ 38 Seegene Anyplex RB5 Detection NOTICIAS Este producto se puede utilizar con prop sitos de diagn stico in vitro IVD In Vitro
3. Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene Nucleic Acids Research 2007 35 6 e40 2 Cho MC Kim H An D Lee M Noh SA Kim MN Chong YP Woo JH Comparison of sputum and nasopharyngeal swab specimens for molecular diagnosis of Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae and Legionella pneumophila Ann Lab Med 2012 32 2 133 138 3 Deborah A Wilson Belinda Yen Lieberman Udo Reischl Steve Gordon and Gary W Procop Detection of Legionella pneumophila by real time PCR for the mip gene Journal of Clinical Microbiology 2003 41 3327 3330 4 Erin A McDonough Christopher Barrozo Russell and David Metzgar Multiplex PCR for detection of Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Legionella pneumophila and Bordetella pertussis in clinical specimens Molecular and Cellular Probes 2005 19 314 322 5 Mustapha Samrakandi Suat L Cirillo Dennis A Ridenour Luiz E Bermudez and Jeffrey Cirillo Genetic and phenotypic differences between Legionella pneumophila strains Journal of Clinical Microbiology 2002 40 1352 1362 6 Khanna J Fan Pehler Harrington Waters Douglass J Stallock S Kehl and K J Henrickson The pneumoplex assays multiplex PCR enzyme_ hybridization assay that simultaneous detection of five organisms Mycoplasma pneumoniae Chlamydia Chlamydophila p
4. n WATER Agua libre de Rnasas CONTROL Control Positivo Mezcla Maestra para PCR Anyplex Fabricante Fecha de fabricacion Consulte instrucciones de uso Seegene Anyplex RB5 Detection Seegene Anyplex II RB5 Detection RB7500Y Anyplex II RB5 Detection 50 rxns RV7G0tY Anyptex Ut RV16 Detection 50 xs Seeptex RY series RY3246 0 RV6C00Y Seeplex RV12 ACE Detection 50 rxns RyY6F60Y Seeptex RVIS AGE Detection 59rxns Accessory product iT a a a a aa aaa aaae SG1701 Ribo_spin vRD Viral RNA DNA Extraction Kit 50 preps 173000 075 MICROLAB STARlet EA 744800 4 STARMag 96 Virus 384T 1box 38 08 2012 V1 0
5. BP Bordetella parapertussis BPP y Control Interno 1 En la PCR la eficiencia puede reducirse por inhibidores que se pueden presentar en las muestras cl nicas Un control interno 1 es incorporado dentro del producto como un conjunto en el control del proceso para monitorear el aislamiento de cidos nucleicos y verificar una posible inhibici n de la PCR El IC es co amplificado con los cidos nucleicos objetivos en las muestras cl nicas El sistema Uracil DNA glicosilasa UDG es empleado en el AnyplexTM RB5 Detection La funci n del UDG es prevenir la mutag nesis por eliminaci n del uracil de las mol culas de DNA por escisi n de N glicos lico unido e iniciar la base de reparaci n por escisi n BER Por lo tanto los sistemas de UDG se utilizan para controlar la contaminaci n cruzada de las muestras con amplicones Seegene Anyplex 1 RB5 Detection 2 Procedimiento Muestras aspirado nasofaringeo hisopado nasofaringeo lavado bronquio alveolar esputo Aislamiento acidos nucleicos Acido nucleico Amplificacion y deteccion usando el sistema Anyplex II Analisis de resultados lt Procedimiento general con el kit Anyplex TM II RB5 Detection gt Seegene Anyplex RB5 Detection ANTECEDENTES Las infecciones del tracto respiratorio principalmente en la forma de neumonia es una causa importante de morbilidad y mortalidad especialmente en ni os y ancianos Las ne
6. Diagnostics en UE dado que la marca IVD CE esta aprobada por la Directiva UE 98 79 EC Los tipos de muestras aplicables son aspirados nasofaringeos hisopados nasofaringeos lavado bronquio alveolar y esputo Esta prueba no se ha validado para otro tipo de muestras Almacene las muestras de ADN a 70 hasta su uso y mant ngalas en hielo durante el tiempo que sean utilizadas La sensibilidad del ensayo puede disminuir en muestras que son repetidamente congeladas y descongeladas o almacenadas por largos periodos de tiempo La confiabilidad de los resultados depende de la recolecci n adecuada de la muestra el transporte almacenamiento y procesamiento El flujo de trabajo en el laboratorio debe procesarse en una manera unidireccional Siempre use guantes desechables en cada rea y c mbielos antes de ingresar a las diferentes reas Cambie los guantes inmediatamente si se contaminan o tr telos con reactivo DNA decontaminante Dedicar suministros y equipo a las reas de trabajo separadas y no moverlos de un rea a otra No pipetee con la boca No coma beba o fume en las reas de trabajo del laboratorio Use guantes desechables libres de polvo bata de laboratorio y gafas protectoras cuando manipule muestras y reactivos Lave las manos despu s de manipular muestras y los reactivos de la prueba Evite contaminar los reactivos al extraer al cuotas de los tubos de reactivos Se recomienda el uso de puntas para pipetas est riles dese
7. clic en Open para encontrar los archivos guardados en la carpeta 1 5 Seegene Viewor for CEX96 v1 1 Me Eck Opm tep 2346567869 1011 121 Wellrdo Q aion Standard Curve ample B F G Negative W Fig 13 Visor Seegene 2 Despu s de abrir el archivo de resultados 1 Seleccione los pocillos de las muestras Haga clic en la columna Men y seleccione la prueba realizada de las opciones de la lista 3 Haga clic en Apply para obtener el resultado final e e ele e 6 1 Load Save JL Export Pork Fig 14 Ajustes para el an lisis de datos en el Visor de Seegene Seegene Anyplex 1 RB5 Detection 3 Verifique el resultado en cada pozo Nota Nombre el NC PCRC y luego haga click en Apply cuando el control de PCR se use por 1 5 Seegene Viewer for CFX96 v1 1 Anyplexll RBS Result Quantitation Ct Results xisx Fig 15 Resultados de la prueba del CFX96 en el visor de Seegene Seegene RESULTADOS 1 Informaci n del analito Fluor foro Cal Red 610 Quasar 670 d RFU dT d RFU dT d RFU dT d RFU dT Anyplex 1 RB5 Detection Anyplex II RB5 Detection Temperatura Temperatura Temperatura Temperatura Seegene Anyplex 1 RB5 Detection 2 Interpretac
8. y etanol Use solo puntas con filtro durante el procedimiento de extracci n Cambie puntas entre tubos Repita el procedimiento de extracci n de cidos nucleicos con un nuevo set de reactivos Seegene Anyplex RB5 Detection Anyplex RB5 Detection OBSERVACION CAUSAS PROBABLES SOLUCION o no se observa Tome una nueva muestra repita el procedimiento senal en los Almacenamiento incorrecto de controles completo Asegure que la muestra sea almacenada en la muestra positivos las condiciones apropiadas Error en la extracci n de cido Repita la extracci n del cido nucleico nucleico Error en la adici n del cido Verifique el n mero de muestras asegure que se nucleico al tubo de PCR adicione el cido nucleico al tubo de PCR correcto correspondiente durante el proceso de detecci n Presencia de inhibidores Diluya la muestra en PBS 10 100x y repita desde el paso de extracci n con la muestra diluida Los fluoroforos para el Seleccione el fluor for correcto para el an lisis de datos analisis de datos no cumple con el protocolo Programacion incorrecta Repita la PCR con la programaci n correcta Mezcla de PCR incorrecta Verifique que todos los componentes se hayan adicionado no Si usa premix precompuesto debe reducir la sensibilidad Cada reactivo utilizado para la homogeneizaci n y gire hacia abajo el tubo de reactivo antes de poner la PCR en tie
9. 0 2 3 4 4 Cote Q Sange 0 MA 0 3 Cal Red El Urkn iS 1075 64 50 Cal Red 610 Urkn 22 1075 6450 Cal Red Unkn 23 105 64 50 Cal Red 61 Urkn 3 105 64 00 Cal Red El Urkes 1076 57 50 Cal Red 611 Unkn 43 1075 6350 Cal Red Gl Urkn S0 MP_10 5 57 50 Cal Red 61 UnknS0 105 6350 Cal Red El UrknS 1076 57 50 Cal Red 611 Unkn57 1075 6300 Cal Red 610 Unkn 54 175 57 50 Red 610 Unk 1074 6500 Completed Scan Mode Al Channels Plate BR White Analysis Mode Baseine Subtracted Curve FR Fig 11 Exporte todos los datos en hojas de calculo en el analisis de datos de la carpeta asignada 5 Verifique que los resultados se guardaron en la ubicacion designada Data Analysis Anyplexll RBS Me Wew Settings Tools Al a A Gd view edit Plate WelGroup __ Edt Favortes Took gt JO uch gt Folders E Address C C Arephectl RBS Detetion t El RES Reet Arpa RES Renk Gene 8 Discrimination Results xisx 34 Expression Results dex 1 15 F 15 FA A dell RBS Rosk 11 RES_Resuk SH E Curve Arrplfication Results dex LS Curve Derivative Results dsx q AA 119 a RES Reak al RES Res Se Curve Pask Results 1 Es HA as rte Ha 5 F
10. 0 Unkn 22 CP_10 5 57 00 A04 Quasar 670 Unkn 22 1075 64 00 A05 Quasar 670 Unkn 29 1075 64 00 z A05 Quasar 670 Unkn 29 CP_10 5 57 00 G 07 Quasar 67 Unkn 36 MP_10 S 57 00 lr 07 Quasar 67 Unkn 36 MP_10 5 64 50 A08 Quasar 670 Unkn 43 MP_10 5 57 00 4 Completed Scan Mode All Channels Plate Type BR White Analysis Mode Baseline Subtracted Curve Fit Fig 10 Pico de fusion de Quasar 670 3 Haga click en la selecci n del Paso numero 8 Step number 8 y seleccione Export All Data Sheets to Excel exportar todas las hojas de datos a Excel desde el menu de herramientas epee ere Eile View Settings Tools Edy Viow Edit Plato Well Group All Wells Curve Curve Data ie Run Infomation FAM HEX V Red610 7 Quasar 670 Peak Type Positive Step Number 2 Fluor A Content 9 Sample MP Cal Red 6 Unkn 29 5 64 50 07 Cal 6 Unkn 36 105 64 00 A08 Cal Red 6 Unkn 43 P_10 5 57 50 A08 Cal Red 6 Unkn 4 MP_10 5 63 50 09 Cal Red 6 Unkn 50 MP 10 5 63 50 A09 Cal Red 6 Unkn 50 MP 10 5 57 50 A10 Cal Red 6 Unkn 57 1075 53 00 A10 Cal Red 6 Unkn 57 MP 10 5 57 50 All Cal Red 6 Unkn 64 MP 10 5 57 50 B01 Cal Red 6 Unkn 02 CP 10 65 00 Cal Red 6 Unkn 02 CP_10 4 57 50 B02 Cal 6 Unkn 09 10 4 65 00 Completed Sc
11. 129 B7 MP Detectado Mycoplasma pneumoniae FH strain MP Detectado Acinetobacter baumannii No detectado Acinetobacter schindleri No detectado Aeromonas hydophila No detectado Bacteroides fragilis No detectado Bordetella avium No detectado Bordetella bronchiseptica No detectado Bordetella hinzii No detectado Bordetella holmesii No detectado Candida albicans ATCC 102310 5 No detectado Candida glabrata No detectado Candida tropicalis No detectado Chlamydia trachomatis No detectado Seegene Anyplex 1 RB5 Detection Resultado Organismo Cadena No Seegene Anyplex 1 RB5 Detection Organismo Cadena No Resultado Para verificar la veracidad de los resultados las pruebas se realizaron por triplicado 2 Sensibilidad Para determinar la sensibilidad de la prueba Anyplex Il RB5 se hicieron diluciones seriadas est ndar 10 a 10 copias de ADN objetivo clonado por reacci n y fue analizado con TM Anyplex Il RB5 Detection La detecci n l mite para la sensibilidad es de 50 copias reacci n Seegene Anyplex 1 RB5 Detection 3 Reproducibilidad La reproducibilidad se llev a cabo en 3 puntos diferentes de tiempo en el curso de 10 d as por 3 personas diferentes Los mismos resultados se obtuvieron en todas las pruebas confirmando la reproducibilidad del producto Seegene Anyplex 1 RB5 Detection REFERENCIAS 1 Chun JY Kim KJ Hwang IT Kim YJ Lee DH Lee IK Kim JK
12. A E TOCE Oligo Mix TOM Primer 4X RB5 TOM Reactivos de amplificaci n y detecci n l 4X Anyplex PCR DNA polimerasa Master Mix Uracil DNA glicosilase UDG con UDG Buffer que contiene dNTPs CONTROL RB5 PC 25 uL Control Positivo PC Mezcla de clones patogenos Agua libre de RNasa 1 000 uL Calidad Ultrapura grado PCR CONTROL 9 RB5 IC 500 uL Control Interno Ex geno IC a Manual de Usuario Il una marca de Seegene Inc Seegene Anyplex RB5 Detection ALMACENAMIENTO Y MANIPULACION Los componentes del Anyplex TM Il RB5 Detection deben ser almacenados a 20 C Todos los componentes son estables en condiciones de almacenamiento recomendadas hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta Debe evitarse la congelaci n y descongelaci n repetida ya que esto puede reducir la sensibilidad Si los reactivos van a ser utilizados de forma intermitente se deben almacenar en al cuotas MATERIALES REQUERIDOS NO SUMINISTRADOS e Guantes desechables libres de talco l tex o nitrilo e Pipetas ajustables y puntas est riles e Microcentr fuga para tubos de 1 5 ml e Kit para aislamiento de cidos nucleicos ver Aislamiento de cidos Nucleicos e K SEEPREP12 No De Cat P4850 SIGMA e Kit Transcripci n reversa No De Cat SGRT801 Seegene e Maquina de hielo e Centr fuga mesa e Agitador vortex e Equipo para PCR en tiemp
13. B Pre ajustes para el an lisis de datos en el CFX 96 1 Despu s del ensayo haga clic en la pesta a Melt curve para confirmar los resultados de los picos de las curvas Data Analysis RBS Result perd File View Settings Tools 4 Ey View Edit Plate ES Well Group All Wells Curve Melt Curve Data Information T Y V V Cal Red 610 4 Quasar 670 12 Boe FAM Unkn 44 MP_10 4 04 50 Scan Mode All Channels Plate Type BR White Analysis Mode Baseline Subtracted Curve Fit Fig 9 Resultado del Pico de Fusi n Seegene Anyplex RBS Detection 2 Seleccione solo Quasar 670 el umbral de pico de fusi n debe ser ajustado a cero fa Data Analysis ABS Result perd File View Settings Tools viewed plato Well Group Wells 4 Curve Melt Curve Data PA Run Infomation pa 6000 q ype Temperature Celsius O FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 Peak Type Positive v SigfNumber 20 x MERIDA E JC SS O Fuor A Content Sample 0 8 0 E Quasar 67 Unkn 01 1075 57 00 Quasar 67 Unkn 08 10 5 64 00 Quasar 67 Unkn 08 1075 57 00 Quasar 67 Unkn 15 CP 10 5 64 00 Quasar 67 Unkn 15 CP 10 5 57 00 Quasar 67
14. Centrifugue los tubos de reactivos brevemente para remover las gotas del interior de las tapas Nota Si usted desea utilizar el RB5 1 para supervisar el procedimiento de cido nucleico aislada y para comprobar si es posible inhibici n de la PCR que ya han sido a adido a los cidos nucleicos extra dos En este caso consulte el esquema de pipeteo A 1 O si usted desea utilizar el IC RB5 exclusivamente para el control de inhibici n de la PCR se debe a adir directamente a la maestra de PCR En este caso consulte el esquema de pipeteo A 2 A Preparaci n de la PCR Mastermix A 1 5 ul 4X RB5 TOM 5 uL 4X Anyplex PCR Master Mix con UDG 5 pul Agua libre de RNasa 15 uL Volumen totalde PCR Mastermix A 2 5 uL 4X RB5 TOM 5 ul 4X Anyplex PCR Master Mix con UDG 2 uL RB5 IC 3 uL Agua libre de RNasa 15 uL Volumen Total de PCR Mastermix Nota Calcule la cantidad necesaria de cada reactivo bas ndose en el n mero de reacciones muestras controles Seegene Anyplex RB5 Detection Mezcle por inversi n 5 veces 0 mediante agitador vortex y centrifugue brevemente Coloque al cuotas de 15 uL del PCR Mastermix en tubos para PCR y cierre las tapas Agregue 5 uL de cada muestra de cidos nucleicos a su tubo respectivo 15 uL PCR Mastermix 5 uL Muestra de cidos nucleicos 20 uL Volumen Total de reacci n Nota Utilice una punta de pipeta nueva con cada muestra diferente Nota Para el Control Negativo
15. an Mode All Channels Plate Type BR White Analysis Mode Baseline Subtracted Curve Fit Fa Data Analysis Anyplexll AS Result perd Eile View Settings El e Import Fluorophore Calibration Met Curve 3 Replace Plate Export All Data Sheets to Exc 70 76 Temperature Celsius M Step Number MN Fluor A Content 9 1 4 9 E FAM Unkn 61 MP_2x10 1 84 50 Quasar 67Unkn O1 1075 64 00 Quasar 67 Unkn 01 CP_10 S 80 00 02 Quasar 67 Unkn 08 CP_10 5 64 00 02 Quasar 67 Unkn 08 CP 10 5 64 50 A03 Quasar 67 Unkn 15 1075 73 00 2403 Quasar 67 Unkne15 10 65 4 00 04 Quasar 67 Unkn 22 CP_10 5 78 00 04 Quasar 67 Unkn 22 CP 10 5 64 00 Ss AOS Quasar 67Unkn 29 1076 64 00 Quasar 67 Unkn 29 1075 74 00 5 07 Quasar 67Unkn 36 1075 64 00 Completed Scan Mode All Channels Plate Type BR White Analysis Mode Baseline Subtracted Curve Fit Fig 11 Exportar todas las hojas de datos a Excel Seegene Anyplex RB5 Detection 4 Guarde los resultados a la carpeta 1 cuando la ventana nueva se abra Data Analysis Anyplexil RBS_Result perd Pie Ven Setting Took 9 G wet coun awet Y 9 60 7 Querer 67
16. chables y con filtro resistente a aerosoles No mezcle los reactivos de diferentes lotes o de tubos diferentes del mismo lote No use este producto despu s de la fecha de vencimiento Use tubos de tapa rosca y evite las salpicaduras o contaminaci n cruzada de muestras durante la preparaci n Se cuidadoso para no contaminar los reactivos con cidos nucleicos extraidos productos de la PCR y control positivo Para prevenir la contaminaci n delos reactivos se recomienda usar puntas con filtro Use reas separadas para cada experimento Use un set diferente de pipetas para cada rea extracci n de ADN mezcla de reactivos la adici n de cido nucleico de molde y la adici n del producto de PCR Solo en un espacio designado abra los tubos de reacci n o tiras despu s de la amplificaci n para evitar la contaminaci n con amplicones Almacene el material positivo aparte de los reactivos del kit Los procedimientos de seguridad en el laboratorio se deben tener en cuenta para manipular las muestras Deben seguirse los procedimientos de seguridad del laboratorio cuando se manipulen las muestras Limpie y desinfecte a fondo todas la superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 0 5 en agua desionizada o destilada Seegene Anyplex RB5 Detection INTENCION DE USO El ensayo RB5 Detection es una prueba cuantitativa in vitro test para la detecci n de Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae L
17. cionadas de bacterias incluyendo Bordetella parapertussis Bordetella holmesii aunque las infecciones por Bordetella parapertussis son normalmente menos severas Por lo tanto es muy importante el diagn stico temprano confiable de la tos ferina para comenzar un tratamiento inmediato con antibi ticos ya que requiere distinguir entre Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis La identificacion rapida y exacta de estos agentes causantes es un componente clave para la creaci n de un pron stico adecuado la facilitaci n del tratamiento temprano y tal vez la atenuaci n de las preocupaciones de salud p blica Las t cnicas cl sicas para la identificaci n microbiol gica sin embargo no pueden proporcionar un medio eficaz de diagn stico porque la mayor a de estos organismos crecen ya sea lentamente o en cultivo lo que lleva a un retraso en la detecci n y el diagn stico La PCR multiplex en tiempo real ha sido desarrollado para detectar Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis en una prueba sencilla Estos ensayos proven la medici n cualitativa de identificaci n de pat genos de una manera r pida sensible espec fica y costo efectiva Seegene Anyplex 1 RB5 Detection REACTIVOS Los reactivos de este kit son suficientes para 50 determinaciones Solicitar informacion de AnyplexTM II Detecci n RB5 RB7500Y Anyplex II RB5 Detection E
18. ect Existing Express Load Selected Plate QuickPlate_96 wells_All Channels pltd Preview Edit Selected Fluorophores HEX Cal Red 610 Quasar 670 Plate Type BR White Scan Mode All Channels Next gt gt Fig 7 Experiment Setup Plate Ejecuci n de la prueba 1 En la ventana Experiment Setup Start Run Haga click en Close Lid para cerrar la tapa del equipo fa Bio Rad Manager admin Elle View User Tools Windows Help 2A RADA Options 241 Protocol Plate Run Information Protocol RBS Detection prel Plate QuickPlate_96 wells_All Channels pltd Notes Scan Mode All Channels Start Aun on Selected Block s Run Status Sample Volume Protocol ID Select All Blocks Flash Block Indicator Open Lid 3 _ Close Lid gt Start Run Fig 8 Close Lid 2 3 Haga click en Start Run Guarde el archivo del ensayo en la carpeta que usted designe Llene en el archivo el nombre y de click en SAVE y la maquina dara inicio Seegene Anyplex RB5 Detection 1 2 An lisis de datos A Creaci n de la carpeta espec fica para guardar los datos 1 Para salvar los datos de cada punto de resultados del archivo cree tres carpetas 2 El nombre de la carpeta por guardar del primer punto de fusi n es 1 el nombre de la segunda carpeta es 2 y el tercer nombre es 3 A
19. egionella pneumophila Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis en muestras de aspirado nsaofaringeo hisopado nasofaringeo lavado bronquio alveolar y esputo PRINCIPIOS Y PROCEDIMIENTO 1 Principios La prueba de detecci n RV16 de Anyplex Il es representativa de la tecnolog a de Seegene est basada la nueva tecnolog a TOCE la cual permite detectar m ltiples pat genos en un solo canal de fluorescencia en los instrumentos para PCR en tiempo real En los ensayos de curvas de disociaci n actuales se observan con frecuencia diferencias de temperatura entre los ADN que muestran una gran variaci n en sus secuencias lo que resulta problem tico en el rea de diagn stico cl nico donde es cr tica la exactitud y reproducibilidad de las pruebas No obstante la tecnolog a TOCE est dise ada para no verse afectada por variaciones en la secuencia por lo tanto garantiza valores de Tm consistentes El Anyplex RB5 Detection representa una nueva clase de pruebas moleculares por c clico Atrapador c clico an lisis de la temperatura de fusi n que es un multiplexado El m todo de CMTA c clico puede discriminar mayor pat genos en muestras co infectadas Es un ensayo de PCR multiplex en tiempo real que permite la amplificaci n detecci n y diferenciaci n simult nea del material gen tico de Chlamydophila pneumonia CP Mycoplasma pneumonia MP Legionella pneumophila LP Bordetella pertussis
20. el RB5 est incluido en el kit Esto permite al usuario confirmar no s lo el procedimiento de aislamiento de cidos nucleicos sino tambi n la posibilidad de inhibici n de la PCR 10 uL del RB5 IC debe adicionarse a cada muestra antes de la extracci n de cidos nucleicos e ElRB5IC se puede a adir ya sea a la mezcla de soluci n de muestra y tamp n de lisis O al tamp n de lisis directamente Note En caso de ser a adido a tamp n de lisis directamente es posible hacer burbujas se debe tener cuidado B 2 Con el fin de confirmar la inhibici n de la PCR El IC RB5 puede opcionalmente ser utilizado exclusivamente para comprobar posibles de inhibici n de la PCR no para confirmar el procedimiento de aislamiento de cido nucleico Por s lo esta aplicaci n a adir 2 ul de la IC RB5 por reacci n directa a la PCR Mastermix C Kits de preparaci n manual Kit de aislamiento Fabricante Cat No vol recomendado O dar Muestra 190 uL QlAamp MinElute Virus Spin Kit QIAGEN 57704 luci n dol Ribo_spin vRD GeneAll 302 150 Muestra 290 uL Viral RNA DNA Extraction Kit SG1701 Elucion 40 uL Para ambas muestras de virus y bacterias respiratorios Si usted desea comprar los productos anteriores de Seegene Inc por favor utilice este No Cat Seegene Anyplex II RB5 Detection Nota El kit Ribo_spin vRD kit solo ha sido validado para los siguientes tipos de muestras aspirad
21. i n de Resultados Resultado Resultado del Control Interno Interpretaci n a dato objetivo no detectado Invalido Senal d bil o negativa del control interno es indicativa de una toma de muestra inadecuada errores en el procedimiento presencia de inhibidores Procese otra alicuota de la muestra original y repita la prueba c clico Resultado cyclic Catcher Melting Temperature Analysis Primer punto CMTA Segundo punto CMTA Tercer punto CMTA AA El control Interno y otras se ales no observadas ver Soluci n de Problemas TROUBLESHOOTING La detecci n del Control Interno IC en el canal de detecci n del Quasar 670 no es requerida para resultados positivos T tulos elevados de otros analitos pueden conducir a una reducci n O ausencia de la se al del Control Interno Seegene Anyplex RB5 Detection 3 Aplicaci n a muestras cl nicas lt Muestra 1 gt ter Pico de fusi n Primer punto CMTA Peak FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 2nd 34 FAM HE Cal Red 610 Quasar 6 0 2do Pico de Fusion Segundo punto CMTA gt _ Well Info Melt Peak Cal Red 610 Quasar 6701 ist 2 3 FAM Cal Red 610 Quasar 670 E a A oN Li oc by b 3er Pico de Fusi n Tercer punto CMTA Well I
22. mience el ensayo Seegene Anyplex RB5 Detection D 2 MICROLAB NIMBUS IVD Nota Mirar el manual de operaci n del MICROLAB NIMBUS IVD Sistema de Purificaci n Automatizado Fabricante Vol recomendado MICROLAB NIMBUS IVD Muestra 600 ul Si usted desea comprar los productos anteriores de Seegene Inc por favor utilice este No Cat Nota El MICROLAB Nimbus IVD solo ha sido validado para los siguientes tipos de muestras aspirado nasofaringeo hisopado nasofaringeo lavado bronquiolveolar D 3 MICROLAB ST ARlet Nota Observar el manual de operaci n del MICROLAB STARlet Sistema de Purificaci n Fabricante Cat No Vol recomendado Automatizado Muestra 600 ul Elucion 100 ul Si usted desea comprar los productos anteriores de Seegene Inc por favor utilice este No Cat STARMag 96 Virus Seegene 744800 4 Nota El MICROLAB STARlet solo ha sido validado los siguientes tipos de muestras aspirado nasofaringeo hisopado nasofaringeo lavado bronquiolveolar Seegene Anyplex RB5 Detection 4 Preparaci n para la PCR en tiempo real Nota Deben usarse los tubos las tapas correctos ver MATERIALES REQUERIDOS NO INCLU DOS Nota Puntas con filtro resistente a aerosoles y guantes ajustados deben usarse cuando se preparen las muestras Poner mucho cuidado para evitar las contaminaciones cruzadas Nota Descongele los reactivos por completo en hielo Nota
23. mpo real Se dejaron los reactivos por largo tiempo a temperatura Verifique la fecha de vencimiento de los reactivos y ambiente o se almacenaron en uno nuevo si es necesario condiciones no apropiadas Seegene Anyplex 1 RB5 Detection DESEMPENO 1 Especificidad La alta especificidad del kit Anyplex Il RB5 est garantizada por los cebadores espec ficamente dise ados para los objetivos de inter s y las condiciones de reacci n Anyplex II RB5 ha sido probado para reactividad cruzada en 69 diferentes pat genos Organismo Cadena No Resultado Bordetella parapertussis BPP Detectado Bordetella pertussis BP Detectado Chlamydiaceae pneumoniae AR 39 CP Detectado Chlamydiaceae pneumoniae 1 CP Detectado Legionella pneumophila Serotype1 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype2 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype3 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype4 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype5 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype6 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype7 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype8 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype9 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype10 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype11 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype12 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype13 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype14 LP Detectado Legionella pneumophila Serotype15 LP Detectado Mycoplasma pneumoniae M
24. neumoniae Legionella pneumophila Legionella micdadei and Bordetella pertussis and its real time counterpart Journal of Clinical Microbiology 2005 43 565 571 7 J Kim JK Rheem Kim J Evaluation of Seeplex Pneumobacter multiplex PCR kit for the detection of respiratory bacterial pathogens in pediatric patients Korean J Lab Med 2009 29 4 307 313 8 Templeton KE Scheltinga SA van der Zee A Diederen BM van Kruijssen AM Goossens Kuijper E Claas EC Evaluation of real time PCR for detection of and discrimination between Bordetella pertussis Bordetella parapertussis and Bordetella holmesii for clinical diagnosis J Clin Microbiol 2003 41 9 4121 4126 9 Winchell JM Thurman KA Mitchell SL Thacker WL Fields BS Evaluation of three real time PCR assays for detection of Mycoplasma pneumoniae in an outbreak investigation J Clin Microbiol 2008 46 9 3116 3118 10 Yvonne Kuoppa Jens Bomman Lena Scott Urban Kumlin Irene Eriksson and Annika Allard Quantitative detection of respiratory Chlamydia pneumoniae infection real time PCR Journal of Clinical Microbiology 2002 40 2273 2274 Seegene Anyplex RB5 Detection EXPLICACION DE LOS SIMBOLOS Explicacion de los simbolos usados en las etiquetas y manual simbolo O N mero de Lote Numero de cat logo Temperatura de Almacenamiento 4 Precaucion PRIMER Mezcla de oligonucleotidos para amplificaci n y detecci
25. nfo Melt Peak HEX Cal Red 610 Quasar 670 ist 2 FAM Cal Red 610 Quasar 670 Cal Red 610 Quasar 670 Seegene Anyplex 1 RB5 Detection lt Muestra 2 gt ter Pico de Fusi n Primer punto CMTA Well Info Peak HEX Cal Red 610 Quasar 670 ist 2nd 3rd _ FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 2do Pico de Fusi n Segundo punto CMTA Well Info Melt Peak HEX Cal Red 610 Quasar 670 ust J2nd 3rd FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 dT 3er Pico de Fusion Tercer Punto CMTA Well Info Melt Peak FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 ist 2nd 3rd FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 d AFU dT Cal Red 610 Quasar 670 Seegene SOLUCION DE PROBLEMAS Anyplex 1 RB5 Detection Anyplex RB5 Detection OBSERVACION CAUSAS PROBABLES SOLUCION No se observa la se al del Control Interno ni ninguna otra se al La se al control no es observada Falsos positivos o se al observada en el control Negativo del Los fluor foros para el an lisis de datos no cumplen con el protocolo Ciclos de PCR y o temperaturas en el equipo Los reactivos permanecieron a temperatura ambiente por un tiempo prolongado se almacenaron en Programaci n incorrecta Extracci n de cido n
26. o el hisopado nasofaringeo y el lavado bronqueoalveolar son examinadas rutinariamente para pat genos respiratorios comunes e Obtener las muestras puede ser dificil en algunos pacientes En tales casos hisopado nasofar ngeo puede recolectarse simple y eficientemente con el hisopo de nylon El medio universal de transporte UTM y el eNat Fabricante Dispositivo de recolecci n de Categoria No muestra COPAN COPAN 606CS01P COPAN UTM con hisopos 360C 305C DIAGNOSTIC HYBRIDS UTM con hisopo flexible 403 406C Nota nosotros recomendamos el uso de UTM o eNat cuando se aplican en el MICROLAM NIMBUS MICROLAB Seegene Anyplex 1 RB5 Detection B Almacenamiento de muestras La sensibilidad de un ensayo puede disminuir si las muestras son congeladas y descongeladas rutinariamente durante per odos de tiempo prolongados e Almacene las muestras a 4 hasta por 72 horas antes de su procesamiento Almacene las muestras restantes a lt 70 C C Transporte de muestras Para asegurar la calidad de las muestras stas deben transportarse tan pronto como sea posible Las muestras deben transportarse en las condiciones de temperatura indicadas e Empaque las muestras cuidadosamente para evitar fugas y roturas e Las muestras deben ser transportadas en fri e Las muestras deben enviarse al laboratorio tan pronto como sea posible despu s de su recolecci n siguiendo las instrucciones de laborat
27. o nasofaringeo hisopado nasofaringeo lavado bronquiolveolar D Sistema de Purificaci n Automatizado D 1 SEEPREP12 Sistema de Purificaci n Automatizado Fabricante Cat No Vol Recomendado Muestra 530 uL Eluci n 60 uL Si usted desea comprar los productos anteriores de Seegene Inc por favor utilice este No Cat SEEPREP12 Viral NA Kit NorDiag SPN1004 Nota El SEEPREP12 solo ha sido validado para los siguientes tipos de muestras aspirado nasofaringeo hisopado nasofaringeo lavado bronquiolveolar e Adicione 10 uL de Proteinasa 20mg mL a cada tubo est ril para muestra de 1 5 mL debidamente etiquetado e Transfiera 540 uL de muestra incluyendo los 10 uL de RB5 IC al tubo que contiene los 10 uL de Proteinasa K mezcle el contenido mediante ligeros golpecillos e Elcartucho y la punta ensamblada se colocan en el instrumento e Coloque el tubo de eluci n de 1 5 mL en el interior del equipo e Presione Continue la primera pantalla para permitir que el equipo se inicie e Presione Start protocol en el men principal del SEEPREP12 e Enel men de selecci n de protocolos presione SPN Viral NA V1 1 e el men de selecci n de volumen de muestra presione 550 uL en la selecci n del volumen de eluci n presione 60 uL e Siga las instrucciones en pantalla para cargar el instrumento e Despu s de que todos los pasos se han completado cierre la puerta y co
28. o real 96 Bio Rad e Tiras de 8 tubos de bajo perfil de 0 2 ml sin tapas color blanco No Cat TLS0851 Bio Rad e Tiras de 8 tapas planas de grado ptico No Cat TCS0803 Bio Rad e Plato de 96 pozos pozo blanco cat No HSP 9655 Bio Rad Soluci n salina Seegene Anyplex RB5 Detection PROTOCOLO 1 Recolecci n de la muestra almacenamiento y transporte Nota Todas las muestras tienen que ser tratadas como materiales potencialmente infecciosos S lo las muestras que sean recogidas transportadas y almacenadas y atiendan estrictamente las siguientes normas e instrucciones ser n permitidas Nota Para garantizar una alta calidad de las muestras se deben transportarse lo m s r pidamente posible Las muestras tienen que ser transportadas en las condiciones de temperatura indicadas A Recolecci n de las muestras Esputo e Dar instrucciones claras a los pacientes cuando recojan las muestras de esputo Los pacientes deben tomar muestras ya sea exterior al aire libre o lejos de otras personas Los pacientes no deben tomar muestras en espacios cerrados tales como inodoros e Lavar boca con agua pero no cepillarse los dientes antes de recoger el esputo El paciente debe toser profundamente y expectorar directamente en el recipiente e Una muestra de esputo debe tener un volumen de 3 5 Aspirado nasofar ngeo hisopado nasofar ngeo lavado bronquioalveolar e El aspirado nasofaringe
29. orio para el transporte Las muestras deben ser transportadas siguiendo tambi n las disposiciones locales y nacionales para el transporte de material pat geno 2 Aislamiento de cidos Nucleicos Diversos fabricantes ofrecen kits para aislamiento de cidos nucleicos La cantidad de muestra resultante puede variar dependiendo del protocolo utilizado Los kits de aislamiento deben ser validados para usar con este kit A Pre tratamiento de las muestras Nota El proceso de pre tratamiento para extraer los cidos nucleicos es el mismo de los kits de extracci n manual y los sistemas de purificaci n autom tica 12 MICROLAB Nimbus IVD MICROLAB STARlet Nota Recolecte la muestra como aspirado nasofar ngeo Diluya la muestra con soluci n salina si la muestra es muy gruesa Esputo En un tubo c nico 15 mL adicione soluci n salina con la muestra 1 2 y mezcle en el vortex durante un minuto Seegene Anyplex RB5 Detection e Incube por 20 minutos a temperatura ambiente e Transfiera el volumen recomendado Ver Recomendaci n Vol de 2 D de soluci n salina a un nuevo tubo e Siga el protocolo del kit de aislamiento Nota En caso de que las muestras no est n viscosas el paso de tratamiento con soluci n salina no es requerido B Control Interno B 1 Confirmaci n del procedimiento de aislamiento de cidos nucleicos y la inhibici n de la PCR Nota El Control Interno d
30. ucleico fallida Alta carga del cido nucleico interno del pat geno Presencia de inhibidores de PCR Presencia de contaminaci n cruzada Seleccione los fluor foros correctos para el an lisis de datos Verifique las condiciones de la PCR y repita con los ajustes adecuados de ser necesario de almacenamiento y la fecha de caducidad ver la Verifique las condiciones etiqueta en el kit de los reactivos utilice un kit nuevo de ser necesario Repita el procedimiento de detecci n con los ajustes adecuados Si el Control Interno ha sido a adido a la extracci n una ausencia de la se al de Cl puede indicar la p rdida del cido nucleico durante la extracci n Asegurese de utilizar el m todo de aislamiento recomendado La muestra debe ser diluida con buffer salino 1 10 y luego agregar el Control Interno RB5 IC a la muestra diluida Si la se al del objetivo es observada es probable que sea positiva para el pat geno aunque la se al del control interno no se observe Si desea verificar el control interno diluya el cido nucl ico en D W esterilizada 10 100X y repita el paso de PCR con el cido nucleico diluido Diluya el cido nucleico aislado en D W est ril 10 100x y repita la PCR con el cido nucleico diluido Si la muestra est todav a presente reinicie desde la extracci n de cido nucleico Descontamine todas las superficies e instrumentos con hipoclorito de sodio
31. umon as agudas caracterizadas por repentinos inicios clasificados en dos grupos neumon a adquirida en la comunidad CAP y la neumon a nosocomial El diagn stico microbiol gico se considera cr tico para los tratamientos adecuados de los pacientes pero la mayor a de los estudios informan las dificultades del diagn stico etiol gico en el 50 de los casos de la PAC La neumon a at pica causada por Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae y Legionella pneumophila representa el 15 a 50 de todos los casos de CAP Chlamydophila pneumoniae y Mycoplasma pneumoniae fueron los organismos causantes de un tercio de los casos de neumon a en la infancia con muchos pacientes que tienen infecciones duales La Legionella pneumophila es el pat geno m s com n del que se reconocen 42 especies Las importantes tasas de mortalidad entre los ancianos y los pacientes con enfermedad subyacente grave pueden ocurrir como resultado de la infecci n con este pat geno El retraso en el diagn stico tambi n puede resultar en aumento de la mortalidad La Bordetella pertussis es el agente causante de la tos ferina pertusis neumon a bronquitis y en los seres humanos La tos ferina es una enfermedad infecciosa que se produce en todo el mundo con una alta prevalencia entre los ni os peque os no vacunados y recientemente ha resurgido en poblaciones altamente vacunadas Como los s ntomas de la tos ferina tambi n son los causados por las especies rela
32. usion 55 85 55 0 5 13 95C 30 sec 14 10 60 1 min 15 72 30 Note Lectura de plato el segmento 7 12 17 La fluorescencia detectada en fusion Est Run Time 03 50 00 Fig 2 Protocol Editor Seegene Anyplex 1 RB5 Detection 3 Haga clic en Sample Volume y modifique el valor a 20 uL 4 Haga clic en OK se abrir la ventana Experiment Setup Experiment Setup Options Protocol E Plate gt Start Run Create New Express Load Select Existing Selected Protocol 5 Detection prel Edit Selected Preview Est Run Time 03 50 00 96 Wells All Channels Sample Volume 20ul i950 950 i 15 00 0 30 Next gt gt Fig 3 Protocolo de configuracion del experimiento B Programacion de la placa 1 En Experiment Setup Plate haga click en Create New para abrir el Plate Editor y crear una nueva placa Experiment Setup Options Protocol 29 Plate Start Run E Create New mi Express Load OuickPlate_36 wells All Channels phd Y Selected Plate QuickPlate_96 wells_All Channels Preview Edit Selected Fluorophores FAM HEX Texas Red Quasar 705 Plate Type BR Clear Scan Mode All Channels 10 12 ES E ES ES ES ES EA EA Ee EA EA ES ES ES EA Fig 4 Plate Editor Crear una nueva placa ocargar una ya existente para el e
33. utilice 5 uL de agua libre de RNasa en lugar de muestra de cido nucleico Nota Para el Control Positivo utilice 5 uL RB5 PC Nota Evite la contaminaci n cruzada del PCR Mastermix y las muestras con el Control Positivo TM Nota En el caso del CFX 96 no etiquete la tapa Seegene Anyplex RB5 Detection CONFIGURACI N DEL EQUIPO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y AN LISIS DE RESULTADOS 1 Sistema de PCR en tiempo real CFX96 Bio Rad 1 1 Configuraci n del Equipo para PCR en tiempo real Nota la configuraci n del Sistema de PCR en tiempo real CFX96 para la detecci n de CP MP LP BP BPP y IC puede ser dividido en los siguientes pasos Programaci n del protocolo programaci n de la placa y ejecuci n A Programaci n del protocolo 1 En el men principal haga clic en Protocol para abrir la ventana de Experiment Setu p Bio Rad Manager admin Fig 1 Programaci n del protocolo Creaci n de un Nuevo protocolo o cargar un protocolo existente para el experimento Seegene Anyplex 1 RB5 Detection 2 En Protocol Editor defina el perfil termico como se indica a continuaci n Segmento de ciclos Temperatura Duraci n 1 1 50 4 2 1 95 15 3 95C 30 sec 4 30 60 1 min 5 30 6 1 55 30 sec 7 1 Curva de fusion 55 85 5s 0 5C 8 95 30 9 10 60 1 min 10 30 11 1 Boe 30 sec 12 1 Curva de f
34. xperimento Seegene Anyplex 1 RB5 Detection 2 Haga click en Select Fluorophores para indicar los fluoroforos FAM HEX Cal Red 610 y Quasar 670 que ser n utilizados en el experimento Plate Editor New File Settings Tools Zoom 100 0 Plate Loading Guide Plate Type BR Clear Fig 5 Select Fluorophores FAM HEX Cal Red 610 y Quasar 670 3 Seleccione los pocillos y haga clic en Sample Type en el men desplegable Unknown Muestras cl nicas Negative Control Positive Control 4 Haga clic en las casillas de verificacion apropiadas FAM HEX CAL Red 610 y Quasar 670 para cargar los fluor foros en los pocillos seleccionados 5 Escriba el nombre de la muestra en Sample Name y presione Enter 6 En Settings del menu principal del Plate Editor escoja el Plate Size tama o de la placa y el Plate Type tipo de placa BR White biScan Mode All Channels ell Groups Plate Loading Guide BA White 1 Clear y 9 1 212 Select Fluorophores Sample Replicate 1 Replicate Series Plate Type BR White Fig 6 Plate Setup Seegene Anyplex 1 RB5 Detection 7 Haga click y guarde la nueva agregada al archivo 8 Se abrira entonces la ventana de Experiment Setup Experiment Setup Options Protocol Plate E Create New Sel
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