ANYPLEX II Detección de MTB/MDR/XDR
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1. iB Lis Fig 14 Visor de Seegene 2 Despu s de abrir los resultados archivados 1 Arrastre los pozos muestra 2 Haga click en la columna men y seleccione Anyplex II MTB MDR XDR en el listado 3 Haga click en Aplicar y obtenga el resultado final 1 Iun Eo gos B oT Ad Lira 0 FP a ea kl Sat Jj inii Fs Fs isp bi P pA Fi mae AMA sua P Hok mig _ __Eam kh Bx 5 s mW Figura 15 Fig 15 Ajustes para an lisis de datos en el visor de Seegene 2 Seegene 3 Revise el resultado para cada pozo i Yai Ai 1 2 i ibuan Cl igo eek BEER Wall inda bd Pend HX dd Fil E Aeyphem E RT Cri mim dati a A sd pp a ode pee Cil eo DETH depp e md na gs ps NAAA Dur ep Y ES DM ee ee eee ep nd 4 9 a i EC ee a fe 208 Dri miin i Lr Pubie esed 5 Hal rasa i cmd 0 rs ATES EA RATE HT rari AFA Gin n lH TH PGA Doas Hi2. 85 C 5 sec 0 5 C Lectura de placa en el segmento 6 La fluorescencia es detectada en fusion 443 rv C7 Q tm E STO gt Care Pu Dead o gt TIT 4 ni Figura 2 Edicion del protocolo 3 Haga click sobre Volumen de muestra para editar directamente 20ul 4 Haga click en OK y guarde un archivo de nuevo protocolo 5 La ventana de configuraci n del experimento se abrir C Seegene r 0 amp 2 peer 13 pa mete C Omia 1 z Dada 10d Pascos 2 En fun OIN M Own Ise we mre mm bev aptum HOHE S 442 Figura 3 Protocolo de configuraci n del experimento B Configuraci n de la Placa 1 En Configuraci n de Placa del experimento haga click en crear nuevo para abrir el editor de placa para crear un nuevo plato fe Wee Ut Tee peo 204 42 usw 3 87 6 wei tms nij Do om m 1 L hup tor Uisud 5 ZEN its Fig 4 Editor de Plato Crear un nuevo plato o cargar uno existente C Seegene 2 Haga Click sobre selecci n de fluoroforo para indicar los fluoroforo FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 and Quasar 705 que ser n usados en el experimento pute cano New ig g File Settings Y 100
3. Drum PD Wasl Ev deg ras Cira FE n El k Par inai IEL Lig FHF rb Fasi s FZG H IRL Fij HE psu Fig 16 Resultados de la prueba en el visor de Seegene RESULTADOS Seegene 1 Diagrama esquematico de los resultados MTB MDR reaction MTB XDR reaction d RFU dT E INH R Injectable drug R kata inh mo om promoter promoter 146 12247 Cal Red 610 Quasar 670 C2 Seegene 2 Informaci n de Anualitos 2 1 Reacci n MTB MDR RESULTADO EN EL VISOR DE FLUOROFORO ANALITO SEEGENE mutations rpoB Cal Red 610 RIF R 4 mutations in INH R1 INH R 3 mutations in INH R2 inhA inhA promoter 2 2 Reacci n MTB XDR RESULTADO EN EL VISOR DE FLUOROFORO ANALITO gyrA Inj drug R 3 mutations in eis promoter Inj drug R Cal Red 610 1401G amp 1484T Inj drug R 1 mutation in rrs 1402T FQ R EM mutations in 2 mutations in rrs FQ R Inj drug R1 eis Inj drug R2 rrs Inj drug R3 rrs 1402T C2 Seegene 3 Interpretaci n de Resultados 3 1 Reacci n MTB MDR Resultado RIF R INH R Interpretaci n HEX Red 610 EMEN Quasar 670 RIF R detectado MTB detectado Invalido ee ee 1 Larepetici n de ensayos se deber a realizar con el ADN original Si el mismo
4. OA p sn an Dh leat n HE Ubri Dn nas p x B au LE BED HEX MW F BM dont ELE ra HEX Du pn 5 vn p kin uds Pak Tip LI fiel a Cara FH Fig 11 Exportar todas las hojas de datos a Excel 4 Guarde el resultado en el archivo especificado cuando una ventana nueva est abierta Seegene a ep 11 E 916 pr oe nc nn T M E ha aa T Guardado Tii Met Coe ate gi cere 1 eraran Anis Dirata i uc Pan iriarte app Pri piem 2 Fla Coates 2 See 2 1000 Cad Aad amp xDh 11 81 11 50 C Hed Lies m cd Red mph Ti RI ENE Liters POT A Levers Fuss xi Ca Hei B er DH Bis 11 50 Cal b nin LEE al 8 linir Asmi Eu FUB Gel Fed B Unis WER Assi TD BH Cal Aad MDH dont 8 Meade ll Meie Tra HH VER Aran Pode Care Fu Fig 12 Exportar todos los datos desde las hojas de c lculo en an lisis de datos un folder dise ado 5 Asegurese que
5. Bl Temp 870 A AA C Seegene Control Positivo Reacci n MTB MDR Well Info Melt Peak HEX Cal Aed 610 Quasar 670 MITE in RIF R UN JA f 200 EPA FAM fish AA MES 150 FF 7 KCN HEX f Y D Cal Red 610 aia 57 k A __EE2 gt X gt A Quasar 4 5 HEX Cal Red SAN NA A Inj Drug A3 A T aiiis 3 AA rho Ot ti Pa 2 T 27 8 Pa n pus Quasar C Seegene SOLUCION DE PROBLEMAS ANYPLEX MTB MDR XDR DETECCION OBSERVACION CAUSA PROBABLE SOLUCI N Almacenamiento incorrecto Verifique las condiciones de almacenamiento de los kits o expiraci n de de vencimiento de los reactivos repita el la fecha de validez del kit ensayo con kits nuevos si es necesario Los fluor foros para an lisis de datos no cumplen con el protocolo No hay se al Seleccione los fluor foros correctos para el an lisis de datos Programaci n incorrecta del termociclador de tiempo real Repita el procedimiento de detecci n con una configuraci n correcta Si la se al del blanco es observada es probable que sea positiva para el pat geno aunque la Alta carga del cido senal del control interno no se observe Si desea No hay se al del
6. Garfein R S Catanzaro D G Catanzaro A and Rodwell T C Evaluation of genetic mutations associated with Mycobacterium tuberculosis resistance to amikacin kanamycin and capreomycin a systematic review PLoS ONE 2012 7 3 33275 4 Gikalo M B Nosoca E Y Krylova L Y Moroz A M The role of eis mutations in the development of kanamycin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from the Moscow region J Antimicrob Chemother 2012 67 9 2017 2109 5 Johnson R Streicher E M Louw E Warren M van Helden P D and Victor T C Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis Curr Issues Mol Biol 2006 8 2 97 111 6 Maus C E Plikaytis B B and Shinnick T M Molecular analysis of cross resistance to capreomycin kanamycin amikacin and viomycin in Mycobacterium tuberculosis Antimicrob Agents Chemother 2005 49 8 3192 3197 7 Medappa and Srivastava V K What is new in the diagnosis of tuberculosis ICMR Bulletin 2002 32 8 Merza M Masjedi M R Extensively drug resistant tuberculosis XDR and extremely drug resistant tuberculosis XXDR risk factors and molecular perspectives Iranian J Clin Infect Dis 2010 5 3 174 188 9 Migliori B Dheda K Centis R Mwaba P Bates M O Grady J Hoelscher M and Zumla A Review of multidrug resistant and extensively drug resistant TB global perspectives with a focus on sub Saharan
7. Vortex durante 30 segundos e Cierre la tapa del tubo con un tap n de bloqueo y deje hervir durante 20 minutos bloque de calentamiento e centrifuga a 15 000 13 000 rpm durante 5 minutos e Use 5 ul del sobrenadante como molde de PCR Medio L quido MGIT e Transferir 0 5 ml del cultivo de la parte inferior a un tubo de microcentrifuga de 1 5 ml e centrifuga a 15 000 13 000 rpm durante 5 minutos e Eliminar el sobrenadante y a adir 200 ul de soluci n de extracci n de ADN al pellet e Mezclar en Vortex durante 30 segundos e Cierre la tapa del tubo con un tap n de bloqueo y dejar hervir durante 20 minutos en bloque de calentamiento e Secentrifuga a 15 000 13 000 rpm durante 5 minutos e Use 5 ul del sobrenadante como molde de PCR 4 Preparaci n para la PCR en tiempo real Nota Los tubos y las tapas correctas deben ser utilizados ver Materiales necesarios pero no proporcionados Nota Use puntas con filtro y guantes ajustados para la preparaci n de muestras Utilizar con cuidado extremo para asegurar que no se presente contaminaci n cruzada Nota descongelar completamente los reactivos en hielo Nota Centrifugar los tubos de reactivos para retirar las gotas de la tapa interior C2 Seegene Nota Cada muestra sera probado simultaneamente en dos reacciones separadas MDR MTB XDR A Preparacion de la Mezcla Maestra 5 ul 4X MTB MDR TOM o 4X MTB XDR TOM 5 ul 4X Anyplex PCR Ma
8. centrifuga a 15 000 13 000 rpm durante 5 minutos y se desecha el sobrenadante con pipeta Tejido fresco e cortar o macerar muestra de tejido en un recipiente est ril e Suspender con 1 ml de PBS 1X e Se centrifuga a 15 000 13 000 rpm durante 5 minutos y se desecha el sobrenadante con pipeta Lavado bronquial e Sin a adir NALC NaOH centrifugar 1 5 ml de la muestra a 15 000 13 000 rpm durante 5 minutos e Desechar el sobrenadante a adir 1 ml de soluci n PBS 1X y mezclar bien e Secentrifuga a 15 000 13 000 rpm durante 5 minutos y se desecha el sobrenadante con pipeta 3 Extracci n de cidos nucleicos La Soluci n de Extracci n de ADN est incluida en el kit de detecci n Anyplex II MTB MDR XDR Seegene Todas las muestras excepto muestras de cultivo Opcional Agregue 1 de agua est ril para la preparaci n de sedimentos centrifugar 15 000 13 000 rpm durante 5 minutos y desechar el sobrenadante con una pipeta e A adir 100 de soluci n de extracci n de ADN a los sedimentos y de v rtice durante 30 segundos e Cierre la tapa del tubo con un tap n de bloqueo y dejar hervir durante 20 minutos en bloque de calentamiento e centrifuga a 15 000 13 000 rpm durante 5 minutos e Use 5 del sobrenadante como molde de PCR Medio de Cultivo S lido e Suspender una colonia con 200 ul de soluci n de extracci n de ADN en un tubo de microcentrifuga de 1 5 ml e Mezcle en
9. cerrados como inodoros e Lavar la boca con agua pero no cepillarse los dientes antes de recoger el esputo Los pacientes deben toser profundamente para expectorar esputo directamente en el recipiente e Una muestra de esputo debe tener un volumen de 3 5 ml Cultivos S lidos Ogawa e Las muestras pueden analizarse tan pronto como el crecimiento sea visible y durante los siguientes 60 d as de incubaci n e Las colonias se pueden recoger con un asa pl stica desechable o aguja Evite tomar medio Medio l quido MGIT e Los tubos indicadores de crecimiento de micobacterias MGITs se examinan con luz UV diariamente para observar fluorescencia naranja brillante en el fondo del tubo que se refleja en el menisco Una vez se observe esta se al positiva se pipetea 500 ul del medio tomados de la parte inferior del tubo Tejido fresco e Cualquier tejido a ensayar se deben recoger as pticamente en un contenedor est ril sin fijadores ni conservantes No coloque muestra de tejido en formalina e Si se seca el esp cimen agregar soluci n salina est ril para mantener la humedad Mantener refrigerado hasta su traslado Lavado bronquial e El Lavado bronquial debe ser as pticamente recogido en un recipiente est ril por el m dico utilizando t cnicas de aspiraci n o procedimientos quir rgicos B Almacenamiento de muestras La sensibilidad de un ensayo puede disminuir si se congela y descongela repetidamente las muestras o
10. la etiqueta Se debe evitar la descongelaci n y congelaci n ya que esto puede reducir la sensibilidad Si los reactivos se van a utilizar en forma intermitente deben ser congelados en al cuotas Seegene MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVISTOS NALC NaOH 0 5 NALC 2 NaOH y 1 47 trisodium citrate o 4 NaOH 1 N NaOH e PBS 1X pH 8 0 e guantes desechable libres de polvo de l tex o nitrilo e Pipetas ajustable y puntas de pipeta est riles e Tubos de microcentr fuga de 1 5 ml e Kit de aislamiento de cido nucleico ver aislamiento del cido nucleico e Ice Maker e Centr fuga de mesa e Vortex mezclador e Sistema CFX96TM PCR en tiempo real Bio Rad e Tapas en tira pticas planas x 8 Cat No 50803 Bio Rad e Tiras de 8 tubos sin tapas color blanco ref 150851 Bio Rad Plato de 96 pozos para PCR blanco art HSP 9655 Bio Rad PROTOCOLO TOMA DE MUESTRA ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE Nota Todas las muestras tienen que ser tratadas como materiales potencialmente infecciosos S lo las muestras que sean recogidas transportadas y almacenadas y atiendan estrictamente las siguientes normas e instrucciones ser n permitidas A Toma de Muestra Esputo C2 Seegene e Dar instrucciones claras a los pacientes cuando tomen muestras de esputo Los pacientes deben recoger muestras bien fuera en el aire libre o lejos de otras personas Los pacientes no deben recoger estas muestras en espacios
11. nucleico del pat geno verificar el control interno diluya la muestra en control interno PBX 10 100X y repita el paso de extracci n con la muestra diluida Presencia de inhibidores de Diluya la muestra en PBS 10 100X y repita el PCR paso de extracci n Descontamine todas las superficies e instrumentos con hipoclorito de sodio y etanol Falsos positivos o 2222 Use solo puntas con filtro durante el Presencia de contaminacion ME M senal observada mex procedimiento de extracci n Cambie puntas control negativo i entre tubos Repita el procedimiento de extracci n de cidos nucleicos con un nuevo set de reactivos Toma de muestra Tome una nueva muestra Incorrecta Falso negativo o no se observa se al en los controles positivos Almacenamiento Tome una nueva muestra y repita el inapropiado de las procedimiento completo Asegure que la muestra muestras sea almacenada en las condiciones apropiadas C Seegene ANYPLEX MTB MDR XDR DETECCION OBSERVACION CAUSA PROBABLE SOLUCI N Error en la extracci n de E T 2 Repita la extracci n del cido nucleico cido nucleico Error en la adici n del cido Falso negativo o no se al tubo de PCR observa se al los correspondiente controles positivos Diluya la muestra en PBS 10 100X y repita el Presencia de inhibidores y M l y paso de extraccion con la muestra diluida Intercambio de muestras d
12. resultado es obtenido refi rase a los resultados de otros m todos diagn sticos 2 Larepetici n de ensayos se debe realizar con el ADN diluido de 1 10 a 1 100 3 2 Reacci n MTB XDR C2 Seegene Resultados FQ R Inj drug R Interpretacion uasar6 0 FAM HEX Red 610 1 Larepetici n de ensayos se deber a realizar con el ADN original Si el mismo resultado es FQ R amp Inj drug R detectada FQ R detectada Inj drug R detectada aj 1 Invalido MTB no detectado inv lido 41 Invalido 4 obtenido refi rase a los resultados de otros m todos diagn sticos 2 Larepetici n de ensayos se debe realizar con el ADN diluido de 1 10 a 1 100 4 Aplicaci n a muestras cl nicas Seegene Muestra 1 Reacci n MTB MDR FAM Cal Hed 510 Quasar 6 A AFA T Reacci n MTB XDR Well Into Melt Fesk HES Red 610 Quasar 670 FAM HEX Cal Red 610 Quasar 6 0 di RFU AT Muestra 2 C Seegene Reacci n MTB MDR Well inta Pook raa Cal Med El 310 FAM 180 HEX 2 uU Cal Red 610 hl _ o uasar Em Bl 7 m o ETT Auto interpretation _ MO 2 Reacci n MTB XDR Well Into Peak Red Quesar ETO 400 p IN 300 F
13. si se almacenan por largos periodos de tiempo Mantenga las muestras refrigeradas a 4 C durante hasta 72 horas antes del procesamiento Guarde las muestras restantes lt 70 C C Transporte de muestras Para garantizar una alta calidad de la muestra se deben ser transportadas tan pronto como sea posible en la temperatura indicada Seegene e Empaque las muestras cuidadosamente para evitar fugas y roturas e Las muestras deben ser transportados en fr o e Las muestras deben enviarse al laboratorio tan pronto como sea posible despu s de su recolecci n de acuerdo a las instrucciones de laboratorio para el transporte Las muestras deben ser tambi n transportadas seg n las disposiciones locales y nacionales para el transporte de materiales pat genos 2 Tratamiento previo de las muestras de esputo e A adir un volumen igual de NALC NaOH 0 5 de NALC 2 de NaOH y 1 47 de citrato tris dico a la muestra en el recipiente de esputo y agitar durante 1 minuto Nota 4 de NaOH 1 NaOH se puede utilizar en lugar de NALC NaOH e Se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente e Transferir 1 5 ml a un tubo nuevo est ril y se centrifuga a 15 000 x g 13 000 rpm durante 5 minutos e Descartar el sobrenadante a adir 1 ml de soluci n PBS 1X y mezclar bien e Se centrifuga a 15 000 x g 13 000 rpm durante 5 minutos y se desecha el sobrenadante con pipeta e A adir 1 ml de 1X soluci n de PBS y mezclar bien e Se
14. tales como ensayos multiplex moleculares y ensayos para la detecci n de mutaciones puntuales es una nueva tecnolog a para el tiempo real de lectura que se basa en el an lisis de temperatura de fusi n Hasta ahora los an lisis de temperaturas de fusi n se han visto limitados por varias causas inherentes es decir diseno restringido de las sondas la incapacidad de realizar detecciones multiples de mayor numero de blancos de manera eficiente y la alta sensibilidad de las temperaturas de fusi n debido a la variaci n de la secuencia de la sonda La tecnolog a supera estas limitaciones al aumentar la capacidad multiplex del ensayo mejorando la flexibilidad en el dise o de la sonda proporcionando una lectura que es independiente de la variaci n de la secuencia diana y la compatibilidad entre plataformas La combinaci n de las tecnolog as y permite la detecci n simult nea en tiempo real de mutaciones puntuales multiples con alta especificidad El kit Anyplex I MTB MDR XDR Detection es una prueba multiplex en PCR por tiempo real que permite la amplificaci n simult nea y la detecci n de secuencias diana de Mycobacterium tuberculosis MTB 7 mutaciones que causan resistencia isoniacida INH katG S315i ATC S315N AAC S315T ACC S315T ACA inhA promotor 15 T 8 A 8 C 18 mutaciones que causan resistencia a rifampicina RIF rpoB L511P CCG Q513K AAA Q513L CTA
15. vitro N mero de Lote Numero de cat logo Fecha de vencimiento Temperatura de Almacenamiento Precauci n Mezcla de oligonucleotidos para amplificaci n y detecci n Agua libre de Rnasas CONTROL Control Positivo Control tipo silvetre Mezcla Maestra para PCR Anyplex Fabricante Fecha de fabricaci n Consulte instrucciones de uso Seegene INSTRUMENTO PARA PCR EN TIEMPO REAL CONFIGURACION Y ANALISIS DE RESULTADOS 1 Sistema PCR en tiempo real CFX 96 BioRad 1 1 Instalaci n Instrumento para PCR en tiempo real CFX 96 Nota para el an lisis de datos simple en el Visor de Seegene ponga los tubos de reacci n MTB en la columna 1 6 en el bloque y los tubos de reacci n MTB XDR en la columna 7 12 en el bloque Nota La Configuraci n del programa para la detecci n MTB INH R RIF R FQ R R f rmaco inyectable y IC se puede dividir en tres pasos configuraci n del protocolo configuraci n de la placa y ejecuci n A Configuraci n del Protocolo En el menu principal haga click en protocolo para abrir la configuraci n del ensayo Figura 1 Configuraci n del protocolo Crear un nuevo protocolo o cargar un protocolo existente para el experimento 2 En el editor del protocolo defina el perfil t rmico como sigue Seegene Segment No of cycles Temperature 1 1 95 C 2 95 C 3 50 60 C 4 2 5 1 55 C Duration 15 min 30 sec 1 min 30 sec 30 sec Melting curve 55
16. AM E LN B ca I x Inj Drug Rz HEX T FOON AON u 100 2 X A Cal Red j M NU M _ Quasar 58 B 6 Et 4 fH A Gd E H Temp KAK o ros ue mem ee e NETA PICO ECT CI CT Muestra 3 Seegene Reacci n MTB MDR Well Int Mali Peak FAM HEX Cal Red 610 Quasar El PA 1 FAM 3 0 HEX 180 eel Cal Red 610 T E A 120 UK Quasar Bl 1 DO Te _ 5 El B B Y T2 fh 5 Hi H Temp Reacci n MTB XDR Wall nio Mah Peak FAM HEX Cal Rad BIO Quasar B70 3H r _ 10 4 1 M HEX n E a CU Cal fed BIO Tum df AL Y asar bil Muestra 4 C Seegene Reacci n MTB MDR Well Inda Hall Peak FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 n e FAM HEX z M Cal Red 10 T m X Quasar EFI rt E R M m B Y fe T di Temp Cal Red 610 Quasar 610 Ic 35 ER EI 4 HEX A o 180 f x Ca Red a i 141 XY _ Bill B rnt n p NE A RENE QUEE GENE Haier zucca saxum Seas meer 58 El 12 M 1b xl We
17. Africa Trop Med Int Health 2010 15 9 1052 1066 10 Qi Y C Ma M J Li D J Chen M J Lu Q B Li X J Li J L Liu W and Cao W C Multidrug resistant and extensively drug resistant tuberculosis in multi ethnic region Xinjiang Uygur Autonomous region China PLoS ONE 2012 7 2 e32103 11 Santos L C Review the molecular basis of resistance in Mycobacterium tuberculosis J Med Microbiol 2012 2 1 24 36 12 Yuan X Zhang T Kawakami K Zhu J Li H Lei J and Tu S Molecular characterization of multidrug and extensively drug resistant Mycobacterium tuberculosis strains in Jiangxi China J Clin Microbiol 2012 50 7 2403 2413 13 World Health Organization Global tuberculosis control WHO Report 2011 WHO HTM TB 201 1 16 14 World Health Organization Towards universal access to diagnosis and treatment of multidrug resistant and extensively drug resistant tuberculosis by 2015 WHO Progress Report 2011 WHO HTM TB 2011 3 Seegene EXPLICACION DE SIMBOLOS Explicaci n de s mbolos usados en la etiqueta y en el manual Explicacion Para Diagnostico in vitro Numero de Lote Numero de catalogo Fecha de vencimiento Temperatura de Almacenamiento Precauci n Mezcla de oligonucleotidos para amplificaci n y detecci n Agua libre de Rnasas Control Positivo Control tipo silwetre Mezcla Maestra para PCR Anyplex Fabricante Fecha de fabricaci n Consulte instrucci
18. C2 Seegene ANYPLEX II Detecci n de MTB MDR XDR Sistema PCR Multiplex para la detecci n simult nea de Mycobacterium tuberculosis y su resistencia ante drogas antituberculosas de primera l nea isoniacida y rifampicina y segunda l nea fluoroquinolonas y drogas inyectables basados en el an lisis de temperaturas de fusi n Para usar con el termociclador de tiempo real CFX96 de Bio Rad TABLA DE CONTENIDO Notas Prop sito de Uso Resumen principio de la prueba y procedimiento Informaci n General Reactivos Almacenamiento y manejo Materiales requeridos pero no provistos Protocolo Configuraci n del equipo de PCR en tiempo real y an lisis de datos Soluci n de Problemas Rendimiento Referencias Explicaci n de S mbolos Informaci n para pedidos C2 Seegene NOTAS Este producto es para uso en diagnostico in vitro IVD Esta prueba ha sido validada para los siguientes tipos de muestras Escobillones cervicales y muestras de citologia liquida Esta prueba no ha sido validada en otros tipos de muestras Almacene las muestras de ADN a 70 C y mantenga en hielo mientras las usa La sensibilidad de un ensayo puede decrecer si se congela y descongela repetidamente las muestras y se almacenan por un largo periodo de tiempo La confiabilidad de los resultados depende de la adecuada toma de muestra del transporte almacenamiento y ejecuci n del procedimiento El flujo de trabajo en el laboratorio debe proceder unidi
19. Q513P CCA 3 amino cidos supresi n en 513 516 D516V GTC D516Y TAC 55221 TTG 55220 CAG H526C TGC H526D GAC H526L CTC H526N H526R CGC H526Y 55311 TTG S531W TGG L533P CCG 7 mutaciones que causan C2 Seegene resistencia fluoroquinolonas FQ gyrA 9 S91P CCG D94A GCC D94G GGC D94H D94N AAC D94Y TAC 6 mutaciones que causan resistencia a drogas inyectables RR 1401 G 1402 T 1484 T promotor eis 37 T 14 T 10 A y el control interno IC El kit Anyplex II MTB MDR XDR Detection incluye un Control Interno que se agrega para comprobar las muestras procesadas y verificar que contengan sustancias que pueden interferir con la amplificaci n por PCR La especificidad de los oligos utilizados para detectar las mutaciones en el kit Anyplex MTB I MDR XDR Detection se puede confirmar por el control tipo silvestre de control WTC Este control est dise ado para mostrar el mismo patr n de muestras de M tuberculosis susceptibles a drogas La reacci n del control tipo silvestre se debe siempre realizar en cada corrida y el resultado de las muestras desconocidas se analiza sobre la base del resultado de este control El sistema UDG uracil DNA glycosilasa UDG dUTP se emplea en el kit Anyplex I MTB MDR XDR Detection Este sistema se utiliza com nmente cuando se realiza PCR para eliminar la contaminaci n po
20. aparte de los reactivos del kit Los procedimientos de seguridad en el laboratorio se deben tener en cuenta para manipular las muestras Limpie y desinfecte a fondo todas la superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 0 596 en agua desionizada o destilada C2 Seegene PROPOSITO DE USO El kit Anyplex II MTB MDR XDR para la detecci n simult nea de Mycobacterium tuberculosis y su resistencia ante drogas antituberculosas de primera l nea isoniacida y rifampicina y segunda l nea fluoroquinolonas y drogas inyectables en esputo cultivo tejido fresco o lavados broncos alveolares de pacientes sintom ticos Cubre 7 mutaciones que causan resistencia a Isoniacida en el gen KatG y en la regi n promotora inhA 18 mutaciones que causan resistencia a Rifampicina en el gen rpoB 7 mutaciones que causan resistencia a fluoroquinilonas en el gen gyrA y 6 mutaciones que causan resistencia a drogas inyectables en el gen rrs y en la regi n promotora eis PRINCIPIO Y PROCEDIMIENTO 1 Principio Seegene tiene dos tecnolog as patentadas relacionadas con PCR Dual Priming Oligonucleotide y la tecnolog a TOCE La tecnolog a es una herramienta fundamental para bloquear la amplificaci n ni espec fica de la plantillas permitiendo que el disefio y desarrollo de ensayos que tengan una alta especificidad La fuerza y la utilidad de la tecnolog a DPO puede ser incorporada con xito en los sistemas de diagn stico molecular
21. are also detected Q513N CAA AAT D518F GAC TTC D518V GAC GTG H526F CAC TTC CAC GGC H528L CAC CTG H528L CAC CTT H5265 CAC AGC and H528T H526G C2 Seegene REACTIVOS Los reactivos que contiene el kit son suficientes para 50 reacciones Informaci n para el pedido del Kit Anyplex Il Detecci n MTB MDR XDR Cat logo TB7500Y SIMBOLO CONTENIDO VOLUMEN DESCRIPCION TOCE Oligo Mix TOM 4X MTB MDR TOM 250UL Reactivo para la amplificaci n y detecci n de MTB Y MDR TOCE Oligo Mix TOM 4X MTB XDR TOM 250UL Reactivo para la amplificaci n y detecci n de MTB Y XDR PCR Master Mix 250ulx2 UDG Uracil DNA Glicolasa con UDG Tamp n conteniendo dNTPS Control Positivo CONTROL MTB MDR XDR PC 100 ul Mezcal de clones y blancos positivos y control interno MTB MDR XDR 100 ul CONTROL w WTC Mezcal de clones de MTB tipo silvestre y control interno Ultrapura Grado PCR Agua libre de 1000 ul Control negativo Agua DNA RNasas esterilizada como control negativo Anyplex Soluci n de Reactivo para la extracci n de Extracci n de ADN ADN bacteriano Manual de usuario Anyplex Il es una marca comercial de Seegene ALMACENAMIENTO Y MANEJO Los componentes del kit de detecci n Anyplex II MTB MDR XDR deben almacenarse a 20 C Todos los componentes son estables en condiciones de almacenamiento recomendadas hasta la fecha de caducidad que aparece en
22. cada mutaci n resistente a los f rmacos diana se amplifica y es detectado espec ficamente por los oligos correspondientes dentro de 3 horas mediante la aplicaci n de las tecnolog as DPO y TOCE de Seegene sin necesidad de realizar otro procedimiento posterior adicional Las mutaciones blanco del kit Anyplex Il Detecci n de MTB MDR XDR se resumen en la siguiente tabla C Seegene Mutaciones blanco del Anyplex Il MTB MDR XDR Detection oe Mutaciones Blanco Droga Relacionado Isoniazid 53151 531514 5315 5315 resistance AGC ATC AGC AAC AGC ACC 15 B 5 promoter C T T A TC Rifampicin rpo L511P 0513K 2513L 513P resistance CTG CCG CAA AAA CAA CTA CAA CCA 3 a a deleti D516V D516Y 2522L in 513 516 GAC GTC GAC TAC TCG TTG 55220 H526C H526D H526L TCG CAG CAC TGC CACOGAC CAC CTC H525N H525R H5265 Y 5531L CAC AAC CAC TAC TCG TTG 5531W L533P TCG TGG CTG CCG Fluoroquinolone gyrA ASDV 581P D944 0946 resistance GCG GTG GAC GCC GAC GGC D84H DS4N D84Y GAC CAC GAC AAC Injectable drug ms 1401 1402 1484 resistance A G G T Inj drug F amp ES eis 37 14 10 promoter G T C T G A Additional nine mutations with the same mutation at the same base underlined
23. e a Cuidadosamente repita la prueba cidos nucleicos El control tipo silvestre no Seleccione los fluoroforos correctos para an lisis es identificado de datos El mensaje de error se muestra en los siguientes casos i valor de la altura del pico de fusi n superior al m ximo valor umbral fijado en los canales HEX y o Cal Red 610 ii valor de la altura del pico de fusi n es inferior al valor umbral fijado en los canales FAM y o Quasar 670 El caso i se debe a contaminaci n de reactivos o espacios verifique si hubo contaminaci n El caso ii puede ocurrir por error en la preparaci n de la mezcla de reacci n o en la configuraci n del termociclador y por al almacenamiento incorrecto del kit por favor repita cuidadosamente la prueba y chequee las condiciones de almacenamiento Cuidadosamente repita la prueba Mensaje de error en el visor de Seegene El resultado de la prueba del control tipo silvestre es anormal Seegene REFERENCIAS 1 Chun J Y Kim K J Hwang I T Kim Y J Lee D H and Lee I K Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene Nucleic Acids Res 2007 35 e40 2 Da Silva P E A and Palomino J C Molecular basis and mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis classical and new drugs J Antimicrob Chemother 2011 66 1417 1430 3 Georghiou S B Magana M
24. el resultado haya sido guardado en el archivo Fu Onis SLIDES nm ur UNTIL PE 221 11 peni al E Be Sete 5l 14 E NL FJ NIT 4 Pl ie raa EE Hat ven cuna roten npe nai E SARA EST ER Q i M 31 a HART IR De Angie AU gy ar ij ua ER EM ig Wore wg LL 554 ETA Mn fn D epis IM HET n n erect i o nene a i I HAT BT PA em GU FETPAT AA A sd 6 00 28 JE cH LE Exa Uai s esa x mm hil HEH Mi Tage Fricke FR Fig 13 Archivos de resultados exportados B Ajustes para an lisis de datos el visor de Seegene C Seegene 1 Abra el programa Visor de Seegene en la pantalla y haga click en abrir para encontrar el archivo guardado lis IET ETE E 3 3 8 1 B Aum app D polos TEE Ch T Gk ee 14 1 PAL potes RE 14 s m
25. es sintom ticos es la piedra angular de las estrategias para el control mundial de la tuberculosis La tuberculosis activa se diagnostica actualmente por un total de evaluaci n de los s ntomas los signos cl nicos y los resultados de las pruebas Los m todos de diagn stico de prueba para tuberculosis incluyen la radiograf a de t rax rayos microscop a tinci n de bacilos cido alcohol resistentes BAAR el cultivo y el diagn stico C2 Seegene molecular Junto al cultivo como la t cnica de referencia los m todos de diagnostico molecular basados en PCR son ampliamente utilizados para el diagn stico precoz de la tuberculosis La detecci n de resistencia a los medicamentos antes de iniciar una quimioterapia inapropiada rescata la morbilidad mortalidad los costos econ micos y el tratamiento innecesario con medicamentos ineficaces Los m todos de rutina para las pruebas de susceptibilidad a f rmacos DST t cnica de referencia para el diagn stico de resistencia a los medicamentos anti tuberculosos son lentos y poco habituales en entornos con recursos limitados El hecho de que a menudo toma varias semanas obtener un resultado retrasa la instauraci n de un tratamiento eficaz lo que ha aumentado el riesgo que cepas de M tuberculosis resistentes a drogas se transmitan a los contactos Adem s los pacientes pueden recibir terapia inadecuada que amplifica m s la resistencia y compromete la probabilidad de un resultado ex
26. iB Scan Mode Ali Charnes e dto 7 Plate Loading Gode Plate BA Oe Fig 5 seleccionar fluoroforo FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 and Quasar 705 Escoja el pozo adecuado y haga click en tipo de muestra del menu desplegable Desconocido Muestra cl nica y control tipo silvestre Control Positivo Control negativo 4 Escoja las apropiadas casillas de verificaci n para especificar el fluoroforo en los pozos seleccionados 5 Digite el nombre de la muestra y el control PC1 PC2 PC3 y presione la tecla enter Nota En los casos del control tipo silvestre se debe digitar el nombre correcto MWTC para la reacci n MTB MR o XWTC para la reacci n MTB XDR 6 En ajustes del menu principal del editor de plato escoja tama o de plato y tipo de plato Yee la Wesew 0 9 go rer carry Ve Roe Tepe TT aw Peewee 5 50 SELE 4 we ELLA PEN lee Fig 6 Configuracion de plato C Seegene 7 Haga click en OK y guarde en un nuevo archivo de configuraci n de plato 8 La ventana de configuraci n de experimento se abrir r wee D int 9 Drs Ld lem au 01740 8 RN ber Figura 7 Configuraci n de plato del experimento C INICIAR CORRIDO 1 En experimento iniciar corrido de la configuraci
27. itoso del tratamiento Por lo tanto el diagn stico preciso r pido y sencillo es necesario para una detecci n eficaz y proporcionar una ayuda util para un tratamiento cl nico adecuado en la lucha mundial contra la tuberculosis Los recientes avances en DST fenot pica incluyen el uso de indicadores de crecimiento de micobacterias y los ensayos basados en fagos Aunque estos m todos son capaces de informar la resistencia fenot pica en 2 a 10 d as el cultivo de microrganismos viables de M tuberculosis viables plantea un riesgo de salud para el personal de laboratorio por lo que requiere altos niveles de bioseguridad Para superar estas limitaciones y para mejorar la velocidad de detecci n de resistencia a los medicamentos numerosos m todos basados en PCR han sido reportados Sin embargo el n mero de diferentes polimorfismos de nucle tidos simples no sin nimos nsSNPs que confieren resistencia sigue siendo un desaf o importante para el desarrollo exitoso de m todos de genotipificaci n Adem s muchos de estos m todos basados en la PCR se ven obstaculizados por la necesidad para el procesamiento posterior para permitir la detecci n de nsSNPs dentro del dominio amplificado por PCR Por ejemplo hibridaci n con oligonucle tidos inmovilizados microarreglos dot blot hibridaci n desnaturalizaci n cromatograf a l quida de alto rendimiento y la secuenciaci n del ADN En el kit Anyplex I Detecci n de MTB MDR
28. medicamentos Cuando una persona con tuberculosis infectada se identifica el tratamiento con medicamentos anti tuberculosos debe comenzarse El m s com n de los medicamentos antituberculosos de primera l nea son isoniacida rifampicina pirazinamida y etambutol Las cepas que son resistentes a una sola droga se han documentado en todos los pa ses estudiados lo que es m s han venido surgiendo cepas de M tuberculosis resistentes a todos los principales medicamentos antituberculosos Una forma particularmente peligrosa de la tuberculosis farmacorresistente es la tuberculosis multirresistente MDR TB que se define como la enfermedad causada por M tuberculosis resistente a por lo menos a dos de los m s eficaces y com nmente usados medicamentos contra la tuberculosis la isoniacida y la rifampicina MDR TB est presente en pr cticamente todos pa ses estudiados por la Organizaci n Mundial de la Salud OMS La tuberculosis ampliamente resistente a los medicamentos XDR TB es un tipo relativamente raro de multiresistencia presenta resistencia a la isoniacida la rifampicina m s resistencia a cualquier fluoroquinolona y al menos uno de tres medicamentos inyectables de segunda l nea amikacina kanamicina y capreomicina En julio de 2010 58 pa ses y territorios informaron al menos un caso de XDR TB 3 El diagn stico de la tuberculosis y la tuberculosis resistente a los medicamentos El diagn stico r pido y preciso de los pacient
29. n del experimento hacer click en cerrar tapa para cerrar la tapa f Yee Lee Ime de 5 0418 fu Sew Mote Shee Puri oe npe y paramos EEUU Pe 1615 AONO GRA Fig 8 Cerrar la tapa 1 Hacer click en iniciar corrido C Seegene 2 Almacene el archivo de corrido en mis documentos en el folder designado llene el nombre del archivo haga click en guardar y entonces la maquina iniciar 1 2 An lisis de datos A Pre ajustes en el CFX 96 para an lisis de datos 1 Despu s del ensayo haga click en el campo curva de fusi n para confirmar los resultados de los picos de fusi n lA ERHEEFH Ta ype Hd kd EAD peri Ele ew Henge Jone EU 8 ES ell Groun A1 Walls ler lun B cabo um arduo Dato Cun lel Cans ala ail ul End Dori mano E P n did iud cas Moa Cerra IFAW E HE El Cab 7 usse 7D Cnm 3 mee 5 Quasar irl inkn DA Bari 5 Queer HF linkr SDA Fam Quitar GUAR 51 00 6 Linn PLA Bici 64 50 Quasar 67 Lirdor DA Basi 5 ni Quasar GF Link DA Bani ri Uuszar DA Esai 57 DU B7 Linkin DA 51 00 Quezar GF Linkin FDH Baa 54 5n Quasar 67 Hop Cin 5a nl Distar CH 52 00 I a Tnm pna p Seegene Fig 9 Resultados Picos de fusion 2 Seleccione sol
30. o Quasar 670 la franja umbral debe ser ajustada a cero ON EH TS ee A GFRGA SUE g Ble Belings Took E 0 yere nie Group Wells OTA Cunen ss Lus mar sence 0 Laden Unk bTUnkn HEA ET Unkn Pup Cuuia Unki MOR FADE as ET Unkn MDA Ase bTUnkn MEA lag mer El Unk aba Unb HDA Age Daea ET Uinkn MOR Age Curr BT MDF As ot iim F Combed O O Scan Mode Al Chamel Plato Type OF White Dageing Subiracipd Curae Fig 10 Pico de fusion umbra de Quasar 670 3 Haga click sobre Step number 7 y seleccione exportar todas las hojas de datos a Excel de herramientas del menu Eeria ME S LL DNE uri i aaa Dass ns Fab Cura ici He Cursus udi erm aperiens UL sic Donic leu irs 21 Beet zn Bagi Scan Roce AB Channel Globe reir EE I Bra p Be ges ER erwin Eu al Ala epee gampr dena Kies a Come 3 aue 2 PP g HEX Uni DR Heat RT i HEX Linki DR Bast pu AID HEX
31. ones de uso Seegene INFORMACION PARA PEDIDOS Producto Presentacion Anyplex Il TB series TB7500Y Anyplex II MTB MDR XDR Detection 50 rans Seeplex TB series TB1110 Y MTB NTM ACE Detection 50 rxns TB2110Y MTB Nested ACE Detection 50 rxns 100 Detection 50 rans System ST105 D512 ScreenTape 16 lane tape 112 51214 screen Tape Loading Tips 16 lane tape 3 840 tips pack Anyplex TB series TB7200X Anyplex MTB NTM Real time Detection 100 rxns Note 8D rens for SmartCycler ll System plus TB series TBP7200X Anyplex plus MTB NTM Detection 100 rxns TBP7201Z Anyplex plus MDR TB Detection 25
32. r el arrastre ya que la UDG elimina residuos de uracilo del ADN por escisi n del enlace Nglycosilico 2 PROCEDIMIENTO Muestra Esputo cultivo tejido fresco o lavado bronquial Aislamiento del cido nucleico Pd Acido nucleico Amplificaci n y detecci n simult nea usando el sistema Anyplex II MTB MDR XDR An lisis de resultados C2 Seegene INFORMACION GENERAL 1 Tuberculosis La tuberculosis es una enfermedad infecciosa bacteriana causada por Mycobacterium tuberculosis es conocida por transmitirse a trav s del aire Cuando las personas infectadas tosen escupen hablan los organismos de M tuberculosis se dispersan el aire S lo un peque o numero de M tuberculosis es suficiente para causar una infecci n cuando se inhala Sin embargo no todas las personas infectadas con el M tuberculosis se enferman el sistema inmunitario mata o limita a los g rmenes en donde pueden permanecer latentes durante anos El fallo del sistema inmune para controlar la infecci n con M tuberculosis conduce a la enfermedad activa Tuberculosis y s ndrome de inmunodeficiencia adquirida SIDA constituyen una combinaci n letal El SIDA debilita el sistema inmunol gico Una persona que es positiva para el VIH y est infectada con M tuberculosis tiene muchas m s probabilidades de enfermar de tuberculosis que alguien que es VIH negativo e infectada con M tuberculosis 2 La tuberculosis resistente a los
33. reccionalmente Siempre use guantes desechables en cada rea y c mbielos antes de entrar en diferentes reas Cambie los guantes inmediatamente si estos se contaminan o tr telos con un reactivo descontaminante de ADN Dedique consumibles y equipo a cada rea de trabajo y los mueva de un rea a otra No pipetee con la boca No coma beba o fume en el laboratorio Use guantes libres de polvo batas de laboratorio y gafas de protecci n cuando manipule muestras y reactivos Lave sus manos vigorosamente despu s de manipular reactivos y muestras Evite contaminaci n cuando tome al cuotas de los reactivos Se recomienda el uso el uso de puntas desechables est riles resistentes a aerosoles No mezclar reactivos de diferentes lotes o de diferentes tubos del mismo lote No use el producto despu s de su fecha de expiraci n Use tubos tapa rosca y evite cualquier tipo de contaminaci n cruzada de las muestras durante las preparaciones Por favor tenga cuidado de no contaminar las muestras con ADN extra do productos de PCR controles positivos Para prevenir la contaminaci n de las muestras se recomienda el uso de puntas con filtro Use reas separadas para cada experimento Use un set diferente de pipetas para cada rea extracci n de ADN mezcla de reactivos y post PCR Despu s de la amplificaci n abra los tubos o tiras de reacci n en la zona de post PCR para evitar contaminaci n con amplicones Almacene el material positivo
34. ster Mix con UDG 5 ul Agua libre de Rnasa 15 ul Volumen total de Mezcla Maestra PCR Nota Calcular la cantidad necesaria de cada reactivo basandose en el numero de reacciones muestras y controles B Mezclar por inversion 5 veces por vortex r pido y centrifugar brevemente C Al cuota 15 ul de la mezcla maestra de PCR en tubos PCR y cerrar las tapas D A adir 5 ul de cidos nucleicos de cada muestra con el tubo 15 ul Mezcla maestra de PCR 5 ul de Muestra de cido nucleico 20 ul Volumen Total de Reacci n Nota Utilice una nueva punta de pipeta est ril para cada muestra Nota Para el control negativo utilice 5 ul de agua libre RNasas en lugar de cido nucleico Nota Para el control positivo utilice 5 ul de MTB MDR XDR PC en vez de muestra de cido nucleico Nota Para el control tipo silvestre utilice 5 ul de MTB MDR XDR WTC en vez de muestra de cido nucleico Nota La reacci n de control tipo silvestre debe ser siempre realizada cada ejecuci n de las pruebas y el resultado resistente a los f rmacos de muestras desconocidas se analizan sobre la base del resultado del control tipo silvestre Nota Por favor tenga cuidado de generar contaminaci n cruzada de la mezcla maestra de PCR y las muestras con el control positivo Nota En caso del CFX96 no marcar la tapa de los tubos de reacci n ya que la fluorescencia se detecta a trav s de la tapa C Seegene Simbolo Explicaci n Para Diagn stico in
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