UMELISA PSA
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1. INTERES CL NICO El ant geno espec fico de pr stata PSA inicialmente caracterizado por Wang y colaboradores 1 es una glicoprote na de 34 KDa que funciona como una proteasa en el suero m s com nmente localizado en el l quido seminal El PSA es producido por el epitelio prost tico y las c lulas neopl sicas del tejido prost tico humano y aunque se ha localizado tambi n en otros tejidos se considera que su presencia en el suero en concentraciones superiores a 4 ug L 4 ng mL se correlaciona con un riesgo elevado de padecer c ncer de pr stata 2 Estudios realizados han revelado que el PSA presente en el suero se puede encontrar en su forma simple libre y unida al complejo a antiquimiotripsina ACT Es por ello que la determinaci n de PSA en suero resulta de gran inter s Como marcador tumoral El PSA es considerado como un marcador tumoral asociado a enfermedades malignas de la pr stata por lo cual se ha utilizado no s lo para el diagn stico sino tambi n para la vigilancia y seguimiento del tratamiento en pacientes con tumores secretores de PSA 3 FUNDAMENTO DEL ENSAYO El UMELISA PSA es un an lisis inmunoenzim tico heterog neo tipo sandwich que emplea las ventajas de la reacci n de alta afinidad entre la Estreptavidina y la Biotina El ensayo determina PSA Libre y Total sobre una base equimolar Se utiliza como fase s lida tiras de ultramicroELISA 10 uL por pocillo revestidas con anticuerpos monoclonal2. Est ndar Las concentraciones calculadas despu s de la correcci n con el factor de diluci n fueron 9 07 para PSA Total y de 6 03 para PSA Libre de la concentraci n original de la muestra pura 10 Paralelismo del UMELISA PSA Determinacion de PSA Total 3 si 5 5 3 B20 E us E ao E Ez 10 2a DA z 5 ana o c 5 0 g o Pura 1 2 1 4 1 8 1 16 Diluci n de la muestra Determinaci n de PSA Libre ONFMOSO Pura 1 2 1 4 1 8 1 16 Diluci n de la muestra Leyenda A Muestra 1 6 Muestra 2 W Muestra 3 3 DETECTABILIDAD La detectabilidad determinada para PSA Total es de 0 02058 ug L 0 02058 ng mL y para PSA Libre de 0 0529 pg L 0 0529 ng mL Se defini como la concentraci n calculada para la fluorescencia equivalente al Suero Est ndar R2a 2 D E utilizando como referencia el patr n internacional IRP 96 670 de la OMS 4 ESPECIFICIDAD El anticuerpo monoclonal anti PSA CB PSA 4 es altamente espec fico para PSA por lo que no se ha evidenciado interferencia en el ensayo con otras prote nas s ricas Componente Cantidades a adidas de reactividad cruzada AFP 10 000 ng mL ND Ferritina 10 000 ng mL ND HCG 100 000 mUl mL ND PAP 1 000 ng mL ND Prolactina 200 ng mL ND ND no detectable 11 BIBLIOGRAF A 1 John Bernard Henry Diagn stico y tratamiento cl nicos por el laboratorio 9 Edici n Salva
3. concentraci n siguiendo un patr n similar al ejemplificado los valores discordantes son eliminados autom ticamente por el programa II El valor de concentraci n calculado para el Suero Control debe encontrarse en el intervalo establecido para el ensayo lll Si las muestras son analizadas por duplicado deben cumplir la siguiente condici n La diferencia de los valores de fluorescencia de los duplicados de una muestra debe ser menor al 10 con respecto a su valor medio INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS Teniendo en cuenta los diferentes factores gen ticos y ambientales que act an sobre poblaciones de diferentes localizaciones geogr ficas la pr ctica internacional recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia El resultado de la concentraci n de PSA total y PSA libre en suero se expresa en pg L ng mL Si el resultado de una muestra no se encuentra dentro de los l mites de la Curva Est ndar se debe repetir el ensayo diluyendo la muestra apropiadamente con la soluci n de trabajo R1 Se consideran normales las muestras con concentraciones de PSA total menores que 3 7 ug L 3 7 ng mL dudosas con concentraciones de 3 7 a 10 pg L 3 7 a 10 ng mL y positivas si las concentraciones son mayores que 10 ug L 10 ng mL A las muestras dudosas se les determina PSA libre y se establece la relaci n porcentual PSA libre PSA total x 100 EL resultado se expresa en porcentaje si los valores son iguales o menor
4. 22 26 10 Curtis Mettlin et al Relative sensitivity and specificity of serum prostate specific antigen PSA level compared with age referenced PSA PSA density and PSA change Cancer 1994 74 1615 20 11 Tsuneo Kobayashi et al Prospective investigation of tumor markers and risk assessment in early cancer screening Cancer 1991 73 1946 53 Marzo 4 2003 UMELISA PSA C digo UM 2036 Centro de Inmunoensayo Calle 134 y Ave 25 Apdo Postal 6653 La Habana Cuba Tel fono 208 2929 Fax 537 208 6514
5. 7 5 mL R7 Sustrato 1x2 mL R8 Tamp n Sustrato 1x18 mL El lote de las placas recubiertas se muestra en el borde de su envase primario el cual est compuesto por cinco d gitos los cuatro primeros representan la fecha de vencimiento de las placas y el quinto representa un indicador num rico interno del proceso de producci n Calibrado frente al patr n de referencia internacional IRP 96 670 de la O M S Todos los reactivos contienen azida s dica 0 2 g L como preservante Los Sueros Est ndares y el Suero Control fueron negativos a las pruebas de detecci n de anti VIH 1 2 HBsAg Anti VHC y S filis no obstante deben ser manipulados como materiales potencialmente infecciosos Preparaci n de las soluciones de trabajo Para la determinaci n cuantitativa de PSA Total R1 Para 4 tiras de reacci n diluya 2 mL de la soluci n R1 hasta un volumen de 50 mL con agua destilada Mezcle suavemente para evitar la formaci n excesiva de espuma Prepare s lo lo necesario para el ensayo R2 a b c d e y f Reconstituya cada frasco con 0 5 mL de la soluci n de trabajo R1 Permita su completa disoluci n y mezcle R3 Reconstituya con 0 5 mL de la soluci n de trabajo R1 Permita su completa disoluci n y mezcle R4 Listo para el uso Cantidad necesaria por tira 0 2 mL R6 Listo para el uso Cantidad necesaria por tira 0 2 mL R7 Diluya 1 10 con R8 Cantidad necesaria para 4 tiras de reacci n 2 mL 0 2 mL de R7 1 8 mL d
6. 9 77 D R2a1 R2f 6 14 22 30 38 46 54 62 70 78 E R2b R3 7 15 23 31 39 47 55 63 71 79 F R2b R3 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 G R2c 1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 H R2 2 10 18 26 34 42 50 58 66 74 82 Los Sueros Est ndares R2a R2f y el Suero Control R3 deben a adirse de forma manual con una pipeta de precisi n Se recomienda evaluar las muestras por duplicado Si utiliza el programa UMELISA PSA para la interpretaci n autom tica de los resultados debe colocar en las posiciones 1 y 2 la primera muestra en las posiciones 3 y 4 la segunda y as sucesivamente 3 Incubaci n de los Sueros Est ndares el Suero Control y las muestras Incube las tiras de reacci n 30 minutos a 37 C en c mara h meda previamente equilibrada a esa temperatura 4 Lavado Utilice un lavador de la tecnolog a SUMA Lave las tiras de reacci n 4 veces Verifique el llenado total del pocillo con la soluci n R1 de trabajo 25 uL La soluci n debe permanecer como m nimo 30 segundos en los pocillos en cada lavado Despu s de la ltima aspiraci n seque las tiras sobre papel absorbente 5 Adici n de los Anticuerpos Biotinilados Con una punta nueva extraiga del frasco de Anticuerpos Biotinilados el volumen necesario a emplear seg n el n mero de tiras de reacci n utilizadas y depos telo en un recipiente limpi
7. cos Para determinaci n de PSA Total R2a R2b R2c R2d R2e y R2f y para la determinaci n de PSA Libre R2a R2a 1 R2b R2c R2d y R2f Muestras Las muestras se diluyen 1 4 con la soluci n de trabajo R1 al menos 15 minutos antes de transferirlos a las tiras de reacci n 2 Adici n de los Sueros Est ndares el Suero Control y las muestras a las tiras de reacci n A ada 10 uL de los Sueros Est ndares el Suero Control y las muestras de suero a Para la cuantificaci n de PSA Total en muestras de suero 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2 A Rall 3 11 19 27 35 43 51 59 67 75 B Rall 4 12 20 28 36 4 52 6s 76 c f l s Ls lla llalla sls La Lo 7 D R R 6 14 2 30 38 46 54 62 70 78 E ro R3 7 15 3 31 39 47 ss 3 71 7 F Rx R3 8 16 24 32 40 48 56 72 E5o G falli 9 17 25 33 41 9 57 6 a 51 H Real 2 10 18 26 34 2 so ss 74 2 b Para la cuantificaci n de PSA Libre en muestras de suero 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R2a R2d 3 11 19 27 35 43 51 59 67 75 B R2a R2d 4 12 20 28 36 44 52 60 68 76 C R2a1 R2f 5 13 21 29 37 45 53 61 6
8. e R8 Prepare inmediatamente antes de usar Para la determinaci n cuantitativa de PSA Libre R1 R3 y R7 De igual forma que lo descrito para la cuantificaci n de PSA total R2 a a 1 b c d y f Reconstituya cada frasco con 0 5 mL de la soluci n de trabajo R1 Permita su completa disoluci n y mezcle R5 Listo para el uso Cantidad necesaria por tira 0 2 mL R6 Diluya 1 2 con R1 inmediatamente antes de usar y solamente lo necesario para el ensayo Cantidad necesaria por tira 0 2 mL 0 1 mL de R6 0 1 mL de R1 CONSERVACION Y ESTABILIDAD Todos los reactivos deben mantenerse de 2 a 8 C En estas condiciones ser n estables en el envase original hasta la fecha de vencimiento Despu s de utilizar parte del contenido de los reactivos el resto es estable durante dos meses si se mantienen las mismas condiciones de almacenamiento y se evita la contaminaci n durante la ejecuci n de la prueba Las tiras de reacci n no utilizadas se mantienen estables durante dos meses de 2 a 8 C en la bolsa suministrada protegida con el desecante y herm ticamente cerrada MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS Agua destilada Hipoclorito de sodio Probetas graduadas entre 10 y 250 mL Pipeta multicanal con puntas desechables para 10 uL Pipetas de precisi n entre 10 y 1000 uL Incubadora a 37 1 C Papel absorbente PRECAUCIONES Manipule las muestras los Sueros Est ndares y el Suero Control como potencialmen
9. es que el 25 son considerados de riesgo y si son mayores que el 25 son considerados normales CARACTER STICAS ESPECIFICAS DEL ENSAYO 1 PRECISI N Se evaluaron tres muestras con concentraciones conocidas de PSA en el ensayo intraensayo y el mismo fue repetido durante varios d as interensayo Precision del UMELISA PSA Determinacion de PSA Total Intraensayo n 10 Interensayo n 20 ug L o oo f 788 o15 875 DE Desviaci n Est ndar CV Coeficiente de Variaci n Precisi n del UMELISA PSA Determinaci n de PSA Libre Intraensayo n 10 Interensayo n 20 ug L p05 oo 661 ote 8so DE Desviaci n Est ndar CV Coeficiente de Variaci n 2 EXACTITUD Se a adieron cantidades conocidas de PSA a tres sueros normales y se determin el porcentaje de recuperaci n al comparar los resultados obtenidos con los valores esperados para cada muestra lo cual promedi un 96 2 4 para la determinaci n de PSA Total y un 92 8 5 8 para la determinaci n de PSA Libre Los resultados se presentan en las siguientes tablas Recuperaci n del UMELISA PSA Determinaci n de PSA Total ns gsr go gn Muestras ug L ug L Recuperaci n del UMELISA PSA Determinaci n de PSA Libre Valor Esperado Valor Obtenido ug L ug L 98 00 Se realizaron diluciones seriadas a tres muestras de pacientes con diferentes niveles de PSA las curvas resultantes son paralelas a la Curva
10. es anti PSA con epitopo lineal de alta afinidad dirigidos contra el PSA Las muestras se incuban en los pocillos de la tira y si stas contienen PSA la misma se fija a los anticuerpos del recubrimiento La realizaci n de un lavado posterior elimina los componentes de la muestra no fijados se a aden anticuerpos monoclonales biotinilados espec ficos al PSA Total o al PSA Libre que se unir n al complejo formado sobre la fase s lida Una vez eliminados los anticuerpos biotinilados en exceso se a ade el conjugado Estreptavidina Fosfatasa Alcalina F A y luego de un paso de incubaci n y lavado se adiciona el sustrato fluorig nico 4 Metilumbeliferil fosfato que ser hidrolizado La intensidad de la fluorescencia emitida permitir detectar la presencia de PSA Total o Libre en la muestra El UMELISA PSA es un ensayo dise ado para la determinaci n de ant geno espec fico de pr stata total y libre en muestras de suero humano para evaluar pacientes con s ntomas de mayor o menor riesgo de presentar un adenocarcinoma prost tico y la poblaci n de riesgo hombres mayores de 40 a os CONTENIDO DEL ESTUCHE Y PREPARACION DE LAS SOLUCIONES DE TRABAJO Codigo UM 2036 288 pruebas Contenido Placa recubierta de 12 tiras x 8 pocillos 3 R1 Soluci n Tamp n 2x25 mL R2 Suero Est ndar a f 7x Liofilizado R3 Suero Control 1 x Liofilizado R4 Anticuerpos Biotinilados 1 1x7 5 mL R5 Anticuerpos Biotinilados 2 1x2 mL R6 Conjugado 1x
11. o A ada 10 uL de Anticuerpos Biotinilados en cada pocillo de la tira reacci n seg n el ensayo que corresponda PSA Total o PSA Libre 6 Incubaci n de los Anticuerpos Biotinilados Incube las tiras de reacci n 30 minutos a 37 C en c mara h meda previamente equilibrada a esta temperatura 7 Lavado Lave las tiras de reacci n seg n se describe en el ac pite 4 8 Adici n del Conjugado Con una punta nueva extraiga del frasco de conjugado el volumen necesario a emplear seg n el numero de tiras de reacci n utilizadas y depositelo en un recipiente limpio A ada 10 uL del conjugado listo para el uso en cada pocillo de la tira reacci n en el caso de PSA total Para PSA libre diluya 1 2 con soluci n de trabajo R1 inmediatamente antes de usar y solamente lo necesario para el ensayo 9 Incubaci n del Conjugado Incube las tiras de reacci n 30 minutos a 37 C en c mara h meda previamente equilibrada a esta temperatura 10 Lavado Lave las tiras de reacci n seg n se describe en el ac pite 4 11 Adici n del Sustrato Coloque 10 uL de sustrato convenientemente diluido en cada pocillo Si utiliza lectores que necesitan posiciones en la tira de reacci n para el ajuste de O y 100 debe exceptuar las posiciones A1 y B1 12 Incubaci n del Sustrato Incube en c mara h meda a temperatura ambiente 20 25 C Normalmente se requiere una incubaci n de 30 minutos para alcanzar una se al fluorescente de 100 a 160 unidade
12. quipos utilizados y verifique previamente su adecuado funcionamiento tenga especial cuidado en las operaciones de pipeteo y lavado Si utiliza la multipipeta ERIZO para transferir los Sueros Estandares el Suero Control y las muestras debe lavar profusamente sus puntas para evitar la contaminaci n al menos un lavado de cinco ciclos con soluci n de trabajo R1 y un lavado de cinco ciclos con agua destilada Deseche la soluci n y el agua destilada despu s de cada lavado Si su laboratorio ejecuta numerosos ensayos donde se usen diferentes tipos de muestras suero plasma sangre seca verifique que las cabezas de Dispensaci n y Aspiraci n del Lavador utilizado hallan sido previamente desinfectadas y el equipo se encuentre adecuadamente cebado ver Manual de Usuario No incorpore a los frascos originales remanentes de reactivos Evite posibles contaminaciones con materiales fluorescentes Evite la exposici n a la luz de los frascos que contienen el sustrato El juego de reactivos no debe emplearse despu s de la fecha de vencimiento Los reactivos del UMELISA PSA de lotes diferentes no se deben intercambiar PROCEDIMIENTO T CNICO 1 Preparaci n de los Sueros Est ndares el Suero Control y las muestras de suero Sueros Est ndares y Suero Control Los Sueros Est ndares y el Suero Control una vez reconstituidos quedan listos para su uso La concentraci n se corresponde con la especificada en la etiqueta de los fras
13. s para el Suero Est ndar R2f Sin embargo debido a las variaciones de temperatura puede resultar conveniente que cada laboratorio ajuste el tiempo de incubaci n para lograr estos niveles de fluorescencia 13 Lectura Realice la lectura de la intensidad de la fluorescencia emitida en cada determinaci n utilizando un lector de la serie SUMA Los valores de fluorescencia de las muestras de suero de concentraci n desconocida se interpolan en un gr fico de fluorescencia contra la concentraci n de PSA Total o Libre correspondiente a la Curva Est ndar obteni ndose los resultados en ug L ng mL Este procedimiento es realizado PROCEDIMIENTO DE C LCULO autom ticamente por el lector SUMA Fluorescencia Fluorescencia PSA Total 150 100 50 0 T T T T 1 0 0 625 1 25 2 5 5 20 Concentraci n pg L PSA Libre 150 100 50 0 T f T T 1 0 0 3125 0 625 1 25 2 5 20 Concentraci n ug L La validaci n interpretaci n e impresi n de los resultados son realizados autom ticamente por el programa UMELISA PSA A las muestras con valores de concentraci n de PSA Total de 3 7 a 10 ug L 3 7 a 10 ng mL se les determina PSA Libre y se calcula la relaci n porcentual PSA Libre PSA Total CONTROL DE LA CALIDAD La Curva Est ndar debe cumplir la siguiente condici n La media de los dos valores de fluorescencia para cada Suero Est ndar R2a R2f deben proporcionar un incremento en fluorescencia proporcional a su
14. t 1993 293 315 2 Stewart sell Cancer markers of the 1990s Comparison of the new generation of markers defined by monoclonal antibodies and oncogene probes to prototypic markers Clinics in Laboratory Medicine March 1990 10 1 1 37 3 Rivera Hidalgo Pablo Valores de referencia Laboratorio de Hormonas Hospital de Oncolog a Centro M dico Nacional Siglo XXI I M S S 4 Osterling Joseph E Prostate specific antigen a critical assessment of the most useful tumor marker for adenocarcinoma of the prostate The Journal of Urology May 1991 145 907 23 5 Anders Christensson et al Serum prostate specific antigen complexed to a1 Antichymotrypsin as an indicator of prostate cancer The Journal of Urology Apr 1992 147 100 105 6 Wolff JM et al Differentiation of bening prostatic hyperplasia and prostate cancer employing prostatic specific antigen density Eur Urol 1994 25 295 98 7 Hans Liljia et al Prostate specific antigen predominantly forms a complex with alphal antichymotrypsin in blood Cancer 1992 70 230 34 8 Per Anders Abrahamsson et al Free and complexed forms of prostate specific antigen in serum Tumor Marker Update 1994 6 1 4 9 Ulf Hakan Stenman et al A complex between prostate specific antigen and al antichymotrypsin is the major form of prostate specific antigen in serum of patients with prostatic cancer assay of the complex improves clinical sensitivity for cancer J cancer Research January 1991 51 2
15. te infecciosos Utilice guantes desechables Los materiales utilizados deben colocarse en soluciones desinfectantes Hipoclorito de sodio al 5 o esterilizarse en autoclave Considere a los equipos y accesorios que se han puesto en contacto directo con las muestras y reactivos como contaminados Realice los procedimientos de limpieza indicados en los manuales de usuario correspondientes Las muestras de suero a utilizar deben ser preferentemente frescas sin precipitados y debe evitarse la congelaci n y descongelaci n reiterada de las mismas Antes de comenzar a trabajar verifique que todos los reactivos est n a temperatura ambiente y los Sueros Est ndares y el Suero Control una vez preparados seg n las especificaciones se encuentren completamente disueltos Las tiras de reacci n deben estar a la temperatura del laboratorio antes de retirarles la cubierta protectora para evitar que se condense humedad en su superficie Verifique que las tiras de reacci n est n niveladas en el soporte Utilice puntas limpias o nuevas para la reconstituci n y trabajo con las soluciones y muestras Garantice el adecuado control de la humedad en todos los pasos de la prueba Las muestras y reactivos una vez aplicados deben mantenerse en las c maras h medas para evitar su evaporaci n ya que esto puede alterar los resultados Verifique peri dicamente la exactitud y precisi n de las pipetas Cumpla las normas de manipulaci n de los e
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