Determinación de nitrito como metabolito estable del óxido
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1. REFERENCIAS Adarmes H F V squez M Galleguillos E Gonz lez 2008 Detecci n de glicosaminoglicanos de la matriz del cart lago articular en el l quido sinovial de carpo equino con fractura en esquirla Arch Med Vet 40 77 81 Bird JLE S May MT Bayliss 2000 Nitric oxide inhibits aggrecan degradation in explants cultures of equine articular cartilage Equine Vet J 32 133 139 Clancy RM AR Amin SB Abramson 1998 The role of nitric oxide in inflammation and immunity Arthritis Rheum 2 1141 1151 Davis KL E Martin IV Turko F Murad 2001 Novel effects of nitric oxide Annu Rev Pharmacol Toxicol 41 203 236 Ersoy Y E Ozerol Baysal I Temel RS MacWalter Meral ZE Altay 2002 Serum nitrite levels in patients with rheumatoid arthritis ankylosing spondylitis and osteoarthritis Ann Rheum Dis 61 76 78 Forstermann U J Boissel H Kleinert 1998 Expressional control of the constituve isoforms of nitric oxide synthase NOS I and NOS II Faseb J 12 773 790 Hashimoto S RL Ochs S Komiya M Lotz 1998 Linkage of chondrocyte apoptosis and cartilage degradation in human osteoarthritis Arthritis Rheum 41 1632 1638 H uselmann HJ M Stefanovic Racic BA Michel CH Evans 1998 Differences in nitric oxide production by superficial and deep human articular chondrocytes Implications for proteoglycan turnover in inflammatory joint disease J Immunol 160 1444 1448 Infostat 2004 Manual del usuario Grupo Infostat F2. picas evidenciables a simple vista tanto a nivel del cart lago articular como de la membrana sinovial Esta diferenciaci n entre los grupos se refuerza en el hecho de que las lesiones del cart lago articular aparecen en aquellos equinos de mayor edad AN 9 9 4 2 a os y AA 10 7 3 8 a os Se evalu la concentraci n de NO en el l quido sinovial equino inmediatamente despu s del beneficio de los animales El NO es extremadamente l bil ya que interacciona r pidamente con O para generar una variedad de xidos de nitr geno que incluyen los nitritos y nitratos como los productos estables m s importantes del NO en los fluidos biol gicos El NO se midi a trav s de la reacci n de Griess que es el m todo m s utilizado debido a que el NO es el nico producto estable que se genera por la descomposici n del NO en soluciones acuosas in vitro Sin embargo tambi n se ha detectado NO en forma predominante en fluidos extracelulares como plasma u orina Nagano 1999 En la selecci n de las muestras se descartaron aquellos l quidos sinoviales con derrame sanguinolento debido a que la oxihemoglobina podr a reaccionar con el NO para generar metahemoglobina y de ese modo afectar el contenido de NO Nagano 1999 Adem s se descartaron aquellos l quidos sinoviales que presentaron turbidez En nuestros resultados no se encontr diferencia significativa para los valores de prote na y de nitrito en el l
3. El nitrato en cambio se forma por la reacci n entre el NO y la oxihemoglobina lo que implica que el nitrato existe en mayor proporci n en plasma y suero Stichtenoth y Fr lich 1998 Miranda y col 2001 Ersoy y col 2002 Si bien los modelos in vitro se alan el incremento de la s ntesis de NO en el cart lago osteoartr tico como consecuencia del est mulo con IL 1 posiblemente en un modelo articular in vivo se podr a esperar que la p rdida de cart lago y la apoptosis de condrocitos van t Hof y col 2000 Kim y col 2003 provocar an una menor s ntesis de NO y por ende una menor concentraci n de nitrito en el l quido sinovial En este trabajo se utiliz el l quido sinovial de la articulaci n metacarpofal ngica equina obtenido inmediatamente despu s del sacrificio de los animales En estas condiciones la concentraci n de nitrito del l quido sinovial reflejar a la s ntesis de NO por el conjunto de estructuras articulares y particularmente del cart lago articular Se busc establecer si la concentraci n de nitrito del l quido sinovial se relaciona con diferentes estados de alteraci n articular tanto de la membrana sinovial como del cart lago articular y as establecer si la concentraci n de nitrito podr a constituir un marcador de diferentes estados de alteraci n articular MATERIAL Y M TODOS MATERIAL BIOL GICO Se obtuvo l quido sinovial LS por artrocentesis as ptica desde la articulaci n
4. cart lago OA El NO inhibe la s ntesis de matriz cartilaginosa e induce la apoptosis en el cart lago articular Se determin indirectamente la producci n de NO a trav s de la concentraci n de nitrito utilizando la reacci n de Griess Se compar la concentraci n de nitrito del l quido sinovial de la articulaci n metacarpofal ngica equina con diferente condici n patol gica La clasificaci n articular y la edad se determinaron por inspecci n macrosc pica El grupo 258 normal NN n 47 no present da o visual de las estructuras articulares Los grupos con da o articular fueron a un grupo con membrana sinovial congestiva sin da o del cart lago NA n 25 b un grupo con da o del cart lago y con membrana sinovial normal AN n 23 y c un grupo con da o del cart lago y con membrana sinovial congestiva AA n 15 El cart lago articular da ado present erosiones y m ltiples l neas de roce y la membrana sinovial da ada present aspecto congestivo No hubo diferencia significativa entre los grupos analizados S lo hubo tendencia a aumentar en el grupo NA 44 4 32 6 umol L posiblemente asociado a la integridad del cart lago y a su mayor respuesta al est mulo proinflamatorio de la membrana sinovial congestiva La concentraci n de nitrito tendi a disminuir en el grupo con da o de cart lago y membrana sinovial AA 26 3 22 1 umol L que se explicar a por la p rdida de cart lago en este modelo in vivo
5. o Mazzetti y col 2001 Se produce p rdida de la funci n del cart lago originada por su erosi n y por la reducci n del contenido de proteoglicanos y de col geno acompa ado de cambios tanto en la estructura como en la agregaci n de estas mol culas McIlwraith 1996 En relaci n al papel que desempe a el NO en el cart lago existen planteamientos contradictorios ya que por un lado participar a como modulador end geno del recambio de la matriz extracelular en diferentes zonas del cart lago articular H uselmann y col 1998 e incluso 255 H ADARMES Y COL podria proteger de la degradaci n del agrec n Bird y col 2000 Por otro lado tambi n se ha sugerido que el NO ser a uno de los responsables de la destrucci n del cart lago en la osteoartritis de rodilla humana Karan y col 2003 y podr a existir una relaci n entre la apoptosis de condrocitos en el cart lago equino y el incremento de la concentraci n de NO van t Hof y col 2000 Kim y col 2003 La cuantificaci n de NO es dificil en medios biol gicos debido a su corta vida media de 6 a 10 segundos y a sus bajas concentraciones y por eso se cuantifican sus metabolitos estables nitrito y nitrato Ralston 1997 Stichtenoth y Fr lich 1998 Miranda y col 2001 Spreng y col 2001 Ersoy y col 2002 El nitrito es el nico producto estable resultante de la autooxidaci n del NO en soluciones acuosas como l quido cefalorraqu deo y l quido sinovial
6. quido sinovial de los distintos grupos articulares seleccionados ni tampoco alguna relaci n entre ambas concentraciones cuadro 1 S lo se pudo apreciar un incremento no significativo de la concentraci n de nitrito en las articulaciones con da o en alguna de la estructuras articulares NA y AN La tendencia de los nitritos a aumentar en el grupo NA L QUIDO SINOVIAL NITRITO EQUINO Cuadro 1 Clasificaci n articular edad promedio de los equinos a os concentraci n de prote nas g L y de nitrito umol L del l quido sinovial de la articulaci n metacarpofal ngica equina Joint classification average age years synovial fluid concentration of proteins g L and nitrite umol L in equine metacar pophalangeal joint Edad Promedio Prote nas Nitrito Articulaci n DE DE DE afios g L umol L NN 5 3 3 6 15 2 6 3 29 4 27 9 NA 4 4 3 1 13 4 8 4 44 4 32 6 AN 9 9 4 2 14 4 7 4 32 7 27 0 AA 10 7 3 8 10 8 5 4 26 3 26 1 NN Cart lago y membrana sinovial macrosc picamente normales NA Cart lago normal y membrana sinovial congestiva AN Cart lago alterado y membrana sinovial normal AA Cart lago alterado y membrana sinovial congestiva 44 4 32 6 umol L se podr a asociar a que el est mulo proinflamatorio de la membrana sinovial congestiva encontrar a una masa de cart lago normal logr ndose estimular una mayor s ntesis de NO por los condrocitos Este modelo NA se podr
7. Arch Med Vet 41 255 259 2009 COMUNICACION Determinaci n de nitrito como metabolito estable del xido n trico en el l quido sinovial de articulaci n metacarpofal ngica equina Nitrite determination as a stable metabolite of nitric oxide in synovial fluid of equine metacarpophalangeal joint Adarmes H JP Sol s A Miiller M Galleguillos Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile Santiago Chile SUMMARY The striking feature of osteoarthritis OA is fibrilation and loss of articular cartilage Nitric oxide NO has been involved as an important biological mediator of OA and its production is significantly higher in OA cartilage NO suppresses cartilagenous matrix synthesis and induces condrocytes apoptosis in articular cartilage The NO production was indirectly determined by measuring nitrite by Griess reaction Nitrite concentration of synovial fluid was compared in different equine metacarpophalangic joint conditions Joint classification and age determination were carried out by macroscopic examination It was considered a normal joint group NN n 47 the one without any visual damage of articular structures The damaged groups considered a a group with a congestive synovial membrane without cartilage damage NA n 25 b a group with damaged cartilage and normal synovial membrane AN n 23 and c a group with damaged cartilage and congestive synovial membrane AA n 15 A damaged cartilage s
8. CA Universidad Nacional de C rdoba Editorial Brujas C rdoba Argentina Jang D G Murrell 1997 Nitric oxide in arthritis Free Radic Biol Med 24 1511 1519 Karan A MA Karan P Vural N Erten C Ta o lu C Aksoy M Canbaz A ncel 2003 Synovial fluid nitric oxide levels in patients with knee osteoarthritis Clin Rheumatol 22 397 399 Kim DY HW Taylor RM Moore DB Paulsen D Y Cho 2003 Articular chondrocyte apoptosis in equine osteoarthritis Vet J 166 52 57 Lee MS MCD Trindale T Ikenoue DJ Schurman SB Goodman RL Smith 2002 Effects of shear stress on nitric oxide and matrix protein gene expression in human osteoarthritic chondrocytes in vitro J Orthop Res 20 556 561 Lowry OH NJ Rosebrough AL Farr RJ Randall 1951 Protein measurement with the Folin s phenol reagent J Biol Chem 193 265 275 Mazzetti I B Grigolo L Pulsatelli P Dolzani T Silvestri L Roseti R Meliconi A Facchini 2001 Differential roles of nitric oxide and oxygen radicals in chondrocytes affected by osteoarthritis and rheumatoid arthritis Clin Sci 101 593 599 MclIlwraith CW 1996 General pathobiology of the joint and response to injure In MclIlwraight CW Trotter GW eds Joint disease in the horse WB Saunders Philadelphia USA Pp 40 70 Miranda KM MG Espey DA Wink 2001 A rapid simple spectrophotometric method for simultaneous detection of nitrate and nitrite Nitric Oxide 5 62 71 Moshage H 1997 Nitric oxide determ
9. a asemejar con una sinovitis leve dado que la concentraci n de prote nas en ninguno de los casos presenta diferencias significativas y no representa valores asociados a inflamaciones m s intensas Adarmes y col 2008 En el grupo AN que representar a una osteoartritis moderada b sicamente por el da o en el cart lago articular tambi n aparece una tendencia a aumentar del contenido de nitrito 32 7 27 umol L al igual que lo descrito en el trabajo de von Rechenberg y col 2000 Sin embargo el incremento no tan elevado como en el grupo NA podr a reflejar una menor masa de cart lago asociada a la p rdida de tejido a pesar de que se ha descrito una mayor s ntesis de NO en el cart lago equino osteoartr tico in vitro van der Harst y col 2006 En el caso del grupo AA que representar a una osteoartritis severa se encontr una disminuci n no sig nificativa del contenido de nitrito 26 3 26 1 mol L a pesar del est mulo que podr a generar la membrana sinovial alterada a trav s de citoquinas proinflamatorias Esta tendencia a disminuir de los nitritos en este grupo AA se podr a relacionar con dos aspectos a la mayor p rdida de tejido articular reflejada por el mayor da o del tejido cartilaginoso y b al hecho de que se ha observado una disminuci n de la s ntesis de nitrito por el cart lago equino a trav s de la edad van der Harst y col 2006 Este grupo AA constituye el grupo de mayor edad 10 7 3 8 a os y
10. do sinovial fueron eliminados Las muestras de LS obtenidas se centrifugaron a 1 000 x g durante 20 minutos Los sobrenadantes se alicuo taron y se conservaron a 20 C hasta su procesamiento DETERMINACI N DE NITRITO En el LS se determin la concentraci n de nitrito utilizando la reacci n de Griess Miranda y col 2001 que detecta espec ficamente nitrito y no nitrato Moshage 1997 Miranda y col 2001 El reactivo de Griess se prepara mezclando una soluci n de N 1 naftil etilendiamina dihidrocloruro 0 1 p v en 5 de HCI con una soluci n de sulfanilamida 2 p v en 5 HCI Ambas soluciones son estables por varios meses a 4 C protegidas de la luz stas se mezclaron inmediatamente antes de realizar la reacci n colorim trica Debido a que esta reacci n se podr a alterar por compues tos como los S nitrosotioles y derivados de la L arginina las muestras de LS se desproteinizaron Miranda y col 2001 por diluci n 1 7 con etanol Las prote nas precipitadas se separaron por centrifugaci n a 1 000 x g durante 20 minutos La reacci n colorim trica se obtiene agregando a 300 uL del sobrenadante desproteinizado 300 uL del reactivo de Griess y se completa un volumen final de 900 uL con agua destilada estableci ndose su absorbancia a 540 nm Como est ndar se utiliz NaNO 0 1 mM en un rango entre 0 9 moles y 10 moles La concentraci n se expres como umoles de nitrito L La reacci n de Griess se basa en la formaci n d
11. e is a mediator of apoptosis in the rheumatoid joint Rheumatology 39 1004 1008 Von Rechenberg B CW Mcllwraith MK Akens DD Frisbie C Leutenegger JA Auer 2000 Spontaneous production of nitric oxide NO prostaglandin PGE2 and neutral metalloproteinases MMPs in media of explant cultures of equine synovial membrane and articular cartilage from normal and osteoarthritic joints Equine Vet J 32 140 150 259
12. e un crom foro por la reacci n de sulfanilamida con ni trito en medio cido seguido de un acoplamiento con aminas bic clicas tales como el N 1 naftil etilendiamina dihidrocloruro DETERMINACI N DE PROTE NAS Los objetivos de esta determinaci n fueron a esta blecer la ausencia de prote nas en el sobrenadante luego de desproteinizar el l quido sinovial con etanol para la determinaci n de nitrito b eliminar aquellos l quidos sinoviales cuya concentraci n de prote nas estuviese muy por encima de los 20 g L que indicar a una inflamaci n articular intensa Adarmes y col 2008 y c establecer alguna relaci n entre la concentraci n de prote nas con la de nitritos en el l quido sinovial Para esta determinaci n el LS o el sobrenadante ob tenido luego de la desproteinizaci n fueron diluidos en una relaci n 1 10 con agua destilada y la concentraci n de prote nas se determin por el m todo espectrofotom trico de Lowry y col 1951 a 750 nm utilizando seroalb mina de bovino BSA como est ndar en un rango entre 5 ug y 50 ug Los resultados se expresan como g L AN LISIS ESTAD STICO A los valores promedio de nitrito y de prote na de las muestras se les estableci un nivel de significancia P lt 0 05 a trav s de un an lisis de varianza y posteriormente por la prueba de Tukey Infostat 2004 RESULTADOS Y DISCUSI N En este trabajo se formaron cuatro grupos articulares a partir de diferencias macrosc
13. ee y col 2002 La NOS I y la NOS III son descritas como isoformas consti tutivas NOS y pueden ser objeto de regulaci n g nica Forstermann y col 1998 mientras que la NOS II representa la isoforma inducible iNOS ya que se expresa en c lulas estimuladas por diferentes citoquinas proinflamatorias como la interleuquina 1 IL 1 interferon gamma INF y y el factor de necrosis tumoral a TNF a La NOS II Aceptado 20 05 2009 Proyecto DID I 14 2 2001 Universidad de Chile Casilla 2 correo 15 La Granja Santiago Chile mgalleguQuchile cl produce concentraciones mucho m s elevadas de NO con respecto a la actividad de NOS I y NOS III Murrell y col 1995 Moshage 1997 Ralston 1997 Stichtenoth y Fr lich 1998 Davis y col 2001 Tomita y col 2001 Los condrocitos constituir an la fuente m s importante de NO en la articulaci n Jang y Murrell 1998 Tambi n se ha establecido que el cart lago osteoartr tico equino produce mayores concentraciones de NO van der Harst y col 2006 y que los condrocitos superficiales de cart lago normal humano sintetizan 2 a 3 veces m s NO que los de zonas profundas al ser estimulados con IL 1 Tambi n se ha demostrado que esta respuesta disminuye a trav s de la edad H uselmann y col 1998 La osteoartritis OA o Enfermedad Degenerativa Articular EDA se caracte riza por la p rdida focal de cart lago debido al est mulo de las v as catab licas inducido por la IL 1 y el TNF
14. este factor podr a ser relevante en este resultado La diferencia no significativa en la concentraci n de nitrito del grupo AA con respecto al grupo AN no se deber a a la edad que es ligeramente inferior en este ltimo grupo 257 H ADARMES Y COL 9 9 4 2 a os por lo que la diferencia se podr a asociar a una mayor cronicidad del cuadro patol gico en el grupo AA con la consiguiente p rdida de cart lago Tambi n se ha descrito que la disminuci n de nitrito en el l quido sinovial se podr a explicar por el incremento de la apop tosis de condrocitos que constituye una de las causas principales de los cambios patol gicos dependientes de la edad Hashimoto y col 1998 Von Rechenberg y col 2000 en un modelo in vitro demostraron a trav s de la reacci n de Griess que la concentraci n de NO fue mayor en el medio de cultivo de explantes de cart lago articular equino que en el de membrana sinovial lo que indicar a una mayor actividad del condrocito en la producci n de NO Adem s en ese trabajo se compararon tejidos articulares normales con aquellos provenientes de osteartritis moderada y osteoartritis severa detect ndose en el caso de la os teoartritis moderada incremento significativo de NO en los explantes de cart lago y de membrana sinovial Para realizar la comparaci n en dicho trabajo se utilizaron 25 mg de tejido hidratado mL de medio de cultivo tanto para cart lago como para membrana sinovial de modo q
15. howed erosions and multiple wear lines and a damaged synovial membrane showed a congestive appearance There were no significant differences in nitrite concentration between the analyzed groups Only in the NA group a non significant increase 44 4 32 6 umol L was detected that was possibly associated to the absence of cartilage loss and so with a major response to proinflammatory stimulation originated in the congestive synovial membrane Nitrite concentration decreased in a non significant way in the damaged cartilage and synovial membrane group AA 26 3 22 1 mol L which might be explained by cartilage loss in this in vivo model Palabras clave l quido sinovial nitrito equino Key words synovial fluid nitrite equine INTRODUCCI N El xido n trico NO es un radical libre que participa en la patogenia de muchas enfermedades que incluyen la osteoartritis en especies como el hombre el perro y el equino debido a que es sintetizado por condrocitos y sinoviocitos como consecuencia del est mulo de citoquinas proinflamatorias Moshage 1997 von Rechenberg y col 2000 Davis y col 2001 Spreng y col 2001 Tomita y col 2001 Tung y col 2002 El NO se sintetiza a partir de la L arginina por la actividad de la enzima xido n trico sintasa NOS que posee tres isoformas NOS L NOS II y NOS II Murrell y col 1995 Moshage 1997 Ralston 1997 Clancy y col 1998 Stichtenoth y Fr lich 1998 Miranda y col 2001 Ersoy y col 2002 L
16. inations Much ado about NO Thing Clin Chem 43 553 556 Murrell GAC D Jang RJ Williams 1995 Nitric oxide activates metalloproteinase enzymes in articular cartilage Biochem Biophys Res Commun 206 15 21 Nagano T 1999 Practical methods for detection of nitric oxide Luminescence 14 283 290 Ralston SH 1997 Nitric oxide and bone What a gas Br J Rheumatol 36 831 838 Spreng D N Sigrist A Schweighauser A Busato P Schawalder 2001 Endogenous nitric oxide production in canine osteoarthritis Detection in urine serum and synovial fluid specimens Vet Surg 30 191 199 Stichtenoth DO JC Fr lich 1998 Nitric oxide and inflammatory joint disease Br J Rheumatol 37 146 257 Tomita M EF Sato M Nishikawa Y Yamano M Inoue 2001 Nitric oxide regulates mitochondrial respiration and fuctions of articular chondrocytes Arthritis Rheum 44 96 104 L QUIDO SINOVIAL NITRITO EQUINO Tung JT J Venta JO Caron 2002 Inducible nitric oxide expression in equine articular chondrocytes effects of antiinflammatory compounds Osteoarthritis Cartilage 10 5 12 Van der Harst M S Bull PA Brama AB Barneveld PR van Weeren C van de Lest 2006 Nitrite and nitrotyrosine concentrations in articular cartilage subchondral bone and trabecular bone of normal juvenile normal adult and osteoarthritic adult equine metacarpophalangeal joints J Rheumatol 33 1662 1667 Van t Hof RJ L Hocking PK Wright SH Ralston 2000 Nitric oxid
17. metacarpofal ngica de equinos criollos de matadero inmediatamente despu s del beneficio de los animales a los que se determin su edad por cronometr a dentaria La punci n se realiz por la cara palmar recesos sinoviales utilizando jeringas de 5 mL con agujas 21 G x 1 Se seleccionaron articulacio nes metacarpofal ngicas normales y otras con alteraci n del cart lago y o de la membrana sinovial en base a la inspecci n visual post mortem Cada articulaci n meta carpofal ngica seleccionada para este estudio proviene de equinos diferentes Se consider como normal NN a aquellas articulaciones sin alteraciones visibles de esos 256 tejidos articulares n 47 es decir con un cart lago de superficie lisa y brillante de color blanco nacarado y una membrana sinovial sin signos de congesti n Las articulaciones alteradas fueron divididas en a aquellas que presentaron s lo congesti n de la membrana sinovial NA n 25 b aquellas que presentaron s lo da o del cart lago articular como focos de erosi n y l neas de roce AN n 23 y c aquellas que presentaron tanto da o del cart lago focos de erosi n y l neas de roce como congesti n de la membrana sinovial AA n 15 Para la selecci n de las articulaciones metacarpofal ngicas tanto normales como alteradas se consider que el LS deb a presentar un color amarillo claro transl cido y sin derrame sanguinolento de lo contrario la articulaci n con su l qui
18. ue la concentraci n de nitrito del medio de cultivo s lo refleja la actividad metab lica de esa cantidad de tejido Por el contrario nuestro trabajo refleja el contenido total de nitrito del l quido sinovial producido por el conjunto de estructuras articulares in vivo Se concluy que en estados de alteraci n severa de la articulaci n AA disminuy la concentraci n de NO posiblemente debido a una menor capacidad de s ntesis provocada por la p rdida de tejido cartilaginoso y o por apoptosis de condrocitos lo que coincide con los equinos de mayor edad Adem s en los estados intermedios de alteraci n articular AN y NA aument la concentraci n de NO en forma independiente de la edad No se encontr relaci n entre las concentraciones de prote na y de nitrito en el l quido sinovial Para responder al efecto de la edad in vivo se podr a evaluar la concentraci n de nitrito en el l quido sinovial de equinos de edades diferentes con sus articulaciones normales Por otro lado el inconveniente del modelo in vitro es que al comparar cantidades similares de condro citos o de cart lago en un medio de cultivo no se refleja la actividad total del conjunto de estructuras articulares del modelo in vivo RESUMEN La osteoartritis OA se caracteriza por fibrilaci n y erosi n del cart lago articular El xido n trico NO ser a un importante mediador biol gico de la OA y su producci n es significativamente mayor en el
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