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1. rmaco primario la pirazinamida cuya hidrataci n se realiza por medio de una soluci n amortiguadora cida hasta alcanzar una concentraci n espec fica El objetivo del uso de esta soluci n amortiguadora cida es que el valor del pH final sea de 5 9 o 6 0 un valor que servir para optimizar la actividad del f rmaco PZA La concentraci n espec fica de f rmaco para esta prueba es de 300 pg ml La detecci n del crecimiento microbiano en el sistema VTI ESP se basa en la medici n precisa de la producci n o del consumo de gas en el espacio libre superior de un frasco de cultivo cerrado herm ticamente Esta informaci n se utiliza para generar una curva de presi n por cada frasco Por medio de un algoritmo interno se analiza la informaci n para determinar el estado de cada una de las muestras de que consta el an lisis Si se cumplen una serie de condiciones el frasco se marca como positivo Se identifican aproximadamente 10 UFC ml de micobacterias en el momento de la detecci n PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO La prueba de sensibilidad de las muestras de M tuberculosis se realiza a trav s del sistema VTI ESP gracias a la inoculaci n de una suspensi n de organismos en los frascos de caldo de cultivo VersaTREK Myco a las que se ha incorporado el VersaTREK Myco GS y la pirazinamida Se conecta un VersaTREK Connector a cada una de los frascos para establecer un sistema de vigilancia estrecha del frasco por medio del instrumento VTI ESP El V2. Number of Isolates a 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Total Test Time INFORMACI N DE RIESGOS Pirazinamida Xn Nocivo R22 Nocivo por ingesti n 20 No comer ni beber durante su utilizaci n S36 sese indumentaria protectora adecuada S46 En caso de ingesti n ac dase inmediatamente al m dico y mu stresele la etiqueta o el envase BIBLIOGRAF A pg 7 Para obtener informaci n adicional llame al Servicio de Asistencia T cnica de TREK al numero 1 800 642 7029 14 ltaliano VersaTREK MYCO PZA KIT 7116 70 USO PREVISTO VersaTREK Myco PZA Kit una tecnica qualitativa rapida per il test di sensibilit n vitro alla pirazinamide PZA del Mycobacterium tuberculosis in coltura VersaTREK Myco PZA Kit viene utilizzato con VersaTREK Automated Microbial Detection System VTI e con ESP Culture System Il ESP Le rispettive sorgenti di inoculo vengono preparate da un flacone di coltura liquida VersaTREK Myco SOMMARIO E SPIEGAZIONE Una diagnosi rapida della tubercolosi importante per l istituzione della terapia farmacologica adeguata e di misure volte a prevenire la diffusione di questa malattia altamente contagiosa Un ritardo nell inizio del trattamento in particolare di ceppi di M tuberculosis con multiresistenza farmacologica MDR TB pu avere come conseguenza l insuccesso della terapia e la morte del paziente Per far fronte a questo problema i microbiologi cl
3. PZA Rehydration Buffer to each drug vial This yields a drug concentration of 4500 ug ml Aseptically add 1 0 ml of the drug to each culture bottle by injecting through the septum with a needle and syringe The final concentration of pyrazinamide is 300 ug ml For the drug free control bottle add 1 ml of the acidic PZA Rehydration Buffer in place of the drug Twenty five tests can be performed from a single vial Drug Concentration Volume added Final of Drug after to Myco test Concentration Reconstitution bottles in Test bottles PZA 4500 pg ml 1 mi 300ug ml The inoculum of a specimen for susceptibility testing must be confirmed as a pure culture of M tuberculosis prior to PZA testing and prepared as follows VersaTREK Myco Seed Bottle A 0 5 ml volume of a 1 0 McFarland equivalent created from an agar or liquid source growth in Middlebrook 7H9 or liquid from a primary detection bottle is aseptically injected into a VersaTREK Myco culture bottle supplemented with 1 0 ml VersaTREK Myco GS A sterile VersaTREK Connector is placed on the bottle and the bottle is incubated in the instrument until a positive signal is determined This seed bottle must be used within 72 hours Remove the VersaTREK Connector and vortex for 1 2 minutes Add 0 5 ml of a 1 10 dilution of culture from a positive VersaTREK Myco seed bottle to the appropriate culture bottles containing drug and to the drug free growth control bottle Wipe the culture bottles and s
4. Se l organismo sensibile al farmaco la crescita microbica sar assente o ritardata Se l organismo resistente alla PZA la crescita microbica sar messa in evidenza dalla comparsa di una curva con andamento verso il basso dalla linea di base Il tempo di rilevamento del flacone senza farmaco determina il completamento del test Il farmaco impiegato in questo sistema quello primario la pirazinamide che viene idratata da un tampone di reidratazione acido fino a una concentrazione critica specifica Il compito di questo tampone di ottenere un pH finale compreso tra 5 9 e 6 0 che ottimizzi l attivit del farmaco PZA La concentrazione specifica del farmaco per questo test di 300 ug ml Il rilevamento della crescita microbica nel sistema VTI ESP basato sulla misurazione sensibile della produzione e o del consumo di gas all interno dello spazio di testa di un flacone di coltura sigillato L informazione ottenuta viene utilizzata per generare una curva di pressione per ciascun flacone Un algoritmo interno analizza l informazione per determinare lo stato di ciascun campione del test Quando un insieme di condizioni viene soddisfatto un flacone segnalato come positivo AI momento del rilevamento sono presenti ca 10 UFC ml di micobatteri PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il test di sensibilit di campioni di M tuberculosis viene eseguito con il sistema VTI ESP inoculando una sospensione di organismi nei flaconi con brodo VersaTREK Myco i
5. gas production and or gas consumption within the headspace of a sealed culture bottle This information is used to generate a pressure curve for each bottle An internal algorithm analyzes the information to determine the status of each test sample When a set of conditions is met a bottle is flagged as positive There are approximately 10 CFU ml of Mycobacteria at the time of detection PRINCIPLES OF THE PROCEDURE Susceptibility testing of M tuberculosis specimens is performed with the VTI ESP System by inoculating a suspension of organisms into VersaTREK Myco broth bottles that have been supplemented with VersaTREK Myco GS and pyrazinamide A VersaTREK Connector is attached to each bottle to establish a closed system for monitoring the bottle with the VTI ESP instrument A hydrophobic membrane in the VersaTREK Connector prevents aerosolization Isolate information is entered into the system computer and the bottles are placed in the instrument for incubation at 35 C under stationary conditions VTI ESP System detects Mycobacterial growth by continuously monitoring every 24 minutes the rate of consumption of oxygen within the headspace of the culture bottle and reports that growth response with a positive signal At the end of the specified incubation period as determined by the drug free control bottle for each isolate that is tested the isolate is manually determined to be susceptible or resistant to the drug REAGENTS The VersaTREK Myco PZ
6. molto probabilmente l antibiotico PZA ha perso la sua attivit Si raccomanda di eseguire il test con un altro stock dell antibiotico LIMITAZIONI 1 Il test di sensibilit VersaTREK Myco PZA non identifica il livello di sensibilit dell isolato esaminato Si tratta di un test qualitativo 2 possibile eseguire il test di sensibilit VersaTREK Myco PZA solo sugli strumenti VTI o ESP Non possibile eseguire il test manualmente 3 Utilizzare solo colture pure di M tuberculosis Confermare la purezza della coltura soprattutto se si ottiene un risultato di resistenza Le colture che contengono pi specie di micobatteri possono dare risultati non esatti 4 Una preparazione dell isolato che non rispetti le indicazioni del produttore pu portare a risultati imprecisi 5 La reidratazione della PZA effettuata senza l esatto volume del PZA Rehydration Buffer acido pu portare a risultati imprecisi 6 La miscelazione completa dei flaconi inoculati importante Una miscelazione non corretta pu portare a risultati di resistenza errati 7 L uso non corretto del supplemento di crescita VersaTREK Myco GS pu portare a risultati di sensibilit errati RISULTATI PREVISTI Nel test iniziale sono stati analizzati un totale di 96 isolati clinici di M tuberculosis con VersaTREK Myco PZA Kit in laboratori di cinque localit diverse Nel test sono stati inclusi isolati clinici e sottocolturati freschi da sorgenti di terreno liquide e
7. non previsti verificare la purezza e l identificazione dell isolato Prima di riportare i risultati riesaminare SEMPRE il grafico dell isolato Consultare il manuale d uso per l analisi dei grafici Se i grafici dei test positivi sono inconsueti contattare l Assistenza tecnica di TREK al numero 1 800 642 7029 Resoconto dei risultati della PZA Crescita del flacone di Risultati test Possibile causa Azione controllo lt 3 giorni Contaminante o inoculo troppo Ripetere test pesante gt 12 giorni ff Organismo non vitale o Ripetere test inoculo troppo leggero gt 3 giorni e lt 12 giorni Sensibile mmm Test valido nessuna azione Resistente f ween nnn nen Se l isolato resistente confermare il risultato Se monoresistente confermare la purezza CONTROLLO DI QUALIT necessario analizzare un nuovo numero di lotto o di spedizione di VersaTREK Myco PZA con l organismo di controllo qualit M tuberculosis ATCC 27294 sensibile alla PZA risultati previsti sono contenuti nella tabella 1 Effettuare il controllo di qualit una volta alla settimana durante l esecuzione del test di sensibilit L osservazione dei risultati esatti entro 4 15 giorni indica che i reagenti sono pronti per essere utilizzati nei test sugli isolati dei pazienti 18 Se non si ottengono i risultati esatti non riportare i risultati dei pazienti Ripetere il controllo di qualita di tutti gli isolat
8. protettivi adatti In caso d ingestione consultare immediatamente il medico e mostrargli il contenitore o l etichetta 9 10 11 12 13 14 Total Test Time RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI pg 7 Per maggiori informazioni contattare l Assistenza Tecnica di TREK al numero 1 800 642 7029 21
9. were performed on 96 isolates from a liquid inoculum source Table 2 presents the results from clinical isolate testing for PZA at 300 ug ml for ESP and 100ug ml for BACTEC Testing showed 11 discordant results for seeded inoculum Of the 11 discordant results from seeded inoculum 10 were resistant for ESP VTI and susceptible for BACTEC and one was susceptible for ESP VTI and resistant for BACTEC Table 2 Clinical Isolate Results VersaTREK Myco PZA susceptibility test compared to BACTEC 460TB susceptibility BACTEC ESP VTI System 460TB System Expected Susceptible Resistant Results Source Tests S R Agree Category Agree Category Agreement Agreement 95 CI 95 CI Liquid 96 83 13 73 88 79 94 1 12 92 3 64 99 8 a 95 Confidence Intervals Cl Lee Eric W and Dubin N Estimation and Sample Size Considerations for Clustered Binary Responses 1994 Statistics in Medicine Vol 13 1241 1252 Figure 1 Total test time for seeded inoculum preparation for VersaTREK Myco PZA Susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis 30 Number of Isolates a 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Total Test Time HAZARD INFORMATION Pyrazinamide Xn Harmful R22 Harmful if swallowed 20 When using do not eat or drink 36 Wear suitable protective clothing S46 If swallowed seek medical advice i
10. with the acidic PZA Rehydration Buffer provided in the kit STORAGE VersaTREK Myco PZA Store at 2 8 C Protect from light Upon rehydration store at 2 8 C and use within 4 weeks or freeze at 20 C and use within 3 months Once thawed do not refreeze PROCEDURE SUSCEPTIBILITY TESTING OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS USING THE VersaTREK ESP CULTURE SYSTEM Il Materials Provided VersaTREK Myco Culture Bottles 7111 42 VersaTREK Myco GS 7112 42 VersaTREK Myco PZA Kit 7116 70 VersaTREK Connectors 7150 44 Materials Required but Not Provided Sterile distilled or deionized water Autoclave Middlebrook 7H10 or other mycobacterial agar or egg base medium for purity checks CO incubator 37 C Sterile loops Sterile tuberculin syringes with permanently attached needles Mycobactericidal disinfectant e g Amphyl OMNI etc Alcohol swabs Vortex mixer Biological safety cabinet Microscope Materials for staining slides Quality Control organism M tuberculosis ATCC 27294 Inoculation of VersaTREK Myco Culture Bottles for Myco Susceptibility Testing 1 10 Label each VersaTREK Myco culture bottle with identifying information For PZA testing 2 bottles will be used per test Disinfect the culture bottle stoppers with alcohol Aseptically add 1 0 ml of VersaTREK Myco GS to each culture bottle by injecting through the septum with a needle and syringe Rehydrate lyophilized PZA by aseptically adding 25 ml acidic
11. A Kit contains two bottles of the lyophilized pyrazinamide drug and four bottles of the acidic PZA Rehydration Buffer Each drug bottle is to be rehydrated to 25 ml with the acidic rehydration buffer FORMULA UPON REHYDRATION PRB Acidic PZA Rehydration Buffer 25 ml PZA Pyrazinamide 0 45 w v SA Solubilizing Agent 1 25 w v Adjusted to meet performance criteria PRECAUTIONS 1 For in vitro diagnostic use 2 Refer to Material Safety Data Sheets for complete hazard information 3 WARNING POTENTIAL INFECTIOUS TEST SPECIMEN Follow Universal Precautions and institutional policy in handling and disposing of infectious agents 4 When working with Mycobacterium tuberculosis grown in culture the recommendation is for Biosafety Level 3 practices containment equipment and facilities 5 The VersaTREK Connector contains a sharp recessed needle that is sterile upon first removing the seal but is potentially contaminated upon termination of use Follow institutional policy for handling and disposing of biohazard contaminated devices Do not handle in a casual manner Sterilize prior to disposal Dispose in an approved sharps container Do not reuse 6 Visually inspect all bottles for contamination cracks or other signs of deterioration Do not use bottles that appear turbid or cracked 7 Use only needle locking syringes Autoclave all VersaTREK Myco bottles prior to disposal Rehydrate the lyophilized PZA drug bottles only
12. CALIDAD Es necesario realizar el an lisis con un nuevo n mero de lote o con una nueva remesa de VersaTREK Myco PZA utilizando el microorganismo de control de calidad M tuberculosis ATCC 27294 sensible a la PZA Los resultados esperados se muestran en el cuadro 1 Es aconsejable realizar el control de calidad semanalmente cuando se realice la prueba de sensibilidad Si se obtienen los resultados deseados en un plazo de 4 a 15 d as ser indicativo de que los reactivos se pueden empezar a utilizar para realizar an lisis en los aislados de los pacientes Si no se obtienen resultados adecuados no informe de los resultados obtenidos en los pacientes Repita el control sobre aquellos aislados de pacientes que se vieran afectados por el error del control de calidad inicial Si la repetici n del control de calidad no se lleva a cabo seg n lo previsto no informe de los resultados obtenidos en los pacientes No utilice el producto hasta que se ponga en contacto con el Servicio de asistencia t cnica 1 A ada 1 ml de VersaTREK Myco GS a los frascos de cultivo de VersaTREK Myco 2 Rehidrate la pirazinamida liofilizada con la PZA Rehydratation Buffer tal y como se describe en el apartado Inoculaci n de los frascos de cultivo VersaTREK Myco para la realizaci n de la prueba de sensibilidad punto 4 3 A ada 1 ml de f rmaco a cada frasco VersaTREK Myco de modo que la concentraci n de pirazinamida se sit e en 300 pg ml A ada 1 0 ml de
13. OTENCIALMENTE INFECCIOSA Siga las precauciones universales y la normativa del centro a la hora de manipular y desechar los agentes infecciosos 4 Ala hora de trabajar con la Mycobacterium tuberculosis que se ha desarrollado en el cultivo se recomienda utilizar el Nivel de Bioseguridad 3 en cuanto a manejo contenci n equipamiento e instalaciones 5 El VersaTREK Connector contiene una aguja embutida y afilada esterilizada hasta que se retira el precinto pero que se puede contaminar despu s del uso Respete la normativa institucional estipulada para el manejo y la eliminaci n de los dispositivos contaminados biol gicamente No manipule los instrumentos de forma despreocupada Realice una esterilizaci n antes de desechar Deseche en un contenedor autorizado No vuelva a utilizar los dispositivos 6 Verifique visualmente todos los frascos en busca de contaminaci n grietas u otros signos de deterioro No utilice frascos que est n turbios o da ados 7 Utilice s lo jeringuillas con bloque de aguja 8 Esterilice en el autoclave todos los frascos de VersaTREK Myco antes de desecharlos 9 Rehidrate los frascos de PZA liofilizada mediante la PZA Rehydration Buffer que se incluyen en el kit ALMACENAMIENTO VersaTREK Myco PZA Guarde a 2 8 C Proteja de la luz Despu s de la rehidrataci n guarde a 2 8 C y use antes de 5 dias si es al cuota guarde a 20 C y use antes de 3 meses Una vez descongelado no lo vuelva a congelar S
14. PZA Rehydratation Buffer al frasco testigo del crecimiento 4 A ada 0 5 ml en una diluci n de 1 10 de cultivo procedente de un frasco de material activo VersaTREK Myco con resultado positivo a los frascos de cultivo adecuados que contengan el f rmaco y al frasco testigo del crecimiento que no lo contenga 5 Despu s de observar los resultados estimados utilice el resto del lote para realizar el an lisis de las muestras Si no se obtienen los resultados deseados p ngase en contacto con el servicio de asistencia t cnica de VersaTREK CUADRO 1 Resultados previstos para el control de calidad ORGANISMO ATCC Pirazinamida M tuberculosis 27294 Sensible Las causas m s habituales de fracaso del control de calidad son la inoculaci n en exceso de las partidas de PZA y la contaminaci n Si se obtienen en repetidas ocasiones resultados de falsa resistencia lo m s probable es que el antibi tico PZA haya perdido actividad En ese caso es aconsejable realizar el an lisis con una nueva reserva de antibi tico RESTRICCIONES 1 La prueba de sensibilidad de VersaTREK Myco PZA no resulta apropiada para interpretar el grado de sensibilidad del aislado sometido a la misma Se trata de una prueba de car cter cualitativo 2 La prueba de sensibilidad de VersaTREK Myco PZA nicamente se podr realizar por medio de los instrumentos VTI o ESP No es aconsejable realizarla de forma manual 3 Utilice nicamente culti
15. T EK DIAGNOSTIC SYSTEMS VersaTREK MYCO PZA KIT 7116 70 INTENDED USE The VersaTREK Myco PZA Kit is a rapid qualitative procedure for in vitro susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis from culture to pyrazinamide PZA The VersaTREK Myco PZA Kit is used with the VersaTREK Automated Microbial Detection System VTI and the ESP Culture System Il ESP Appropriate inoculum sources are prepared from a liquid VersaTREK Myco seed bottle SUMMARY AND EXPLANATION Rapid diagnosis of tuberculosis is important for initiation of appropriate drug therapy and institution of measures to prevent the spread of this highly contagious disease Delayed treatment particularly of multiple drug resistant M tuberculosis MDR TB strains can result in treatment failure and patient mortality To address these issues clinical microbiologists are urged to use the most sensitive and rapid diagnostic tests that provide reliable results Experts at the CDC have made several recommendations regarding Mycobacterial testing including the use of both a liquid and solid medium for Mycobacterial culture For pyrazinamide susceptibility testing of M tuberculosis the VTI ESP System combines a liquid culture medium VersaTREK Myco Broth a growth supplement VersaTREK Myco GS and a specific concentration of pyrazinamide with a detection system that automatically incubates and continuously monitors culture bottles inoculated with isolates of M tubercu
16. TREK Microbial Detection System Recovery of different microorganisms and time to detection was used to demonstrate no difference in performance between ESP Culture System Il and VersaTREK Microbial Detection System with additional testing of M tuberculosis and PZA Results and time to detection by either system were not significantly different Clinical Site testing Clinical Evaluation The VersaTREK Myco PZA susceptibility test was evaluated at five geographically diverse sites composed of regional reference centers public health laboratories and university hospital based laboratories The VersaTREK Myco PZA Kit was compared to the BACTEC 460TB PZA susceptibility test method Reproducibility Testing Lot reproducibility was performed using two well characterized strains of M tuberculosis from CDC using two lots each of VersaTREK Myco broth and VersaTREK Myco GS Testing was performed in triplicate and on three separate days The overall reproducibility was gt 95 for seeded inoculum Challenge Testing CDC challenge set of 30 organisms was tested at three sites Of the possible 90 test points only 77 were valid The lower number of tests 7 2 repeat rate was due to no growth contamination or instrument issues Of the 77 organisms tested 68 were susceptible and 9 were resistant There was an overall agreement of 98 7 with expected results Clinical Isolate Testing using Seed Inocula Susceptibility tests of Mycobacterium tuberculosis
17. are a 2 8 C ed utilizzare entro 4 settimane o congelare alla temperatura di 20 C e procedere all utilizzo entro 3 mesi Una volta scongelato non congelare nuovamente PROCEDURA TEST DI SUSCETTIBILIT DEL MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS UTILIZZANDO IL VersaTREK ESP CULTURE SYSTEM Il Materiali forniti VersaTREK Myco Culture Bottles 7111 42 VersaTREK Myco GS 7112 42 VersaTREK Myco PZA Kit 7116 70 VersaTREK Connectors 7150 44 16 Materiali richiesti ma non forniti Acqua distillata o deionizzata sterile Autoclave Middlebrook 7H10 o altro agar micobatterico o medium a base di uovo Incubatrice alla CO2 a 37 C Anse sterili Siringhe sterili per tubercolina con aghi permanenti Disinfettante micobatterico cio Amphyl OMNI ecc Tamponi imbevuti di alcool Mescolatore vortice Cabina di sicurezza biologica Microscopio Materiali per la colorazione dei vetrini Organismo con Controllo di Qualit M tuberculosis ATCC 27294 Inoculazione di Flaconi di Coltura VersaTREK Myco per il test di suscettibilit Myco 1 Etichettare ciascun flacone di coltura VersaTREK Myco con informazioni di identificazione Per il test alla PZA vengono utilizzati 2 flaconi per ciascun test Disinfettare i tappi dei flaconi di coltura con dell alcol Aggiungere in modo asettico 1 0 ml di VersaTREK Myco GS a ciascun flacone di coltura iniettandolo nel setto con un ago e una siringa Reidratare la PZA liofilizzata aggiungendo in modo
18. asettico 25 ml di PZA Rehydration Buffer acido a ciascun flacone di farmaco Ci produce una concentrazione di farmaco di 4500 ug ml Aggiungere in modo asettico 1 0 ml del farmaco a ciascun flacone di coltura iniettandolo nel setto con un ago e una siringa La concentrazione finale di pirazinamide di 300 ug ml Per il flacone di controllo senza farmaco aggiungere 1 ml di PZA Rehydration Buffer acido al posto del farmaco Con un unico flacone possibile effettuare venticinque test Farmaco Concentrazione di Volume aggiunto ai flaconi Concentrazione finale farmaco al termine della test dei micobatteri nei flaconi test ricostituzione PZA 4500 ug ml 1ml 300ug ml L inoculo di un campione per i test di sensibilit deve essere confermato come coltura pura del M tuberculosis precedentemente al test alla PZA e preparato nel seguente modo Flacone di coltura VersaTREK Myco Un volume di 0 5 ml di un equivalente McFarland da 1 0 creato da una sorgente agar o liquida crescita in Middlebrook 7H9 o liquido da un flacone di rilevamento primario iniettata in modo asettico in un flacone di coltura VersaTREK Myc integrato con 1 0 ml di VersaTREK Myco GS Un VersaTREK Connector sterile collocato sul flacone posto in incubazione nello strumento finch non viene determinato un segnale positivo Il flacone di coltura deve essere utilizzato entro 72 ore Rimuovere il VersaTREK Connector e il miscelatore vortex per 1 2 minuti Aggiungere 0 5
19. colare interpretazioni di sensibilit o resistenza utilizzando la seguente formula Sensibile non si verificata alcuna crescita oppure il tempo di rilevamento del flacone con farmaco superiore a tre giorni arrotondato al numero intero pi vicino del tempo di rilevamento del flacone di controllo senza farmaco arrotondato al numero intero pi vicino Resistente il tempo di rilevamento del flacone con farmaco inferiore a tre giorni arrotondato al numero intero pi vicino del tempo di rilevamento del flacone di controllo senza farmaco arrotondato al numero intero pi vicino Ignorare la crescita che si sviluppa dopo tre giorni poich non considerata indicazione di resistenza Confermare tutti i risultati di resistenza mediante un metodo alternativo prima di riportarli flaconi positivi devono essere trattati per AFB Acid Fast Bacilli e sottocolturati su una piastra agar Middlebrook 7H10 o 7H11 e su una piastra agar non selettiva ad es agar sangue per garantire la purezza dei campioni flaconi di controllo della crescita che presentano un segnale in meno di 2 5 giorni possono indicare la presenza di un contaminante non micobatterico mentre quelli che presentano un segnale entro 12 giorni dall inoculazione possono indicare una preparazione del flacone non corretta In entrambi i casi necessario ripetere il test dei campioni La monoresistenza alla PZA inconsueta quindi in caso di risultati di resistenza
20. da La tabella 2 presenta i risultati dei test di isolati clinici per la PZA a 300 ug ml per ESP e a 100ug ml per BACTEC test hanno presentato 11 risultati discordanti per l inoculo di coltura Degli 11 risultati discordanti dall inoculo di coltura 10 erano resistenti all ESP VTI e sensibili al BACTEC mentre uno era sensibile all ESP VTI e resistente al BACTEC Tabella 2 Risultati degli isolati clinici Test di sensibilit VersaTREK Myco PZA confrontato con la sensibilit di BACTEC 460TB Sistema Sistema ESP VTI BACTEC 460TB Risultati Sensibile Resistente previsti Sorgente Test S R Categoria Categoria 20 Concorde Corrispondenza Concorde Corrispondenza 95 IC a 95 IC Liquido 96 83 13 73 88 79 94 1 12 92 3 64 99 8 a 95 Intervalli di confidenza Cl Lee Eric W and Dubin N Estimation and Sample Size Considerations for Clustered Binary Responses 1994 Statistics in Medicine Vol 13 1241 1252 Figura 1 Tempo complessivo del test per la preparazione dell inoculo di coltura per il test di sensibilit VersaTREK Myco PZA sul Mycobacterium tuberculosis INFORMAZIONI SUI RISCHI Number of Isolates a Pirazinamide Xn R22 20 S36 S46 Nocivo Nocivo per ingestione Non mangiare n bere durante l impiego Usare indumenti
21. ded to the nearest whole number of the time to detection of the drug free control bottle rounded to the nearest whole number Growth after three days of the control bottle should be disregarded because it is not considered to be an indication of resistance All resistant results should be confirmed by an alternate method prior to reporting Bottles that signal positive should be stained for AFB Acid Fast Bacilli and subcultured to a Middlebrook 7H10 or 7H11 agar plate as well as a non selective agar plate e g Blood Agar to ensure purity of the specimen Growth control bottles that signal in less than 2 5 days may indicate the presence of a non Mycobacterial contaminant whereas control bottles that do not signal within 12 days after being inoculated may be indicative of improper bottle preparation For either situation the specimen should be retested Mono resistance to PZA is uncommon therefore in the event of unexpected resistance results verify purity and identification of the isolate ALWAYS review the isolate s graph before reporting Refer to the Operator s Manual for graph analysis If graphs for tests that have signaled positive look abnormal contact TREK Technical Support at 1 800 642 7029 PZA Result reporting Growth of Control bottle Test Result Possible cause Action lt 3 days J Contaminant or too heavy of Repeat test an inoculum gt 12 days J Nonviable organism or too Repeat test
22. della PZA risultati e il tempo di rilevamento dei due sistemi non presentavano differenze significative Test clinico Valutazione clinica Il test di sensibilit VersaTREK Myco PZA stato valutato nei laboratori di cinque localit diverse che comprendono centri di riferimento regionale laboratori di salute pubblica e laboratori universitari ospedalieri VersaTREK Myco PZA Kit stato confrontato con il metodo del test di sensibilit BACTEC 460TB PZA Test di riproducibilit La riproducibilit del lotto stata eseguita utilizzando due ceppi di M tuberculosis ben definiti forniti dal CDC e utilizzando due lotti uno per ciascun brodo di VersaTREK Myco e VersaTREK Myco GS Il test stato eseguito tre volte e in tre giorni diversi La riproducibilit complessiva stata gt 95 per inoculo di coltura Test Challenge Il test CDC stato svolto su 30 organismi stato analizzato in tre laboratori Dei 90 possibili punti del test solo 77 erano validi Il numero pi basso dei test tasso di ripetizione 7 2 non stato provocato da alcun elemento dello strumento della contaminazione e della crescita Dei 77 organismi analizzati 68 erano sensibili e 9 erano resistenti La corrispondenza complessiva con i risultati previsti stata del 98 7 Test degli isolati clinici utilizzando inoculi di coltura test di sensibilit del Mycobacterium tuberculosis sono stati eseguiti su 96 isolati prelevati da una sorgente di inoculo liqui
23. diquen la presencia de un contaminante de origen no microbacteriano mientras que los que no se se alen en los 12 d as siguientes a la inoculaci n pueden indicar que la preparaci n de las mismas ha sido inadecuada Si se da cualquiera de estas situaciones las muestras se deber n someter a un nuevo an lisis No es habitual encontrar monoresistencia a la PZA por tanto en caso de que se produzcan resultados de resistencia imprevistos es necesario comprobar la pureza y la identificaci n del aislado Revise SIEMPRE la gr fica de los aislados antes de informar acerca de los resultados obtenidos Consulte el manual de usuario para obtener informaci n adicional acerca del an lisis de las gr ficas Si las gr ficas de las pruebas que han obtenido un resultado positivo presentan alguna anomal a p ngase en contacto con el Servicio de asistencia t cnica de TREK en el tel fono en EE UU 1 800 642 7029 Informe de resultados de la PZA Crecimiento en frasco testigo Resultado de la prueba Posible causa Acci n lt 3 d as Presencia de contaminante o Repetir la prueba cantidad excesiva de inoculante gt 12 d as Organismo no viable o Repetir la prueba cantidad insuficiente de inoculante gt 3 d as y lt 12 d as Sensible An lisis v lido ninguna acci n Resistente mmm Si el aislado es resistente confirme el resultado y si es monoresistente confirme su pureza 11 CONTROL DE
24. e culture bottles containing drug and to the drug free growth control bottle 5 After observation of expected results use the remainder of the lot in testing specimens If expected results are not achieved contact VersaTREK Technical Support TABLE 1 Expected Quality Control Results Organism ATCC Pyrazinamide M tuberculosis 27294 Susceptible The most common causes of quality control failure are over inoculation of the PZA test sets and contamination If repeated false resistance results are obtained the PZA antibiotic most likely has lost activity The recommendation is to test with a new antibiotic stock LIMITATIONS 1 The VersaTREK Myco PZA susceptibility test does not interpret the degree of susceptibility of the isolate being tested It is a qualitative test 2 The VersaTREK Myco PZA susceptibility test can only be performed on the VTI or ESP instruments Testing cannot be performed manually 3 Use only pure cultures of M tuberculosis The user must confirm the purity of the culture especially if the result is resistant Cultures that contain multiple species of Mycobacteria may give erroneous results 4 Failure to prepare the isolates per the manufacturer s recommendation may lead to inaccurate results 5 Failure to re hydrate the PZA with the proper volume of acidic PZA Rehydration Buffer may give inaccurate results 6 Thorough mixing of inoculated bottles is important Failure to mix adequately
25. ersaTREK Connector cuenta con una membrana hidr foba que evita que se produzca aerosolizaci n La informacion relativa a los aislados se introduce en el ordenador del sistema y los frascos se colocan en el instrumento para someterlos a incubaci n a una temperatura de 35 C en condiciones estables El sistema VTI ESP detecta el crecimiento micobacteriano por medio de la supervisi n constante cada 24 minutos de la tasa de consumo de ox geno registrada en el espacio libre superior del frasco de cultivo e informa de la respuesta de crecimiento con una se al positiva Una vez que finalice el periodo de incubaci n determinado por los frascos testigo sin f rmaco de cada uno de los aislados analizados se establece de forma manual si el aislado ser sensible o resistente a dicho f rmaco REACTIVOS El VersaTREK Myco PZA Kit contiene dos frascos de pirazinamida liofilizada y cuatro frascos de soluci n rehidratante cida PZA Cada frasco del f rmaco se rehidrata hasta 25 ml por medio de la soluci n amortiguadora cida F RMULA TRAS LA HIDRATACION PRB S luci n amortiguadora rehidratante cida PZA 25 ml PZA Pirazinamida 0 45 w v SA Agente solubilizante 1 25 w v Ajustado para cumplir los criterios de rendimiento PRECAUCIONES 1 Para aplicaciones de diagn stico in vitro 2 Consulte las Hojas de Informaci n de Seguridad del Material para obtener informaci n completa sobre los riesgos 3 ADVERTENCIA MUESTRA DE PRUEBA P
26. i di pazienti relativi al primo controllo di qualita non riuscito Se la ripetizione del controllo di qualita non offre i risultati previsti non riportare i risultati dei pazienti Non utilizzare il prodotto prima di avere contattato l Assistenza tecnica 1 Aggiungere 1 ml di VersaTREK Myco GS ai flaconi di coltura VersaTREK Myco 2 Reidratare la pirazinamide con PZA Rehydration Buffer acido come descritto in Inoculazione dei flaconi di coltura VersaTREK Myco per i test di sensibilit punto 4 3 Aggiungere 1 ml di farmaco a ciascun flacone VersaTREK Myco per ottenere concentrazioni finali di farmaco di 300 ug ml Aggiungere 1 0 ml di PZA Rehydration Buffer al flacone di controllo della crescita 4 Aggiungere 0 5 ml di una coltura diluita 1 10 prelevata da un flacone di coltura positiva VersaTREK Myco agli appositi flaconi di coltura con farmaco e al flacone di controllo della crescita senza farmaco 5 Al termine dell osservazione dei risultati previsti utilizzare il lotto rimanente per analizzare i campioni Se non sono stati ottenuti i risultati previsti contattare l Assistenza tecnica di VersaTREK TABELLA 1 Risultati previsti di controllo qualit Organismo ATCC Pirazinamide M tuberculosis 27294 Sensibile Le cause pi comuni di un controllo di qualit non riuscito sono l eccessiva inoculazione del materiale per il test alla PZA e la contaminazione Se si ottengono risultati di resistenza errati
27. ible o resistente al f rmaco a partir de una f rmula Anote el tiempo de detecci n del frasco que no contiene f rmaco Este tiempo se utiliza para calcular interpretaciones sensibles o resistentes de acuerdo con la siguiente f rmula Sensible No se detecta crecimiento o el tiempo de detecci n del frasco que contiene el f rmaco supera en m s de tres d as se redondea hasta el n mero entero m s cercano al tiempo de detecci n del frasco testigo que no lo contiene se redondea hasta el n mero entero m s cercano Resistente El tiempo de detecci n del frasco que contiene el f rmaco no supera en m s de tres d as se redondea hasta el n mero entero m s cercano al tiempo de detecci n del frasco testigo que no lo contiene se redondea hasta el n mero entero m s cercano Se debe desestimar el crecimiento del frasco testigo una vez transcurridos tres d as ya que no se considera como indicativo de resistencia Todos los resultados resistentes se deber n confirmar a trav s de un m todo alternativo antes de la elaboraci n del informe En los frascos en que se obtenga una se al positiva se debe realizar una tinci n de los BAR bacilo cido resistente y un subcultivo en una placa de agar modelo Middlebrook 7H10 o 7H11 as como en una placa agar no selectiva por ejemplo agar sangre para garantizar la pureza de la muestra Es posible que los frascos testigo del crecimiento que se se alen en un plazo inferior a 2 5 d as in
28. inici devono utilizzare i test diagnostici piu rapidi e sensibili che forniscano risultati affidabili Nei test per micobatteri gli esperti del CDC raccomandano tra l altro l uso di terreni sia liquidi sia solidi per la coltura dei micobatteri x Per il test di sensibilit alla pirazinamide del M tuberculosis il sistema VTI ESP combina un terreno di coltura liquido VersaTREK Myco Broth un supplemento di crescita VersaTREK Myco GS e una specifica concentrazione di pirazinamide con un sistema di rilevamento a incubazione automatica e monitoraggio continuo dei flaconi di coltura inoculati con isolati di M tuberculosis prelevati da una variet di sorgenti di campioni Le spugne nei flaconi VersaTREK Myco offrono una matrice di supporto di crescita e aumentano l area della superficie esposta all ossigeno presente nello spazio di testa La tecnologia del sistema VTI ESP basata sul rilevamento di variazioni di pressione nello spazio di testa di un flacone sigillato dovute alla crescita microbica Per il rilevamento di micobatteri a crescita molto lenta stato realizzato uno speciale algoritmo Con il sistema VTI ESP possibile iniettare il farmaco antitubercolare PZA in flaconi VersaTREK Myco integrati con VersaTREK Myco GS Un inoculo di una coltura confermata di M tuberculosis cresciuto da un flacone di coltura viene aggiunto a un flacone di controllo senza farmaco utilizzato come controllo positivo e a un flacone test contenente PZA
29. light inoculum gt 3 days and lt 12 days Susceptible free Valid test no action Resistant If isolate is resistant confirm the result and if mono resistant confirm purity QUALITY CONTROL A new lot number or shipment of VersaTREK Myco PZA should be tested with the quality control organism M tuberculosis ATCC 27294 PZA susceptible Expected results are shown in Table 1 Quality control should be run once each week when susceptibility testing is performed Observation of the proper results within 4 15 days indicates the reagents are ready for use in testing patient isolates If proper results are not observed do not report patient s results Repeat quality control and any patient isolates affected by the initial quality control failure If repeat quality control does not perform as expected do not report patient results Do not use the product until you have contacted Technical Services 1 Add 1 ml VersaTREK Myco GS to VersaTREK Myco culture bottles 2 Rehydrate lyophilized pyrazinamide with acidic PZA Rehydration Buffer as described under Inoculation of VersaTREK Myco Culture Bottles for Susceptibility Testing Item 4 3 Add 1 ml of drug to each VersaTREK Myco bottle to yield final drug concentrations of pyrazinamide at 300 ug ml Add 1 0 ml PZA Rehydration Buffer to the growth control bottle 4 Add 0 5 ml of a 1 10 dilution of culture from a positive VersaTREK Myco seed bottle to the appropriat
30. losis from a variety of specimen sources The sponges in the VersaTREK Myco bottles provide a growth support matrix and increase the surface area exposed to headspace oxygen The technology of the VTI ESP System is based on the detection of headspace pressure changes within a sealed bottle due to microbial growth A special algorithm has been developed for detection of very slow growing Mycobacteria With the VTI ESP System anti tuberculosis drug PZA can be injected into VersaTREK Myco bottles supplemented with VersaTREK Myco GS An inoculum of a confirmed culture of M tuberculosis grown from a seed bottle is added to a drug free control bottle used as a positive control and to a test bottle containing PZA If the organism is susceptible to the drug delayed or no microbial growth will be detected If the organism is resistant to PZA microbial growth will be detected by the generation of a curve exhibiting a downward excursion from the baseline The time to detection of drug free bottle determines when a test is complete The drug used in this system is the primary drug pyrazinamide which is hydrated with an acidic rehydration buffer to a specific critical concentration The purpose of the acidic rehydration buffer is to attain a final pH of 5 9 to 6 0 which optimizes the activity of the PZA drug The specific drug concentration for this test is 300 ug ml The detection of microbial growth in the VTI ESP System is based on the sensitive measurement of
31. lture System II ESP Las fuentes de inoculante se preparan a partir de un frasco de material activo liquido VersaTREK Myco RESUMEN Y DESCRIPCION El diagn stico precoz de la tuberculosis resulta esencial para poder iniciar un tratamiento farmacol gico adecuado y poner en pr ctica una serie de medidas destinadas a evitar la propagaci n de esta enfermedad altamente contagiosa El tratamiento tard o en especial de numerosas cepas de M tuberculosis MDR TB resistentes a los f rmacos puede provocar la ineficacia del tratamiento y el aumento de la tasa de mortalidad en los pacientes Para hacer frente a esta situaci n los microbi logos cl nicos estan obligados a utilizar las pruebas de diagn stico de mayor sensibilidad y rapidez que al mismo tiempo ofrezcan los resultados m s fiables Los expertos de los CDC Centros para el Control de Enfermedades de Estados Unidos han realizado una serie de recomendaciones acerca de los an lisis micobaterianos entre las que se incluye el uso de dos medios el l quido y el s lido para los cultivos micobacterianos Para realizar la prueba de sensibilidad a la pirazinamida de la M tuberculosis el sistema VTI ESP combina un medio de cultivo l quido VersaTREK Myco Broth un complemento para el crecimiento VersaTREK Myco GS y una concentraci n espec fica de pirazinamida con un sistema de detecci n que incuba de forma autom tica y supervisa de forma continuada los frascos de material acti
32. may lead to false resistant results 7 Failure to use the VersaTREK Myco GS growth supplement may lead to false susceptible results EXPECTED RESULTS In the initial testing a total of 96 clinical isolates of M tuberculosis were tested with the VersaTREK Myco PZA Kit at five geographically diverse sites The testing included both fresh clinical and sub cultured isolates from liquid and solid media sources The repeat rates for this study was lt 10 The average time to result for the VersaTREK Myco PZA susceptibility test was 8 18 days for a liquid seed inoculum with a range from 3 to 15 days See figure 1 below PERFORMANCE CHARACTERISTICS In house testing Lot Reproducibility Lot reproducibility was performed using 4 well characterized strains of M tuberculosis which were tested in triplicate and on three separate days Three lots of VersaTREK Myco broth were represented in the testing The overall reproducibility was 100 for seeded inoculum Eight lots of manufactured VersaTREK Myco PZA seven VersaTREK Myco broth and six VersaTREK Myco GS were evaluated for reproducibility with acceptable results for all lots CDC Challenge Panel Testing Ten well characterized strains of M tuberculosis were tested and compared to BACTEC 460TB and to expected results Eight strains were susceptible and two were resistant to PZA There was an overall 100 agreement with BACTEC and expected results Comparison of ESP Culture System II and Versa
33. ml di una coltura diluita 1 10 prelevata da un flacone di coltura positiva VersaTREK Myco agli appositi flaconi di coltura con farmaco e al flacone di controllo della crescita senza farmaco Pulire i flaconi di coltura e i tappi con disinfettante micobatterico Mescolare tutti i flaconi invertendo pi volte Rimuovere il sigillo dal flacone di un VersaTREK Connector Posizionare l estremit dell ago del VersaTREK Connector nel tappo del flacone di coltura NOTA Non capovolgere il flacone di coltura mentre VersaTREK Connector si trova sul flacone Il liquido nell ago pu interferire con le letture della pressione del flacone 17 10 Collocare nello strumento il flacone di coltura con il VersaTREK Connector Per maggiori informazioni sull inserimento del flacone consultare il manuale d uso del sistema VTI ESP Suggerimento per il caricamento se il numero indicatore del campione 123 assegnare ai flaconi del test alla PZA numeri indicatori come ad esempio 123PC per il controllo positivo di crescita e 123P per la pirazinamide In questo modo sar possibile ricercare e ordinare in un gruppo tutti i flaconi associati a questo numero indicatore del campione RISULTATI Per i test di sensibilit che utilizzano il sistema VTI ESP l isolato analizzato viene interpretato come sensibile o resistente a un farmaco in base a una formula Registrare il tempo di rilevamento del flacone senza farmaco Questo tempo impiegato per cal
34. mmediately and show this container or label REFERENCES 1 Stratton C W 1992 The resurgence of tuberculosis Inf Dis Newsl 11 73 80 2 Tenover F C J T Crawford R E Huebner L J Geiter C R Horsberg Jr and R C Good 1993 The resurgence of tuberculosis Is your laboratory ready J Clin Microbiol 31 767 770 3 CDC National Institutes of Health Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4th Edition Atlanta US Department of Health and Human Services Public Health Service CDC and NIH 1999 DHHS publication no CDC 93 8395 ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BACTEC is a trademark of Becton Dickinson and Company ESP and VersaTREK are trademarks of TREK Diagnostic Systems Inc T EK DIAGNOSTIC SYSTEMS For additional information call TREK Technical Support at 1 800 642 7029 TREK Diagnostic Systems 982 Keynote Circle Suite 6 Cleveland Ohio 44131 800 871 8909 LEC REP TREK Diagnostic Systems Imberhorne Lane East Grinstead West Sussex RH19 1QX England L TDST015 3 2006 09 Espanol VersaTREK MYCO PZA KIT 7116 70 APLICACIONES PREVISTAS El VersaTREK Myco PZA Kit es un sistema cualitativo rapido que se emplea para realizar in vitro la prueba de sensibilidad a la pirazinamida PZA de la Mycobacterium tuberculosis a partir de un cultivo El VersaTREK Myco PZA Kit se utiliza en combinaci n con el VersaTREK Automated Microbial Detection System VTI y el ESP Cu
35. ntazione per la sicurezza dei materiali per informazioni complete sui rischi 3 AVVERTENZA CAMPIONE DI PROVA POTENZIALMENTE INFETTIVO Per la manipolazione e lo smaltimento di agenti infettivi attenersi alle normative istituzionali 4 Durante il trattamento del Mycobacterium tuberculosis cresciuto in coltura si raccomanda di attenersi alla prassi al equipaggiamento di sicurezza e agli impianti del Livello 3 di biosicurezza 5 Il VersaTREK Connector contiene un ago rientrante sterile subito dopo la rimozione del sigillo ma potenzialmente contaminato subito dopo l utilizzo Seguire la politica istituzionale per il trattamento e lo smaltimento di dispositivi contaminati da sostanze biologiche pericolose Maneggiare con attenzione Sterilizzare prima dello smaltimento Per lo smaltimento utilizzare appositi contenitori per rifiuti con pericolo di lesione Non riutilizzare 6 Verificare che nessun flacone presenti segni di contaminazione rottura o altro segno di deterioramento Non utilizzare flaconi dall aspetto torbido o con segni di danneggiamento 7 Utilizzare solo siringhe con sistema di bloccaggio ago 8 Sterilizzare in autoclave tutti i flaconi di VersaTREK Myco prima dello smaltimento 9 Reidratare i flaconi con farmaco PZA liofilizzato solo con il PZA Rehydration Buffer acido fornito nel kit CONSERVAZIONE VersaTREK Myco PZA Conservare a una temperatura di 2 8 C in luogo protetto dalla luce In caso di reidratazione conserv
36. ntegrati con VersaTREK Myco GS e pirazinamide Un VersaTREK Connector viene collegato a ciascun flacone in modo da creare un sistema chiuso di monitoraggio del flacone con lo strumento VTI ESP Una membrana idrofobica nel VersaTREK Connector previene l aerosolizzazione Le informazioni dell isolato sono inserite nel computer del sistema e i flaconi sono collocati nello strumento per l incubazione a 35 C in condizioni stazionarie Il sistema VTI ESP rileva la crescita micobatterica mediante il monitoraggio continuo ogni 24 minuti della velocit di consumo dell ossigeno all interno dello spazio di testa del flacone di coltura e riporta la reazione a tale crescita con un segnale positivo AI termine del periodo di incubazione specificato determinato per ciascun isolato analizzato dal flacone di controllo senza antibiotico viene determinato manualmente se l isolato sensibile o resistente all antibiotico 15 REAGENTI VersaTREK Myco PZA Kit contiene due flaconi di pirazinamide liofilizzata e quattro flaconi di tampone acido di reidratazione della PZA Ciascun flacone del farmaco deve essere reidratato a 25 ml con il tampone acido di reidratazione FORMULA IN CASO DI REIDRATAZIONE PRB Tampone acido di reidratazione della PZA 25 ml PZA Pirazinamide 0 45 w v SA Agente solubilizzante 1 25 w v Regolati per soddisfare i criteri di prestazione PRECAUZIONI 1 Per l utilizzo diagnostico In Vitro 2 Fare riferimento alla docume
37. o empleado en la detecci n en el caso de ambos sistemas no resultaron significativamente distintos An lisis en centros cl nicos Evaluaci n cl nica La prueba de sensibilidad VersaTREK Myco PZA fue evaluada en cinco puntos geogr ficos distintos compuestos por centros de referencia regionales laboratorios de salud p blica y laboratorios dependientes de hospitales universitarios Se compar el VersaTREK Myco PZA Kit con el sistema de an lisis BACTEC 460TB PZA An lisis de reproducibilidad La reproducibilidad de lotes se llev a cabo gracias a dos cepas perfectamente caracterizadas de M tuberculosis procedentes del CDC y al empleo de dos lotes de caldo de cultivo VersaTREK Myco y otros dos de VersaTREK Myco GS El an lisis se realiz por triplicado en tres d as diferentes La reproducibilidad total fue del gt 95 del inoculante activado Prueba de provocaci n El conjunto del CDC utilizado para la prueba de provocaci n y compuesto por 30 microrganismos se someti al an lisis en tres lugares distintos Del total de 90 puntos posibles para la prueba nicamente 77 se consideraron v lidos La reducci n del n mero de pruebas tasa de repetici n del 7 2 se debi a la ausencia de crecimiento a la contaminaci n o a asuntos relacionados con el instrumental De los 77 microorganismos sometidos a la prueba 68 resultaron ser sensibles y 9 resistentes Se produjo una coincidencia total del 98 7 en funci n de los resultados p
38. pu s de esta operaci n la concentraci n de f rmaco ser de 4500 ug ml Agregue en condiciones as pticas 1 0 ml de f rmaco a cada frasco de cultivo inyect ndolo a trav s del diafragma con una aguja y una jeringa La concentraci n final de pirazinamida ser de 300 ug ml En el caso del frasco testigo sin f rmaco a ada 1 ml de PZA Rehydratation Buffer en lugar del f rmaco Se pueden realizar 25 an lisis a partir de una sola ampolla F rmaco Concentraci n de Volumen a adido a Concentraci n final en los f rmaco tras la los frascos de prueba frascos de la prueba reconstituci n Myco PZA 4500 ug ml 1 mi 300ug ml Es necesario comprobar que el inoculante de una muestra para realizar la prueba de sensibilidad sea un cultivo puro de M tuberculosis antes de proceder a la realizaci n de la prueba PZA y prepararlo del siguiente modo Frasco de material activo VersaTREK Myco Se inyecta en condiciones as pticas un volumen de 0 5 ml de un equivalente de 1 0 de McFarland creado a partir de un agar o una fuente l quida desarrollado en un Middlebrook 7H9 o del l quido de un frasco de detecci n primaria en un frasco de cultivo VersaTREK Myco al que se ha a adido 1 0 ml de VersaTREK Myco GS El frasco incorpora un VersaTREK Connector y se incuba en el instrumento hasta que se produce una se al positiva El frasco de material activo se debe utilizar en un plazo de 72 horas Retire el VersaTREK Connector y agite en v rtice du
39. rante uno a dos minutos A ada 0 5 ml en una diluci n de 1 10 de cultivo procedente de un frasco de material activo VersaTREK Myco con resultado positivo a los frascos de cultivo adecuados que contengan el f rmaco y al frasco testigo del crecimiento que no lo contenga Limpie los frascos de cultivo y los topes con desinfectante micobactericida Mezcle todos los frascos invirti ndolos varias veces Extraiga la junta de la parte inferior de un VersaTREK Connector Introduzca el extremo de aguja del VersaTREK Connector a trav s del tap n del frasco de cultivo NOTA no invierta el frasco de cultivo mientras el VersaTREK Connector est en el frasco El l quido en la aguja puede interferir en las lecturas de presi n del frasco 10 10 Coloque el frasco del cultivo en el instrumento con el VersaTREK Connector Consulte el manual del usuario del sistema VTI ESP para obtener informaci n adicional sobre la introducci n de frascos Sugerencias para la operaci n de carga Si el n mero de identificador de prueba es 123 asigne a los frascos de PZA n meros de identificaci n por ejemplo 123CP para el control del crecimiento positivo y 123P para la pirazinamida De este modo se podr n localizar todas los frascos asociadas a este n mero de identificador de prueba as como ubicarlos dentro de un grupo RESULTADOS Para realizar la prueba de sensibilidad utilizando el sistema VTI ESP se valorar si un aislado de prueba es sens
40. revistos 13 Analisis clinico de aislados con uso de inoculantes activos La prueba de sensibilidad de la Mycobacterium tuberculosis se realiz en 96 aislados procedentes de una fuente de inoculante l quida El cuadro 2 muestra los resultados del an lisis cl nico de aislados con una concentraci n de PZA de 300 ug ml en el caso del sistema ESP y de 100 ug ml en el del sistema BACTEC Los an lisis mostraron 11 resultados discordantes en relaci n con el inoculante activado De estos 11 resultados discordantes 10 eran resistentes a ESP VTI y sensibles a BACTEC y uno era sensible a ESP VTI y resistente a BACTEC Cuadro 2 Resultados obtenidos en aislados cl nicos Prueba de sensibilidad de VersaTREK Myco PZA en comparaci n con los de BACTEC 460TB Sistema Sistema ESP VTI BACTEC 460TB Resultados Sensible Resistente previstos Origen s R Coincidencia Coincidencia do Pruebas Coincidencia de las Coincidencia las categorias categorias 95 IC 95 IC Liquido 96 83 13 73 88 79 94 1 12 92 3 64 99 8 a Intervalos de confianza IC del 95 Lee Eric W and Dubin N Estimation and Sample Size Considerations for Clustered Binary Responses 1994 Statistics in Medicine Vol 13 1241 1252 Figura 1 Duraci n total de la prueba para la preparaci n del inoculante activado para VersaTREK Myco PZA Prueba de sensibilidad de Mycobacterium tuberculosis
41. solide tassi di ripetizione in questo studio sono stati lt 10 Il tempo medio per il conseguimento dei risultati del test di sensibilit VersaTREK Myco PZA stato di 8 18 giorni per un inoculo di coltura liquida con un intervallo da 3 a 15 giorni Vedere figura 1 di seguito 19 CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE Test interni Riproducibilita del lotto La riproducibilit del lotto stata eseguita utilizzando 4 ceppi di M tuberculosis ben definiti analizzati tre volte e in tre giorni diversi Durante il test sono stati presentati tre lotti di brodo di VersaTREK Myco La riproducibilit complessiva stata del 100 per inoculo di coltura stata calcolata la riproducibilit di otto lotti di VersaTREK Myco PZA prodotto sette brodi VersaTREK Myco e sei VersaTREK Myco GS con risultati accettabili per tutti i lotti CDC test Challenge su pannello Dieci ceppi ben definiti di M tuberculosis sono stati analizzati e confrontati con BACTEC 460TB e con i risultati previsti Otto ceppi erano sensibili e dieci erano resistenti alla PZA Si verificata una corrispondenza completa del 100 con BACTEC e con i risultati previsti Confronto tra ESP Culture System Il e VersaTREK Microbial Detection System Il recupero di diversi microorganismi e il tempo di rilevamento sono stati utilizzati per dimostrare che non esistono differenze tra ESP Culture System Il e VersaTREK Microbial Detection System con test aggiuntivo del M tuberculosis e
42. toppers with a Mycobactericidal disinfectant Mix all bottles by inverting several times Remove the seal from the bottom of a VersaTREK Connector Press the needle end of the VersaTREK Connector through the culture bottle stopper NOTE Do not invert the culture bottle while the connector is on the bottle Fluid in the needle may interfere with the pressure readings for the bottle Place the culture bottle with the VersaTREK Connector into the instrument Refer to the VTI ESP System Operator s Manual for details on bottle entry Loading suggestion If the sample accession number is 123 give the PZA test bottles accession numbers such as 123PC for the positive growth control and 123P for pyrazinamide In this way all bottles associated with this sample accession number will be able to be searched for and located as a group RESULTS For susceptibility testing using the VTI ESP System a test isolate is interpreted as being susceptible or resistant to a drug based on a formula Record the time to detection of the drug free bottle This time is used to calculate susceptible or resistant interpretations using the following formula Susceptible No growth or the time to detection of the drug bottle is greater than three days rounded to the nearest whole number of the time to detection of the drug free control bottle rounded to nearest whole number Resistant Time to detection of drug bottle is within three days roun
43. tore at 2 8 C PROCEDIMIENTO PRUEBAS DE SENSIBILIDAD DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS UTILIZANDO EL VersaTREK ESP CULTURE SYSTEM Il Materiales suministrados VersaTREK Myco Culture Bottles 7111 42 VersaTREK Myco GS 7112 42 VersaTREK Myco PZA Kit 7116 70 VersaTREK Connectors 7150 44 Materiales necesarios pero no suministrados Agua destilada o desionizada est ril Autoclave Middlebrook 7H10 u otro agar micobacteriano o caldo de cultivo basado en huevos Incubadora CO 37 C Bucles est riles Jeringuillas de tuberculina est riles con agujas permanentemente colocadas Desinfectante micobactericida ej Amphyl OMNI etc Tampones de alcohol Mezclador de v rtice Armaz n de seguridad biol gica Microscopio Materiales para muestras de tinci n Organismo de control de calidad M tuberculosis ATCC 27294 Inoculaci n de frascos de cultivo VersaTREK Myco para la pruebas de sensibilidad a micobacterias 1 Etiquete cada una de los frascos de cultivo VersaTREK Myco con una informaci n identificativa En la prueba de la PZA se utilizar n dos frascos por prueba Desinfecte los tapones de los frascos de cultivo con alcohol Agregue en condiciones as pticas 1 0 ml de VersaTREK Myco GS a cada frasco de cultivo inyect ndolo a trav s del diafragma con una aguja y una jeringa Rehidrate el PZA liofilizado a adiendo en condiciones as pticas 25 ml de PZA Rehydratation Buffer a cada una de las ampollas de f rmaco Des
44. ulante activo l quido con unos l mites de 3 y 15 d as V ase la figura 1 a continuaci n CARACTER STICAS DEL FUNCIONAMIENTO An lisis interno Reproducibilidad de los lotes La reproducibilidad de los lotes se llev a cabo utilizando 4 cepas perfectamente caracterizadas de M tuberculosis que fueron analizadas por triplicado en tres d as distintos Tres lotes de caldo de cultivo VersaTREK Myco quedaron representados en el an lisis La reproducibilidad total fue del 100 del inoculante activado Se evalu la reproducibilidad de ocho lotes de VersaTREK Myco PZA manufacturado de siete de caldos de cultivo VersaTREK Myco y de seis VersaTREK Myco GS obteni ndose resultados aceptables en todos los casos CDC Prueba de provocaci n en placa Se analizaron diez cepas de M tuberculosis perfectamente caracterizadas y se compararon con las de BACTEC 460TB y con los resultados previstos Ocho cepas resultaron ser sensibles y dos resistentes a la PZA Se produjo una coincidencia total del 100 con BACTEC y con los resultados previstos Comparaci n entre el ESP Culture System II y el VersaTREK Microbial Detection System La recuperaci n de diferentes microorganismos y el tiempo empleado en la detecci n se utilizaron para demostrar que no existe ninguna diferencia en el rendimiento obtenido con el ESP Culture System Il y el VersaTREK Microbial Detection System con el an lisis adicional de la M tuberculosis y la PZA Los resultados y el tiemp
45. vo inoculadas con los aislados de M tuberculosis a partir de una gran variedad de fuentes de muestra Las esponjas de los frascos de VersaTREK Myco aportan una matriz de soporte para el crecimiento y permiten aumentar la superficie expuesta al ox geno del espacio libre superior La tecnolog a del sistema VTI ESP se basa en la detecci n de los cambios a causa del crecimiento microbiano originados en la presi n del espacio libre superior del interior de un frasco cerrado herm ticamente Se ha desarrollado un algoritmo especial para la detecci n de las micobacterias de crecimiento muy lento Gracias al sistema VTI ESP la PZA un f rmaco empleado en el tratamiento de la tuberculosis se puede inyectar en los frascos de VersaTREK Myco que lleven incorporado el VersaTREK Myco GS Se a adir a un frasco testigo que no incorpore el f rmaco adem s de a un frasco de prueba que contenga PZA un inoculante del cultivo confirmado de M tuberculosis que se haya desarrollado en un frasco de material activo Si el organismo es sensible al f rmaco no se registrar crecimiento microbiano o ser retardado Si el organismo es resistente a la PZA se detectar el crecimiento microbiano por medio de la generaci n de una curva con una tendencia descendente a partir de la l nea de base El tiempo empleado en la detecci n del frasco que no contiene el f rmaco servir para determinar cu ndo finalizar el an lisis El f rmaco utilizado en este sistema es el f
46. vos puros de M tuberculosis El usuario debe garantizar la pureza del cultivo en particular si el resultado pone de manifiesto su resistencia En el caso de los cultivos que contengan m ltiples especies de micobacterias es posible que se obtengan resultados err neos 4 Si no se respetan las recomendaciones del fabricante a la hora de preparar los aislados es posible que se obtengan resultados inexactos 5 So no se realiza de un modo adecuado la rehidrataci n de la PZA con el volumen adecuado de PZA Rehydratation Buffer cida puede que los resultados obtenidos no sean del todo exactos 12 6 Es importante mezclar cuidadosamente los frascos inoculados Si la mezcla no se realiza del modo adecuado es posible obtener resultados indicativos de una falsa resistencia 7 Si no se utiliza correctamente el complemento para el crecimiento VersaTREK Myco GS es posible que los resultados de sensibilidad est n falseados RESULTADOS ESPERADOS Para el an lisis inicial se analizaron un total de 96 aislados cl nicos de M tuberculosis con el VersaTREK Myco PZA Kit en cinco puntos geogr ficos distintos El an lisis incluye a los aislados cl nicos reci n obtenidos y a los aislados de subcultivos procedentes de una fuente l quida o s lida La tasa de repetici n establecida para este estudio fue del lt 10 El plazo medio para obtener los resultados de la prueba de sensibilidad de VersaTREK Myco PZA fue de 8 18 d as en el caso de un inoc
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