Cervista ® HPV HR 92-011, PRD-01560
Contents
1. Copias reacci n HPV Positivo HPV Negativo Diana o c lulas ml extra das N n n 2500 84 13 15 71 84 HPV 33 5000 84 81 96 3 4 10 0008 84 84 100 0 0 2500 84 1 1 83 99 HPV 35 5000 84 60 71 24 29 10 000 84 84 100 0 0 2500 84 52 62 32 38 HPV 39 5000 84 84 100 0 0 10 000 84 84 100 0 0 2500 84 84 100 0 0 HPV 45 5000 84 84 100 0 0 10 000 84 84 100 0 0 25008 84 77 92 7 8 HPV 51 5000 84 84 100 0 0 10 000 84 84 100 0 0 2500 84 21 25 63 75 HPV 52 50008 84 84 100 0 0 10 000 84 84 100 0 0 25008 84 64 76 20 24 HPV 56 5000 84 83 99 1 1 10 0007 84 84 100 0 0 25008 84 60 71 24 29 HPV 58 5000 84 84 100 0 0 10 000 84 84 100 0 0 25008 84 16 19 68 81 HPV 59 50008 84 79 94 5 6 10 0008 84 84 100 0 0 2500 84 40 48 44 52 HPV 66 5000 84 84 100 0 0 10 000 84 84 100 0 0 2500 84 43 51 41 49 HPV 68 5000 84 84 100 0 0 10 000 84 84 100 0 0 2500 SiHa 97 500 Jurkat 84 0 0 84 100 SiHa Jurkat 5000 SiHa 95 000 Jurkat 84 15 18 69 82 20 000 SiHa 80 000 Jurkat 84 84 100 0 0 1250 HeLa 98 750 Jurkat 84 65 77 19 23 HeLa Jurkat 2500 HeLa 97 500 Jurkat 84 84 100 0 0 10 000 HeLa 90 000 Jurkat 84 84 100 0 02. L mite inferior de Laboratorios N mero de N mero de Porcentaje de confianza del 95 comparaciones coincidencias coincidencia de un solo lado Laboratorio 1 vs 500 490 98 0 96 6 Laboratorio 2 Laboratorio 1 vs A Laboratorio 3 500 500 100 0 99 4 Laboratorio 2 vs Laboratorio 3 500 490 98 0 96 6 Todos los pares de laboratorios 1500 1480 98 7 97 9 Sustancias interferentes Se analizaron cuatro muestras cervicouterinas una negativa al HPV tres positivas al HPV y tres muestras de estirpe celular una negativa al HPV dos positivas al HPV con sustancias agregadas que potencialmente podr an estar presentes en la muestra cervicouterina Las sustancias que se agregaron a las muestras inclu an la soluci n PreservCyt dos tipos de lavados vaginales jalea anticonceptiva dos tipos de cremas antimic ticas y muestras cl nicas negativas que conten an visualmente sangre y mucosidad La soluci n PreservCyt el lavado la jalea anticonceptiva y las cremas antimic ticas se agregaron a dos niveles 0 5 y 2 Estos niveles se seleccionaron para representar situaciones extremas que podr an potencialmente ocurrir durante la recolecci n de muestras si la higiene del cuello uterino no se realizaba correctamente antes de obtener la muestra El ADN se aisl de muestras puras y no puras usando el Genfind DNA Extraction Kit y se analizaron con la prueba Cervista HPV HR para evaluar la interferencia provocada p
3. controles k HPV Oligo Mix 1 203 8k 1 25 Cleavase Enzyme Solution 2k 1 25 Volumen de la mezcla total 10k 1 25 pl Reduzca la temperatura del termociclador a 63 C Agregue 10 ul de la mezcla de reacci n apropiada a los pocillos con control o con muestra v ase la figura 2 procurando pipetear por debajo del aceite mineral Incube la placa a 63 C durante 4 horas Recogida de datos 1 Tenga siempre la placa a temperatura ambiente antes de la lectura Si la placa no se puede leer inmediatamente gu rdela de 2 a 8 C se recomienda leer la placa antes de 24 horas tras la finalizaci n del ensayo Coloque la placa de 96 pocillos el pocillo A1 debe quedar en la esquina superior izquierda en el soporte de la placa del lector de placas de fluorescencia Retire la cinta de sellado de placas Defina el tipo de placa para establecer las coordenadas y la altura de la sonda para ese tipo de placa en particular Guarde las configuraciones Lea la placa entera Se requieren dos exploraciones por separado FAM excitaci n 485 nm emisi n 530 nm y Red excitaci n 560 nm emisi n 612 nm Para detectar la se al HPV el instrumento debe estar configurado para detectar el fluor foro FAM Para detectar el ADN gen mico de muestra el instrumento debe estar configurado para detectar el fluor foro Red Ajuste la ganancia del lector de la placa de fluorescencia para que est en el rango din
4. Se han documentado m s de 100 tipos de HPV en la bibliograf a aproximadamente 40 de los cuales infectan el rea anogenital y se transmiten por v a sexual De los tipos de HPV que se transmiten por v a sexual hasta ahora se conocen 14 genotipos oncog nicos HPV16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 tipos de alto riesgo HR como la causa de casi todos los c nceres de cuello uterino La detecci n del ADN del HPV de alto riesgo junto con un resultado de citolog a ambiguo ASC US sit a a una mujer en un riesgo mayor de presentar una neoplasia intraepitelial cervicouterina subyacente 2 o 3 CIN 2 o CIN 3 Mientras que el CIN 3 s lo aparece en aproximadamente un 5 de los casos de ASC US es un precursor inmediato del c ncer de cuello uterino y por consiguiente su detecci n es muy importante para el tratamiento de la paciente Por lo tanto la identificaci n de mujeres con una citolog a ASC US junto con una infecci n por HPV de alto riesgo es una ayuda til para que los m dicos decidan a qui n se debe monitorizar o tratar de forma m s agresiva En 2002 varios grupos de profesionales sanitarios de EE UU publicaron las directrices para el tratamiento de las pacientes y recomendaron m todos de diagn stico precoz del c ncer de cuello uterino seg n la edad la presencia de anomal as citol gicas en una muestra de la prueba de Papanicolaou y otros factores 1 11 Estas directrices de tratamiento de la
5. 84 9 87 3 La coincidencia porcentual positiva entre los dos m todos fue de 91 8 89 7 93 6 y la concidencia porcentual negativa fue de 84 2 IC 95 82 7 85 7 Se midi el rendimiento cl nico de la prueba Cervista HPV HR frente a los resultados de una colposcopia y una histolog a Las muestras de biopsia procedieron de mujeres con una citolog a ASC US garantizadas por las directrices de cuidados est ndar en cada laboratorio participante Los resultados histol gicos de consenso provistos por un panel de revisi n central sirvieron de criterio de referencia para determinar la presencia o ausencia de enfermedad En ausencia de datos histol gicos la falta de lesiones cervicouterinas colposc picamente visibles y sin biopsia se identificaron con una ausencia de enfermedad Hubo 1347 sujetos ASC US enfermos conocidos histolog a central o colposcopia negativa y resultados de Cervista HPV HR En las tablas 5 y 6 aparece una comparaci n de los resultados de Cervista HPV HR con una colposcopia histolog a central 13 Tabla 5 resultados de Cervista HPV HR y de colposcopia histolog a consenso CIN2 entre mujeres con citolog a ASC US Cervista HPV HR Colposcopia Histolog a Positivo Negativo Total Positivo 64 705 769 Negativo 5 573 578 Total 69 1278 1347 Incluye resultados indeterminados P CIN2 Histolog a Ni CIN ni CIN1 por histolog a central o colposcopia sin histolog a ce
6. al Red de la muestra entre la se al Red del control negativo NTC CV_ADN gen mico FOZ coeficiente de variaci n porcentual para los valores de ADN gen mico FOZ generados por las tres HPV Oligo Mix 10 Criterios Resultado generado CV ADN gen mico lt 25 si Uno o mas HPV FOZ gt 0 70 gt si Proporci n HPV FOZ lt 1 525 si Uno o mas HPV FOZ lt 1 93 gt si ADN gen mico FOZ medio lt 1 50 si IND CV alto IND HPV FOZ bajo NEG IND ADN genomico bajo Figura 3 Criterios de denominacion de las muestras ordenados de arriba a abajo CONTROL DE CALIDAD Control negativo 1 El control negativo No Target Control debe producir los resultados apropiados para que las muestras de esa placa sean v lidas Si no cumple esos criterios las muestras y los controles de esa placa tampoco son validos y deben repetirse v ase la tabla 3 2 La se al m nima para cada una de las tres mezclas debe ser mayor o igual a 600 RFU 2 600 3 El CV de la se al HPV media de las tres mezclas debe ser menor del 25 0 lt 25 0 o las muestras y controles de esa placa no son v lidos y deben repetirse v ase la tabla 3 4 El CV de la se al de ADN gen mico media de las tres mezclas debe ser menor de 25 0 lt 25 0 Tabla 3 criterios del control negativo No Target Control T T CV m x Se al Se al de ADN Resultados i a p HPV y ADN Resu
7. con afinidad por los tipos Mix E tapa y raya 1 x 1400 pl 8 x 1400 ul HPV 18 39 45 59 y 68 suspendido en agua amarillas y tamp n MOPS pH 7 5 HPV Oligo 03 Oligonucle tidos con afinidad por los tipos Mix Bi tapa y raya de 1 x 1400 pl 8 x 1400 ul HPV 16 31 33 35 52 y 58 suspendido en color naranja agua y tamp n MOPS pH 7 5 Cleavase E Cleavase Enzyme suspendida en 140 mM MgClz trometamol 10 mM pH 8 0 25 mM t e e ol eee On KCI 0 25 Tween 20 0 25 Nonidet P40 25 Glicerol y 0 05 mg ml BSA C1 1000 copias ul ADN tipo 51 HPV clonado HPV tapa y 3000 copias ul ADN HIST2H2BE clonado en Control 1 transparente y ad SASRA tRNA de levadura y tamp n de cido ed tico raya negra 0 1 mM trometamol 10 mM C2 1000 copias yl ADN tipo 18 HPV clonado HPV tapa y 3000 copias ul ADN HIST2H2BE clonado en Control 2 transparente y PERRI BAA OHI tRNA de levadura y tamp n de cido ed tico raya negra 0 1 mM trometamol 10 mM C3 1000 copias yl ADN tipo 16 HPV clonado HPV tapa y 3000 copias ul ADN HIST2H2BE clonado en Control3 transparentey 1X350 pi 9x ONH tRNA de levadura y tamp n de cido ed tico raya negra 0 1 mM trometamol 10 mM Control sin NTC molde o tapa tRNA de levadura y tamp n de cido ed tico control transparente y Pees 9285041 0 1 mM trometamol 10 mM negativo raya negra ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1 Para uso de diagn stico in vitro 2 Se deben tomar precauciones de seguridad universales cuando se man
8. controlado descritas en el estudio de selecci n ASC US LSIL Triage Study ALTS En la tabla 7 aparece una comparaci n del dise o del estudio la prevalencia de la enfermedad y las caracter sticas de rendimiento cl nico para el estudio Hologic y el ALTS La diferencia en las tasas CIN2 observadas entre los dos estudios pueden reflejar las diferencias entre las poblaciones as como las diferencias de diagn stico de la enfermedad 14 Tabla 7 Comparaci n del ensayo cl nico Hologic y ALTS Criterio ALTS Hologic N mero de centros participantes Estados 4 4 89 22 Edad media de los sujetos 29 33 Sujetos con colposcopia completada 1149 1347 Sujetos sin lesi n sin biopsia realizada 25 28 Sujetos sin lesi n patol gica en la biopsia 49 53 Sujetos con CIN1 15 14 Sujetos con CIN2 11 5 Tasa de detecci n para CIN2 96 93 Tasa de detecci n para CIN3 96 100 Valor predictivo negativo para CIN2 98 9 99 1 Valor predictivo negativo para CIN3 99 5 100 0 Tasa de referidos a colposcopia 57 57 Concordancia con PCR 82 7 86 1 Grupo de colposcopia inmediata de ALTS N mero de sujetos con una enfermedad conocida y resultados de Cervista HPV HR La tasa de referidos para mujeres de m s de 30 a os fue del 43 Sensibilidad anal tica Se analiz el ADN plasm dico de HPV clonado que representa los 14 tipos de HPV detectados por la prue
9. lidos cuando los controles negativos y positivos producen los resultados correctos Si el control negativo No Target Control no es v lido o si cualquier resultado para un control positivo no es v lido todos los resultados de las muestras de esa placa no son v lidos y deben repetirse Consulte las secciones de resoluci n de problemas en las Instrucciones de uso y en el Software User Manual for Invader Call Reporter Consulte la secci n Resoluci n de problemas del Manual del usuario de Cervista MTA referencia MAN 02378 002 para el sistema Cervista MTA 2 Todos los requisitos de control de calidad deben realizarse segun las normas locales estatales y federales y seg n los requisitos de acreditaci n LIMITACIONES 1 La prueba Cervista HPV HR detecta el ADN de los tipos de HPV de alto riesgo 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 Esta prueba no detecta ADN de los tipos de bajo riesgo de HPV por ej 6 11 42 43 44 2 La prueba Cervista HPV HR muestra la reactividad cruzada a dos tipos de HPV de riesgo desconocido Se observ un resultado positivo de HPV con 5000 copias reacci n del tipo de HPV 67 y 50 000 copias reacci n del tipo de HPV 70 3 Un resultado negativo no excluye la posibilidad de infecci n por HPV porque es posible que niveles muy bajos de infecci n o un error de muestreo provoquen un resultado negativo falso 4 Esta prueba s lo ha sido validada para su uso en muestras cervicouterinas rec
10. n preparadas no se usaron en el per odo de tiempo recomendado Use mezclas de reacci n antes de 30 minutos de haberlas preparado La muestra presenta el resultado IND CV alto Mezcla insuficiente o no homog nea de muestras Adici n no homog nea de mezcla de reacci n Adici n no homog nea de la muestra e Aseg rese de que todas las muestras y reactivos se mezclen completamente e Cuando agregue la mezcla de reacci n a cada pocillo coloque las puntas en la parte inferior del pocillo por debajo del aceite mineral y transfiera lentamente hacia arriba y hacia abajo de 3 a 4 veces e Verifique que se expulse todo el l quido de la punta de la pipeta durante las adiciones e Verifique que se agreg la muestra correcta a cada pocillo e Verifique que se agreg el volumen correcto a cada pocillo e Verifique que la informaci n de calibraci n del equipo sea la actual e Realice una inspecci n visual para buscar vol menes homog neos entre los pocillos Sospecha de contaminaci n durante la adici n de muestras Utilice puntas con filtro de aerosol sin nucleasas y tubos est riles durante la instalaci n Utilice guantes cuando prepare la prueba Aseg rese de que las puntas de pipeta s lo tocan la soluci n que se est dispensando No toque las puntas de las pipetas con las manos Limpie las superficies del laboratorio utilizando los materiales
11. 0 06 51 2500 5000 1 35 0 09 52 1250 2500 1 28 0 04 56 1250 2500 1 37 0 10 58 2500 5000 1 35 0 09 59 2500 5000 1 35 0 09 66 2500 5000 1 30 0 06 68 2500 5000 1 30 0 06 Media 1 324 0 074 15 Precisi n y especificidad comparada con el m todo de PCR y secuenciaci n de ADN Se realiz un estudio para evaluar la capacidad de la prueba Cervista HPV HR para detectar ADN del HPV de alto riesgo de muestras cl nicas Las muestras se caracterizaron utilizando un m todo de determinaci n del genotipo del HPV de investigaci n que utilizaba una amplificaci n de PCR degenerada seguida por una secuenciaci n de tipo espec fico de HPV El m todo de PCR secuenciaci n se utiliz como nico determinante para la presencia de ADN del HPV El estudio se realiz con 192 muestras almacenadas en la soluci n PreservCyt de las cuales 189 presentaron resultados de secuenciaci n claros De estas 189 muestras dos resultaron indeterminadas con la prueba Cervista HPV HR Los resultados indeterminados no se incluyeron en el an lisis comparativo de la prueba Cervista HPV HR y los m todos de PCR secuenciaci n La proporci n de los resultados negativos de PCR secuenciaci n que fueron positivos con la prueba Cervista HPV HR fue de 5 187 Por otro lado la proporci n de los resultados positivos de la PCR secuenciaci n que fueron negativos seg n la prueba Cervista HPV HR fue de 11 187 v ase la tabla 9 Cuando se analiz de esta manera se
12. 10 000 84 2 2 82 98 Jurkat 20 000 84 0 0 84 100 100 000 84 O 0 84 100 Rendimiento de la prueba Cervista HPV HR en muestras recogidas en SurePath Preservative Fluid en comparaci n con las muestras recogidas en PreservCyt Solution Un total de 418 pacientes participaron en un estudio de recogida conjunta para obtener muestras cervicales emparejadas recogidas de cada paciente en SurePath Preservative Fluid y PreservCyt Solution Cada par de muestras fue analizado con la prueba Cervista HPV HR Se observ una coincidencia en porcentaje total del 92 para los resultados obtenidos para las muestras recogidas en SurePath Preservative Fluid con respecto a los resultados obtenidos con las muestras recogidas en PreservCyt Solution 20 Tabla 16 Resumen de los resultados de Cervista HPV HR con muestras cervicales recogidas conjuntamente en SurePath Preservative Fluid y PreservCyt Solution Referencias Resultados de muestras en SurePath Resultados de muestras en PreservCyt Total 418 418 positivas 29 4 29 2 negativas 69 9 70 6 indeterminadas 0 7 0 2 1 2 3 Pagina web del National Cancer Institute www cancer gov 2008 Meijer CJ Snijders PJ and Castle PE 2006 Clinical utility of HPV genotyping Gynecol Oncol 103 12 17 Wright TC Jr Massad LS Dunton CJ Spitzer M Wilkinson EJ and Solomon D 2007 2006 consensus guidelines for the ma
13. 614 402 5 795 763 5 846 717 5 985 557 5 994 069 6 001 567 6 090 543 6 090 606 6 348 314 6 458 535 6 555 357 6 562 611 6 635 463 6 673 616 6 759 226 6 872 816 6 875 572 6 913 881 7 060 436 7 067 643 y 7 087 381 n meros de patente en Canad 2 163 015 y 2 203 627 n meros de patente en Australia 694 736 731 062 737 449 738 849 744 369 779 443 y 781 188 n mero de patente en Jap n 3 665 648 n mero de patente en Europa 711 361 Todas las patentes de los Estados Unidos y las patentes extranjeras donde sea aplicable que puedan haberse expedido o que se puedan expedir en el futuro con respecto a dichas solicitudes de patentes y todas las solicitudes de patentes en EE UU y en el extranjero y expedici n de patentes correspondientes donde sea aplicable cuyo objeto en su totalidad o en parte tengan derecho al beneficio de las fechas de dep sito de cualquiera de las patentes o solicitudes de patentes anteriores que se enumeren en la documentaci n de este producto GARANT A LIMITADA DEL PRODUCTO GARANT AS Se otorga la garant a del equipo de los suministros y del software al cliente original para que act e sustancialmente seg n las especificaciones publicadas del producto durante un 1 a o desde la fecha de instalaci n si fuera aplicable o desde la fecha de entrega si esta fuera anterior Las opciones y accesorios postventa tienen una garant a de seis 6 meses y la garant a de los tubos de rayos x se correspo
14. CERO INCLUIDOS SIN SALVEDADES LOS CLIENTES DEL CLIENTE LA PRESENTE GARANT A SE CONSIDERAR NULA SI EL CLIENTE TRANSFIERE EL PRODUCTO A CUALQUIER ENTIDAD QUE POSEA MENOS DEL CINCUENTA 50 POR CIENTO DE LA TITULARIDAD DEL PRODUCTO ALGUNOS ESTADOS NO PERMITEN LA EXCLUSI N DE GARANT AS IMPL CITAS POR LO QUE NO SE LE PUEDEN APLICAR LAS EXCLUSIONES MENCIONADAS ANTERIORMENTE ASIMISMO PUEDE QUE TENGA OTROS DERECHOS QUE VAR EN DE UN ESTADO A OTRO Estas garant as no se aplicar n a ning n elemento que haya sido a reparado desplazado o alterado por otra persona que no sea el personal de asistencia autorizado por Hologic b sometido a un abuso estr s o mal uso f sico incluidos t rmico o el ctrico c almacenado mantenido u operado de cualquier manera distinta a lo aconsejado por las especificaciones o instrucciones aplicables de Hologic o d suministrado con otra garant a distinta a la de Hologic o como una versi n previa a su lanzamiento o tal como est 28 RECLAMACIONES Y RESARCIMIENTOS DE LA GARANT A En caso de cualquier reclamaci n de la garant a Hologic sustituir con elementos nuevos o reparados cualquier pieza del equipo componente o suministro consumible que est n cubiertos por la garant a y se esforzar el m ximo posible para restablecer o proporcionar una soluci n temporal ante cualquier defecto o error detectado del software que impida trabajar en conformidad sustancial con las especificaciones de func
15. Cerlistarupv HR Cervista HPV HR 92 011 PRD 01560 USO La prueba Cervista HPV HR tiene dos finalidades 1 Junto con la citolog a cervical en mujeres de a partir de los 30 a os para guiar el tratamiento de la paciente 2 Para clasificar pacientes con resultados de la prueba de Papanicolaou con c lulas escamosas at picas de significado indeterminado ASC US por sus siglas en ingl s para determinar la necesidad de realizar una colposcopia VY l 15 C 92 011 96 30 C PRD 01560 Ns Hologic UK Ltd Link 10 Napier Way REP Crawley West Sussex RH10 9RA UK 44 0 1293 522080 No almacenar en un congelador sin escarcha Prot jala de la luz S LO PARA LA EXPORTACI N PROHIBIDA SU VENTA EN LOS ESTADOS UNIDOS DE AMERICA O CANADA NDICE ABREVIATURAS UTILIZADAS S MBOLOS ARMONIZADOS UTILIZADOS RESUMEN Y EXPLICACI N DE LA PRUEBA PRINCIPIOS DEL PROTOCOLO REACTIVOS SUMINISTRADOS ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES NORMAS DE ALMACENAMIENTO Y MANIPULACI N REACTIVOS Y MATERIALES ADICIONALES 1 MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS RECOGIDA DE LAS MUESTRAS EXTRACCI N Y ALMACENAMIENTO DEL ADN PARA AN LISIS PROTOCOLO DE LA PRUEBA NOTAS DEL PROTOCOLO INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS CONTROL DE CALIDAD LIMITACIONES CARACTER STICAS DE FUNCIONAMIENTO REFERENCIAS GU A DE RESOLUCI N DE PROBLEMAS ABREVIATURAS UTILIZADAS ASC US C lulas escamosas at picas de significado indeterminad
16. El per odo de incubaci n fue m s largo que el per odo recomendado Confirme que la incubaci n se realiz durante el per odo de tiempo especificado y a la temperatura especificada El control negativo No Target Control presenta los siguientes resultados CV alto NTC del HPV CV alto NTC del ADN gen mico Mezcla insuficiente o no homog nea de reactivos Preparaci n incorrecta de mezclas de reacci n Adici n no homog nea del control negativo No Target Control o mezcla de reacci n a la microplaca e Aseg rese que todas las muestras reactivos y mezclas de reacci n se mezclen completamente e Cuando agregue la mezcla de reacci n a cada pocillo coloque las puntas en la parte inferior del pocillo por debajo del aceite mineral y transfiera lentamente hacia arriba y hacia debajo de 3 a 4 veces e Verifique que se expulse todo el l quido de la punta de la pipeta durante las adiciones e Verifique que se agreg el reactivo correcto a cada pocillo e Verifique que se agregasen los vol menes correctos de reactivos a cada pocillo e Verifique que la informaci n de calibraci n del equipo sea la actual e Realice una inspecci n visual para buscar vol menes homog neos entre los pocillos 23 El control presenta un resultado de Control no v lido Sospecha de contaminaci n durante la preparaci n de adici n de muestras o mezcla de reacci n e Ut
17. Infect Dis 194 1291 1299 10 Saslow D Runowicz CD Solomon D Moscicki A B Smith RA Eyre HJ Cohen C American Cancer Society guideline for the early detection of cervical neoplasia and cancer CA Can Jour Clin 2002 53 342 362 11 Wright TC Jr Schiffman M Solomon D Cox JT Garcia F Goldie S Hatch K Noller KL Roach N Runowicz C Saslow D 2004 Interim guidance for the use of human papillomavirus DNA testing as an adjunct to cervical cytology for screening Obstet Gynecol 103 304 309 12 Hall JG Eis PS Law SM Reynaldo LP Prudent JR Marshall DJ Allawi HT Mast AL Dahlberg JE Kwiatkowski RW de Arruda M Neri BP and Lyamichev VI 2000 Sensitive detection of DNA polymorphisms by the serial invasive signal amplification reaction PNAS 97 15 8272 8277 21 GU A DE RESOLUCI N DE PROBLEMAS PROCEDIMIENTO DE ENSAYO MANUAL PARA CERVISTA HPV HR Tabla 17 guia de resoluci n de problemas insuficiente para las mezclas de las muestras agregadas a la placa Problema Posible causa Posible solucion La cantidad de Recalcule manualmente la cantidad necesaria muestras ingresadas de la mezcla de reacci n necesaria para en la ficha Selecci n completar la placa completa de an lisis del Volumen software es inferiora Recree copias impresas de software utilizando la cantidad correcta de muestras reacci n Volumen de mezcla de reacci n excesivo agregado a una microplaca de 96 pocil
18. MENTE POR ESCRITO CON LA EXCEPCI N DE DA OS PERSONALES O MUERTE CAUSADOS POR ACTOS U OMISIONES NEGLIGENTES O INTENCIONADOS POR ERROR POR PARTE DE HOLOGIC EN NING N CASO SE CONSIDERAR A HOLOGIC REPONSABLE BAJO NINGUNA TEORIA LEGAL O POR CUALQUIER OTRA CAUSA YA SEA EN BASE A LA GARANT A CONTRATO PROCEDIMIENTO FRAUDULENTO NEGLIGENCIA O CUALQUIER OTRA TEORIA INCLUSO EN EL CASO DE SER ADVERTIDO DE ESTA POSIBILIDAD DE NINGUNA CANTIDAD QUE EXCEDA EL PRECIO HONORARIO O CARGO QUE PERCIBA HOLOGIC POR EL MISMO Hologic Cervista Cleavase Invader Invader Call Reporter PreservCyt y ThinPrep son marcas comerciales registradas de Hologic Inc El resto de marcas comerciales y marcas comerciales registradas mencionadas en este manual de usuario son propiedad de sus respectivas empresas Algunos componentes del an lisis de cidos nucleicos por ejemplo composiciones y m todos para manipular o visualizar cidos nucleicos para el an lisis pueden incluirse en una o m s patentes que otras partes poseen Igualmente podr an estar patentados los cidos nucleicos que contienen secuencias de nucle tidos espec ficas La fabricaci n uso o venta de estos componentes o cidos nucleicos puede requerir una o m s licencias No se debe interpretar nada en este documento como una autorizaci n o licencia impl cita para realizar usar o vender ninguno de los componentes o cidos nucleicos incluidos en alguna de estas patentes 2011 Ho
19. Verifique que se ha seguido el protocolo adecuado para la extracci n del ADN e Consulte las instrucciones de uso secci n Caracter sticas de funcionamiento sustancias interferentes Volumen de ADN de muestra insuficiente Volumen de eluci n insuficiente durante la extracci n del ADN Repita la extracci n de ADN de la muestra Verifique que se ha seguido el protocolo adecuado para la extracci n del ADN Un n mero alto de muestras de ADN con valores FOZ del FAM positivos en las tres mezclas de reacci n Sospecha de error durante la extracci n de ADN Sospecha de contaminaci n del reactivo de extracci n del ADN e Repita la extracci n de ADN de la muestra e Verifique que se ha seguido el protocolo adecuado para la extracci n del ADN 26 RESOLUCI N DE PROBLEMAS PARA EL SISTEMA CERVISTA MTA Consulte la secci n de Resoluci n de problemas del Manual del usuario de Cervista MTA referencia MAN 02378 002 para sistemas Cervista MTA Informaci n de contacto Fabricante me Hologic Inc 502 S Rosa Road Madison WI 53719 EE UU Tel fono 608 273 8933 P gina web www hologic com Asistencia t cnica Su representante local le informar de las v as de acceso a soporte t cnico desde fuera de los EE UU Distribuidores P ngase en contacto con Hologic para obtener una lista de los distribuidores en todo el mundo Tel fono 608 273 8933 P gina web www
20. apropiados 25 Evaporaci n de la muestra Burbujas en los pocillos de reacci n Verifique la adici n de aceite mineral a cada pocillo En caso de ser posible centrifugue las placas antes de la exploraci n de fluorescencia Las mezclas de reacci n preparadas no se usaron en el per odo de tiempo recomendado Use mezclas de reacci n antes de 30 minutos de haberlas preparado La muestra presenta el resultado IND ADN gen mico bajo Cantidad insuficiente de c lulas en la muestra Sospecha de error durante la extracci n de ADN Se utiliz una cantidad insuficiente de ADN en el ensayo e Mezcle la muestra y repita la extracci n de ADN e Verifique que se agreg el volumen correcto a cada pocillo e Verifique que se ha seguido el protocolo adecuado para la extracci n del ADN Inhibici n de la muestra de ADN Repita la extracci n de ADN de la muestra Consulte las instrucciones de uso secci n Caracter sticas de funcionamiento sustancias interferentes Es posible que la muestra de ADN no haya estado completamente desnaturalizada Verifique que la muestra se desnaturalizase a la temperatura correcta y durante una cantidad de tiempo apropiada La muestra presenta el resultado IND HPV Foz bajo Sospecha de error durante la extracci n de ADN Inhibici n de la muestra de ADN e Repita la extracci n de ADN de la muestra e
21. asos estas infecciones mixtas pueden generar se ales positivas de intensidad similar en todos los pocillos de reacci n y por lo tanto la relaci n HPV FOZ ser menor de 1 525 Para evitar la posibilidad de falsos negativos debido a una situaci n de tres positivos como la descrita anteriormente se aplica un segundo c lculo del siguiente modo cuando la relaci n FOZ es menor de 1 525 pero los tres valores FOZ individuales son mayores que o iguales a un segundo valor de corte de 1 93 la muestra es positiva para el HPV En tres diferentes situaciones se genera una llamada de indeterminaci n 1 cuando el CV entre los valores ADN gen mico FOZ es gt 25 0 CV alto 2 cuando los tres valores HPV FOZ son lt 0 7 HPV FOZ bajo y 3 cuando el valor medio de ADN gen mico FOZ de una muestra negativa es lt 1 5 ADN gen mico bajo En la figura 3 aparece un resumen de los criterios de llamada de las muestras antes descritos Terminolog a HPV_FOZ para cada HPV Oligo Mix la se al FAM de la muestra dividida por la se al FAM del control negativo No Target Control Relaci n HPV_FOZ el valor mayor de HPV FOZ de las tres HPV Oligo Mix dividido por el valor menor de HPV FOZ de las tres HPV Oligo Mix normalizado a 1 0 si FOZ es menor de 1 0 ADN gen mico FOZ medio el valor medio determinado a partir de los tres valores de ADN gen mico FOZ obtenidos a partir de cada una de las tres mezclas de reacci n calculado dividiendo la se
22. ba Cervista HPV HR para determinar la sensibilidad anal tica individual de cada tipo espec fico Los valores de L mite de detecci n individuales LoD se calcularon para los 14 tipos de HPV 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 68 como una funci n de una medida LoB y una medida de varianza poblacional SDs de concentraciones m ltiples del HPV diana espec fico Directriz CLSI NCCLS EP17 A Vol 24 N 34 Se utilizaron nueve muestras de ADN caracterizadas como negativas al HPV aisladas de las muestras cervicales para determinar el valor LoB relaci n FAM FOZ 1 20 Se analiz cada ADN pl smido de HPV a concentraciones de 7500 5000 2500 y 1250 copias por reacci n cada uno en un fondo de tres concentraciones de ADN gen mico aislado de una estirpe celular negativa al HPV 10 ng 100 ng y 1 ug por reacci n Se analizaron todas las muestras positivas y negativas en repeticiones de ocho El l mite de detecci n para cada tipo de HPV se presenta en la tabla 8 Los l mites se describen seg n la relaci n FAM FOZ y como un rango de n mero de copias Tabla 8 resumen de sensibilidad anal tica de la prueba Cervista HPV HR LoD Tipo de ADN del N mero de LoD HPV copias reacci n Relaci n FAM FOZ SD 16 1250 2500 1 34 0 08 18 1250 2500 1 34 0 08 31 1250 2500 1 30 0 06 33 2500 5000 1 31 0 07 35 5000 7500 1 34 0 09 39 2500 5000 1 30 0 06 45 1250 2500 1 31
23. control correcto a cada pocillo e Verifique la informaci n de calibraci n del equipo e Realice una inspecci n visual para buscar vol menes homog neos entre los pocillos No se agreg el control correcto a la placa o no se agreg a la posici n correcta de la placa Verifique que los controles correctos se agregaron a las posiciones correctas de las placas El per odo de incubaci n fue m s corto o m s largo que el per odo de tiempo recomendado Confirme que la incubaci n se realiz durante el per odo de tiempo especificado y a la temperatura especificada 24 Sospecha de contaminaci n durante la adici n de muestras Utilice puntas con filtro de aerosol sin nucleasas y tubos est riles durante la instalaci n Utilice guantes cuando prepare la prueba Aseg rese de que las puntas de pipeta s lo tocan la soluci n que se est dispensando No toque las puntas de las pipetas con las manos Limpie las superficies del laboratorio utilizando los materiales apropiados Evaporaci n de la muestra Verifique la adici n de aceite mineral a cada pocillo Orientaci n de la placa incorrecta Cuando explore la placa ori ntela para que el pocillo A 1 est en la esquina superior izquierda Burbujas en los pocillos de la placa de reacci n En caso de ser posible centrifugue las placas antes de la exploraci n de fluorescencia Las mezclas de reacci
24. d para confirmar que un resultado negativo no se debe a una muestra insuficiente 1a Los oligos HPV forman una estructura 1b Los oligos HIST2H2BE forman una estructura invasiva sobre el ADN del HPV invasiva sobre el ADN gen mico Ps e rt F bi A A gt gt gt mr y DR ore ETIT E LA 5 Bihia d y mader i y 2 El enzima Cleavase reconoce la estructura y corta los oligos de la sonda t 4 TAR T s 5 3a Las colas de los oligos de la sonda HPV forman 3b Las colas de los oligos de la sonda HIST2H2BE forman estructuras invasivas sobre los oligos FAM FRET estructuras invasivas sobre los oligos Red FRET 2D mH 5 am a ees cose 4 La enzima Cleavase reconoce la estructura y libera los fluor foros de los oligos FRET originando la se al fluorescente Fluorescencia FAM Fluorescencia Red Ao he Sarre PPP n Dom nes coses Figura 1 representaci n gr fica de la qu mica Invader en Cervista HPV HR REACTIVOS PROPORCIONADOS Tabla 1 contenido de Cervista HPV HR Cantidad Cantidad Abreviatura en en el vial y en el vial y Reactivo la etiqueta del volumen de volumen de Descripci n del componente vial reactivo reactivo REF REF 92 011 PRD 01560 HPV Oligo o1 Oligonucle tidos con afinidad por los tipos Mix e tapa y raya 1 x 1400 ul 8 x 1400 pl HPV 51 56 y 66 suspendido en agua azules y tamp n MOPS pH 7 5 HPV Oligo 02 Oligonucle tidos
25. e ADN purificado clonado o amplicones PCR a concentraciones de 1 x 10 copias reacci n y 1 x 10 copias reacci n a menos que se indicara lo contrario utilizando la prueba Cervista HPV HR Todas las muestras produjeron resultados negativos Tipo de papilomavirus humano 1a Tipo de papilomavirus humano 6 Tipo de papilomavirus humano 44 Tipo de papilomavirus humano 53 Tipo de papilomavirus humano 11 Tipo de papilomavirus humano 67 Tipo de papilomavirus humano 42 Tipo de papilomavirus humano 70 Tipo de papilomavirus humano 43 Gen de control interno humano 18 Los tipos de papilomavirus humano 67 y 70 produjeron resultados positivos con la prueba Cervista HPV HR con 1 x 10 y 1 x 10 copias reacci n En una nueva valoraci n de estas muestras se obtuvieron resultados negativos con la prueba Cervista HPV HR con 1 x 10 copias reacci n y 1 x 10 copias reacci n respectivamente Adem s tambi n se analiz el ADN extra do de un panel de doce muestras cervicouterinas que se almacenaron en la soluci n PreservCyt y previamente se confirm que conten an tipos de HPV de bajo riesgo tipos 6 42 43 44 53 o 70 mediante PCR secuenciaci n y produjo resultados negativos con la prueba Cervista HPV HR Precision La repetibilidad y la precisi n dentro del laboratorio de la prueba Cervista HPV HR se demostr en un estudio de 21 d as con tres operadores diferentes realizando cada uno d
26. ecogida autorizado Las muestras cervicales en PreservCyt Solution pueden almacenarse a temperatura ambiente 20 30 C durante un m ximo de 24 semanas antes de la realizaci n de la prueba Las muestras cervicales en SurePath Preservative Fluid pueden almacenarse a temperatura ambiente 20 30 C durante un m ximo de 6 semanas antes de la realizaci n de la prueba El kit Genfind DNA Extraction Kit REF 95 449 ha sido validado para su uso con la prueba Cervista HPV HR El procedimiento recomendado para la extracci n de ADN de muestras cervicales en PreservCyt Solution o SurePath Preservative Fluid est incluido en las instrucciones de uso del kit Genfind DNA Extraction Kit Los laboratorios que realicen una prueba Cervista HPV HR con alg n m todo de extracci n que no sea el Genfind DNA Extraction Kit validado son los responsables de la validaci n de dicho m todo Las muestras de ADN se pueden guardar de 2 a 8 C hasta cuatro semanas Para un almacenamiento m s prolongado coloque las muestras en un congelador a una temperatura de entre 30 C y 15 C PROCEDIMIENTO DE PRUEBA PARA EL SISTEMA CERVISTA MTA Consulte el Manual del usuario de Cervista MTA referencia MAN 02378 002 para obtener m s informaci n acerca del uso del sistema automatizado para realizar la prueba Cervista HPV HR PROCEDIMIENTO DE PRUEBA MANUAL PARA CERVISTA HPV HR Procedimiento de reacci n 1 Agregue 10 ul de cada ADN de m
27. ga la mezcla correcta a cada columna 10 Coloque siempre la punta de la pipeta cerca de la parte inferior del pocillo para asegurarse de que la mezcla de reacci n se agregue por debajo del aceite mineral Mezcle rellenando y vaciando cuidadosamente la punta de la pipeta de 3 a 5 veces Las notas de procedimiento 5 9 y 10 no se aplican al sistema Cervista MTA INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS Para cada una de las tres reacciones se genera un valor de la relaci n se al ruido se al de la muestra medida frente a la se al de un pocillo de reacci n con un control negativo El valor de la relaci n se al ruido es conocido como FOZ veces por encima de cero Se genera un resultado final positivo negativo o indeterminado para cualquier muestra particular seg n el an lisis de los tres pocillos de reacci n por separado La relaci n entre los valores de HPV FOZ generados por las tres mezclas de reacci n determina si una muestra es o no positiva La relaci n HPV FOZ se calcula dividiendo el valor HPV FOZ m s alto de cualquiera de las tres mezclas de reacci n entre el valor HPV FOZ m s bajo de los tres Cuando alg n valor FOZ es menor de 1 el c lculo de la relaci n se redondea a 1 Si la relaci n HPV FOZ es mayor o igual a 1 525 entonces la muestra es positiva para HPV Sin embargo en un subconjunto de infecciones mixtas todos los pocillos de reacci n pueden generar una se al mucho mayor que la del ruido de fondo En algunos c
28. hologic com ec ree Representante autorizado para la Comunidad Europea Hologic UK Ltd Link 10 Napier Way Crawley West Sussex RH10 9RA Reino Unido 44 0 1293 522 080 NOTA PARA LOS DESTINATARIOS SOBRE LA LICENCIA LIMITADA La recepci n de un producto de Hologic o de su distribuidor autorizado incluye una licencia limitada no exclusiva e instransferible protegida por algunos derechos de propiedad intelectual de Hologic Esta licencia solo permite el uso del producto en los m todos para los que est destinado La licencia limitada no incluye ninguna licencia para el uso del producto en la investigaci n o el desarrollo de nuevos productos la fabricaci n de productos o su retroingenier a mejoras de la tecnolog a de este producto ni otros prop sitos comerciales El cliente no est autorizado a transferir este producto a ning n tercero para ninguna finalidad sin el consentimiento expreso por escrito de Hologic A no ser que se indique otra cosa en este p rrafo no se concede ninguna otra licencia de manera expl cita impl cita o por exclusi n Para m s informaci n sobre la disponibilidad de licencias adicionales para practicar las metodolog as patentadas p ngase en contacto con Legal Department Hologic Inc 502 South Rosa Rd Madison WI 53719 608 273 8933 27 La prueba Cervista HPV HR emplea una qu mica Invader patentada y componentes espec ficos protegidos por Los n meros de patente de los EE UU 5
29. ilice puntas con barreras de aerosol sin nucleasas y tubos est riles cuando realice las mezclas de reacci n e Utilice guantes cuando prepare la prueba e Aseg rese de que las puntas de pipeta s lo tocan la soluci n que se est dispensando e No toque las puntas de las pipetas con las manos e Limpie las superficies del laboratorio utilizando los materiales apropiados Evaporaci n de la muestra Verifique la adici n de aceite mineral a cada pocillo Burbujas en los pocillos de la placa de reacci n En caso de ser posible centrifugue las placas antes de la exploraci n de fluorescencia Las mezclas de reacci n preparadas no se usaron en el per odo de tiempo recomendado Mezcla insuficiente o no homog nea de controles Adici n no homog nea de la mezcla de reacci n Adici n de control insuficiente o no homog nea Use mezclas de reacci n antes de 30 minutos de haberlas preparado e Aseg rese de que todos los controles y reactivos se mezclen completamente y de forma homog nea e Cuando agregue la mezcla de reacci n a cada pocillo coloque las puntas en la parte inferior del pocillo por debajo del aceite mineral y transfiera lentamente hacia arriba y hacia abajo de 3 a 4 veces e Aseg rese de que se expulse todo el l quido de la punta de la pipeta durante las adiciones e Verifique que se agreg el control correcto a cada pocillo e Verifique que se agreg el volumen de
30. ionamiento Alternativamente Hologic podr elegir entre reparar o abonar al cliente una cantidad igual al precio de compra del equipo componente software suministro consumible o servicio defectuoso Los elementos sustituidos pasar n a ser propiedad de Hologic Todas las reclamaciones deber n iniciarse poni ndose en contacto con Hologic dentro del periodo de garant a aplicable y treinta 30 d as despu s de descubrir la rotura o disconformidad Se deber dar acceso razonable y una oportunidad a Hologic para que inspeccione todos los materiales relacionados Si tanto Hologic como el cliente fueran incapaces de resolver cualquier reclamaci n y el cliente no lo hubiera notificado en el plazo de un 1 a o desde que surgiera la reclamaci n el cliente no podr iniciar acciones legales posteriores Se entender que estos resarcimientos comprenden toda la responsabilidad por parte de Hologic y el resarcimiento exclusivo del cliente por incumplimiento de garant a y sustituyen a cualquier otro resarcimiento por derecho o equidad L MITE DE RESPONSABILIDAD HOLOGIC NO SE RESPONSABILIZAR DE NINGUNA P RDIDA DA O O GASTO INCLUIDOS AUNQUE NO EXCLUSIVAMENTE P RDIDA DE BENEFICIOS DATOS O USO ESPECIAL ACCIDENTAL PUNITIVO EJEMPLAR O RESULTANTE QUE SURJA DIRECTA O INDIRECTAMENTE DE LA VENTA MANIPULACI N SERVICIO O USO DEL PRODUCTO PEDIDO O SUMINISTADO NI DE NINGUNA CAUSA RELACIONADA CON EL MISMO A NO SER QUE LAS PARTES AS LO ACUERDEN EXPRESA
31. ipos v ricos con secuencias de ADN semejantes Los oligonucle tidos que se unen al gen histona humano 2 H2be HIST2H2BE tambi n est n presentes en estas tres mezclas de oligonucle tidos El HIST2H2BE funciona como un control interno que produce una se al semicuantitativa del ADN gen mico presente en la muestra El formato de la prueba Cervista HPV HR permite una detecci n simult nea de secuencias de ADN del HPV y HIST2H2BE en un nico pocillo utilizando dos secuencias de colas de 5 diferentes en las sondas as como tambi n dos oligonucle tidos FRET diferentes cada uno con un fluor foro espectralmente distinto FAM y Red A prop sito las colas de 5 se unen s lo a sus oligonucle tidos FRET respectivos para generar una se al diana espec fica v ase figura 1 Un resultado positivo indica que al menos uno de los 14 tipos de alto riesgo est presente en la muestra de ADN Este resultado se representa mediante una se al fluorescente FAM por encima del valor discriminatorio derivado emp ricamente Para cada reacci n un resultado negativo se representa mediante una se al fluorescente FAM por debajo del valor discriminatorio derivado emp ricamente Para determinar la cantidad relativa de ADN de muestra en cada reacci n se mide el HIST2H2BE humano mediante una se al fluorescente Red por encima del valor discriminatorio derivado emp ricamente en cada reacci n La medida de esta diana funciona como un mecanismo de control de calida
32. ipulan tejidos y fluidos humanos Las muestras deben eliminarse seg n las normas locales 3 No mezcle los reactivos de diferentes lotes o de diferentes viales del mismo lote No utilice los reactivos despu s de su fecha de caducidad Los componentes de los productos residuos de los productos envases pueden considerarse desechos de laboratorio Elimine los reactivos no utilizados y los desechos seg n las normas locales estatales y federales correspondientes NORMAS DE ALMACENAMIENTO Y MANIPULACI N e Almacene todos los reactivos entre 30 C y 15 C e No utilice los reactivos despu s de la fecha de caducidad que aparece en el exterior del envase e No los almacene en un congelador sin escarcha e Prot jalos de la luz e Antes de su uso retire los reactivos del congelador y d jelos descongelar al menos 30 minutos a temperatura ambiente o hasta que una inspecci n visual indique que no hay material congelado e Agite antes de su uso e Hologic Inc recomienda no mas de seis 6 ciclos de congelado descongelado para todos los reactivos de la prueba Cervista HPV HR e Prepare las mezclas de reacci n antes de cada uso La mezcla de reacci n preparada debe usarse antes de 30 minutos REACTIVOS Y MATERIALES ADICIONALES El software Invader Call Reporter es un componente necesario para este Producto de diagn stico in vitro IVD Este software se proporciona una vez con el pedido inicial del Cervista HPV HR y des
33. laboratorios luego en los tres laboratorios reproducibilidad entre laboratorios Se evalu un acuerdo entre d a plazo de laboratorio calculando el acuerdo entre rondas para cualquiera de las dos rondas realizadas durante dos d as por separado en un laboratorio para todos los apareamientos posibles El acuerdo porcentual promedio y el intervalo de confianza al 95 exacto unilateral se presenta en primer lugar para cada laboratorio reproducibilidad intralaboratorios entre rondas luego en los tres laboratorios reproducibilidad entre laboratorios entre rondas Se evalu un acuerdo entre laboratorios calculando el acuerdo porcentual entre rondas para cualquiera de las dos rondas realizadas por dos laboratorios diferentes para todos los posibles apareamientos n 3 laboratorios 1 y 2 laboratorios 1 y 3 laboratorios 2 y 3 El acuerdo porcentual promedio y el intervalo de confianza al 95 unilateral se presentan en las tablas 10 y 11 16 Tabla 10 Acuerdo porcentual dentro del laboratorio entre d as del HPV HR Molecular Assay L mite inferior de Laboratorio N mero de N mero de Porcentaje de confianza del 95 comparaciones coincidencias coincidencia de un solo lado Laboratorio 1 200 200 100 0 96 3 Laboratorio 2 200 193 96 5 90 8 Laboratorio 3 200 200 100 0 96 3 ames 600 593 98 8 96 9 laboratorios Tabla 11 acuerdo porcentual entre laboratorios del HPV HR Molecular Assay
34. logic Inc Numero de catalogo 15 3053 301 Revision 103 HOLOGIC 29
35. los Verifique que los vol menes correctos de reacci n se agregaron a cada pocillo Verifique que la informaci n de calibraci n del equipo sea la actual El control negativo No Target Control presenta los siguientes resultados e Aumentar ganancia para exploraci n 1 e Aumentar ganancia para exploraci n 2 e Aumentar ganancia para ambas exploraciones Los ajustes de ganancia del lector de microplacas de fluorescencia son demasiado bajos lo que provoca que los valores de se al fluorescente en bruto caigan por debajo del requisito m nimo Aumente el ajuste de ganancia del fluorimetro para la exploraci n designada para que el control negativo No Target Control produzca una se al m nima de 600 RFU y lea la placa nuevamente 22 Se produce un error durante la importaci n de datos Revise el ajuste de la ganancia FAM y Red y vuelva a leer toda la placa No se permiten las lecturas de placas parciales Revise el ajuste de la ganancia FAM y vuelva a leer toda la placa No se permiten las lecturas de placas parciales Revise el ajuste de la ganancia Red y vuelva a leer toda la placa No se permiten las lecturas de placas parciales Problemas del fluorimetro Consulte la Gu a de resoluci n de problemas del Invader Call Reporter Software User Manual para asuntos relacionados con el fluor metro que puedan contribuir a este error
36. ltados HPV m n gen mico m n gen mico 11 Controles HPV E Los controles del HPV controles HPV 1 3 deben producir los resultados apropiados para que la prueba sea v lida Si los controles no cumplen esos criterios las muestras de esa placa tampoco son v lidas y deben repetirse v ase la tabla 4 Una relaci n HPV FOZ se determina dividiendo el HPV FOZ m s alto de las tres mezclas de reacci n entre el HPV FOZ m s bajo de las tres normalizado a 1 0 si es menor de 1 0 El HPV Control 1 debe producir un valor HPV FOZ positivo 2 1 525 s lo para el HPV Oligo Mix 1 HPV Control 2 debe producir un valor HPV FOZ positivo 2 1 525 s lo para el HPV Oligo Mix 2 y el HPV Control 3 debe producir un valor HPV FOZ positivo 2 1 525 s lo para el HPV Oligo Mix 3 El ADN gen mico FOZ medio de las tres mezclas debe ser mayor o igual a 1 50 2 1 50 o el control no es v lido para un ADN gen mico bajo El CV del ADN gen mico FOZ medio de las tres mezclas debe ser menor de 25 0 lt 25 0 Tabla 4 control HPV y criterios de muestras d ADN CV ADN Control Resultados eV EOS doo gen mico gen mico p FOZ medio FOZ HPV Control 1 Control v lido 2 1 525 Mezcla 1 s lo 2 1 50 lt 25 0 HPV Control 2 Control v lido 2 1 525 Mezcla 2 s lo 2 1 50 lt 25 0 HPV Control 3 Control v lido 2 1 525 Mezcla 3 s lo 2 1 50 lt 25 0 Verificaci n de la prueba 1 Los resultados de las muestras son v
37. mico lineal del lector seg n las instrucciones del fabricante La ganancia debe configurarse para el control negativo No Target Control NTC produzca valores que est n en el rango de fondo del lector con una RFU m nimo de 600 Los valores NTC no tienen que ser id nticos para la lectura de los FAM y Red NOTAS Y PRECAUCIONES SOBRE EL PROCEDIMIENTO 1 Los laboratorios deben aplicar buenas pr cticas de laboratorio y cumplir todos los requisitos exigidos por la legislaci n federal estatal y local aplicable 2 Mezcle bien las muestras los reactivos y las mezclas de reacci n Utilice puntas de pipeta con filtro para aerosoles desechables y est riles sin nucleasas para cada adici n y traslado para evitar una contaminaci n cruzada 4 Use tubos de polipropileno sin nucleasas y desechables para preparar las mezclas de reacci n Compruebe que la placa de 96 pocillos sea compatible con el termociclador y el lector de placas de fluorescencia antes de iniciar la prueba Utilice s lo equipos calibrados 7 Los controles se deben agregar a las posiciones indicadas en la cuadr cula de colocaci n de muestras ubicada en la figura 2 para que el software Invader Call Reporter funcione correctamente 8 Utilice nuevo aceite mineral para cada configuraci n de reacci n no traslade estos reactivos a su recipiente original una vez que hayan sido agregados 9 Consulte la hoja de colocaci n de muestras para asegurarse de que se agre
38. nagement of women with abnormal cervical cancer screening tests Am J Obstet Gynecol 197 4 346 55 Sherman ME Schiffman M and Cox TJ 2002 Effects of age and human papilloma viral load on colposcopy triage data from the randomized Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance Low grade Squamous Intraepithelial Lesion Triage Study ALTS Jour Nat Can Inst Davey DD Neal MH Wilbur DC Colgan TJ Styer PE and Mody DR 2004 Bethesda 2001 implementation and reporting rates 2003 practices of participants in the college of American Pathologists Interlaboratory Comparison Program in Cervicovaginal Cytology Arch Path Lab Med 4 94 2 102 107 5 128 1224 1229 6 Wright TC Jr Cox JT Massad LS Twiggs LB Wilkinson EJ 2001 Consensus Guidelines for the management of women with cervical cytological abnormalities JAMA 2002 287 2120 2129 Solomon D Schiffman M and Tarone R 2001 Comparison of three management strategies for patients with atypical squamous cells of undetermined significance baseline results from a randomized trial Jour Nat Can Inst 93 4 293 299 Mayrand MH E Duarte Franco Rodrigues SD Walter J Hanley 2007 A Ferenczy S Ratnam F Coutl e EL Franco Human Papillomavirus DNA versus Papanicolau Screening Tests for Cervical Cancer N Engl J Med 357 16 1579 1588 Wheeler CM WC Hunt M Schiffman PE Castle 2006 Human papillomavirus genotypes and the cumulative 2 Year risk of cervical cancer J
39. nder con el prorrateo lineal indicado en la especificaci n del producto aplicable Periodo de garant a Las piezas de recambio est n garantizadas durante el periodo que reste de la garant a o noventa 90 d as desde la entrega si este plazo fuera mayor Los materiales consumibles est n cubiertos con la garant a indicada en las especificaciones publicadas durante un periodo que finaliza con la fecha de caducidad que figura en sus respectivos envases La garant a cubre la mano de obra necesaria para restablecer los servicios Hologic no garantiza que el uso de los productos no se interrumpa o no tenga errores ni que los productos funcionen con productos autorizados de otras casas TODA LA RESPONSABILIDAD DE HOLOGIC SE LIMITA EXPRESAMENTE A REPARAR O SUSTITUIR LOS PRODUCTOS SEG N CONVENGA HOLOGIC Y DE LA FORMA DESPACHADA ORIGINALMENTE O CORREGIR EL SERVICIO QUE HAYA SUSCITADO ALGUNA RECLAMACI N O A ELECCI N DE HOLOGIC LA DEVOLUCI N O ABONO AL CLIENTE POR UN IMPORTE IGUAL AL PRECIO HONORARIO O CARGO DE HOLOGIC LAS GARANT AS MENCIONADAS ANTERIORMENTE SUSTITUYEN Y EXCLUYEN CUALQUIER OTRA GARANT A QUE NO EST INDICADA AQU EXPRESAMENTE YA SEA EXPRESA O MPLICITA CONFORME A DERECHO U OTRO TIPO INCLUIDAS AUNQUE NO EXCLUSIVAMENTE CUALQUIER GARANT A IMPL CITA DE COMERCIABILIDAD O CONFORMIDAD CON UN FIN DETERMINADO ESTA GARANT A LIMITADA SE CONCEDE NICAMENTE AL CLIENTE ORIGINAL SIN QUE SE OTORGUE NI PUEDA SER V LIDA PARA UN TER
40. ntral Tabla 6 Resultados de Cervista HPV HR y de colposcopia histolog a consenso CIN3 entre mujeres con citolog a ASC US Cervista HPV HR Colposcopia Histologia Positivo Negativo Total Positivo 22 705 727 Negativo 0 573 573 Total 22 1278 1300 Incluye resultados indeterminados P CIN3 incluido un adenocarcinoma in situ Ni CIN CIN1 ni CIN2 por histolog a central o colposcopia sin histolog a central Entre las mujeres con una citolog a ASC US la sensibilidad cl nica de la prueba para CIN2 fue del 92 8 IC 95 83 9 97 6 y el valor predictivo negativo fue del 99 1 IC 95 98 0 99 7 La sensibilidad cl nica y los valores predictivos negativos de la prueba para CIN3 son ambos del 100 IC 95 84 6 100 y 99 4 100 Hay varias variables clave que se sabe que influyen en las caracter sticas de funcionamiento de cualquier prueba HPV en un estudio cl nico Estas incluyen pero sin limitarse a ellas t cnicas de toma de muestras cervicouterinas la calidad de los resultados citol gicos la edad de la poblaci n estudiada la prevalencia de la enfermedad los m todos de diagn stico de la enfermedad y m todos de interpretaci n histol gica Dado el n mero de variables presentes durante las pruebas de HPV de rutina en los diferentes laboratorios cabe destacar que muchos de los resultados obtenidos del ensayo cl nico Hologic son similares a los vistos en las condiciones de ensayo
41. o CIN Neoplasia intraepitelial cervicouterina ADN cido desoxirribonucleico FAM Fluor foro carboxifluoresce na FRET Transferencia de energ a por resonancia de fluorescencia FOZ Veces por encima de cero del ingl s Fold over zero se al de control o de la muestra dividida por la se al de control negativo ADN gen mico ADN gen mico HIST2H2BE Gen de la histona humana 2 gen H2be HPV Virus del papiloma humano HR Alto riesgo M x M ximo M n M nimo MTA Automatizaci n de rendimiento de medio NTC Control sin molde o control negativo Oligo Oligonucle tido Pap Prueba de citolog a cervical Papanicolaou Red Fluor foro rojo Redmond RFU Unidad de fluorescencia relativa RESUMEN Y EXPLICACI N DE LA PRUEBA Cada a o se presentan aproximadamente 11 000 nuevos casos de c ncer de cuello uterino invasivo en EE UU y se atribuyen m s de 3500 muertes a este tipo de cancer En la etapa m s temprana del c ncer de cuello uterino la tasa de supervivencia en 5 a os es del 92 y en todas las etapas del c ncer de cuello uterino la tasa de supervivencia en 5 a os es de aproximadamente el 72 El c ncer de cuello uterino est provocado por una infecci n persistente con el virus del papiloma humano HPV Se ha demostrado que se puede prevenir el c ncer de cuello uterino con programas citol gicos y de diagn stico precoz del HPV para facilitar la detecci n y el tratamiento de las lesiones precancerosas
42. observ un acuerdo total del 91 4 171 187 IC 95 86 5 95 0 entre los m todos con un acuerdo positivo y negativo del 89 8 y 93 7 respectivamente IC 95 82 5 94 8 y 85 8 97 9 Tabla 9 Detecci n del ADN de HPV de la prueba Cervista HPV HR en comparaci n con la secuenciaci n espec fica de tipo PCR Secuenciaci n Total Negativo 74 11 Positivo 5 9 5 79 Prueba Cervista HPV HR Reproducibilidad En este estudio de investigaci n se evalu la reproducibilidad total de la prueba Cervista HPV HR en tres laboratorios utilizando un panel de c lulas cultivadas positivas y negativas al HPV y muestras cervicouterinas positivas y negativas al HPV Se extrajo ADN de 2 ml de muestra cervicouterina o c lulas cultivadas suspendidas en la soluci n PreservCyt El ADN se extrajo usando el Genfind DNA Extraction Kit Se analizaron diecis is muestras en tres ubicaciones durante cinco dias no consecutivos en un periodo de tiempo de dos semanas Para el estudio se usaron dos lotes de los kits Cervista HPV HR y tres lotes de los Genfind DNA Extraction Kits Se evalu un acuerdo en el plazo de un dia laboratorio calculando el acuerdo porcentual entre rondas para los tres posibles apareamientos en el plazo de cada d a laboratorio El acuerdo porcentual promedio y el intervalo de confianza del 95 exacto unilateral se presenta en primer lugar para cada laboratorio reproducibilidad intra
43. ogidas en la soluci n PreservCyt o SurePath Preservative Fluid 12 5 El funcionamiento de la prueba Cervista HPV HR ha sido determinado usando ADN extra do con el Genfind DNA Extraction Kit 6 Se observ interferencia en las muestras cervicouterinas recogidas en soluci n PreservCyt y contaminadas con altos niveles 2 de jalea anticonceptiva o cremas antimic ticas cuando se a sla el ADN con el Genfind DNA Extraction Kit En estas condiciones se pueden obtener resultados negativos falsos 7 La interferencia se observ en las muestras cervicales recogidas en SurePath Preservative Fluid contaminado con jalea anticonceptiva y o cremas fungicidas en concentraciones del 0 5 y el lubricante personal ASTROGLIDE en concentraciones del 0 5 si el ADN ha sido aislado con el kit Genfind DNA Extraction Kit En estas condiciones es posible que se produzcan falsos negativos La interferencia potencial del lubricante personal ASTROGLIDE no ha sido evaluada en muestras cervicales recogidas en PreservCyt Solution CARACTER STICAS DE FUNCIONAMIENTO Funcionamiento en ensayo cl nico Se realiz un estudio cl nico multic ntrico transversal y prospectivo para evaluar el funcionamiento de la prueba Cervista HPV HR para la detecci n del papilomavirus humano y neoplasia intraepitelial cervicouterina de grado 2 o superior CIN2 en muestras citol gicas l quidas Las muestras citol gicas ThinPrep residuales se obtuvier
44. on de 3540 mujeres que se habian sometido a un programa rutinario de diagn stico precoz del cancer de cuello uterino Este estudio incluy 2026 mujeres de mas de 30 a os y con resultados citol gicos normales WNL y 1514 mujeres de m s de 18 a os con resultados ASC US Las muestras citol gicas se obtuvieron de 89 laboratorios de todo Estados Unidos El ADN se extrajo a partir de muestras ThinPrep cervicouterinas residuales que quedaron despu s de terminar un programa de diagn stico precoz de c ncer de cuello uterino Despu s el ADN se analiz usando la prueba Cervista HPV HR El rendimiento anal tico de la prueba se midi frente a resultados de PCR secuenciaci n Las muestras de ADN residuales tanto de los sujetos ASC US como los WNL se usaron para una amplificaci n por PCR y secuenciaci n Las muestras de ADN se amplificaron usando cebadores de consenso para el gen HPV L1 Tambi n se amplific una parte del gen de la beta globina humana como control interno Los amplicones purificados se usaron como moldes en reacciones de secuenciaci n m ltiples para 14 tipos de HPV de alto riesgo 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 Los datos de secuenciaci n se analizaron utilizando varios programas de alineamiento de secuencias Una comparaci n de la prueba Cervista HPV HR con el m todo de PCR secuenciaci n tanto entre sujetos ASC US como WNL result en una coincidencia total del 86 1 entre los dos m todos IC 95
45. or las sustancias introducidas La jalea anticonceptiva y las cremas antimic ticas que conten an clotrimazol o miconazol a una concentraci n en la muestra del 2 causaron resultados negativos falsos e indeterminados Durante la extracci n de ADN la jalea anticonceptiva interfiri en la separaci n de perlas magn ticas en el tamp n de trometamol 10 mM causando una recuperaci n de ADN baja y una muestra insuficiente de ADN para el an lisis Esta interferencia fue visualmente detectable Los niveles de las sustancias anteriores que son necesarios para causar el fallo del ensayo son inusualmente altos y no se deben encontrar en muestras cl nicas reales si el m dico sigue el adecuado procedimiento de Papanicolaou de recolecci n de muestras por el que se debe higienizar el cuello uterino antes de obtener la muestra de c lulas para el an lisis de Papanicolaou 17 La prueba Cervista HPV HR tambi n se prob con componentes que potencialmente pudieran haberse transferido sin querer durante la extracci n de la muestra con el Genfind DNA Extraction Kit Se analiz el ADN que conten a tres niveles 0 5 y 10 cada uno de etanol al 70 o perlas magn ticas Genfind para evaluar la interferencia provocada por las sustancias introducidas Se observ una interferencia cuando el 10 del volumen de la muestra de ADN conten a etanol al 70 o las perlas magn ticas Reactividad cruzada Se analiz un panel de bacterias hongos y virus
46. os ciclos al d a en grupos de equipos asignados individualmente Cada ciclo estuvo formado por cuatro placas Se usaron disposiciones de muestras en las placas diferentes para los ciclos de un d a Cada ciclo incluy muestras de ADN gen mico aislado de l neas celulares positivas para HPV SiHa tipo 16 y HeLa tipo 18 y una l nea celular negativa para HPV Jurkat y muestras artificiales con ADN plasm dico de HPV16 HPV18 HPV31 HPV33 HPV35 HPV39 HPV45 HPV51 HPV52 HPV56 HPV58 HPV59 HPV66 o HPV68 y ADN de Jurkat Las muestras se analizaron por duplicado con tres concentraciones Con 2500 copias reacci n las muestras de ADN plasm dico produjeron un 57 4 675 1176 de resultados positivos Con 5000 copias reacci n las muestras de ADN plasm dico produjeron un 97 2 1143 1176 de resultados positivos Con 10 000 copias reacci n las muestras de ADN plasm dico produjeron un 100 0 1176 1176 de resultados positivos consulte la tabla 15 Tabla 15 resumen de valores positivos y negativos para cada condici n de muestra analizada Copias reacci n HPV Positivo HPV Negativo Diana o c lulas ml extra das N n n 2500 84 82 98 2 2 HPV 16 5000 84 84 100 0 0 10 000 84 84 100 0 0 2500 84 64 76 20 24 HPV 18 5000 84 84 100 0 0 10 000 84 84 100 0 0 2500 84 58 69 26 31 HPV 31 5000 84 84 100 0 0 10 000 84 84 100 0 0 19
47. pu s cuando haya nuevas actualizaciones del software P ngase en contacto con su representante si necesita copias adicionales El Genfind DNA Extraction Kit kit de extracci n de ADN Genfind es un accesorio de la prueba Cervista HPV HR P ngase en contacto con su representante local para pedir el Genfind DNA Extraction Kit REF 95 449 MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS Suministros consumibles Puntas de pipeta con filtro y sin nucleasas Placas de polipropileno de 96 pocillos Selladores de placas transparentes Aceite mineral calidad de biologia molecular Tubos de 2 0 ml con tapas roscadas de polipropileno est riles Equipo Sistema Cervista MTA para usuarios de automatizaci n Pipetas Agitadora vorticial Lector de placas para fluorescencia Tecan Infinite F200 Tecan GENios o BioTek FLx800 Ordenador de escritorio con sistema operativo Microsoft Windows XP Microsoft Excel y Adobe Reader e Termociclador o estufa capaz de mantener las temperaturas de reacci n apropiadas RECOGIDA DE LAS MUESTRAS EXTRACCI N Y ALMACENAMIENTO DEL ADN PARA AN LISIS Entre las muestras cervicales que pueden analizarse con la prueba Cervista HPV HR est n las siguientes e Muestras recogidas en PreservCyt Solution el sistema de conservaci n de pruebas de Papanicolau ThinPrep con un dispositivo de recogida autorizado e Muestras recogidas en SurePath Preservative Fluid con un dispositivo de r
48. que se encuentran habitualmente en el tracto anogenital femenino as como tambi n numerosos tipos de papilomavirus humano clonados de riesgo bajo o indeterminado con la prueba Cervista HPV HR para evaluar una posible reactividad cruzada consulte las tablas 12 14 Tabla 12 los organismos enumerados a continuaci n se agregaron a la soluci n PreservCyt a concentraciones de aproximadamente 1 x 10 ufc ml y 1 x 10 ufc ml Se extrajo ADN de estos organismos y una linea celular negativa Jurkat 1 x 10 c lulas ml utilizando el Genfind DNA Extraction Kit Todas las muestras dieron resultados negativos con la prueba Cervista HPV HR Proteus vulgaris Staphylococcus aureus Staphylococcus epideridis Streptococcus mitis Streptococcus pyogenes Candida albicans Corynebacterium pseudodiptheriticum Enterococcus faecalis Escherichia coli Lactobacillus acidophilus Tabla 13 se analiz el ADN purificado obtenido de los organismos enumerados a continuaci n a concentraciones de 1 x 10 copias reacci n y 1 x 10 copias reacci n utilizando la prueba Cervista HPV HR Todas las muestras produjeron resultados negativos Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Virus Herpes simplex tipo 1 HSV 1 Virus Herpes simplex tipo 2 HSV 2 Virus de la inmunodeficiencia humana Neisseria meningitides tipo 1 HIV 1 regiones pol y env Mycoplasma hominis Tabla 14 se analizaron muestras d
49. s pacientes recomendaban analizar la presencia de tipos de HPV de alto riesgo como una herramienta de diagn stico precoz habitual junto con la citolog a en casos concretos Las recomendaciones principales de las directrices de pr ctica profesional m s recientes Consensus Guidelines for the Management of Women with Abnormal Cervical Cancer Screening Tests de 2006 incluyen 1 el diagn stico precoz de mujeres de m s de 30 a os y en combinaci n con otros m todos de diagn stico precoz y 2 tratamiento de mujeres de m s de 20 a os con ASC US En todos los casos las decisiones de tratamiento de la paciente reflejan la historia citol gica total de la paciente y otros factores de riesgo ademas de la presencia o ausencia de tipos de HPV de alto riesgo PRINCIPIOS DEL PROTOCOLO La Cervista HPV HR es una prueba de diagn stico cualitativo in vitro para la detecci n de ADN de los 14 tipos de HPV de alto riesgo a saber los tipos 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 66 y 68 La prueba Cervista HPV HR utiliza la qu mica Invader un m todo de amplificaci n de se al para la detecci n de secuencias de cido nucleico espec ficas El m todo usa dos reacciones isot rmicas una reacci n primaria que se realiza en la secuencia de ADN diana y una reacci n secundaria que produce una se al fluorescente v ase la figura 1 En la reacci n primaria dos tipos de oligonucle tidos espec ficos de la secuencia es decir una
50. sonda oligonucleot dica y un oligonucle tido Invader se unen a la secuencia diana de ADN Cuando estos oligonucle tidos se superponen por al menos un par de bases en la secuencia diana se forma una estructura invasiva que act a como un sustrato para la enzima Cleavase La enzima corta el extremo 5 cola de la sonda en la posici n de la superposici n Las sondas est n presentes en un gran exceso molar y entran y salen r pidamente del ciclo de la secuencia diana para que se generen muchas colas cortadas en el extremo 5 por cada secuencia diana Las colas cortadas se unen despu s a un oligonucle tido FRET del ingl s Fluorescence Resonance Energy Transfer que significa transferencia de energ a por resonancia de fluorescencia en horquilla universal creando otra estructura invasiva que la enzima Cleavase reconoce como un sustrato La enzima corta los oligonucledtidos FRET entre el fluor foro y la mol cula extintora y produce una se al de fluorescencia mientras las colas cortadas entran y salen del ciclo Para cada copia de diana las reacciones primarias y secundarias combinadas provocan una amplificaci n de se al de 10 10 veces por hora Las secuencias de las colas y los oligonucle tidos FRET son universales ya que no son complementarios a la secuencia diana Los reactivos para este ensayo son tres mezclas de oligonucle tidos que detectan los 14 tipos de HPV agrupados seg n una relaci n filog nica es decir t
51. uestra y de control a tres pocillos de una placa de 96 pocillos seg n se indica en la cuadr cula de colocaci n de muestras v ase la figura 2 Mezcla 1 Mezcla 2 Mezcla 3 Mezcla 1 Mezcla 2 Mezcla 3 Mezcla 1 Mezcla 2 Mezcla 3 Mezcla 1 Mezcla 2 Mezcla 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C1 C1 C1 S5 S5 S5 13 13 13 21 21 21 B C2 C2 C2 S6 S6 S6 14 14 S14 22 22 22 C C3 C3 C3 S7 S7 S7 15 S15 S15 23 23 23 D NTC NTC NTC S8 S8 S8 S16 S16 S16 S24 S24 24 E S1 S1 S1 sg s9 S9 S17 S17 S17 S25 S25 25 F S2 S2 S2 S10 S10 S10 S18 S18 S18 S26 S26 S26 G S3 S3 S3 11 S11 S11 S19 S19 S19 S27 S27 S27 H S4 S4 S4 S12 S12 S12 S20 S20 S20 S28 S28 S28 Figura 2 colocaci n de muestras en la prueba Cervista HPV HR 2 Cubra cada pocillo con 20 ul de aceite mineral y cinta de sellado de placas para minimizar la evaporaci n 3 Incube las muestras a 95 C durante 5 minutos en un termociclador 4 Mezcle bien los reactivos y las mezclas de reacci n antes de su uso 5 Prepare las mezclas de reacci n seg n se indica en la hoja de Preparaci n de mezcla impresa desde el software del Invader Call Reporter o seg n los c lculos de la tabla 2 Prepare una mezcla de reacci n para cada una de las tres HPV Oligo Mix Tabla 2 Instrucciones para la preparaci n de la mezcla de reacci n N mero de reacciones Componente Hl pocillo muestras y Volumen total
Download Pdf Manuals
Related Search