LM DNA Kit Product Insert
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1. conjugada con R ficoeritrina que haya sido congelada durante el transporte o el almacenamiento EQUIPOS NECESARIOS 1 Luminex Instrument y PLATAFORMA XY N mero de producto 888300 888310 2 Termociclador con tapa calefactada y tiempos de ascenso descenso t rmico ajustables un rango t rmico m nimo de 2 C a 100 C y una precisi n de por lo menos 0 5 C Puede que sea necesario modificar las condiciones de los termocicladores para optimizar los perfiles Para obtener un perfil t rmico llame al Servicio t cnico tel 203 328 9500 o 888 329 0255 RECOLECCI N Y PREPARACI N DE LAS MUESTRAS a Se puede purificar el ADN humano de sangre completa capas leucocitarias y muestras bucales obtenidas con hisopos utilizando un m todo validado que cumpla con los criterios siguientes b El ADN que se extrae de la sangre preservada en EDTA y ACD cido citrato dextrosa ha sido testeado y se ha demostrado que produce los resultados esperados para este ensayo No se han realizado pruebas con otros conservantes El ADN aislado debe mantenerse en TRIS 10 mM a pH 8 0 9 0 o en agua exenta de nucleasas Si est presente un quelante como el EDTA su concentraci n final no debe ser superior a 0 5 mM La presencia de alcohol detergentes o sales puede afectar a la amplificaci n del ADN La concentraci n final de ADN debe estar comprendida entre 10 y 200 ng pl El cociente entre la absorbancia de la muestra de ADN a 260 nm y a 280 nm2. de Suficiente para N No congelar caducidad la luz pruebas Precauci n Consultar las Consultar las l i l Representante instrucciones AN di Fabricante para Europa de uso ll P gina 1 de 9 LC775IVDES 17 02 14 REACTIVOS POR N MERO DE REFERENCIA A Kit LIFECODES de tipificaci n de HLA A para ser utilizado con Luminex Producto N 628410 50 N mero de Volumen de 50 Y uficiente para 2a8 C Kit LIFECODES de tipificaci n de HLA A eRES para ser utilizado con Luminex Producto N 628459 50 y cepas 0088 2a8 2C ezala do sondas LIFECODES HLA A GRES osea Kit LIFECODES de tipificaci n de HLA B para ser utilizado con Luminex Producto N 628510 50 f N mero de Volumen de me 50 y Mezcla maestra LIFECODES HLA B MES 2a AB C E T 2a8 2C LC BE Kit LIFECODES de tipificaci n de HLA B eRES para ser utilizado con Luminex Producto N 628559 50 N mero de Volumen de 50 Y Mezcla maestra LIFECODES HLA B SO muestras t 2a8 C Mezcla de sondas LIFECODES HLA B Proteger de la luz Ha de sondas LIFECODES HLA B 2a8 C 0088 LM C Kit LIFECODES de tipificaci n de HLA C para ser utilizado con Luminex Producto N 628810 50 N mero de Volumen de P 50 y Peza nuera LFECODES HAC Te 2a8 2C Las mezclas de sondas son fotosensibles exp ngalas lo menos posible a la luz PRECAUCI N No utilice los componentes pasadas las respectivas fechas de caducidad P gina 2
3. debe estar comprendido entre 1 65 y 2 0 DO o P gina 4 de 9 LC775IVDES 17 02 14 g El ADN puede utilizarse inmediatamente despu s de aislado o conservarse a 20 C durante un a o como m ximo No debe someterse a congelaciones y descongelaciones repetidas porque se degrada PROCEDIMIENTO A Materiales suministrados Consulte la informaci n espec fica en las tablas en reactivos por secci n del art culo n mero de cat logo e Mezcla maestra adecuada MX Soluci n diluyente DS e Mezcla mezclas adecuada s de sondas BM Tabla s de umbrales Gr fico s de hibridaci n con sondas B Materiales reactivos y equipos necesarios pero no suministrados los de la lista o equivalentes e Conjugado de ficoeritrina PE Estreptavidina SA PE 1mg mL e Ba o de ultrasonidos Fisher Scientific n ref FS15 o FS20 Lifecodes NY ref 628511 e Microcentr ftuga Luminex Sheath Fluid 1x 20x Lifecodes n ref 628005 e Puntas de filtro de barrera 628025 e Microesferas de calibraci n Luminex Cal 1 Cal 2 Con 1 y e Polimerasa Taq recombinante Con 2 Lifecodes n ref 628006 628007 628008 y 628009 Agitador v rtex respectivamente e Agua exenta de nucleasas Lifecodes NY ref 757003 20 ml e Pipetas pipetas multicanal y puntas 1 20 yl 20 200 ul 1000 pul e Tubos para PCR y tapones Thermo Strip 0 2 ml de AB Gene N e Programa de hojas de c lculo para visualizar archivos de valores ref AB0451 G
4. muestran una correlaci n de 98 89 4 del l mite inferior del intervalo de confianza de 95 para 50 muestras evaluadas cuando se comparan con los resultados que se obtienen con el m todo de SSP UniTray de Pel Freez El kit HLA DRB1 muestra una correlaci n de 98 91 1 del l mite inferior del intervalo de confianza de 95 para 60 muestras evaluadas cuando se compara con los resultados obetidos con el kit HLA DRB de LIFECODES REFERENCIAS 1 Olerup O et al 1992 Tissue Antigens 39 225 3 Maeda M et al 1989 Tissue Antigens 34 290 2 Saiki RK et al 1986 Nature 324 163 4 Bugawan TL et al 1990 Immunogenetics 32 231 P gina 8 de 9 LC775IVDES 17 02 14 LICENCIA LIMITADA Este producto no se suministra con polimerasa Taq y no incluye una licencia amparada por patentes en otros pa ses propiedad de F Hoffmann La Roche Ltd y Roche Molecular Systems Inc para utilizar en el proceso de la reacci n en cadena de la polimerasa PCR descrito en las citadas patentes Para m s informaci n sobre la necesidad de obtener licencias de adquisici n en su pa s contacte con F Hoffmann La Roche Ltd o Roche Molecular Systems Inc La adquisici n de este producto incluye una licencia limitada e intransferible amparada por la patente estadounidense 5 981 180 o las correspondientes en otros pa ses propiedad de Luminex Corporation para realizar an lisis multiplex de muestras cl nicas para la tipificaci n HLA Fabricante Immu
5. separados por comas csv Placas de 96 pocillos para termociclador PCR Costar e Bloque calefactor Fisher Scientific Standard Heatblock N ref N ref 6509 13259 030 e Pel cula Microseal Bio Rad N ref MSA 5001 o cinta Costar e Isopropanol al 70 o lej a al 20 N ref 6524 e Termociclador v ase Equipos necesarios p gina 4 INSTRUCCIONES DE USO NOTAS Las mezclas de sondas y la PE estreptavidina son fotosensibles prot jalas de la luz y no las congele Caliente las microesferas a 55 60 C durante al menos 5 10 minutos para solubilizar totalmente los componentes de la mezcla de sondas Trate brevemente la mezcla de sondas con ultrasonidos 15 s y ag tela en v rtex durante 15 segundos aproximadamente para suspender completamente las microesferas Distrib yala en al cuotas con sumo cuidado utilizando pipetas calibradas De no proceder as puede que se pierda reactivo y el an lsis de la muestra fracase Todas las temperaturas deben mantenerse con exactitud Fluctuaciones de apenas 0 5 C pueden afectar los resultados En la fase de hibridaci n las muestras no deben permanecer m s de 5 minutos a 56 C una vez diluidas vea la secci n Resultados Se recomienda analizar las muestras amplificadas lo antes posible Si no es posible analizar las muestras en el Luminex Instrument el mismo d a el producto amplificado puede conservarse hasta 3 d as a 2a8 2C antes de su uso Para una conser
6. umbrales y son espec ficos de cada lote Son valores medios de la MFI de cada microesfera con los que se compensa el ruido de fondo debido a la variaci n de las microesferas 4 Para cada muestra divida los datos de cada sonda corregidos seg n el ruido de fondo por el valor de la sonda de consenso correspondiente corregido seg n el ruido de fondo con lo que se obtiene el conjunto de datos normalizados MFI sonda MFI blanco de control para la sonda MFI consenso MFI blanco de control para la sonda de consenso 5 Para cada sonda registre el valor normalizado en la hoja de la tabla de umbrales 6 Una vez asignados todos los valores puede compararse el patr n de hibridaci n con sondas es decir la combinaci n de todas las asignaciones positivas y negativas en una muestra dada con la s tabla s de hibridaci n con sondas suministrada Precauci n e Existe una tabla de umbrales para cada locus y para cada mezcla de sonda e Estas tablas de umbrales son espec ficas de cada lote aseg rese de que el n mero de lote de las tablas de umbrales es el mismo que el del kit de tipificaci n e Si un valor normalizado correspondiente a una sonda determinada supera el umbral m ximo para una asignaci n negativa y no alcanza el valor m nimo para una asignaci n positiva la muestra deber considerarse indeterminada para dicha sonda La muestra debe tipificarse suponiendo primero que el valor es negativo y luego que es positiv
7. 0 voltios aproximadamente durante 45 minutos o hasta que la muestra corra lo bastante como para distinguir bandas separadas para el producto monocatenario y el bicatenario la banda del azul de bromofenol u otro marcador visible migra entre 2 5 y 5 cm a partir de los pocillos 5 Fotograf e utilizando un transiluminador UV acompa ado de un filtro fotogr fico amarillo GelStar Cambrex n 50536 PRECAUCION Utilice indumentaria de protecci n cuando manipule el colorante de cidos nucleicos GelStarO o el bromuro de etidio o cuando fotograf e el gel con un transiluminador UV HLA HLA HLA A HLA B HLA C DRB1 DRB3 4 5 HLA DQB 6 An lisis del gel Bicatenario s pb 370 340 476 447 260 160 Monocatenario s pb 250 200 170 100 Interpretaci n del gel Amplificaci n No hay amplificaci n Pocillo C_ ADN bicatenario intenso ADN monocatenario menos intenso Banda del cebador P gina 9 de 9 LC775IVDES 17 02 14
8. El volumen total de la mezcla maestra y el ADN gen mico debe ser de 50 ul para la reacci n de cada muestra 6 Cierre bien los tubos para evitar la evaporaci n durante la PCR 7 Coloque las muestras en el termociclador y ejecute el programa vea la Tabla 2 Tabla 1 Componentes de la reacci n para la Tabla 2 Condiciones del termociclador para la amplificaci n amplificaci n Componente Cantidad por reacci n PCR por muestra MC LIFECODES Hasta un volumen final Agua exenta de nucleasas de 50 yu Nota Para cerciorarse de que se ha amplificado la muestra consulte la secci n Electroforesis en gel Ap ndice A C Hibridaci n e Aseg rese de que los componentes del tamp n de hibridaci n de la mezcla de sondas LIFECODES est n solubilizados y las microesferas totalmente suspendidas W MES MI Ds P gina 5 de 9 LC775IVDES 17 02 14 Encienda el Luminex Instrument y la Plataforma XY para que adquieran la temperatura correspondiente durante 30 minutos 1 Caliente la mezcla de sondas en un bloque calefactor a 55 60 C durante al menos 5 10 minutos para solubilizar totalmente los componentes de la mezcla de sondas 2 Trate brevemente 15 s la mezcla de sondas con ultrasonidos y ag tela en v rtex durante 15 segundos aproximadamente para suspender por completo las microesferas 3 En una placa de termociclador de 96 pocillos Costar6 n ref 6509 distribuya al cuotas de 5 ul del producto de la PC
9. MER LIFECODES Immucor Transplant Diagnostics Inc 550 West Avenue Stamford CT 06902 EE UU Tel 1 203 328 9500 u 888 329 0255 en EE UU y Canad Fax 1 203 328 9599 WWW IMMUCOR COM La documentaci n sobre el producto est disponible en varios idiomas en www Immucor com FOLLETO INFORMATIVO DEL PRODUCTO KITS DE TIPIFICACI N LIFECODES HLA SSO para ser utilizados con Luminex Para diagn stico in vitro CONTENIDO Instrucciones de uso A Purificaci n del ADN gen mico B Amplificaci n Resumen y explicaci n C Hibridaci n Principios del procedimiento D An lisis de la muestra con el Luminex Instrument Reactivos Resultados A Identificaci n Contol de calidad B Advertencias y precauciones Limitaciones del procedimiento C Instrucciones de conservaci n Resoluci n de problemas D Purificaci n o tratamiento para su uso Valores previstos E Indicaciones de inestabilidad Caracter sticas espec ficas de rendimiento Equipos necesarios Referencias Recolecci n y preparaci n de muestras Licencia limitada Procedimiento Marcas comerciales utilizadas A Materiales suministrados Ap ndice A B Materiales reactivos y equipos necesarios pero Electroforesis en gel no suministrados Interpretaci n del gel DEFINICI N DE LOS S MBOLOS Etiquetas del producto y documentaci n suplementaria L mite N mero de LOT N mero de superior de L mites de lote referencia temperatura temperatura Fecha de Proteger
10. R espec fico de locus 4 Vierta en cada pocillo 15 ul de la mezcla apropriada de sondas Los Kits eRES requieren dos pocillos por muestra uno para la mezcla de sondas de eRES y otro para la mezcla de sondas est ndar Las mezclas de sondas eRES y est ndar no tienen que obtenerse en el mismo proceso Ambas mezclas de sondas se requieren para obtener los resultados de eRES Cuando se vierta la mezcla de sondas a m s de 10 pocillos agite en v rtex con cuidado cada mezcla de sondas despu s de cada grupo de diez Selle la placa con cinta de polietileno Costar No 6524 5 Hibride las muestras en las condiciones de incubaci n siguientes Tabla 3 Condiciones del A 97 C durante 5 minutos EP A 47 C durante 30 minutos termociclador para la hibridaci n ASC durante 10 minutos MANTENER A 56 C 6 Mientras las muestras hibridan prepare una mezcla al 1 200 de soluci n diluyente y PE estreptavidina Combine 170 ul de soluci n diluyente DS y 0 85 ul de 1mg mL PE estreptavidina SA PE por muestra Se recomienda preparar una cantidad de mezcla de soluci n diluyente suficiente para n 1 muestras con objeto de cubrir las p rdidas por pipeteo Vea la tabla 4 7 Mantenga la mezcla de soluci n diluyente y PE estreptavidina en la oscuridad y a temperatura ambiente La PE estreptavidina es fotosensible La soluci n diluyente puede ser calentada a 45 C durante 5 minutos y agitada en v rtex no bien llega al laboratorio para garantizar qu
11. agencias certificadoras LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Las condiciones descritas para la PCR y el an lisis deben controlarse con precisi n Las desviaciones de estos par metros pueden hacer fracasar el procedimiento Todos los aparatos deben calibrarse seg n las recomendaciones del fabricante y utilizarse respetando los l mites especificados por ste 1 Las microesferas deben estar precalentadas y en suspensi n total antes de su uso Esto garantiza que los componentes del tamp n de hibridaci n est n disueltos 2 Las incubaciones a 47 C y 56 C exigen una gran exactitud 0 5 C Debe emplearse un termociclador Debe verificarse la temperatura en los pocillos de la placa de 96 pocillos del termociclador mediante un termopar Bio Rad Model VPT 0300 o equivalente La temperatura no debe variar m s de 0 5 C dentro de los pocillos y de un pocillo a otro 3 Eltiempo que se mantiene la muestra a 56 C es crucial y no debe superar los 15 minutos en total Esto comprende los 10 minutos de la incubaci n m s un m ximo de 5 minutos para diluir todas las muestras con la mezcla de soluci n diluyente y PE estreptavidina 4 Una vez diluidas las muestras son estables a temperatura ambiente durante un m ximo de 2 horas prot jalas de la luz Dado que una placa de 96 pocilllos llena puede tardar hasta 1 5 horas en pasar por el Luminex Instrument el an lisis debe iniciarse como m ximo 30 minutos despu s de la diluci n para garantiz
12. ar que la ltima muestra se analice dentro del l mite de las dos horas 5 No mezcle componentes de otros kits y lotes Debido a la complejidad de la tipificaci n de HLA la interpretaci n de los datos y los resultados de la tipificaci n deber an ser revisados por personal calificado P gina 7 de 9 LC775IVDES 17 02 14 RESOLUCI N DE PROBLEMAS microesferas ultrasonidos ag tela en v rtex y repita el an lisis correctamente Luminex IS La v a de flujo de la muestra Extraiga la aguja y l mpiela con ultrasonidos L vela est bloqueada con flujo retr grado Si el problema persiste llame a Immucor Transplant Diagnostics Inc Tel 32 3 385 47 91 Falla en el umbral La muestra no se Compruebe la concentraci n y la pureza del ADN de CON amplific o lo hizo en Caliente la Mezcla maestra a 37 C durante 5 minutos escasa medida no est n disueltas agite suavemente en v rtex y centrifugue brevemente Polimerasa Taq poco eficaz Utilice nicamente polimerasa Taq recombinante Pruebe con la polimerasa Taq de Lifecodes N 167075 Las condiciones de la amplificaci n no est n dentro de los Ejecute el perfil t rmico en el termociclador para l mites especificados verificar que los par metros est n dentro de los l mites especificados Baja intensidad de fluorescencia mediana MF Antes de usar la soluci n diluyente cali ntela a 45 C durante 5 minutos y ag tela en v rtex Cons rvela a temperatura ambiente Sustituya
13. cor Transplant Diagnostics Inc 550 West Avenue Stamford CT 06902 EE UU Tel 1 203 328 9500 888 329 0255 en EE UU y Canad Fax 1 203 328 9599 Representante autorizado Emergo Europe Molenstraat 15 2513 BH The Hague The Netherlands Tel fono 31 0 70 345 8570 Fax 31 0 70 346 7299 Servicio t cnico europeo Tel 32 3 385 4791 Fecha de la ltima revisi n y publicaci n de este documento Rev 17 2014 02 10 MARCAS COMERCIALES UTILIZADAS AB Gene AB Gene House Agarosa IDNA Cambrex Bio Science Costar Corning Incorporated QIAAmp Qiagen Inc Microseal Bio Rad Laboratories Inc GelStar Cambrex Bio Science Luminex Luminex Corporation AP NDICE A Electroforesis en gel Las PCR que se llevan a cabo en la tipificaci n con kits LIFECODES HLA SSO se han ideado para obtener productos bicatenarios y monocatenarios que son los principales productos que hibridan con los SSO Ya sea por aseguramiento de la calidad o para solucionar un problema puede que se precise una electroforesis en gel para examinar la PCR e investigar la presencia de ADN amplificado Material necesario el de la lista o equivalente e Agarosa para electroforesis Agarosa IDNA de Cambrex Colorante de cidos nucleicos GelStar Cambrex n 50535 n 50170 Transiluminador UV ChromatoVUE UVP Inc modelo TM36 Equipo de electroforesis alimentaci n el ctrica e Sistema fotogr fico Buffer de gel 1X TAE 40X Pr
14. correspondencias En este caso es probable que tipificaciones basadas en otras sondas sean incorrectas Hay que analizar de nuevo la muestra y posiblemente deba repetirse la amplificaci n Si m s de dos sondas ofrecen resultados indeterminados debe reanalizarse la muestra Si de un patr n de hibridaci n con sondas no se obtiene un tipo HLA la muestra debe amplificarse y analizarse de nuevo Puede que tambi n se necesite aislar otra vez el ADN de la muestra y repetir la amplificaci n y el an lisis Como se ha se alado en la secci n Limitaciones del procedimiento es fundamental cumplir rigurosamente el protocolo Cualquier desviaci n puede hacer fracasar la tipificaci n de la muestra CARACTER STICAS ESPEC FICAS DE RENDIMIENTO Cuando se utilizan los Kits de Tipificaci n LIFECODES HLA SSO seg n el procedimiento descrito en el folleto informativo se puede determinar el tipo de HLA de las Clases y II de las muestras de ADN El Kit HLA A eRES muestra una correlaci n de 98 46 95 24 del l mite inferior del intervalo de confianza de 95 y los Kits HLA B eRES DRB1 eRES y DRB 3 4 5 muestran una correlaci n de 100 97 72 del l mite inferior del intervalo de confianza de 95 para 130 muestras evaluadas cuando se comparan con los resultados obtenidos mediante el secuenciamiento bidireccional Los kits HLA A B C y DQB muestran una correlaci n de 100 92 9 del l mite inferior del intervalo de confianza de 95 y los kits DRB
15. de 9 LC775IVDES 17 02 14 LM DR1 Kit LIFECODES de tipificaci n de HLA DRB1 para ser utilizado con Luminex Producto N 628751 50 N mero de Volumen de a 50 Y a uficiente para 2a8 C LC DR1E Kit LIFECODES de tipificaci n de HLA DRB1 eRES para ser utilizado con Luminex Producto N 628759 50 N mero de Volumen de 50 Y EDR Mezcla maestra LIFECODES HLA DRB1 870 IET 2a 2a aero encante para 50 muestras pa min CE Kit LIFECODES de tipificaci n de HLA DRB 3 4 5 para ser utilizado con Luminex Producto N 629200 50 ys MX DRB3 4 5 Mezcla maestra LIFECODES HLA DRB 3 4 5 629201 870 uL 2 8 Suficiente para 50 muestras BM DRB3 25 Da de sondas LIFECODES HLA DRB 810 uL e i rA NEN C 0088 A ST diluyente 628515 197m 18 300 LM DQB Kit LIFECODES de tipificaci n de HLA DQB para ser utilizado con Luminex Producto N 628610 50 N mero de Volumen de z 50 Y fici 2a8 2C Mezcla de sondas LIFECODES HLA DQB DIC de lados C Las mezclas de sondas son fotosensibles exp ngalas lo menos posible a la luz PRECAUCI N No utilice los componentes pasadas las respectivas fechas de caducidad P gina 3 de 9 LC775IVDES 17 02 14 USO Tipificaci n de alelos de HLA de clase I y Il basada en el ADN RESUMEN Y EXPLICACI N La tipificaci n de HLA basada en la amplificaci n del ADN por PCR es un m todo de laboratorio muy difundido Dicha amplificaci n se utiliza para multiplicar el n mero
16. de copias de una regi n seleccionada del ADN Para la tipificaci n de HLA se realiza seguidamente un ensayo con el que se determinan las propiedades del ADN amplificado En la tipificaci n de HLA se han empleado diversos tipos de ensayos tales como SSP 1 SSOP directo 2 RFLP 3 y tecnolog as de SSOP y dot blot inversa 4 Al igual que los m todos de SSOP y dot blot inversa los kits de tipificaci n LIFECODES HLA SSO emplean oligonucle tidos con especificidad de secuencia SSO para determinar qu alelos HLA est n presentes en una muestra amplificada por PCR No es el m todo sino el conjunto de SSO utilizado lo que determina la capacidad de distinguir entre los diversos alelos presentes en la amplificaci n por PCR Los m todos de SSOP y dot blot inversa emplean marcadores enzim ticos y sustratos colorim tricos que requieren un revelado ulterior mientras que el ensayo LIFECODES es un sistema m ltiple homog neo Es decir todos los SSO se analizan simult neamente y todo el ensayo se lleva a cabo en un solo recipiente de reacci n con la adici n de un solo reactivo PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO El procedimiento de tipificaci n de LIFECODES HLA SSO se basa en la hibridaci n con sondas SSO del ADN monocatenario marcado obtenido por PCR En la amplificaci n del ADN por PCR se emplean cantidades equimolares del cebador directo y del inverso para generar un ADN bicatenario pero si un cebador es m s abundante que el otro adem s de prod
17. e todos los componentes est n disueltos Antes de preparar la mezcla la soluci n diluyente debe estar a temperatura ambiente 18 30 C Prep rela antes de su uso y deseche toda la que no haya utilizado Tabla 4 Vol menes para preparar Soluci n diluyente DS cr la soluci n diluyente Toa en 850 pul 4 25 yl 1700 pl 8 5 pl 8500 pul 42 5 pl Nota NO DETENGA EL PROGRAMA DE HIBRIDACI N ANTES DE EXTRAER LA BANDEJA DEL TERMOCICLADOR 8 Enel paso final a 56 C y estando la bandeja en el termociclador diluya cada muestra con 170 ul de la mezcla preparada de soluci n diluyente y PE estreptavidina Es fundamental diluir todas las muestras en un espacio de tiempo no superior a 5 minutos siguiendo el paso de MANTENER 10 minutos a 56 C 9 Saque del termociclador la bandeja de muestras y col quela en el Luminex Instrument D An lisis de la muestra con el Luminex Instrument Para obtener mejores resultados analice las muestras de inmediato con el Luminex Instrument Las muestras pueden leerse hasta 30 minutos despu s de haberlas diluido Si no va a leer de inmediato las muestras prot jalas de la luz 1 Encienda el Luminex Instrument entre 30 minutos y 4 horas antes de analizar las muestras 2 Antes de analizar las muestras en el Luminex Instrument configure una corrida de serie para las muestras Batch Run a En el men Archivo seleccione Create a New Batch Crear una serie nueva de muestras Por ejemplo si va a analizar l
18. in vitro 2 Deben asignarse pipetas distintas para las manipulaciones previas a la PCR y para las posteriores a ella 3 Riesgo biol gico Todas las muestras biol gicas y de sangre deben tratarse como potencialmente infecciosas Al manipularlas observe las precauciones b sicas o universales 4 La soluci n diluyente las mezclas de sondas la polimerasa Taq y la PE estreptavidina contienen componentes peligrosos Evite que entren en contacto con la piel o los ojos y elimine todo el material despu s de su uso de conformidad con las normas locales Para m s informaci n consulte las fichas de datos de seguridad MSDS 5 Las decisiones cl nicas que afectan el tratamiento de un paciente no deben basarse nicamente en los resultados de estos kits C Instrucciones de conservaci n 1 Consulte en la etiqueta del embalaje de los componentes del kit las temperaturas de conservaci n correctas 2 Las mezclas de sondas y la PE estreptavidina son fotosensibles PROTEJALAS DE LA LUZ NO LAS CONGELE 3 No utilice los componentes pasadas las respectivas fechas de caducidad D Purificaci n o tratamiento necesario para su uso Vea Recolecci n y preparaci n de muestras E Indicaciones de inestabilidad 1 Si durante el transporte o el almacenamiento las sales de la soluci n se precipitan resolubil celas por completo antes de utilizar la soluci n agit ndola en v rtex a temperatura ambiente 18 a 30 C 2 No utilice estreptavidina
19. la PE estreptavidina Multiples fracasos Amplificaci n Las condiciones de la Ejecute el perfil t rmico en el termociclador para de SSO o aleloespec tfica amplificaci n no est n dentro verificar que los par metros se hallan dentro de los la muestra no de los par metros l mites especificados ofrece resultados de especificados tipificaci n de HLA ipificaci n de La muestra de ADN est contaminada A sle de nuevo el ADN de la muestra de sangre ADN parcialmente degradado Evaporaci n durante la hibridaci n Si no est usando una placa completa deje vac a una fila a cada lado de las muestras que va a analizar para tapar herm ticamente la placa La amplificaci n por PCR puede verificarse mediante electroforesis en gel v ase el Ap ndice A VALORES PREVISTOS Los valores pueden ser positivos o negativos En algunos pocos casos los valores pueden ser indeterminados Un valor indeterminado representa un intervalo en el que no se han observado valores positivos ni negativos Si una muestra contiene valores indeterminados para una sonda SSO dada debe tipificarse que la sonda es negativa y de nuevo que es positiva Pueden darse tres situaciones 1 Una de las elecciones la positiva o la negativa ofrece una correspondencia 2 Con ambas elecciones se obtienen correspondencias Se puede repetir el an lisis de la muestra o registrar los alelos obtenidos con ambas tipificaciones 3 Con ninguna de las dos elecciones se obtienen
20. o e Para m s informaci n sobre los valores umbral v ase la secci n VALORES PREVISTOS CONTROL DE CALIDAD Se recomienda llevar a cabo un control negativo y uno positivo en cada ensayo tales como un blanco de agua y una muestra previamente tipificada respectivamente Las pruebas de SSO consensuadas resumidas en la Tabla de Umbrales hibridan con alelos espec ficos de los locus correspondientes Los valores obtenidos con los SSO Consensuados de los controles positivos deber an sobrepasar los valores umbral para los SSO tal y como se indica en la Hoja de Trabajo de la Tabla de Umbrales Los valores obtenidos con SSO Consensuados de blancos de agua deber n estar por debajo del valor de umbral para el SSO tal como se indica en la Hoja de Trabajo de la Tabla de Umbrales La s mezcla s de sondas de LIFECODES tiene n una o m s sondas de SSO consensuados que se identifican en las hojas de trabajo del kit de tipificaci n Estas sondas consensuadas hibridizan a todos los alelos y act an como controles internos para verificar la amplificaci n y confirmar que ocurrieron las hibridizaciones Si no se obtiene el valor m nimo para esos SSO puede que la muestra no produzca la tipificaci n correcta y se deber a repetir el ensayo para dicha muestra El ensayo se debe llevar a cabo seg n las recomendaciones del envase as como seg n otros procedimientos de control de calidad que cumplen las especificaciones locales estatales federales y o de las
21. omega n V4281 La migraci n relativa del producto monocatenario depende de la concentraci n del gel y del sistema tamp n empleado A continuaci n se indican las migraciones aproximadas para cada amplificaci n en muestras analizadas en gel de agarosa al 2 en tamp n TAE 1X Condiciones de la electroforesis 1 Saque del congelador el colorante de cidos nucleicos GelStar Cambrex n 50535 para descongelarlo Mant ngalo en la oscuridad 2 El gel utilizado para este procedimiento debe ser al 2 es decir para obtener un lecho de gel de 200 ml utilice 4 gramos de agarosa en 200 ml de TAE 1X Diluya a partir de TAE 40X A ada 10 ul de colorante de cidos nucleicos GelStar6 a la agarosa fundida Al verter el gel aseg rese de dejar espacio de sobra para que el ADN recorra una distancia significativa entre 2 5 y 5 cm PRECAUCION GelStar6O es un posible carcin geno NOTA En lugar del colorante de cidos nucleicos GelStar6 se pueden utilizar geles con 20 ul de bromuro de etidio en concentraci n de f 10 mg mL La intensidad de la banda del producto es menor en los geles que contienen bromuro de etidio que en los que contienen GelStar PRECAUCION El bromuro de etidio es un carcin geno confirmado 3 Mantenga el gel en la oscuridad y deje que se solidifique 4 Una mezcla de 2 5uL de cada producto PCR y 2 5uL de carga doble b fer con tinte visible por muestra por la amplificaci n de carga Deje correr el gel en a oscuridad a 16
22. os HLA DRB1 a ada serie de muestras Batch para HLA DRB Se suministra la plantilla para la serie de muestras que en este caso se denomina HLA DRB Tenga en cuenta que las versiones de la plantilla son espec ficas de cada lote y corresponden al n mero de lote de cada kit Para crear las series de muestras siga paso a paso las instrucciones que aparecen en la pantalla Cuando d nombre a la serie de muestras no utilice comas porque al exportar los datos se perder la informaci n posterior a la coma Para m s instrucciones sobre la creaci n de series batches y multiseries multibatches de muestras consulte el manual del usuario del Luminex b Haga clic en el icono de expulsi n para expulsar el portaplaca Coloque la placa de 96 pocillos del termociclador que contiene las muestras en el bloque calefactor XYP situado sobre el portaplaca c Haga clic en el icono de retracci n del portaplaca Las muestras ya est n preparadas para ser analizadas Antes de iniciar el an lisis debe realizarse un cebado d Una vez analizadas las muestras en el aparato debe higienizarse ste con isopropanol al 70 o lej a dom stica al 20 seguido de dos lavados En ese momento se puede apagar el aparato si no se va a utilizar m s ese d a 3 Una vez completado el an lisis de una serie batch los datos se exportan como archivo de valores separados por comas csv Estos archivos se denominan OUTPUT CSV y se archivan en una carpeta que lleva el nombre de la se
23. rie que se introdujo en el Luminex IS A partir de este momento los datos est n ya disponibles para proceder a la tipificaci n como se describe seguidamente Consulte el manual del usuario del Luminex IS para m s informaci n acerca del funcionamiento del aparato incluyendo los procedimientos diarios de encendido calibraci n mantenimiento y apagado RESULTADOS La tipificaci n de las muestras puede realizarse como sigue Los archivos CSV generados pueden abrirse y los datos pueden procesarse con los programas habituales de hojas de c lculo como Microsoft Excel Lotus 123 Corel Quattro Pro o similares El an lisis consta de las etapas siguientes 1 Compruebe que en cada muestra el n mero de eventos por cada SSO es de al menos 60 Esta informaci n se encuentra en la secci n DataType Count del archivo CSV 2 Compruebe que en cada muestra los valores de las sondas de consenso superan la intensidad de fluorescencia mediana m nima correspondiente MFI Los umbrales m nimos son espec ficos de cada lote y figuran en la tabla de umbrales P gina 6 de 9 LC775IVDES 17 02 14 Precauci n Para obtener resultados fiables el Luminex Instrument debe reunir datos suficientes e Recoger al menos 60 eventos para cada SSO 3 Reste a los valores de la muestra el valor del control de ruido de fondo para obtener el conjunto de datos corregidos en funci n del ruido de fondo Los valores del control de ruido de fondo figuran en la tabla de
24. rse para determinar la presencia o ausencia de secuencias concretas de ADN en el producto amplificado y para identificar los posibles alelos en la muestra En la tipificaci n por el procedimiento LIFECODES HLA SSO se unen las sondas a microesferas Luminex ideadas para utilizarse con el Luminex Instrument Se pueden mezclar hasta 100 poblaciones diferentes de microesferas Luminex y se las puedeanalizar en el Luminex Instrument porque cada una de ellas se distingue por su firma o color de fluorescencia caracter stico A cada microesfera de color puede unirse una sonda SSO distinta Por consiguiente en una mezcla compuesta por varias sondas es posible distinguir unas de otras por su uni n a microesferas de un color determinado El Luminex Instrument tambi n mide las cantidades relativas de producto de PCR marcado que hibrida con cada microesfera Luminex Por consiguiente al igual que ocurre con otros m todos SSOP la se al relativa obtenida con las sondas SSO en el ensayo LIFECODES puede utilizarse para asignar a las sondas una reactividad positiva o negativa con la muestra de ADN amplificado v ase la secci n Resultados Esto a su vez ofrece la informaci n necesaria para determinar el fenotipo HLA de la muestra REACTIVOS A Identificaci n V ase en las tablas en reactivos por secci n del art culo n mero de cat logo de la relaci n completa de productos y sus n meros de referencia B Advertencias o precauciones 1 Para diagn stico
25. ucto bicatenario la reacci n genera algo de ADN monocatenario Durante los ciclos iniciales de la etapa de amplificaci n con LIFECODES se genera ADN bicatenario Una vez agotado el cebador limitante el cebador restante utiliza el producto bicatenario como molde para generar ADN monocatenario Este m todo genera tanto productos bicatenarios como monocatenarios que una vez desnaturalizados participar n en la reacci n de hibridaci n Cada una de las distintas sondas puede ser hom loga de una secuencia del ADN amplificado exclusiva de un alelo o grupo de alelos Dicho de otro modo estas sondas se han creado para que cada una de ellas hibride preferentemente con una regi n complementaria que puede estar presente o no en el ADN amplificado Adem s el ADN amplificado hibrida tambi n con una o m s sondas de consenso hom logas a secuencias presentes en todos los alelos de un locus La tipificaci n con SSO puede verse afectada por el tipo de material biol gico el m todo de purificaci n y la cantidad e integridad del ADN gen mico Por consiguiente la se al obtenida con la s sonda s de consenso puede servir de indicador del xito de la amplificaci n e hibridaci n Puede utilizarse asimismo para normalizar la se al de las sondas aleloespec ficas y efectuar los ajustes necesarios seg n las variaciones de la cantidad de producto amplificado en la reacci n de hibridaci n El an lisis de los resultados de la tipificaci n con SSO puede aplica
26. vaci n m s prolongada almacenar la muestra a 20 C como mucho una semana hasta el momento de analizarla El producto amplificado s lo puede congelarse y descongelarse una vez Las congelaciones y descongelaciones repetidas degradan las muestras amplificadas y su an lisis de realizarse ofrece resultados incorrectos A Purificaci n del ADN gen mico con un m todo de su elecci n la concentraci n final debe estar comprendida entre 10 y 200 ng ul En caso necesario ajuste con agua exenta de nucleasas Mantenga todas las muestras a concentraciones similares B Amplificaci n del ADN PCR 1 Deje que la temperatura de la mezcla maestra se iguale con la temperatura ambiente 18 30 C 2 Agite suavemente los reactivos en v rtex durante 10 segundos aproximadamente Esto garantizar que las sales est n disueltas Centrif guelos brevemente 5 10 segundos en la microcentr fuga para que el contenido se desplace al fondo del tubo 3 Gui ndose por la Tabla 1 prepare los componentes para la amplificaci n para n 1 reacciones utilizando de cada componente excepto el ADN la cantidad indicada por reacci n Complete con agua exenta de nucleasas hasta un volumen final de 50 ul por reacci n Agite suavemente en v rtex centrifugue y coloque sobre hielo 4 Pipetee la cantidad adecuada de ADN gen mico 100 300ng en los tubos de PCR 5 Distribuya al cuotas de la mezcla ampliada en los tubos de PCR que contienen el ADN gen mico
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