IVD - BAG Health Care GmbH
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1. HISTO TAQ R F 70975 ou Qiagen Taq ne pas utiliser de Taq Polymerase hot start ex Ampli Taq Gold Trousse EXTRA GENE R F 7059 facultative pour l extraction d ADN partir de sang lymphocytes ou leucocytes ou mat riel pour d autres m thodes d extraction d ADN Pipettes piston 0 5 250 uL D N 2 sur 28 Embouts st riles avec filtre int gr Thermocycleur consulter la liste des thermocycleurs valid s page 7 Agarose ADN Tampon TBE 0 5x Tris 45 mM acide borique 45 mM EDTA 0 5 mM Bromure d thidium EtBr Appareil d lectrophor se gel immerg G n rateur lectrique 200 300 V 200 mA chelle ADN R F 7097 Source d UV transilluminateur 220 310 nm Syst me de documentation du gel 60000 2 3 Conservation et stabilit Les trousses sont livr es temp rature ambiante Conserver tous les r actifs lt 20 C La date de p remption est indiqu e sur l tiquette de chaque r actif Elle est galement valable une fois les r actifs ouverts La date de p remption indiqu e sur l tiquette externe correspond au r actif ayant la validit la plus courte dans la trousse D congeler le tampon PCR 10x peu de temps avant utilisation 3 Donn es de performance La composition du m lange d amorces garantit une identification fiable des all les mentionn s sur la fiche de travail d apr s les donn es des s quences connu2. alis e par du personnel comp tent exp riment en technologie mol culaire et en s rologie des groupes sanguins Les recommandations les plus r centes de m decine transfusionnelle et de d termination des groupes sanguins ainsi que d anamn se de la 3 sur 12 transfusion doivent tre respect es pour r duire le risque de typages erron s en particulier en cas de r sultats discordants entre les m thodes d analyse s rologique et de g n tique mol culaire Le g notypage des groupes ABO et RHD RHCE ainsi que la d termination des sp cificit s Kell Kidd Duffy MNS HPA et HNA doivent tre r alis s apr s un test s rologique Des conditions particuli res de s curit doivent tre respect es pour viter la contamination et donc les fausses r actions Porter des gants pour manipuler sans poudre si possible Utiliser de nouveaux embouts pour chaque tape de pipetage avec un filtre int gr Utiliser des zones de travail s par es pour les t ches avant l amplification isolement de l ADN et pr paration des r actions et apr s l amplification lectrophor se sur gel documentation De pr f rence utiliser deux pi ces diff rentes Utiliser les dispositifs et autres mat riels uniquement leur place respective et ne pas les changer 4 2 Isolement de l ADN La trousse EXTRA GENE est parfaitement adapt e pour l isolement de l ADN puisque les acides nucl iques pur peuvent tre obte
3. es sur la fiche de travail Pour toutes les pistes sans amplification sp cifique d all le le contr le interne doit appara tre 434 pb sauf pour la trousse D Zygosity TYPE et la r action PCR avec le m lange n 2 de la trousse RH TYPE pour lesquelles la longueur du contr le interne est de 659 pb Dans la plupart des cas avec une amplification sp cifique d all le le contr le interne est plus faible ou absent En cas de r sultats incorrects consulter le guide de d pannage paragraphe 6 S il n est pas possible d obtenir des r sultats nets avec les trousses BAGene p ex en raison d all les inconnus ne pouvant pas tre d tect s par les amorces existantes les recommandations nationales de transfusion doivent tre respect es conform ment aux typages s rologiques Le s quen age de ces chantillons est recommand Les r sultats de typage doivent tre interpr t s en tenant compte de la variation g n tique dans les diff rents groupes ethniques En cas de doute le ph notype est valide 4 6 2 ABO TYPE et ABO TYPE variant L expression homozygote des all les ABO O01 ABO O03 ABO B101 ABO A201 est indiqu e au moyen de bandes dans la r action PCR correspondante 1 3 5 ou 7 Dans le cas d une h t rozygotie les quatre non r actions doivent pr senter une bande dans le gel 2 4 6 et 8 en plus de deux pr parations PCR sp cifiques 1 3 5 7 L homozygotie de l all le ABO A101 est indiqu e
4. isoler l ADN essayer taille non significative d autres m thodes dowent Sere negligees Concentration en ADN trop Utiliser moins d ADN lev e Concentration en enzyme trop Utiliser moins d enzyme lev e Param tres d amplification Optimiser les param tres incorrects d amplification voir 4 3 Le r sultat donne plus Contamination crois e V rifier les m langes de de 2 sp cificit s produits d amplification typage sans ajouter nouvel all le d ADN respecter des conditions de travail propres d contaminer Pas de bandes visibles Coloration l EtBr trop faible Refaire la coloration ou bandes tr s faibles chelle ADN invisible Le fond du gel est trop Dur e de coloration l EtBr Tremper le gel dans de trop longue concentration en l eau ou du TBE r duire la EtBr trop lev e concentration en EtBr Bande floue Tampon d lectrophor se trop R duire la tension utiliser chaud ou p rim mauvais du tampon TBE O 5x tampon d lectrophor se gellutiliser un gel enti rement non enti rement polym ris polym ris Si l quipement et les mat riels utilis s sont ceux propos s dans cette notice l optimisation des param tres d amplification ne doit tre envisag e qu en dernier ressort Dans la plupart des cas il est possible d valuer le test sans tenir compte des bandes suppl mentaires de taille discordante 11 sur 12 7 Bibliographie Green and Sambrook 2012 Molecular Cl
5. les trousses BAGene Hatem Extension finale 1 Cycle 6 sur 12 Ne pas utiliser de bloc chauffant en aluminium par ex avec le GeneAmp PCR System 9700 En cas d utilisation de thermocycleurs pr sentant des vitesses tr s rapides de mont e et de descente en temp rature il est recommand d utiliser une vitesse plus lente de mont e et de descente en temp rature 2 5 C s Comme les thermocycleurs de diff rents fabricants fonctionnent diff remment et m me des appareils individuels d un m me type peuvent tre talonn s diff remment il peut tre n cessaire d optimiser les param tres d amplification Pour optimiser l appareil utiliser les consignes suivantes en cas de r sultats faussement positifs bandes non sp cifiques types suppl mentaires augmenter la temp rature d hybridation par pas de 1 C en cas de r sultats faussement n gatifs bandes manquantes r duire la temp rature d hybridation par pas de 1 C et ou augmenter les dur es d hybridation par pas de 5 secondes et ou augmenter les dur es de d naturation par pas de 5 secondes Il est recommand d utiliser uniquement des thermocycleurs r guli rement talonn s La trousse BAG Cycler Check REF 7104 est recommand e pour le contr le des thermocycleurs 4 4 lectrophor se sur gel La s paration des produits d amplification est r alis e par lectrophor se sur un gel horizontal d agarose Le tampon
6. n gatifs Ceci est indiqu soit par des bandes uniquement pour le contr le interne soit par l absence totale de bandes 5 Avertissements et pr cautions Le bromure d thidium est un agent mutag ne puissant viter les contaminations et le contact avec la peau Consulter les instructions d utilisation et les avertissements et pr cautions du fabricant Le transilluminateur met une lumi re UV longueur d onde tr s courte qui peut provoquer des br lures de la peau et de la r tine Utiliser un masque facial anti UV Tous les produits biologiques utilis s pour l extraction d ADN par exemple le sang ou un tissu humain doivent tre manipul s comme des substances potentiellement infectieuses Il est recommand de respecter les pr cautions de s curit adapt es pour manipuler les produits biologiques ne pas pipeter la bouche utiliser des gants jetables pour manipuler les produits biologiques et r aliser le test se d sinfecter les mains une fois le test termin Les produits biologiques doivent tre inactiv s avant leur limination p ex dans un autoclave Les produits jetables doivent tre autoclav s ou incin r s apr s usage Un renversement de produits potentiellement infectieux doit tre ramass imm diatement avec du papier absorbant et les zones contamin es doivent tre nettoy es avec un d sinfectant standard adapt ou avec de l alcool 70 Les mat riels utilis s pour nettoyer les renversemen
7. 25 460 verkauf bag healthcare com www bag healthcare com Customer Service Tel 49 0 6404 925 125 Fax 49 0 6404 925 421 service bag healthcare com
8. O BAG tam care Notice technique d utilisation Trousses BAGene DNA SSP CE IVD Trousses de test pour la d termination des groupes sanguins ABO types RH syst mes Kell Kidd et Duffy syst me MNS sp cificit s HPA et HNA par m thode de g n tique mol culaire pr ts l emploi pr aliquot s Lire attentivement les instructions figurant dans le manuel d utilisation du ou des syst me s et sur les tiquetages et ou dans la notice d utilisation du r actif R F 6640 ABO TYPE R F 6641 ABO TYPE variant R F 6645 RH TYPE R F 6646 Partial D TYPE R F 6647 Weak D TYPE R F 6648 D Zygosity TYPE R F 6650 KKD TYPE R F 6652 MNS TYPE R F 6660 HPA TYPE R F 66701 HNA TYPE Table des mati res 1 Description du produit sisi ris aene a aaa aaia tan 2 2 MEE EE EE E E sas EE 2 2 1 Contenu des trousses BAGene SSP ssssssssesesessssssesesrnrenennnnnnrnrnnarenrnrane 2 2 2 Mat riel n cessaire mais non OUI stttess 2 2 3 Conservation et stabilit ses nsc iieeietne es 3 3 Donn es de p riormanees inside aient nee 3 4 PrOtOCOlE srsrrinisepisiiisinsrini eii ennie E EARE EE AAE EE EEE 3 4 1 Conditions de s curit et remarques sp cifiques s ssrrsrrrrrrrrrrsrrsrrnrn 3 4 2 Isolement de ADN dr amant aidons 4 4 3 Amplification sirrsisirrriri ierisinde scnu eme Dies een ste LEARNER Ei EDELA tnt 4 AA lec
9. d lectrophor se recommand est le TBE 0 5x Tris 45 mM acide borique 45 mM EDTA 0 5 mM Le gel doit contenir une concentration de 2 0 2 5 d agarose Laisser le gel polym riser pendant au moins 30 minutes avant de d poser les chantillons Une fois l amplification termin e sortir les chantillons du thermocycleur et d poser soigneusement la totalit des m langes r actionnels sur chaque position du gel Ajouter en plus 10 uL de l chelle ADN pour la comparaison des tailles R aliser la s paration par lectrophor se 10 12 V cm avec une distance de 20 cm entre les lectrodes soit environ 200 240 V pendant 20 40 minutes Une dur e de 40 minutes est recommand e pour am liorer la s paration des bandes avec la trousse D Zygosity TYPE Une fois l lectrophor se termin e colorer le gel complet dans une solution de bromure d thidium EtBr environ 0 5 ug mL d EtBr dans de l eau o du tampon TBE Il est galement possible d ajouter l EtBr 0 5 ug mL au tampon d lectrophor se ou au gel d agarose Au besoin l exc s d EtBr peut tre limin en immergeant le gel dans de l eau pendant 20 30 minutes 4 5 Documentation Pour la documentation visualiser l amplification PCR l aide d un transilluminateur UV 220 310 nm et la photographier avec un syst me de documentation du gel Choisir le temps d exposition et l ouverture pour que les bandes soient bien nettes et se d tachent du fond sombre donn
10. e est diff rente La composition du m lange initial est indiqu e dans le tableau 1 4 sur 12 Tableau 1 Composition du m lange initial selon le nombre de cupules r actionnelles Marque gt N lot Nb de Eau Tampon PCR Solution ADN Taq Volume cupules distill e 10 x 50 100 ng L 5 U uL total 1 8 1 1 0 08 10 uL 2 16 2 2 0 2 20 uL 6x 50 7 7 0 5 65 uL 7 70 9 9 0 7 90 uL 8 80 10 10 0 8 100 uL 9 88 11 11 0 9 110 uL 10 96 12 12 1 0 120 uL 11 104 13 13 1 0 130 uL 12 112 14 14 1 1 140 uL 13 128 16 16 1 3 160 uL 14 136 17 17 1 4 170 uL 15 144 18 18 1 4 180 uL 16 152 19 19 1 5 190 uL Pour des concentrations en ADN diff rentes les quantit s d ADN et d eau doivent varier en cons quence p ex pour 12 cupules 5 8 uL de solution d ADN 120 ng uL et 119 uL d eau distill e Il est recommand de pr parer au minimum le m lange initial n cessaire pour 6 m langes r actionnels en raison du faible volume de Taq Polym rase Pour la trousse D Zygosity TYPE il est recommand d utiliser une concentration en ADN de 30 50 ng L 5 sur 12 3 Homog n iser au Vortex et distribuer ensuite 10pL de ce m lange dans chacune des cupules r actionnelles pr aliquot es Changer d embout apr s chaque tape de distribution Bien fermer les tubes avec les bouchons respectifs S assurer de ne pas toucher la paroi interne des bouchons ni les bords s
11. es l heure actuelle L exactitude et la reproductibilit de la sp cificit de chaque m lange d amorces ont t v rifi es pour chaque lot l aide d chantillons d ADN de contr le pr sentant des sp cificit s connues Les all les qui ne sont pas disponibles et qui n ont pas t test s en raison de leur raret sont indiqu s sur la fiche de travail mention n t non test l heure actuelle Des tudes de performance ont t r alis es sur toutes les trousses BAGene SSP avec des chantillons d ADN pr c demment typ s Ces tudes ont montr des r sultats nets et conformes aux pr typages s rologiques et ou g nomiques Aucune discordance n a t observ e au cours des tudes Les chantillons d ADN utilis s pour l valuation et le contr le de qualit des m langes ont t extraits l aide de trousses Extra Gene I m thode de relargage ou Qiagen m thode sur colonne Les trousses BAGene sont valid es avec HISTO TAQ REF 70975 ou la Taq Polymerase de Qiagen Un typage fiable est garanti condition d utiliser 50 100 ng d ADN par m lange r actionnel l exception de la trousse D Zygosity TYPE En raison du programme PCR prolong de ce produit une concentration inf rieure en ADN de 30 50 ng par m lange r actionnel doit tre utilis e 4 Protocole 4 1 Conditions de s curit et remarques sp cifiques La PCR est une m thode particuli rement sensible qui doit tre r
12. es approximatives ouverture 11 temps d exposition 1 seconde Reporter les r sultats sur la fiche de travail fournie voir paragraphe 4 6 4 6 Interpr tation des r sultats et limites de la m thode 4 6 1 G n ral Les r sultats des d terminations en g n tique mol culaire r alis es avec les trousses BAGene sont document s sur les fiches de travail fournies 7 sur 12 Celles ci comportent un tableau r pertoriant les caract ristiques sp cificit s ph notypes et g notypes ainsi qu un exemple de sch ma r actionnel pour faciliter l interpr tation Les pr parations PCR disposent chacune d un num ro de r action p ex ABO TYPE r actions n 1 8 La fiche de travail indique sous les num ros de r action la longueur du fragment des produits PCR sp cifiques en pb Les sch mas possibles de bandes dans le gel sont pr sent s dans les lignes qui suivent Des produits PCR sp cifiques r action positive sont indiqu s par le signe et les cases correspondantes du diagramme sont color es ABO TYPE ABO TYPE variant Partial D TYPE Weak D TYPE D Zygosity TYPE KKD TYPE MNS TYPE HPA TYPE HNA TYPE vert autre RH TYPE rouge rose et bleu L valuation des sch mas r actionnels est r alis e en lignes de la gauche vers la droite Seules les bandes pr sentant une taille conforme par rapport l chelle ADN doivent tre consid r es positives Les tailles conformes des amplicons sp cifiques sont indiqu
13. ifique de l hormone HGH d une longueur de 434 pb appara t comme contr le interne La r action PCR n 2 est une exception ici la bande de contr le appara t 659 pb sp cifique de la s quence g nomique du chromosome I de 90 kpb l extr mit 5 de la bo te rh sus Si le sch ma r actionnel indique une cat gorie D un examen suppl mentaire l aide de la trousse Partial D TYPE doit tre r alis afin d exclure les mutations ponctuelles pouvant tre l origine de ces r sultats 4 6 4 Partial D TYPE Une bande manquante dans la r action n 4 peut indiquer un DFR s rologie faiblement positive avec l anti D ou un RHDY h mi ou homozygote D n gatif en s rologie En l absence d information s rologique la confirmation ou l exclusion du RHDY peut tre obtenue par la trousse RH TYPE En pr sence d un type 41 et 45 de D faible le m lange n 9 peut pr senter une absence de r action Des mutations de parties de l intron peuvent galement conduire une r action manquante dans les m langes 8 ou 9 En pr sence d un type 20 de D faible la r action n 10 n affiche g n ralement aucune bande Parfois une bande faible appara t Il n est pas possible l heure actuelle de diff rencier par g n tique mol culaire les variants DCS DFW DIM et DNU de D du type RHD standard La prise en compte des haplotypes est utile 9 sur 12 4 6 5 D Zygosity TYPE Pour les all les RHD ne pouvant pas tre d termi
14. mplification est obtenue uniquement si les amorces correspondent en totalit la s quence cible Elle est ensuite visualis e par lectrophor se sur gel d agarose Figure 1 principe de la PCR SSP E Appariement parfait gt amplification Mismatch gt pas d amplification all le sp cifique all le non sp cifique La composition de chaque m lange d amorces permet l identification claire des g notypes ABO RH KEL JK FY MNS HPA et HNA indiqu s dans les diagrammes d valuation respectifs Chaque typage utilise un certain nombre de m langes r actionnels pr aliquot s Un contr le interne d amplification est pr sent dans chaque m lange r actionnel 2 Mat riel 2 1 Contenu des trousses BAGene SSP Plaques barrettes PCR pour le typage du groupe sanguin Les m langes r actionnels pr aliquot s et s ch s sont compos s d amorces sp cifiques d all le d amorces de contr le interne sp cifique du g ne HGH Human Growth Hormone ou d une s quence du chromosome I 90 kpb l extr mit 5 de la bo te rh sus et de nucl otides Le m lange r actionnel n 1 est indiqu par un marquage Le num ro du lot est imprim sur chaque plaque barrette Tampon PCR 10x Bouchons de barrette 8x Notice d utilisation fiche de travail Informations relatives l valuation uniquement pour ABO TYPE variant Mat riel n cessaire mais non fourni Taq Polymerase 5 U UL p ex
15. n s par s rologie RhD n gatifs une discordance peut appara tre entre le r sultat s rologique et le g notypage La d tection positive de la bo te rh sus aval indique la pr sence d un all le RHD RHD positif sauf dans le cas du RHDY homozygote et h mizygote La r action est ici n gative malgr la pr sence d un all le RHD De plus le r sultat peut galement tre faussement n gatif en pr sence d une bo te rh sus aval modifi e g n tiquement m me si l chantillon pr sente un r sultat s rologique D positif En cas de r sultat s rologique D positif et de PCR positive pour la bo te rh sus hybride la conclusion est donc Dd Le r sultat est DD gt quand un r sultat PCR est n gatif pour la bo te rh sus hybride En raison d un polymorphisme distinct de la bo te rh sus hybride des Africains le r sultat peut tre faussement positif en pr sence de l all le RHDY et d un autre all le RHD En cas d absence d une bo te rh sus hybride dans la population africaine les r sultats des all les RHDY et Cde obtenus par la trousse RH TYPE doivent tre pris en compte D autres all les RHD n gatifs de l antig ne D ne peuvent pas tre exclus avec les trousses de tests actuellement disponibles Ceci doit tre pris en compte dans l interpr tation des r sultats Cependant l incidence de ces all les dans la population blanche est tr s faible L ADN d grad peut produire des r sultats faussement
16. nus rapidement partir de sang total sans utiliser de produits chimiques ni de solvants toxiques Par ailleurs des m thodes commerciales sur colonne ou sur bille ou d autres m thodes d crites dans la bibliographie permettent d obtenir un ADN de puret satisfaisante La pr sence d h parine peut inhiber la PCR De ce fait il est recommand d utiliser du sang recueilli sur EDTA ou sur citrate pour le typage Les indices de puret de l ADN doivent tre les suivants DO 6 DO230 gt 1 5 et lt 2 0 indicateur de contamination par de l ARN ou des prot ines DO6 DO 30 gt 1 8 indicateur de contamination par des sels des glucides ou des solvants organiques 4 3 Amplification Tous les m langes r actionnels pr aliquot s et s ch s contiennent d j les amorces sp cifiques d all le et de contr le ainsi que les nucl otides Ceux ci sont livr s s ch s dans la cupule r actionnelle Les param tres de l amplification sont optimis s pour obtenir un volume final de 10 pL 1 Sortir le nombre n cessaire de plaques barrettes du cong lateur et d congeler le tampon PCR 10x 2 Pipeter le m lange initial compos de tampon PCR 10x de solution d ADN de Taq Polym rase et d eau distill e et bien homog n iser Les diff rentes trousses BAGene utilisent le m me m lange initial et peuvent de ce fait tre combin es l exception de la trousse D Zygosity TYPE pour laquelle la concentration d ADN recommand
17. oning A Laboratory Manual New York Cold Spring Harbour Laboratory Consulter le site www bag healthcare com pour obtenir d autres r f rences Explication des symboles utilis s Date de p remption Temp rature de conservation Consulter la notice technique d utilisation lt Le Suffisant pour n tests BLOOD TYPING Destin la d termination du groupe sanguin CONT Contenu contient HNA TYPING Destin au g notypage des syst mes HNA HPA TYPING Destin au g notypage des syst mes HPA Notice technique d utilisation zj BE Pour usage de diagnostic in vitro LOT N de lot PCRBUF 10x Tampon PCR concentr 10x PCRCAP Bouchons PCR PCRPLATE Plaques PCR PCRSTRIP Barrettes PCR REACTIONMIX M lange r actionnel REF Code produit RTU Pr t l emploi WORKSHEET Fiche de travail Pour obtenir de plus amples informations consulter le site Internet www bag healthcare com ou crire l adresse info bag healthcare com N B pour les modes d emploi en d autres langues veuillez utiliser ce lien www bag healthcare com en Diagnostika Downloads http BAG Health Care GmbH AmtsgerichtsstraRe 1 5 35423 Lich Germany OBAG 12 sur 12 Tel 49 0 6404 925 0 Fax 49 0 6404 925 250 info bag healthcare com Auftragsannahme Ordering Tel 49 0 6404 925 450 Fax 49 0 6404 9
18. par des bandes uniquement dans les quatre non r actions gt 2 4 6 8 car il n existe pas de pr paration sp cifique ABO A101 La constellation h t rozygote ABO A101 peut tre reconnue par une bande suppl mentaire des r actions sp cifiques d all le 1 3 5 7 9 10 11 12 13 14 15 ou 16 Comme seuls certains variants d all le A peuvent tre d tect s avec la trousse ABO TYPE variant d autres variants d all le A peuvent tre masqu s derri re le r sultat PCR ABO A101 Comme seuls certains variants d all le B et aucun variant d all le A sont d tect s avec la trousse ABO TYPE variant d autres variants d all le B ou A peuvent tre masqu s derri re les r sultats PCR respectivement ABO B101 et ABO A201 La plupart des all les B et cis AB pr sentent galement un r sultat positif la r action ABO B101 Des explications d taill es sont fournies sur une notice d information compl mentaire pour l valuation de chaque trousse ABO TYPE variant Veuillez consulter les remarques particuli res sur la fiche de travail de la trousse ABO TYPE ainsi que celle de la trousse ABO TYPE variant Une bande sp cifique de l hormone HGH d une longueur de 434 pb appara t comme contr le interne 8 sur 12 4 6 3 RH TYPE La d termination par g n tique mol culaire du RHD standard ainsi que de certains variants RHD haplotypes RHD positifs dans des chantillons D n gatifs en s rologie D partiel son
19. t r alis s dans les r actions PCR d sign es Les pr parations 1 et 2 sont des r actions PCR multiplexes pour examiner 5 polymorphismes RHD intron RHD 4 et 7 exon 7 ainsi que la d termination sp cifique de RHD W16X et de RHDY Ceci signifie que contrairement toutes les autres trousses BAGene sauf pour la bande de contr le interne chaque r action PCR doit produire non pas un mais deux amplicons sp cifiques Pour faciliter l valuation les cases respectives sont divis es et pr sentent un fond bicolore quand deux bandes peuvent appara tre Les longueurs de fragment du produit PCR et les polymorphismes sont galement identifi s par une couleur sp cifique selon les cases pour le sch ma r actionnel Exemple RHDY Pr paration n 1 deux bandes sp cifiques doivent tre pr sentes dans le gel Produit PCR 224 pb identification verte sch ma r actionnel dans la case avec un fond vert Produit PCR 123 pb identification bleue sch ma r actionnel dans la case avec un fond bleu Pr paration n 2 deux bandes sp cifiques doivent tre pr sentes dans le gel Produit PCR 154 pb identification rouge sch ma r actionnel dans la case avec un fond rouge Produit PCR 390 pb identification verte sch ma r actionnel dans la case avec un fond vert Les r actions PCR d sign es sont destin es la d termination en g n tique mol culaire des caract ristiques du locus du g ne RHCE Une bande sp c
20. trophor se sur gel sssssssssssssitiniikkkt stts tetta nkk ktkt nan ane donnanemest s endianee 7 4 5 Documentation sssssssrssrrrrsrnnrrrsunrrssnnrrnsnnrrsnnnrrnnnnrrnnnnnnnnnnnrnnannnnnnnnnnn 7 4 6 Interpr tation des r sultats et limites de la m thode 7 5 Avertissements et pr cautions ssississssssiisisessenecesneseenenesneneenes 10 6 B patinade sus ins AE Ta eE EO EEEE EAEE N Eada 11 7 BD lIG OI BAISE ennemie mnde dense nasale 12 8 Explication d s symboles utilis s sautent inner 12 Version 9 14 Publication juillet 2014 Distribu en Belgique en France et au Luxembourg par m diane diagnostics Z A de la Cha ne 78370 PLAISIR 01 30 07 50 60 info mediane diag fr 1 Description du produit Les trousses BAGene sont utilis es pour le g notypage des sp cificit s ABO RH Kell Kidd Duffy MNS HPA et HNA Elles compl tent explicitent et confirment les r sultats s rologiques et assurent un typage clair des donneurs des receveurs et des femmes enceintes au niveau de l ADN L ADN leucocytaire purifi constitue le mat riau de base du typage par les trousses BAGene SSP Le test est r alis par PCR SSP PCR par amorces sp cifiques de s quence ou Sequence Specific Primers voir figure 1 Cette m thode est bas e sur le fait que l extension de l amorce et de ce fait la r ussite de la PCR repose sur l appariement exact de l extr mit 3 des deux amorces Par cons quent l a
21. ts y compris les gants doivent tre inactiv s avant leur limination p ex dans un autoclave L limination de tous les chantillons des r actifs non utilis s et des d chets doit tre conforme aux r glementations nationales r gionales et locales Les fiches de donn es de s curit FDS peuvent tre t l charg es l adresse www bag healthcare com 10 sur 12 6 D pannage Probl me Rasonpossire Pas d amplification ADN contamin par des R isoler l ADN essayer chelle ADN visible inhibiteurs de PCR ADN d autres m thodes d grad Concentration en ADN trop Modifier la concentration lev e ou trop faible en ADN r isoler l ADN Enzyme absente ou en Faire le typage modifier la concentration trop faible concentration de l enzyme ADN provenant de sang Refaire le typage avec du h parin sang recueilli sur EDTA Param tres d amplification Optimiser les param tres incorrects d amplification voir 4 3 chec r p t sur Fuite dans les tubes Fermer troitement les certaines pistes pas r actionnels perte d eau et tubes avec leurs bouchons sur le contr le modification de la d amplification concentration au cours de la PCR Amplification non Contamination par les produits D contaminer refaire le sp cifique bandes d amplification typage respecter des suppl mentaires les conditions de travail bandes propres suppl mentaires d une ADN contamin par des sels R
22. up rieurs des tubes avec les doigts pour viter les contaminations En cas d utilisation de thermocycleurs quip s de capot ferm troitement il est galement possible d utiliser des tapis de silicone r utilisables Agiter l g rement la plaque pour dissoudre le r sidu bleu situ au fond de la cupule Toute la solution PCR doit se d poser au fond de la cupule 4 Placer les tubes r actionnels dans le thermocycleur et bien serrer le couvercle pour que les cupules ne se d forment pas la chaleur Lancer le programme PCR Il n est pas n cessaire de recouvrir les m langes r actionnels avec de l huile min rale en pr sence d un couvercle chauffant et ajust Param tres d amplification pour toutes les trousses BAGene sauf D Zygosity TYPE o tape Dur e T Nb de cycles Thermocycleurs valid s Premi re 96 C 1 Cycle PTC 100 200 C1000 d naturation MJ Research BioRad GeneAmp PCR Hybridation 4 vitesse de mont e en y temp rature du extension mod le 9600 ABI TO Cydes Mastercycler epGradient S utiliser la fonction Hybridation Simuler le gradient 5 Mastercycler Eppendorf Tprofessiona D natureton 10 Sec 96 C 15 cycles Biometra Herason fso see ferc ATTENTION programme PCR diff rent Param tres d amplification pour la trousse D Zygosity TYPE Premi re 95 C 1 Cycle Voir param tres d naturation d amplification pour toutes C JD naturation 20Sec 35 Cycles
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