Anti-EBV EBNA IgG ELISA
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1. PC double test 200 Echantillon 1 21 aa 200 Recouvrir la MTP en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 30 1 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 Processeur 30 1 mn 37 1 C WB 550 550 550 550 tape 2 puits pl CONJ 100 100 100 100 Recouvrir la MTP en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 30 1 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 Processeur 30 1 mn 37 1 C barrettes de microplaques inutilis es FOL 3 Feuilles transparentes auto adh sives Feuilles transparentes auto adh sives pour recouvrir les puits des microplaques pendant l incubation ag 1 Notice du coffret Conservateurs concentration totale lt 0 11 Mat riaux n cessaires mais non fournis avec la trousse micropipettes photom tre spectral 450 nm longueur d onde de r f rence 615 690 nm aveur de microplaques lavage de fond et incubateur 37 C pour les MTP Avertissement et pr cautions Conjugu est irritant Proclin 300 Ne pas incorporer de r actifs Eviter le contact avec les yeux et la peau Traiter tous les chantillons et les mati res utilis es pour le test comme des produits potentiellement infectieux et prendre les mesures de s curit appropri es Les contr les sont n gatifs pour anti HIV 1 2 ant2. STD inf rieure lt 0 800 a Date de p remption d pass e b Temp rature trop basse ou dur e d incubation trop faible c Erreur de lavage lavage trop intensif ou contact m canique entre le distributeur et la phase solide du puits d Contamination de Pc ST ou 3b 5 Valeur de DO moyenne de up rieure Z 0 200 voir 1 et 2 a d a n a pas t pipet apr s le pipetage des chantillons pipeter tous les chantillons avant de pipeter les blancs et les contr les b Contamination par le couvercle du PC CE 187702 12 04 2011
3. RU ml Placer les deux valeurs limites aux coordonn es suivantes x y Coordonn es de la valeur limite inf rieure DO seuil 1 RU mi Coordonn es de la valeur limite sup rieure DO de PC RU mI valeur port e par l tiquette Joindre les deux points par une ligne droite Les valeurs des DO des chantillons sont lues sur la courbe d talonnage en RU mlI par d placement parall le partir de l axe des x en utilisant une r gle Si un chantillon a t dilu plus de 1 21 la valeur d termin e partir du graphe doit tre multipli e par le facteur de pr dilution par exemple valeur mesur e x 10 pour une dilution de 1 210 D termination math matique La valeur RU mI d un chantillon test la dilution de 1 21 est calcul e par l quation suivante DO de l chantillon seuil RU mil de l chantillon RU mI 1 x 1 DO de STD 1 21 seuil Pour la d termination quantitative d un chantillon dilu plus de 1 21 la valeur obtenue par le calcul ci dessus doit tre multipli e par le facteur de pr dilution Exemple pour un chantillon mesur une dilution de 1 210 facteur de pr dilution 10 RU mi de l chantillon 1 210 RU mI de l chantillon calcul d apr s la formule x 10 Interpr tation et informations Les valeurs quantitatives d termin es sont sp cifiques du test et ne sont pas comparables avec les valeurs d termin
4. Processeur 15 1 mn la temp rature ambiante dans l obscurit STOP 100 100 100 100 Mesurer l extinction imm diatement ou dans les 15 mn suivant l arr t 450 nm en utilisant un spectrophotom tre spectral longueur d onde de r f rence 615 690 nm En cas d utilisation de processeurs ELISA l op rateur doit valider le test sous sa propre responsabilit Calcul de la d termination qualitative Apr s mesure des valeurs d extinction 450 nm dans tous les puits filtre de r f rence 615 690 nm soustraire la valeur moyenne des blancs des valeurs d extinction des contr les et des chantillons Extinction moyenne des blancs lt 0 100 Apr s soustraction du blanc les valeurs des contr les doivent satisfaire les crit res de validit suivants DO moyenne de NC lt 0 200 DO moyenne de P Calcul de la d termination quantitative Le kit comprend une solution standard conforme aux directives RiliB K de l ordre f d ral de m dicins allemands 8 pour la d termination quantitative 8 Apr s mesure des valeurs d extinction 450 nm dans tous les puits filtre de r f rence 615 690 nm soustraire la valeur moyenne des blancs des valeurs d extinction des contr les et des chantillons Extinction moyenne des blancs lt 0 100 Apr s soustraction du blanc les valeurs des contr les doivent satisfaire les crit res de validit suivants DO moyenne de Nc 0 200 DO mo
5. 3 J Virol Meth 42 301 108 6 Hinderer W Nebel Schickel H Horn J Vornhagen R Wenger S ss R et Sonneborn H H 1993 Biotest Bulletin 5 33 46 7 Tamir D Benderley A Levy J et al 1974 Pediatrics 53 330 8 Bundes rztekammer Richtlinie der Bundes rztekammer zur Qualit tssicherung labormedizinischer Untersuchungen 2008 Guide de d pannage 1 Taux lev et inattendu de r sultats r actifs Des chantillons ou des contr les ont t pipet s avant le pipetage de ou bien le m lange a t insuffisant 2 Valeur moyenne du blanc sup rieure au crit re de validit DO Z 0 100 a SUB devenue bleue par oxydation ou contamination b Erreur de lavage Effectuer l tape des 5 cycles de lavage Si l on utilise un dispositif de lavage manuel effectuer 7 cycles de lavage de l tape de lavage Utiliser le de Bio Rad contenu dans la trousse c Erreur d incubation temp rature trop haute dur e d incubation d pass e ou plaque non incub e directement apr s la fin du pipetage d Erreur de longueur d onde une mesure sans filtre de r f rence augmentera les valeurs de DO d approximativement 0 120 3 Coloration jaune dans tous les puits voir 2a 2b a contamin pr parer un nouveau tampon de lavage b contamin r p ter le test avec des r actifs provenant de flacons encore ferm s Utiliser les r actifs dans des conditions plus aseptiques 4 Valeur de DO moyenne de Pc
6. Anti EBV EBNA IgG ELISA Test immunoenzymatique pour la d tection in vitro des anticorps IgG dirig s contre l antig ne nucl aire 1 EBNA 1 du virus d Epstein Barr EBV p72 dans le s rum ou le plasma Conditionnement 807017 x Irritant Usage pr vu Le test Anti EBV EBNA IgG ELISA est un test de diagnostic in vitro pour la d tection d anticorps IgG dirig s contre l antig ne EBNA 1 p72 de l EBV Les r sultats obtenus dans ce test associ s d autres donn es cliniques et d autres informations sur le patient obtenues dans des analyses d autres anticorps sp cifiques du virus d Epstein Barr comme es tests anti EA IgM IgG et anti VCA IgG IgM aident poser le diagnostic s rologique d une infection par EBV Une primo infection par EBV peut donner une mononucl ose infectieuse IM maladie de Pfeiffer 1 2 La maladie atteint le plus souvent les grands adolescents et les jeunes adultes La maladie aigu peut donner les sympt mes suivants i vre angine amygdalite lymphad nopathie malaise maux de t te myalgies spl no et h patom galie ruption cutan e et leucocytose 2 D autres agents pathog nes infectieux comme le cytom galovirus Toxoplasma gondii le virus de la rub ole les virus de l h patite le virus de l immunod ficience humaine HIV peuvent donner des sympt mes similaires Le test peut tre utilis pour diff rencier les tapes primaires et ardives d une infection par l EBV et il joue
7. double Un chantillon inconnu doit d abord tre test une dilution de 1 21 La sensibilit exig e pour d finir l tat immunitaire ne peut tre obtenue qu cette dilution Si la DO de chantillon d passe la DO d etalon il faut nouveau mesurer l chantillon une plus grande dilution par exemple pr dilution de 1 10 dilution finale de 1 210 On peut aussi r aliser le test d embl e une dilution de 1 210 Cette dilution permet de rendre compte de 85 d infections anciennes approximativement Si les valeurs sont inf rieures la valeur de seuil ou si la valeur de DO est sup rieure au contr le positif il faut tester nouveau l chantillon une dilution de 1 21 ou 1 2100 respectivement Pour que la quantification soit correcte les condiitons suivantes doivent tre respect es Valeur seuil lt DO de l chantillon lt DO du d etalon 1 21 La d termination quantitative se fonde sur un talonnage en deux points la courbe d talonnage tant d termin e entre la valeur seuil et la valeur moyenne d etalon STDx conform ment aux informations sp cifiques donn es pour le lot utilis Les valeurs entre les deux limites sont d termin es graphiquement ou math matiquement D termination graphique Les limites de la courbe d talonnage sont plac es dans un syst me de coordonn es L chelle de l axe des x s tend de la DO 0 000 2 500 et celle de l axe des y de 0 120
8. e tampon de lavage avec de l eau d min ralis e ou d sionis e 1 501 Le tampon ainsi pr par est stable pendant une semaine conserv 2 8 C Tous les autres composants du test sont pr ts l emploi Tous les r actifs sont sp cifiques d un lot ne pas les utiliser avec des trousses d autres lots Ne pas utiliser de r actifs d autres fabricants Pr paration des chantillons Utiliser des chantillons de s rum ou plasma frais sans h molyse Des chantillons de s rum ou de plasma forte lip mie ict riques ou contamination microbienne et des pr parations d immunoglobuline concentr es risquent de donner des r sultats de test non fiables Eviter de congeler et d congeler les chantillons plusieurs reprises Si les chantillons doivent tre transport s les emballer conform ment aux exigences r glementaires pour le transport de mati res infectieuses Ne pas inactiver les chantillons car il pourrait se produire des r actions non sp cifiques Performance du test Suivre strictement le protocole voir la proc dure de pipetage Dilution des chantillons au 1 21 avec pr dilution dans des tubes Diluer les contr les PC NC et les chantillons au 1 21 dans un tube par exemple 25 ul de contr le ou d chantillon 500 pl de Bien m langer Dilution des chantillons au 1 21 avec dilution directement dans la plaque Pipeter 200 ul de DIL dans chaque puits Cette dilution directement dans la micr
9. es en utilisant les tests Anti EBNA 1 1gG d autres fabricants La d finition des RU mI est bas e sur un s rum talon sp cifique Anti EBNA 1 IgG utilis par Bio Rad en interne pour standardiser l talon fourni avec la trousse de test Les r sultats Mi Bio Rad Medical Diagnostics GmbH Industriestr 1 D 63303 Dreieich Germany Tel 49 6103 801 95 Fax 49 6103 801 724 www bio rad com techsupport bmd bio rad com communiqu s doivent souligner ce point par l addition d une remarque par exemple unit s Anti EBNA 1 IgG de Bio Rad Cependant la constance des r sultats de cette m thode quantitative obtenus pour les divers lots de trousses de test est garantie par des tol rances de fabrication normales La valeur quantitative ne correspond pas au titre au point de virage de l chantillon En premi re approximation cependant la valeur quanti tative est proportionnelle au titre au point de virage Dans le cas d un ensemble de r sultats douteux de faibles valeurs quantitatives Anti EBNA 1 IgG lt 100 RU ml peuvent conforter le diagnostic de primo infection en particulier si les valeurs augmentent nettement dans les chantillons ult rieurs Par contre des valeurs lev es gt 100 RU ml sont plus en faveur d une infection apr s la phase aigu ou d une infection ancienne Pendant un traitement immunosuppresseur ou en relation avec une immunod ficience acquise SIDA les quantit s d IgG anti EBNA importantes l orig
10. i HCV HBsAg anti syphilis et les transaminases lev es Ne pas pipeter la bouche Conform ment aux bonnes pratiques de laboratoire porter des gants une blouse de laboratoire et des lunettes de s curit D contaminer les mati res liquides et non combustibles avec de l hypochlorite de sodium concentration finale 3 temps d action au moins 30 minutes Neutraliser obligatoirement les d chets liquides contenant des acides avant leur limination Autoclaver obligatoirement les M utilis es et les mati res r employer pendant 1 heure 121 C La est sensible la lumi re et doit tre mise l abri de celle ci Le test doit tre ex cut par des techniciens de laboratoire bien form s et agr s Ex cuter le test dans des conditions aseptiques et microbiologiquement contr l es En cas de trousse d origine d t rior e en informer le fabricant Stockage Les r actifs s ils sont stock s 2 8 C sont stables jusqu aux dates de p remption figurant sur chaque tiquette individuelle Apr s ouverture des r actifs ceux ci doivent Voir avertissement et pr cautions WB 550 550 550 550 STOP 15ml Solution d arr t pr te l emploi tape 3 puits pl Acide sulfurique lt 1 N HSO SB 1 Sachet de conservation sachet en poly thyl ne pour conserver les SUB 100 100 100 100 Incubation 30 1 mn la temp rature ambiante dans obscurit STOP 100 100 100 100 Mesurer l extinction im
11. ine peuvent diminuer fortement dans le temps parfois m me pour devenir inf rieures la limite de d tection En outre il a t observ qu une petite partie 1 2 des individus sains ayant eu une infection par EBV infection latente et tant positifs dans le test anti VCA IgG taient n gatifs dans le test anti EBNA IgG 14 Plus rarement lt 1 il existe des individus apparemment sains chez lesquels on n a jamais pu d tecter les anticorps EBNA sujets ne r pondant pas aux EBNA 1 Par cons quent il est en g n ral recommand d appliquer la s rologie anti EBV VCA IgG N cat Bio Rad 807 019 dans les cas o il faut d terminer l tat immunitaire vis vis de EBV Les distributions observ es pour les valeurs quantitatives de 1gG anti EBNA chez les individus sains N 100 dons de sang sont les suivantes en RU ml 38 5 1 100 RU ml 55 1 100 1000 RU ml et 6 4 1000 4000 RU ml Approximativement 94 des adultes sains ont des concentrations d anticorps entre 1 et 1000 RU mIl Cela peut tre consid r comme l intervalle normal Limitations de la m thode Un r sultat de test n gatif obtenu dans le test Anti EBV EBNA IgG ELISA n exclut pas totalement une infection par l EBV Les r sultats du test doivent tre utilis s conjointement avec les informations disponibles sur l valuation clinique du patient et les autres proc dures de diagnostic existantes Les r sultats des tests de patients im
12. ine V PC 1 2 ml Contr le EBV EBNA IgG positif pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V STD 1 2 ml Etalon EBV EBNA IgG pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V DIL 45 ml Diluant de l chantillon pr t l emploi conservateur 0 01 de sulfate de n omycine 0 03 de chloramph nicol CONJ 15 ml Conjugu d anti IgG humain anticorps monoclonal marqu par de la peroxydase pr t l emploi Conservateur 0 025 de p nicilline V 0 025 de sulfate de streptomycine 0 2 de Proclin 300 Tampon de lavage concentr 500 x conservateur 0 01 de 2 bromo 2 nitro 1 3 propanediol WB 6 ml SUB 13 ml Solution de substrat pr te l emploi Solution de 3 3 5 5 t tram thylbenzidine TMB lt 0 05 dans H20 tre utilis s dans les 30 jours En cas de r p tition de tests conserver les r actifs imm diatement apr s usage 2 8 C Enfermer la P dans un sachet d aluminium avec un d shydratant et la mettre la temp rature ambiante avant ouverture Remettre les barrettes inutilis es avec le d shydratant dans le sachet refermable et les conserver ainsi 2 8 C Ne pas toucher avec les doigts le bord sup rieur ni le fond des puits Pr paration des r actifs Diluer l
13. m diatement ou dans les 15 mn suivant l arr t 450 nm en utilisant un spectrophotom tre spectral longueur d onde de r f rence 615 690 nm Processeur 15 1 mn la temp rature ambiante dans l obscurit Proc dure de pipetage pour la d termination quantitative d IgG dilution en tube Laisser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante avant emploi Pipeter les contr les et le blanc en dernier Apr s pipetage des contr les et des chantillons mettre la plaque incuber imm diatement tape 1 puits ui A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 Blanc 200 DIL NC double test 200 PC STD double test 200 PC STD Echantillon 1 21 200 Recouvrir la MTP en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 30 1 mn 37 1 C Processeur 30 1 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 WB 550 550 550 550 CE 187702 12 04 2011 tape 2 puits ui CONJ 100 100 100 100 Recouvrir la MTP en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA ncubation 30 1 mn 37 1 C Processeur 30 1 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 WB 550 550 550 550 tape 3 puits ui SUB 100 100 100 100 ncubation 30 1 mn la temp rature ambiante dans obscurit
14. munod prim s peuvent tre difficiles interpr ter 1 Des r sultats de test positifs peuvent ne pas tre valides chez des personnes ayant re u des transfusions sanguines ou d autres produits sanguins au cours des derniers mois Le test Anti EBV EBNA IgG ELISA a t analys avec les chantillons suivants susceptibles de donner une r action crois e s rums anti virus de la varicelle positifs 50 s rums anti cytom galovirus positifs 16 et s rums anti Herpes simplex type 1 et 2 27 Aucun des chantillons n a t positif dans le test Anti EBV EBNA IgG ELISA Performance Les r sultats obtenus dans le test Anti EBV EBNA IgG associ s d autres tests tels que anti EA IgM IgG and anti VCA IgM IgG facilitent le diagnostic s rologique d une infection par l EBV 4 7 La sensibilit du syst me de test ELISA dans ces trois tests a t trouv e chez les patients IM gale 99 2 La sp cificit a t trouv e gale 98 8 5 Etude de la pr cision Un panel de 10 s rums repr sentant des chantillons peu r actifs et tr s r actifs a t test sur 10 jours diff rents La variabilit inter s ries pour ces s rums a t trouv gale 7 7 16 5 Les chantillons de ce m me panel ont t test s huit fois dans une s rie de tests La variabilit intra s ries pour ces s rums tait de 4 8 15 4 Valeurs attendues Quatre vingt dix neuf chantillons de s rums provenant de donneurs de
15. oplaque convient tout particuli rement bien en cas d utilisation de dispositifs de pipetage automatiques Si la dilution est effectu e directement dans la plaque manuellement il est important d viter la fixation non sp cifique de prot ines en observant les tapes suivantes Pipeter premi rement 200 pI de DIL dans le puits puis ajouter 10 ul d chantillon ou de t moins M langer de 5 7 fois quand on ajoute les 10 pl d chantillon ou de t moins Proc dure de lavage La proc dure de lavage constitue un point critique Un lavage insuffisant entra nerait une mauvaise pr cision et des r actions non sp cifiques L1 lavage manuel laver 5 fois avec la solution tampon aspirer le contenu du puits et ajouter 250 yl de solution tampon R p ter cette tape 5 fois L2 lavage automatique laver 3 fois avec 250 yul de solution tampon en utilisant le programme de lavage automatique Tapoter bri vement sur la plaque apr s lavage Ne pas laisser la plaque s cher Proc dure de pipetage pour la d termination qualitative d IgG dilution en tube Laisser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante avant emploi Pipeter les contr les et le blanc en dernier Apr s pipetage des contr les et des chantillons mettre la plaque incuber imm diatement tape 1 puits ui A1 B1 c1 D1 E1 F1 G1 Blanc 200 NC double test 200 NC
16. sang asymptomatiques sains ont t test s par le test EBNA IgG ELISA de Bio Rad Sur les 99 chantillons 92 ont t trouv s positifs 92 93 et 7 ont t trouv s n gatifs 7 07 Ces chiffres sont en accord avec les valeurs publi es pour la pr valence de l exposition l EBV dans la population adulte La pr valence peut varier selon divers facteurs comme la localisation g ographique l ge l tat socio conomique la race le type de test utilis les proc dures de pr l vement et de manipulation des chantillons les ant c dents cliniques et pid miologiques 6 7 Les s rums de patients ayant t atteints de maladies dues au CMV 20 au toxoplasme 20 et de maladies rhumato des 20 ont t analys s En utilisant le syst me EA IgM EA IgG et EBNA IgG ELISA 7 17 et 29 chantillons ont pu tre identifi s comme correspondant une primo infection une infection r activ e et une infection ancienne par l EBV 5 Litt rature 1 Linde A 1992 Rev Med Microbiol 3 43 51 2 Straus S Cohen J I Tosato G et Meier J 1993 Ann Int Med 118 45 58 3 DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical devices 4 Gorgievski Hrisoho M Hinderer W Nebel Schickel H Horn J Vornhagen R Sonneborn H H H Wolf H et Siegl G 1990 J Clin Microbiol 26 2305 2311 5 F rber I Wutzler P Wohlrabe P Wolf H Hinderer W et Sonneborn H H 199
17. un r le central dans le diagnostic de l EBV 96 tests coffret de tests complets Principe de la m thode Le test Anti EBV EBNA IgG ELISA est un test immunoenzymatique indirect avec antig ne adsorb ELISA tr s sensible pour la d tection d anticorps sp cifiques de l EBV dans le s rum ou le plasma Pendant la premi re tape d incubation les anticorps IgG de chantillon vont se lier l antig ne recombinant rec EBNA 1 p72 4 6 tapissant la MTP Les mati res non sp cifiques seront limin es par lavage Le complexe anticorps antig ne form est d tect en utilisant un anticorps monoclonal sp cifique marqu par une enzyme dirig contre l IgG humaine Le conjugu li de fa on non sp cifique est limin par une autre tape de lavage Pendant la derni re incubation la solution de substrat TMB 3 3 5 5 t tram thylbenzidine est introduite dans les puits La r action enzymatique est arr t e par addition d acide sulfurique la couleur passe du bleu au jaune et la densit optique est mesur e avec un spectrophotom tre 450 nm et avec une longueur d onde de r f rence de 615 690 nm La trousse contient Microplaque 12 barrettes s cables de 8 puits chacune tapiss s par rec EBV EBNA 1 p72 antigen concentration gt 0 05 ug ml MTP 1 NC 1 2 ml Contr le EBV EBNA IgG n gatif pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicill
18. yenne de STD 20 800 Calcul de la valeur seuil et de la zone grise La valeur seuil est calcul e partir de la DO moyenne des contr les n gatifs NC X laquelle on ajoute 0 200 Valeur seuil NC X 0 200 La zone grise s tend entre la valeur seuil et la valeur seuil moins 20 Interpr tation du r sultat Les chantillons ayant une valeur d extinction inf rieure la zone grise sont consid r s comme n gatifs Si un chantillon a une valeur d extinction gale ou sup rieure la zone grise il est consid r comme positif pour les anticorps IgG sp cifiques de l EBNA de EBV Si la valeur de DO de l chantillon retest est dans la zone grise r sultat douteux nous recommandons de demander un nouveau pr l vement Pour plus d informations sur es interpr tations du sch ma de r activit 6 un sch ma d interpr tation complet est disponible sur demande aupr s de Bio Rad Proc dure d analyse quantification Le kit comprend une solution standard conforme aux directives RiliB K de l ordre f d ral de m dicins allemands 8 pour la d termination quantitative Pour effectuer une d termination quantitative il faut que le r sultat du standard se situe dans l intervalle valide indiqu sur l tiquette Ce test est r alis comme d crit pour la m thode qualitative Les et sont oujours mesur s une dilution finale de 1 21 Les contr les doivent tre mesur s en
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