Anti-HIV TETRA ELISA
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1. Les m thodes compl mentaires pouvant tre utilis es incluent le transfert de western la d termination de p24 et les techniques des acides nucl iques NAT L influence des interf rences sur la r activit du test Anti HIV TETRA ELISA de Biotest a t tudi e On a ainsi test les cas de s rums ict riques h molytiques et lip miques en ajoutant de la bilirubine de l h moglobine et des triglyc rides dans plusieurs s ries de titrage Les niveaux de concentration suivants ont t tudi s Bilirubine 0 02 0 16 mg ml Triglyc rides 5 80 mg ml H moglobine 0 2 4 mg ml Dans le cas de la bilirubine et des triglyc rides aucune variation de DO n a t observ e dans l ensemble du domaine de concentration pour des chantillons de s rum aussi bien n gatifs que positifs pour des anticorps anti HIV Dans le cas de l h moglobine on n a observ d augmentation de l activit de base qu partir d une augmentation de la concentration of 2 mg ml dans le cas de s rums n gatifs pour les anticorps anti HIV Dans le cas d un s rum tr s h molytique par cons quent il faut prendre en compte la possibilit d un r sultat faux positif Les s rums h molytiques devront par cons quent tre test s en utilisant une seconde m thode ELISA ou un test de confirmation transfert de western NAT en cas d obtention nouveau de r sultats positifs Dans le cas d chantillons positifs pour les anticorps anti HIV aucune2. 180 gt 0 600 Calcul de la valeur seuil et de la zone grise La valeur seuil est calcul e partir de la DO moyenne des t moins n gatifs NCx laquelle on ajoute 0 250 Valeur seuil NCx 0 250 La zone grise s tend entre la valeur seuil et la valeur seuil moins 10 Interpr tation des r sultats Les chantillons ayant une valeur d absorption inf rieure la zone grise sont consid r s comme n gatifs Si un chantillon a une valeur d absorption gale ou sup rieure la valeur seuil il est consid r comme positif pour les anticorps sp cifiques du HIV Les chantillons ayant une DO dans la zone grise sont consid r s comme douteux Il est recommand de recommencer analyse de l chantillon dans un tel cas Proc dure de pipetage pour la d termination de la performance du test Laisser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante avant emploi Pipeter les contr les et le blanc en dernier Apr s pipetage des contr les et des chantillons mettre la plaque incuber imm diatement tape 1 puits ul A1 B1 C1 D1 Et G1 chantillon Blanc 50 double test 50 150 double test 50 150 Echantillon 50 150 Recouvrir la en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 60 2 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 550 550 550 550 tape 2 puits ui CONJ pas dans le bl
3. diff rence significative de la r activit du test en fonction de la concentration d h moglobine n a t observ e Litt rature 1 DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical devices 2 Promoting early HIV diagnosis et entry into care Valdiserri R O et coll AIDS 13 2317 2330 1999 Revue ditoriale 3 Evaluation of a new third generation HIV 1 2 Immunoassay Lang D et coll Clin Lab 45 1999 Guide de d pannage 1 Taux lev et inattendu de r sultats r actifs Des chantillons ou des contr les ont t pipet s avant le pipetage de ou bien le m lange a t insuffisant 2 Valeur moyenne du blanc sup rieure au crit re de validit DO 0 100 a devenue bleue par oxydation ou contamination b Erreur de lavage Effectuer l tape des 5 cycles de lavage Utiliser le de Biotest contenu dans la trousse c Erreur d incubation temp rature trop haute dur e d incubation d pass e ou plaque non incub e directement apr s la fin du pipetage d Erreur de longueur d onde une mesure sans filtre de r f rence augmentera les valeurs de DO d approximativement 0 120 Coloration jaune dans tous les puits voir 2a 2b a contamin pr parer un nouveau tampon de lavage b DIL ou contamin r p ter le test avec des r actifs provenant de flacons encore ferm s Utiliser les r actifs dans des conditions plus aseptiques 4 Valeur de DO moyenne de PC inf rieure lt 0 600
4. Anti HIV TETRA ELISA Test ELISA pour l analyse qualitative d anticorps anti HIV dans du s rum ou du plasma humain Conditionnement j 807 007 96 tests coffret de tests complets 807 008 480 tests coffret de tests complets Usage pr vu Le syndrome d immunod ficience acquise SIDA se caract rise par une issue fatale L agent pathog ne du SIDA a t identifi comme tant le virus de l immunod ficience humaine du type 1 HIV 1 et du type 2 HIV 2 2 Le HIV se transmet par contact sexuel entre des personnes infect es par le HIV par des produits sanguins contamin s par le HIV par des instruments m dicaux par exemple des aiguilles pour injections mal d sinfect s et par transmission de la m re l enfant Le test ELISA titrage immuno enzymatique utilisant un antig ne adsorb est un test maintenant bien tabli pour la d tection des anticorps anti HIV dans le s rum ou le plasma humain Cependant un test ELISA n assure pas 100 de s curit dans le diagnostic du HIV Par cons quent un test ELISA positif pour un anticorps doit tre confirm en utilisant une autre m thode plus sp cifique transfert du type western PCR Un r sultat ELISA n gatif n exclut pas totalement par ailleurs la possibilit de la pr sence de HIV 1 2 Principe du test analyse de troisi me g n ration Anti HIV TETRA ELISA de Biotest est un dosage immunoenzymatique du type sandwich tr s sensible de troisi me g n ration pour l
5. Pipeter 150 ul de dans chacun des puits D1 et E1 Pipeter les chantillons dans les puits partir de F1 Finalement bien m langer La dilution directe dans la microplaque est particuli rement appropri e en cas d utilisation d un syst me de manipulation des liquides automatis Si la dilution directe est ex cut e manuellement prendre les pr cautions suivantes pour viter une fixation non sp cifique de prot ines a premi rement distribuer les 50 ul de dans les puits puis ajouter les 150 uL d chantillon ou de contr le et b pendant l addition des 150 ul de l chantillon ou du contr le m langer trois fois avec le DIL Proc dure de lavage La proc dure de lavage constitue un point critique Un lavage insuffisant entra nerait une mauvaise pr cision et des r actions non sp cifiques W1 laver 5 fois avec le tampon de lavage Pour cela liminer le liquide du puits et distribuer 300 ul de tampon de lavage Remplir le puits avec au moins 250 ul de tampon de lavage volume total 550 R p ter cette proc dure de lavage 5 fois Tapoter bri vement sur la plaque apr s lavage Ne pas laisser la plaque s cher Evaluation Soustraire le blanc de toutes les valeurs des contr les et des chantillons L absorption du blanc doit tre inf rieure une DO de 0 100 Les valeurs des contr les doivent satisfaire les crit res suivants DO moyenne des contr les n gatifs DO moyenne des contr les positifs lt 0
6. a Date de p remption d pass e b Temp rature trop basse ou dur e d incubation trop faible c Erreur de lavage lavage trop intensif ou contact m canique entre le distributeur et la phase solide du puits d Contamination de PC ou 3b 5 Valeur de DO moyenne de sup rieure gt 1 80 voir 1 et 2 a d a n a pas t pipet apr s le pipetage des chantillons pipeter tous les chantillons avant de pipeter les blancs et les contr les b Contamination par le couvercle du M Biotest Industriestr 1 D 63303 Dreieich C Germany www biotest de mail biotest de Tel 49 6103 801 0 Fax 49 6103 801 140 0197 Biotest
7. anc 100 100 100 Recouvrir la en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 60 2 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 550 550 550 550 tape 3 puits pl SUB 100 100 100 100 Incubation 30 2 mn la temp rature ambiante dans l obscurit STOP 100 100 100 100 Mesurer l extinction imm diatement ou dans les 15 mn suivant l arr t 450 nm en utilisant un spectrophotom tre spectral longueur d onde de r f rence 615 690 nm En cas d utilisation de processeurs ELISA l op rateur doit valider le test sous sa propre responsabilit Donn es de performance Sensibilit Les r sultats suivants ont t obtenus pour la sensibilit du test Anti HIV TETRA ELISA de Biotest tous les s rums des 460 chantillons HIV 1 positifs et des 200 chantillons HIV 2 positifs ont t trouv s positifs La sensibilit du test Anti HIV TETRA ELISA de Biotest d termin e en testant 21 panels de s roconversion est en bonne corr lation avec les tests comparatifs Anti HIV Pour l analyse de la capacit de d tection d anticorps dirig s contre diff rents sous types de HIV les s rums suivants ont t test s sous type A 6 B 9 C 5 D 4 E 3 F 3 E F 3 O 10 Tous ces s rums ont donn un r sultat positif La sensibilit tait de 100 Sp cificit La sp cificit du test Anti HIV TETRA ELISA de Biotest a t
8. appliqu aux 151 chantillons suivants risquant de donner des r actions crois es positifs pour l anti facteur rhumato de 13 positifs pour l anticorps antinucl aire ANA 8 positifs pour l anti virus de l h patite A 17 positifs pour l anti virus de l h patite B 22 positifs pour l anti virus de l h patite C 15 positifs pour l anti HTLV I II 10 positifs pour l anti virus d Epstein Barr 37 positifs pour l anti virus de la varicelle 11 positifs pour l anti E coli 18 Aucune r activit crois e n a pu tre d tect e pour l Anti HIV TETRA ELISA de Biotest En outre des chantillons contenant p24 isol 23 obtenus partir de donneurs de sang sains sans aucune corr lation avec le HIV ont t test s Ces s rums donnaient des bandes hors de la r gion GAG p24 p40 p50 d apr s l analyse par transfert de western L acide nucl aire sp cifique du HIV n a pas pu tre d tect dans ces s rums Seuls 3 sur les 23 chantillons p24 isol ont t trouv positifs 13 avec l Anti HIV TETRA ELISA de Biotest En cas de r sultat positif dans le test Anti HIV TETRA ELISA de Biotest l identification de l chantillon concern comme tant un p24 isol peut tre r alis e par un transfert de western Limitations de la m thode Un r sultat n gatif dans le test Anti HIV TETRA ELISA de Biotest n exclut pas avec une certitude absolue la possibilit d une infection par le HIV
9. e p nicilline V 3ml 3m Contr le positif pour HIV pr t l emploi Echantillon polyclonal de lapin Anti HIV positif conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V CONJ 0 5ml 3 x 0 5ml Concentr de conjugu concentr 50 x gp41 p24 rec de l antig ne de HIV et peptides gp41 et gp36 de HIV marqu s par la peroxydase conservateur 0 2 de Procline 300 0 01 de gentamicine Dit 1x 8ml 1 x 32ml Diluant de l chantillon pr t l emploi conservateur 0 2 de Procline 300 200U ml de p nicilline V et streptomycine CONJDIL 1 x 15ml 2 x 30mI Diluant du conjugu pr t l emploi conservateur 0 2 de Procline 300 0 01 de gentamicine el x 50ml 3 x 50mI Tampon de lavage concentr 25 x conservateur 0 1 de Kathon Tween lt 3 E x 16ml 4 x 16mli Solution de substrat pr te l emploi W Solution de 3 3 5 5 t tram thylbenzidine TMB lt 0 05 dans H20 Voir avertissement et pr cautions ET x 30mI 2 x 30mI Solution d arr t pr te l emploi Acide sulfurique lt 1 N H2SO4 DES Sachet de conservation sachet en poly thyl ne pour conserver les barrettes de microplaques inutilis es Feuilles transparentes auto adh sives pi ini Feuilles transparentes auto adh sives pour recouvrir les puits des microplaques pendant l incubation Conservateurs concentration totale lt 0 8 Mat riaux n cessaires mais non fournis avec
10. e diagnostic in vitro ol Les anticorps r agissent avec les antig nes de la MTP qui est tapiss e par trois prot ines recombinantes rec et un peptide de virus HIV 3 Si des anticorps HIV 1 2 sont pr sents dans l chantillon tester ils se lieront la MTP Toute mati re li e de fa on non sp cifique est limin e par une proc dure de lavage puis le conjugu d antig nes est ajout Le conjugu est un m lange de 2 prot ines recombinantes et de 2 peptides des r gions GAG ENV de HIV 1 et HIV 2 marqu s directement par de la peroxydase de raifort Le conjugu d enzyme non li est limin dans une autre tape de lavage La pr sence de complexes anticorps antig ne li s est d montr e en utilisant une r action enzymatique qui donne un produit color avec la TMB 3 35 5 t tram thylbenzidine comme substrat On arr te la r action enzymatique en utilisant de l acide sulfurique et on lit la densit optique DO 450 nm dans un photom tre spectral contre une longueur d onde de r f rence de 615 690 nm Contenu des trousses de 96x et 480x test BE EE EE 1 5 Microplaque 12 barrettes s cables de 8 puits chacune tapiss s des gp41 gp36 et p24 rec de l antig ne HIV avec un peptide de HIV gp41 concentration gt 0 5 ug ml 8 8ml 3 8m Contr le n gatif pour HIV pr t l emploi Echantillon de lapin Anti HIV n gatif conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 d
11. giquement contr l es Si le coffret d origine est endommag en informer le fabricant Stockage Les r actifs s ils sont stock s 2 8 C sont stables jusqu aux dates de p remption figurant sur chaque tiquette individuelle Apr s ouverture des r actifs ceux ci doivent tre utilis s dans les 30 jours En cas de r p tition de tests conserver les r actifs imm diatement apr s usage 2 8 C Enfermer la dans un sachet d aluminium avec un d shydratant et la mettre la temp rature ambiante avant ouverture Remettre les barrettes inutilis es avec le d shydratant dans le sachet refermable et les conserver ainsi 2 8 C Ne pas toucher avec les doigts le bord sup rieur ni le fond des puits Pr paration des r actifs Diluer le concentr de tampon de lavage avec de l eau d min ralis e ou d sionis e par exemple diluer 40 ml 1 litre Le tampon ainsi pr par est stable pendant une semaine conserv 18 25 C En cas de cristallisation apr s stockage 2 8 C remettre le concentr de tampon de lavage en solution en le chauffant 37 C Bien m langer le tampon avant de le diluer Diluer le conjugu concentr au 1 50 dans des conditions aseptiques par exemple 100 ul de conjugu 4 9 ml de diluant du conjugu Bien secouer le concentr avant dilution en mouillant bien toutes les parois int rieures du flacon pour r cup rer toute condensation Le conjugu pr par apr s dilution pe
12. la trousse micropipettes photom tre spectral 450 nm longueur d onde de r f rence 615 690 nm laveur de microplaques d usage courant lavage de fond 187694 07 03 2008 incubateur 37 C pour les ELISA En cas d utilisation de processeurs ELISA l op rateur doit valider le test sous sa propre responsabilit Avertissement et pr cautions Ne pas incorporer de r actifs Eviter le contact avec les yeux et la peau Traiter les chantillons les contr les et les mati res utilis es pour le test comme des produits potentiellement infectieux et prendre les mesures de s curit appropri es Les contr les sont n gatifs pour anti HIV 1 2 anti HCV HBsAg anti syphilis et les transaminases lev es Ne pas pipeter la bouche Conform ment aux bonnes pratiques de laboratoire porter des gants une blouse de laboratoire et des lunettes de s curit D contaminer les mati res liquides et non combustibles avec de l hypochlorite de sodium concentration finale 3 temps d action au moins 30 minutes Neutraliser obligatoirement les d chets liquides contenant des acides avant leur limination Autoclaver obligatoirement les utilis es et toutes les mati res r employer pendant 1 heure 121 C La est sensible la lumi re et doit tre mise l abri de celle ci Le test doit tre ex cut par des techniciens de laboratoire bien form s et agr s Ex cuter le test dans des conditions aseptiques et microbiolo
13. tudi e par un laboratoire ind pendant Sur 4133 chantillons de s rum provenant de donneurs de sang sains 7 chantillons ont t trouv s r actifs La sp cificit est de 99 83 Echantillons s rum plasma Les chantillons de s rum et de plasma citrate EDTA de 165 donneurs de sang n gatifs pour le HIV ont t test s en parall le par le test Anti HIV TETRA ELISA de Biotest Aucune diff rence significative n a t observ e entre les valeurs de DO mesur es sur l chantillon de s rum et de plasma correspondant En outre un s rum humain positif pour un anticorps anti HIV a t additionn 45 chantillons de s rum plasma Les valeurs d absorption des paires d chantillons n ont pas pr sent de diff rences significatives Pr cision Dans une tude la variabilit intra s ries du test Anti HIV TETRA ELISA de Biotest a t tudi e en pipetant des chantillons r actifs dans 45 cavit s d une microplaque Le coefficient de variation suivant CV a t d termin Echantillon CV Tr s r actif 3 9 Mod r ment r actif 10 1 La variabilit inter s ries a t mesur e en testant 2 chantillons dans les plages des DO moyennes et lev es 16 fois pendant 3 jours ind pendamment l un de l autre Le coefficient de variation suivant CV a t d termin Echantillon CV Tr s r actif 8 7 Mod r ment r actif 10 4 R activit crois e Le test Anti HIV TETRA ELISA de Biotest a t
14. ut se conserver pendant 4 semaines 2 8 C dans un r cipient ferm l abri de la lumi re Tous les autres composants de la trousse de test sont pr ts l emploi Tous les r actifs sont sp cifiques d un lot ne pas les utiliser avec des trousses d autres lots Ne pas utiliser de r actifs d autres fabricants Pr paration des chantillons Utiliser des chantillons de s rum ou plasma frais sans h molyse Des chantillons de s rum ou de plasma forte lip mie ict riques ou contamination microbienne et des pr parations d immunoglobuline concentr es risquent de donner des r sultats de test non fiables Eviter de congeler et d congeler les chantillons plusieurs reprises Si les chantillons doivent tre transport s les emballer conform ment aux exigences r glementaires pour le transport de mati res infectieuses Ne pas inactiver les chantillons car il pourrait se produire des r actions non sp cifiques Performance du test Suivre strictement le protocole voir la proc dure de pipetage Laisser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante 18 25 C avant utilisation Diluer tous les contr les et chantillons dans le rapport 3 4 dans la microplaque en utilisant le diluant de l chantillon Distribuer 50ul de dans chaque puits Le blanc dans A 1 est utilis comme contr le de substrat et n est donc rempli que par 50 ul de DIL Pipeter 150 lil de dans chacun des puits B1 C1
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