Home

Melle Laila SBABOU Melle Laila SBABOU

1. variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 83 ISSR FL3 151 pb 0 861 0 522 124 ISSR FL6 310 pb 0 454 1 293 84 ISSR FL3 139 pb 0 454 1 293 125 ISSR FL6 272 pb 1 260 0 073 85 ISSR FL4 926 pb 1 260 0 073 126 ISSR FL6 253 pb 0 055 0 081 86 ISSR FL4 621 pb 0 230 0 021 127 ISSR FL6 235 pb 0 454 1 293 87 ISSR FL4 457 pb 0 140 1 186 128 ISSR FL6 219 pb 0 040 0 417 88 ISSR FL4 397 pb 0 140 1 186 129 ISSR FL6 200 pb 0 454 1 293 89 ISSR FL4 363 pb 0 046 1 326 130 ISSR FL6 175 pb 1 260 0 073 90 ISSR FL4 310 pb 0 140 1 186 131 ISSR FL6 161 pb 0 102 0 007 91 ISSR FL4 296 pb 1 260 0 073 132 ISSR FL6 148 pb 0 002 0 502 92 ISSR FL4 262 pb 0 230 0 021 133 ISSR FL6 134 pb 0 454 1 293 93 ISSR FL4 236 pb 0 454 1 293 134 ISSR FL6 124 pb 0 040 0 417 94 ISSR FL4 202 pb 1 260 0 073 135 ISSR FL7 767 pb 1 260 0 073 95 ISSR FL4 183 pb 0 454 1 293 136 ISSR FL7 767 pb 1 260 0 073 96 ISSR FL4 157 pb 0 046 1 326 137 ISSR FL7 573 pb 0 861 0 522 97 ISSR FL4 131 pb 1 260 0 073 138 ISSR FL7 435 pb 0 102 0 007 98 ISSR FL5 783 pb 0 140 1 186 139 ISSR FL7 372 pb 0 454 1 293 99 ISSR FL5 700 pb 0 102 0 007 140 ISSR FL7 340 pb 0 002 0 502 100 ISSR FL5 638 pb 0 040 0 417 141 ISSR FL7 319 pb 0 167 0 025 101 ISSR FL5 614 pb 0 140 1 186 142 ISSR FL7 304 pb 0 323 0 009 102 ISSR FL5 5
2. Contributions Contributions des des variables variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 173 ISSR FL4 323 pb 0 190 0 643 216 ISSR FL7 867 pb 0 245 0 235 174 ISSR FL4 303 pb 0 335 0 021 217 ISSR FL7 675 pb 0 145 0 060 175 ISSR FL4 280 pb 0 318 0 252 218 ISSR FL7 568 pb 0 252 0 220 176 ISSR FL4 266 pb 0 061 0 002 219 ISSR FL7 509 pb 0 170 0 010 177 ISSR FL4 251 pb 0 023 0 104 220 ISSR FL7 489 pb 0 318 0 252 178 ISSR FL4 219 pb 0 000 0 332 221 ISSR FL7 467 pb 0 484 0 020 179 ISSR FL4 205 pb 0 158 0 066 222 ISSR FL7 449 pb 1 580 0 008 180 ISSR FL4 187 pb 0 123 0 901 223 ISSR FL7 378 pb 0 252 0 220 181 ISSR FL4 160 pb 0 134 0 015 224 ISSR FL7 364 pb 0 050 0 025 182 ISSR FL4 148 pb 0 861 0 012 225 ISSR FL7 350 pb 0 190 0 643 183 ISSR FL4 132 pb 0 318 0 252 226 ISSR FL7 320 pb 0 252 0 220 184 ISSR FL4 119 pb 0 090 0 206 227 ISSR FL7 262 pb 0 608 0 000 185 ISSR FL4 112 pb 0 245 0 235 228 ISSR FL7 255 pb 0 022 0 215 186 ISSR FL5 746 pb 1 795 0 225 229 ISSR FL7 220 pb 0 038 0 470 187 ISSR FL5 346 pb 0 338 0 145 230 ISSR FL7 193 pb 0 023 1 357 188 ISSR FL5 333 pb 0 861 0 012 231 ISSR FL7 193 pb 0 309 0 262 189 ISSR FL5 316 pb 0 318 0 252 232 ISSR FL7 134 pb 1 306 0 022 190 ISSR FL5 259 pb 0 170 0 007 233 ISSR FL7 129 pb 0 109 0 220 191 ISSR FL5 245 pb 0 557 0 433 234 ISSR FL8 1443 pb 0 532 0 052 192 ISSR F
3. G ne Num ro Description d accession 90_F CA410642 Tubby E491_F CA411197 14 3 3 protein 285_F CA410024 pfam_AP2_AP2 domain E080_F CA410807 Sigma 54 factor interaction region 880_F CA410612 RNA binding region RNP 1 RNA recognition motif YPR_005_FI11_092 abl ND Homeobox YPR_008_A08_054 abl ND YPR_003_A05_033 abl ND YPR_005_E05_036 ab ND Methyl CpG binding YPR_008_A08_054 ab1 ND YPR_003_A05_033 ab1 ND YPR_002_D11_090 ab1 ND UniRef100_Q2QWI0 RNA polymerase Rpb3 Rpb11 dim E598_F CA411302 GmTC219208_ weakly similar to UPIQ948K9 Q948K9 CmE8 protein partial 87 E771_F CA411470 Histone H1 H5 888_F CA410619 YPR_O11_E05_036 ab1 ND DEAD DEAH box helicase N terminal YPR_013_H02_016 ab1 ND YPR_001_G11_084 ab1 ND Pas de similarit E080_F CA410807 Sigma 54 factor interaction region E647_F CA411349 HMG1 2 high mobility group box 889_F CA410620 Myb DNA binding 783_F CA410518 YPR_009_CO1_002 ab1_ ND YPR_008_C12_087 ab1__ ND Basic leucine zipper YPR_008_A04_022 abl1 ND YPR_005_F11_092 ab1 ND Homeobox YPR_009_G07_052 ab1 ND Sigma 54 factor interaction region YPR_010_H08_073 ab1 ND 625 F CA410353 Pathogenesis related transcriptional factor and ERF YPR_002_D11_090 ab ND UniRef100_Q2QWI0 RNA polymerase Rpb3 Rpb11 dim 365 F CA410107 Pathogenesis related transcriptional factor and ERF 931 F CA410651 pfam_SRP19_SRP19 protein 93_F CA410673 UniRef100_Q9
4. Amorce Marqueurs Taille des bandes Marqueurs PIC g n r s obtenues polymorphes Fl 30 151 24pb 1000pb 28 0 94 F2 36 137 65pb 2234pb 35 0 96 F3 25 1276pb 195 45pb 24 0 94 F4 26 2928pb 196 60pb 25 0 89 FL1 32 807 72pb 113 70pb 32 0 95 FL2 17 414 16pb 96 10pb 17 0 91 FL3 34 1063pb 129 32pb 34 0 96 FL4 27 801 13pb 112 34pb 27 0 95 FL5 7 745 93pb 206 83pb 6 0 76 FL6 22 908pb 153 43pb 20 0 94 FL7 19 1230pb 128 60 19 0 91 FL8 26 1443pb 198 72pb 26 0 94 FL10 43 1752pb 148 89pb 43 0 97 FLI1 30 1645pb 122 63pb 30 0 95 FL12 28 1333pb 149 94pb 27 0 94 Total 402 96 10pb 2928pb 393 97 7 0 927 0 0509 Tableau IL 13 Liste des marqueurs ISSR sp cifiques g n r s dans l analyse de la diversit intra sp cifique de L albus Accession Marqueurs ISSR sp cifiques Alb01 F2 188 50pb F2 255 40pb F2 1109pb FL4 132 15pb FL4 280 06pb FL5 315 90pb FL10 1439pb FL10 917pb Alb06 F1 167 31pb FL10 1362pb FL10 1326pb Alb04 F1 841 45pb F2 1276pb FL3 846 06pb FL4 112 34pb FL7 866 64pb FL8 261 99pb Alb03 F1 209 43pb F4 584 32pb FL3 550 44pb FL3 776 31pb FL7 568 35pb FL7 377 71pb FL7 320 30pb FL11 909pb Alb10 FL1 164 33pb FL1 229 23pb FL1 247 90pb FL1 572 91pb FL3 129 32pb FL4 801 13pb FL8 755 15pb FL8 486 11pb Alb07 F1 151 24pb F1 400 59pb F2 322 36pb F4 495 50pb FL4 302 73pb FL11 146 80pb Alb0
5. Contributions Contributions des des variables variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 247 ISSR FL2 780 pb 0 575 0 234 288 ISSR FL3 586 pb 0 322 2 351 248 ISSR FL2 727 pb 0 283 0 539 289 ISSR FL3 568 pb 0 511 0 194 249 ISSR FL2 676 pb 0 892 0 938 290 ISSR FL3 552 pb 2 069 1 170 250 ISSR FL2 628 pb 1 369 0 499 291 ISSR FL3 535 pb 0 575 0 234 251 ISSR FL2 588 pb 1 369 0 499 292 ISSR FL3 510 pb 0 511 0 194 252 ISSR FL2 544 pb 0 263 1 006 293 ISSR FL3 491 pb 0 393 0 491 253 ISSR FL2 521 pb 1 577 2 577 294 ISSR FL3 467 pb 0 083 1 173 254 ISSR FL2 490 pb 0 083 1 173 295 ISSR FL3 450 pb 0 621 0 897 255 ISSR FL2 459 pb 1 641 2 149 296 ISSR FL3 431 pb 1 369 0 499 256 ISSR FL2 442 pb 0 237 1 202 297 ISSR FL3 412 pb 0 237 1 202 257 ISSR FL2 415 pb 0 712 0 016 298 ISSR FL3 387 pb 0 263 1 006 258 ISSR FL2 377 pb 0 034 1 243 299 ISSR FL3 366 pb 1 185 1 658 259 ISSR FL2 367 pb 1 005 1 491 300 ISSR FL3 342 pb 1 369 0 499 260 ISSR FL2 354 pb 0 083 1 173 301 ISSR FL3 330 pb 1 369 0 499 261 ISSR FL2 338 pb 0 755 1 156 302 ISSR FL3 326 pb 1 369 0 499 262 ISSR FL2 314 pb 0 712 0 016 303 ISSR FL3 314 pb 0 237 1 202 263 ISSR FL2 298 pb 0 263 1 006 304 ISSR FL3 294 pb 1 369 0 499 264 ISSR FL2 284 pb 0 237 1 202 305 ISSR FL3 280 pb 1 369
6. Contributions Contributions des variables des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 420 E ACT M CAT 577 pb 0 196 0 489 465 E ACT M CAT 157 pb 0 236 0 383 421 E ACT M CAT 562 pb 0 016 0 606 466 E ACT M CAT 151 pb 0 002 0 238 422 E ACT M CAT 530 pb 0 002 0 238 467 E ACT M CAT 138 pb 0 135 0 018 423 E ACT M CAT 514 pb 0 040 0 003 468 E AGG M CTC 2709 pb 0 007 0 166 424 E ACT M CAT 497 pb 0 594 0 006 469 E AGG M CTC 2343 pb 0 235 0 237 425 E ACT M CAT 488 pb 0 236 0 383 470 E AGG M CTC 2157 pb 0 016 0 606 426 E ACT M CAT 471 pb 0 007 0 166 471 E AGG M CTC 1827 pb 0 661 0 000 427 E ACT M CAT 460 pb 0 594 0 006 472 E AGG M CTC 1614 pb 0 041 0 025 428 E ACT M CAT 448 pb 0 040 0 003 473 E AGG M CTC 1455 pb 0 060 0 006 429 E ACT M CAT 433 pb 0 196 0 489 474 E AGG M CTC 1251 pb 0 594 0 006 430 E ACT M CAT 425 pb 0 041 0 025 475 E AGG M CTC 1095 pb 0 661 0 000 431 E ACT M CAT 409 pb 0 196 0 489 476 E AGG M CTC 1000 pb 0 135 0 018 432 E ACT M CAT 401 pb 0 016 0 606 477 E AGG M CTC 922 pb 0 016 0 606 433 E ACT M CAT 395 pb 0 016 0 606 478 E AGG M CTC 863 pb 0 661 0 000 434 E ACT M CAT 382 pb 0 661 0 000 479 E AGG M CTC 813 pb 0 594 0 006 435 E ACT M CAT 372 pb 0 016 0 606 480 E AGG M CTC 755 pb 0 594 0 006 436 E ACT M CAT 370 pb 0 040 0 003 481 E AGG M CTC 716 pb 0 025 0 018 437 E ACT M CAT 361 pb 0 007 0 487 482 E AGG M CTC 675 pb 0
7. 154 3 1 3 1 b Pr paration et transformation des plantes par trempage racinaire 154 3 1 3 1 c Localisation de l expression du promoteur LaSCR2 155 3 1 3 2 Activit du pLaSCR2 GUS au niveau des racines transg nique de Me di ag tr n atula Lans rend ae sn ne Ras aS 158 3 1 3 2a Pr paration et transformation des plantes par trempage 158 3 1 3 2b Localisation de l expression pLaSCR2 GUS 158 3 2 L hybridation in situ du LaSCR1 chez le Lupin blane 160 3 2 1 Traitement des tissues iii aA TEE a aG 160 3 2 2 Utilisation de sondes froides digoxigenine 160 Seo HYyDIdAtON SES R ann Ana ee te RAS ee dian Re ee ne Aa 161 3 2 4 R sultats Hdmi essences ondes retenue eat ana ttes 161 3 3 Conclusion did nrn n rnrn arrn arrra nnna arrra eue eee 163 Partie 4 Analyse de la fonction du g ne SCR 4 1 ARN dinterf rence ARNi Silen age duSCR 163 4 1 1 Pr paration du vecteur LaSCR1i ARNi uo eee eee eee cece neta tees ee eaeaeaes 163 4 1 1 a Choix de la s quence du g ne utiliser 1 2 0c cece cece cece eee eee teeta en eeneeee 163 4 1 1 b Clonage du fragment LaSCRI dans le vecteur Sphellsgate c cccceeeeees 164 4 2 Silen age du g ne La
8. Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 493 ISSR FL10 548 pb 0 263 1 006 516 ISSR FL11 598 pb 0 486 0 240 494 ISSR FL10 507 pb 0 334 2 866 517 ISSR FL11 570 pb 0 146 0 321 495 ISSR FL10 481 pb 2 154 2 383 518 ISSR FL11 545 pb 1 880 1 375 496 ISSR FL10 446 pb 0 511 0 194 519 ISSR FL11 501 pb 0 237 1 202 497 ISSR FL10 422 pb 0 235 1 453 520 ISSR FL11 467 pb 0 322 2 351 498 ISSR FL10 404 pb 1 880 1 375 521 ISSR FL11 426 pb 3 669 1 563 499 ISSR FL10 386 pb 1 098 0 540 522 ISSR FL11 382 pb 0 755 1 156 500 ISSR FL10 373 pb 0 963 0 922 523 ISSR FL11 372 pb 1 618 0 463 501 ISSR FL10 356 pb 0 083 1 173 524 ISSR FL11 360 pb 0 799 0 914 502 ISSR FL10 352 pb 0 240 0 235 525 ISSR FL11 342 pb 1 251 0 186 503 ISSR FL10 341 pb 1 821 1 226 526 ISSR FL11 327 pb 1 705 1 361 504 ISSR FL10 318 pb 0 263 1 006 527 ISSR FL11 313 pb 0 755 1 156 505 ISSR FL10 304 pb 1 232 0 281 528 ISSR FL11 295 pb 0 799 0 914 506 ISSR FL10 293 pb 1 369 0 499 529 ISSR FL11 281 pb 3 669 1 563 507 ISSR FL10 272 pb 1 729 1 251 530 ISSR FL11 263 pb 1 232 0 281 508 ISSR FL10 260 pb 1 618 0 463 531 ISSR FL11 258 pb 3 583 1 990 509 ISSR FL10 238 pb 0 334 2 866 532 ISSR FL11 248 pb 0 237 1 202 510 ISSR FL10 227 pb 3 149 1 860 533 ISSR FL11 230 pb 1 232 0 281 511 ISSR FL10 217 pb 0 334 2 866 534 ISSR FL11 222 pb 0 322 2 351 512 ISSR FL10 208 pb 0 621 0 897 535 ISSR FL11
9. EDTA 0 5 M SDS 20 Ce tampon doit tre chauff 42 C avant utilisation 227 Annexes Annexe ITI 5 Milieu Fahraeus modifi La solution nutritive est pr par e avec les l ments suivants Solution nutritive sans azote Concentration finale Macro l ments MgSO4 7H20 0 5 mM CaCl 0 9 mM KH PO4 3H 0 0 7 mM Na HPO 0 8 mM Citrate de fer 20 uM NH NO3 Micro l ments MnCl 100 pg ml CuSO 100 ug ml ZnCb 100 pg ml NaMoO 100 ug ml Agar 100 pg ml Ajuster le pH de la solution a 7 5 Autoclaver la solution Laisser refroidir jusqu une temp rature de 55 60 C Ajouter la kanamycine raison de 27 5 ug l Couler le milieu dans des boites st riles Les boites peuvent tre conserv es 4 C pendant une dur e maximale de 3 jours 228 Annexes Annexe IIL 6 Cartes des vecteurs de clonage utilis s wae 154 i Ssp 445 Sspi 2850 SP 122 Xmn 2645 Nae 333 Sca 2526 x Pvu 503 Pvu 2416 Pvu Il 532 NY pBluescript SK phagemid vector 2958 bp Pvu 977 Aff ll 1153 TOPO ccc TT GGG AAG TGG Not Asc 229 Annexes Annexe IIL 6 suite Cartes des vecteurs de clonage utilis s Spe 1 1 7440 Niel 1 7432 Apat 17322 OCS terminator P27 3 PRIMER Abal 16699 attR1 Sma 1 3 S959 Amal OS957F _ eed Bi attR2 Nina T 15280 SpHG8 Red Bamra 1 18274 5 irxi
10. Groupes Accessions marqueurs Diversit Marqueurs sp cifiques Cos15 Cos16 F4 203 16pb FL1 473 97pb FL2 397 32pb FL5 218 77pb FL5 181 68pb L cGI 1 Cos17 Cos18 451 0 0037001 FL5 141 29pb FL5 183 26pb FL5 116 26pb FL6 723 33pb FL7 438 67pb FL7 436 38pb FL8 709 85pb FL9 890 60pb F1 329 49pb F1 192 00pb FL1 1482pb FL1 1325pb FL1 1123pb FL1 1067pb Cos19 Cos20 FL1 1060pb FL1 851 80pb FL1 804 60pb FL1 584 66pb FL1 374 88pb L c GI 2 Cos21 Cos22 705 0 0037034 FL3 1773pb FL3 1332pb FL3 125 37pb FL5 561 31pb FL5 309 61pb Cos23 FL5 343 22pb FL5 322 63pb FL5 475 48pb FL5 800 32pb FL7 1357pb FL7 108 33pb FL9 670 38pb FL11 153 84pb F1 975pb F2 236 67pb F2 196 15pb F2 120 52pb F2 384 12pb F2 395 35pb Cos07 Cos08 F3 164 83pb F4 2164pb F4 1727pb F4 1477pb F4 1264pb FL4 639 53pb L c GII 1 Cos09 Cos10 724 0 0037035 FL4 560 57pb FL4 436 92pb FL6 896 37pb FL6 812 31pb FL4 380 25pb Cos11 Cos12 FL7 1826pb FL7 1181pb FL7 994pb FL7 827 16pb FL7 387 29pb FL7 273 48pb FL8 144 11pb FL9 477 93pb FL9 100 17pb FL10 1057pb FL10 932pb L c GII 2 Cos13 Cos14 226 0 00369 F1 138 46pb F4 1354pb FL8 941pb FL10 1183pb Cos01 Cos02 F1 543 62pb F1 172 44pb F2 146 45pb F3 1111pb F4 179 20pb F4 174 46pb L c GII 3 Cos03 Cos04 782 0 0037033 PE1 6833pb FL1 565 82pb FL2 111 14pb FL6 630 83pb FL4 361 21pb Cos05 Cos06 FL7 465 85pb FL9
11. 116 CHAPITRE III Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc INTRODUCTION Au cours ce cette tude nous nous sommes int ress s aux facteurs de transcription FT du Lupinus albus Une analyse de l expression de 161 FT chez le lupin blanc en r ponse diff rents stress abiotiques a t r alis e moyennant des filtres ADNc ou macroarrays Ensuite nous nous sommes int ress s a un FT particulier le Scarecrow SCR Le g ne SCR isol chez le lupin blanc a t analys en d tail avec l isolement de ses deux copies LaSCRI et LaSCR2 leurs expression au niveau du syst me racinaire et leurs fonctions chez Lupinus albus et Medicago truncatula III 1 Criblage d une banque de facteurs de transcription Cette tude a port sur l analyse de l expression de quelques facteurs de transcriptions FT au niveau des feuilles et du syst me racinaire du lupin blanc en r ponse diff rents stress Les plantes de L albus ont t soumises a diff rents stress et ont t ainsi cultiv es en absence d azote N de fer Fe ou de phosphore P Nous avons analys l expression de 161 clones ou tiquettes EST expressed sequence tags correspondant a 72 contigs Tableau III 1 et 88 singletons Tableau II 2 Aussi 18 marqueurs d expression ont t utilis s Tableau II 3 Ces marqueurs comprennent des marqueurs posit
12. La comparaison des 23 accessions de cosentinii a t r alis e sur la base des marqueurs ISSR et en utilisant l indice de Dice Les r sultats sont pr sent s sous forme de pourcentages de similarit s dans le tableau 1 20 On remarque que les pourcentages de similarit taient tr s variables et fluctuaient entre 24 87 et 61 07 La similarit la plus faible 24 87 a t not e entre deux accessions g ographiquement loign es Cos18 hay Menzah Rabat et Cos11 route de Souk larbaa vers K nitra Par contre la similarit la plus importante a t enregistr e pour deux accessions de la m me r gion Rabat K nitra CosO5 et Cos06 11 2 2 2 b Classification hi rarchique Les r sultats obtenus par comparaison des diff rentes accessions moyennant l indice de Dice ont t utilis s pour r aliser un dendrogramme de classification hi rarchique en UPGMA Figure IL 16 A un pourcentage de similarit de 42 on peut subdiviser le dendrogramme en cinq groupes Le groupe L c GI 1 repr sentant la r gion de T mara Rabat hay Menzeh Le groupe L c GI 2 repr sentant la zone allant de hay Menzeh vers Mohammedia Le groupe L c GII 1 regroupant des populations originaires de la r gion entre Rabat et K nitra Cos07 et Cos08 de K nitra Cos09 Cos10 et Cos11 et une population de T mara Cos12 Le groupe L c GII 2 avec deux populations peu loign es g ographiquement Une population de T mara Cos13 et une popu
13. l Est B et C Contour m diterran en C Afrique du nord D l Ouest de l Am rique On note aussi que les lupins du nouveau monde ne forment pas un groupe monophyl tique en tant divis s en deux groupes A et E Par contre les lupins de l ancien monde forment 3 clades diff rents B C et D repr sentant les groupes du contour de la m diterran e et C qui repr sente les esp ces de I Afrique du nord RSS SERRES LEE ET EE COR EEE EE EF AA qaannsananaskannine OUTGROUP Eastern P New World America Circum Mediterranean Old North Africa World Circum Mediterranean Westeni New World America Figure I 6 Diagramme repr sentant la relation phylog n tique du genre Lupinus bas e sur les s quences d ADN ribosomal ITS de 44 taxons de lupin et 5 outgroup Les groupes identifi s et leurs r gions correspondantes sont repr sent s par des triangles ouverts 13 Revue bibliographique II Approches de la diversit mol culaire II 1 Marqueurs mol culaires pour I tude de la diversit g n tique L tude de la diversit ou polymorphisme g n tique est li e au d veloppement de la biologie qui a permis le d veloppement de plusieurs marqueurs a savoir les marqueurs morphologiques les marqueurs biochimiques et les marqueurs mol culaires Les marqueurs morphologiques et biochimiques ont largement contribu aux tudes de la diversit chez les plantes Ces marque
14. 0 070 0 A37 1 390 tt 0 242 ommo optag 0 202 0456 0 480 gamtai 70 0 267 0468 ota 0150 0 225 1 536 0 538 masr 1400 ome 0207 0 083 onas 0120 onog 0087 sioan Esa ae 0067 0204 T oore 87 0218 net 0422 0676 ESF a7 ome 0250 0158 0209 0495 0080 0 704 BR EAF 1 452 027 0 204 0 134 0 226 0 198 0 751 0 915 EM ORF 1 373 0 148 0 358 0133 0159 0 210 0 975 0 962 262 E589 T 1 655 0115 0020 0 424 0 042 0 132 0 741 01089 1 595 Over 1 527 0 116 0 829 0130 0 171 0197 0 680 ameg 8898 ESA 1 416 0 154 0 292 0 122 0182 0 228 0 355 0 668 1 998 Le sur lignage indique les g nes qui sont sur exprim s ou sous exprim s __ 224 Annexes Annexe III 2 suite Expression des facteurs de transcription en r ponse au diff rents stress Racines proteoides Code EST D es oze 01a o8 nd ed 1908 E 1 482 0 113 0 254 0 111 0 165 0 224 0 272 0 262 1 E742 F 1 518 0 107 0 255 0126 0 152 0 232 0 214 0 254 2am EMSs 1 465 0 147 0 361 0 138 0 169 0 207 2 510 1 163 BIST6 EI8F Ss 1 419 0 115 0 292 0 126 0 180 0 212 0 599 0 279 200 E71 F 1 394 0 135 0 174 0 124 0 199 0 170 0 093 1 208 Bass ETF 1 439 0 157 0 277 0 068 0 114 0 153 7 215 8696 20200 E817 F 1 465 0 140 0 255 0 113 0 202 0 208
15. 0 131 0 981 SSSH E848 F 1 527 0 129 0 285 0 113 0 183 0 231 0 850 0 867 5928 YPR_011_A07_ 050 ab1_5_ORF1 1 440 0 131 0 335 0 150 0 190 0 250 0 304 0 328 0 968 Le sur lignage indique les g nes qui sont sur exprim s ou sous exprim s __ 225 Annexes Annexe IIL 3 Marquage radioactif de l ADN La pr paration de sondes radioactives consiste en le marquage de fragments d ADN sp cifique en utilisant le Kit de marquage High prime labelling kit Roche Applied Science USA Les fragments d ADN ins r s dans des plasmides sont isol s par amplification ou par digestion 1 D naturation des ADN 10 ng d ADN dans un volume final de 12ul sont d natur s 90 C pendant 10min Les ADN d natur s sont remis dans la glace rapidement 2 Marquage des ADN Les ADN d natur s sont marqu s dans 4uldu m lange r actionnel High prime 4ulde dNTP dGTP dCTP et dTTP Sul d isotope P dATP Ce m lange est incub a 37 C pendant 30min La r action est ensuite arr t e par ajout de 2ul d EDTA 0 2M PH 8 0 Le m lange est centrifug dans une colonne de sephadex pour purifier et liminer les nucl otides et l isotope non incorpor s La r ussite du marquage est v rifi e par quantification de la radioactivit incorpor e Les sondes pr par es doivent tre d natur es avant toute utilisation 226 Annexes Annexe IIL 4 Pr paration du Southern blot et cond
16. Apr s la s rie d optimisation du protocole d amplification par RAPD nous avons opt pour le m lange r actionnel et le programme d amplification qui nous a permis d avoir le meilleur profil d amplification La RAPD PCR a t optimis e dans 25 ul de volume final avec 10 mM Tris HCl pH 8 3 50 mM KCI 2 5 mM MgCh 200 uM de dATP dGTP dCTP dTTP 0 2 mM d amorces 2 5 mM de Taq polymerase promega et 30 ng ul d ADN L amplification a t r alis e dans un thermocyleur AMPLITRON RII selon le programme d amplification suivant Une tape de d naturation de l ADN 90 C pendant 3 mn suivie de 60 cycles d amplifications comportant chacun une d naturation 94 C pendant 1 mn une tape d amorcage a 35 C pendant 1 mn et une tape d longation 72 C pendant 2 mn Le programme est ensuite boucl par une tape finale d longation 72 C pendant 15 mn 60 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Ces protocoles ont t utilis s pour amplifier les ADN du L luteus et L cosentinii moyennant 97 amorces RAPD Les produits de amplification sont s par s par lectrophor se sur gel d agarose 1 et dans un tampon de migration Tris Borate EDTA TBE Le gel est soumis a un courant de 50 V pendant 5 heures Les produits PCR sont par la suite visualis s sous ultras violets apr s coloration au bromure d ethidium 10 mg ml II 1 4 Les marqueurs ISSR Les marqueurs ISSR ont t des marqueurs de
17. E ACC M CAT 661 pb 0 002 0 238 21 E ACC M CAG 412 pb 0 661 0 000 63 E ACC M CAT 639 pb 0 278 0 321 22 E ACC M CAG 391 pb 0 135 0 018 64 E ACC M CAT 606 pb 0 007 0 166 23 E ACC M CAG 383 pb 0 661 0 000 65 E ACC M CAT 606 pb 0 007 0 166 24 E ACC M CAG 362 pb 0 236 0 383 66 E ACC M CAT 583 pb 0 025 0 018 25 E ACC M CAG 346 pb 0 594 0 006 67 E ACC M CAT 564 pb 0 661 0 000 26 E ACC M CAG 344 pb 0 007 0 166 68 E ACC M CAT 511 pb 0 007 0 487 27 E ACC M CAG 340 pb 0 025 0 018 69 E ACC M CAT 488 pb 0 278 0 321 28 E ACC M CAG 330 pb 0 235 0 237 70 E ACC M CAT 467 pb 0 135 0 018 29 E ACC M CAG 322 pb 0 007 0 487 71 E ACC M CAT 446 pb 0 016 0 606 30 E ACC M CAG 308 pb 0 235 0 237 72 E ACC M CAT 424 pb 0 661 0 000 31 E ACC M CAG 295 pb 0 007 0 487 73 E ACC M CAT 410 pb 0 007 0 487 32 E ACC M CAG 295 pb 0 196 0 489 74 E ACC M CAT 370 pb 0 135 0 018 33 E ACC M CAG 284 pb 0 661 0 000 75 E ACC M CAT 358 pb 0 661 0 000 34 E ACC M CAG 272 pb 0 236 0 383 76 E ACC M CAT 349 pb 0 661 0 000 35 E ACC M CAG 272 pb 0 594 0 006 77 E ACC M CAT 340 pb 0 236 0 383 36 E ACC M CAG 263 pb 0 007 0 487 78 E ACC M CAT 326 pb 0 135 0 018 37 E ACC M CAG 252 pb 0 236 0 383 79 E ACC M CAT 315 pb 0 594 0 006 38 E ACC M CAG 243 pb 0 060 0 006 80 E ACC M CAT 306 pb 0 236 0 383 39 E ACC M CAG 232 pb 0 235 0 237 81 E ACC M CAT 296 pb 0 007 0 166 40 E ACC M CAG 226 pb 0 661 0 000 82 E ACC M CAT 281 pb 0 007 0 487 41
18. ISSR FL3 308 pb 0 142 2 602 215 ISSR FL4 153 pb 0 004 0 284 174 ISSR FL3 286 pb 0 057 0 298 216 ISSR FL4 137 pb 0 470 0 255 175 ISSR FL3 282 pb 0 008 0 500 217 ISSR FL5 1334 pb 0 057 0 298 176 ISSR FL3 261 pb 0 010 0 240 218 ISSR FL5 1178 pb 0 008 0 500 177 ISSR FL3 244 pb 0 000 1 484 219 ISSR FL5 987 pb 0 010 0 240 178 ISSR FL3 225 pb 0 098 1 673 220 ISSR FL5 907 pb 0 083 0 281 179 ISSR FL3 203 pb 0 499 0 026 221 ISSR FL5 885 pb 0 057 0 298 180 ISSR FL3 192 pb 0 170 0 702 222 ISSR FL5 716 pb 0 145 0 010 181 ISSR FL3 179 pb 0 000 0 073 223 ISSR FL5 668 pb 0 131 0 001 182 ISSR FL3 179 pb 0 001 0 009 224 ISSR FL5 533 pb 0 378 0 136 183 ISSR FL3 166 pb 0 103 0 278 225 ISSR FL5 511 pb 0 499 0 026 184 ISSR FL3 150 pb 0 991 1 137 226 ISSR FL5 492 pb 0 069 0 034 185 ISSR FL4 1703 pb 0 008 0 500 227 ISSR FL5 451 pb 0 057 0 298 186 ISSR FL4 1236 pb 0 004 0 284 228 ISSR FL5 427 pb 0 602 0 283 187 ISSR FL4 1120 pb 1 601 0 020 229 ISSR FL5 413 pb 0 109 0 000 188 ISSR FL4 936 pb 0 057 0 298 230 ISSR FL5 411 pb 0 083 0 281 189 ISSR FL4 759 pb 0 000 0 267 231 ISSR FL5 380 pb 0 086 0 191 190 ISSR FL4 701 pb 0 814 0 027 232 ISSR FL5 351 pb 0 000 0 267 191 ISSR FL4 674 pb 0 124 0 044 233 ISSR FL5 335 pb 1 129 0 107 192 ISSR FL4 630 pb 0 176 0 002 234 ISSR FL5 318 pb 1 134 0 140 193 ISSR FL4 560 pb 0 004 0 284 235 ISSR FL5 313 pb 0 432 0 053 194 ISSR FL4 523 pb 0 000 0 267 236 ISSR FL5
19. t tr s int ressante Les 11 amorces ISSR et 10 combinaisons d amorces AFLP se sont av r es hautement informatives Le nombre de bandes r v l es a t important aussi bien dans le cas des marqueurs AFLP qu ISSR N anmoins les marqueurs AFLP ont permis de g n rer plus de bandes que les marqueurs ISSR Figure II 23 et IL 24 Ainsi 234 fragments AFLP ont t enregistr s chez L albus 275 chez L cosentinii 277 chez L angustifolius et 278 chez L luteus En outre 79 bandes obtenues chez L luteus 88 chez L albus 89 chez L angustifolius et 103 chez L cosentinii Par ailleurs les quatre esp ces de lupin ont t caract ris es par des marqueurs ISSR et AFLP uniques Le nombre de marqueurs AFLP uniques 322 obtenus a t plus important que celui des marqueurs ISSR uniques 69 Ces marqueurs uniques peuvent tre interessant dans l identification des esp ces de lupins marocains Le sequen age de ces marqueurs uniques peut tre interessant dans l identification des esp ces de lupin du Maroc Les marqueurs ISSR et AFLP ont permis de generer deux dendrogrammes proposant des representations differentes des quatres esp ces tudi es On deduit que chacun des deux marqueurs engendre une valuation differente de la similarit g n tique entre les esp ces de lupin D un autre c t le degr de variabilit g n tique de chacune des esp ces tudi es sur la base des marqueurs ISSR a t valu moyennant I
20. tudes g n tiques qui ont port sur Arabidopsis proposent au moins 4 facteurs de 149 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc transcription A PHRI famille MYB AtWRKY75 AtZat6 zinc finger et AtBHLH impliqu s dans le signal du phosphore Mission et al 2005 ont identifi le PIBS de l l ment AtPHR surexprim au niveau des promoteurs de plusieurs g nes induits en conditions de stress phosphorique Par ailleurs Muller et al 2007 ont rep r le motif AGTTTT qui a t tr s abondant chez les g nes d Arabidopsis inhib s en r ponse au stress phosphorique Aussi le motif GAATAT a t surrepr sent chez 16 g nes induits par le phosphore Tableau IIL6 Les l ments r gulateurs d tect s au niveau des promoteurs de LaSCRI et LaSCR2 El ment S quence Position au niveau Position au niveau du pLaSCR1 du pLaSCR2 TC repeats TCTCTCT Aucun 19 Helix Loop Helix CA T G A C TG 887 1393 611 PHO like G T A C T A GT 231 313 618 Aucun GG 816 1297 Nitrogen regulatory TATC A T A T 42 60 117 112 219 614 688 protein 2 Nit2 764 BES1 CANNTG 232 375 1113 88 201 452 611 1135 1393 813 1042 Binding CCAAT 183 530 610 664 777 transcription 987 Factor DNA binding with ACTTTA 760 Aucun one finger Dof elements WRKY box T T TGAC C T Aucun Aucun Zinc finger A T GATA A G 433 737 905 16
21. 10 mM 1 uL d inhibiteur d ARNase et 1 ul de la super script reverse transcriptase La r action de transcription inverse est optimis e pendant 1 heure 43 C Ce m lange est stock 80 C 145 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 2 2 Effet du stress phosphorique sur le profil d expression des g nes LaSCR1 et LaSCR2 L expression des deux g nes LaSCRI et LaSCR2 au niveau des racines du lupin blanc a t analys e par une retro transcriptase PCR RT PCR et par la PCR en temps r el qPCR 2 2 1 Mesure de l expression par PCR RT PCR La mesure de l expression de LaSCR1 et LaSCR2 a t r alis e par amplification par PCR des ADNc en utilisant des amorces sp cifiques aux deux g nes Les quantit s d ADNc ont t normalis es en utilisant la tubuline comme standard Pour LaSCRI un fragment de 500 pb a t amplifi l aide des amorces LaSCRI F 5 CAA CAC TAG TGT CCC ACA GTA G 3 et LaSCRI R 5 GCTGAGAATCTGGAAGATGC 3 Dans le cas de LaSCR2 un fragment de 650 pb a t amplifi moyennant les amorces LaSCR2 F 5 CTCACTCACCTTGGCTTCTCT 3 et LaSCR2 R 5 CTCAACAGTAGCACCGGTACTAG 3 La PCR a t optimis e dans 20ul contenant 2ul d ADNc 2 5 mM de MgCL tampon Gotaq 10X Prom ga 0 4 mM de dNTPs 7 5 ng de chacune des amorces et 0 2 ul de Taq polymerase L amplification a t r alis e en 27 cycles de 1 min 94 C 30 s 55 C et 1 min a 72 C La fig
22. 15 9 marqueurs sp cifiques ont t enregistr s Le nombre de ces marqueurs par accessions a t variable 1 marqueur sp cifique pour AIb02 trois pour Alb06 quatre pour Alb05 six pour Alb04 et Alb07 sept pour Alb08 huit pour AIb03 neuf pour AlbO1 et Alb10 Le maximum de marqueurs sp cifiques 11 a t not pour l accession Alb09 II 2 2 1 a Distances g n tiques Les similarit s entre les diff rentes accessions de L albus ont t calcul es sur la base des 402 marqueurs ISSR obtenus et moyennant I indice de Dice Tableau IL 14 La similarit entre les accessions tudi es a t tr s importante et d duite selon les pourcentages obtenus Les pourcentages de similarit s variaient entre 70 1 et 82 5 Les similarit s les plus faibles 70 1 et 70 8 ont t enregistr es entre des accessions g ographiquement loign es exemple Alb01 Souk larbaa et ALb10 Marrakech La similarit la plus importante 82 5 a t obtenue entre deux populations de Bouznika Alb03 et ALb04 Des valeurs interm diaires celles ci ont t obtenues comme r sum dans le tableau II 14 84 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau IL 12 Liste des amorces ISSR utilis es dans l analyse de la diversit intra sp cifique de L albus le nombre de marqueurs engendr s la taille de ces marqueurs le nombre de marqueurs polymorphes et l indice de diversit de ces marqueurs
23. At4g17230 AtSCLI At1g21450 AtSCL8 At5g52510 AtSCL32 At3g49950 AtSHR At4g37650 AtSCL29 At3g13840 AtSCL6 At4g00150 AtSCL22 At3g60630 AtSCL27 At2g45160 et AtSCL15 At4g36710 L arbre phylog n tique a t labor l aide du programme MAFFT version 6 L arbre construit pr sente une racine rooted tree et comprend comme groupe externe outgroup un gene humain human STAT HsSRC 19 NP004374 Bolle 2004 and Lim et al 2005 135 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc L arbre phylog n tique Figure III 5 montre l organisation des g nes analys s en 9 clusters SCR DELLA SHR SCL3 HAM SCL4 PATI LAS et SCL9 Cette repr sentation est comparable celle pr sent e par d autres auteurs Bolle 2004 Lim ef al 2005 et Lee et al 2008 On note que les deux g nes LaSCRI et LaSCR2 sont tr s similaires aux autres g nes SCR de part leurs position dans le cluster SCR Le SCL23 positionn dans le cluster SCR a t d crit comme tant le gene de GRAS le plus proche des g nes SCR 1 2 3 e Analyse fonctionnelle des deux prot ines Les deux prot ines LaSCRI et LaSCR2 ont t analys es l aide du programme www predictprotein org Cette analyse a permis de pr dire la structure des deux prot ines LaSCR1 2 et aussi de r v ler la pr sence de plusieurs motifs Tableau III 5 synonymes de modifications post traductionnelle On note la pr sence des sites
24. ISSR FL11 250 pb 0 001 0 009 354 ISSR FL10 125 pb 0 553 0 042 368 ISSR FL11 234 pb 0 541 0 239 355 ISSR FL10 105 pb 0 001 0 150 369 ISSR FL11 231 pb 0 005 0 002 356 ISSR FL11 987 pb 0 004 0 284 370 ISSR FL11 212 pb 0 059 0 206 357 ISSR FL11 869 pb 0 008 0 500 371 ISSR FL11 202 pb 0 090 2 023 358 ISSR FL11 839 pb 0 014 0 003 372 ISSR FL11 182 pb 0 088 0 027 359 ISSR FL11 760 pb 0 008 0 500 373 ISSR FL11 170 pb 0 000 0 550 360 ISSR FL11 728 pb 0 069 0 034 374 ISSR FL11 158 pb 0 130 0 234 361 ISSR FL11 694 pb 0 008 0 500 375 ISSR FL11 145 pb 0 375 0 009 362 ISSR FL11 647 pb 0 001 0 150 376 ISSR FL11 138 pb 0 952 0 584 363 ISSR FL11 624 pb 0 109 0 154 377 ISSR FL11 122 pb 0 553 0 042 364 ISSR FL11 595 pb 0 076 0 161 218 Annexes Annexe II 7 Classification hi rarchique des populations de lupin utilis es la base des marqueurs ISSR C 16 C 15 Cast Cats C 19 C 23 C 20 Caz2z C 21 C 10 Catt C 13 SEERE Q SREEEEREERERERERES IUHU3S02 7 snan FT snqjo 7 219 Annexes Annexe ILS Repr sentation tridimensionnelle ou multi dimensional scaling des populations du genre Lupinus en utilisant les marqueurs ISSR 220 Annexes Annexe IIL 1 Extraction de PARN chez le lupin blanc Maxi pr paration Broyer 2g de tissus dans de l azote liquide Au broyat ajouter 9 ml de tampon d extraction Ac tate de Na 0 2 M EDTA 10 mM 1
25. ISSR FL6 896 pb 1 232 0 281 14 ISSR F3 165 bp 1 232 0 281 55 ISSR FL6 812 pb 2 947 1 650 15 ISSR F4 2164 pb 1 279 0 973 56 ISSR FL6 723 pb 0 127 0 788 16 ISSR F4 1727 pb 0 214 0 431 57 ISSR FL6 631 pb 1 232 0 281 17 ISSR F4 1477 pb 0 263 1 006 58 ISSR FL4 380 pb 1 662 0 221 18 ISSR F4 1354 pb 1 369 0 499 59 ISSR FL4 361 pb 1 679 1 165 19 ISSR F4 1264 pb 0 143 1 429 60 ISSR FL7 1826 pb 0 712 0 016 20 ISSR F4 203 pb 1 369 0 499 61 ISSR FL7 1357 pb 0 892 0 938 21 ISSR F4 179 pb 1 369 0 499 62 ISSR FL7 1181 pb 0 186 2 569 22 ISSR F4 174 pb 0 712 0 016 63 ISSR FL7 994 pb 2 154 2 383 23 ISSR FL1 1482 pb 0 214 0 431 64 ISSR FL7 827 pb 3 669 1 563 24 ISSR FL1 1325 pb 0 712 0 016 65 ISSR FL7 466 pb 1 662 0 221 25 ISSR FL1 1123 pb 1 232 0 281 66 ISSR FL7 439 pb 0 322 2 351 26 ISSR FL1 1067 pb 0 443 0 625 67 ISSR FL7 436 pb 2 291 2 165 27 ISSR FL1 1060 pb 1 369 0 499 68 ISSR FL7 387 pb 1 369 0 499 28 ISSR FL1 852 pb 1 369 0 499 69 ISSR FL7 273 pb 1 159 1 462 29 ISSR FL1 805 pb 1 369 0 499 70 ISSR FL8 144 pb 0 100 0 984 30 ISSR FL1 585 pb 1 369 0 499 71 ISSR FL7 108 pb 0 712 0 016 31 ISSR FL1 168 pb 1 369 0 499 72 ISSR FL8 941 pb 2 291 2 165 32 ISSR FL1 566 pb 0 712 0 016 73 ISSR FL8 710 pb 0 394 0 264 33 ISSR FL1 474 pb 1 369 0 499 74 ISSR FL9 891 pb 0 892 0 938 34 I
26. U K pp 1 40 Glombitza C Dubuis PH Thulke O 2004 Crosstalk and differential response to abiotic and biotic stressors reflected at the transcriptional level of effector genes from secondary metabolism Plant Molec Biol 54 817 835 Godwin I D E A B Aitken amp L W Smith 1997 Application of inter simple sequence repeat ISSR markers to plant genetics Electrophoresis 18 1524 1528 Goff S A Cone K C amp Chandler V L 1992 Functional analysis of the transcriptional activator encoded by the maize B gene evidence for a direct functional interaction between two classes of regulatory proteins Genes Dev 6 864 875 Goff SA Ricke D Lan TH ef al April 2002 A draft sequence of the rice genome Oryza sativa L ssp japonica Science journal 296 5565 92 100 Goldstein AH 1992 Phosphate starvation inducible enzymes and proteins in higher plants Jn JL Wray ed Society for Experimental Biology Seminar Series 49 Inducible Plant Proteins Cambridge University Press Cambridge UK pp 25 44 Graham M A Ramirez M Vald z L pez O Lara M Tesfaye M amp Vance C P 2006 Identification of candidate phosphorus stress induced genes in Phaseolus vulgaris L through clustering analysis across several plant species Funct Plant Biol 33 789 797 177 R f rences bibliographiques Graves PR and Haystead TAJ 2002 Molecular biologist s guide to proteomics Microbiol Molec Biol Rev 66 1 39 63 Gregory M
27. cosentinii sur la base des marqueurs ISSR 103 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit a b i e 8 LutO7 Lut09 Lut06 Lut0B Lut05 Lut03 LutO2 LutO1 Figure IL 19 Profils lectrophor tiques et dendrogrammes obtenus pour les accessions de L luteus l aide de l amorce F3 a et F2 b Tableau IL 23 Nombre taille et diversit des marqueurs ISSR g n r s par les 8 populations de L luteus Amorce Marqueurs Taille des bandes Marqueurs PIC g n r s obtenues polymorphes FI 23 1415 123 27 23 0 94 F2 30 791 20 131 67 30 0 95 F3 30 1383 163 90 30 0 95 FLI 33 1384 126 99 33 0 96 FL2 18 800 55 153 28 18 0 92 FL3 17 658 06 149 94 17 0 91 FL4 32 1703 137 02 32 0 95 FLS 29 1334 116 30 29 0 95 FL6 16 582 05 106 78 16 0 91 FL7 21 637 99 107 65 21 0 94 FL8 25 1406 133 83 25 0 95 FL9 26 1613 125 98 26 0 95 FLIO 22 1343 104 92 22 0 94 FLI1 36 987 122 02 36 0 96 Total 358 104 92 1703 358 0 940 0 017 104 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit 11 2 2 3 Chez Lupinus luteus Dans l tude de la diversit intra sp cifique de L luteus 14 amorces ISSR ont t maintenues et ont permis de g n rer une h t rog n it de profils importante Figure II 19 Ainsi 358 bandes ISSR polymorphes ont t enregistr es avec une moyenne de 25 5 bandes par amorce Tableau II 23 Le nombre de bandes t variable selon les
28. digestion par des enzymes de restriction Les tiquettes sont ligu s en une seule s quence qui est cloner et s quencer Les s quences obtenues sont analys es in silico pour d terminer le nombre d occurrences de chaque tiquette dans les chantillons test s La technologie 454 est une des nouvelles technologies de s quencage int grant haut d bit et rapidit Elle est bas e sur le pyros quencage avec la synth se d ADN cible en temps r el avec l ajout s quentiel et dans l ordre des bases Chaque base est marqu e par un fluorophore diff rent dont le signal est mesur par bioluminescence l aide d une cam ra L ordre d incorporation de ces bases sur les l ADN compl mentaire de la cible n osynth tis e permet de d duire la s quence et sa lecture apr s s quencage Lamoril et al 2008 Cette technologie permet le s quencage de 20 millions de bases en un cycle de quatre heures Cette technologie est tr s utilis e pour le s quencage des g nomes entiers le s quencage en profondeur ou ultra deep s quencing de g nes cibles et aussi pour les analyses de l ARN Les puces a ADN sont aussi appel es puces a g nes bio puces DNA chip DNA microarray ou biochip Schena et al 1995 Stears et al 2003 Le principe de fonctionnement d une puce brevet e a t pr sent en 1988 par Edward Southern et ce n est qu en 1995 qu a eu lieu le d veloppement des puces ADN par Davis et Brown La commercialis
29. e sur la base des donn es ISSR et des pourcentages de similarit s calcul s Figure IL 22 Cette repr sentation permet d avoir une id e sur la distribution des populations de L luteus dans un espace tridimensionnel selon les trois axes X Y et Z Comme c est montr dans la figure II 22 les populations de L luteus sont organis es en trois groupes potentiels I II et III pr d finis Les trois groupes sch matis s par les 3 ellipses sont ind pendants l un de l autre Ceci peut supposer une absence d change de g nes entre les trois groupes 110 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Biplot axes F1 et F2 32 76 4 173 177 3 Lut01 164 345 83 f 41 36 304 1193 bad ge 270 32 7 14 i 184 F2 15 94 233 Lut0 96 amp 3 6 5 43 2 4 9 F1 16 82 Figure IL 21 Analyse en composantes principales des populations de L luteus sur la base des marqueurs ISSR 3 F1 629 21pb 4 F1 556 09pb 5 F1 534 33pb 6 F1 509 15pb 9 F1 370 96pb 8 F1 403 96pb 14 F1 279 33pb 33 F2 502 23pb 23 F1 123 27pb 26 F2 717 13pb 30 F2 566 15pb 33 F2 502 23pb 36 F2 408 04pb 37 F2 387 42pb 41 F2 314 59bp 82 F3 188 34pb 83 F3 163 90pb 67 F3 552 13pb 20 F1 157 22pb 24 F2 791 20pb 38 F2 367 95pb 66 F3 568 99pb 96 FL1 507 85pb 100 FL1 362 04pb 101 FL1 342 13pb 103 FL1 298 59pb 121 FL1 791 74pb 152 FL2 524 04bp 156 FL2 372 25pb 161 FL2 258 91pb
30. es par ajustement matriciel On obtient alors un tableau plus petit r sumant le contenu du tableau initial ou encore on remplace un grand nombre de variables par un plus petit nombre de variables explicatives appel es des facteurs Cette analyse factorielle permet de convertir les tableaux de donn es en un nuage de points dans un espace de n dimensions g n ralement sup rieure 3 Le nuage de points est d fini par les distances entre les points et la masse affect e chaque point Un ajustement du nuage permet de d terminer l axe qui restitue au mieux la forme g om trique et massique du nuage et constitue le premier axe d inertie ou premier axe factoriel du nuage L axe orthogonal au premier axe pr sente le deuxi me axe factoriel et ainsi de suite pour les dimensions 3 La morphologie du nuage et la r partition des points permet une meilleure lecture de l information des donn es L analyse factorielle des correspondances AFC a t propos e par Benzecri et collaborateurs 1973 L AFC est bas e sur l utilisation de la m trique chi deux Elle sert en particulier d terminer et hi rarchiser les d pendances entre les lignes et les colonnes d un tableau Les analyses d AFC sont g n ralement compl t s par des essais de classification ascendante hi rarchique CAH qui permettent de construire des arbres de classification des lignes ou des colonnes L analyse en composantes principale ACP a t mise au point p
31. gories une banque EST de 7 10 jours apr s mergence JAE et la banque EST de 12 a 14 JAE Plusieurs de ces s quences EST demeurent encore sans annotation Il existe aussi une banque d EST int ressante du lupin blanc non encore publi e et disponible au laboratoire du professeur Vance University du Minnesota saint paul USA Tableau I 5 Nombre d tiquettes EST disponibles et connues chez quelques esp ces de plantes en comparaison avec Caenorhabditis elegans et Homo sapiens Recherche effectu e le 25 12 2008 http www ncbi nlm nih gov dbEST Esp ce Nombre de s quences EST disponible dans Genbank Homo sapiens 8 163 898 Zea mays 2 018 337 Arabidopsis thaliana 1 526 124 Glycine max 1 386 618 Lupinus albus 8418 Lupinus angustifolius 388 Triticum aestivum 1 051 304 Orysa sativa japonica 985 283 Caenorhabditis elegans 352 044 Medicago truncatula 260 238 Orysa sativa indica 201 453 Populus trichocarpa 89 943 Phaseolus vulgaris 83 448 Pinus pinaster 27 847 Medicago sativa 12 072 Triticum monococcum 11 190 Pinus sylvestris 660 29 Revue bibliographique IIL2 La g nomique fonctionnelle L objectif de la g nomique fonctionnelle est la compr hension du fonctionnement des diff rents composants du g nome La forme la fonction et le d veloppement des organismes d pendent de l information apport e par plusieurs processus li s l ac
32. labor es 114 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit On note que les accessions s organisent en groupes ou sous groupes En effet nous avons d finit trois groupes chez L albus deux groupes et cing sous groupes chez L cosentinii et trois groupes chez L luteus Globalement la structuration des diff rentes accessions et la classification hi rarchique des groupes obtenus mettent en relief le degr de similarit et de diversit entre les populations tudi es Par contre le regroupement des diff rentes populations n a pas t clairement corr l a leurs origines g ographiques Par ailleurs la comparaison de l ensemble des populations du lupin a t effectu e sur la base des marqueurs ISSR et en utilisant l indice de diversit de Dice A la base des r sultats obtenus une classification hi rarchique en UPGMA Annexe II 7 une analyse factorielle ainsi qu une repr sentation tridimensionnelle de type MDS Annexe II 8 ont t optimis es Les marqueurs ISSR utilis s ont assur une bonne structuration et s paration des trois esp ces analys es L albus L cosentinii et L luteus Le syst me de reproduction du lupin savoir l autogamie et l allogamie peut supposer un flux de g nes entre les populations d une m me esp ce Par ailleurs l autogamie et l allogamie peuvent expliquer la similarit entre les accessions de differentes origines g ographiques Dans le present travail on
33. sentant les deux principales voies de s quen age du g nome Figure I 11 Les diff rents niveaux de contr le des processus cellulaires Figure 1 12 Sch ma montrant les deux tapes du m canisme d ARNi Figure L13 R seau de r gulation au niveau racinaire impliquant quelques facteurs de transcriptions Figure I 14 Sch ma repr sentant les cinq domaines fonctionnels de la s quence conserv e des produits de la famille GRAS Figure I 15 Repr sentation sch matique de l anatomie de la racine d Arabidopsis thaliana Figure 1 16 Racines proteo des de Lupinus albus cultiv sous carence Phosphorique Figure 1 17 Sections des racines proteoides r colt es de plantes cultiv es sous stress phosphorique Figure 1 18 Racines secondaires lat rales du lupin blanc cultiv en stress phosphorique Figure IL 1 Sites de collecte des accessions marocaine de lupin utilis es Figure II 2 Gel d agarose avec l ADN de lupin extrait Figure II 3 Profils RAPD de L luteus Figure II 4 Profils RAPD de L luteus Figure II 5 Profils lectrophor tiques ISSR des quatre esp ces de lupin tudi es Figure IL6 UPGMA des quatre esp ces de lupin sur la base des marqueurs ISSR Figure II 7 ACP des quatre esp ces de lupin selon les marqueurs ISSR Figure II 8 Profils AFLP de quatre esp ces de lupin tudi es Figure IL 9 UPGMA des quatre esp ces de lupin sur la base des marqueurs AFLP Figure IL 10 ACP des quatre esp ces de lupin
34. t utilis s pour analyser la diversit inter sp cifique entre deux esp ces de lupin Une esp ce sauvage L cosentinii dont les chantillons ont t collect s dans la r gion de Rabat Hay riad et une esp ce cultiv e L luteus de la r gion de K nitra Les ADN ont t extraits partir des deux esp ces de lupin et amplifi s moyennant 97 amorces RAPD Operon technologique Almeda selon le protocole d amplification pr alablement optimis Les premiers r sultats d amplifications par PCR RAPD r v lent un haut niveau de polymorphisme chez les deux esp ces Figures II 3 et II 4 Chez L luteus des 97 amorces RAPD essay es 76 78 3 ont g n r des profils lectrophor tiques lisibles I s agit de AD2 AF2 5 AI15 AJ12 AK1 AK2 AK4 AMI AM2 AM4 AM9 AN1 AN3 AN5 AN12 CI C3 7 D1 5 D15 D20 E1 4 F2 5 G2 4 H1 5 12 5 M1 R1 3 R11 S3 8 S18 T1 8 T16 U2 U3 U9 Y15 Chez L cosentinii des 97 amorces RAPD utilis es 27 27 8 marqueurs RAPD ont permis de g n rer des profils lectrophor tiques nettes AF2 4 AK2 4 AN3 B10 C1 4 C6 D1 D2 D5 E1 E3 E4 F1 F5 G1 H3 H4 M1 S6 8 T1 T4 T5 T6 U2 U3 U9 Les profils RAPD obtenus chez les deux esp ces de lupin ont montr une h t rog n it lectrophor tique int ressante N anmoins nous avons r v l la non reproductibilit au niveau de certains marqueurs Ainsi tude de la diversit du lupin moyennant les marqueurs RAPD
35. tiquement modifi Le ph nom ne de transformation g n tique a t d couvert en 1928 par Frederick Griffith Ce ph nom ne tr s commun chez les bact ries est un l ment important de l volution des esp ces La transformation g n tique des organismes vivants en particulier les plantes a t largement d velopp e depuis l identification de l Agrobacterium tumefaciens en 1977 La transgen se est un m canisme largement utilis en agroalimentaire et en industrie pharmaceutique et particuli rement pour l tude de la fonction des g nes La transg n se n cessite le choix du transg ne un g ne d int r t ou un g ne dont on veut connaitre la fonction L int gration du transg ne au sein de l organisme vivant utilise plusieurs techniques de transformation g n tique Les m thodes de transformation g n tique peuvent tre class es en m thodes directe et indirecte La transformation g n tique directe assure la p n tration du transg ne dans l organisme transformer sans le recours aucun vecteur On cite l l ctroporation la micro injection la biolistique ou le bombardement de particules et le transfert moyennant le Poly Ethyl ne Glycol PEG La transformation indirecte n cessite par contre l utilisation de vecteurs de transformation tels que les virus et les bact ries Actuellement la plupart des transformations g n tiques des plantes utilisent les Agrobacterium On note l Agrobacteriun tumefaciens qui est resp
36. 0 499 265 ISSR FL2 269 pb 3 151 0 795 306 ISSR FL3 269 pb 1 049 1 876 266 ISSR FL2 251 pb 1 369 0 499 307 ISSR FL3 262 pb 0 083 1 173 267 ISSR FL2 233 pb 1 778 2 367 308 ISSR FL3 250 pb 1 369 0 499 268 ISSR FL2 224 pb 0 989 0 726 309 ISSR FL3 241 pb 1 369 0 499 269 ISSR FL2 219 pb 0 263 1 006 310 ISSR FL3 226 pb 1 369 0 499 270 ISSR FL2 205 pb 0 755 1 156 311 ISSR FL3 214 pb 0 712 0 016 271 ISSR FL2 195 pb 0 306 0 407 312 ISSR FL3 198 pb 1 232 0 281 272 ISSR FL2 187 pb 1 369 0 499 313 ISSR FL3 182 pb 1 022 1 680 273 ISSR FL2 179 pb 0 263 1 006 314 ISSR FL3 175 pb 0 240 0 235 274 ISSR FL2 163 pb 1 369 0 499 315 ISSR FL3 163 pb 0 892 0 938 275 ISSR FL2 151 pb 1 369 0 499 316 ISSR FL3 154 pb 1 232 0 281 276 ISSR FL2 137 pb 1 369 0 499 317 ISSR FL3 139 pb 0 306 0 407 277 ISSR FL2 126 pb 0 322 2 351 318 ISSR FL4 461 pb 0 573 0 658 278 ISSR FL3 1236 pb 1 369 0 499 319 ISSR FL4 396 pb 0 098 1 671 279 ISSR FL3 1024 pb 0 712 0 016 320 ISSR FL4 352 pb 0 712 0 016 280 ISSR FL3 957 pb 0 511 0 194 321 ISSR FL4 332 pb 1 232 0 281 281 ISSR FL3 896 pb 1 369 0 499 322 ISSR FL4 314 pb 0 712 0 016 282 ISSR FL3 847 pb 0 322 2 351 323 ISSR FL4 293 pb 0 420 0 687 283 ISSR FL3 764 pb 0 892 0 938 324 ISSR FL4 280 pb 0 263 1 006 284 ISSR FL3 737 pb 1 592 0 267 325 ISSR FL4 270 pb 1 369 0 499 285
37. 007 0 487 458 E ACT M CAT 197 pb 0 235 0 237 503 E AGG M CTC 172 pb 0 016 0 606 459 E ACT M CAT 185 pb 0 025 0 018 504 E AGG M CTC 166 pb 0 594 0 006 460 E ACT M CAT 178 pb 0 016 0 606 505 E AGG M CTC 161 pb 0 661 0 000 461 E ACT M CAT 175 pb 0 594 0 006 506 E AGG M CTC 154 pb 0 016 0 606 462 E ACT M CAT 169 pb 0 278 0 321 507 E AGG M CTC 149 pb 0 007 0 487 463 E ACT M CAT 167 pb 0 196 0 489 464 E ACT M CAT 163 pb 0 135 0 018 202 Annexes Annexe II 4 Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans I ACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L albus Contributions Contributions des variables des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 1 ISSR F2 378 pb 0 078 0 083 44 ISSR F3 284 pb 0 234 0 354 2 ISSR F2 366 pb 0 099 0 023 45 ISSR F3 265 pb 0 002 0 047 3 ISSR F2 358 pb 0 001 0 342 46 ISSR F3 236 pb 1 502 0 055 4 ISSR F2 347 pb 0 338 0 145 47 ISSR F3 226 pb 0 441 0 000 5 ISSR F2 333 pb 0 890 0 287 48 ISSR F3 210 pb 1 502 0 055 6 ISSR F2 322 pb 0 335 0 021 49 ISSR F3 195 pb 0 132 0 042 7 ISSR F2 308 pb 0 044 0 094 50 ISSR F4 2928 pb 0 637 0 915 8 ISSR F2 292 pb 1 795 0 225 51 ISSR F4 2662 pb 0 056 1 413 9 ISSR F2 270 pb 0 000 0 073 52 ISSR F4 1453 pb 0 637 0 915 10 ISSR F2 255
38. 030 155 ISSR FL3 165 pb 0 038 0 470 113 ISSR FL2 285 pb 0 001 0 014 156 ISSR FL3 152 pb 0 119 0 307 114 ISSR FL2 255 pb 0 171 0 016 157 ISSR FL3 139 pb 0 484 0 020 115 ISSR FL2 220 pb 1 022 0 245 158 ISSR FL3 129 pb 0 441 0 000 116 ISSR FL2 207 pb 0 018 0 498 159 ISSR FL4 801 pb 0 441 0 000 117 ISSR FL2 176 pb 0 367 0 058 160 ISSR FL4 769 pb 0 123 0 901 118 ISSR FL2 143 pb 0 013 0 000 161 ISSR FL4 716 pb 0 833 0 515 119 ISSR FL2 138 pb 0 020 0 019 162 ISSR FL4 653 pb 0 123 0 901 120 ISSR FL2 133 pb 0 048 0 506 163 ISSR FL4 617 pb 0 000 0 864 121 ISSR FL2 123 pb 0 000 0 377 164 ISSR FL4 612 pb 0 080 0 246 122 ISSR FL2 109 pb 0 795 0 056 165 ISSR FL4 548 pb 0 188 0 320 123 ISSR FL2 104 pb 0 278 0 024 166 ISSR FL4 500 pb 0 056 1 413 124 ISSR FL2 96 pb 0 147 0 093 167 ISSR FL4 467 pb 0 057 0 238 125 ISSR FL3 1063 pb 0 401 0 032 168 ISSR FL4 453 pb 0 048 0 506 126 ISSR FL3 901 pb 0 028 0 000 169 ISSR FL4 408 pb 0 338 0 145 127 ISSR FL3 846 pb 0 245 0 235 170 ISSR FL4 386 pb 0 188 0 320 128 ISSR FL3 776 pb 0 252 0 220 171 ISSR FL4 363 pb 0 069 0 494 129 ISSR FL3 688 pb 0 005 0 053 172 ISSR FL4 348 pb 0 080 0 246 204 Annexes Annexe II 4 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L albus
39. 1 129 0 107 116 ISSR FL1 127 pb 0 003 0 122 158 ISSR FL2 322 pb 0 359 0 887 117 ISSR FL1 1384 pb 0 499 0 026 159 ISSR FL2 307 pb 0 008 0 500 118 ISSR FL1 1024 pb 0 499 0 026 160 ISSR FL2 286 pb 1 051 0 174 119 ISSR FL1 875 pb 0 362 0 058 161 ISSR FL2 259 pb 0 000 0 945 120 ISSR FL1 792 pb 0 004 0 284 162 ISSR FL2 234 pb 0 003 2 109 121 ISSR FL1 792 pb 0 057 0 298 163 ISSR FL2 214 pb 0 057 0 298 122 ISSR FL1 709 pb 0 010 0 240 164 ISSR FL2 198 pb 0 002 0 049 123 ISSR FL1 640 pb 1 129 0 107 165 ISSR FL2 186 pb 0 001 0 150 124 ISSR FL1 640 pb 0 128 0 047 166 ISSR FL2 167 pb 0 004 1 246 125 ISSR FL1 603 pb 0 000 0 094 167 ISSR FL2 153 pb 0 000 0 267 126 ISSR FL1 600 pb 0 069 0 034 168 ISSR FL3 658 pb 0 010 0 240 215 Annexes Annexe IL 6 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L luteus Contributions Contributions des variables des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 169 ISSR FL3 490 pb 0 083 0 281 211 ISSR FL4 194 pb 0 424 0 050 170 ISSR FL3 398 pb 0 076 0 098 212 ISSR FL4 183 pb 0 010 0 240 171 ISSR FL3 362 pb 0 008 0 500 213 ISSR FL4 166 pb 0 090 0 862 172 ISSR FL3 340 pb 0 602 0 283 214 ISSR FL4 153 pb 0 004 0 284 173
40. 1 3 4 Lupinus angustifolius Cette esp ce aussi appel e lupin feuilles troites est facilement reconnaissable par son feuillage Narrow leafed lupin Figure I 4a Ces feuilles sont d une largeur de 1 5 4 mm pour les types sauvages et de 6 mm maximum pour les types cultiv s alors que L albus pr sente 12 20 mm et L luteus 8 15 mm Des types larges feuilles et graines Figure I 4b ont t s lectionn s en m diterran e et Europe du nord Les types sauvages pr sentent de larges graines avec un large spectre de couleur L inflorescence est en grappe et la corolle est de couleur bleue clair ou fonc et teint e de violet La domestication de L angustifolius a t r alis e en fin des 1920 en Allemagne apr s la s lection de vari t s faible taux d alcalo des Hackbarth and Troll 1956 Figure I 4 Lupinus angustifolius a plante avec feuilles et fleurs bleues b graines Unit de 1 cm 1 3 5 Lupinus luteus Le lupin jaune ou Lupinus luteus est une esp ce caract ris e par des plantes a fleurs toujours jaunes du clair au fonc Figure I 5 et qui ont t cultiv es comme plantes ornementales Gladstones 1998 Les vrais types sauvages sont rarement collect s dans la p ninsule ib rique et pr sentent des plantes a graines petites et fleurissement tardif Les graines du lupin jaune sont lisses de couleur marron noir sur un fond blanch tre et peuvent tre chez certaines vari t s de couleur jaune Les fleurs
41. 1 369 0 499 152 ISSR F3 347 pb 1 005 1 491 112 ISSR F2 132 pb 0 758 0 679 153 ISSR F3 314 pb 1 232 0 281 113 ISSR F2 115 pb 1 072 0 736 154 ISSR F3 300 pb 0 712 0 016 114 ISSR F2 746 pb 0 374 0 024 155 ISSR F3 290 pb 0 511 0 194 115 ISSR F2 736 pb 1 022 1 680 156 ISSR F3 277 pb 0 755 1 156 116 ISSR F2 594 pb 0 758 0 679 157 ISSR F3 258 pb 1 232 0 281 117 ISSR F2 480 pb 0 536 2 656 158 ISSR F3 244 pb 1 369 0 499 118 ISSR F2 307 pb 1 022 1 680 159 ISSR F3 234 pb 1 369 0 499 119 ISSR F2 137 pb 0 758 0 679 160 ISSR F3 230 pb 1 232 0 281 120 ISSR F2 774 pb 4 195 0 990 161 ISSR F3 221 pb 1 369 0 499 121 ISSR F2 571 pb 0 143 1 429 162 ISSR F3 205 pb 4 282 0 092 122 ISSR F2 522 pb 0 869 1 709 163 ISSR F3 194 pb 0 006 1 647 123 ISSR F2 350 pb 0 536 2 656 164 ISSR F3 184 pb 1 369 0 499 208 Annexes Annexe IT 5 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L cosentinii Contributions Contributions des des variables variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 165 ISSR F3 175 pb 1 525 1 194 206 ISSR FL1 724 pb 0 663 1 132 166 ISSR FL7 1550 pb 0 799 0 914 207 ISSR FL1 697 pb 1 369 0 499 167 ISSR FL7 931 pb 0 623 1 758 208 ISSR
42. 1047pb 0 94 E ACT M CAC 19 142 07pb 1599pb 0 93 E ACG M CAG 15 149 99pb 661 76pb 0 97 E ACT M CAG 38 141 00pb 1643pb 0 97 E ACT M CAT 43 138 28pb 1690pb 0 97 E AGG M CTC 20 148 97pb 2343pb 0 95 Total 275 134 26pb 2343pb 0 957 0 0134 L luteus E ACC M CAG 29 180 09pb 1126pb 0 96 E ACC M CAT 32 130 51pb 1111pb 0 96 E ACC M CTA 29 145 43pb 1014pb 0 96 E ACG M CAC 25 131 08pb 847 59pb 0 96 E ACG M CAT 28 142 07pb 1460pb 0 96 E ACT M CAC 31 132 37pb 1047pb 0 96 E ACG M CAG 16 144 26pb 631 77pb 0 93 E ACT M CAG 38 141 00pb 963pb 0 97 E ACT M CAT 31 138 28pb 1572pb 0 96 E AGG M CTC 19 148 97pb 1827pb 0 94 Total 278 130 51pb 1827pb 0 956 0 0111 78 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit La comparaison des quatre esp ces de point de vue diversit g n r e a t faite moyennant l indice de diversit de Nei ou lij Selon les valeurs obtenues La plus grande diversit a t observ e chez L luteus 0 0039151 suivi de L angustifolius et L cosentinii qui ont montr une valeur de diversit de 0 0039150 En outre la plus faible diversit a t observ e chez L albus 0 003913 Tableau IL 8 Liste des marqueurs AFLP sp cifiques obtenus pour chacune des esp ces de lupin Esp ce Amorce Marqueurs sp cifiques L E ACC M CAG 576 3
43. 142 34pb E ACG M CAC 692 41 pb 435 03pb 98pb 168 08pb 156 78pb 146 26pb 131 08pb E ACG M CAG 269 85pb 176 69pb E ACG M CAT 562 89pb 267 68pb 228 71 pb 141 74pb 137 50pb 132 37pb E ACT M CAG 397 86pb 267 26pb 196 52pb 183 79pb 79 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit IT 2 1 3 a Distances g n tiques Les similarit s entre les quatre esp ces de lupin tudi es ont t calcul es sur la base des marqueurs AFLP et en utilisant l indice de Dice Les r sultats figurent dans le tableau II 9 Les valeurs obtenues sont tr s importantes et traduisant ainsi une grande similarit entre les esp ces tudi es La similarit la plus faible 52 2 a t not e entre L luteus et L albus Aussi la similarit la plus lev a t obtenue entre L cosentinii et L angustifolius avec 63 9 Des similarit s interm diaires ont t enregistr es pour d autres couples d esp ces comme c est montr dans le tableau II 9 Tableau II 9 Pourcentages de similarit s calcul s entre les diff rentes esp ces de lupin sur la base des marqueurs AFLP L angustifolius L cosentinii L albus L luteus L angustifolius 100 L cosentinii 63 91 100 L albus 53 27 57 69 100 L luteus 56 67 52 33 52 24 100 IT 2 1 3 b Classification hi rarchique Sur la base des pourcentages de similarit s calcul s une classification en UPGMA des quatre esp ces de lupin a t r a
44. 168 FL3 658 06pb 169 FL3 489 67pb 173 FL3 308 47pb 184 FL3 149 94pb 188 FL4 936pb 198 FL4 436 37pb 205 FL4 282 51pb 208 FL4 234 77pb 211 FL4 194 47pb 226 FLS 491 59pb 233 FLS 334 92pb 248 FL6 496 40pb 261 FL6 106 78pb 270 FL7 302 37pb 297 FL8 296 82pb 298 FL8 281 33pb 299 FL8 256 33pb 304 FL8 163 13pb 331 FL9 164 52pb 338 FL10 686 56pb 339 FL10 639 33pb 345 FL10 333 58pb 347 FL10 296 27pb 360 FL11 727 52pb 367 FL11 516 79pb 380 FL11 264 26pb 383 FL11 231 33pb 386 FL11 181 87pb 111 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit L I GIII D Laos inog Figure IL 22 Repr sentation tridimensionnelle de type MDS des populations de L luteus sur la base des marqueurs ISSR 112 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit II 3 Conclusion Le pr sent travail vise approcher de la variabilit g n tique d une collection marocaine de lupin Pour ceci cette tude de la diversit g n tique du lupin a t men e au niveau inter et intra sp cifique L analyse de la diversit inter sp cifique a port e sur quatre esp ces de lupin Lupinus albus L angustifolius L cosentinii et L luteus Dans cette tude les marqueurs ISSR et AFLP ont t choisis et utilis s sur la base des ADN bulk des quatre esp ces de lupin La diversit inter sp cifique du lupin du Maroc abord e en utilisant comme moyen les marqueurs ISSR et AFLP a
45. 196 0 489 438 E ACT M CAT 351 pb 0 041 0 025 483 E AGG M CTC 577 pb 0 278 0 321 439 E ACT M CAT 341 pb 0 002 0 238 484 E AGG M CTC 534 pb 0 278 0 321 440 E ACT M CAT 335 pb 0 594 0 006 485 E AGG M CTC 498 pb 0 135 0 018 441 E ACT M CAT 328 pb 0 235 0 237 486 E AGG M CTC 473 pb 0 016 0 606 442 E ACT M CAT 325 pb 0 007 0 166 487 E AGG M CTC 430 pb 0 135 0 018 443 E ACT M CAT 315 pb 0 007 0 487 488 E AGG M CTC 375 pb 0 040 0 003 444 E ACT M CAT 298 pb 0 007 0 166 489 E AGG M CTC 362 pb 0 016 0 606 445 E ACT M CAT 282 pb 0 196 0 489 490 E AGG M CTC 353 pb 0 025 0 018 446 E ACT M CAT 280 pb 0 016 0 606 491 E AGG M CTC 338 pb 0 016 0 606 447 E ACT M CAT 276 pb 0 002 0 238 492 E AGG M CTC 324 pb 0 278 0 321 448 E ACT M CAT 270 pb 0 594 0 006 493 E AGG M CTC 303 pb 0 235 0 237 449 E ACT M CAT 261 pb 0 007 0 487 494 E AGG M CTC 290 pb 0 007 0 487 450 E ACT M CAT 251 pb 0 025 0 018 495 E AGG M CTC 275 pb 0 025 0 018 451 E ACT M CAT 245 pb 0 196 0 489 496 E AGG M CTC 268 pb 0 016 0 606 452 E ACT M CAT 237 pb 0 060 0 006 497 E AGG M CTC 257 pb 0 002 0 238 453 E ACT M CAT 230 pb 0 196 0 489 498 E AGG M CTC 222 pb 0 278 0 321 454 E ACT M CAT 219 pb 0 235 0 237 499 E AGG M CTC 213 pb 0 594 0 006 455 E ACT M CAT 216 pb 0 002 0 238 500 E AGG M CTC 206 pb 0 007 0 487 456 E ACT M CAT 213 pb 0 196 0 489 501 E AGG M CTC 195 pb 0 661 0 000 457 E ACT M CAT 209 pb 0 041 0 025 502 E AGG M CTC 184 pb 0
46. 211 pb 1 880 1 375 513 ISSR FL10 187 pb 0 127 0 788 536 ISSR FL11 191 pb 1 126 0 944 514 ISSR FL10 176 pb 2 520 0 084 537 ISSR FL11 179 pb 0 755 1 156 515 ISSR FL10 151 pb 1 369 0 499 538 ISSR FL11 166 pb 0 322 2 351 213 Annexes Annexe IL 6 Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans ACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L luteus Contributions des variables Contributions des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 1 ISSR F1 1415 pb 1 107 0 35 43 ISSR F2 282 pb 0 489 0 402 2 ISSR F1 1071 pb 0 499 0 026 44 ISSR F2 265 pb 0 492 0 005 3 ISSR F1 629 pb 0 461 0 002 45 ISSR F2 258 pb 0 069 0 034 4 ISSR F1 556 pb 0 004 0 284 46 ISSR F2 242 pb 0 174 0 002 5 ISSR F1 534 pb 0 008 0 5 47 ISSR F2 222 pb 0 142 2 602 6 ISSR F1 509 pb 0 526 0 186 48 ISSR F2 207 pb 0 424 0 050 7 ISSR F1 426 pb 0 008 0 5 49 ISSR F2 186 pb 0 325 0 247 8 ISSR F1 404 pb 0 553 0 042 50 ISSR F2 166 pb 0 000 0 267 9 ISSR F1 371 pb 0 08 0 232 51 ISSR F2 158 pb 0 082 1 517 10 ISSR F1 343 pb 0 004 0 284 52 ISSR F2 146 pb 0 276 0 117 11 ISSR F1 321 pb 0 003 0 194 53 ISSR F2 132 pb 0 408 0 000 12 ISSR F1 305 pb 0 051 0 108 54 ISSR F3 1383 pb 0 091 0 066 13 ISSR F1 293 pb 0 09 0 862 55 ISSR F3 1289 pb 1 601 0 0
47. 331 Budak H Pedraza F Baenziger PS Cregan PB Dweikat I 2003 Development and utilization of SSR to estimate genetic diversity in a collection of pearl millet germplasm Crop Sci 43 2284 2290 Castle LA Siehl DL Gorton R 2004 Discovery and directed evolution of a glyphosate tolerance gene Science 304 5674 1151 1154 Chalmers K J R Waugh J I Sprent A J Simons and W Powell 1992 Detection of genetic variation between and within populations of Gliricidia sepium and G maculata using RAPD markers Heredity 69 465 Chao S Sharp P J Worland A J Warham E J Koebner R M D Gale M D 1989 RFLP based genetic maps of wheat homoeologous group 7 chromosomes Theor Appl Genet 78 495 504 Chen XM Liu J Cheng YL 2002 HENI functions pleiotropically in Arabidopsis development and acts in C function in the flower Development 129 1085 Chen Z and Gallie DR 2004 The ascorbic acid redox state controls guard cell signaling and stomatal movement Plant Cell 16 1143 1162 Christoffels A van Gelder A Greyling G Miller R Hide T Hide W 2001 STACK Sequence Tag Alignment and Consensus Knowledgebase Nucleic Acids Res 29 1 234 8 Christopher A Cullis 2004 Plant genomics and proteomics Clements J C B J Buirchell and W A Cowling 1996 Relationship between morphological variation and geographical origin or selection history in Lupinus pilosus Plant Breeding 115 16 22 Collier R Fuchs B Walt
48. 381 pb 0 200 0 342 134 ISSR FL3 520 pb 0 023 1 357 92 ISSR FL1 365 pb 0 108 0 074 135 ISSR FL3 500 pb 0 008 0 185 93 ISSR FL1 345 pb 0 195 0 564 136 ISSR FL3 476 pb 0 272 0 533 94 ISSR FL1 309 pb 0 033 1 040 137 ISSR FL3 445 pb 0 009 0 297 95 ISSR FL1 286 pb 0 231 0 014 138 ISSR FL3 426 pb 0 000 0 073 96 ISSR FL1 280 pb 0 169 0 870 139 ISSR FL3 404 pb 0 018 0 133 97 ISSR FL1 271 pb 0 077 0 001 140 ISSR FL3 384 pb 0 000 0 008 98 ISSR FL1 263 pb 0 188 0 320 141 ISSR FL3 370 pb 0 051 0 126 99 ISSR FL1 255 pb 0 484 0 020 142 ISSR FL3 349 pb 0 063 0 145 100 ISSR FL1 248 pb 0 441 0 000 143 ISSR FL3 349 pb 0 278 0 024 101 ISSR FL1 229 pb 0 441 0 000 144 ISSR FL3 344 pb 0 053 0 001 102 ISSR FL1 205 pb 0 557 0 433 145 ISSR FL3 333 pb 0 004 0 001 103 ISSR FL1 186 pb 0 484 0 020 146 ISSR FL3 313 pb 0 130 0 137 104 ISSR FL1 164 pb 0 441 0 000 147 ISSR FL3 286 pb 0 027 0 275 105 ISSR FL1 142 pb 0 088 1 373 148 ISSR FL3 269 pb 0 063 0 117 106 ISSR FL1 127 pb 0 006 0 129 149 ISSR FL3 263 pb 0 001 0 052 107 ISSR FL1 114 pb 0 401 0 032 150 ISSR FL3 241 pb 0 008 0 117 108 ISSR FL2 414 pb 0 401 0 032 151 ISSR FL3 228 pb 0 081 0 043 109 ISSR FL2 391 pb 0 484 0 020 152 ISSR FL3 213 pb 0 040 0 019 110 ISSR FL2 362 pb 0 109 0 220 153 ISSR FL3 198 pb 0 358 0 695 111 ISSR FL2 322 pb 0 401 0 032 154 ISSR FL3 182 pb 0 082 0 531 112 ISSR FL2 306 pb 0 039 0
49. 622 29pb FLI1 136 29pb 100 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau II 22 Information et variabilit des deux axes F1 et F2 Valeur propre 1 671 1 360 Variabilit 20 891 16 994 20 891 37 886 On remarque qu en limitant la repr sentation ACP aux marqueurs ISSR uniques les 23 populations de Cosentinii sont regroup es en trois groupes distincts Le groupe 1 avec une population de Rabat Cos20 dont la repr sentation est appuy par quatre marqueurs ISSR sp cifiques Le groupe 2 avec une population de K nitra Cos09 et les six marqueurs uniques contribuant sa distribution Le groupe 3 regroupant le reste des populations de Cosentinii et les marqueurs ISSR uniques appuyant leurs repr sentations 11 2 2 2 d Repr sentation tridimensionnelle Dans le but d avoir une autre vision sur la structuration des 23 populations de Cosentinii une repr sentation tridimensionnelle ou multidimensional scaling MDS a t r alis e Figure IL 18 La repr sentation bas e sur les donn es ISSR et les distances g n tiques calcul es est repr sent e selon les axes X Y et Z On note que les 23 populations de Cosentinii sont dispers es sur l ensemble des plans Par ailleurs on arrive a retrouver le regroupement potentiel des populations pr d fini dans la repr sentation en UPGMA Les diff rents groupes ont t d limit s par des ellipses Trois groupes L c GII 1 L c GI 2 et L c GII 3
50. 733 436 ISSR FL8 416 pb 1 022 1 680 477 ISSR FL9 179 pb 1 499 0 243 437 ISSR FL8 390 pb 0 663 1 132 478 ISSR FL9 170 pb 0 059 1 219 438 ISSR FL8 363 pb 1 369 0 499 479 ISSR FL9 154 pb 1 033 0 968 439 ISSR FL8 351 pb 0 006 1 647 480 ISSR FL9 141 pb 1 880 1 375 440 ISSR FL8 328 pb 0 237 1 202 481 ISSR FL9 132 pb 0 469 0 429 441 ISSR FL8 299 pb 2 069 1 170 482 ISSR FL9 124 pb 0 775 0 868 442 ISSR FL8 277 pb 2 563 1 056 483 ISSR FL9 115 pb 0 712 0 016 443 ISSR FL8 260 pb 1 159 1 462 484 ISSR FL9 107 pb 1 369 0 499 444 ISSR FL8 241 pb 0 240 0 235 485 ISSR FL10 821 pb 0 712 0 016 445 ISSR FL8 230 pb 1 592 0 267 486 ISSR FL10 762 pb 1 369 0 499 446 ISSR FL8 219 pb 0 623 1 758 487 ISSR FL10 692 pb 0 799 0 914 447 ISSR FL8 208 pb 1 369 0 499 488 ISSR FL10 677 pb 0 235 1 453 448 ISSR FL8 194 pb 0 575 0 234 489 ISSR FL10 644 pb 0 755 1 156 449 ISSR FL8 185 pb 0 237 1 202 490 ISSR FL10 604 pb 0 034 1 243 450 ISSR FL8 180 pb 0 394 0 264 491 ISSR FL10 590 pb 1 592 0 267 451 ISSR FL8 173 pb 0 322 2 351 492 ISSR FL10 572 pb 1 005 1 491 212 Annexes Annexe IT 5 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L cosentinii Contributions des variables Contributions des variables
51. 86pb FLA4 548 49pb FLA4 386 10pb FL4 302 73pb FL6 458 30pb FL8 830 97pb FL8 379 56pb FL10 1362pb FL10 1326pb FL10 1187pb FL10 780 04pb FL10 554 14pb FL10 530 26pb FL10 340 63pb FL11 1052pb FL11 278 32pb FL11 248 11pb FL11 203 80pb FL11 146 80pb L a GII Alb09 260 0 0009833 23 F2 347 24pb F2 212 46pb FL1 572 91pb FL1 563 51pb Alb10 FL1 255 34pb FL1 247 90pb FL1 229 23pb FL1 185 93pb FL1 164 33pb FL2 391 30pb FL3 138 89pb FL3 129 32pb FLA4 801 13pb FLA4 407 78pb FLA4 160 16pb FLS5 346 45pb FL7 467 24pb FLS 755 15pb FL8 511 43pb FLS8 486 11pb FL8 207 85pb FL11 416 72pb FL11 122 63pb L a GIIT Alb0l 551 0 00208204 47 Fl 841 45pb F1 369 82pb F1 209 43pb F2 2110pb F2 1453pb Alb02 F2 1109pb F2 255 40pb F2 188 50pb F3 1276pb F3 1039pb Alb03 F4 638 41pb F4 584 32pb F4 284 84pb FL1 445 97pb Alb04 FL1 141 61pb FL2 133 17pb FL3 846 06pb FL3 776 31pb FL3 550 44pb FLA4 452 58pb FLA4 112 34pb FL6 535 73pb FL7 489 34pb FL8 122Ipb FL3 182 30pb FL3 165 14pb FLA4 616 55pb FL4 363 03pb FLA4 280 06pb FLA4 132 15pb FL5 315 90pb FL5 206 83pb FL6 908pb FL6 901pb FL7 1230pb FL7 866 64pb FL7 568 35pb FL7 377 71pb FL7 320 30pb FL7 220 10pb FLS8 261 99pb FLI0 1439pb FLI0 917pb FL10 714 70pb FL10 577 50pb FL11 909pb FL11 502 95pb 87 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit IT 2 2 1 b Classification
52. A Rafalski amp D Labuda 1994 Genome fingerprinting by simple sequence repeat SSR anchored polymerase chain reaction amplification Genomics 20 176 183 188 R f rences bibliographiques Sites web utilis s http bioinformatics psb ugent be webtools plantcare html http www bioinformatik de cgi bin browse Catalog Software Online_Tools http bioinfo genotoul fr multalin multalin html http blast ncbi nlm nih gov Blast cgi http www dna affrc go jp PLACE http www ebi ac uk Tools clustalw2 index html http evolution genetics washington edu phylip software html http www genome ou edu SeqStrategy html http www genome gov 10001812 http www lirmm fr caraux PermutMatrix http www ncbi nlm nih gov projects gorf http www tigr org http us expasy org 189 ANNEXES Annexes Annexe II 1 Electrophor se des amplifias AFLP en conditions d naturantes 1 Pr paration des plaques de verre pour l lectrophor se Les petite plaque sur laquelle va se fixer le gel et la grande plaque doivent tre bien nettoy es avec de l thanol et l eau milliQ Traitement de la petite plaque par le binding silane a methacryloxypropyl trimetoxysilane Etaler sur la plaque 1ml d une solution de bind silane 30u1 de binding silane pure 10 ml d thanol et 2 5 ml d acide ac tique glacial avec du papier sopalin Fixer le binding silane a 56C pendant 30 min Enlever l exc s du dind
53. A eee nn ARE ce gece Net ANA Ne cn Ar hte oh aust teu 132 2 8 R s ltats se een Gien ee den Ga 132 1 2 3a Analyse des s quences ADNc LaSCR1 et LaSCR2 isol es 132 1 2 3b Caract risation des diff rents domaines fonctionnelles des prot ines LaSCR1 et LaSCR2 134 1 2 3c Comparaison avec Arabidopsis thaliana SCR AISCR 2 cece eee eee eect eee eee ee ee etna eee ees 134 1 2 30 Comparaison avec d autres g nes SCR isin cei ecvaecwanids cereve ceuvdaceukwameuedaceieinceudawexdeen 135 1 2 3e Analyse fonctionnelle des deux prot ines 0 136 1 3 Structure des g nes LaSCR1 et LaSCR2 140 1 3 1 Isolement de l ADN g nomique ADNg LaSCR1 et LaSCR2 cececeeeeeeee eee es 140 1 3 1a Pr paration d une banque ADNg du lupin blanc 140 1 3 1b Criblage de la banque ADN si renier eue fat 140 1 3 2 SECUEM CAGE ne te DA MA nd du eh ie 140 1 3 SRESUItatS aie see iste center fe bette SR Re Re nes ee 141 1 3 3a Structure des deux g nes LaSCR1 et LaSCR2 et comparaison avec AISCR 141 1 4 Nombre de copies du SCR dans le g nome du Lupin blanc 143 1 9 CONCIUSION SRE RS AR Rp en ns nt 144 Partie 2 Expression du g ne Scarecrow au niveau du syst me racinaire du lupin blanc 2 1 Mat riel v g ta
54. ACG M CAG 467 52pb 218 E ACG M CAG 390 63pb 228 E ACG M CAG 269 85pb 234 E ACG M CAG 207 64pb 257 E ACG M CAT 488 99pb 259 E ACG M CAT 448 37pb 262 E ACG M CAT 404 99pb 264 E ACG M CAT 384 24pb 265 E ACG M CAT 366 67pb 273 E ACG M CAT 278 05pb 278 E ACG M CAT 241 81pb 317 E ACT M CAC 317 82pb 330 E ACT M CAC 186 78pb 348 E ACT M CAG 734 54pb 359 E ACT M CAG 477 65pb 360 E ACT M CAG 455 44pb 371 E ACT M CAG 309 32pb 372 E ACT M CAG 301 25pb 385 E ACT M CAG 196 52pb 389 E ACT M CAG 173 85pb 391 E ACT M CAG 161 37pb 394 E ACT M CAG 146 12pb 421 E ACT M CAT 576 55pb 422 E ACT M CAT 562 24pb 435 E ACT M CAT 382 16pb 456 E ACT M CAT 215 80pb 457 E ACT M CAT 212 76pb 479 E AGG M CTC 862 54pb 486 E AGG M CTC 498 18pb 501 E AGG M CTC 205 90pb 81 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit 11 2 1 3 c Analyse en composantes principales Une repr sentation en deux dimensions ou analyse en composante principale ACP a t r alis e Figure II 10 Cette repr sentation permet d avoir une vision sur les liens entre les esp ces tudi es ainsi que de visualiser les marqueurs contribuant cette repr sentation La distribution a t effectu e selon les deux axes les plus informatifs F1 et F2 apportant 48 54 de variabilit Tableau IT 10 Plusieurs marqueurs AFLP ont contribu s a la structuration des quatre esp ces de lupin Annexe II 3 Pour ce qui est de l analyse ACP
55. ACT M CAG 414 pb 0 235 0 237 404 E ACT M CAT 1118 pb 0 016 0 606 363 E ACT M CAG 398 pb 0 661 0 000 405 E ACT M CAT 1060 pb 0 041 0 025 364 E ACT M CAG 398 pb 0 236 0 383 406 E ACT M CAT 1010 pb 0 002 0 238 365 E ACT M CAG 381 pb 0 135 0 018 407 E ACT M CAT 968 pb 0 196 0 489 366 E ACT M CAG 367 pb 0 135 0 018 408 E ACT M CAT 922 pb 0 278 0 321 367 E ACT M CAG 356 pb 0 236 0 383 409 E ACT M CAT 886 pb 0 235 0 237 368 E ACT M CAG 341 pb 0 002 0 238 410 E ACT M CAT 881 pb 0 041 0 025 369 E ACT M CAG 323 pb 0 135 0 018 411 E ACT M CAT 849 pb 0 002 0 238 370 E ACT M CAG 309 pb 0 236 0 383 412 E ACT M CAT 811 pb 0 007 0 166 371 E ACT M CAG 301 pb 0 002 0 238 413 E ACT M CAT 780 pb 0 661 0 000 372 E ACT M CAG 287 pb 0 025 0 018 414 E ACT M CAT 743 pb 0 594 0 006 373 E ACT M CAG 276 pb 0 135 0 018 415 E ACT M CAT 713 pb 0 040 0 003 374 E ACT M CAG 267 pb 0 661 0 000 416 E ACT M CAT 694 pb 0 196 0 489 375 E ACT M CAG 258 pb 0 002 0 238 417 E ACT M CAT 666 pb 0 278 0 321 376 E ACT M CAG 253 pb 0 007 0 487 418 E ACT M CAT 644 pb 0 002 0 238 377 E ACT M CAG 245 pb 0 594 0 006 419 E ACT M CAT 606 pb 0 007 0 487 201 Annexes Annexe IL 3 suite Contribution des marqueurs AFLP dans les deux axes F1 et F2 de DACP r alis e dans l analyse intersp cifique
56. ADNc de LaSCRI et LaSCR2 isol es Le s quen age a permis de g n rer une s quence de 2581pb pour l ADNc de LaSCRI et une s quence de 2579pb pour Il ADNc de LaSCR2 et qui ont t obtenues apr s quatre r actions de s quen ages Ces deux s quences ont t d pos es dans la banque de g nes NCBI sous les num ros d accessions FJ236985 LaSCRI cDNA et FJ236986 LaSCR2 cDNA Les deux ADNc LaSCRI et LaSCR2 sont hautement similaires au g ne SCR d Arabidopsis thaliana L ADNc de LaSCRI pr sente un cadre de lecture ouvert ORF de 2581pb codant pour une prot ine de 776 acides amin s aa Aussi l ADNc de LaSCR2 pr sente un ORF de 2579pb codant pour une prot ine de 770 aa La comparaison des deux prot ines LaSCRI et LaSCR2 montre qu elles sont identiques a 85 132 LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR LaSCR1 LaSCR2 AtSCR HHH 58 48 116 119 62 176 AFF 106 234 234 152 289 294 202 348 352 240 408 407 295 468 467 355 527 523 415 587 583 475 647 643 535 707 703 999 767 763 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc MLSGASNNNT ee de eee ee MASEMEPTHT M
57. Cgmp kinase CAMP_Phospho_site 29 SSK 54 SGK 40 SQK 119 SSK 125 SSR Site de phosphorylation de la 158 SQR prot ine Kinase C protein 383 TTR 297 SVR kinase C phosphorylation site 452 SAR 385 TTR 457 SHK 454 SAR 558 TGK 474 SHK 625 SPK Site de phosphorylation de la tyrosine Kinase 645 RFVEAIH TYR_phospho_ site Y 138 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Tableau III 5 suite Motifs potentiels pr sents au niveau des prot ines LaSCR1 et LaSCR2 Position au S quence Position au S quence Nom du motif niveau de du niveau de du LaSCR1 Motif LaSCR2 Motif 39 SSEE 33 SSEE 60 SEME 66 SEME 120 SKVD 211 SMED 126 SRVD 271 TSHD Site de phosphorylation de la caseine 368 SHQE Kinase II CK2_PHOSPHO_ SITE 212 SMED 379 TAPD 550 TSME 274 TSHD 593 TKTE 606 SLYD 363 SATD 611 TGSD 369 THHE 630 TVVE 549 TSME 663 SYGE 738 TLVE 4 GASNNN 7 GGSNNN 13 GNNNNG 19 GSPLTS 16 GSNNNN 72 GAVVGG Site de N myristoylation 299 GVVLNQ 25 GSPLTS MYRISTYL 461 GIYATL 547 GLGTSM 78 GAIDSR 612 GSDTNT 309 GLNQNQ 640 GSFLGR 357 GGNSSM 661 GSSYGE 463 GIYATF 714 GISLSG 546 GLGTSM 730 GMFPSE 558 GNRLSD AMIDATION 558 TGKR 54 SGKR 548 LGTSMEA 547 LGTSMEA LEUCINE ZIPPER LEATGKR LEATGNR LSDFANK LSDFANK E L 139 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 1 3 Structure des g
58. Cos13 Cos04 Cosii Cosi4 Cosi8 CosO2 Cos05 Cos0 CosO1 Cos08 Cos09 CosO7 Cosi0 Figure IL 15 Profils lectrophor tiques ISSR obtenus pour les accessions de L cosentinii moyennant l amorce F1 a et F3 b et les classifications hi rarchiques en UPGMA correspondantes 92 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit I 2 2 2 Chez Lupinus cosentini L tude intra sp cifique de L cosentinii sur la base des marqueurs ISSR a port sur les 23 diff rentes accessions L chantillonnage de cosentinii a couvert une zone entre K nitra et Mohammedia 15 amorces ISSR ont permis de g n rer des profils lectrophor tiques nets Figure II 15 et ont donc t maintenues dans cette tude Un total de 547 bandes ISSR a t obtenu avec une moyenne de 36 4 bandes par amorce Tableau II 17 En fait le nombre de fragments g n r s a t variable d une amorce une autre et allait de 25 FL11 51 FL1 Le nombre de bandes g n r es tait aussi variable selon les accessions Tableau II 18 Le poids mol culaire de ces bandes tait tr s variable entre 99 88 et 1826 pb Les marqueurs ISSR utilis s ont r v l un pourcentage de polymorphisme tr s lev de 100 confirm par un indice de diversit proche de 1 En effet les valeurs de PIC variaient entre 0 94 et 0 97 avec une moyenne de 0 956 et un cart type de 0 0073 Sur la base des marqueurs ISSR obtenus les 23 accessions analys es ont pr sent pl
59. IFI Ii S26S dak 152633 p W intron KpnI 14466 Mire 1 346 4 moter a oF Nos pro Eco I 14456 ou 6 RR Rami i 492 Xho 1 14450 attR2 Sna l 13801 Arei T 13799 8 D Red ss Sp Hellsgate S ee attR1 20 KB ij Xho 1 13021 rs pam CaMV zZ Stat 22333 7 i Net qi 668 Right Border Sac Y 10600 Spec Resistance Na I SOT NPT II Nos termsnato Neri 5893 Afs GS99 74 230 Annexes Annexe IIL 7 Test histochimique de l activit 6 glucuronidase GUS Le mat riel a analyser est incub dans un tampon phosphate constitu de 1 ml de Na 2PO 0 1 M pH 7 0 1 ml de K3 Fe CN 6 0 1 M 2 gouttes K4 Fe CN 6 0 1 M Triton X 100 4mld EDTA 0 5 M PH 8 0 q s p 200 ml avec NaPO pH 7 0 A ce m lange on ajoute 200 mg du substrat Vacide 5 bromo 4 chloro 3 indolyl b D glucuronique X Gluc et on laisse homog n iser pendant 30 min Le mat riel incub dans la solution X Gluc est plac dans une cloche et infiltr sous vide pendant 10 min La suite de la r action qui produit de l acide glucuronique s effectue 37 C La coloration des chantillons est v rifi e chaque 20 30min Pour arr ter la coloration les chantillons sont transf r s dans une solution d eau Pour une meilleure vision sous microscope les chantillons sont d color s dans des bains successifs d thanol 231 Annexe III S Lis
60. ISSR FL3 689 pb 0 420 0 687 326 ISSR FL4 250 pb 1 232 0 281 286 ISSR FL3 623 pb 0 186 2 569 327 ISSR FL4 237 pb 0 755 1 156 287 ISSR FL3 597 pb 0 511 0 194 328 ISSR FL4 212 pb 0 755 1 156 210 Annexes Annexe IL 5 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L cosentinii Contributions Contributions des variables des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 329 ISSR FL4 198 pb 1 369 0 499 370 ISSR FL6 496 pb 0 146 0 321 330 ISSR FL4 180 pb 1 636 0 025 371 ISSR FL6 440 pb 0 322 2 351 331 ISSR FL4 164 pb 0 799 0 914 372 ISSR FL6 412 pb 0 712 0 016 332 ISSR FL4 163 pb 0 623 0 458 373 ISSR FL6 384 pb 1 369 0 499 333 ISSR FL4 146 pb 0 852 1 951 374 ISSR FL6 365 pb 0 511 0 194 334 ISSR FL4 134 pb 0 892 0 938 375 ISSR FL6 355 pb 1 232 0 281 335 ISSR FL4 123 pb 0 235 1 453 376 ISSR FL6 334 pb 1 369 0 499 336 ISSR FL4 114 pb 1 190 0 516 377 ISSR FL6 317 pb 1 369 0 499 337 ISSR FL4 100 pb 1 821 1 226 378 ISSR FL6 299 pb 0 511 0 194 338 ISSR FL5 684 pb 2 773 1 446 379 ISSR FL6 288 pb 0 374 0 024 339 ISSR FL5 625 pb 3 063 1 693 380 ISSR FL6 281 pb 1 369 0 499 340 ISSR FL5 515
61. KVVTVVEODM he ske she she de ke ke he he ke she she he ke le he eT 1Q0 EEGLHLLTLL he ke she he he de he he he he ohe de he he MT he SCLGIYATLP Wee eke Ee Wo ee eT we B PVADKVGNLD DEY eee LE 4 de he ke she ke SNAGS de e aa GRF he de de he MH de he fl ot te te he he he he he he she he see he he he her ae he ne ne ne ne he he ae me ne ne ne ne le ae oder ne ne ne ne he he he he he she he he le le he he pod ke she she Dee ba oe eae RS Figure III 4 Alignement des s quences de LaSCR1 LaSCR2 et AtSCR I VAIID Leucine heptad II PFYRE et SAW 57 60 47 115 118 61 175 176 105 233 233 TSF 288 293 201 347 351 239 407 406 294 467 466 354 52 522 414 586 582 474 646 642 534 706 702 594 766 762 653 776 770 Les lignes pointill es d finissent les cinq domaines fonctionnels Leucine heptad 133 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 1 2 3 b Caract risation des diff rents domaines fonctionnels des prot ines LaSCRI et LaSCR2 A partir des deux s quences ADNc de LaSCRI et LaSCR2 les deux prot ines correspondantes ont t d duites l aide du programme ORF Finder propos par NCBI La comparaison des deux prot ines montre qu elles sont divergentes au niveau de leurs parties N terminale En comparaison avec LaSCRI la prot ine LaSCR2 pr sente 60 substitutions 13 insertio
62. LaSCR1 wm wy eee me me wy ee Actin SSL Figure III 22 Une RT PCR des ARN isol s de plantes SCRi et Myoi transform es par la m thode de trempage racinaire L actine a t utilis e comme marqueur interne pour quilibrer la quantit d ARN utilis X rO LaSCR1 500 bp LaSCR2 650 bp Actin 550 bp Figure III 23 RT PCR des ARN isol s de plantes de lupin SCRi et Myoi transform es par la m thode d injection L actine a t utilis e comme marqueur interne pour quilibrer la quantit d ARN utilis 168 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 4 3 Silencage du g ne MtSCR chez Medicago truncatula 4 3 1 R sultats 4 3 1 a Analyse morphologique des racines transg niques des mutants LaSCRi La transformation de Medicago truncatula par A rhizogenese avec le vecteur d ARNi contenant un fragment du g ne SCR du lupin a permis de g n rer des plantes composites En effet seul le syst me racinaire ou racines chevelues est transg nique La comparaison entre les plantes transg niques LaSCRi et les plantes t moins Myoi montre une nette diff rence au niveau de leurs ph notypes Figure IIL 24 Les plantes LaSCRi pr sentent une r duction claire au niveau de la taille du syst me racinaire en comparaison avec les plantes t moins Figure IIL 24 Ph notype des plantes Medicago truncatula transform es par rhizogenese avec le vecteur d ARNi contenant
63. Lupinus albus var Ultra ont t cultiv es dans la chambre de culture une temp rature de 20 15 C et un cycle de 16 8 h lumi re obscurit Johnson ef al 1996 Les plantes sont arros es un jour sur deux avec 500 ml de solution nutritive contenant du phosphore P sans phosphore P sans azote N ou sans fer Fe Les plantes t moins P re oivent 500 ml de solution nutritive compl te contenant 3 0 mM KNOs3 2 5 mM Ca NO3 0 5 mM Ca H2P0 2 1 0 mM MgS0 12 0 mM Fe as FeEDTA 4 0 mM MnCb 22 0 mM H3BO3 0 4 mM ZnSO 0 05 mM NaMoOQ et 1 6 mM CuSO4 Par contre Les plantes cultiv es en conditions de carences re oivent diff rentes solutions nutritives Ainsi 123 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc en cas de stress phosphorique P 0 5 mM de CaSO est ajout e au lieu de 0 5 mM de Ca H2PO Dans le cas d une carence d azote N 3 mM de KCL est ajout e au lieu de 3 mM de KNO3 et 2 5 mM de CaSO au lieu de Ca NO3 2 Alors que les plantes cultiv es en conditions de stress ferrique Fe ne re oivent pas le FEEDTA Les racines normales RN les racines proteoides RP et les feuilles F du lupin ont t collect es apr s 12 et 14 Jours apr s mergence JAE Les ARN totaux ont t isol s et purifi s annexe III 1 et utilis s pour la pr paration des cibles radioactives Les ARN totaux ont t ainsi reversement transcrits et marqu s par l isotope PdATP
64. SSR se base sur amplification par PCR de l ADN g nomique moyennant des amorces sp cifiques flanquant les s quences r p t es et la s paration des amplifias par lectrophor se sur gel de polyacrylamide Les SSR se sont r v l s des marqueurs mol culaires tr s utiles dans la s lection assist e par marqueurs l analyse de la diversit g n tique et l analyse de la g n tique des populations chez plusieurs esp ces Gupta 2000 Budak ef al 2003 20 Revue bibliographique 11 1 6 Les marqueurs SNP Les marqueurs SNP single nucleotide polymorphism sont une source importante de polymorphisme de l ADN Le changement d un nucl otide par un autre est un processus biallelique codominant Ceci peut tre un processus synonyme n entra nant pas de changement de l acide amin ou encore non synonyme entra nant la substitution d un acide amin par un autre Le changement au niveau d un nucl otide peut aussi provoquer la cr ation abolition d un site d pissage ou encore un stop pr coce mutation non sens Chez les plantes les SNP sont des marqueurs g n tiques utilis s dans plusieurs tudes de populations dans le marquage des germplasmes dans la cartographie de g nes et dans les associations g notype ph notype Giancola S et al 2006 Chez les plantes le mais est consid r tr s polymorphe avec une moyenne d un SNP par 104 pb Tenaillon et al 2001 le bl pr sente un SNP tous les 200 bp Ravel et al 2004 le soj
65. TH 1999 Transcription factors and their genes in higher plants functional domains evolution and regulation Eur J Biochem 262 247 257 Liu Q Zhang Y Chen SY 2000 Plant protein kinase genes induced by drought high salt and cold stresses Chinese Science Bulletin 45 13 1153 1157 Lim Jun Yrjo Helariutta Chelsea D Specht Jee Jung Lynne Sims Wesley B Bruce Scott Diehn and Philip N Benfey 2000 Molecular Analysis of the SCARECROW Gene in Maize Reveals a Common Basis for Radial Patterning in Diverse Meristems The Plant Cell Vol 12 1307 1318 Lim J Jung JW Lim CE Lee M H Kim BJ Kim M Bruce WB Benfey PN 2005 Conservation and diversification of SCARECROW in maize Plant Molecular Biology 59 619 630 Limpens E Ramos J Franken C Raz V Compaan B Franssen H Bisseling T and Geurts R 2004 RNA interference in Agrobacterium rhizogenes transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula J Exp Bot 55 983 92 Lu MH and Chen JF 2004 Genetic engineering of plant for cold tolerance Acta Bot Boreal Occident Sin 24 10 1953 1958 Ma Z Q and N L V Lapitan 1998 A comparison of amplifed and restriction fragment length polymorphism in wheat Cereal Res Commun 26 7 13 Mackill D J Z Zhang E D Redona and P M Colowit 1996 Level of polymorphism and genetic mapping of AFLP markers in rice Genome 39 969 977 181 R f rences bibliographiques Maheswaran M P K Sub
66. and J B Reid 1995 Partioning and distribution of RAPDvariation in a forest tree species Eucalyptus globulus Myrtaceae Heredity 74 628 637 Neumann G Massonneau A Martinoia E Romheld V 1999 Physiological adaptations to phosphorus deficiency during proteoid root development in white lupin Planta 208 373 382 Neumann G Massonneau A Langlade N Dinkelaker B Hengeler C Ro mheld V Martinoia E 2000 Physiological aspects of cluster root function and development in phosphorus deficient white lupin Lupinus albus L Annals of Botany 85 909 919 Neumann G and Martinoia E 2002 Cluster roots an underground adaptation for survival in extreme environments Trends Plant Sci 7 162 167 Nybom H 1994 DNA fingerprinting a useful tool in fruit breeding Euphytica 77 59 64 O Brian M R and Vance C P 2007 Legume Biology Sequence to Seeds Plant Physiology Vol 144 p 537 Ouenzar B Hartmann C Rode A and Benslimane A 1998 Date Palm DNA Mini Preparation without Liquid Nitrogen Plant Molecular Biology reporter 16 263 269 Parisi M Nuttall R Edwards P Minor J Naiman D Lu J Doctolero M Vainer M Chan C Malley J Eastman S and Oliver B 2004 A survey of ovary testis and soma biased gene expression in Drosophila melanogaster adults Genome Biol 5 R40 183 R f rences bibliographiques Penaloza E Gutierrez A Martinez J Munoz G Bravo L A and C
67. au Maroc Structuration de la diversit II 1 2 Protocole d extraction des ADN du lupin Afin de trouver un protocole d extraction d ADN convenable pour le lupin nous avons consult plusieurs protocoles d ADN de plantes Deux principaux protocoles d extraction ont t retenus du fait qu ils r pondaient parfaitement nos besoins savoir la faisabilit au laboratoire et une technicit raisonnable 11 1 2 1 Extraction de VADN total du lupin selon le protocole de BERNATSKY et TANKSLEY 1986 Le premier protocole choisi est celui d velopp par BERNATSKY et TANKSLEY en 1986 et qui a t largement utilis chez de nombreuses familles de plantes Gramin es Orchid es Conif res Foug res et L gumineuses Ce protocole est convenable pour l extraction des ADN a partir de tissus frais ou s ch s Il est caract ris essentiellement par l utilisation du C thyl Trim thyl Ammonium Bromide CTAB Le protocole de BERNATSKY et TANKSLEY pr conise l extraction d ADN partir de 200 mg de feuilles fraiches finement d coup es Le mat riel v g tal est broy l aide de mortier et pilier pr refroidis et dans 700 ul de tampon d extraction 0 14 M de Sorbitol 0 22 M Tris pH 8 0 0 22 M EDTA 1 8 M NaCl 15 g l de CTAB et 1 de B m rcapto thanol Apr s homog n isation du broyat on ajoute 300 ul de tampon d extraction et on broie nouveau pendant 5 mn et on transfert l homog nat dans un nouveau tube eppendor
68. bandes nettes obtenues aussi appel es marqueurs sont d tect es Ces bandes sont not es 1 pour pr sence et 0 pour absence A partir des matrices de pr sence absence nous avons calcul l indice de diversit ou PIC Polymorphism Information Content d crit par Bostein et al 1980 et modifi par Anderson et al 1993 PIC 1 gt Pi Pij tant la fr quence du marqueur r v l e par l amorce j Par la suite nous avons compar les diff rents chantillons tudi s par paires Les distances g n tiques ont t calcul es l aide de l indice de diversit de Dice Cet indice peut se calculer comme suit a le nombre d all les communs aux deux populations x et y b le nombre d all les dans la population x c le nombre d all les dans la population y A partir des distances g n tiques calcul es entre les diff rents chantillons tudi s une classification hi rarchique en UPGMA unweighted pair group method arithmetic average ainsi qu une repr sentation tridimensionnelle ou multidimensional scaling MDS ont t labor es moyennant GelComparll 65 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Les dendrogrammes et les MDS ont engendr un certain nombre de groupes et sous groupes Ces groupes form s ont t compar s sur la base de leur diversit calcul e par I indice de diversit de Nei comme suit I ij 2 Pij 1 Pij Pij tant la fr quence d un marqueur i dans la
69. c GI 2 L c GH 1 L c GII 2 et L c GII 3 ont t caract ris s par plusieurs marqueurs ISSR en commun Par ailleurs un certain nombre de marqueurs ISSR uniques ont t enregistr s Tableau IL 21 Le nombre de marqueurs uniques variait entre 226 pour L c GII 2 et 782 pour L c GII 3 Tableau IL 21 Le degr de diversit de chacun des cinq sous groupes a t valu moyennant l indice de diversit de Nei Le sous groupe L c GH 1 repr sentant les populations de la r gion de K nitra et de Rabat montre le plus diversit Par contre le sous groupe L c GII 2 est d fini par deux populations peu loign es g ographiquement Une population originaire de Rabat Cos14 et une de T mara Cos13 pr sentent le degr de diversit le plus faible 0 036 I1 2 2 2 c Analyse en composantes principales L analyse en composantes principales ACP des 23 populations de Cosentinii a t labor e sur la base des marqueurs ISSR Figure II 17 L ACP a t r alis e selon les deux axes F1 et F2 apportant 20 59 de variabilit Tableau II 22 On remarque que les 23 populations sont group es au niveau de la moiti positive de l axe F1 La structuration a t appuy e par plusieurs ISSR L apport et la contribution de chaque ISSR ont t r sum s au niveau de l annexe II 5 99 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau II 21 Marqueurs ISSR sp cifiques pour chaque groupe de L cosentinii
70. cosentinii L luteus tant une esp ce cultiv e dont les graines proviennent de la r gion de K nitra L cosentinii est une esp ce sauvage que l on a r colt e dans la r gion de Rabat Ryad 59 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit 11 1 3 1 Optimisation du m lange r actionnel de amplification RAPD PCR Le protocole de Williams et al 1990 a t utilis comme protocole de base pour amplification RAPD et partir duquel nous avons commenc la s rie d optimisation des composants du m lange r actionnel 1 La concentration de l ADN tant un param tre tr s important de la PCR Nous avons test quatre concentrations diff rentes 30 ng 60 ng 90 ng et 120 ng 2 La concentration du MgCl est tr s critique dans tout m lange r actionnel Nous avons ainsi essay quatre concentrations diff rentes 1 5 2 0 2 5 et 3 0 mM 3 Les dNTP ont t aussi un facteur optimiser Nous avons essay les concentrations de 100 150 200 et 250 uM 4 La concentration des amorces a t aussi un facteur influen ant le profil de Vamplification Quatre concentrations ont t test es 0 1 0 15 0 2 et 0 25 mM Deux facteurs cl du programme d amplification ont t optimis s la temp rature d amorcage que nous avons fait varier entre 30 C 32 C 35 C et 40 C et le nombre de cycles d amplification essay s 40 50 60 et 65 cycles 11 1 3 2 Protocole d amplification de VADN par la RAPD PCR
71. d engrais de phosphate sont non renouvelables exemple des rochets de phosphate et seront puis es dans les prochains 60 90 ans Runge Metzger 1995 Aussi l utilisation excessive des engrais peut polluer les cours d eau locales et entra ner le processus deutrophisation Withers et al 2001 Pour rem dier ce genre de situations une meilleure gestion des engrais en phosphate est n cessaire ainsi que le d veloppement de cultures capables d acqu rir ou d utiliser le phosphore plus efficacement Certaines plantes d veloppent des m canismes d adaptations permettant l assimilation du phosphore du sol Hammond J ef al 2004 C est le cas du lupin blanc qui pr sente une tol rance particuli re au stress phosphorique Dinkelaker et al 1989 Gardner et al 1982 En effet cette plante s adapte la carence phosphorique avec une modification morphologique du syst me racinaire qui s accompagne par une adaptation biochimique consistant en la s cr tion d acides organiques et l expression d un ensemble de g nes Ces modifications accroissent l acquisition du phosphate par le lupin blanc Liu et al 2001 Neumann ef al 1999 Penaloza et al 2002 Uhde Stone et al 2003 Grace a sa tol rance extr me au stress phosphorique le lupin blanc est devenu une plante mod le pour l tude de l adaptation des plantes la carence phosphorique IV 2 1 Adaptation morphologique Racines proteo des Le lupin blanc et la plupart des membres d
72. dans la banque de g nes NCBI Tableau II 3 Liste des marqueurs d expression utilis s dans les filtres ADN Marqueur Code Annotation Expression chez le lupin blanc EST MI 371_F Similaire au cytokinin oxidase RP de 14 JAE et RN P P M2 847_F Similaire au cytokinin oxidase M3 Myosine g ne humain Pas d expression M4 468_F Alfa tubuline RP RN P P et F P P M5 187_F Formamidase RP de 14JAE M6 901_F Novel phosphatase RP P RN P et F P M7 1359_F Polyubiquitine RP RN P P et F P P M8 131_F MATE M9 449 F MATE M10 471_F MATE M11 584_F MATE MI2 685 F MATE Fra M13 429 F MATE M14 1020_F MATE M15 1160_F MATE M16 1281_F MATE M17 1297_F MATE M18 1141_F NAD dependent glyceraldehyde RN P P F P P et 3P Dehydrogenase surexpression au niveau des RP RP racines proteoides RN racines normales F feuilles JAE jours apr s emergence P P conditions de culture en absence pr sence de phosphore JAE jours apr s emergence 122 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc III 1 1 Approche exp rimentale III 1 1 1 Pr paration des Filtres a ADNc Les clones EST sont ins r s dans le vecteur pbluescript et stock s dans du glyc rol a 80 C Ces clones ont t mis en culture dans du milieu LB additionn d ampicilline 4 37 C pendant 16 a 18h A partir de ces cultures liquides les plasmide
73. de SCR dans le d veloppement racinaire normal chez Medicago truncatula IPS FF FL A J MtSCR Figure III 25 RT PCR des ARN des plantes LaSCRi de Medicago truncatula SCRil SCRi8 et des plantes t moins Cnt1 Cnt4 Le g ne actine est utilis comme transcrit invariant pour quilibrer la quantit d ARN 170 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 4 4 Conclusion La transformation de Lupinus albus et de Medicago truncatula avec le vecteur LaSCR ARNi a permis de g n rer des plantes composites avec un ph notype visible Les plantes SCRi montrent un syst me racinaire plus r duit que celui des plantes t moins Ce ph notype a t accompagn par une r duction de l expression des g nes SCR LaSCR1 LaSCR2 et MtSCR L efficacit de LaSCR ARNi dans la diminution du transcrit de SCR chez le lupin et la luzerne et la r duction du syst me racinaire montrent la conservation de la fonction de SCR et son r le dans le d veloppement racinaire chez les l gumineuses Le ph notype visuel observ chez Lupinus albus et Medicago truncatula ARNi a t similaire celui obtenu au niveau des mutants T DNA scr 1 et scr 2 d Arabidopsis thaliana Di Laurenzio et al 1996 et aussi au niveau des plantes ARNi d Arabidopsis SCRi 1 et SCRi 2 Cui et al 2007 171 CONCLUSION GENERALE Les l gumineuses pr sentent une grande importance en tant que cultures vivri res dans le monde
74. de l activit B glucuronidase GUS Annexe IILS Liste des amorces utilis es SOMMAIRE INTRODUCTION GENERALE 8 antes un aile add uadaadstes 1 CHAPITRE I Revue bibliographique INTRODUCTION ESS RSS nt a a ct a a ciated ne t de nt fades 4 IL genre Lupinus SR AA tt et ESEE IAEE E 4 ACIASSTIOAON saaie cere SN eden E Nes une 4 l 2 Description DOLARIQUC ss Re te tete a alan een ence end ne aan Le 5 l 3 Le lupin du Mal OCS eater dcectuan ensia nade heer ne anea a seeped E a a aE EN EE ei 7 3 1 gt UDINUS albu Sn nean eer a a a A E r pia A ES oaea 7 13 2 LU DINUS COSBITEU scadunuisienoti eae rinin n EEEa r nE D ETE EEEE N REEERE SEE i 8 PL UIDIN US DIOSUS SR ama tt E Mie calle Site esa aii ate E A E ine ea 9 l 3 4 Lupinus QNOUSINONUIG satiate jo er nn den tn Ochod oak kaa d 10 ESS Lupinus IIS 8082006 seman nee aie a Ra see Geeta yep is E ete ioe hens lente EUR Ee seeks 10 3 6 gt LUDINUS GHANUCUS ccs sexed sae ieee nes idiee aweueianenk toad anda Mode O aaa vena gelaewsaneniacbas 11 l 4 Phylog nie du LUDIN ete tk be tet ile Nace tA ih aha Ahr ia cnn Ad Saha ed cd gate 12 ll Approches de la diversit mol culaire 14 Il 1 Marqueurs mol culaires pour l tude de la diversit g n tique 14 HET T bes Marqueurs APP ie duc moe wiser nd aaeinededea S siemens 15 ll 4 2 Les marg e rs RAP D bai tien ns tt de AN it nt id tae 16
75. development Nature 417 962 966 Fiehn O 2002 Metabolomics the link between genotypes and phenotypes Plant Mol Biol 48 155 171 Field D and Wills C 1996 Long polymorphic microsatellites in simple organisms Proc R Soc Lond 263 209 215 Fire A Xu S Montgomery M Kostas S Driver S Mello C 1998 Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature 391 6669 806 11 Fleischmann RD Adams MD White O Clayton RA Kirkness EF Kerlavage AR Bult CJ Tomb JF Dougherty BA Merrick JM and al 1995 Whole genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd Science 269 496 512 Fourmann M Barret P Froger N Baron C Charlot F Delourme R Brunel D 2002 From Arabidopsis thaliana to Brassica napus development of amplified consensus genetic markers ACGM for construction of a gene map Theor Appl Genet 105 1196 1206 Gardner WK Parberry DG Barber DA 1982 The acquisition of phosphorus by Lupinus albus L I Some characteristics of the soil root interface Plant Soil 68 19 32 Gesch RW Kang IH Gallo Meagher M 2002 Rubisco expression in rice leaves is related to genotypic variation of photosynthesis under elevated growth CO2 and temperature Plant Cell Environm 26 12 98 107 Giancola S McKhann H Berard A Camilleri C Durand S Libeau P Roux F Reboud X Gut I G Brunel D 2006 Utilization of the three high throughput SNP genotyping
76. du TBE 1X D poser les chantillons produits PCR et les marqueurs de poids mol culaire Lancer la migration lectrophor tique 200V pendant 16h 4 R v lation du gel au nitrate d argent S parer les deux plaques minutieusement Fixer le gel en mettant la petite plaque dans une solution d thanol 10 v v pendant 10 min Rincer le gel l eau bi distill e 3 fois pendant 30 s chaque Mettre dans une solution d acide ac tique 1 v v pendant 3 min Rincer l eau bi distill e 3 fois pendant 30 s chaque Mettre dans la solution une solution de coloration avec du nitrate d argent 0 2 p v pendant 25 min Rincer l eau bi distill e 3 fois 30 s chaque Laisser le gel dans la solution de r v lation avec 3 p v de carbonate de sodium et 0 02 v v de formaldehyde 37 jusqu obtention de l intensit d sir des bandes Arr ter le d veloppement en laissant le gel 10 min dans une solution d acide ac tique glacial 10 v v Rincer le gel l eau bi distill e st rile Laisser le gel s cher avant de prendre des photos 193 Annexes Annexe II 2 Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intersp cifique Contributions Contributions des des variables variables Code Marqueur F1 F2 Code M
77. e l aide du Kit de d tection DIG Nucleic Acid Detection Kit Roche Applied Science et selon les instructions donn es L anticorps anti DIG a t utilis la concentration de 1 100 et pour incubation de 12 20h Le signal a t d tect en utilisant la phosphatase alcaline de substrats NITROBLUE t trazolium et le 5 bromo 4 chloro 3 indolyl18 phosphate La figure III 18 r sume les r sultats obtenus On remarque que l expression du LaSCRI a t observ e au niveau de l endoderme et du centre quiescent de la pointe racinaire du lupin Les chantillons t moins hybrid s par les sondes de LaSCRI sens ne montrent aucun signal Cette exp rience a t confirm e deux fois Une exp rience similaire a t men e sur les racines proteoides afin de v rifier l expression du LaSCRI ce niveau Les ARNm du LaSCRI ont t d tect s au niveau de la couche d endoderme des racines proteoides avec un profil similaire celui observ pour les racines normales Le profil d expression du LaSCR1 obtenu au niveau des racines normales et proteo des du lupin est similaire celui observ chez plusieurs esp ces de plantes a savoir A thaliana Malamy amp Benfey 1997 Zea mais Lim et al 2000 2005 Pisum sativum Sassa et al 2001 Orisa sativa Kamiya et al 2003 et Pinus sylvestris Laajanen et al 2007 Nous avons aussi observ une diminution de l expression de LaSCRI au niveau des cellules filles du cortex des r
78. e 7 8 fois avec de l eau distill e st rile Les graines sont ensuite incub es 2 min dans du chlore et rapidement rin es avec de l eau distill e st rile Les graines sont ensuite incub es dans de l eau distill e st rile pendant 2 5 jours l obscurit et 4 C L eau est chang e chaque jour Les graines sont ensuite pr germ es sur boites de p tri contenant de agar 1 Les boites sont invers es et incub es pendant 24 30h a l obscurit et temp rature ambiante Les plantules avec des radicelles de 1cm de long sont id ales pour la transformation Ainsi et dans des conditions st riles 3 mm des pointes des radicelles sont coup es et tremp es dans la solution d Agrobaterium avec le vecteur recombinant d int r t Huit plantules sont ensuite transf r es sur des boites claires de 100X100 mm contenant du milieu Fahraeus modifi voir annexe IILS pour la composition et additionn de 27 5 ug ml de kanamycine Les boites sont ensuite incub es verticalement dans une chambre de culture avec 21 C et 16h 8h de lumi re obscurit Les racines chevelues apparaissent apr s une dur e de 7 10 jours Par ailleurs la collecte des plantes se fait apr s 14 21 jours de culture en s assurant que les racines transform es ont atteint 1 5 2 cm de long Seules les racines transform es et suppos es tre transg niques sont r colt es 3 1 3 2 b Localisation de l expression pLaSCR2 GUS L expression du promote
79. es de 400 770 acides amin s et partagent une similitude importante le long de la partie terminale Cette s quence est caract ris e par cing motifs distincts Figure I 14 dans l ordre suivant Leucine haptad repeat I LHRI le motif VHHD Leucine heptad repeat II LHRIT le motif PFYRE et le motif SAW LS RRX LHRI VHIID LHRIT PFYRE SAW RS LULU Figure I 14 Sch ma repr sentant les cinq domaines fonctionnels de la s quence conserv e des produits de la famille GRAS Les motifs LHRI et LHRII ne sont pas fr quemment pr sents dans la structure Le motif LHRI comprend deux unit s s par es par un espaceur riche en proline et connu pour sa fonction d interrompre la structure alpha h lice La pr sence des motifs LHR dans les produits de la famille de GRAS sugg re que la prot ine fonctionne comme multim re Hurst 1994 Le motif VHIID non conserv est reconnaissable par les r sidus P N H D Q L Pro Asn His Asp Gln Leu et nomm selon les r sidus les plus conserv s V H I I D Val His Ile Ile Asp Au niveau de la prot ine SCR la pr sence des motifs LHR I LHR II et VHIID joue un r le dans l interaction prot ine prot ine entre SCR et SHR 42 Revue bibliographique Periclinal Division oob Anticlinal Division EN Epidermis Vasculature EM Cortex EM CortewEndodermal Initial GB Endodermis BEM Epidermal Root Cap Initial Pericycle Quiescent Center Wild Type scarecrow EN Mutant Layer D Roo
80. et membranes et aussi dans le m tabolisme de l nergie Raghothama 1999 N anmoins le phosphore demeure un l ment inaccessible et indisponible de part sa faible concentration dans le sol qui est de l ordre de 2 a 10 uM Raghothama 1999 et Racine secondaire Racines tertiaires radicelles Figure I 16 Racines proteoides de Lupinus albus cultiv en carence Phosphorique P 47 Revue bibliographique Figure 1 17 Racines proteo des r colt es de plantes cultiv es en condition de carence phosphorique P a coupe transversale d une racine proteoide sectionn e 1 cm de la pointe apicale b coupe longitudinale d une racine proteo de sectionn e 2 cm de la pointe apicale Les sections ont t color es avec de la safranine et du vert Fast green Fl ches solides D veloppement des m rist mes des racines tertiaires Fl ches en pointilles pericycle X Xyl me P Phlo me Le diam tre de la racine est de 1 mm Le grossissement est de 100 X Johnson J et al 1996 48 Revue bibliographique aussi du fait qu en conditions acides le phosphore forme des complexes insolubles avec des cations en particulier l aluminium Al et le fer Fe En cons quence 30 40 du rendement des r coltes des terrains cultiv s du monde est limit e par la disponibilit du phosphore Runge Metzger 1995 Pour ceci l apport d engrais phosphat est n cessaire pour les cultures N anmoins les sources naturelles
81. hi rarchique Les pourcentages de similarit de Dice calcul s entre les diff rentes accessions de L albus ont t utilis s pour r aliser une classification hi rarchique en UPGMA Figure IT 12 La classification probable des 10 accessions de L albus montre le regroupement de ces accessions un pourcentage de similarit de 75 en trois groupes distincts le groupe L aGI form de quatre accessions g ographiquement loign es Alb05 Douar beni moussa Alb06 et Alb07 Mekn s et Alb08 El jadida le groupe L aGII avec les deux accessions de Marrakech Alb09 et Alb10 le troisi me groupe L aGIII est d fini par quatre accessions une de Benslimane Alb01 deux de Bousnika Alb02 et Alb03 et une de Souk larbaa Alb01 A un degr de similarit plus lev 77 on peut d finir deux sous groupes au sein du groupe L aGI Le sous groupe Alb05 A1b06 et le sous groupe Alb07 A1b08 D un autre c t chacun des trois groupes a permis de g n rer un nombre de fragments ISSR variable Le groupe L aGI a g n r le nombre le plus lev de bandes avec 554 Le groupe L aGIII a r v l 551 bandes ISSR Le groupe L aG I montre le nombre le plus faible de fragments avec 260 La variabilit des trois groupes d duite par le nombre de bandes ISSR obtenues est aussi appuy e par la moyenne de diversit de chaque groupe Tableau II 15 Des 1365 fragments ISSR obtenus 110 8 05 ont t sp cifiques Tableau II 15 40 marqueurs sp cif
82. ieee ene es 80 ll 2 1 3 b Classification hi rarchique Sa sscedind biwbbe dus bastide beowebbdouacled ids 80 11 2 1 3 c Analyse en composantes principaleS cess eessesseeeeeeeneenennnnnceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeess 82 Il 2 2 Analyse de la diversit intra sp cifique eeeaeaeaeaeaees 84 Il 2 2 1 Chez Lupinus albus M RAR de Us AO AN ee nan 84 ll 2 2 1 a Distances g n tiques sacuinsvevereayviasalscsviedacasansstes inden exsen snes ae iso 84 ll 2 2 1 b Classification TlCTarc iQue sans dates far nano dala nt taf 88 11 2 2 1 c Analyse en composantes principales 90 ll 2 2 1 d Distribution tridimensionnelle 22e nnnanantiniatentnnetiinnb 90 Il 2 2 2 Chez Lupinus COS land arsenal anne sens tan dar AR 93 ll 2 2 2 a Distances g n tiques sheep ia hat care Sa AS a ON eat tat bata 97 ll 2 2 2 b Classification hi rarchique sr veuar4yaqaea vodigaavacduad rates nage 97 11 2 2 2 c Analyse en composantes principales 99 11 2 2 2 d Repr sentation tridimensionnelle 0 101 ll 2 2 3 Chez Lupinus luteus AS AR AN AP ct te AA ni Ne tn tt tnt 105 11 2 2 3 a Matrice des distances g n tiques ceccececeec eee eneee eee eeeeeeeeeeeeeeeaeeeeeeeaees 106 11 2 2 3 b Classification hi rarchique ccccccceeceeeec eee eeeeaeeeeeeeeeeeeeeenneaeeeenneantaees 108 11 2 2 3 c Analyse en composantes principales 110 11 2 2 3 d Distribution tridimensionn
83. indice de diversit de Nei lij Pour les marqueurs ISSR les valeurs de diversit Iij ont t de l ordre 0 1073198 pour L luteus de 0 01074605 pour L albus de 0 01074744 pour L angustifolius et de 0 1076404 pour L cosentinii Ceci sugg re que L cosentinii qui est une esp ce sauvage pr sente le plus de diversit g n tique alors que l esp ce cultiv e L luteus montre une faible diversit 113 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Les marqueurs AFLP par contre proposent un autre sch ma de diversit des quatre esp ces Les valeurs de diversit de Nei taient de 0 003913 pour L luteus de 0 0039150 pour L angustifolius et L cosentinii et de 0 0039151 pour L albus Ainsi en utilisant les marqueurs AFLP L albus a montr le plus de diversit par rapport L luteus qui pr sente la plus faible diversit Notons que ces deux esp ces de lupin sont les deux esp ces de lupin cultiv es au Maroc D un autre c t la similarit entre les esp ces de lupin a t calcul e moyennant l indice de diversit de Dice et sur la base des marqueurs ISSR et AFLP Les r sultats obtenus ont t utilis s pour laborer une classification hi rarchique en UPGMA et une analyse factorielle A la lumi re des r sultats obtenus deux sch mas potentiels de classification des quatre esp ces ont t propos s La deuxi me partie de ce travail a port sur l tude de la diversit intra sp cifique de L alb
84. la zone 3 repr sente longation des initiales des proteoides travers le cortex la zone 4 d finit les racines proteoides non d velopp es alors que la zone 5 correspond aux racines proteoides compl tement d velopp es Figure II 9 La zone 5 pr sente l tat finale et mature de d veloppement des proteoides du fait de leurs d veloppement d termin Cette exp rience a t r alis e en trois r p titions 144 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc zone 3 i zone 1 Figure III 9 Les diff rentes zones des racines proteoides d finissants les stades de d veloppement des radicelles La racine est color e au bleu de m thyl ne et blanchie au chlore 2 1 2 Extraction de CARN Les ARN ont t isol s partir des feuilles et racines collect es l aide du Kit d extraction d ARN RNAeasy Kit Invitrogene et trait s la DNAase selon les instructions du Kit DNA free Ambion Inc Austin TX USA Les ARN ont t quantifi s et stock s 80 C 2 1 3 Pr paration des ADN compl mentaires Les ARN extraits ont t r trotranscrits en ADNc en utilisant le Kit de superscript reverse transcriptase Invitrogene Ainsi dans un volume final de 12 ul contenant lug d ARN et 1 ul de primer oligodT les ARN sont d natur s pendant 5 min 4 65 C et refroidis pendant 10 min dans la glace A ce m lange on ajoute 5 uL du tampon First Strand 5X 2 uL de DTT 0 1 M 1 uL de dNTP
85. la nature de cet EST par alignement de sa s quence dans la banque de g nes NCBI a donn le r sultat suivant gblu 2798 1 aTu62798 Arabidopsis thaliana SCARECROW SCARECROW1 _446 S quences produisant un alignement significatif Score E Bits Value dbj AB048713 1 Pisum sativum PsSCR mRNA for SCARECROW 813 0 0 ref NM 115282 3 Arabidopsis thaliana SCR SCARECROW _ 668 0 0 gb AY113991 1 Arabidopsis thaliana putative SCARECROW1 _ 668 0 0 gb ayo0s0840 1 Arabidopsis thaliana putative SCARECROW1 _668 0 0 gb Ay056315 1 Arabidopsis thaliana putative SCARECROW1 _ 668 0 0 0 0 0 0 emb AL132957 1 aTF24B22 Arabidopsis thaliana DNA chromosome 3 649 La s quence de l EST utilis e montre une similarit de 100 et une E value de 0 avec les genes SCR de Pisum sativum et d Arabidopsis thaliana La s quence de cet EST a t d pos e dans la banque de g ne sous le num ro d accession CA41 1474 1 2 L ADN compl mentaire ADNc de LaSCR1 et LaSCR2 1 2 1 Isolement de l ADNc des g nes LaSCR1 et LaSCR2 Chez le lupin blanc deux g nes SCR ont t isol s et ont t nomm s LaSCR1 et LaSCR2 1 2 1 a Pr paration d une banque d ADNc du lupin blanc Une banque d ADNc a t pr par e partir des racines proteoides du lupin cultiv sous stress phosphorique en utilisant le Kit de synth se d ADNc Stratagene La jalla CA Pour ceci 4ug d ARN PolyA extrait partir de racines proteoides g es de 7 et 10 j
86. les g nes candidats li s au syst me racinaire Endre et al 2002 Levy et al 2004 N anmoins la transformation par A rhizogeneses pr sente une limite majeure du fait que la partie a rienne est non transform e la g n ration de plantes transg niques par multiplication v g tative demeure difficile Exception faite de quelques plantes comme Medicago truncatula dont on a r ussi g n rer de nouvelles plantules partir des racines transg niques Crane ef al 2006 Des essais ont t r alis s par l quipe de Vance C Universit du Minnesota Saint Paul USA a partir de mutants Ri T DNA de lupin blanc afin de g n rer des plantules transg niques Les tests de culture in vitro des racines transg niques RNAi ont permis d obtenir des cals Les cals ont t transf r s sur un milieu riche en cytokinine d o la diff renciation visible de l embryon et des racines mais la g n ration d une plantule enti re n a pas t r ussie Uhde stone ef al 2005 L une des tapes cl s de la r ussite de la transformation est le bon choix de la souche d Agrobacterium utiliser Les souches faible virulence comme Arqua l ou K599 permettent de g n rer un faible nombre de racines transg niques et avec une morphologie et croissance similaires aux racines non transform es Quandt et al 1993 Collier et al 2005 D autres souches comme MSU440 et R1000 sont consid r es grande virulence La souche A4T d A rhizogenes
87. methods the GOOD assay Amplifluor and TaqMan in diploid and polyploid plants Theor Appl Genet 112 1115 1124 Gilbert G A Knight J D Vance C P amp Allan D 2000 Proteoid root development of phosphorus deficient lupin is mimicked by auxin and phosphonate Annals of Botany 85 921 928 176 R f rences bibliographiques Gill B S K S Gill W J Raupp J Delaney R S Kota L Mickelson D Hassawi A K Fritz T S Cox S H Hulbert R G Sears T R Endo D Namuth and N L V Lapitan 1993 Genetic and physical mapping in Triticum tauschii and Triticum aestivum In D Hoisington and A NcNab eds Progress in Genome Mapping of Wheat and Related Species Proceedings of the 2rd Public Workshop Intern Triticeae Mapping Initiative 22 26 Sept 1992 10 17 CIM MYT Mexico DF Gladstones J S 1970 Lupins as crop plants Field Crop Abstr 23 123 148 Gladstones J S 1974 Lupins of the Mediterranean region and Africa Western Australian Department of Agriculture technical bulletin 26 1 48 Gladstones J S 1994 An historical review of lupins in Australia 1 38 In DracupMand Palta J eds Proceedings of the First Australian Lupin Technical Symposium Department of Agriculture Western Australia pp 1 38 Gladstones J S 1998 Distribution origin taxonomy history and importance In Gladstones J S Atkins C and Hamblin J eds Lupins as Crop Plants Biology Production and Utilization CABI Oxon
88. montre que le genome du lupin est tr s riche avec les motifs repet s AG GA CA et GT Selon Wang et al 1994 les motifs AT n et AG n sont les plus microsatellites les plus fr quents chez les plantes Selon les r sultats ISSR obtenus dans ce travail on note que la proportion des motifs GA n est plus importante que celle des motifs CA n Cette carect ristique a aussi t decrite chez plusieurs plantes Gupta et al 1994 L abondance des microsatellites comme les motifs GAGA semblent tre impliqu s dans la r gulation des gnes et le control de l expression chez les mammiferes et les plantes Sangwan amp Brian 2002 Santi et al 2003 Van Steensel et al 2003 Le motif r p t GA a t tr s utilis chez plusieurs germplasmes dans identification des variations all liques des g nes li s au stress Reddy et al 2009 Par ailleurs d autres motifs comme CA n AC n ou GT n ont t tr s bien tudi s chez les mammif res Jingyi Hui et al 2003 Jung Hee ef al 2004 Jingyi Hui ef al 2005 Dzamila et al 2006 N anmoins la fonction de ces l ments reste encore inconnue 115 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit oS BRERBAABBS L angustifolius 0 Marqueurs ISSR g n r s Marqueurs ISSR sp cifiques ET Marqueurs AFLP g n r s O Marqueurs AFLP sp cifiques Figure IL 24 Nombre de marqueurs AFLP g n r s et sp cifiques par esp ce de lupin tudi es
89. montrent qu un facteur de transcription typique est constitu de i une r gion de fixation de Tl ADN ii un site d oligomerisation iii un domaine de la r gulation de la transcription et 38 Revue bibliographique Anin 28 ARE a ome Lateral Aun G AC root Cylukinin 4 cell division Root hair differentiation Radial patterning Stem cell identity Figure 1 13 R seau de r gulation au niveau racinaire impliquant quelques facteurs de transcription La r gulation est repr sent e par des fl ches pleines ou en pointilles activation ou barres inhibition Le mouvement des prot ines est repr sent par des fl ches ondul es Montiel et al 2004 39 Revue bibliographique iV un signal de localisation nucl aire NLS nuclear localisation signal Liu L et al 1999 N anmoins certains facteurs de transcription ne contiennent pas un domaine de la r gulation de la transcription Goff et al 1992 ou une r gion sp cifique de fixation d ADN On a aussi not la pr sence d autres domaines fonctionnels chez quelques prot ines exemple du motif G protein b subunit Like chez le COP1 constitutive photomorphogenic 1 Deng et al 1992 et la prot ine bZIP basic zipper Sato et al 1998 Ceci montre que de nouveaux domaines fonctionnels sont pr sents chez les facteurs de transcription des plantes Liu L et al 1999 La classification des facteurs de transcription d pend de
90. ont t largement tudi s chez Arabidopsis thaliana et sont li s la formation et la sp cification de l endoderme Di laurenzio 1996 Sabatini S et al 2003 Jocelyn E Malamy and Philip N Benfey 1997 Cui H et al 2007 Le g ne SCR sera pr sent plus en detail dans le paragraphe III 2 2 2a 40 Revue bibliographique Tableau I 6 Liste de 18 Facteurs de transcription impliqu s dans le d veloppement racinaire Facteurs de Famille Esp ce Fonction transcription MP ARF Arabidopsis Etablissement du m rist me racinaire BDL AUX IAA Arabidopsis Etablissement du m rist me racinaire SHR GRAS Arabidopsis_ Organisation racinaire radiale SCR GRAS Arabidopsis Organisation racinaire radiale maintenance du m rist me QHB HB Orysa sativa Maintenance du m rist me racinaire TTGI WD40 Arabidopsis Production du mucilage de graines et de pigments d anthocyanine la structuration des cellules de l piderme GL2 HB Arabidopsis_ la structuration des cellules de piderme CPC MYB Arabidopsis_ la structuration des cellules de piderme TRY MYB Arabidopsis _ la structuration des cellules de l piderme ETCI MYB Arabidopsis la structuration des cellules de l piderme WER MYB Arabidopsis la structuration des cellules de l piderme GL3 EGL3 Bhlh Arabidopsis la structuration des cellules de l piderme NACI NAC Arabidopsis Initiation des
91. plusieurs travaux se sont succ d s IV 1 Stress abiotiques Les facteurs abiotiques sont des facteurs cologiques ou facteurs physico chimiques influen ant une bioc nose donn e On peut classer les facteurs abiotiques de diff rente mani re on repr sente ici le classement le plus simple subdivisant ces facteurs en quatre cat gories i Les facteurs d ordre climatique avec comme l ments l eau la lumi re la temp rature et l air L eau est un facteur tr s important en tant qu l ment essentiel pour certains organismes vivants et cosyst mes Ce param tre sera discut plus en d tail dans cette partie La lumi re est un l ment essentiel pour les organismes photosynth tiques N anmoins la photop riode qualit et quantit de la lumi re peut tre un facteur limitant de la croissance et du d veloppement de certains organismes vivants La temp rature peut aussi tre un facteur limitant de la croissance des tre vivants L tude des m canismes d adaptations des organismes aux temp ratures extr mes est aussi tr s int ressante L air tant un l ment important dans les m canismes de diss mination de pollen par exemple il peut aussi tre limitant selon l intensit la fr quence et la direction du vent ii Les facteurs d ordre daphique sont li s la structure granulom trie et la composition du sol en humus et en l ments min raux en particulier les phosphates calcium fer nitrate e
92. repr sentant les populations de K nitra et de Rabat et une population de Mohammedia sont inter crois s 101 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Biplot axes F1 et F2 20 59 F1 12 20 Figure IL 17 Analyse en composantes principales des 23 accessions de L cosentinii avec les 48 marqueurs ISSR appuyant cette structuration 1 F1 975pb 2 F1 883 17pb 3 F1 819 28pb 4 F1 749 01 5 F1 649 88 6 F1 632 07pb 7 F1 613 78pb 8 F1 580 79pb 9 F1 558 19pb 10 F1 543 62pb 11 F1 517 17pb 12 F1 487 94pb 13 F1 463 73pb 14 F1 432 10pb 15 F1 389 85pb 16 F1 348 10pb 17 F1 334 13pb 18 F1 329 49pb 19 F1 301 07pb 20 F1 283 24pb 21 F1 282 73pb 22 F1 270 43pb 23 F1 244 86pb 24 F1 228 44pb 25 F1 213 70pb 26 F1 199 67pb 27 F1 192 00pb 28 F1 181 48pb 29 F1 172 44pb 30 F1 155 40pb 32 F2 236 67pb 33 F2 196 15pb 34 F2 120 52pb 35 F2 682 50pb 36 F2 384 12pb 37 F2 382 43pb 39 F2 132 44pb 40 F2 115 16pb 41 F2 745 65pb 42 F2 736 15pb 43 F2 593 69pb 45 F2 146 45pb 46 F2 480 20pb 47 F2 307 46pb 48 F2 136 56pb 49 F2 774 26pb 50 F2 570 92pb 102 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit a ao osib Cosi NS L e GI i a A 1 _Cos1 8 Cosi4 Cos tb we p P dl Coste Cos08 x L c GII 1 Coso A L c GI 2 Cos12 Cos11 0510 VS Z Figure IL 18 Repr sentation tridimensionnelle de type MDS repr sentant les accessions de L
93. sont arrang es de fa on r guli re sur le rac me Cette esp ce est la premi re avoir t domestiqu e La culture du lupin jaune doux sur des sols sableux acides a t un succ s en 1950 1960 en Allemagne et en Pologne La vari t polonaise Teo caract ris e par un fleurissement pr coce pr sente une bonne adaptation aux saisons de culture courtes Les graines du L luteus sont les plus riches graines des l gumineuses en prot ines 38 et en acides amin s sulfur s et lysine Tableau I 3 Cowling et al 1998 10 Revue bibliographique Graines de Lupinus luteus Figure LS Lupinus luteus a plante montrant feuilles et fleurs jaunes b graines Unit de 0 5 cm Tableau L3 Comparaison de la composition des graines de lupin blanc bleu et jaune en mati res s che grasse et en prot ines Source ARVALIS UNIP blanc bleu jaune Amidon TOT i 1 Me thionine cystine Mati re min rale Tanins total 04 03 03 1 3 6 Lupinus atlanticus _ 90 1 4 2 21 0 9 0 4 3 8 3 9 Gladstone 1974 a d crit L atlanticus comme tant une nouvelle esp ce malgr sa similarit avec d autres esp ces Cette esp ce est caract ris e par des graines assez large des fleurs bleues avec un secteur blanc au centre similaires aux fleurs de L pilosus Le feuillage vert clair est tr s similaire celui de L digitatus esp ce cultiv e pr sentant des fleurs bleues Sa distribution g ograph
94. sur la base des marqueurs AFLP Figure IL 11 Profils lectrophor tiques ISSR d accessions de L albus Figure IL 12 Classification hi rarchique en UPGMA des accessions de Lupinus albus Figure IL 13 ACP des populations de L albus sur la base des marqueurs ISSR Figure IL 14 MDS des accessions de L albus sur la base des marqueurs ISSR Figure IL 15 Profils lectrophor tiques ISSR obtenus pour les accessions de L cosentinii Figure IL 16 Dendrogramme des accessions de L cosentinii sur la base des ISSR Figure IL 17 ACP des 23 accessions de L cosentinii selon les marqueurs ISSR Figure IL 18 MDS des accessions de L cosentinii sur la base des marqueurs ISSR Figure IL 19 Profils lectrophor tiques et dendrogrammes des accessions de L luteus Figure IL 20 UPGMA des populations de L luteus g n r sur la base des marqueurs ISSR Figure IL 21 ACP des populations de L luteus sur la base des marqueurs ISSR Figure IL 22 MDS des populations de L luteus sur la base des marqueurs ISSR Figure IL 23 Nombre de marqueurs ISSR g n r s et sp cifiques par esp ce de lupin utilis e Figure IL 24 Nombre de marqueurs AFLP g n r s et sp cifiques par esp ce de lupin tudi es Figure II 1 Courbes de r gression lin aire de l analyse de variabilit de l intensit des signaux Figure III 2 Comparaison de l expression des g nes au niveau des feuilles racines proteoides et racines normales du lupin en r pons
95. the GRAS gene family in Arabidopsis thaliana Plant Mol Biol 67 659 670 Lefort Buson M Rodolphe F et Charcosset A 1990a De nouvelle perspectives pour l analyse g n tique des caract res quantitatifs I re partie A la recherche des locus importants Biofutur 91 30 37 Lefort Buson M Rodolphe F et Charcosset A 1990b De nouvelles perspectives pour l analyse g n tique des caract res quantitatifs La s lection assist e par marqueurs Biofutur 91 30 37 Leonhardt N Kwak J M Robert N Waner D Leonhardt G and Schroeder J I 2004 Microarray expression analyses of Arabidopsis guard cells and isolation of a 180 R f rences bibliographiques recessive abscisic acid hypersensitive protein phosphatase 2C mutant Plant Cell 16 596 615 L vy J Bres C Geurts R Chalhoub B Kulikova O Duc G Journet E P An J M Laubert E Bisseling T D nari J Rosenberg C and Debell F 2004 A putative Ca and calmodulin dependant protein kinase required for bacterial and fungal symbioses Science 303 1361 1364 Liu HS and Li FM 2005 Photosynthesis root respiration and grain yield of spring wheat in response to surface soil drying Plant Growth Regul 45 149 154 Liu J Uhde Stone C Li A Vance CP Allan DL 2001 A phosphate transporter with enhanced expression in proteoid roots of white lupin Lupinus albus L Plant Soil 237 257 266 Liu L White MJ MacRae
96. un fragment du g ne SCR du lupin Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 4 3 1 b Mesure de l expression du MtSCR au niveau des racines transg niques Une RT PCR a t r alis e afin de v rifier l expression du g ne SCR de Medicago MtSCR au niveau des chantillons d ARNi Figure III 25 Ces chantillons ont t obtenus apr s transformation de Medicago par le vecteur d ARNi contenant une partie du g ne SCR du lupin La RT PCR a t optimis e en utilisant les deux amorces sp cifiques du g ne SCR de Medicago MISCR LSO8 p CGTAACGTACTTGCAGTTGG 37 et LS09 p ACCGTCCGATCTTCATCAAC 3 A partir de la figure IIL 25 on note que le g ne MtSCR pr sente diff rents degr s d expression au niveau des chantillons SCRi Le degr d expression de MtSCR a t corr l au degr de ph notype obtenu Ainsi l expression de MtSCR a t tr s faible au niveau des chantillons SCRil SCRi2 et SCRi3 pr sentant des syst mes racinaires tr s r duits Aussi l expression de MtSCR a t moyenne au niveau des chantillons SCRi4 et SCRi5 avec des syst mes racinaires de taille moyenne Par contre au niveau des chantillons SCRi6 SCRi7 et SCRi8 avec un syst me racinaire de taille similaire celle des plantes t moins on remarque que l expression de MtSCR est comparable celle du t moin Cette corr lation entre le silen age du g ne MtSCR et le degr du ph notype obtenu montre l implication
97. une grande extension depuis les ann es 80 et surtout avec le d veloppement des techniques de PCR L utilisation des marqueurs mol culaires est en perp tuelle croissance tant en g nomique structurale qu en g nomique fonctionnelle L valuation de la diversit des ressources phytog n tiques constitue une tape cl dans les programmes d am lioration et de conservation de ces ressources dans le but d une utilisation durable D un autre c t le progr s des tudes sur la biologie des l gumineuses est li au d veloppement de deux plantes mod les Lotus japonicus et Medicago truncatula Ces deux organismes diplo des pr sentent des g nomes de taille modeste et sont favorables la transformation g n tique Le nombre d articles consacr s ces deux syst mes refl te leur succ s Ces progr s sont aussi facilit s par l acc s l information travers les plateformes bioinformatiques et les diff rents sites web Exemple du manuel de M truncatula http www noble org MedicagoHandbook qui propose gratuitement des protocoles et plusieurs informations utiles La synt nie entre le g nome R f rences bibliographiques de M truncatula et de L japonicus avec les autres l gumineuses indique que ces plantes mod les vont contribuer dans la compr hension de la biologie des plantes de culture O Brian et Vance 2007 Les recherches sur d autres plantes mod les comme Arabidopsis thaliana et Glycine max ont p
98. utilis 11 1 2 2 Extraction de l ADN total du lupin selon le protocole modifi de BERNATSKY et TANKSLEY 1986 La modification du protocole d extraction d ADN de BERNATSKY et TANKSLEY a port essentiellement sur la concentration des diff rents constituants du tampon d extraction Deux tampons d extraction ont t essay s le tampon 1 avec 0 14 M sorbitol 0 22 M Tris pH 8 0 0 22 M EDTA 15 g l CTAB 1 de B mercapto thanol et avec comme modification l utilisation de 0 22 M de NaCl et de 10 g l de N lauryl sarcosine Le tampon 2 comporte 0 15 M Tris pH 8 0 0 015 M EDTA 1 M NaCl 15 g l de CTAB et 1 de B mercapto thanol Les concentrations ont t choisies en se r f rant d autres protocoles d extraction L extraction de ADN a t r alis e selon les m mes tapes et conditions du protocole de base d taill au paragraphe II 1 2 1 La v rification de la qualit et quantit de VADN extrait par lectrophor se et spectrophotom trie a r v l un ADN d une qualit Figure II 2 et quantit tr s faibles Nous avons ainsi abandonn ce protocole sans pour autant tenter d effectuer d autres modifications 11 1 2 3 Extraction de l ADN total du lupin selon le protocole brute de B OUENZAR et al 1998 Le deuxi me protocole d extraction d ADN qui nous a sembl assez int ressant est un protocole d velopp par Ouenzzar B en 1998 pour le palmier dattier Ce protocole est bas sur l
99. vecteur pGEMTeasy Promega Madison WI USA et ensuite clon dans le vecteur pBSSK pour une utilisation dans le marquage digoxygenine DIG Les sondes d ARN marqu digoxigenine ont t g n r es dans les deux orientations sens t moin et anti sens exp rience Ceci a t perform selon une transcription in vitro en utilisant le nucl otide marqu DIG 11 UTP Roche Applied Science Mannheim Germany Les sondes d orientation sens permettent de v rifier que la coloration obtenue est li e a l hybridation sp cifique de la sonde avec les ARNm et non pas un art fact 160 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 3 2 3 Hybridation La sonde pr par e est pr trait e pendant 10 min a 80 C dans une solution de DTT 3M ARNt 10ug ul et polyA 20ug ul L hybridation des tissus et de la sonde marqu e est r alis e pendant 12 20 h et 42 C dans un tampon contenant la sonde trait e le formamide le NaCl 5M le Tris Cl 100mM PH 7 5 le Denhardt s 50X le sulphate dextran 50 v v et le DTT 3M Les lames sont ensuite soumises a une s rie de lavages 5 10 min temp rature ambiante dans une solution de SSC 5X et DTT 5M 30 min 37 C dans de l ARNase 0 5ug ml et 30 min 37 C dans de l ARNase 0 5ug ml et DTT 5mM Un dernier lavage est assur dans du SSC 2X et DTT ImM pendant 30min et temp rature ambiante 3 2 4 R sultats La d tection immunologique a t r alis
100. 0 468 994 921 1053 PIBS PHR1 GNATATNC Aucun Aucun 150 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc gt Sequence du Promoteur de LaSCR1 HLH BES1 1427 CGTGTCACCGTAGTATTATAGATCAGCACCAGATGAATGTACTGAACCGCTCTAAAGACC BES1 1367 TTTAGCTTTTAACTCTCTTCAATCAAACACTTGTGTTCTTTTTTCAAAATCTTTTACCTT PHO L 1307 TTTTTGTGTGGTAAAATGTGATGTTAGTATCCCACCTTCCTTTTCGTCATTGATTTTGGT 1247 GCCAACTTTTTAGTTTTGTGTCCGATGCACTGTTTGGTTTGACAAAGTTTGCTAATCCCA 1187 CCAAATTATATAATGAAAAATGAAAAATCACGTATGAAGTCAAGAGGAAAAAGCTGGTTG BES1 1127 CTGATGCTGCAGTTGAAAGCAAAATGTCAAACGCTACGATTCATATT TT TGGGAACATAG 1067 GTCTGGCAGCTCCTTCTCCTCGTTCGCTGCGTCACTTCTATCACTTATATCACAATTAAT Binding TF 1007 TTTTCTATCAGTGTCTCCAATGCTCCCATTAAACCGTGTCATTCGATTAAATATAAAAGT Zinc finger Zinc finger HLH 947 TATAACAACTATAATTTGATTTGATAAATATATGGAGAGATAGAGTT TT TAAGAACAGAT 887 GATCTGATTATCTCTGTTGCAATTTTTCACCCAAAAGATTTTCTTAAAGTTGTAAAATTA PHO L 827 TTTTGAAAGTGGTTTTTTTTGTCCATATCCAGGTTTTATATTTTTTATTATATAATTGGA DOF Zinc finger 767 AGACTTTATTTTAAAAATAATGATT TGATAAAAAGTGTCAAAATACTATGACATTCTACT 707 AAAGTTAATAGAAAGTTAATTAAGTATAAAAAATTCGT TAGGAAAACAAGGAAACCACAC PHO L Binding TF 647 ACAAATAAATATATAAATAAATAAAAGTGGCT TTCCAATGTATAATT TCCGACAGCAAACA Binding TF 587 GTAACTAGTGCCTCATATTATATGGAAATAAGTTGGGATGAGCCCTCACTAGCCCAATAG 527 TATAATAACATGTATGTCATTAAAAAATATATTCTTATGTGTCTTTTTATTCCCCTTACT Zinc finger 467 AAAACAAAAATAGAATATTATGTTGAGTGAGATAGGAT TT GAAAGGAGATCAGATTACAT
101. 0 0 003 214 ISSR FL6 153 pb 0 070 1 971 257 ISSR FL8 223 pb 0 002 0 070 215 ISSR FL7 1230pb 0 048 0 506 258 ISSR FL8 208 pb 0 484 0 020 205 Annexes Annexe II 4 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L albus Contributions Contributions des variables des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 259 ISSR FL8 199 pb 0 008 0 011 297 ISSR FL10 232 pb 0 098 0 141 260 ISSR FL10 1752 pb 0 123 0 901 298 ISSR FL10 216 pb 0 004 0 976 261 ISSR FL10 1532 pb 0 002 0 000 299 ISSR FL10 197 pb 0 231 0 017 262 ISSR FL10 1439 pb 0 318 0 252 300 ISSR FL10 197 pb 0 231 0 017 263 ISSR FL10 1362 pb 0 279 0 013 301 ISSR FL10 185 pb 0 156 0 003 264 ISSR FL10 1326 pb 0 279 0 013 302 ISSR FL10 149 pb 0 231 0 014 265 ISSR FL10 1187 pb 0 108 0 074 303 ISSR FL11 1645 pb 0 012 0 048 266 ISSR FL10 1035 pb 0 010 0 202 304 ISSR FL11 1269 pb 0 018 0 039 267 ISSR FL10 995 pb 0 058 0 015 305 ISSR FL11 1052 pb 0 401 0 032 268 ISSR FL10 947 pb 0 356 0 017 306 ISSR FL11 909 pb 0 252 0 220 269 ISSR FL10 947 pb 0 000 0 239 307 ISSR FL11 826 pb 0 098 0 171 270 ISSR FL10 917 pb 0 318 0 252 308 ISSR FL11 786 pb 0 330 0 653 271 ISSR FL10 865 pb 0 028 0 037 309 ISSR FL11 688 pb 0 650 0 348 272 ISS
102. 0 007 0 487 328 E ACT M CAC 196 pb 0 196 0 489 287 E ACG M CAT 157 pb 0 007 0 487 329 E ACT M CAC 187 pb 0 040 0 003 288 E ACG M CAT 156 pb 0 025 0 018 330 E ACT M CAC 176 pb 0 235 0 237 289 E ACG M CAT 147 pb 0 236 0 383 331 E ACT M CAC 171 pb 0 016 0 606 290 E ACG M CAT 144 pb 0 196 0 489 332 E ACT M CAC 162 pb 0 135 0 018 291 E ACG M CAT 142 pb 0 661 0 000 333 E ACT M CAC 154 pb 0 661 0 000 292 E ACG M CAT 138 pb 0 661 0 000 334 E ACT M CAC 150 pb 0 196 0 489 293 E ACG M CAT 132 pb 0 661 0 000 335 E ACT M CAC 149 pb 0 025 0 018 200 Annexes Annexe IL 3 suite Contribution des marqueurs AFLP dans les deux axes F1 et F2 de DACP r alis e dans l analyse intersp cifique Contributions des variables Contributions des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 336 E ACT M CAC 142 pb 0 135 0 018 378 E ACT M CAG 235 pb 0 135 0 018 337 E ACT M CAG 1643 pb 0 025 0 018 379 E ACT M CAG 227 pb 0 002 0 238 338 E ACT M CAG 1319 pb 0 196 0 489 380 E ACT M CAG 222 pb 0 007 0 487 339 E ACT M CAG 1235 pb 0 025 0 018 381 E ACT M CAG 214 pb 0 041 0 025 340 E ACT M CAG 1126 pb 0 594 0 006 382 E ACT M CAG 213 pb 0 236 0 383 341 E ACT M CAG 1042 pb 0 016 0 606 383 E ACT M CAG 203 pb 0 135 0 018 342 E ACT M CA
103. 0pb 272 FL7 192 66pb 285 FL8 680 57pb 294 FL8 336 81pb 312 FL10 917pb 325 FL10 426 62pb 331 FL10 327 61pb 341 FL10 197 12pb 345 FL11 1645pb 353 FL11 599 16pb 359 FL11 394 95pb 371 FL11 185 05pb 374 FL11 122 63pb 89 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit IT 2 2 1 c Analyse en composantes principales Une autre repr sentation bidimensionnelle ou analyse en composantes principales ACP a t r alis e sur la base des marqueurs ISSR Figure II 13 Cette repr sentation en nuage de points nous permet d avoir une autre vision sur la structuration des 10 accessions d albus Ceci est appuy par la contribution de 48 marqueurs ISSR La repr sentation ACP a t r alis e selon les premiers axes F1 et F2 ceux ci ont apport le maximum d information avec 38 09 de variabilit Tableau II 16 La contribution de chacun des marqueurs ISSR dans la structuration des populations d albus a t r sum e dans annexe II 4 A premi re vue on retrouve le m me regroupement probable des accessions propos par la classification en UPGMA On note aussi que l ensemble des accessions est group dans un m me niveau pr cis ment au niveau de la partie positive de l axe F1 et des deux c t s positifs et n gatifs de laxe F2 Seules les accessions du groupe L aGI II Alb01 04 ont t positionn es au niveau de la partie n gative de l axe F2 Tableau IL 16 Valeur propre variabilit et pourcent
104. 0pb Cos03 0 Cos21 FL7 108 33pb FL9 670 38pb Cos07 F2 236 67pb F3 164 83pb FL9 100 17pb FL10 1057pb Cos02 FL9 622 29pb Cos05 FL1 565 82pb Cos23 F1 329 49pb FL1 851 80pb Cos18 FL1 473 97pb FL5 218 77pb FLS 141 29pb FL2 1696pb FL2 1241pb FL3 1773pb FLS 561 31pb FLS 309 61pb Cos22 FL7 1357pb Cos12 FL6 896 37pb FL6 812 31pb FL7 1181pb Cos04 F1 543 62pb Cos24 F1 192 00pb FL1 1325pb FL1 1123pb FL3 1332pb FL3 125 37pb Cos22 FL1 1482pb Cos13 FL2 628 48pb Cos14 F1 138 46pb FL6 364 59pb FL8 941pb FL10 1183pb Cos08 F2 120 52pb FL10 932pb Cos11 F2 196 15pb FLA 133 66pb FL7 827 16pb FL8 144 11pb Cos01 F4 174 46pb FL4 361 21pb FL6 630 83pb Cos06 F1 172 44pb FL2 111 14pb F4 2164pb F4 1727pb F4 1264pb FL1 115 53pb FL4 639 53pb Cos09 FLA4 560 57pb FL4 436 92pb 95 Cos16 Cos15 Cos17 Cos18 Cos19 Cos23 Cos20 Cos22 Cos21 Cos10 Cos09 Cos08 Cos11 Cos07 Cos12 Cos14 Cos13 Cos02 Cos01 Cos03 Cos06 Cos05 Cos04 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau IL 20 Matrice de similarit de Dice entre les 22 accessions de L cosentinii sur la base des marqueurs ISSR 100 00 51 80 100 00 50 01 42 93 34 35 38 15 42 93 34 29 30 65 35 35 38 10 39 83 33 06 34 71 34 45 37 94 40 93 33 34 36 69 38 24 37 15 38 39 28 45 47 35 100 00 34 98 47 37 100 00 40 59 40 17 46 88 100 00 42 11 38 54 42 98 53 70 100 00 35 01 35 75 37 91 53 48 48 20 100 00 32 33 40 01 35 99 49 32 50 01
105. 1 232 0 281 456 ISSR FL9 752 pb 1 438 0 296 416 ISSR FL7 223 pb 0 127 0 788 457 ISSR FL9 728 pb 1 369 0 499 417 ISSR FL7 203 pb 1 369 0 499 458 ISSR FL9 587 pb 1 232 0 281 418 ISSR FL7 180 pb 0 799 0 914 459 ISSR FL9 541 pb 0 322 2 351 419 ISSR FL7 169 pb 2 154 2 383 460 ISSR FL9 459 pb 1 369 0 499 420 ISSR FL7 163 pb 0 663 1 132 461 ISSR FL9 430 pb 0 006 1 647 421 ISSR FL7 149 pb 0 712 0 016 462 ISSR FL9 409 pb 1 369 0 499 422 ISSR FL7 135 pb 0 663 1 132 463 ISSR FL9 392 pb 0 672 2 874 423 ISSR FL7 127 pb 0 263 1 006 464 ISSR FL9 370 pb 0 573 0 658 424 ISSR FL7 116 pb 0 195 1 437 465 ISSR FL9 359 pb 1 641 2 149 425 ISSR FL8 1228 pb 0 712 0 016 466 ISSR FL9 346 pb 1 525 1 194 426 ISSR FL8 793 pb 3 669 1 563 467 ISSR FL9 329 pb 0 911 0 650 427 ISSR FL8 681 pb 1 232 0 281 468 ISSR FL9 314 pb 0 322 2 351 428 ISSR FL8 624 pb 1 049 1 876 469 ISSR FL9 299 pb 2 520 0 671 429 ISSR FL8 576 pb 0 127 0 788 470 ISSR FL9 275 pb 0 322 2 351 430 ISSR FL8 529 pb 2 614 2 715 471 ISSR FL9 255 pb 0 712 0 016 431 ISSR FL8 511 pb 2 154 2 383 472 ISSR FL9 243 pb 3 149 1 860 432 ISSR FL8 488 pb 0 963 0 922 473 ISSR FL9 229 pb 1 369 0 499 433 ISSR FL8 479 pb 2 494 0 280 474 ISSR FL9 213 pb 2 520 0 084 434 ISSR FL8 456 pb 3 517 0 237 475 ISSR FL9 200 pb 0 263 1 006 435 ISSR FL8 429 pb 1 778 2 367 476 ISSR FL9 188 pb 0 715 1
106. 10 Selon que les clones sont ordonn s avant ou apr s le s quen age on distingue 1 La m thode de s quen age par ordonnement hi rarchique cette technique est bas e sur le s quen age de fragments dig r s apr s leurs classements Les fragments g nomiques dig r s sont de grande taille 50 200 kb et sont clon s dans des vecteurs artificiel comme les chromosomes artificiels bacteriens BAC 2 La m thode globale ou shotgun est bas e sur le s quen age des fragments g nomiques dans un ordre al atoire Les s quences des diff rents clones seront ordonn es par chevauchement l aide des programmes bioinformatiques Cette technique a t popularis e par le s quen age de g nomes bact riens du g nome de la drosophile et du g nome humain La technique shotgun pr sente l avantage d tre plus rapide et moins co teuse que la premi re technique Historique Le premier s quen age effectu a concern le g nome du bact riophage X174 publi en 1977 par l quipe de Sanger En 1995 le s quen age du g nome de la premi re cellule bact rienne Haemophilus influenzae avec 1 8 millions de paires de bases Fleischmann R D ef al 1995 En 1990 se lance le grand projet du g nome humain Homo sapiens dirig par James D Watson l Institut National de sant NIH aux Etats Unis d Am rique Plusieurs chercheurs du royaume unis de France d Allemagne du Japon et de la Chine ont particip ce projet La prem
107. 125 75 800 pb gt 700 pb gt 600 ph gt 500 ph gt 400 pb gt 200 pb gt 200pb gt 150pb gt Le lupin au Maroc Structuration de la diversit E ACZ M CTA E ACC M CATIE ACC M CAGHE ACG M CACRE ACG M CA izmir TS ES EL 1234 1234 1235412341 2 34 Z i R ee C i Huy pul peines mans pme pibid ihh Figure II 8 Electrophor se sur gel de polyacrylamide d amplifiats AFLP de quatre esp ces de lupin marocain par 5 combinaisons d amorces M Marqueur de poids mol culaire 50pb 1 Lupinus luteus 2 Lupinus angustifolius 3 Lupinus cosentinii et 4 Lupinus albus 76 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Chez L angustifolius 277 bandes AFLP ont t g n r es avec une moyenne de 27 7 bandes par amorce Le nombre des fragments obtenus variait entre 17 E AGG M CTC et 36 E ACT M CAT La taille des bandes obtenues variait entre 134 26pb et 2709pb Les valeurs de PIC ont t variables entre 0 94 et 0 97 avec une moyenne de 0 957 et un cart type de 0 0078 Chez L cosentinii 275 fragments AFLP ont t obtenus avec une moyenne de 27 5 bandes par amorce utilis e Le nombre de fragments g n r s variait de 15 E ACG M CAG a 43 E ACT M CAT La taille de ces bandes allait entre 134 26 et 2343 pb Les valeurs de l indice de diversit ou PIC variaient de 0 93 0 97 avec une moyenne de 0 957 et un cart type de 0 01345 Chez L luteus un total de 2
108. 17 YPR_002_D11 _090 ab1 1 439 On46 415 0132 omron 0 245 15866 0856 SIBON 1 369 0 136 0 102 0 165 90 F ms 0 532 2822 ozmas 0 006 03220 0 748 0 786 1 077 931 F 1433 ono 03350 on27 omo 0189 0 277 1 617 m808 pF 1 466 039 0 27 omma om6s om95 0 626 0 805 mzao E385 F 1 347 omao 05345 omas O76 0 202 0 967 4 216 msn E392 Fs 1 402 oms2 ous Oma 0 203 0200 ozo90 0 804 2660 PAIE PAB eked w222 076 13660 0 213 0051 0071 05338 0070 0 844 Le sur lignage indique les g nes qui sont sur exprim s ou sous exprim s __ 223 Annexes Annexe IIL 2 suite Expression des facteurs de transcription en r ponse au diff rents stress ___ Feuilles Racines Normales Racines proteoides _ eur dt 1 438 optam oaen om3 oteo 0 252 moge 0414 0 738 7 1 443 0124 0 234 0 105 0170 0 259 0 228 1 056 YeR 003_E10_071 ab1 0146 0401 0157 0225 4 538 3 289 mer to oat oan Fora f otea oz Fasos ier Faga YPR_008_D10_079 ab1 1 430 0105 0415 0 090 otto 0145 0448 1 1063 2514 0445 0152 0 55 1 239 0 770 YPR_010_F10 _080 1 548 015 0415 0 100 0120 07188 0127 1 ik 1 510 0148 0 329 0 129 opza oyt79 5 733 6275 same i 351 0143 0 239 0 095 0 134 oer 0483 07135 1 i 1 398 0084 0122 0032 0022 01138 0 267
109. 1994 et aussi aux tudes phyllog n tiques chez plusieurs esp ces comme le palmier dattier et le bl Gupta ef al 2000 11 1 3 Les marqueurs ISSR Les ISSR ou Inter Simple Sequence Repeat sont une variante de la PCR d velopp s en 1994 par Zietkiewicz et collaborateurs Cette technique exploite l abondance al atoire des SSR dans le g nome des plantes Les SSR tant des s quences r p t s en tandem de motifs mono di tri ou t tranucl otidique Figure I 8 g n rant un syst me de marqueurs multi locus tr s int ressant qui permet d exploiter la distribution abondante et al atoire des SSRs dans le g nome des plantes L int r t de cette technique est qu elle ne n cessite aucune connaissance pr alable de la s quence utilis e 16 Revue bibliographique Amplification des fragments entre R sultat sur gel deux SSR Variation de longueur entre les deux chantillons Echantillon 2 AC 6 NN gt AN AC pas d amplification Figure L8 Sch ma pr sentant le principe et r sultat des ISSR chez trois chantillons diff rents 17 Revue bibliographique Cette technique a connu dans sa m thodologie plusieurs variations avec l utilisation des gels d acrylamides ou agarose et la r v lation au nitrate d argent bromure d ethidium ou moyennent la radiographie Les marqueurs ISSR ont t largement utilis s pour les analyses du polymorphisme g n tique au niveau intra et inter sp cifique chez pl
110. 1_G11_084 ab1 Contig258 YPR_005_F11_092 abl Homeobox Contig390 YPR_005_B06_046 ab1 YPR_002_F03_027 abl1 YPR_008_B06_046 ab1 YPR_002_E12_087 ab1 YPR_011_E05_036 ab1 YPR_013_H02_016 ab1 Sigma 54 factor interaction region Pas de similarit DEAD DEAH box helicase N terminal 119 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Tableau II 2 Liste des tiquettes singletons Code Code NCBI EST Description 1028 F CA409491 UniRef100_Q6IELO WRKY transcription factor 71 Oryza sativa 1053_F CA409515 Pathogenesis related transcriptional factor and ERF 1182_F CA409642 UniRef100_P41152 Heat shock factor protein HSF30 Lycopersicon peruvianum 1206_F CA409665 Pathogenesis related transcriptional factor and ERF 122_F CA409690 Heat shock factor HSF type DNA binding 1280_F CA409729 Plant specific eukaryotic initiation factor 4B 1355_F CA409799 DNA binding WRKY 1358_F CA409801 UniRef100_Q6DG70 Zgc 91962 Brachydanio rerio 137_F CA409823 StTC127390_ similar to TIGR_Ath11At5g16780 1 68418 m01965 SART 1 family protein contains Pfam domain PF03343 SART 1 family partial 61 1412_F CA409857 GhTC36042_similar to UPIQ93 YF1 Q93YF1 Nucleic acid binding protein partia
111. 1pb 155 07pb Albus E ACC M CAT 1459pb 1316pb 446 33pb 233 37pb 158 79pb E ACG M CAC 342 59pb 327 44pb E ACG M CAG 861 37pb 467 52pb 406 84pb 219 11pb E ACG M CAT 543 39pb E ACT M CAG _ 1042pb 826 40pb 548 52pb 173 85pb E ACT M CAC 1895pb 1706pb 317 82pb 171 25pb E ACT M CAT 1166pb 1118pb 562 24pb 401 44pb 395 41 pb 371 95pb 279 58pb 177 69pb L E AGG M CTC 2157pb 472 62pb 362 25pb 338 18pb 268 03pb 172 24pb angustifolius 154 31 pb 143 81pb E ACC M CAG 343 82pb E ACC M CAT 703 89pb 606 22pb 606 20pb 295 64pb 276 19pb 269 96pb 145 60pb E ACC M CTA _ 415 05pb 382 25pb E ACG M CAC 634 86pb 255 92pb 237 89pb E ACG M CAG 449 99pb 381 86pb 185 86pb 165 67pb E ACG M CAT 804 67pb 344 85pb 256 77pb 217 97pb 197 83pb E ACT M CAG 525 10pb E ACT M CAC _ 602 90pb 360 44pb 228 00pb L cosentinii E ACC M CAG 910pb 340 17pb 189 16pb E ACC M CAT 1390pb 582 97pb E ACC M CTA 804 86pb 664 64pb 613 31 pb 427 54pb E ACG M CAC 888 Le 841 23pb 370 79pb 360 84pb 275 81pb E ACG M CAG 422 14p 149 9 p E ACG M CAT 448 37pb 317 99pb 298 96pb 278 05pb 212 38pb 156 46pb E ACT M CAG 1643pb 1235pb 445 84pb 286 53pb 161 37pb E ACT M CAC 1599pb 1380 gt a 41pb 148 69pb L luteus E AGG M CTC 716 pb 353 PAER 12pb E ACC M CAG 975pb OFS RRs mr 82pb es 6pb 283 80pb 226 19pb 210 19pb E ACC M CAT 130 51 pb 563 62pb 423 73pb 357 63pb 348 87pb 251 05pb 186 13pb 166 78pb 148 37pb
112. 2 13 14 08 Il 01 06 09 F1 1 6 4 0 6 7 7 4 5 5 0 0 8 7 10 9 6 9 3 4 4 5 3 F2 3 7 7 6 3 10 7 8 8 7 5 11 9 8 8 10 7 5 6 15 9 6 5 F3 5 12 10 10 8 11 9 10 8 5 6 8 7 9 8 7 6 7 8 9 12 7 7 F4 17 14 10 13 11 12 5 12 8 13 7 12 14 10 11 15 17 14 7 16 13 6 14 FLI 8 7 2 7 7 19 10 8 9 16 10 16 9 8 18 15 3 8 10 8 10 9 9 FL2 9 13 5 4 9 10 7 7 7 12 3 11 3 14 7 8 7 4 15 4112 5 7 FL3 6 13 6 6 7 112 7 10 10 10 6 17 8 14 13 12 7 8 12 12 12 11 9 FLA4 5 4 4 4 6 3 4 6 7 5 4 5 5 6 5 6 4 4 6 5 7 5 9 FL5 5 T 7 6 8 11 9 10 8 9 9 12 7 10 14 12 8 8 8 6 10 8 6 FL6 6 4 12 9 9 8 9 10 11 9 8 8 6 8 7 7 5 10 9 8 12 13 8 FL7 9 7 10 6 7 7 10 8 6 9 10 11 5 8 7 9 9 4 6 2 7 8 5 FL8 7 14 12 8 12 113 9 6 14 9 13 10 9 13 8 10 6 13 10 7 12 11 9 FL9 11 10 10 9 12 12 11 11 11 10 8 10 11 9 11 10 9 8 14 12 11 9 12 FL10 10 11 8 8 9 6 10 11 6 8 7 6 7 7 7 8 10 9 11 12 8 8 11 FL11 7 7 8 8 10 8 7 9 9 7 7 6 7 9 6 7 9 7 8 7 8 9 8 94 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau IL 19 Marqueurs ISSR sp cifiques aux diff rentes accessions de L cosentinii Accession Marqueurs sp cifiques Cos10 F4 1477pb FL7 1826pb FL7 994pb Cos15 FL2 397 32pb Cos16 FL7 436 38pb Cos17 F4 203 16pb FL5 181 68pb FL6 723 33pb FL9 890 6
113. 20 14 ISSR F1 279 pb 0 009 0 093 56 ISSR F3 1125 pb 0 091 0 066 15 ISSR F1 248 pb 0 001 0 15 57 ISSR F3 1052 pb 1 129 0 107 16 ISSR F1 237 pb 0 059 0 206 58 ISSR F3 979 pb 0 474 0 039 17 ISSR F1 224 pb 0 004 0 284 59 ISSR F3 934 pb 0 010 0 240 18 ISSR F1 203 pb 0 091 0 066 60 ISSR F3 889 pb 0 001 0 009 19 ISSR F1 170 pb 0 109 0 154 61 ISSR F3 838 pb 0 001 0 150 20 ISSR F1 157 pb 0 408 0 62 ISSR F3 784 pb 0 977 0 074 21 ISSR F1 151 pb 0 0 073 63 ISSR F3 701 pb 1 827 0 335 22 ISSR F1 132 pb 0 0 032 64 ISSR F3 653 pb 0 349 1 352 23 ISSR F1 123 pb 0 008 0 5 65 ISSR F3 590 pb 0 000 1 484 24 ISSR F2 791 pb 0 0 267 66 ISSR F3 569 pb 0 076 0 098 25 ISSR F2 755 pb 0 0 945 67 ISSR F3 552 pb 0 384 0 076 26 ISSR F2 717 pb 0 135 0 001 68 ISSR F3 529 pb 1 129 0 107 27 ISSR F2 681 pb 0 362 0 058 69 ISSR F3 497 pb 0 457 0 564 28 ISSR F2 638 pb 0 499 0 026 70 ISSR F3 478 pb 1 601 0 020 29 ISSR F2 602 pb 1 134 0 14 71 ISSR F3 451 pb 1 107 0 350 30 ISSR F2 566 pb 0 001 0 637 72 ISSR F3 418 pb 0 000 0 073 31 ISSR F2 546 pb 0 004 0 284 73 ISSR F3 383 pb 0 142 2 602 32 ISSR F2 530 pb 0 111 0 231 74 ISSR F3 358 pb 0 152 1 948 33 ISSR F2 502 pb 0 109 0 598 75 ISSR F3 328 pb 0 197 0 048 34 ISSR F2 474 pb 0 074 1 216 76 ISSR F3 309 pb 1 107 0 350 35 ISSR F2 433 pb 0 79 0 001 77 ISSR F3 286 pb 0 000 0 073 36 ISSR F2 408 pb 0 199 0 848 78 ISSR F3 256 pb 1 827 0 3
114. 23 ISSR FL6 362 pb 0 156 0 121 164 ISSR FL12 873 pb 0 140 1 186 195 Annexes Annexe IT 2 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intersp cifique Contributions Contributions des variables des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 165 ISSR FL12 776 pb 1 645 0 111 176 ISSR FL12 234 pb 1 260 0 073 166 ISSR FL12 646 pb 0 140 1 186 177 ISSR FL12 217 pb 1 184 0 436 167 ISSR FL12 612 pb 1 184 0 436 178 ISSR FL12 212 pb 0 454 1 293 168 ISSR FL12 551 pb 0 140 1 186 179 ISSR FL12 199 pb 1 260 0 073 169 ISSR FL12 429 pb 0 102 0 007 180 ISSR FL12 183 pb 1 645 0 111 170 ISSR FL12 400 pb 0 454 1 293 181 ISSR FL12 171 pb 1 260 0 073 171 ISSR FL12 355 pb 1 260 0 073 182 ISSR FL12 159 pb 1 184 0 436 172 ISSR FL12 323 pb 0 156 0 121 183 ISSR FL12 149 pb 0 861 0 522 173 ISSR FL12 310 pb 0 454 1 293 184 ISSR FL12 126 pb 0 140 1 186 174 ISSR FL12 287 pb 0 102 0 007 185 ISSR FL12 256 pb 0 230 0 021 175 ISSR FL12 256 pb 0 230 0 021 196 Annexes Annexe IL 3 Contribution des marqueurs AFLP dans les deux axes F1 et F2 de ACP r alis e dans l analyse intersp cifique Contributions Contributions des va
115. 292 pb 0 014 0 001 195 ISSR FL4 504 pb 0 197 0 048 237 ISSR FL5 266 pb 0 461 0 002 196 ISSR FL4 482 pb 0 363 0 023 238 ISSR FL5 215 pb 0 553 0 042 197 ISSR FL4 475 pb 0 010 0 240 239 ISSR FL5 205 pb 0 499 0 026 198 ISSR FL4 436 pb 0 106 0 012 240 ISSR FL5 196 pb 0 091 0 066 199 ISSR FL4 413 pb 0 881 0 000 241 ISSR FL5 184 pb 0 957 0 004 200 ISSR FL4 390 pb 0 091 0 066 242 ISSR FL5 164 pb 0 553 0 042 201 ISSR FL4 348 pb 0 001 1 187 243 ISSR FL5 151 pb 0 010 0 240 202 ISSR FL4 326 pb 0 010 0 240 244 ISSR FL5 129 pb 0 001 0 009 203 ISSR FL4 300 pb 0 347 0 001 245 ISSR FL5 116 pb 0 001 0 150 204 ISSR FL4 296 pb 0 076 0 098 246 ISSR FL6 582 pb 0 000 0 267 205 ISSR FL4 283 pb 0 001 0 009 247 ISSR FL6 555 pb 0 004 0 284 206 ISSR FL4 269 pb 0 002 0 018 248 ISSR FL6 496 pb 0 100 0 126 207 ISSR FL4 254 pb 0 475 0 081 249 ISSR FL6 453 pb 0 541 0 239 208 ISSR FL4 235 pb 0 006 0 006 250 ISSR FL6 437 pb 0 331 0 106 209 ISSR FL4 220 pb 0 316 0 039 251 ISSR FL6 409 pb 0 000 0 003 210 ISSR FL4 208 pb 0 086 0 191 252 ISSR FL6 379 pb 0 499 0 026 216 Annexes Annexe IL 6 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L luteus Contributions des Contributions variables des variables Code Marqu
116. 3 PZ4 PZ5 PN PZ1 PZ2 PZ3 PZ4 PZ5 PN Lupin Root Zones Figure IIL 11 PCR en temps r el des ADNc g n r s partir de racines normales et proteoides cultiv es en conditions d absence P ou pr sence P de phosphore en utilisant des amorces sp cifiques de LaSCR1 et LaSCR2 Les racines normales P sont utilis es en tant qu chantillons calibres A partir des r sultats r sum s au niveau de la figure III 11 on remarque que l expression de P ARNm de LaSCRI et LaSCR2 est similaire au niveau des plantes cultiv es dans les deux conditions d absence P pr sence P de phosphore Par contre le profil d expression des LaSCRs est variable selon le stade de d veloppement de ces proteoides Ainsi on note qu ind pendamment de la condition de stress l expression de LaSCR1 et LaSCR2 augmente au niveau des zones 2 et 3 Ces deux zones caract ristiques de la formation des m rist mes des racines proteoides Par ailleurs l expression des deux g nes diminue au niveau des racines proteoides matures ou zones 4 et 5 L expression des LaSCRs au niveau des feuilles n a pas t d tect e r sultats non pr sent s 2 3 Conclusion Les r sultats de la RT PCR et de la PCR en temps r el montrent que les deux g nes SCR s expriment au niveau des racines du lupin blanc Cette expression n a pas t affect e par les conditions de carence phosphorique P Par ailleurs on note que l expression de LaSCRI et
117. 35 37 ISSR F2 387 pb 0 039 0 253 79 ISSR F3 230 pb 0 952 0 584 38 ISSR F2 368 pb 0 135 0 001 80 ISSR F3 220 pb 1 601 0 020 39 ISSR F2 347 pb 0 1 0 126 81 ISSR F3 209 pb 0 499 0 026 40 ISSR F2 335 pb 0 131 0 001 82 ISSR F3 188 pb 1 129 0 107 41 ISSR F2 315 pb 0 001 0 637 83 ISSR F3 164 pb 1 129 0 107 42 ISSR F2 292 pb 0 162 0 007 84 ISSR FL1 1384 pb 0 499 0 026 214 Annexes Annexe IL 6 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans ACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L luteus Contributions Contributions des des variables variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 85 ISSR FL1 1024 pb 0 499 0 026 127 ISSR FL1 580 pb 0 553 0 042 86 ISSR FL1 875 pb 0 362 0 058 128 ISSR FL1 532 pb 1 129 0 107 87 ISSR FL1 792 pb 0 004 0 284 129 ISSR FL1 508 pb 0 147 0 362 88 ISSR FL1 792 pb 0 057 0 298 130 ISSR FL1 484 pb 0 009 0 093 89 ISSR FL1 709 pb 0 010 0 240 131 ISSR FL1 450 pb 1 129 0 107 90 ISSR FL1 640 pb 1 129 0 107 132 ISSR FL1 420 pb 1 827 0 335 91 ISSR FL1 640 pb 0 128 0 047 133 ISSR FL1 362 pb 0 118 0 021 92 ISSR FL1 603 pb 0 000 0 094 134 ISSR FL1 342 pb 0 209 0 000 93 ISSR FL1 600 pb 0 069 0 034 135 ISSR FL1 306 pb 0 098 1 118 94 ISSR FL1 580 pb 0 553 0 042 136 IS
118. 37 214 E ACG M CAG 442 pb 0 040 0 003 173 E ACG M CAC 446 pb 0 236 0 383 215 E ACG M CAG 422 pb 0 025 0 018 174 E ACG M CAC 435 pb 0 661 0 000 216 E ACG M CAG 407 pb 0 016 0 606 175 E ACG M CAC 430 pb 0 235 0 237 217 E ACG M CAG 391 pb 0 661 0 000 176 E ACG M CAC 407 pb 0 236 0 383 218 E ACG M CAG 382 pb 0 007 0 166 177 E ACG M CAC 385 pb 0 007 0 487 219 E ACG M CAG 367 pb 0 135 0 018 178 E ACG M CAC 371 pb 0 025 0 018 220 E ACG M CAG 353 pb 0 041 0 025 179 E ACG M CAC 361 pb 0 025 0 018 221 E ACG M CAG 333 pb 0 040 0 003 180 E ACG M CAC 353 pb 0 594 0 006 222 E ACG M CAG 321 pb 0 594 0 006 181 E ACG M CAC 344 pb 0 278 0 321 223 E ACG M CAG 311 pb 0 594 0 006 182 E ACG M CAC 343 pb 0 016 0 606 224 E ACG M CAG 296 pb 0 278 0 321 183 E ACG M CAC 327 pb 0 016 0 606 225 E ACG M CAG 282 pb 0 041 0 025 184 E ACG M CAC 317 pb 0 060 0 006 226 E ACG M CAG 275 pb 0 235 0 237 185 E ACG M CAC 311 pb 0 661 0 000 227 E ACG M CAG 270 pb 0 661 0 000 186 E ACG M CAC 303 pb 0 594 0 006 228 E ACG M CAG 263 pb 0 235 0 237 187 E ACG M CAC 302 pb 0 060 0 006 229 E ACG M CAG 252 pb 0 135 0 018 188 E ACG M CAC 285 pb 0 041 0 025 230 E ACG M CAG 234 pb 0 040 0 003 189 E ACG M CAC 276 pb 0 025 0 018 231 E ACG M CAG 219 pb 0 016 0 606 190 E ACG M CAC 276 pb 0 235 0 237 232 E ACG M CAG 212 pb 0 135 0 018 191 E ACG M CAC 256 pb 0 007 0 166 233 E ACG M CAG 208 pb 0 196 0 4
119. 4 2 866 360 ISSR FL5 200 pb 0 573 0 658 401 ISSR FL7 554 pb 0 712 0 016 361 ISSR FL5 194 pb 1 466 2 163 402 ISSR FL7 531 pb 0 712 0 016 362 ISSR FL5 400 pb 0 672 2 874 403 ISSR FL7 490 pb 0 486 0 240 363 ISSR FL5 231 pb 1 847 1 031 404 ISSR FL7 414 pb 1 232 0 281 364 ISSR FL5 157 pb 0 186 2 569 405 ISSR FL7 373 pb 0 334 2 866 365 ISSR FL5 126 pb 2 154 2 383 406 ISSR FL7 354 pb 0 083 1 173 366 ISSR FL5 283 pb 0 469 0 429 407 ISSR FL7 341 pb 0 712 0 016 367 ISSR FL6 579 pb 1 499 0 243 408 ISSR FL7 322 pb 0 053 0 955 368 ISSR FL6 548 pb 1 049 1 876 409 ISSR FL7 308 pb 0 263 1 006 369 ISSR FL6 518 pb 0 186 2 569 410 ISSR FL7 300 pb 0 263 1 006 211 Annexes Annexe IL 5 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L cosentinii Contributions Contributions des des variables variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 411 ISSR FL7 285 pb 1 620 2 192 452 ISSR FL8 164 pb 3 805 1 345 412 ISSR FL7 276 pb 1 022 1 680 453 ISSR FL8 153 pb 1 232 0 281 413 ISSR FL7 258 pb 1 369 0 499 454 ISSR FL9 1095 pb 0 892 0 938 414 ISSR FL7 237 pb 0 263 1 006 455 ISSR FL9 819 pb 2 248 0 248 415 ISSR FL7 228 pb
120. 40 0 003 267 E ACG M CAT 327 pb 0 041 0 025 309 E ACT M CAC 477 pb 0 278 0 321 268 E ACG M CAT 318 pb 0 025 0 018 310 E ACT M CAC 447 pb 0 135 0 018 269 E ACG M CAT 308 pb 0 236 0 383 311 E ACT M CAC 407 pb 0 002 0 238 270 E ACG M CAT 299 pb 0 025 0 018 312 E ACT M CAC 381 pb 0 278 0 321 271 E ACG M CAT 285 pb 0 236 0 383 313 E ACT M CAC 364 pb 0 236 0 383 272 E ACG M CAT 278 pb 0 025 0 018 314 E ACT M CAC 360 pb 0 007 0 166 273 E ACG M CAT 268 pb 0 661 0 000 315 E ACT M CAC 333 pb 0 661 0 000 274 E ACG M CAT 257 pb 0 007 0 166 316 E ACT M CAC 318 pb 0 016 0 606 275 E ACG M CAT 253 pb 0 278 0 321 317 E ACT M CAC 311 pb 0 002 0 238 276 E ACG M CAT 249 pb 0 236 0 383 318 E ACT M CAC 300 pb 0 661 0 000 277 E ACG M CAT 242 pb 0 594 0 006 319 E ACT M CAC 280 pb 0 060 0 006 278 E ACG M CAT 234 pb 0 236 0 383 320 E ACT M CAC 264 pb 0 661 0 000 279 E ACG M CAT 229 pb 0 661 0 000 321 E ACT M CAC 253 pb 0 002 0 238 280 E ACG M CAT 218 pb 0 007 0 166 322 E ACT M CAC 237 pb 0 236 0 383 281 E ACG M CAT 212 pb 0 025 0 018 323 E ACT M CAC 228 pb 0 007 0 166 282 E ACG M CAT 203 pb 0 135 0 018 324 E ACT M CAC 222 pb 0 236 0 383 283 E ACG M CAT 198 pb 0 007 0 166 325 E ACT M CAC 214 pb 0 002 0 238 284 E ACG M CAT 191 pb 0 060 0 006 326 E ACT M CAC 211 pb 0 661 0 000 285 E ACG M CAT 182 pb 0 135 0 018 327 E ACT M CAC 203 pb 0 661 0 000 286 E ACG M CAT 166 pb
121. 49 30 100 00 35 61 37 35 38 91 54 55 46 65 48 45 55 11 100 00 44 04 30 28 35 23 32 24 38 10 30 26 27 79 32 37 100 00 34 01 33 34 28 38 31 77 32 66 31 49 37 11 34 51 48 35 100 00 48 54 38 57 36 19 38 32 42 21 30 59 37 51 34 23 44 73 49 19 100 00 41 81 29 83 24 87 35 12 36 45 32 78 35 39 29 71 47 85 45 94 57 02 100 00 32 21 37 15 40 63 39 15 36 03 36 21 42 51 35 75 45 51 46 73 50 41 47 12 100 00 42 80 33 93 36 15 31 95 28 92 27 37 33 61 30 59 40 19 37 21 46 02 47 87 40 01 100 00 46 92 44 98 36 37 37 16 33 34 34 11 37 10 34 62 42 86 39 22 43 37 43 70 41 45 42 16 100 00 41 67 34 91 28 11 32 19 31 71 27 78 37 19 29 03 37 45 40 43 40 36 40 80 37 63 40 56 44 16 100 00 31 67 31 78 34 45 34 54 40 17 42 11 37 96 38 44 39 18 36 89 39 85 40 18 42 01 37 62 36 04 30 46 100 00 36 52 32 76 29 58 34 35 38 14 36 37 38 65 41 03 37 01 32 93 40 31 40 49 29 85 34 88 40 36 32 77 56 43 100 00 43 13 31 89 30 85 37 41 39 14 36 69 38 50 36 37 37 51 36 28 41 39 41 55 43 64 42 11 44 34 35 24 55 78 44 45 100 00 44 92 45 06 45 75 37 61 35 91 31 41 38 60 37 23 41 77 43 64 44 83 40 75 47 79 38 55 39 62 42 70 43 95 40 17 44 25 100 00 38 18 36 29 35 79 36 37 38 34 40 35 36 17 37 87 34 93 42 01 41 23 38 27 48 38 39 24 43 05 38 24 45 74 40 91 52 21 61 07 100 00 36 60 33 50 40 57 44 53 34 79 40 93 45 91 43 78 40 01 46 52 48 17 34 51 46 96 38 15 38 47 35 01 42 39 42 49 52 51 57 86 51 13 100 00 96 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit IT 2 2 2 a Distances g n tiques
122. 49_F CA411449 UniRef100_Q56X14_Auxin response factor 9 Arab E755_F CA411455 Histone deacetylase superfamily E758_F CA411458 GmTC229886_ similar to UPITAFA_MOUSE Q8KOHS Transcription initiation factor TFIID subunit 10 Transcription initiation factor TFIID 30 kDa subunit TAF 1 30 TAFII 30 mTAFI30 partial 7 121 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Tableau II 2 suite Liste des tiquettes singletons Code EST Code NCBI Description E761_F CA411462 Histone core E771_F CA411470 Histone H1 H5 E775_F CA411474 GRAS transcription factor SCR E785_F CA411484 MtTC100497_ similar to UPIQ7Y1B6 Q7Y1B6 GAI like protein partial 72 E794_F CA411493 GmTC220681_ similar to UPIQ6Z2V7 Q6Z2V7 NHL repeat containing protein like partial 27 E817_F CA411515 GmTC203635_ similar to PIRIT46225IT46225 alpha NAC like protein Arabidopsis thaliana partial 71 E844_F CA411542 GmTC214290_ homologue to UPIQ6UJX5 Q6UJX5 Molecular chaperone Hsp90 2 complete E848_F CA411546 TIP49 C terminal E849 F CA411547 MtTC109325_ similar to UPIQ6AXI9 Q6AXI9 Zec 101129 protein partial 33 YPR_011_A07_050 abl_5 ORFI Pathogenesis related transcriptional factor and ERF YPR_012_H04_032 ab1_1_ORF2 HMG1 2 high mobility group box YPR_013_C11_082 abl_1_ORFI Helix loop helix DNA binding Etiquettes non encore d pos es
123. 52 pb 0 140 1 186 143 ISSR FL7 280 pb 1 184 0 436 103 ISSR FL5 515 pb 0 055 0 081 144 ISSR FL7 254 pb 1 260 0 073 104 ISSR FL5 469 pb 0 040 0 417 145 ISSR FL7 233 pb 0 040 0 417 105 ISSR FL5 443 pb 1 260 0 073 146 ISSR FL7 220 pb 0 861 0 522 106 ISSR FL5 404 pb 0 140 1 186 147 ISSR FL7 206 pb 1 184 0 436 107 ISSR FL5 384 pb 1 260 0 073 148 ISSR FL7 178 pb 0 861 0 522 108 ISSR FL5 355 pb 0 040 0 417 149 ISSR FL7 155 pb 0 230 0 021 109 ISSR FL5 341 pb 0 140 1 186 150 ISSR FL9 640 pb 1 260 0 073 110 ISSR FL5 317 pb 0 055 0 081 151 ISSR FL9 501 pb 1 260 0 073 111 ISSR FL5 285 pb 0 454 1 293 152 ISSR FL9 432 pb 1 260 0 073 112 ISSR FL5 250 pb 0 156 0 121 153 ISSR FL9 350 pb 1 260 0 073 113 ISSR FL5 192 pb 0 454 1 293 154 ISSR FL9 324 pb 1 184 0 436 114 ISSR FL5 163 pb 0 454 1 293 155 ISSR FL9 300 pb 0 861 0 522 115 ISSR FL5 142 pb 0 454 1 293 156 ISSR FL9 264 pb 0 454 1 293 116 ISSR FL6 817 pb 1 260 0 073 157 ISSR FL9 239 pb 0 323 0 009 117 ISSR FL6 768 pb 1 260 0 073 158 ISSR FL9 218 pb 0 230 0 021 118 ISSR FL6 635 pb 1 260 0 073 159 ISSR FL9 186 pb 0 002 0 502 119 ISSR FL6 539 pb 1 184 0 436 160 ISSR FL9 157 pb 0 454 1 293 120 ISSR FL6 500 pb 1 260 0 073 161 ISSR FL9 133 pb 0 046 1 326 121 ISSR FL6 467 pb 1 184 0 436 162 ISSR FL9 120 pb 0 140 1 186 122 ISSR FL6 415 pb 1 645 0 111 163 ISSR FL9 110 pb 0 046 1 326 1
124. 6 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L luteus Contributions Contributions des des variables variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 337 ISSR FL10 747 pb 0 174 0 002 365 ISSR FL11 573 pb 0 000 0 267 338 ISSR FL10 687 pb 0 176 0 002 366 ISSR FL11 549 pb 0 474 0 039 339 ISSR FL10 639 pb 0 087 0 289 367 ISSR FL11 517 pb 0 553 0 042 340 ISSR FL10 547 pb 0 000 0 073 368 ISSR FL11 486 pb 0 076 0 161 341 ISSR FL10 543 pb 0 008 0 500 369 ISSR FL11 459 pb 0 083 0 281 342 ISSR FL10 488 pb 0 001 0 150 370 ISSR FL11 439 pb 0 069 0 034 343 ISSR FL10 367 pb 0 001 0 150 371 ISSR FL11 436 pb 0 010 0 240 344 ISSR FL10 351 pb 0 276 0 117 372 ISSR FL11 420 pb 0 144 0 000 345 ISSR FL10 334 pb 0 952 0 584 373 ISSR FL11 384 pb 1 601 0 020 346 ISSR FL10 319 pb 0 000 0 267 374 ISSR FL11 366 pb 0 432 0 053 347 ISSR FL10 296 pb 0 008 0 500 375 ISSR FL11 361 pb 0 553 0 042 348 ISSR FL10 249 pb 0 083 0 281 376 ISSR FL11 337 pb 0 004 0 426 349 ISSR FL10 240 pb 0 091 0 066 377 ISSR FL11 323 pb 0 073 0 261 350 ISSR FL10 223 pb 0 001 0 150 378 ISSR FL11 295 pb 0 408 0 000 351 ISSR FL10 195 pb 0 111 0 231 365 ISSR FL11 281 pb 0 001 0 009 352 ISSR FL10 182 pb 0 000 0 267 366 ISSR FL11 265 pb 0 408 0 000 353 ISSR FL10 155 pb 0 378 0 136 367
125. 6 LS01 SCRF5 gt SCR F8 SCRF7 Figure III 6 Sch ma du s quen age du g ne LaSCR1 haut et du g ne LaSCR2 bas Les fl ches indiquent la position d amorces utilis es dans le s quen age Les lignes pointill es d finissent les s quences obtenues Le GT et AG indiquent le d but et la fin d introns 141 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc LaSCR1 2 ATG TAA si HER eof a EU ATG TGA Atser O e HE 500 bp Figure III 7 Structure des deux g nes LaSCR1 et LaSCR2 en comparaison avec AtSCR sur la base des domaines fonctionnels Les rectangles indiquent les s quences codantes Les lignes indiquent les s quences non codantes Les lignes en gras repr sentent les parties des s quences o les deux introns sont tr s similaires ATG codons d initiations TAA et TGA codons stop 142 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 1 4 Nombre de copies du SCR dans le g nome du lupin blanc Deux southern blots ont t optimis s afin de v rifier le nombre de copies du g ne SCR chez Le lupin blanc Les southern blots ont t pr par s avec de ADN dig r par EcoRI ou HindIII et ont t soumis a une hybridation par 1 ADNc de LaSCRI ou de LaSCR2 comme sondes Les tapes de pr paration du gel d ADN et de l hybridation sont d taill es dans l annexe III 4 La figure II 8 montre les deux southern blots hybrid s respectivement avec l ADNc de
126. 6 pb 0 248 0 571 331 ISSR FL11 147 pb 0 335 0 021 294 ISSR FL10 251 pb 0 017 0 155 332 ISSR FL11 123 pb 0 484 0 020 295 ISSR FL10 240 pb 1 428 0 003 296 ISSR FL10 166 pb 0 391 0 301 206 Annexes Annexe IT 5 Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans I ACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L cosentinii Contributions Contributions des variables des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 1 ISSR F1 975 bp 1 369 0 499 42 ISSR FL4 437 pb 1 369 0 499 2 ISSR F1 544 bp 1 369 0 499 43 ISSR FL5 561 pb 1 232 0 281 3 ISSR F1 329 bp 1 232 0 281 44 ISSR FL5 310 pb 0 511 0 194 4 ISSR F1 192 bp 1 620 2 192 45 ISSR FL5 219 pb 0 322 2 351 5 ISSR F1 172 bp 1 369 0 499 46 ISSR FL5 182 pb 0 799 0 914 6 ISSR F1 138 bp 1 369 0 499 47 ISSR FL5 141 pb 0 712 0 016 7 ISSR F2 237 bp 1 159 1 462 48 ISSR FL5 343 pb 1 232 0 281 8 ISSR F2 196 bp 0 083 1 173 49 ISSR FL5 183 pb 0 892 0 938 9 ISSR F2 121 bp 0 595 0 701 50 ISSR FL5 116 pb 0 263 1 006 10 ISSR F2 384 bp 1 369 0 499 51 ISSR FL5 323 pb 0 263 1 006 11 ISSR F2 395 bp 0 098 1 671 52 ISSR FL5 475 pb 0 240 0 235 12 ISSR F2 146 bp 0 799 0 914 53 ISSR FL5 800 pb 0 083 1 173 13 ISSR F3 1111 bp 0 143 1 429 54
127. 60pb FL10 296 27pb ut FL11 869 11pb FL11 760 41pb FL11 693 70pb IT 2 2 3 a Matrice des distances g n tiques Les similarit s g n tiques entre les accessions de L luteus ont t calcul es sur la base des donn es ISSR et selon l indice de diversit de Dice et les r sultats figurent dans le tableau 11 26 La similarit entre les diff rentes accessions t tr s importante vu les valeurs enregistr es Les pourcentages de similarit les plus faibles taient de 68 7 69 7 68 5 et 68 0 et ont t obtenus entre des populations g ographiquement loign es Par ailleurs les pourcentages de similarit les plus lev s 88 7 et 88 5 ont t not s entre des populations de la r gion du Rharb Lut03 LutO1 et Lut02 Lut01 Aussi des pourcentages de similarit interm diaires ont t enregistr s entre diff rentes populations et notamment entre deux populations de Khemisset Lut07 et Lut08 106 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau II 26 Pourcentages de similarit s obtenus entre les populations de L luteus Lut05 100 Lut06 83 7 100 Lut07 76 2 79 8 100 Lut01 77 4 74 6 75 5 100 Lut03 80 4 80 9 80 6 88 7 100 Lut02 73 9 73 6 74 9 88 5 87 9 100 Lut09 68 7 71 3 69 7 71 6 75 0 73 3 100 Lut08 74 5 74 1 72 5 68 5 73 2 68 0 51 8 100 Oo Oo Ll ed Oo 10 o o q po te EEN A nn a 4 4 4 A E ES E 1
128. 677 40 pb 2 FL12 149 26 pb 3 FL1 392 09 pb 4 FL9 185 86 pb 5 F1 240 92 pb 6 FL5 192 22 pb 7 F2 188 23 pb 8 F1 191 65 pb 9 FL9 264 04 pb 10 F1 268 73 pb 11 FL6 414 87 pb 12 FL7 319 05 pb 13 F2 211 89 pb 14 FL12 255 80 pb 15 FL3 581 99 pb 16 FL7 435 18 pb 17 FL9 501 48 pb 18 FL7 767 10 pb 19 FL3 238 31 pb 20 FL6 174 54 pb 21 FL3 344 56 pb 22 FL5 383 80 pb 23 FL1 285 76 pb 24 FL1 654 92 pb 25 FL7 767 12BP pb 26 FL12 198 69 pb 27 FL12 428 69 pb 28 FL3 504 35 pb 29 F2 246 13 pb 30 FL6 160 68 pb 31 FL6 253 25 pb 32 F1 459 09 pb 33 F1 180 64 pb 34 F2 272 02 pb 35 FL5 468 73 pb 36 FL1 422 49 pb 37 FL1 147 21 pb 38 FL9 323 63 pb 39 FL7 205 55 pb 40 FL12 216 86 pb 41 FL1 185 39 pb 42 FL2 242 69 pb 43 F1 154 73 pb 44 FLA 396 50 pb 45 FL2 263 06 pb 46 FL1 495 50 pb 47 FL5 551 96 pb 48 FL12 873 35 pb 49 FL1 196 32 pb 50 FL5 783 18 pb 74 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit IT 2 1 2 c Analyse en composantes principales Les donn es ISSR ont t analys es par le logiciel XLSTAT 2009 pour g n rer une repr sentation bidimensionnelle des quatre esp ces de lupin Figure I 7 L analyse en composante principale ACP permet de visualiser le lien entre les quatre esp ces ainsi que la contribution des marqueurs ISSR dans cette repr sentation L annexe II 2 r sume la contribution de ces marqueurs Les deux premiers axes F1 et F2 repr sentent 32 et 30 3
129. 7 219 pb 0 091 0 066 316 ISSR FL9 523 pb 0 118 0 021 275 ISSR FL7 204 pb 0 003 0 122 317 ISSR FL9 497 pb 0 553 0 042 276 ISSR FL7 188 pb 0 001 0 009 318 ISSR FL9 479 pb 0 091 0 066 277 ISSR FL7 173 pb 0 103 0 278 319 ISSR FL9 458 pb 0 000 0 267 278 ISSR FL7 146 pb 0 541 0 239 320 ISSR FL9 437 pb 0 014 0 003 279 ISSR FL7 127 pb 0 008 0 500 321 ISSR FL9 422 pb 0 499 0 026 280 ISSR FL7 127 pb 0 008 0 500 322 ISSR FL9 405 pb 0 000 0 073 281 ISSR FL7 117 pb 0 100 0 126 323 ISSR FL9 362 pb 0 081 0 004 282 ISSR FL7 108 pb 0 457 0 564 324 ISSR FL9 337 pb 0 004 0 284 283 ISSR FL8 1406 pb 0 008 0 500 325 ISSR FL9 301 pb 0 009 0 042 284 ISSR FL8 1021 pb 0 039 0 253 326 ISSR FL9 286 pb 0 135 0 001 285 ISSR FL8 787 pb 0 100 0 126 327 ISSR FL9 259 pb 0 325 0 247 286 ISSR FL8 679 pb 0 057 0 298 328 ISSR FL9 234 pb 0 091 0 066 287 ISSR FL8 635 pb 0 001 0 150 329 ISSR FL9 207 pb 0 008 0 500 288 ISSR FL8 576 pb 0 008 0 500 330 ISSR FL9 176 pb 0 144 0 000 289 ISSR FL8 549 pb 0 000 0 267 331 ISSR FL9 165 pb 0 137 0 189 290 ISSR FL8 496 pb 0 051 0 108 332 ISSR FL9 143 pb 0 008 0 500 291 ISSR FL8 466 pb 0 109 0 000 333 ISSR FL9 126 pb 0 000 0 267 292 ISSR FL8 438 pb 0 008 0 500 334 ISSR FL10 1343 pb 0 499 0 026 293 ISSR FL8 406 pb 0 076 0 098 335 ISSR FL10 1112 pb 0 008 0 500 294 ISSR FL8 406 pb 0 002 0 018 336 ISSR FL10 882 pb 0 000 0 003 217 Annexes Annexe IL
130. 729 3 1 399 1 218 E080 F 1 386 om26 01374 onu opan O76 0464 BON m2 E647 F 1 445 om28 0438 om27 ons omg 03023 1 027 eg YPRO05_E05 0361 L381 0S0 0883 OOT OSB 0 205 07129 L368 sasa YPR_ _008 A04 022 abl 1410 0 135 0 147 0 199 0 182 0 517 sor ras 019 0344 0104 oa86 0258 0 567 0 707 208 YPR_009_H08 _064 ab1 1 405 05144 0404 05132 0 167 7 k TBE _ 1 419 Quo 0898 Qu O79 0 256 0439 0 624 maaa 1 467 0 076 0 120 0 269 YPR_002_HOT_060abI 1 412 0 150 0 366 0 135 0 162 0 228 0 353 1 204 By YPR 009 EI _083 abl 1 451 0 078 0 382 0 090 0 119 0 300 0 311 1 315 0 601 YPR_009_ COL _002 abl 1 386 0 093 0 21 0 139 oI 1 335 A es Fer OT LORS OO LOL LS DT LOST YPR_008_CI2 087 abl GE re se 0290 T O0 tee LR 007a LT Ts Le sur lignage indique les g nes qui sont sur exprim s ou sous exprim s __ 222 Annexes Annexe III 2 suite Expression des facteurs de transcription en r ponse au diff rents stress YPR_005_F11 _092 ab1 1 552 OM49 01392 om36 ose 0225 1262 Bom E YPR_008_A08 _054 ab1 1 436 0 153 0 130 0 163 YPR_009_G07 _052 ab1 1 366 09129 01875 01093 055 01193 0 290 0 974 ess 1 294 0 141 0 366 0 072 0 160 0 226 0 001 YPR_010_H08 _073 ab1 1 433 0 127 0 365 0 099 0 154 0 176 0 013 1 022 YPR_003_A05 _033ab1 07129 0150 02
131. 78 bandes AFLP ont t not es avec une moyenne de 27 8 bandes par amorce Le nombre des fragments AFLP allait de 16 E ACG M CAG a 38 E ACT M CAG Le poids mol culaire de ces fragments variait entre 130 51pb et 1827pb Les amorces utilis es ont t tr s informatives avec des valeurs de PIC proche de 1 Les valeurs de PIC variaient entre 0 93 et 0 97 avec une moyenne de 0 956 et un cart type de 0 011135 Des 1064 fragments AFLP enregistr s on remarque que plusieurs bandes sont communes aux diff rentes esp ces N anmoins on note que 322 a savoir 30 26 des marqueurs taient sp cifiques Tableau II 8 101 soit 43 16 des marqueurs se sont r v l s sp cifiques pour L albus avec une moyenne de 10 marqueurs par amorce Le nombre de ces marqueurs variait de 2 E ACC M CAG et E ACG M CAC 52 E ACT M CAT 60 21 66 marqueurs sp cifiques pour L angustifolius avec une moyenne de 6 marqueurs par amorce Le nombre de ces marqueurs variait entre 1 E ACC M CAG E ACT M CAG et E AGG M CTC et 21 E ACT M CAT 75 27 27 des marqueurs t sp cifiques pour L cosentinii avec en moyenne 7 5 marqueur par amorce Le nombre de ces marqueurs allait de 2 E ACC M CAT et E ACG M CAG 31 E ACT M CAT 86 30 9 marqueurs sp cifiques pour L luteus avec une moyenne de 8 6 marqueurs par amorce Le nombre de ces fragments t variable entre 3 E ACG M CAG et 22 E ACT M CAT 11 Le lupin au Maroc Structurat
132. 8 FL1 113 70pb FL2 321 92pb FL2 414 16pb FL3 1063pb FL8 830 97pb FL10 530 26pb FL11 1052pb Alb05 F1 933pb FL2 103 69pb FL3 348 86pb FL10 780 04pb Alb09 F2 212 46pb FL1 185 93pb FL1 255 34pb FL1 563 51pb FL2 391 30pb FL3 138 89pb FL8 511 43pb FL8 207 85pb FL11 416 72pb FL11 122 63pb Alb02 FL5S 206 83pb 85 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau II 14 Matrice des similarit s calcul es entre les accessions de L albus sur la base des marqueurs ISSR Alb08 100 Alb07 77 7 100 Alb06 72 6 77 5 100 AIb0S 78 8 75 5 81 5 100 Alb10 71 1 71 3 72 2 745 100 Alb09 77 9 76 5 71 4 74 8 80 8 100 Alb04 70 3 70 4 74 3 78 8 70 7 71 4 100 A1b03 71 0 72 9 73 7 74 9 72 5 74 0 82 5 100 AIb02 70 4 72 0 76 1 77 0 71 2 72 3 80 7 79 6 100 AlbOI 73 2 71 1 73 2 70 8 70 1 715 72 1 77 6 80 100 86 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau IL 15 Marqueurs ISSR uniques obtenus pour chacun des groupes de L albus Groupe Accessi Nombre de Moyenne Nombre de Marqueurs sp cifiques on marqueurs Diversit marqueurs sp cifiques L a GI Alb05 554 0 00208226 40 F1 933pb F1 400 59pb F1 290 66pb F1 167 31pb F1 158 18pb F1 Alb06 151 24pb F2 322 36pb F3 715 21pb F4 495 50pb F4 314 43pb ALb07 FL1 770 80pb FL1 365 36pb FL1 271 31pb FL1 262 90pb Alb08 FL1 127 09pb FL1 113 70pb FL2 414 16pb FL2 321 92pb FL2 103 69pb FL2 96 10pb FL3 1063pb FL3 348
133. 80 nm N anmoins la quantit d ADN obtenue nous a sembl insuffisante pour r aliser l ensemble des exp riences de PCR programm es 11 1 2 4 Protocole am lior de B OUENZAR 1998 Le protocole de B Ouenzar 1998 a t maintenu pour l extraction de ADN du lupin avec deux modifications principales afin de le rendre plus pratique Nous avons augment la quantit du mat riel v g tal initial utilis e afin d avoir suffisament d ADN lg de feuilles fraiches de lupin a t utilis au lieu de 200 mg Aussi l ensemble des volumes des tampons utilis s dans l extraction ont t ajust s multipli s par 5 L tape d incubation 60 C du mat riel v g tal broy avec le SDS et l ac tate de sodium a t perform sans ph nol chloroforme Par mesure de s curit le ph nol chloroforme a t ajout au m lange apr s l tape d incubation II 1 3 Les marqueurs RAPD Optimisation du protocole d amplification RAPD PCR Les marqueurs RAPD ont t choisis dans un premier temps afin d tudier la diversit g n tique chez le lupin du Maroc Nous avons commenc par optimiser le protocole d amplification pour avoir un r sultat interpr table et reproductible Nous avons ainsi test diff rentes concentrations des composants du m lange r actionnel de la PCR ainsi que du programme d amplification Les ADN de deux esp ces de lupin ont t utilis s dans ces tests d optimisation L luteus et L
134. 86 56 11 1 2 2 Extraction de l ADN total du lupin selon le protocole modifi de BERNATSKY et TANKSLEY 1986 58 11 1 2 3 Extraction de l ADN total du lupin selon le protocole brute de B OUENZAR et al 1998 58 11 1 2 4 Protocole am lior de B OUENZAR 1998 59 Il 1 3 Les marqueurs RAPD Optimisation du protocole d amplification RAPD PCR 59 11 1 3 1 Optimisation du m lange r actionnel de l amplification RAPD PCR 60 11 1 3 2 Protocole d amplification de l ADN par la RAPD PCR eee eee nee nae 60 a4 LSS MAQUIS ASSR ns uns RE nn en 61 TES BSS Marqueurs ARUP isis cis ster N er eee Rd A E A A D de nn ee 62 IG Analyse des TeSUITAIS armes Ath damn man Center eee Ent 65 EDS SU ACS 2 Senna dont talennhe dette ste date telnet ae stat taie 68 Il 2 1 Analyse de la diversit inter sp cifique 68 Il 2 1 1 Polymorphisme r v l par les marqueurs RAPD cence ee eeaeeeeeeneeeenanes 68 11 2 1 2 Apport des marqueurs ISSR dans l tude de la diversit inter sp cifique 70 ll 2 1 2 a Distances g n tiques een den tn ann as tete Nate 73 ll 2 1 2 b Classification hi rarchique same rennes ie is 73 11 2 1 2 c Analyse en composantes principales os eeeeeeeeeeccecceccceeceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeneesnenees 75 Il 2 1 3 Apport des marqueurs AFLP dans la diversit inter sp cifique 75 ll 2 1 3 a Distances g n tiques ii arm
135. 89 192 E ACG M CAC 243 pb 0 135 0 018 234 E ACG M CAG 202 pb 0 236 0 383 193 E ACG M CAC 238 pb 0 007 0 166 235 E ACG M CAG 190 pb 0 196 0 489 194 E ACG M CAC 225 pb 0 594 0 006 236 E ACG M CAG 186 pb 0 007 0 166 195 E ACG M CAC 221 pb 0 278 0 321 237 E ACG M CAG 181 pb 0 236 0 383 196 E ACG M CAC 208 pb 0 135 0 018 238 E ACG M CAG 177 pb 0 661 0 000 197 E ACG M CAC 197 pb 0 135 0 018 239 E ACG M CAG 172 pb 0 236 0 383 198 E ACG M CAC 182 pb 0 135 0 018 240 E ACG M CAG 166 pb 0 007 0 166 199 E ACG M CAC 173 pb 0 196 0 489 241 E ACG M CAG 150 pb 0 196 0 489 200 E ACG M CAC 168 pb 0 661 0 000 242 E ACG M CAG 150 pb 0 025 0 018 201 E ACG M CAC 157 pb 0 661 0 000 243 E ACG M CAG 144 pb 0 236 0 383 202 E ACG M CAC 146 pb 0 661 0 000 244 E ACG M CAT 1047 pb 0 135 0 018 203 E ACG M CAC 141 pb 0 594 0 006 245 E ACG M CAT 987 pb 0 002 0 238 204 E ACG M CAC 131 pb 0 661 0 000 246 E ACG M CAT 906 pb 0 236 0 383 205 E ACG M CAG 861 pb 0 016 0 606 247 E ACG M CAT 855 pb 0 041 0 025 206 E ACG M CAG 711 pb 0 041 0 025 248 E ACG M CAT 805 pb 0 007 0 166 207 E ACG M CAG 662 pb 0 235 0 237 249 E ACG M CAT 773 pb 0 135 0 018 208 E ACG M CAG 632 pb 0 135 0 018 250 E ACG M CAT 700 pb 0 135 0 018 209 E ACG M CAG 568 pb 0 002 0 238 251 E ACG M CAT 631 pb 0 002 0 238 210 E ACG M CAG 523 pb 0 041 0 025 199 Annexes Annexe IL 3 suite Contribution de
136. 9 de la variabilit totale Le tableau II 6 r sume les valeurs propres et la variabilit des deux axes La contribution de chacun des marqueurs ISSR dans cette distribution a t r sum e dans l annexe II 2 Tableau II 6 Valeur propre variabilit et pourcentage cumul des deux premiers axes de l ACP Axe F1 Axe F2 Valeur propre 1 280 1 216 Variabilit 32 002 30 399 cumul 32 002 62 400 II 2 1 3 Apport des marqueurs AFLP dans la diversit inter sp cifique L tude de la diversit inter sp cifique du lupin par les marqueurs AFLP a t men e sur L albus L angustifolius L cosentinii et L luteus 10 combinaisons d amorces AFLP Tableau II 3 ont t utilis es et ont permis d engendrer des profils lectrophor tiques tr s h t rog nes Figure II 8 Le nombre de bandes AFLP obtenues a t variable d une esp ce a une autre et selon l amorce utilis e Tableau II 7 Aussi et sur un ensemble de 510 bandes g n r es avec 51 bandes par amorce 457 89 6 ont t polymorphes Chez L albus 234 bandes AFLP ont t g n r es avec une moyenne de 23 4 bandes par amorce Le nombre de ces fragments variait de 16 E ACC M CAG a 33 E ACT M CAG La taille des bandes obtenues allait entre 138 28 pb et 2157 pb Les amorces utilis es ont t tr s informatives d o les valeurs de PIC entre 0 93 et 0 98 avec une moyenne de 0 95 et un cart type de 0 0
137. 9 11 FL2 7 6 5 6 4 5 8 6 5 7 FL3 10 9 11 11 9 8 10 15 9 12 FL4 8 8 8 9 8 9 9 8 8 8 FL5 3 3 3 3 3 3 2 3 2 4 FL6 13 11 11 12 13 12 9 11 13 12 FL7 6 5 9 8 6 5 5 6 6 6 FL8 8 10 9 8 12 8 10 4 10 6 FL10 16 26 14 13 11 17 17 20 12 15 FL11 8 8 7 12 7 11 13 15 13 7 83 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit II 2 2 Analyse de la diversit intra sp cifique H 2 2 1 Chez Lupinus albus L analyse intra sp cifique de L albus sur la base des marqueurs ISSR a permis de g n rer des profils lectrophor tiques tr s h t rog nes Figure IL 11 A l aide des 15 amorces ISSR 402 bandes ont t obtenues avec une moyenne de 26 8 bande par amorce Le nombre de fragments g n r s a t variable selon l amorce utilis e Tableau H 11 Le nombre minimum de bandes a t r v l par l amorce FLS et le nombre maximum avec l amorce FL10 Le poids mol culaire de ces fragments variait entre 96 10 pb et 2928 pb Moyennant ces marqueurs un taux de polymorphisme de 97 75 a t r v l Aussi les indices de diversit ou PIC ont t tr s importants entre 0 91 et 0 97 avec une moyenne de 0 927 et un cart type de 0 0509 Tableau II 12 La comparaison des 10 accessions d albus sur la base des marqueurs ISSR g n r s montre qu ils pr sentent en commun plusieurs fragments ISSR N anmoins chaque accession a t caract ris e par au moins un marqueur unique Tableau II 13 Ainsi 64
138. 92 0 938 189 ISSR F4 344 pb 0 486 0 240 230 ISSR FL1 195 pb 0 059 1 219 190 ISSR F4 329 pb 1 729 1 251 231 ISSR FL1 192 pb 1 369 0 499 191 ISSR F4 320 pb 1 369 0 499 232 ISSR FL1 184 pb 1 369 0 499 192 ISSR F4 302 pb 1 369 0 499 233 ISSR FL1 178 pb 1 369 0 499 193 ISSR F4 290 pb 1 369 0 499 234 ISSR FL1 161 pb 1 369 0 499 194 ISSR F4 277 pb 1 369 0 499 235 ISSR FL1 156 pb 0 755 1 156 195 ISSR F4 263 pb 1 232 0 281 236 ISSR FL1 149 pb 1 369 0 499 196 ISSR F4 248 pb 0 263 1 006 237 ISSR FL1 135 pb 1 232 0 281 197 ISSR F4 237 pb 0 127 0 788 238 ISSR FL1 126 pb 1 369 0 499 198 ISSR F4 224 pb 0 595 0 701 239 ISSR FL1 116 pb 0 237 1 202 199 ISSR F4 214 pb 1 232 0 281 240 ISSR FL2 1696 pb 1 159 1 462 200 ISSR F4 193 pb 1 369 0 499 241 ISSR FL2 1299 pb 0 511 0 194 201 ISSR FL1 1199 pb 0 127 0 788 242 ISSR FL2 1241 pb 0 322 2 351 202 ISSR FL1 976 pb 1 369 0 499 243 ISSR FL2 1173 pb 1 022 1 680 203 ISSR FL1 908 pb 0 306 0 407 244 ISSR FL2 1093 pb 1 049 1 876 204 ISSR FL1 772 pb 0 127 0 788 245 ISSR FL2 924 pb 1 369 0 499 205 ISSR FL1 744 pb 1 369 0 499 246 ISSR FL2 848 pb 0 443 0 625 209 Annexes Annexe IL 5 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L cosentinii
139. 97 F CA411104 Tubby E399 F CA411106 Pathogenesis related transcriptional factor and ERF E463_F CA411170 GmTC215369_ UPIO22465 022465 GH1 protein Fragment complete E473_F CA411170 UniRef100_Q8LBV8_Putative DNA binding protein E478_F CA411184 MtTC106609_ similar to UPIGIGA_ARATH Q9SQI2 GIGANTEA protein partial 90 E485_F CA4I1191 RING U box E491_F CA411197 14 3 3 protein ESOI_F CA411207 ssDNA binding transcriptional regulator E502_F CA411208 Transcription initiation Spt4 E520_F CA411225 UniRef100_Q5VQY5_Putative ring finger protein E529_F CA411234 AtTC261385_ UPIERF4_ARATH 080340 Ethylene responsive element binding factor 4 AtERF4 complete ES41_F CA411246 GmTC218149_ similar to UPIQ70127 Q70127 SAR DNA binding protein like protein partial 57 E545_F CA411250 GmTC216457_similar to GBIAAS58510 1145357102IA Y550299 MYB transcription factor Arabidopsis thaliana partial 27 E585_F CA411289 Histone H2B E598_F CA411302 GmTC219208_ weakly similar to UPIQ948K9 Q948K9 CmE8 protein partial 87 E627_F CA411329 Zinc finger C2H2 type E630_F CA411332 UniRef100_Q94KS0_Histidine containing phosphot E659 F CA411361 Histone H3 E692_F CA411393 UniRef100_Q5Z9H7_Zinc finger protein like Oryza sa E706_F CA411407 Pathogenesis related transcriptional factor and ERF E730_F CA411431 Heat shock protein Hsp90 E742_F CA411431 LIM zinc binding E745_F CA411445 SET domain E7
140. AGTCTCTOGATTICATTTAAAAAAT 576 AGCAATAAGAAAATGCTAAGCATGAGCAACAACATACATAARAATCAAAATACACAAAGAC Sine finger 516 AAACAACAAATTGACAATAAGTATACCCTTGGCATTOGAT TAGAGATAGATCOCAAAAGGE HES1 456 BRAATOGCATAGAGARCECTOTTCAAGCCAGRA RAA AA AACOGGAATOCTETTOGCCATTOTOCA 396 AATCTTCACACCOTTATCTOCNTTGONMTATACGCTACTAATTCAAATTACACATAACATTC 336 CTTOGCTTCAATGGGATGOGCTTT TAGCTAGCTAAGTTAATTATTTGATATAGAGAGGAGG 276 ABRAAAGTACATAAACATATTAAASSAAAT ICTACTGCIATGAGCTGAACCTATTATCTATT BESi Sine finger 216 GOGACATASRATCACATGTATTAAATGACATTATATTTICCCOTCOCAGATTAATGATAATTA 156 CTTTTTGTTTTAATTTTTTTTATTTTCTCTATGTAMAATATCATAATARATTGAACAAC BES1 96 ATACATGTGATTTATGTOCCTTATCTATTACCCATCA TATCACCTATTAATCTATCTCAC TC Rick 36 TOACCTTOCCTIOTETETARARATOCATOCTTOETOECTATS Figure III 13 Position des l ments r gulateurs d tect s au niveau des 1176 pb du promoteur de LaSCR2 Le codon d initiation est marqu par le ATG soulign 3 1 1 b Clonage du promoteur LaSCR2 en amont du g ne rapporteur GUS Le but de cette exp rience tait de cloner une partie du promoteur de LaSCR2 en amont du g ne rapporteur GUS pr alablement ins r dans le vecteur pBI 101 2 La fusion promoteur pLaSCR2 GUS a t optimis e de fa on avoir les deux codons d initiation dans un m me cadre de lecture 1Kb du promoteur LaSCR2 contenant le codon d initiation et 5 pb de la s quence 152 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc codante de LaSCR2 a t amplifi pa
141. ARNm en petits fragments ne pouvant plus se traduire en prot ines entra ne le silen age des g nes Pour ceci l ARNi est aussi appel silen age post transcriptionel Chez Arabidopsis thaliana existe plusieurs homologues de Dicer qui agissent quand la plante est expos e plusieurs types de virus Ce ph nom ne est reconnu pour tre un syst me immunitaire adaptatif tabli par la plante En r ponse les virus affectant les plantes ont labor des m canismes qui permettent de supprimer la r ponse RNAi chez les cellules de plantes Ceci inclut les prot ines virales qui s attachent aux courts fragments d ARN double brin Quelques g nomes de plantes expriment aussi des ARNsi en r ponse une infection par des bact ries de types sp cifiques Actuellement ARNi est largement exploit en biologie pour tudier la fonction des g nes dans la culture de cellules in vivo pour plusieurs organismes mod les Pour ce fait DARN double brin est synth tis partir d une s quence compl mentaire au g ne d int r t et introduit dans la cellule ou dans l organisme Cet ARN sera reconnu comme un mat riel g n tique exog ne et va donc activer le processus d ARNi Ce moyen permet aux chercheurs de r duire l expression des g nes cibles et d tudier le r le physiologique des produits du g ne On parle aussi du m canisme de Knock down par opposition au Knock out qui permet d inhiber enti rement l expression du g ne Les bio
142. AT 148 pb 0 661 0 000 139 E ACC M CTA 273 pb 0 661 0 000 98 E ACC M CAT 146 pb 0 007 0 166 140 E ACC M CTA 267 pb 0 278 0 321 99 E ACC M CAT 142 pb 0 661 0 000 141 E ACC M CTA 252 pb 0 235 0 237 100 E ACC M CAT 138 pb 0 235 0 237 142 E ACC M CTA 243 pb 0 235 0 237 101 E ACC M CAT 134 pb 0 235 0 237 143 E ACC M CTA 234 pb 0 016 0 606 102 E ACC M CAT 131 pb 0 661 0 000 144 E ACC M CTA 224 pb 0 016 0 606 103 E ACC M CTA 1060 pb 0 235 0 237 145 E ACC M CTA 214 pb 0 040 0 003 104 E ACC M CTA 1014 pb 0 002 0 238 146 E ACC M CTA 208 pb 0 661 0 000 105 E ACC M CTA 1008 pb 0 041 0 025 147 E ACC M CTA 191 pb 0 060 0 006 106 E ACC M CTA 987 pb 0 060 0 006 148 E ACC M CTA 176 pb 0 135 0 018 107 E ACC M CTA 961 pb 0 040 0 003 149 E ACC M CTA 173 pb 0 235 0 237 108 E ACC M CTA 906 pb 0 235 0 237 150 E ACC M CTA 170 pb 0 040 0 003 109 E ACC M CTA 866 pb 0 594 0 006 151 E ACC M CTA 165 pb 0 235 0 237 110 E ACC M CTA 829 pb 0 007 0 487 152 E ACC M CTA 165 pb 0 196 0 489 111 EACC M CTA 805 pb 0 025 0 018 153 E ACC M CTA 155 pb 0 040 0 003 112 E ACC M CTA 758 pb 0 594 0 006 154 E ACC M CTA 145 pb 0 002 0 238 113 E ACC M CTA 728 pb 0 135 0 018 155 E ACC M CTA 144 pb 0 235 0 237 114 EACC M CTA 718 pb 0 016 0 606 156 E ACC M CTA 141 pb 0 235 0 237 115 E ACC M CTA 690 pb 0 661 0 000 157 E ACC M CTA 136 pb 0 235 0 237 116 E ACC M CTA 665 pb 0 025 0 018 158 E AC
143. Ainsi 30 ug d ARN sont incub s avec lul d amorce poly dT Sigma pendant 10 min a 70 C et refroidit dans de la glace La transcription inverse a t r alis e dans un volume de 20 ul contenant le m lange d ARN 4ul du tampon First Strand 5X Super script Kit GibcoBRL 2ul de DTT 0 1M lul de m lange de dNTP 0 25 mM de dATP 10 mM de dCTP 10 mM de dTTP et 10 mM de dGTP Sul de isotope P dATP et lul de la superscript reverse transcriptase Invitrogen Carlsbad CA USA La retro transcription est assur e pendant 1 heure 42 C Le m lange est ensuite purifi dans une colonne de sephadex pour liminer les nucl otides non incorpor s Le m lange de la cible radioactive est d natur avant l utilisation 11 1 1 3 Hybridation des membranes Les membranes sont pr hybrid es pendant au moins 5 min a 42 C dans une cassette d hybridation et avec le tampon 0 5 V de Formamide 1M Na HPO pH 7 2 4M NaCL SDS a 7 et 0 5 M PEDTA L hybridation des membranes est optimis e pendant un minimum de 12 heures a 42 C dans un nouveau volume de tampon de pr hybridation additionn de 1 million Cpm count per minute par ml de cible radioactive Apr s l hybridation les membranes sont successivement lav es 42 C pendant 30 min dans chacun des trois tampons suivants SSC 2X 0 1 SDS SSC 0 5X 0 1 SDS et ensuite dans SSC 0 1X 0 1 SDS Les filtres ADN sont ensuite envelopp s dans du plastique papier Saran et e
144. Altered lateral root development and enhanced expression of phosphoenol pyruvate carboxylase Plant Physiology 112 31 41 Jorgensen RA Cluster PD English J Que Q Napoli CA 1996 Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers comparison of sense vs antisense constructs and single copy vs complex T DNA sequences Plant Mol Biol 31 957 973 Joshi S P V S Gupta R K Aggarwal P K Ranjekar amp D S Brar 2000 Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter simple sequence repeat ISSR polymorphism in the genus Oryza Theor Appl Genet 100 1311 1320 Kamiya Noriko Itoh Jun Ichi Morikami Atsushi Nagato yasuo and Matsuoka Makoto 2003 The SCARECROW gene s role in asymmetric cell division in rice plants The plant journal 36 45 54 Kantety R V X P Zeng J L Bennetzen amp B E Zehr 1995 Assessment of genetic diversity in dent and popcorn Zea mays L inbred lines using inter simple sequence repeat ISSR amplification Molecular Breeding 1 365 373 Karl Pearson 1901 National Life from the Standpoint of Science with a second edition in 1905 London A amp C Black Kashi Y King D Soller M 1997 Simple sequence repeats as a source of quantitative genetic variation Trends Genet 13 74 78 179 R f rences bibliographiques Kass E Wink M 1997 Molecular phylogeny and phylogeography of Lupinus Leguminisae inferred from nucleotide sequences of the rbcL ge
145. BES1 407 TTAAAAAATAGTAGCAGTAACGGTAAGCATT TGCAACACATAAATAAAATCAAAATACAC 347 AAAGACAAACAAGAAATTGCCAACAAACGGCGTGGTCTCTCGTCGCCCCAACACACCTAT 287 TTGTCCCTTTGCATTGGATTGAAGATTGATAT TGAGAAGCA TCCAAAAGGCAAGTGGCAT Binding TF 227 AGAGAACCGTGATAAAGAAGGGAATCCTATAGCCACTGTCCCAATCTGTTTGGTTACATG Nit2 167 CTACTAATTCAAAATACACATAACATGGCTTCGATGGGATGTGTTTATCTACCTTCGTGA Nit2 107 GCAAAAGCTACATAACATATTCAAAACAATTTTACGTATCACTATCAACTATCACTCCCT Nit2 47 ATCTATCTCACTCTTGGCTTCTCCATAAATTGGATGCTTCTGATGCTATG Figure III 12 Repr sentation des l ments r gulateurs au niveau des 1427 pb du promoteur de LaSCRI1 Le ATG soulign repr sente le codon d initiation de la transcription 151 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc gt Sequence du promoteur de LaSCR 2 1176 TCTGTOCCGAACCTATAGTACTTAATATAASAAT TAATACATT TATOOGOATGTTAGTICA Since 1116 TTCATAGAGCTATTCAGTIIITT TAGACATCCATOTCATAACTCOTATATAGAGTAGTATG 1056 ATAAAAAAGCATGIGATT ITT TAGCTOITOTTCTTAATCAATOTCTGGAATCTGCOACAGA finger 996 MTASTACTAAATOTTTOGATTARAATAATTTOTTTACTACTOTACTCTOTAGAACTTARAAC 936 TOECTATAATTITTITOCEATTACTTITTATOTTATTOTTOGATOTTAATTATTATAGCTABATAAT 676 TCAAAATTOCOTTGSCTTGOAAACAACTAAADCCATATOCAAAAAAAAAT GAA TOSSGATCA 516 CPPGTCTCGAATGATCTCTCATTCOCCTATCTCOCACCAATGCATATATTATCATATAAATA 756 AAAGAAATTTTTAAAAAACAAAAACTGAGATICT TAT AGT POGGGACATGGCATTAGGAC 696 CACTATCTACCTCATICOTCTITGCNTCTOCAATCTATAATT TOCGACCGCARACAGTAGC 636 TAGTAGCTACTGOCTCATAT CATATOCTAATAAGT
146. E ACC M CAG 215 pb 0 007 0 487 83 E ACC M CAT 276 pb 0 007 0 166 42 E ACC M CAG 210 pb 0 661 0 000 84 E ACC M CAT 270 pb 0 007 0 166 197 Annexes Annexe IL 3 suite Contribution des marqueurs AFLP dans les deux axes F1 et F2 de DACP r alis e dans l analyse intersp cifique Ccontributions Contributions des variables des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 85 EACC M CAT 265 pb 0 594 0 006 127 E ACC M CTA 403 pb 0 016 0 606 86 EACC M CAT 251 pb 0 661 0 000 128 E ACC M CTA 382 pb 0 235 0 237 87 EACC M CAT 241 pb 0 135 0 018 129 E ACC M CTA 382 pb 0 007 0 166 88 EACC M CAT 233 pb 0 016 0 606 130 E ACC M CTA 366 pb 0 007 0 487 89 EACC M CAT 208 pb 0 135 0 018 131 E ACC M CTA 354 pb 0 007 0 487 90 E ACC M CAT 193 pb 0 594 0 006 132 E ACC M CTA 342 pb 0 002 0 238 91 E ACC M CAT 186 pb 0 661 0 000 133 E ACC M CTA 336 pb 0 040 0 003 92 E ACC M CAT 177 pb 0 040 0 003 134 E ACC M CTA 325 pb 0 661 0 000 93 E ACC M CAT 172 pb 0 235 0 237 135 E ACC M CTA 318 pb 0 661 0 000 94 E ACC M CAT 167 pb 0 661 0 000 136 E ACC M CTA 313 pb 0 007 0 487 95 E ACC M CAT 159 pb 0 016 0 606 137 E ACC M CTA 306 pb 0 060 0 006 96 E ACC M CAT 152 pb 0 007 0 487 138 E ACC M CTA 283 pb 0 594 0 006 97 E ACC M C
147. En effet ces valeurs augmentent avec le nombre de variables Pour ceci le calcul des distances euclidiennes n cessite la r duction des variables comme le cas des analyses en composantes principales ACP Les indices de distance semi m triques sont des indices qu on ne peut pas positionner dans un espace euclidien Exemple de la distance de Bray et Curtis Une tape aussi tr s importante de la classification est la g n ration de l arbre et le calcul du bootstrap ou la v rification de la robustesse des diff rents n uds de cet arbre 11 2 2 Analyse factorielle Les analyses factorielles fournissent un moyen pour d crire l information g n rale en consid rant les caract res tudi s dans leur ensemble ainsi que les inter correlations entre les caract res et leurs effets sur la structuration de la population 23 Revue bibliographique Les analyses factorielles ont t d velopp es en sociologie conomie et psychologie avec des donn es souvent redondantes Les plus commun ment utilis es des analyses factorielles sont l analyse en composante principale ACP et l analyse factorielle des correspondances AFC Ces analyses factorielles permettent la repr sentation d une population d crite par un ensemble de caract res dont les modalit s sont quantitatives mesures continues pour une ACP et qualitatives pour une AFC Les analyses factorielles permettent de r aliser un d codage et une simplification des donn
148. FL1 685 pb 0 715 1 733 168 ISSR FL7 883 pb 1 232 0 281 209 ISSR FL1 655 pb 1 369 0 499 169 ISSR F4 843 pb 1 369 0 499 210 ISSR FL1 625 pb 0 263 1 006 170 ISSR F4 816 pb 1 369 0 499 211 ISSR FL1 597 pb 1 232 0 281 171 ISSR F4 776 pb 0 100 0 984 212 ISSR FL1 574 pb 0 595 0 701 172 ISSR F4 732 pb 0 443 0 625 213 ISSR FL1 531 pb 0 663 1 132 173 ISSR F4 700 pb 0 623 1 758 214 ISSR FL1 495 pb 0 573 0 658 174 ISSR F4 657 pb 0 100 0 984 215 ISSR FL1 459 pb 4 058 0 772 175 ISSR F4 619 pb 0 263 1 006 216 ISSR FL1 440 pb 1 369 0 499 176 ISSR F4 584 pb 0 471 3 084 217 ISSR FL1 423 pb 1 033 0 968 177 ISSR F4 566 pb 1 369 0 499 218 ISSR FL1 392 pb 0 511 0 194 178 ISSR F4 546 pb 1 232 0 281 219 ISSR FL1 358 pb 2 182 0 076 179 ISSR F4 522 pb 1 369 0 499 220 ISSR FL1 333 pb 1 369 0 499 180 ISSR F4 497 pb 0 237 1 202 221 ISSR FL1 311 pb 0 595 0 701 181 ISSR F4 472 pb 0 799 0 914 222 ISSR FL1 296 pb 0 394 0 264 182 ISSR F4 458 pb 0 306 0 407 223 ISSR FL1 280 pb 1 251 0 186 183 ISSR F4 437 pb 0 034 1 243 224 ISSR FL1 269 pb 0 783 1 844 184 ISSR F4 421 pb 0 283 0 539 225 ISSR FL1 257 pb 0 053 0 955 185 ISSR F4 406 pb 1 369 0 499 226 ISSR FL1 244 pb 0 420 0 687 186 ISSR F4 391 pb 0 892 0 938 227 ISSR FL1 232 pb 1 641 2 149 187 ISSR F4 385 pb 0 712 0 016 228 ISSR FL1 215 pb 0 143 1 429 188 ISSR F4 364 pb 0 237 1 202 229 ISSR FL1 203 pb 0 8
149. FL3 992 pb 0 040 0 417 24 ISSR F2 151 bp 0 323 0 009 65 ISSR FL3 865 pb 0 040 0 417 25 ISSR F2 138 bp 0 230 0 021 66 ISSR FL3 677 pb 0 046 1 326 26 ISSR FL1 1126 pb 0 040 0 417 67 ISSR FL3 582 pb 0 102 0 007 27 ISSR FL1 655 pb 1 260 0 073 68 ISSR FL3 504 pb 0 102 0 007 28 ISSR FL1 626 pb 0 140 1 186 69 ISSR FL3 463 pb 0 861 0 522 29 ISSR FL1 569 pb 0 861 0 522 70 ISSR FL3 414 pb 0 861 0 522 30 ISSR FL1 497 pb 1 184 0 436 71 ISSR FL3 389 pb 1 645 0 111 31 ISSR FL1 496 pb 0 140 1 186 72 ISSR FL3 364 pb 0 055 0 081 32 ISSR FL1 445 pb 1 260 0 073 73 ISSR FL3 345 pb 1 260 0 073 33 ISSR FL1 422 pb 0 040 0 417 74 ISSR FL3 334 pb 0 167 0 025 34 ISSR FL1 392 pb 0 861 0 522 75 ISSR FL3 299 pb 0 156 0 121 35 ISSR FL1 379 pb 0 040 0 417 76 ISSR FL3 278 pb 1 260 0 073 36 ISSR FL1 350 pb 0 040 0 417 77 ISSR FL3 253 pb 0 323 0 009 37 ISSR FL1 311 pb 0 454 1 293 78 ISSR FL3 238 pb 1 260 0 073 38 ISSR FL1 286 pb 1 260 0 073 79 ISSR FL3 228 pb 1 645 0 111 39 ISSR FL1 269 pb 0 046 1 326 80 ISSR FL3 197 pb 0 002 0 502 40 ISSR FL1 256 pb 0 140 1 186 81 ISSR FL3 194 pb 1 260 0 073 41 ISSR FL1 239 pb 0 040 0 417 82 ISSR FL3 169 pb 0 454 1 293 194 Annexes Annexe II 2 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intersp cifique Contributions des Contributions des variables
150. FNVI Somatic embryogenesis related protein Dactylis glomerata E385_F CA411094 UniRef100_Q3AFJ1_TPR domain protein Carboxydo E392_F CA411099 pfam_BTB_BTB POZ domain 135_F CA410468 No apical meristem NAM protein 1182_F CA409642 UniRef100_P41152 Heat shock factor protein HSF30 Lycopersicon peruvianum 1358 F CA409801 UniRef100_Q6DG70 Zgc 91962 Brachydanio rerio 129 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Liste des g nes int ressants sous exprim s surexprim s G ne Num ro Description d accession 137_F CA409823 StTC127390 similar to TIGR_Ath1IAt5g16780 1 68418 m01965 SART 1 family protein contains Pfam domain PF03343 SART 1 family partial 61 1425_F CA409868 MtTC94757_similar to UPIQ43457 Q43457 Heat shock transcription factor 34 partial 86 E529_F CA411234 AtTC261385_ UPIERF4_ARATH 080340 Ethylene responsive element binding factor 4 AtERF4 complete E541_F CA411246 GmTC218149_ similar to UPIQ70I27 Q70127 SAR DNA binding protein like protein partial 57 E545_F CA411250 GmTC216457_similar to GBIAAS58510 11453571021AY550299 MYB transcription factor Arabidopsis thaliana partial 27 E598_F CA411302 GmTC219208_ weakly similar to UPIQ948K9 Q948K9 CmE8 protein partial 87 E742_F CA411431 LIM zinc binding E745_F CA411445 SET domain E758_F CA411458 GmTC229886_ similar to UPITAFA_MOUSE Q8KOHS Transcr
151. G 963 pb 0 040 0 003 384 E ACT M CAG 197 pb 0 661 0 000 343 E ACT M CAG 900 pb 0 135 0 018 385 E ACT M CAG 190 pb 0 236 0 383 344 E ACT M CAG 865 pb 0 007 0 487 386 E ACT M CAG 184 pb 0 661 0 000 345 E ACT M CAG 826 pb 0 016 0 606 387 E ACT M CAG 179 pb 0 135 0 018 346 E ACT M CAG 780 pb 0 236 0 383 388 E ACT M CAG 174 pb 0 016 0 606 347 E ACT M CAG 735 pb 0 002 0 238 389 E ACT M CAG 166 pb 0 594 0 006 348 E ACT M CAG 691 pb 0 040 0 003 390 E ACT M CAG 161 pb 0 025 0 018 349 E ACT M CAG 664 pb 0 002 0 238 391 E ACT M CAG 158 pb 0 060 0 006 350 E ACT M CAG 627 pb 0 594 0 006 392 E ACT M CAG 153 pb 0 594 0 006 351 E ACT M CAG 587 pb 0 002 0 238 393 E ACT M CAG 146 pb 0 236 0 383 352 E ACT M CAG 567 pb 0 236 0 383 394 E ACT M CAG 141 pb 0 135 0 018 353 E ACT M CAG 565 pb 0 060 0 006 395 E ACT M CAT 1690 pb 0 594 0 006 354 E ACT M CAG 549 pb 0 016 0 606 396 E ACT M CAT 1595 pb 0 025 0 018 355 E ACT M CAG 525 pb 0 007 0 166 397 E ACT M CAT 1572 pb 0 135 0 018 356 E ACT M CAG 512 pb 0 007 0 487 398 E ACT M CAT 1456 pb 0 135 0 018 357 E ACT M CAG 499 pb 0 196 0 489 399 E ACT M CAT 1429 pb 0 007 0 166 358 E ACT M CAG 478 pb 0 135 0 018 400 E ACT M CAT 1348 pb 0 002 0 238 359 E ACT M CAG 455 pb 0 196 0 489 401 E ACT M CAT 1305 pb 0 278 0 321 360 E ACT M CAG 446 pb 0 025 0 018 402 E ACT M CAT 1226 pb 0 135 0 018 361 E ACT M CAG 432 pb 0 135 0 018 403 E ACT M CAT 1166 pb 0 016 0 606 362 E
152. G M CAC 971 pb 0 594 0 006 117 E ACC M CTA 613 pb 0 025 0 018 159 E ACG M CAC 929 pb 0 235 0 237 118 E ACC M CTA 577 pb 0 060 0 006 160 E ACG M CAC 888 pb 0 025 0 018 119 E ACC M CTA 539 pb 0 135 0 018 161 E ACG M CAC 848 pb 0 007 0 487 120 E ACC M CTA 517 pb 0 661 0 000 162 E ACG M CAC 841 pb 0 025 0 018 121 E ACC M CTA 490 pb 0 235 0 237 163 E ACG M CAC 815 pb 0 278 0 321 122 E ACC M CTA 476 pb 0 040 0 003 164 E ACG M CAC 788 pb 0 196 0 489 123 E ACC M CTA 456 pb 0 661 0 000 165 E ACG M CAC 724 pb 0 060 0 006 124 E ACC M CTA 437 pb 0 135 0 018 166 E ACG M CAC 692 pb 0 661 0 000 125 E ACC M CTA 428 pb 0 025 0 018 167 E ACG M CAC 635 pb 0 007 0 166 126 E ACC M CTA 415 pb 0 007 0 166 168 E ACG M CAC 585 pb 0 236 0 383 198 Annexes Annexe IL 3 suite Contribution des marqueurs AFLP dans les deux axes F1 et F2 de DACP r alis e dans l analyse intersp cifique Contributions Contributions des variables des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 169 E ACG M CAC 570 pb 0 007 0 487 211 E ACG M CAG 496 pb 0 007 0 166 170 E ACG M CAC 516 pb 0 002 0 238 212 E ACG M CAG 468 pb 0 016 0 606 171 E ACG M CAC 492 pb 0 236 0 383 213 E ACG M CAG 450 pb 0 007 0 166 172 E ACG M CAC 472 pb 0 235 0 2
153. ISSR F4 197 pb 0 000 0 377 33 ISSR F3 645 pb 0 005 0 053 76 ISSR FL1 808 pb 0 300 1 173 34 ISSR F3 591 pb 0 119 0 307 77 ISSR FL1 771 pb 0 034 0 479 35 ISSR F3 570 pb 0 047 0 104 78 ISSR FL1 737 pb 0 004 0 006 36 ISSR F3 479 pb 1 795 0 225 79 ISSR FL1 704 pb 0 300 1 173 37 ISSR F3 445 pb 0 154 0 002 80 ISSR FL1 644 pb 0 303 0 317 38 ISSR F3 403 pb 0 111 0 000 81 ISSR FL1 600 pb 0 299 1 092 39 ISSR F3 386 pb 0 150 0 053 82 ISSR FL1 582 pb 0 034 0 633 40 ISSR F3 353 pb 0 094 0 221 83 ISSR FL1 573 pb 0 441 0 000 41 ISSR F3 333 pb 0 048 0 093 84 ISSR FL1 564 pb 0 484 0 020 42 ISSR F3 314 pb 0 109 0 220 85 ISSR FL1 478 pb 0 995 0 325 43 ISSR F3 294 pb 0 001 0 362 86 ISSR FL1 465 pb 0 303 0 317 203 Annexes Annexe II 4 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L albus Contributions des variables Contributions des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 87 ISSR FL1 456 pb 0 370 0 000 130 ISSR FL3 629 pb 0 090 0 476 88 ISSR FL1 446 pb 0 048 0 506 131 ISSR FL3 590 pb 0 035 0 036 89 ISSR FL1 428 pb 0 026 0 045 132 ISSR FL3 571 pb 0 017 0 025 90 ISSR FL1 405 pb 0 123 0 901 133 ISSR FL3 550 pb 0 252 0 220 91 ISSR FL1
154. L3 Les 25 combinaisons d amorces AFLP utilis es dans l tude de la diversit inter sp cifique du lupin du Maroc Tableau IL 4 Amorces ISSR utilis es dans tude intersp cifique et marqueurs g n r s Tableau II 5 Similarit s calcul es entre les quatre esp ces de lupin sur la base des ISSR Tableau II 6 Valeur propre variabilit et pourcentage cumul des deux premiers axes de PACP Tableau II 7 Marqueurs AFLP g n r s pour chaque amorce utilis e chez les quatre esp ces de lupin Tableau IL 8 Marqueurs AFLP sp cifiques obtenus pour chacune des esp ces de lupin Tableau II 9 Pourcentages de similarit s calcul s entre les diff rentes esp ces de lupin sur la base des AFLP Tableau II 10 Valeurs propre variabilit et pourcentage cumul des deux premiers axes de l ACP bas e sur les ISSR Tableau IL 11 Marqueurs ISSR g n r s pour les dix accessions de L albus et par amorce Tableau IL 12 Amorces ISSR utilis es dans l analyse de la diversit intra sp cifique de L albus et marqueurs engendr s Tableau IL 13 Marqueurs ISSR sp cifiques g n r s dans l analyse de la diversit intra sp cifique de L albus Tableau IL 14 Matrice des similarit s calcul es entre les accessions de L albus sur la base des marqueurs ISSR Tableau IL 15 Marqueurs ISSR uniques obtenus pour chacun des groupes de L albus Tableau IL 16 Valeur propre variabilit et pourcentage cumul des deux premiers axe
155. L4 182 90pb FLS 150 54pb FL5 987pb FLA 475 49pb FL6 106 78pb Lut09 FL11 436 16pb F1 247 58pb F3 837 74pb FL1 179 39pb FL2 186 02pb FL5 116 30pb FL8 635 30pb FL9 1355pb FLI0 487 61pb FL10 366 83pb FL10 222 58pb Lut08 FL10 104 92pb FL11 647 38pb F1 403 96pb FL1 579 59pb FLI 144 58pb FL5 164 29pb FL5 215 39pb FL7 419 14pb FL9 497 40pb FL10 124 70pb FL11 516 79pb FL11 360 83pb Lut02 FL11 122 02pb F1 556 09pb F1 343 48pb F1 224 01pb F2 546 30pb FL1 791 77pb FL1 227 14pb FL2 524 04pb FL4 1236pb FL4 559 54pb FL4 153 38pb FL4 153 38pb Lut06 FL6 555 26pb FL8 133 83pb FL9 337 19pb FL11 987pb F2 791 20pb F2 166 18pb FL2 153 28pb FL4 759 31pb FL4 523 03pb FL5 351 32pb FL6 582 05pb FL8 549 16pb FL9 457 95pb FL9 125 98pb Lut07 FL10 319 13pb FL10 182 14pb FL11 572 65pb F1 203 19pb F3 1383pb F3 1125pb FL2 800 55pb FL4 390 01pb FL5 196 03pb Lut03 FL7 219 25BP FL9 479 18BP FL9 234 09pb FL10 239 76pb F1 1071bp F2 638 29bp F3 209 33bp FL1 1384pb FL1 1024pb FL1 207 93pb FL3 203 03pb FL5 205 11pb FL5 511 49pb FL6 378 97pb FL9 422 17pb LutOI FL10 1343pb F1 534 33pb F1 425 78pb F1 123 27pb FL2 388 42pb FL2 307 07pb FL3 362 23pb FL3 282 21pb FLA4 1703pb FL5 1178pb FL7 126 70pb FL7 126 69pb FL8 1406pb FL8 576 22pb FL8 437 70pb FL9 1613pb FL9 1449pb er FL9 206 52pb FL9 142 52pb FL10 1112pb FL10 542
156. L5 207 pb 0 228 0 196 235 ISSR FL8 1221 pb 0 000 0 893 193 ISSR FL6 908 pb 0 069 0 494 236 ISSR FL8 1191 pb 0 059 0 157 194 ISSR FL6 901 pb 0 082 0 531 237 ISSR FL8 1128 pb 0 000 1 730 195 ISSR FL6 830 pb 0 060 0 429 238 ISSR FL8 987 pb 0 150 0 053 196 ISSR FL6 789 pb 0 010 0 141 239 ISSR FL8 867 pb 0 098 0 141 197 ISSR FL6 749 pb 0 017 0 800 240 ISSR FL8 831 pb 0 401 0 032 198 ISSR FL6 692 pb 0 169 0 870 241 ISSR FL8 822 pb 0 044 0 231 199 ISSR FL6 685 pb 0 018 0 107 242 ISSR FL8 755 pb 0 441 0 000 200 ISSR FL6 644 pb 0 948 0 111 243 ISSR FL8 681 pb 0 109 0 258 201 ISSR FL6 583 pb 0 162 0 548 244 ISSR FL8 627 pb 0 123 0 901 202 ISSR FL6 536 pb 0 088 1 373 245 ISSR FL8 583 pb 1 502 0 055 203 ISSR FL6 508 pb 0 350 0 722 246 ISSR FL8 511 pb 0 484 0 020 204 ISSR FL6 487 pb 0 003 0 054 247 ISSR FL8 486 pb 0 441 0 000 205 ISSR FL6 458 pb 0 108 0 074 248 ISSR FL8 453 pb 0 171 0 015 206 ISSR FL6 444 pb 1 187 0 121 249 ISSR FL8 414 pb 0 092 0 007 207 ISSR FL6 396 pb 1 795 0 225 250 ISSR FL8 380 pb 0 279 0 013 208 ISSR FL6 350 pb 1 795 0 225 251 ISSR FL8 344 pb 0 109 0 220 209 ISSR FL6 313 pb 0 792 0 002 252 ISSR FL8 337 pb 1 502 0 055 210 ISSR FL6 287 pb 0 305 0 002 253 ISSR FL8 317 pb 0 065 0 097 211 ISSR FL6 276 pb 0 000 0 078 254 ISSR FL8 287 pb 0 007 0 096 212 ISSR FL6 246 pb 0 070 1 971 255 ISSR FL8 262 pb 0 245 0 235 213 ISSR FL6 190 pb 0 088 1 373 256 ISSR FL8 249 pb 0 05
157. LaSCR2 est li e au stade de d veloppement des racines proteo des En effet l expression de LaSCRs augmente au niveau des zones racinaires avec des radicelles en d veloppement zones 2 et 3 Cette expression diminue au niveau des zones 4 et 5 o les racines proteo des sont compl tement d velopp es Ces r sultats supposent le r le du SCR dans la r gulation de l activit m rist matique racinaire chez le lupin 148 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Partie 3 Expression tissulaire de LaSCR1 et LaSCR2 au niveau des racines de Lupinus albus et de Medicago truncatula 3 1 Le promoteur pLaSCR2 dirige l expression du g ne LaSCR2 L tude de l expression tissulaire d un g ne fait appel aux g nes rapporteurs dont l activit se traduit par une modification visible de la couleur de la plante l exprimant Lors de cette tude le g ne rapporteur GUS a t utilis pour suivre l expression du g ne LaSCR2 Le g ne GUS code pour la f glucuronidase capable d hydrolyser quelques compos s glucoroniques Ainsi en pr sence d un substrat X gluc acide 5 brom 4 chloro 3 indolyl B D glucoronide la f glucuronidase conduit l apparition d un produit de couleur bleue Jefferson 1989 A partir de d riv s umbelliferyl la B glucuronidase lib re de l umbellif rone et permet de mesurer l activit enzymatique par fluorim trie Les plantes ou organes contenant ainsi un g n
158. LaSCRI et de LaSCR2 comme sondes L hybridation du premier southern blot avec LaSCRI comme sonde r v le trois bandes dans le cas o l ADN est dig r par EcoRI et deux bandes quand ADN est dig r par HindIII La s quence du g ne LaSCRI pr sente un site de restriction pour EcoRI ce qui explique la pr sence des deux premi res bandes Par contre la troisi me bande indique qu il existe chez L albus une deuxi me copie du g ne LaSCRI Par ailleurs l hybridation du deuxi me northern blot avec LaSCR2 comme sonde r v le une bande unique aussi bien pour les ADN dig r s par EcoRI que par HindIII Ceci montre qu il existe chez le lupin blanc une seule copie du g ne LaSCR2 kb EcoR1 Hindill kb ECORT Hindili 23 1 _ DE 6 6 a _ 6 6_ 44 4 4 al 2 3 2 3 LaSCRI LaSCR2 Figure III 8 Southern blots pr par s par l ADN du lupin blanc dig r par EcoRI ou HindIII et hybrid s par LaSCR1 ou LaSCR2 143 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 1 5 Conclusion Deux g nes SCR LaSCRI et LaSCR2 ont t isol s chez le lupin blanc Ces deux g nes pr sentent une grande similarit avec AtSCR Aussi la structure de LaSCR1 2 avec deux exons encadrant un intron unique est similaire celle des autres genes SCR On note aussi que la position de l intron est conserv e entre LaSCR1 LaSCR2 et les autres g nes SCR Les deux prot ines LaSCR1 et LaSCR2 pr senten
159. Lut05 L I Lut06 GI Lut07 Lut Ot L I Lut03 GII Lut02 Lut09 L i Lutog EN Figure IL 20 Dendrogramme en UPGMA des populations de L luteus g n r sur la base des marqueurs ISSR 107 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit 11 2 2 3 b Classification hi rarchique Un dendrogramme a t labor sur la base des donn es ISSR l indice de diversit de Dice et la m thode d agglom ration UPGMA Figure II 20 A un niveau de similarit de 75 le dendrogramme d finit trois groupes probables ou clusters Le groupe I ou L I GI groupant trois accessions g ographiquement peu loign es Lut05 Lut06 et Lut07 Le groupe II ou L I GIT avec trois accessions de la r gion du Rharb Lut01 Lut02 et Lut03 Le groupe III ou L I GIIT r unissant une population de Khemisset Lut08 et une population de Ouazzane Lut09 Une comparaison de ces trois groupes a t effectu e sur la base du nombre de marqueurs ISSR obtenus et aussi de la diversit g n r e Tableau 11 27 Ainsi le groupe MI L I GIID a t caract ris par le nombre le plus lev de marqueurs obtenus 592 et de diversit 0 004687 suivi par le groupe I L I GT Celui ci a g n r 450 marqueurs ISSR et une moyenne de diversit de 0 004686 Par contre le groupe I L I GIT a montr le minimum de marqueurs ISSR 341 et une moyenne de diversit de 0 004680 Les trois groupes potentiels de L luteus ont montr plusieurs marqueurs en commu
160. Pascal G Christian JA 2004 Transcription factor networks Pathways to the knowledge of root development Plant Physiol 136 3478 3485 Grennan AK 2006 Abiotic stress in rice An omic approach Plant Physiol 140 1139 1141 Gupta PK Varshney RK 2000 The development and use of microsatellite markers for genetic analysis and plant breeding with emphasis on bread wheat Euphytica 113 163 185 Hackbarth J and H J Troll 1956 Lupins as grain Legumes and fodder plants Pp 1 51 in Handbook pf Plant Breeding Part IV in German H Kappert and W Rudof eds 2 edn Verlag Paul Parey Berlin and Hamburg Haig S M 1998 Molecular contributions to conservation Ecology 79 2 413 425 Hammond Scott M Caudy Amy A and Hannon Gregory J 2001 POST TRANSCRIPTIONAL GENE SILENCING BY DOUBLESTRANDED RNA Nature Vol2 110 119 Hammond J P Broadley M R amp White P J 2004 Genetic responses to phosphorus deficiency Annals of Botany 94 323 332 Hancock J M 1996 Simple sequences and the expanding genome BioEssays 18 421 425 Hao GP Wu ZY Chen MS 2004 ATHK1 gene regulates signal transduction of osmotic stress in Arabidopsis thaliana J Plant Physiol Mol Biol 30 5 553 560 Heidstra R Welch D amp Scheres B 2004 Mosaic analyses using marked activation and deletion clones dissect Arabidopsis SCARECROW action in asymmetric cell division Genes Development 18 1964 1969 Helentjaris M Slocum S Wright A S
161. R FL10 780 pb 0 278 0 024 310 ISSR FL11 637 pb 0 059 0 157 273 ISSR FL10 715 pb 0 048 0 506 311 ISSR FL11 599 pb 0 007 0 185 274 ISSR FL10 640 pb 0 001 0 359 312 ISSR FL11 555 pb 0 709 0 953 275 ISSR FL10 605 pb 0 002 0 605 313 ISSR FL11 503 pb 0 082 0 531 276 ISSR FL10 578 pb 0 088 1 373 314 ISSR FL11 474 pb 0 003 0 356 277 ISSR FL10 554 pb 0 006 0 129 315 ISSR FL11 444 pb 0 008 0 117 278 ISSR FL10 530 pb 0 401 0 032 316 ISSR FL11 417 pb 0 484 0 020 279 ISSR FL10 513 pb 0 074 0 734 317 ISSR FL11 395 pb 0 016 0 009 280 ISSR FL10 484 pb 0 003 0 002 318 ISSR FL11 381 pb 0 011 0 024 281 ISSR FL10 459 pb 0 028 0 037 319 ISSR FL11 357 pb 0 072 0 297 282 ISSR FL10 453 pb 0 098 0 139 320 ISSR FL11 336 pb 0 003 0 173 283 ISSR FL10 427 pb 0 486 0 308 321 ISSR FL11 317 pb 0 134 0 012 284 ISSR FL10 406 pb 0 027 0 275 322 ISSR FL11 297 pb 0 028 0 002 285 ISSR FL10 390 pb 0 129 0 167 323 ISSR FL11 278 pb 0 033 0 428 286 ISSR FL10 367 pb 0 023 0 023 324 ISSR FL11 265 pb 0 219 0 038 287 ISSR FL10 351 pb 0 202 0 069 325 ISSR FL11 248 pb 0 033 0 428 288 ISSR FL10 341 pb 0 108 0 074 326 ISSR FL11 235 pb 0 019 0 011 289 ISSR FL10 328 pb 0 531 0 076 327 ISSR FL11 223 pb 0 197 0 053 290 ISSR FL10 307 pb 0 003 0 081 328 ISSR FL11 204 pb 0 033 0 428 291 ISSR FL10 294 pb 0 689 0 098 329 ISSR FL11 185 pb 0 011 0 223 292 ISSR FL10 279 pb 0 340 0 102 330 ISSR FL11 168 pb 0 123 0 901 293 ISSR FL10 26
162. SBABOU L BRHADA F THAMI ALAMI I FILALI MALTOUF A AFLP markers International journal of agriculture and biology Vol 12 Issue 1 January 2010 SBABOU L BRHADA F FILALI MALTOUF A 2009 A modified protocol for total DNA isolation suitable for RAPD ISSR and AFLP analyses Lupinus as a study case Acta botanica sous press S minaires pr sent s Characterization and Conservation of SCARECROW in white lupin Master Qualit Microbiologique et S curit sanitaire 2008 FSR Expression et fonction des g nes quelques techniques et applications Master Biotechnologies et Am lioration G n tique des Productions Agricoles 2009 2010 IAV Hassan II Master Sciences et Technologies de la Vie et de la Sant 2010 FSR Marqueurs mol culaires et diversit g n tique Master Biotechnologies et Am lioration G n tique des Productions Agricoles 2009 IAV Hassan II Introduction a la bioinformatique Master Sciences et Technologies de la Vie et de la Sant 2010 FSR Communications orales Molecular analysis of SCARECROW genes expressed in white lupin cluster roots 2010 Premi re Journ e du Laboratoire Mixte International Biotechnologies microbienne et v g tale Characterization and Conservation of SCARECROW in white lupin 2008 Universit al Akhawayn Etude de la diversit g n tique du Lupin Lupinus spp marocain par les marqueurs RAPD et AFLP 2004 10 11 D cembre Premi re ren
163. SCR chez L albus see ce cece cece cece cece eee tees eeeeeeeeseeees 164 42 L R SUMAIS Rss ae nan ee D RO le es see ans Catania orb T on E A N 164 4 2 1 a Analyse morphologique des racines transg niques des mutants LaSCRi 165 4 2 1 b Mesure de l expression du LaSCR au niveau des racines transg niques 165 4 3 Silen age du g ne MtSCR chez Medicago truncatula 169 4 3 1 R sultats RS en RS ER A Re chia 169 4 3 1 a Analyse morphologique des racines transg niques des mutants LaSCRi 169 4 3 1 b Mesure de l expression du MtSCR au niveau des racines transg niques ss SO 4 4 COMGCIISIOM ER runt EE white Rie sak cA RAR de en ES a A a E Sees 171 CONCLUSION GENERALE 173 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES eeeeneenenes 176 ANNEXES ES RS ARS torte te cline RS Set nae nd SoA din a scenes 190 INTRODUCTION GENERALE Introduction g n rale L analyse de la variabilit g n tique des tres vivants en particulier ceux d importance agronomique constitue une tape essentielle pour comprendre les m canismes d volution des esp ces ainsi que pour assurer une bonne gestion des ressources biologiques pour une utilisation durable Le lupin est une l gumineuse grande importance agronomique conomique et nutritionnelle Le lupin est cultiv depuis plus de 4000 ans pour ses graines tr s riches en prot ines et en huiles ce qui lui co
164. SR FL1 299 pb 0 057 0 298 95 ISSR FL1 532 pb 1 129 0 107 137 ISSR FL1 288 pb 0 006 0 006 96 ISSR FL1 508 pb 0 147 0 362 138 ISSR FL1 276 pb 0 007 0 008 97 ISSR FL1 484 pb 0 009 0 093 139 ISSR FL1 269 pb 0 111 0 231 98 ISSR FL1 450 pb 1 129 0 107 140 ISSR FL1 254 pb 0 057 0 298 99 ISSR FL1 420 pb 1 827 0 335 141 ISSR FL1 236 pb 0 408 0 000 100 ISSR FL1 362 pb 0 118 0 021 142 ISSR FL1 227 pb 0 004 0 284 101 ISSR FL1 342 pb 0 209 0 000 143 ISSR FL1 208 pb 0 499 0 026 102 ISSR FL1 306 pb 0 098 1 118 144 ISSR FL1 198 pb 0 110 0 469 103 ISSR FL1 299 pb 0 057 0 298 145 ISSR FL1 179 pb 0 001 0 150 104 ISSR FL1 288 pb 0 006 0 006 146 ISSR FL1 179 pb 0 069 0 034 105 ISSR FL1 276 pb 0 007 0 008 147 ISSR FL1 145 pb 0 553 0 042 106 ISSR FL1 269 pb 0 111 0 231 148 ISSR FL1 137 pb 0 106 0 012 107 ISSR FL1 254 pb 0 057 0 298 149 ISSR FL1 127 pb 0 003 0 122 108 ISSR FL1 236 pb 0 408 0 000 150 ISSR FL2 801 pb 0 091 0 066 109 ISSR FL1 227 pb 0 004 0 284 151 ISSR FL2 618 pb 0 001 0 009 110 ISSR FL1 208 pb 0 499 0 026 152 ISSR FL2 524 pb 0 004 0 284 111 ISSR FL1 198 pb 0 110 0 469 153 ISSR FL2 413 pb 0 001 1 187 112 ISSR FL1 179 pb 0 001 0 150 154 ISSR FL2 390 pb 0 197 0 048 113 ISSR FL1 179 pb 0 069 0 034 155 ISSR FL2 388 pb 0 008 0 500 114 ISSR FL1 145 pb 0 553 0 042 156 ISSR FL2 372 pb 0 586 0 150 115 ISSR FL1 137 pb 0 106 0 012 157 ISSR FL2 353 pb
165. SSR FL1 375 pb 1 369 0 499 75 ISSR FL9 670 pb 1 525 1 194 35 ISSR FL2 397 pb 1 369 0 499 76 ISSR FL9 622 pb 2 723 0 970 36 ISSR FL2 111 pb 1 369 0 499 77 ISSR FL9 478 pb 1 232 0 281 37 ISSR FL3 1773 pb 0 892 0 938 78 ISSR FL9 100 pb 3 380 0 455 38 ISSR FL3 1332 pb 0 712 0 016 79 ISSR FL10 1183 pb 0 263 1 006 39 ISSR FL3 125 pb 1 369 0 499 80 ISSR FL10 1057 pb 0 322 2 351 40 ISSR FL4 640 pb 0 511 0 194 81 ISSR FL10 932 pb 0 755 1 156 41 ISSR FL4 561 pb 1 232 0 281 82 ISSR FL11 154 pb 2 947 1 650 207 Annexes Annexe IL 5 suite Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans ACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L cosentinii Contributions Contributions des des variables variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 83 ISSR FL11 136 pb 2 154 2 383 124 ISSR F2 318 pb 1 232 0 281 84 ISSR F1 883 pb 0 471 3 084 125 ISSR F2 822 pb 2 723 0 970 85 ISSR F1 819 pb 0 146 0 321 126 ISSR F2 365 pb 1 865 1 469 86 ISSR F1 749 pb 0 374 0 024 127 ISSR F2 334 pb 1 369 0 499 87 ISSR F1 650 pb 4 715 1 287 128 ISSR F2 292 pb 0 186 2 569 88 ISSR F1 632 pb 0 374 0 024 129 ISSR F2 460 pb 3 012 2 078 89 ISSR F1 614 pb 0 214 0 431 130 ISSR F2 274 p
166. SSR sont ensuite s par s par lectrophor se sur gel d agarose 1 5 pendant 2 heures Apr s la r v lation des gels au bromure d ethidium et exposition aux UV les images des gels sont enregistr s sur ordinateur pour un traitement ult rieure avec le logiciel Gel comparll II 1 5 Les marqueurs AFLP Les marqueurs AFLP ont t choisis pour tudier la diversit inter sp cifique entre les quatre esp ces du lupin marocain Le protocole des AFLP d velopp en 1995 par Vos et al a t utilis comme plateforme lors de notre tude Ce protocole de base a t sujet de quelques modifications afin de l adapter aux conditions de notre laboratoire Le protocole d AFLP consiste en quatre tapes essentielles Une tape de digestion de l ADN g nomique du lupin par deux endonucleases EcoRI ayant comme site de restriction G AATTC et Tru9I isoschizom re de Msel ayant pour site de restriction T TAA Lors de cette tape nous avons dig r 1100 ng d ADN de lupin avec 10 unit s d EcoRI et 5 unit s de Tru9 La digestion est optimis e dans le tampon B promega 6 mM Tris HCl 6 mM MgCl 50 mM NaCl et 1 mM DTT a pH 7 5 et 37 C pendant 2 heures L enzyme est inactiv e a 80 C pendant 15 mn La v rification de la r ussite de la digestion est r alis e par visualisation des produits de la digestion par lectrophor se sur gel d agarose La deuxi me tape consiste en une ligation des fragments d ADN dig r s aux ad
167. Schmid KJ Sorensen TR Stracke R Torjek O Altmann T Mitchell Olds T Weisshaar B 2003 Large scale identification and analysis of genome wide single nucleotide polymorphisms for mapping in Arabidopsis thaliana Genome Res 13 1250 125 Shan X T K Blake and L E Talbert 1999 Conversion of AFLP markers to sequence specific PCR markers in barley and wheat Theor Appl Genet 98 1072 1078 Shane M W amp Lambers H 2005 Cluster roots a curiosity in context Plant Plant and Soil 274 101 125 Shao HB Chu LY Zhao CX Shao MA 2006 Some advances in plant stress physiology and their implications in the Systems Biology Era Colloids Surf B Biointerfaces 49 4 Simpson M J A 1986 Geographical variation in lupinus albus L II Northwest Spain the Nile Valley the Balkans and Turkey Plant Breed 96 241 251 Smith C P 1944 Lupinus L In L Abrahams ed Illustrated Flora of the Pacific States 2 483 519 Stanford University Press Stanford CA Stanton JA Macgregor AB Green DP 2003 Identifying tissue enriched gene expression in mouse tissues using the NIH UniGene database Appl Bioinformatics 2 3 Suppl S65 73 Stears R L Martinsky T and Schena M 2003 Trends in microarray analysis Nat Med 9 140 145 Steen I 1997 Phosphorus availability in the 21 century Management of a non renewable resource Phosphorus Potassium 217 25 31 Stein Lincoln D et al 1998 The Genome Sequence of C
168. UNIVERSIT MOHAMMED V AGDAL FACULT DES SCIENCES i Rabat TH SE DE DOCTORAT Pr sent e par Melle Laila SBABOU N d ordre 2465 Discipline Biologie Sp cialit G nomique et biotechnologie Diversit g n tique du lupin au Maroc Et Etude du d veloppement racinaire du lupin blanc sous stress abiotique par des approches de g nomique fonctionnelle Soutenue le 31 octobre 2009 Devant le jury Pr sident Pr Wail BENJELLOUN Doyen de la Facult des Sciences Rabat Examinateurs Pr Fatiha BRHADA PES Facult des Sciences Rabat Pr Abdelkarim Filali Maltouf P E S Facult des Sciences Rabat Dr Gilles BENA Charg de recherche IRD France Pr Said AMZAZI P E S Facult des Sciences Rabat Pr Cherkaoui EL MODAFAR P E S FST Marrakech Dr Patrick DOUMAS Charg de recherche I R D France AVANT PROPOS Les travaux pr sent s dans cette th se ont t r alis s au laboratoire de Microbiologie et Biologie Mol culaire LMBM de la Facult des Sciences de Rabat FSR Universit Mohammed V Rabat Agdal sous la direction du Pr Fatiha BRHADA Ce travail est r alis dans le cadre d une collaboration entre le laboratoire de Microbiologie et de Biologie Mol culaire de la facult des siences de Rabat et l unit d Agronomy and Plant Genetics de l universit du Minnesota Twin cities de Saint Paul USA En tant que laur ate Fulbright je tiens a exprimer mes vifs remerciements a l
169. _F E545_F E598_F E742_F E745_F E758_F E761_F E771_F E817_F et E848_F Par contre au niveau des racines normales aucun g ne n a t stimul en r ponse aux trois types de stress Les g nes surexprim s sont pr sent s dans une matrice d expression avec un code couleur qui permet de visualiser le degr de cette expression figure II 3 127 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc CF RN RP_ FESSES Re San F YPR_O11_E05 035 abi YPR D Gil _0B4 YPR_O13_HO2 _016 ab1i EOI F EG47_F YPR_O05 EDS _035 abi YPR_OOS_AO4 022 abt 889 F 783 F YPR_OO2_ HOT _06ab1 YPR_OOG_CO1 O02 abt 880 F YPR_OOS_ C12 _O87 abi WPR_OOS Fil _06Z abi YPR_OOS AGS 054 abi YPR_OOG_ GOT 052 ab1 625 _F YPR_O1_HO _073 abi YPR_O03_AQS 033ab1 YPR_O02 D411 OS0 abi 265 F 3341F alert ETTIF ERIT_F ERS F Figure II 3 Matrice repr sentant l expression de quelques g nes sur exprim s lignes dans les conditions et tissus analys s colonne F feuilles RN racines normales RP racines proteoides P condition de carence en phosphore N condition de carence en azote Fe condition de carence en fer L chelle des couleurs Min 32 13 0 00 Max 32 13 128 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Ce r sultat est r sum dans le tableau suivant Liste des g nes int ressants surexprim s
170. a t abandonn e pour choisir d autres marqueurs mol culaires 68 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit ISSR FL4 ISSR FL6 ISSR FLI2 Figure II 5 Profils lectrophor tiques ISSR des quatre esp ces de lupin tudi es moyennant les amorces ISSR F1 ISSR FL1 ISSR FLA FL6 et FL12 1 L albus 2 L luteus 3 L cosentinii et 4 L angustifolius Le 100 pb DNA ladder est utilis comme marqueur de poids mol culaire 69 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit II 2 1 2 Apport des marqueurs ISSR dans tude de la diversit inter sp cifique Les marqueurs ISSR ont t les premiers marqueurs de choix pour tudier la diversit inter sp cifique Lors d une tude pr c dente sur la caract risation mol culaire du lupin les marqueurs ISSR ont permis de r v ler un haut niveau de polymorphisme Figure II 5 L tude inter sp cifique a port sur les quatre esp ces de lupin L albus L angustifolius L cosentinii et L luteus Chaque esp ce a t repr sent e par un ADN bulk de l ensemble de ses accessions Des 16 amorces ISSR test es Tableau I 2 cinq amorces 31 25 F3 F4 FL8 FL10 et FL11 ont g n r es des profils d amplification non lisible 11 amorces 68 75 F1 3 FL1 7 et FL9 ont montr es des profils d amplification lisibles avec un nombre int ressant de bandes Figure II 5 En effet 184 bandes ISSR ont t enregistr es avec 160 87 frag
171. a pr sente un SNP par 273 pb Zhu et al 2003 le colza pr sente un SNP tous les 600 pb Fourmann et al 2002 et chez Arabidopsis thaliana un SNP est rencontr tous les 336 pb Schmid et al 2003 Le niveau de variation d pend hautement du locus consid r et peut tre encore plus important II 2 Analyse de la variabilit L tude de la variabilit moyennant les marqueurs mol culaires cit s pr c demment permet de g n rer des r sultats sous forme de tableaux complexes avec un ensemble de variables nombreuses et souvent de typologie diverses Les m thodes statistiques uni ou multi vari es permettent l analyse de la similarit et de la diversit entre les entit s tudi es ainsi que le calcul des param tres g n tiques des diff rentes populations Les r sultats obtenus peuvent tre aussi r sum et class s en groupes gr ce des techniques descriptives telles que les analyses factorielles et les m thodes de classifications 21 Revue bibliographique 11 2 1 M thodes de classification La classification hi rarchique ou hierarchical clustering permet le regroupement ou le clustering d un ensemble d chantillons en se basant sur la notion de distance En effet le clustering consiste en le regroupement des chantillons en groupes sous groupes ou clusters partageant des caract ristiques communes Les m thodes de classification sont des m thodes non param triques ne consid rant qu une seule hypoth se qui s
172. a Commission Maroco Am ricaine MACECE et AMIDEAST avec le Fulbright Scholarship Program pour le support financier le suivi et soutien le long de mon s jour aux USA L encadrement scientifique ce cette th se a t agr ablement assur par ma tr s ch re directrice de th se le professeur Fatiha BRHADA Je tiens a lui exprimer ma gratitude pour son suivi sa disponibilit sa compr hension son respect des engagements et pour ses encouragements continus Je la remercie aussi pour sa patience et s rieux lors de la correction de mon manuscrit Les mots ne sauront traduire ma gratitude et remerciements pour mon professeur the Boss Pr Abdelkarim FILALI MALTOUF responsable du LMBM et Vice Pr sident aux Affaires Acad miques Estudiantines et Modernisation de la Pr sidence Universit Mohammed V Agdal Je le remercie d avoir su diriger et orienter mes travaux de recherches tout en me laissant une large marge de libert pour mener a bien ce travail Sa passion pour la recherche son esprit innovateur et son dynamisme perp tuel sont exemplaires Etre son tudiante fut un grand honneur Milles merci au Dr Carroll VANCE directeur de recherche de l unit d Agronomy and Plant Genetics de m avoir gentiment accueilli parmi son quipe Je le remercie d avoir cru au projet SCRECROW et d avoir mis a ma disposition tout les moyens pour le mener Je le remercie lui et sa douce pouse Michelle pour leur sensibilit et amiti M
173. acines normales Ce profil d expression a t aussi observ chez le riz DiLaurenzio et al 1996 Kamiya et al 2003 161 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Figure III 18 Expression du LaSCR1 au niveau des racines normales du lupin blanc Le transcrit de LaSCRI localis au niveau de l endoderme en coupe longitudinale a et transversale c Echantillon t moin sans aucun signal en coupe longitudinale b et transversale d QC centre quiescent RC cap racinaire Co cortex En endoderme Xy xyl me Les sondes ont t marqu es par la digoxigenine DIG 11 UTP 162 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 3 3 Conclusion L expression tissulaire du SCR au niveau du syst me racinaire du lupin a t abord e par deux moyens L expression du LaSCRI et la localisation des ARNm a t analys e par une hybridation in situ des racines normales et proteoides avec une sonde de LaSCR1 marqu e par la digoxigenine DIG 11 UTP L expression du LaSCR2 au niveau des racines du lupin et de la luzerne en utilisant le promoteur de LaSCR2 li au g ne rapporteur GUS L expression des deux g nes LaSCR1 2 a t localis e au niveau de la couche d endoderme et au niveau du centre quiescent L expression du SCR au niveau des racines du lupin et de Medicago a t tr s pr coce et a t observ e depuis la formation des primordia des racines normales et
174. acines proteo des juv niles et immatures Ceci entraine une diminution de l abondance des bact ries totales dans la zone entourant les racines proteo des matures On rel ve aussi une lutte contre les champignons avec l augmentation de l activit glucanase et chitinase un stade pr c dant l excr tion des citrates Weisskopf L et al 2005 50 Revue bibliographique a 5 JAE b 6 JAE c 7 JAE Figure I 18 Racines secondaires lat rales collect es 2cm de la zone de transition des racines du lupin blanc cultiv en condition de carence phosphorique P Les fl ches montrent les m rist mes des racines secondaires a 5 JAE b 6 JAE c 7 JAE et d 8 JAE Les racines sont color es au bleu de m thyl ne Barre d unit s 1 mm Grossissement 30 X IV 2 3 Adaptation g n tique Les racines proteo des du lupin blanc cultiv sous carence phosphorique P montrent un syst me de r gulation de l expression de certains g nes Ceci influence l acquisition du phosphate inorganique Pi et du carbone le m tabolisme secondaire ainsi que les processus de d veloppement On note aussi la stimulation de l expression des g nes li s la glycolyse Uhde stone et al 2003 Le g ne LaMATE est hautement exprim au niveau des proteo des du lupin blanc cultiv sous diff rents types de stress savoir en manque de phosphore P de fer Fe d azote N de mangan se MN et en exc s d al
175. aenorhabditis briggsae A Platform for Comparative Genomics PLoS Biology 1 166 192 Stein LD et al 2001 WormBase network access to the genome and biology of Caenorhabditis elegans Nucleic Acids Research 29 82 86 Talhinhas P Neves Martins J Leitao J 2003 AFLP ISSR and RAPD markers reveal high levels of genetic diversity among Lupinus spp Plant Breeding Volume 122 Issue 6 Pages 507 510 Tautz D Trick M and Dover G 1986 Crytic simplicity in DNA is a major source of genetic variation Nature 322 652 656 186 R f rences bibliographiques Tenaillon MI Sawkins MC Long AD Gaut RL Doebley JF Gaut BS 2001 Patterns of DNA sequence polymorphism along chromosome 1 of maize Zea mays ssp mays L Proc Natl Acad Sci USA 98 9161 9166 Turner BL 1957 The chromosomal distributional relationships of Lupinus texensis and L subcamosus Madrono 14 13 Tuskan GA Difazio S Jansson S et al 2006 The genome of black cottonwood Populus trichocarpa Torr amp Gray Science 313 5793 1596 604 Uhde Stone C Zinn K E Ramirez Yanez M Li A Vance C P and Allan D L 2003 Nylon filter arrays reveal differential gene expression in proteoid roots of white lupin in response to phosphorus deficiency Plant Physiol 131 1064 1079 Uhde Stone C Liu J Zinn K E Allan D L and Vance C P 2005 Transgenic proteoid roots of white lupin a vehicle for characterizing and silencing root genes invo
176. age cumul des deux premiers axes de l ACP bas e sur les marqueurs ISSR Valeur propre 2 303 1 515 Variabilit 20 934 13 776 20 934 34 710 I11 2 2 1 d Distribution tridimensionnelle Une distribution tridimensionnelle ou Multidimensionnal scaling MDS a t effectu e afin d avoir une id e sur la structuration tridimensionnelle des 10 accessions d albus Figure II 14 Cette repr sentation permet de voir la distribution des diff rentes accessions selon trois axes X Y et Z sur la base de leurs distances g n tiques On retrouve clairement les trois regroupements d accessions L aGI L aGII et L aGIII propos s pr c demment Figure II 13 Dans la figure II 14 les trois groupes ont t d limit s par des ellipses tr s loign es l une de l autre et ne pr sentent aucun chevauchement Ceci suppose qu il n y a pas d change entre les accessions des trois groupes 90 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit nus L a GI Ab0S 4607 Ab06 Figure IL 14 Distribution spatiale tridimensionnelle MDS repr sentant les accessions de L albus moyennant les marqueurs ISSR 91 i ae b x Cos04 Cosl2 Ces05 Cos23 Ces02 Cos22 Cos 3 Ces03 Cos2t Cosl4 CosO7 Cos24 Cosl CosO Cost f Ces08 Ces10 Cesi5 Ces06 Ces09 Cos 8 Cos22 Cosl Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Cos0O3 Cosi2 Cosi5 Cosi7 Cosi Cos24 Cos22 Cos21 Cos23 Cos20
177. aires on peut d duire les indices de distances D comme suit D 1 S c Indices de similarit s quantitatifs sym triques L indice fait le rapport entre le nombre de descripteurs ayant le m me tat pour les deux objets et le nombre total de descripteurs Exemple de l indice d Estabrook et Rogers et l indice de Gower 22 Revue bibliographique d Indices de similarit s quantitatifs asym triques Dans cette cat gorie deux indices sont fr quemment utilis s l indice de Steinhaus et la similarit du khi carr Pour le cas des donn es quantitatives on distingue deux cat gories d indices de distance selon leurs propri t s g om triques Les indices de distances m triques qui ob issent aux quatre propri t s suivantes 1 Si deux entit s a et b sont similaires a b la distance entre a et b est nulle D a b 0 2 Si les deux entit s a et b sont diff rentes la distance entre elles est sup rieure 0 D a b gt 0 3 La distance entre les deux entit s est la m me dans les deux sens D a b D b a 4 Si on consid re trois entit s a b et c alors D a b D b c est plus grand ou gal a D a c La plus courante des distances m triques est la distance euclidienne Dans un espace euclidien chaque variable est consid r e comme une dimension et les diff rents objets se positionnent selon les valeurs de ces variables Ces mesures n ont pas de valeurs maximales et d pendent de l chelle des variables
178. amorces utilis es et d une accession une autre Tableau 11 24 Le poids mol culaire des bandes variait entre 104 92 et 1703 pb On note que les amorces utilis es ont t tr s informatives selon les valeurs de l indice de diversit calcul es PIC qui variaient entre 0 91 et 0 96 avec une moyenne de 0 94 et un cart type de 0 017 Parmi les 358 marqueurs ISSR obtenus 108 30 16 marqueurs uniques ont t enregistr s Tableau IL 25 Chacune des populations de Luteus a t caract ris e par un certain nombre de marqueurs sp cifiques qui allait entre 10 Lut03 et 24 Lut05 Tableau IL 24 Marqueurs ISSR g n r s pour les accessions de L luteus pour chaque amorce Amorce Nombre de marqueurs g n r s ISSR Lut09 Lut08 Lut02 Lut06 Lut07 Lut03 LutOI1 Lut05 F1 6 7 5 8 9 8 5 6 F2 9 16 10 15 16 10 12 12 F3 12 13 11 14 12 17 12 14 FL1 9 13 11 11 4 8 12 11 FL2 4 5 7 7 8 8 7 7 FL3 9 5 6 6 6 6 7 8 FL4 12 14 4 14 14 8 6 12 FL5 5 7 6 9 8 6 7 11 FL6 5 7 5 6 6 3 6 8 FL7 8 7 8 6 5 7 9 5 FL8 6 5 4 11 11 4 5 12 FL9 4 6 4 9 5 5 5 12 FL10 4 5 4 3 4 6 4 7 FL11 10 13 12 15 10 10 9 14 105 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau II 25 Marqueurs ISSR sp cifiques des populations de Lupinus luteus Accession Marqueurs ISSR sp cifiques F3 934pb FL1 708 76pb FL3 658 06pb FL3 260 67pb FL4 325 62pb F
179. aptateurs ayant des bouts coh sifs aux extr mit s dig r es L adaptateur EcoRI pr sente la s quence suivante 5 CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA 5 Et l adaptateur Msel pr sente la s quence suivante 5 GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT 5 Ces adaptateurs sont caract ris s aussi par leur s quence compl mentaire a celle des amorces de la pr amplification La ligation est optimis e dans 40 ul de m lange r actionnel contenant 62 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau II 3 Liste des 25 combinaisons d amorces AFLP utilis es dans l tude de la diversit inter sp cifique du lupin du Maroc Amorces MseT M CAC M CAG M CAT M CTA M CTC Amorces EcoRI E ACC E ACG E ACT T E AGC E AGG T 63 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit L ADN dig r 5 pM d adaptateur EcoRI et 50 pM d adaptateur Msel 10 mM d ATP 300 mM Tris HCL PH 7 8 100 mM MgCh 100 mM DTT et 1 5 unit s de T4 ligase promega La ligation est optimis e a 37 C pendant 3 heures Cette tape peut aussi tre v rifi e par visualisation des produits de la ligation apr s lectrophor se sur gel d agarose La troisi me tape du protocole d AFLP consiste en une pr amplification ou encore appel e PCR non s lective Cette PCR est bas e sur l utilisation de deux amorces EcoRI primer 0 do
180. ar Karl Pearson en 1901 en tant qu une technique de r duction de dimensionnalit s Cette m thode d analyse de donn es permet la r duction du nombre de variables et consid re les axes qui repr sentent le mieux les corr lations entre les variables al atoires L ACP est consid r e comme un outil de compression lin aire 24 Revue bibliographique III La g nomique structurale et fonctionnelle m thodes et applications Actuellement l un des d fis majeurs du chercheur est la compr hension des m canismes complexes chez les organismes vivants Les ph nom nes tels que la croissance le d veloppement et l adaptation aux stress en particulier le stress hydrique n cessitent une bonne compr hension et analyse de l information port e par le g nome Ceci implique deux disciplines piliers de la biologie mol culaire la g nomique structurale et la g nomique fonctionnelle La g nomique structurale nous permet de d chiffrer et extraire l information port e par le g nome et par les prot ines La g nomique fonctionnelle nous permet par contre de comprendre les modalit s de r gulation et d interaction de cette information IIL 1 La g nomique structurale Cette discipline est bas e essentiellement sur le s quen age et l identification des g nes La d finition des structures introns exons et r gions inter g niques est une tape cruciale de la g nomique structurale Cette identification s effectue par comparaison des s
181. arqueur F1 F2 1 ISSR F1 569 pb 0 046 1 326 42 ISSR FL1 196 pb 0 140 1 186 2 ISSR F1 552 bp 0 140 1 186 43 ISSR FL1 185 pb 1 184 0 436 3 ISSR F1 478 bp 0 167 0 025 44 ISSR FL1 165 pb 0 002 0 502 4 ISSR F1 459 bp 0 323 0 009 45 ISSR FL1 147 pb 1 184 0 436 5 ISSR F1 383 bp 0 454 1 293 46 ISSR FL2 543 pb 0 040 0 417 6 ISSR F1 269 bp 0 454 1 293 47 ISSR FL2 526 pb 1 260 0 073 7 ISSR F1 241 bp 0 454 1 293 48 ISSR FL2 470 pb 0 102 0 007 8 ISSR F1 229 bp 0 102 0 007 49 ISSR FL2 381 pb 0 167 0 025 9 ISSR F1 192 bp 0 454 1 293 50 ISSR FL2 359 pb 0 167 0 025 10 ISSR F1 181 bp 0 040 0 417 51 ISSR FL2 332 pb 0 454 1 293 11 ISSR F1 173 bp 0 140 1 186 52 ISSR FL2 307 pb 0 861 0 522 12 ISSR F1 159 bp 0 046 1 326 53 ISSR FL2 278 pb 0 046 1 326 13 ISSR F1 155 bp 0 140 1 186 54 ISSR FL2 263 pb 0 140 1 186 14 ISSR F2 409 bp 0 102 0 007 55 ISSR FL2 243 pb 0 002 0 502 15 ISSR F2 318 bp 1 260 0 073 56 ISSR FL2 243 pb 1 184 0 436 16 ISSR F2 304 bp 0 040 0 417 57 ISSR FL2 214 pb 0 861 0 522 17 ISSR F2 283 bp 0 140 1 186 58 ISSR FL2 202 pb 1 184 0 436 18 ISSR F2 272 bp 0 040 0 417 59 ISSR FL2 183 pb 0 861 0 522 19 ISSR F2 246 bp 0 102 0 007 60 ISSR FL2 173 pb 0 140 1 186 20 ISSR F2 222 bp 0 140 1 186 61 ISSR FL2 162 pb 0 040 0 417 21 ISSR F2 212 bp 0 167 0 025 62 ISSR FL2 150 pb 1 260 0 073 22 ISSR F2 188 bp 0 454 1 293 63 ISSR FL2 143 pb 1 645 0 111 23 ISSR F2 166 bp 0 167 0 025 64 ISSR
182. ation de la premi re puce 31 Revue bibliographique ADN a eu lieu en 1996 par l affymetrix Les puces ADN pr sentent des mol cules d ADN sur du verre plastique ou silicum Le principe de cette technique est bas sur des r actions d hybridation compl mentaires entre les brins d ADN fixes et des ARN de l chantillon tester ARN r tro transcrit en ADNc Aujourd hui on commercialise des puces ADN avec le g nome entier de plusieurs esp ces Arabidopsis thaliana soja etc Ces techniques bas es essentiellement sur les rapports d hybridation d finis par l abondance potentielle du transcrit pr sentent une limite majeure pour les g nes avec un nombre de copies faible Benfey P 2006 Pour ceci les r sultats des techniques de profilage transcriptionel doivent tre v rifi s par d autres techniques telles que l analyse des gels d ARN Van Zhong and Burns 2003 Parisi et al 2004 les PCR quantitatives Leonhardt et al 2004 les exp riences de g nes reporteurs ou encore les tests d hybridation in situ Chez le lupin blanc une tude du transcriptome par l utilisation de puces ADN a contribu la compr hension de l adaptation des plantes la carence phosphorique P 2102 ESTs pr alablement isol s partir de racines proteo des P du lupin blanc ont t analys s et ont permis a l identification de 35 g nes surexprim s diff rents stades de d veloppement des racines proteo des cultiv e
183. au sud de l Am rique Les travaux de Gladstones 1974 constituent une r f rence dans la taxonomie des lupins de la m diterran e et d Afrique et permettent de clarifier les confusions et controverses rencontr es dans la taxonomie des Lupinus qui datent de l poque linn enne Dans la litt rature plusieurs esp ces de lupin ont t faussement appel es par leurs synonymes botaniques Par exemple L termis est attribu e par quelques auteurs a L albus var albus originaire d Egypte I 2 Description botanique Les lupins de l ancien monde sont des esp ces herbac es annuelles pr sentant des feuilles digit es Elles sont principalement autogames et caract ris es par leur aneuplo die avec une variation du nombre de chromosomes de 32 52 Selon la structure du t gument des graines on peut d finir deux groupes les lupins a sem lisse connus en m diterran e et les lupins a sem rugueuse pr sents particuli rement en Afrique du nord Tableau I 1 et I 2 Gladstone 1994 Heyn et Herrnstadt 1977 Plitmann et Pazy 1984 Chez les esp ces du nouveau monde on reconna t des centaines d esp ces annuelles ou vivaces qui peuvent tre herbac es ou vasculaires pr sentant des feuilles digit es Ces plantes sont autogames ou allogames avec un nombre de chromosomes de 48 g n ralement fixe Cependant quelques taxons font exception avec 2n 96 ou 36 Smith 1944 Phillips 1957 Turner 1957 Ce groupe est pr sent dans les Highlands s
184. b 0 511 0 194 90 ISSR F1 581 pb 0 237 1 202 131 ISSR F2 258 pb 0 322 2 351 91 ISSR F1 558 pb 0 755 1 156 132 ISSR F2 637 pb 0 511 0 194 92 ISSR F1 517 pb 0 306 0 407 133 ISSR F2 543 pb 2 154 2 383 93 ISSR F1 488 pb 1 192 3 171 134 ISSR F2 497 pb 1 232 0 281 94 ISSR F1 464 pb 0 083 1 173 135 ISSR F2 416 pb 1 369 0 499 95 ISSR F1 432 pb 1 369 0 499 136 ISSR F2 435 pb 1 620 2 192 96 ISSR F1 390 pb 0 712 0 016 137 ISSR F3 1060 pb 0 237 1 202 97 ISSR F1 348 pb 1 369 0 499 138 ISSR F3 927 pb 1 369 0 499 98 ISSR F1 334 pb 1 369 0 499 139 ISSR F3 822 pb 0 322 2 351 99 ISSR F1 301 pb 0 511 0 194 140 ISSR F3 751 pb 1 369 0 499 100 ISSR F1 283 pb 1 369 0 499 141 ISSR F3 685 pb 1 369 0 499 101 ISSR F1 283 pb 1 369 0 499 142 ISSR F3 623 pb 1 369 0 499 102 ISSR F1 270 pb 3 200 0 467 143 ISSR F3 585 pb 1 232 0 281 103 ISSR F1 245 pb 0 127 0 788 144 ISSR F3 553 pb 1 369 0 499 104 ISSR F1 228 pb 0 263 1 006 145 ISSR F3 523 pb 1 232 0 281 105 ISSR F1 214 pb 0 237 1 202 146 ISSR F3 489 pb 1 232 0 281 106 ISSR F1 200 pb 1 880 1 375 147 ISSR F3 467 pb 0 374 0 024 107 ISSR F1 181 pb 0 377 0 453 148 ISSR F3 449 pb 1 369 0 499 108 ISSR F1 155 pb 1 251 0 186 149 ISSR F3 422 pb 1 369 0 499 109 ISSR F2 683 pb 3 610 1 794 150 ISSR F3 402 pb 1 232 0 281 110 ISSR F2 382 pb 0 374 0 024 151 ISSR F3 373 pb 1 369 0 499 111 ISSR F2 222 pb
185. b FLS 8 142 02pb 514 58pb 0 92 442 63pb 383 80pb 383 80pb FL6 8 134 13pb 817 44pb 0 92 817 44pb 768 01pb 634 61pb 500 00pb 272 31pb 174 54pb FL7 8 155 09pb 767 12pb 0 92 767 12pb 767 10pb 254 10pb FL9 8 110 28pb 640 30pb 0 911 640 30pb 501 48pb 432 28pb 349 79pb FL12 7 149 26pb 399 74pb 0 93 355 23pb 234 22pb 198 69pb 171 40pb Total 93 110 28pb 817 44pb oe 34 71 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau II 4 Suite Liste des amorces ISSR utilis es dans l tude intersp cifique des quatre esp ces de lupin les marqueurs g n r s pour chaque amorce ISSR et la taille des marqueurs engendr s Esp ces Amorce Marqueurs Taille des bandes PIC marqueurs g n r s obtenues sp cifiques L luteus F1 8 159 43pb 568 95pb 0 88 F2 4 151 41pb 408 67pb 0 85 408 67pb 246 13pb FL1 4 165 30pb 569 04pb 0 91 470 15pb FL2 7 143 26pb 470 15pb 0 93 470 15pb FL3 7 139 19pb 677 40pb 0 94 581 99pb 504 35pb FL4 4 156 50pb 362 91pb 0 89 0 FL5 5 142 02pb 699 95pb 0 92 699 95pb FL6 8 134 13pb 414 87pb 0 92 160 68pb FL7 7 178 28pb 572 81pb 0 92 435 18pb FL9 7 110 28pb 299 82pb 0 911 0 FL12 6 149 26pb 775 85pb 0 93 428 69pb 286 75pb Total 67 110 28pb 775 85pb 0 909 11 0 026 Le tableau II 4 r sume le nombre des marqueurs sp cifiques obtenus pour chaque esp ce et pour chaque amorce Le no
186. biotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Tableau II 4 Comparaison de LaSCRI et LaSCR2 avec AtSCR sur la base des domaines fonctionnels et de la partie N terminale Nom de motif Similarit avec AtSCR LaSCR1 LaSCR2 Homopolymeric repeat 40 4 42 Leucine heptad I 88 6 86 5 VHIID 93 4 93 4 Leucine heptad II 81 8 75 7 PFYRE 93 4 93 5 SAW 86 87 7 1 2 3 d Comparaison avec d autres g nes SCR Une analyse phylog n tique a t perform e afin d analyser les distances g n tiques entre les deux g nes SCR du lupin et plusieurs g nes de la famille de GRAS Ceci inclut les g nes SCR de plusieurs esp ces de plantes savoir Arabidopsis thaliana AtSCR At3g54220 Zea mays ZmSCR AAG13663 Oryza sativa OsSCR BAD22576 Pisum sativum PsSCR BAB39155 et Pinus sylvestris PsySCR ABH85406 Cette comparaison comprend aussi 31 g nes d A thaliana appartenant a la famille de GRAS Les sequences des 31 g nes ont t prises du site TAIR www arabidopsis org AtSCL23 At5g41920 AtSCL3 Atlg50420 AtRGLI At1g66350 AtRGL2 At3g03450 AtRGL3 At5g17490 AtGAI At1g14920 AtRGA At2g01570 AtSCL28 Atlg63100 AtLAS SCLI8 At1g55580 AtSCL4 At5g66770 AtSCL7 At3g50650 AtSCL26 At4g08250 AtSCL31 Atlg07520 AtSCL33 At2g29060 AtSCL14 Atlg07530 AtSCL11 At5g59450 AtSCL30 At3g46600 AtSCL9 At2g37650 AtPAT1 At5g48150 AtSCL21 At2g04890 AtSCLS At1g50600 AtSCL13
187. btenues ont t compar es avec celles des ADNc par alignement Ainsi la position et la s quence des introns et des promoteurs ont t rep r es Les s quences obtenues ont t d pos es dans NCBI sous les num ros d accessions FJ236987 LaSCR1 et FJ236988 LaSCR2 140 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 1 3 3 R sultats 1 3 3 a Structure des deux g nes LaSCRI et LaSCR2 et comparaison avec AtSCR Les deux g nes isol s pr sentent deux exons et un intron unique Figure II 6 Le g ne LaSCRI a un exon 1 de 1868 pb et un exon 2 de 463 flanquant un intron de 1022pb LaSCRI a aussi un promoteur de 1427 pb Par ailleurs LaSCR2 pr sente un exon 1 de 1856 pb et un exon 2 de 368 pb et entre les deux un long intron de 2404 pb Aussi LaSCR2 pr sente un promoteur de 1066 pb On remarque que les deux g nes SCR du lupin pr sentent les introns les plus longs en comparaison avec les autres g nes SCR connus N anmoins la position des introns est tr s conserv e chez tous les g nes SCR y compris les LaSCR1 et LaSCR2 LaSCR1 Promoteur Exon 1 Intron Exon 2 1427pb 1868 pb 1022 pb 463 pb ATG GT AG TA Oe SRRI _ SER re mee SCR F2 Dt ig ee ee gt SCR F SCR FF LaSCR2 Promoteur Exon 1 Intron Exon 2 1176pb 1856 pb 2404 pb 368 pb AT GT A ole ee lt Site De E R1 aa y R5 gt ia i lt a ee ra Et SCR F
188. c 2n 32 Les plantes ont naturellement des fleurs bleues bleu p le avec des t ches blanches au niveau des marges sup rieures Figure I 2 alors que les fleurs roses ou blanches ont t s lectionn es On rencontre L cosentinii dans les r gions montagneuses du Maroc et sur les zones c ti res surtout au niveau de la cha ne Rabat Casablanca o on a remarqu un d veloppement massif de cette plante au cours des derni res ann es Revue bibliographique Graines de Lupinus cosentinii Figure I 2 Lupinus cosentini a plante avec feuilles et fleurs de couleur violette b graines Unit montre 0 5 cm 1 3 3 Lupinus pilosus Cette plante est caract ris e par des feuilles poilues et les graines les plus larges du groupe du lupin a graines rugueuses et a probablement t s lectionn e pour ce caract re auparavant Les types sauvages pr sentent de larges fleurs bleues Figure I 3 avec des taches blanches et de larges gousses Les graines sont de couleur marron rouge a rose avec une tache sombre en forme de croissant Les plantes de cette esp ce pr sentent des inflorescences larges et visibles qui ont int ress les horticulteurs du nord de l Europe qui s lectionnent les vari t s de jardin Les types s lectionn s sont caract ris s par un fleurissement pr coce et des fleurs blanches ou roses Clements et al 1996 Figure I 3 L pilosus montrant les feuilles et l inflorescence bleue Revue bibliographique
189. chaefer and J Nienhuis 1986 Construction of genetic linkage maps in maize and tomato using restriction fragment length polymorphisms Theor Appl Genet 72 761 769 Helliwell C A Wesley S V Wielopolska A J amp Waterhouse P M 2002 High throughput vectors for efficient gene silencing in plants Functional Plant Biology 29 1217 1225 Heyn CC et Herrnstadt I 1977 Seed coat structure of Old World Lupinus species Bot Noti ser 130 427 35 Hondelmann W 1984 The lupin ancient and modern crop plant Theor Appl Genet 68 1 9 178 R f rences bibliographiques Huang J amp S M Sun 2000 Genetic diversity and relationships of sweet potato and its wild relatives in Ipomoea series Batatas Convolvulaceae as revealed by inter simple sequence repeat ISSR and restriction analysis of chloroplast DNA Theor Appl Genet 100 1050 1060 Hurst H C 1994 Transcription factors I bZIP proteins Protein Prof 7 123 168 Jaillon O Aury JM Noel B et al September 2007 The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla Nature 449 7161 463 7 Jefferson R A 1989 The GUS reporter gene system Nature 342 837 838 Jeschke WD Pate JS 1995 Mineral nutrition and transport in xylem and phloem of Banksia prionotes Proteaceae a tree with dimorphic root morphology J Exp Bot 46 895 905 Johnson J F Vance C P amp Allan D L 1996 Phosphorus deficiency in Lupinus albus
190. choix pour tudier la diversit inter et intra sp cifique du lupin marocain Les ADN des quatre esp ces de lupin utilis es L albus L luteus L cosentinii et L angustifolius ont t amplifi s par les marqueurs ISSR 60 ng de l ADN de chaque esp ce ont t amplifi s dans 25 ul de m lange r actionnel contenant 10 mM Tris HCl pH 8 3 50 mM KCl 25 mM MgCh 0 5 mM dNTP 4 mM d amorce et 1 unit de Taq polym rase Nous avons utilis 16 amorces ISSR Tableau II 2 dont 12 FL1 FL12 sont sp cifiques au Lupin Talhinhas ef al 2003 Tableau II 2 Liste des 16 diff rentes amorces ISSR utilis es dans tude de la diversit intra et inter sp cifique du lupin marocain Code de S quence 5 3 P amorce Fl CA AT F2 CA 6 GC F3 CA AG F4 AGC T FLI AC CA FL2 AC s CG FL3 AC CT FL4 AG CC FLS AG CG FL6 CA s AG FL7 CA g AC FL8 GA CC FL9 GA CG FL10 GA s CT FL11 GT CC FL12 GT CG 61 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit La PCR est optimis e selon le programme d amplification suivant Une tape de d naturation 94 C pendant 30s suivie de 40 cycles avec une tape de d naturation a 94 C pendant 30s une hybridation a 45 C pendant 45s et une tape d longation a 72 C pendant 2mn L amplification est boucl e par une tape d longation a 72 C pendant 7mn Les produits d amplification I
191. cidifient fortement la rhizosphere adjacente en secr tant une grande quantit d acides organiques en particulier les citrates et les malates Ceci permet a la plante d extraire le phosphate inorganique d un volume restreint du sol Les protons solubilisent le phosphore dans les sols calcaires Le lupin blanc et la plupart des Proteaceae se d veloppent sur des sols acides Les dicarboxylates et tricarboxylates agissent comme des changeurs d anions pour le phosphate permettant de le lib rer des complexes Fe P AI P ou Ca P La s cr tion de protons et d acides organiques permettent aux plantes qui forment des racines proteoides de survivre sur des sols pauvres en phosphore La quantit des citrates et malates secr t s diff re d un stade un autre du d veloppement des racines proteo des Les jeunes proteo des en d veloppement secr tent beaucoup de malates et une faible quantit de citrate alors que les racines proteo des non m tures secr tent une quantit similaire de citrates et malates Les proteo des matures secr tent de grandes quantit s de carboxylates particuli rement des citrates et acidifient la rhizosph re La solubilisation l extraction et l assimilation du phosphore se fait au stade mature des racines proteo des Le lupin blanc d veloppe une strat gie complexe pour prot ger les acides organiques secr t s contre la d gradation microbienne On remarque une augmentation de l excr tion des isoflavonoides au niveau des r
192. contre du pole de comp tence MisoBioP FST Fes Communications affich es Clonage et analyse mol culaire du g ne SCARECROW au niveau du syst me racinaire du Lupin blanc 2008 4 me Congr s International de G n tique et Biologie Mol culaire amp de biotechnologie Ouarzazate Scarecrow SCR Mediates Root Development in Lupinus albus and Medicago truncatula 2007 July 7 11 Plant Biology and Botany Chicago Illinois Preliminary study of genetic diversity in Moroccan lupinus species using the RAPD markers 2004 8 10 Septembre 7 National Biotechnology Congress University of Catania Etude pr liminaire de la diversit g n tique du Lupin Marocain par les marqueurs RAPD 2004 8 et 9 mars S minaire international d veloppement des cultures fourrag res une n cessit pour am liorer les productions animales et att nuer la d gradation des ressources naturelles INRA Rabat Etude pr liminaire de la diversit g n tique du Lupin Marocain par les marqueurs RAPD 2003 Troisi me congr s de G n tique et de Biologie Mol culaire Tanger R sum L objectif de ce travail a t d tudier la variabilit g n tique des populations marocaines de L albus L angustifolius L cosentinii et L luteus Les marqueurs ISSR et AFLP ont t tr s informatifs avec des indices de diversit g n tique PIC proches de 1 Aussi ces marqueurs ont permis de r v ler un haut niveau de polymorphism
193. cs l universit du Minnesota Saint Paul aux Etats Unis d Am rique Chapitre I Revue bibliographique Revue bibliographique INTRODUCTION Cette premi re partie de la th se est une introduction au travail dans laquelle diff rentes parties seront discut es Nous nous proposons de donner une pr sentation g n rale du lupin depuis sa classification jusqu sa phylog nie avec une vue particuli re sur les lupins du Maroc Ensuite un aper u sur l tude de la diversit g n tique via les marqueurs mol culaires et l analyse de cette diversit moyennant les m thodes de classification et les analyses factorielles Ce volet synth tise aussi l importance de la g nomique structurale et de la g nomique fonctionnelle comme deux disciplines compl mentaires et leurs importances dans la compr hension de l information g n tique Dans cette partie on pr sente aussi le lupin blanc en tant que plante mod le pour l tude de l adaptation au stress phosphorique et aussi les m canismes d adaptations adopt s par cette plante I Le genre Lupinus I 1 Classification Les lupins appartiennent l embranchement des spermaphytes le sous embranchement des angiospermes la classe des Magnoliopsidae Dicotyl dones la sous classe des Rosidae l ordre des fabales la famille des Fabaceae L gumineuses la sous famille des papilionac es tribu des genist es et le genre Lupinus Ce genre comporte 200 500 esp ce
194. de phosphorylation de glycosylation d amidation et un site pour la leucine zipper Le site de la leucine zipper est un site de dimerisation commun aux prot ines impliqu es dans la r gulation de l expression des g nes 136 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc SCL23 PsySCR AtSCR Cs SOR PsSCR ZmSCR OsSCR SCL3 RGL3 RGL2 Re DELLA GAI RGA SCL28 tas LAS SCL18 sur SCL4 7 SCL26 SCL31 SCL33 SCL14 can SCL9 SCL30 SCL9 PATI SCL21 SCL5 SCL13 PATIL SCLI SCL8 SCL32 SHR SHR SCL29 SCL6 SCL22 re Han SCL15 HsSRC 0 1 Figure IILS Arbre phylog n tique de LaSCR1 LaSCR2 les 5 g nes SCR connus et les 31 g nes de la famille de GRAS Le g ne HsSRC est utilis comme outgroup L chelle indique la distance g n tique 137 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Tableau III 5 Motifs potentiels pr sents au niveau des prot ines LaSCRI et LaSCR2 Position au S quence Position au S quence Nom du motif niveau de du niveau de du LaSCR1 Motif LaSCR2 Motif 8 NNTE 33 NNSS 27 NNSS 37 NISS 87 NMSL 94 NMSS 93 NCSS 142 NYST 136 NYST 197 NSTS Site de la N glycosylation 193 NSSS 220 NNSA 217 NNSA 278 NTST 275 NTSA 290 NNSS 286 NSSA 301 NNTI 293 NNTT 359 NSSM 591 NVTK Site de phosphorylation de prot ine d pendante Camp et 560 KRLS 86 RRSS
195. doderme entre le pericycle et l piderme on parle de supernumerary De r cents travaux Cui et al 2007 montrent que le g ne SCR n est pas autor gul et qu il est par contre sous le control d un autre facteur de transcription SHR La mutation au niveau du SHR g n re un ph notype similaire celui des mutants SCR d o le nom short root ou racines courtes Le g ne SHR s exprime au niveau du tissu vasculaire et partir duquel la prot ine migre vers l endoderme o elle sera bloqu e par SCR au niveau du noyau Le complexe prot ique SCR SHR va se fixer sur le promoteur de SCR pour stimuler l expression de SCR Les deux prot ines SCR et SHR vont former un complexe prot ine prot ine Ce complexe SCR SHR se fixe aussi sur d autres promoteurs comme le MAGPIE MGP SCR Like3 SCRL3 NUTCRACKER NUC RECEPTOR LIKE KINASE RLK Chez toutes les esp ces tudi es jusqu aujourd hui SCR s exprime au niveau de la couche endodermique et du centre quiescent La pr sence de l endoderme sous forme d une seule couche semble tre un m canisme volutif conserv et en relation avec le g ne SCR Cui et al 2007 La caract ristique du SCR en tant que marqueur des cellules souches a t utilis e dans plusieurs travaux Chez le mais une tude a port sur l excision partielle et totale de la pointe de la racine et l analyse de la r g n ration de la pointe racinaire et de la structuration radiale SCR a t utilis comme
196. e Des valeurs de similarit lev es ont t enregistr es entre les quatre esp ces de lupin et aussi entre des accessions de la m me esp ce Les valeurs de similarit les plus importantes ont concern le lupin cultiv L albus et L luteus Par ailleurs les esp ces et accessions de lupin tudi es ont t caract ris es par un certain nombre de marqueurs sp cifiques La classification hi rarchique des diff rentes accessions de lupin la base de l indice de diversit de Dice montre leur groupement ind pendamment de leurs origines g ographiques D un autre c t nous avons isol chez Lupinus albus deux g nes SCARECROW SCR LaSCRI et LaSCR2 L hybridation in situ et l tude du promoteur ont montr que les deux g nes s expriment de mani re consistante au niveau de l endoderme des racines normale et racines proteoides du lupin blanc L expression du SCR au niveau des racines proteo des r v l e par PCR en temps r el a t influenc e par le stade de d veloppement Aussi le silen age du SCR chez Lupinus albus et Medicago truncatula via ARN d interf rence a permis de r duire le d veloppement racinaire au niveau des racines chevelues Les deux g nes SCR du lupin sont orthologues au SCR d Arabidopsis thaliana Mots cl s Lupinus diversit AFLP ISSR SCARECROW Racines proteoides ARNi Abstract The objective of this work was the evaluation of the genetic variability of the Moroccan populat
197. e aux trois stress Figure II 3 Matrice repr sentant l expression des g nes sur exprim s Figure IIL 4 Alignement des s quences de LaSCRI LaSCR2 et AtSCR Figure III S Arbre phylog n tique de LaSCR1 2 et les autres g nes de la famille de GRAS Figure II 6 Sch ma du s quen age des deux g nes LaSCRI et LaSCR2 Figure III 7 Structure des deux g nes LaSCR1 et LaSCR2 en comparaison avec AtSCR Figure II 8 Southern blots du lupin blanc Figure IIL9 Les diff rentes zones des racines proteoides d finissants les stades de d veloppement des radicelles Figure III 10 Expression de LaSCR1 et LaSCR2 au niveau des organes de L albus Figure III 11 PCR en temps r el des ADNc g n r s a partir de racines normales et proteoides Figure III 12 Repr sentation des l ments r gulateurs au niveau du promoteur de LaSCR1 Figure III 13 Position des l ments r gulateurs d tect s au niveau du promoteur de LaSCR2 Figure III 14 Sch ma d une partie du plasmide pBI 102 avec le promoteur de LaSCR2 Figure III 15 Expression du promoteur de LaSCR2 dirig e par GUS au niveau des racines normales du lupin blanc Figure HI 16 Localisation de l expression de LaSCR2 diff rents stades de d veloppement des racines proteoides Figure IIL 17 Localisation de expression du SCR dirig e par GUS au niveau des racines de Medicago truncatula Figure IIL 18 Expression du LaSCR1 au niveau des racines normales du lupin blanc Figu
198. e des BAC par Shotgun organiser les r gions en Assemblage des s quences utilisant la synteny Organiser les s quences des contigs Po A les lacunes PCR reliant les banques S quences fini Annotation Figure I 10 Sch ma repr sentant les deux principales voies de s quen age du g nome 27 Revue bibliographique Tableau I 4 Exemple de quelques esp ces de plantes dont le g nome a t s quen taille du g nome couverte par le s quen age et nombre de g nes identifi s Recherche effectu e D cembre 2008 Organisme Taille du g nome Nombre Date d ach vement approximatif de g nes Arabidopsis thaliana 120 Mb 25 490 2000 Ecotype Columbia Nature 2000 Cyanidioschyzon merolae 16 5 Mb 5 331 2004 Strain 10D Matsuzaki et al 2004 Oryza sativa 420 Mb 32 50 000 2002 ssp indica Goff SA et al 2002 Oryza sativa 46 022 55 615 2002 ssp japonica sou Yu J et al 2002 Ostreococcus tauri 12 6 Mb 2006 Derelle E et al 2006 Physcomitrella patens 500 Mb 39 458 2008 Rensing SA ef al 2008 Populus trichocarpa 550 Mb 45 555 2006 Tuskan GA et al 2006 Vitis vinifera 490 Mb 30 434 2007 Jaillon O et al 2007 Zea mais 2500 Mb 50 000 60 000 2008 en cours de publication IIL 1 2 S quencage d tiquettes de s quences exprim es EST Le s quen age d EST est une variante du s quen age ciblant en particulier les s quences codantes et igno
199. e est tr s bien adapt e pour la transformation g n tique du lupin blanc III 2 2 2 Mutation de g nes Les mutations sont des processus naturels cl s du processus volutif des organismes vivants Elles occurrent naturellement apr s des erreurs au cours de la division cellulaire de l ADN ou apr s exposition aux agents mutag nes Les mutations peuvent tre intentionnellement provoqu es par les scientifiques pour l tude de la fonction des g nes qui est d duite partir du ph notype obtenu Les tudes de mutations ont 34 Revue bibliographique contribu la compr hension du d veloppement des plantes et la r gulation de la formation des organes Les tudes de la fonction des diff rents g nes d Arabidopsis thaliana a t possible grace aux tudes de mutations au niveau de ces g nes Les mutants T DNA d Arabidopsis thaliana pour l ensemble des g nes identifi s sont disponibles dans les banques de mutants Citons quatre g nes impliqu s dans la morphogen se racinaire d finis moyennant des mutations de type T DNA La mutation short root SHR entraine l alt ration de la structuration racinaire radiale ainsi qu une croissance d termin e de la racine au lieu d une croissance ind termin e Les mutations Cobra Lion s tail et Sabre entrainent par contre une expansion cellulaire anormale au niveau des racines Benfey P et al 1993 IIL 2 2 3 Silencage post transcriptionnel ARNi L ARN dinterf rence ou ARNi est
200. e la famille des Proteaceae forment des racines secondaires tertiaires avec une structure particuli re appel e proteo des en r ponse certains stress Phosphorique Ferrique et d azote Purnell 1960 Dinkelaker Hengeler amp Marschner 1995 Neumann amp Martinoia 2002 Lamont 2003 Shane amp Lambers 2005 Les racines proteo des peuvent tre d finies comme tant des racines secondaires avec 10 m rist mes ou plus par centim tre ou bien des racines tertiaires Figure I 16 Les racines proteo des sont caract ris es par un d veloppement limit Ces racines prennent naissance du pericycle au niveau de chaque p le oppos au xyl me Figure I 17 en comparaison avec les racines normales qui mergent aussi du pericycle et des p les oppos s du xyl me mais de fa on non ponctuelle On observe occasionnellement les m rist mes des racines secondaires 5 jours 49 Revue bibliographique apr s mergence JAE Les racines tertiaires ou radicelles se d veloppent rapidement dans le cortex et mergent travers l piderme 8 JAE Figure I 18 Dans le champ les racines proteoides de Banksia prionotes forment une touffe dense dans la couche organique au niveau de la surface du sol sableux Ces racines sont capables d assimiler le Phosphore l azote et les micronutriments des quantit s plus importantes que les racines non proteoides profondes Jeschke and Pate 1995 IV 2 2 Adaptation Biochimique Les racines proteoides a
201. e rapporteur se traduisent par une modification visible de leur couleur quand le g ne s exprime 3 1 1 Promoteurs LaSCR1 et LaSCR2 3 1 1 a Caract risation des l ments r gulateurs des promoteurs de LaSCRI et LaSCR2 Les promoteurs de LaSCR1 1427 pb et de LaSCR2 1066 pb ont t isol s et s quenc s comme expliqu dans les r sultats de la partie I Ces s quences ont t analys es pour la recherche des l ments r gulateurs ou l ments cis Deux programmes ont t utilis s pour analyser les deux promoteurs le PLACE http www dna affrc go jp PLACE et le Plant care cis acting regulatory elements http bioinformatics psb ugent be webtools plantcare html Aussi plusieurs l ments ont t recherch s manuellement Les l ments d tect s sont list s dans le tableau II 6 L emplacement de ces l ments est sch matis au niveau des figures III 12 et IIL 13 Les l ments rep r s peuvent tre regroup s en l ments de r ponse au stress phosphorique comme les TC repeats Helix loop helix PHO like et Nit2 et des l ments li s d autres types de stress comme les Binding transcription factor l l ment Dof WRKY Wing finger et PHRI Plusieurs tudes rapportent que les g nes codant pour des facteurs de transcription montrent une r ponse au stress phosphorique On nomme les familles MYB Zinc finger WRKY B HLH et Nit2 Mission et al 2005 Graham et al 2006 Muller et al 2007 Les
202. e she she she ee ske he hee L g TSSSSKVDNN he de eee Re eee SRPPRR SHL FSGLPLFPAS Mee ee We eee she her ee TT ee SD HSSNSVSIPO ee ee ee ee er ee ke Te ee ee AVGENNTTEV SYR eee THDGTSSVVA GYNY MS QEREN TD LOCAEAVSAE he he he a e he she she she ee ke he ke D STLVSHSS H Se OT he de RWMPOTHSL PGLFHILASR we veel ve ee We we ee a mms 1 PORLNVTRTE LEI s TER R RY EDGNNNN S DEFNG MLPHGAVVGG de de de ee TDS VAVVPNPTTP DHW 4 ee eae LDSNY TV QCRNHHHNSS he 0e ve dde dde he he he LINNVREIIY we Gh ee LHOYHDYYE GVVLNONHRE WEG 444 OX LYQOISN PS TALPAHHNDI D 4 D 4 PPOYETV NLEDANKMLL MU ee LY EY eee KVASAYOVEN eee eee My Ye Pe ke de he AVAVHWLOHS he he she a sde de he de She he ke she she ke he he ke he GGSPLTSASN ee ee ee he OP PH PLR RFPRR CND Wee ek SSS MDT NYSTMLLPSS ee ee QOPPS TAAA SSSSTGANVE ve de ee me PCNPNLAVVL Ce he a he he le MO CAT LPSTTTTVNV e GAN POCCOCHOCCQ SHQEECCDIV E eee ee TATVPAVO EISOLSTPFG he he a a a he he he she she he he ke he she de GIslP IFVKFSH NSSKFSSEEH ke de i Y Pr soe a DNMSLLLNCS NY syv rIee SCSTTINPNY he he he she ee ee TV SQOPN VAASPSMEDN ee ee ee ee ee MSVO DOD EYRLRLLTSH he he he he he he he he he
203. eau IIL 6 Les l ments r gulateurs d tect s au niveau des promoteurs de LaSCRI et LaSCR2 Liste des annexes Annexe II 1 Electrophor se des amplifias AFLP en conditions d naturantes Annexe II 2 Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intersp cifique Annexe II 3 Contribution des marqueurs AFLP dans les deux axes F1 et F2 de DACP r alis e dans l analyse intersp cifique Annexe II 4 Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L albus Annexe II 5 Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L cosentinii Annexe II 6 Contribution des marqueurs ISSR obtenus dans DACP r alis e dans l analyse intra sp cifique de L luteus Annexe II 7 Classification hi rarchique des populations de lupin utilis es la base des marqueurs ISSR Annexe II 8 Repr sentation tridimensionnelle ou multi dimensional scaling des populations du genre Lupinus en utilisant les marqueurs ISSR Annexe III 1 Extraction de l ARN chez le lupin blanc Maxi pr paration Annexe III 2 Expression des facteurs de transcription en r ponse au diff rents stress analys s Annexe IIL3 Marquage radioactif de ADN Annexe II 4 Pr paration du Southern blot et conditions d hybridation Annexe IILS5 Milieu Fahraeus modifi Annexe IIL6 Cartes des vecteurs de clonage utilis s Annexe III 7 Test histochimique
204. ec une tape de d naturation de 30 s 94 C une tape d hybridation de 30 s 56 C et une tape d longation de 1 mn 72 C Les produits de l amplification s lective sont s par s par lectrophor se et en conditions d naturantes sur gel de poly acrylamide 6 pendant 16 h 200V 2 mA Les amplifiats sont pr trait s en leur ajoutant le m me volume du tampon de charge d AFLP contenant 9 volumes de formamide et 1 volume du tampon Blue orange loading dye 0 4 Orange G 0 03 Bleu de Bromoph nol 0 03 Xyl ne Cyanol FF 15 Ficoll 400 10 mM Tris HCl pH 7 5 50 mM EDTA pH 8 0 promega Les chantillons sont d natur s pendant 5 mn 95 C et ensuite 64 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit s par s par lectrophor se sur gel d acrylamide pendant 16 heures 200V en pr sence du tampon de migration TBE 1X L lectrophor se est r alis e sur un syst me T Rex Aluminium Backed Sequencer Owl Portsmouth England La r v lation des gels d acrylamide se fait par coloration au nitrate d argent Les d tails techniques du protocole d AFLP utilis sont pr sent s dans l annexe II 1 II 1 6 Analyse des r sultats Les gels obtenus apr s migration lectrophor tique des produits PCR ISSR et AFLP sont num ris es et enregistr s sous une haute r solution Les images sont trait es par le logiciel GelComparll version 2 5 Applied Maths Kortrijk Belgium Seules les
205. elle ose eccecceccecccecceeceneeceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeneeneaees 110 IESCONCIUSION aiussincnunatdnneanccunsbancenecsnoideanunetenabinen Nuasaehanarsnndenguanaanuaemabanentndpien 113 CHAPITRE III Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc INTRODUCTION ns ei ne Net 117 lll 1 Criblage d une banque de facteurs de transcription 117 Ill 1 1 Approche exp rimentale oo eee e cece eee eee eee eee cee ee sees eens nena ee ee ea eaeaes 123 lll 1 1 1 Pr paration des Filtres ADNc issues 123 lll 1 1 2 Pr paration des cibles radioactives 123 lll 1 1 3 Hybridation des MCMDIANCS a ieesanni vue rstt enr asemmndennas peter etes meme anses onan eens 124 lll 1 2 R sultats et GISCUSSION zie tein end ne ne eat 125 IMS Gonlum aaea E ns ne mnt soda les en OM A 130 111 2 Le g ne SCARECROW chez le Lupin blanc 131 Partie 1 Clonage du g ne SCARECROW TA CHOU UN EST nn GR tt 131 1 2 L ADN compl mentaire ADNc de LaSCR1 et LaSCR2 131 1 2 1 Isolement de l ADNc des g nes LaSCR1 et LaSCR2 eee ececececeeeeeeeeeeeeeeeeeeees 131 1 2 1a Pr paration d une banque d ADNc du lupin blanc 131 1 2 1b Crblage de la banque UADNG lt saiwsi var deiweisentandei Qoebaedan cents seaxda eeteasieeandanden wae 132 12222 S U NCAQR spn por css nn
206. entier Sur le plan agronomique les l gumineuses constituent une source majeure d azote gr ce a leur relation symbiotique avec les rhizobiums Cette symbiose permet la transformation de l azote atmosph rique en formes assimilables par les organismes Sur le plan conomique les l gumineuses couvrent le 1 3 des besoins alimentaires humains en Azote et 25 des productions mondiales majeures en cultures Aussi sur le plan nutritionnel les l gumineuses sont cultiv es essentiellement pour leurs graines dot es d une grande valeur nutritionnelle et destin es l alimentation humaine et animale De part cette importance la recherche sur les l gumineuses tend vers la g n ration de cultures avec un meilleur rendement et des caract res de r sistances aux stress biotique et abiotique Liu et al 2000 Chen et al 2002 Fiehn 2002 Gesch et al 2002 Graves and Haystead 2002 Castle et al 2004 Chen and Gallie 2004 Glombitza et al 2004 Hao et al 2004 Lu and Chen 2004 Liu and Li 2005 Grennan 2006 Ceci n cessite l valuation du germplasme une bonne compr hension de la biologie des plantes et des interactions plantes environnement Afin de r pondre ces objectifs plusieurs technologies et ressources sont disponibles les marqueurs mol culaires les puces ADN les ESTs la transformation l ARNi etc La caract risation des germplasmes prend avantage des techniques de biologie mol culaire Ces techniques ont connu
207. entinii L luteus et L angustifolius Les marqueurs ISSR et AFLP ont permis de r v ler un haut niveau de polymorphisme a l chelle inter sp cifique Malgr la similarit lev e observ e entre les quatre esp ces chaque esp ce a t caract ris e par des marqueurs uniques A l chelle intra sp cifique les marqueurs ISSR ont permis de d tecter un haut niveau de polymorphisme chez L albus L luteus et L cosentinii Des niveaux de similarit s variables ont t r v l s entre les diff rentes populations N anmoins la plus grande similarit a t obtenue entre les populations des esp ces cultiv es L albus et L luteus Le syst me de reproduction autogame et allogame du lupin suppose un flux de g nes entre les populations de la m me esp ce Ainsi l autogamie et l allogamie peut expliquer la similarit entre les accessions loign es g ographiquement Chaque population a t caract ris e par des marqueurs sp cifiques De ce fait ces populations peuvent tre consid r es comme des entit s conserv es 174 R f rences bibliographiques Dans la deuxi me partie de ce travail nous avons essay de contribuer la compr hension du d veloppement des racines proteo des du lupin blanc Deux g nes SCR du lupin appel s cons cutivement LaSCRI et LaSCR2 ont t isol s et caract ris s Ces deux g nes se sont exprim s d s les stades pr coces du d veloppement des racines proteo des L express
208. er N Kevin L W and Taylor C G 2005 Ex vitro composite plants an inexpensive rapid method for root biology Plant J 43 449 457 Consortium The C elegans Sequencing Consortium 1998 Genome sequence of the nematode C elegans a platform for investigating biology Science 282 2012 2018 174 R f rences bibliographiques Cowling W A 1986 Collection of Wild Lupins in Greece Plant Gen Resour Newslet IBPGR FAO 1986 V 65 P 20 22 Cowling W A Buirchell B J and Tapia M E 1998 Lupin Lupinus L Promoting the Conservation and Use of Underutilized and Neglected Crops 23 IPGRI Rome Italy Crane C Wright E Dixon R A and Wang Z Y 2006 Trangenic Medicago truncatula plants obtained from Agrobacterium tumefaciens transformed roots and Agrobacterium rhizogenes transformed hairy roots Planta 223 1344 1354 Cristofolini G 1989 A serological contribution to the systematics of the genus Lupinus Fabaceae Plant Systematic and Evolution 166 265 278 Cui H Levesque M P Vernoux T Jung J W Paquette A J Gallagher K L Wang J Y Blilou I Scheres B Benfey P N 2007 An Evolutionarily Conserved Mechanism Delimiting SHR Movement Defines a Single Layer of Endodermis in Plants SCIENCE VOL 316 20 Deng X W Matsui M Wei N Wagner D Chu A M Feldmann K A amp Quail P H 1992 COPI an Arabidopsis regulatory gene encodes a protein with both a zinc binding motif and a Gb homolo
209. ermis de r pondre plusieurs questions sur les m canismes de d veloppement des plantes Vu l importance accord e bien comprendre la biologie des plantes plusieurs projets de recherche se sont focalis s sur les l ments essentiels pour le d veloppement et la croissance des plantes On cite le phosphate comme tant le second l ment limitant de la croissance des plantes apr s l azote Le phosphate est utilis par les plantes sous la forme de Pi qui est immobile et in galement r parti dans le sol On reconnait plus de 30 des terres arables du monde qui n cessitent l apport d engrais phosphat s pour les cultures Vance 2003 Ces engrais constituent des ressources non renouvelables qui sont entrain de devenir moins disponibles et plus co teuses Quelques scientifiques estiment que les r serves naturelles en Phosphate seront facilement puis es d ici 2060 Steen 1997 Vance 2001 Vance 2003 Paradoxalement une partie du phosphate appliqu pour les syst mes de cultures intensives contribue la pollution des eaux souterraines et de l environnement marin Ainsi la ma trise de l am lioration de l acquisition et de l utilisation du phosphate par les plantes est critique pour une production de cultures saines respectant l environnement Dans la premi re partie de nos travaux de recherche nous avons approch les relations inter et intra sp cifiques de quatre esp ces de lupin marocains L albus L cos
210. es remerciements les plus sinc res s adressent au pr sident du jury et Doyen de la Facult des Sciences Pr Wail BENJELLOUN de m avoir fait l honneur de pr sider ce jury malgr tout ses engagements Je remercie Dr Gilles BENA d avoir gentiment accepter de lire ma th se et aussi de faire partie du jury Je le remercie particuli rement pour sa bonne humeur son nergie et enthousiasme qu il apporte a l quipe LMBM LMI Je lui souhaite un bon courage dans sa mission J exprime tous mes remerciements au Pr Said AMZAZI mon ancien professeur de biochimie et vice doyen de la facult des Science de Rabat d avoir accept de faire partie du jury de cette th se Mes profonds remerciements au professeur Cherkaoui El MODAFAR de la facult des sciences et techniques de Marrakech pour avoir aimablement accept de lire mon manuscrit et aussi de se d placer volontierement pour juger ce travail Mes profonds remerciements vont aussi au Dr Claudine FRANCHE directeur de recherche l institut de recherche pour le d veloppement IRD France d avoir bien voulu consacrer de son temps pour lire ma th se et critiquer le travail De l autre bout de la terre je voudrais aussi remercier l ensemble des personnes ayant tr s largement particip la r alisation du projet SCARECROW Susann MILLER Bruna BUCCIARELLI Kelly ZINN et Jun LIU Je les remercie pour la passion et l nergie qui nous ont anim s et unis au fils des d couverte
211. eul oligonucl otide d une dizaine de bases qui permet d amplifier par PCR un ou plusieurs segments d ADN de l chantillon Chaque bande de Pamplifi t correspond l existence sur chacun des brins d ADN d un motif compl mentaire Pamorce Sur le plan g n tique la technique RAPD ne fournit pas de marqueurs sp cifiques de locus elle r v le conjointement plusieurs locus qui ne sont pas n cessairement conserv s lorsqu on change de fond g n tique En effet cette technique permet de r v ler un polymorphisme de pr sence absence Ainsi pour un locus donn il y a ou il n y a pas d amplification du fragment La technique RAPD jouit d une grande popularit aupr s des g n ticiens dans le domaine v g tal En effet cette technique se caract rise par rapport a d autres techniques Mini satellites SSR RFLP AFLP etc par sa grande simplicit rapidit de manipulation et n cessit d une faible quantit d ADN n anmoins les RAPD pr sentent l inconv nient d tre faiblement reproductibles De plus les marqueurs RAPD permettent de g n rer un taux lev de polymorphisme qui a t largement utilis chez les populations Chalmers ef al 1992 et esp ces comme le haricot le pois et le pois chiche Nesbitt er al 1995 Weder 2002 Ces marqueurs ont aussi contribu chez les plantes la construction de plusieurs cartes g n tiques Reiter et al 1992 l identification des cultivars Nybom
212. eur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 253 ISSR FL6 358 pb 0 162 0 007 295 ISSR FL8 369 pb 0 362 0 058 254 ISSR FL6 339 pb 0 046 0 971 296 ISSR FL8 323 pb 0 086 0 394 255 ISSR FL6 304 pb 0 431 0 873 297 ISSR FL8 297 pb 0 124 0 044 256 ISSR FL6 265 pb 0 586 0 150 298 ISSR FL8 281 pb 0 014 0 003 257 ISSR FL6 264 pb 0 457 0 564 299 ISSR FL8 256 pb 0 363 0 023 258 ISSR FL6 197 pb 0 144 0 000 300 ISSR FL8 232 pb 0 457 0 564 259 ISSR FL6 182 pb 1 051 0 174 301 ISSR FL8 209 pb 0 957 0 004 260 ISSR FL6 109 pb 0 069 0 034 302 ISSR FL8 187 pb 0 384 0 076 261 ISSR FL6 107 pb 0 010 0 240 303 ISSR FL8 173 pb 0 083 0 281 262 ISSR FL7 638 pb 0 118 0 021 304 ISSR FL8 163 pb 0 421 0 856 263 ISSR FL7 535 pb 0 006 0 031 305 ISSR FL8 151 pb 0 424 0 050 264 ISSR FL7 454 pb 0 602 0 283 306 ISSR FL8 151 pb 0 076 0 098 265 ISSR FL7 419 pb 0 553 0 042 307 ISSR FL8 134 pb 0 004 0 284 266 ISSR FL7 383 pb 0 383 0 790 308 ISSR FL9 1613 pb 0 008 0 500 267 ISSR FL7 353 pb 0 005 0 553 309 ISSR FL9 1449 pb 0 008 0 500 268 ISSR FL7 340 pb 0 000 0 003 310 ISSR FL9 1449 pb 0 057 0 298 269 ISSR FL7 302 pb 0 176 0 002 311 ISSR FL9 1355 pb 0 001 0 150 270 ISSR FL7 302 pb 0 489 0 402 312 ISSR FL9 919 pb 0 424 0 050 271 ISSR FL7 277 pb 0 378 0 136 313 ISSR FL9 778 pb 0 362 0 058 272 ISSR FL7 234 pb 0 080 0 232 314 ISSR FL9 639 pb 0 091 0 051 273 ISSR FL7 219 pb 0 091 0 066 315 ISSR FL9 551 pb 0 378 0 136 274 ISSR FL
213. extraction de ADN partir de 200 mg de feuilles fraiches bien d coup es Le mat riel v g tal est bien broy dans 700 ul de tampon d extraction 50 mM Tris pH 8 0 3 mM EDTA pH 8 0 300 mM Mannitol 0 1 d albumine de serum bovin 1 de poly thylene glycol et 0 028 de f mercapto thanol On rajoute 300 ul du tampon d extraction et on broie nouveau pendant 5 mn On transfert l homog nat dans un tube eppendorff de 2 ml contenant 800 ul de ph nol chloroforme 100 ul de SDS 20 et 80 ul d ac tate de sodium 3M On homog n ise le m lange par de simples inversions pendant 5 mn et temp rature ambiante Ensuite on incube le tout 58 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit 60 C pendant 5 mn en assurant des agitations interm diaires On laisse les tubes refroidir dans la glace avant de centrifuger 5600 g pendant 10 mn temp rature ambiante Au surnageant r cup r on ajoute le m me volume d isopropanol pr refroidi 20 C et on maintient les tubes dans la glace pendant 2 heures Un culot est r cup r apr s une centrifugation 5600g pendant 10 mn le culot est lav avec de l thanol 70 s ch et suspendu dans 50 ul de TE La v rification de la qualit de l ADN par lectrophor se r v le une bande intense et bien claire significative d un ADN de bonne qualit Figure IL 2 La qualit de l ADN a t confirm e par mesure de la densit optique 260 nm et 2
214. ff Le m lange est incub dans la glace pendant 5 mn avant d ajouter 800ul de ph nol chloroforme alcool isoamilique 25 24 1 On fait agiter les tubes pendant 20 mn temp rature ambiante Apr s une tape de centrifugation 10000g pendant 3 5 mn on r cup re le surnageant et on le maintient dans la glace On ajoute au surnageant r cup r 500 ul d isopropanol pr refroidi 20 C et on m lange par inversions des tubes On incube le m lange a 20 C pendant 30 mn Ensuite on centrifuge a 12000 g pendant 10 mn et le culot r cup r est lav 2 fois avec 100 ul d thanol 70 pr refroidi Le culot est ensuite bien s ch et suspendu dans 50 ul de TE Tris EDTA Cet ADN r cup r est quantifi par spectrophotom trie 260 nm et 280 nm Pour v rifier la qualit de ADN extrait nous avons fait migrer par lectrophor se diff rents volumes de cet ADN sur gel d Agarose 0 8 Apr s r v lation du gel aucune bande n a t 56 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit d ADN Figure II 2 Gel d agarose montrant l ADN extrait selon le protocole de BERNATSKY et TANKSLEY 1 2 3 et 4 et le protocole de B OUENZAR 5 et 6 57 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit d tect e Aussi la quantification de l ADN par spectrophotom trie 260 nm n a pas donn de signal Suite ces r sultats nous avons du apporter quelques modifications au protocole d extraction
215. gous domain Cell 71 791 801 Derelle E Ferraz C Rombauts S ef al August 2006 Genome analysis of the smallest free living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features Proc Natl Acad Sci U S A 103 31 11647 52 Di Laurenzio L Wysocka Diller J Malamy J E Pysh L Helariutta Y Freshour G Hahn M G Feldmann K A and Benfey P N 1996 The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root Cell 86 423 33 Dinkelaker B Hengeler C Marschner H 1995 Distribution and function of proteoid roots and other root clusters Bot Acta 108 183 200 Dinkelaker B Romheld V Marschner H 1989 Citric acid excretion and precipitation of calcium citrate in the rhizosphere of white lupin Lupinus albus L Plant Cell Environ 12 285 292 Dunn D B et Gillett J 1966 Lupines of Canada and Alaska Queen s Press Ottawa Canada Dunn D B 1971 A case of long range dispersal and rapid speciation in Lupinus Transactions of the Missouri Academy of Science 5 26 38 175 R f rences bibliographiques Dunn D B 1984 Cytotaxonomy and distribution of the New World lupin species Proceedings of the Third International Lupin Conference June 4 8 67 85 La Rochelle France Endre G Kereszt A Kevei Z Mihacea S Kalo P and Kiss G B 2002 A receptor kinase gene regulating symbiotic nodule
216. he ee ee Se MTT IPDNFPPDES MH ko gk OCOHK P P ATAPDTTREKK NEA we TNTAEALY ER TSAOR We ae de We ee FTAINOQATOFA dede ve ee de ee we we ZTGKRLSDFA he he she AT ke she she he de ke he she he le he ke she de de ae LYDVTGSDTN TLWLLORLS P he she he she he he ae de de de de de de de se A Me ke he he he ke ke FT e de de de de de ee VEAIHYYSAL ee eee ee ve de de de de ee we we FOOCGFRGIS Ta Ww ee ve we ae we Messe PTSAITHHHN T p pes FDSLGSSYGE ESEER Elo We he he he he CE eh er she he de del CELLIER LLLLLL SAW LSGNAATOAS LLLGMFPSEG YTLVEDNGIL KLGWKDLCLL TASAWRPPFH he he he he he he dde he he he Lee he ke le ee QLLSREIRNV THSQOKLOHSH ee D 4 QU dede de SNNRGPPPPP SLPPAVERTT he he he she she she sde she she she HISQROOODO N I Tee eee NNN S2AATA Se de Se NT ee D SSSSSASPTV DNTSAAPNND Wee eT ee eT DPS ss GZAZPLVMNO Se de he Te eae SGQORKMVRKR GKY eee de he PPPLY 4 e SENNNDYHYK ee de de oy ee de SNPD NNS NOLTSPAVCG he she he she de he she de he de pLs WIDGILKDLI he he she he he he she sde dde dde V AYIR Y MLSNWVVLPI KEETROORKD de ke 4 MOG 4 XX TER O SEAISARLVS Me h ak e a aa a ke she he Se eee FEREERV H I I E a bodied NKLGLPFEFS he he she she he he oder he he ke Dee de se de she ke ok Ce
217. i re version de s quen age a t annonc e en 2000 et la version compl te a t publi e en Avril 2003 Le s quen age a permis d identifier entre 20000 et 25000 g nes qui sont accessibles pour les tudes biologiques Venter J C ef al 2001 Le n matode Caenorhabditis elegans est le premier organisme pluricellulaire s quenc Il a t publi en 1998 avec toutefois quelques lacunes qui ont t couverte en 2002 Stein et al 1998 En 2003 on annonce la s quence d un n matode apparent le C briggsae Ceci a permis d effectuer une tude de g nomique comparative entre les deux esp ces de n matodes Stein L D et al 2003 Chez les plantes plusieurs esp ces ont t s quen es Tableau I 4 avec Arabidopsis qui est la premi re dont le g nome a t compl tement s quen en d cembre 2000 Le s quen age a 26 Revue bibliographique couvert 115 4 Mb d un g nome de taille totale de 125 Mb The Arabidopsis Genome Initiative 2000 Isoler ADN de Isoler ADN poids mol culaire lev Digestion partielle Fragmentation Pr paration d une banque BAC avec de large inserts Cloner les fragments Organiser la banque pour l automatisation Isoler les ADN BAC S quencer les fragments BAC fingerprinting Constituer les contigs t D velopement de MTP ini ss Re se Liaison avec Liaisons EST Minimal tiling Path BAC et s quences cartes physiques Constituer les contigs S quengag
218. ibonucl ique Acide d soxyribonucl ique compl mentaire ADN de transfert Amplified fragment length polymorphism Acide Indol Ac tique Acide ribonucl ique Ribonucl ase Acide ribonucl ique messager Auxin response factor Ad nosine tri phophate Agrobacterium rhizogenese Auxin Bacterial artificial chromosome Bromure d thidium Bovine serum albumi Basic leucine zipper Cleaved amplified polymorphic sequence C tyltrim thylammonium Constitutive photomorphogenic 1 DiM thyl SulfOxide DNA binding with one finger Di thyl pyrocarbonate Digoxyg nine Densit Optique D soxyribonucl ase D oxynucl otides triphosphates Acide Ethyl ne Diamine T traac tique Expressed sequence tag Facteur de transcription Gibb rellines Gibberellin intensive Repressor of gal 3 GAI RGA SCARECROW Gramme milligramme microgramme G ne codant pour la B glucuronidase GUS Heure minute seconde Inter Simple Sequence Repeat Internal transcribed spacer Jour apr s emergence Lupinus albus SCARECROW LB M mM uM m mm cm MAR Mb Kb pb MOPS nptIl NAC n 2n 3n NLS OGM P PBS PCR pH QTL Qsp RAPD RFLP RNAi RNase rpm RT PCR SDS SSR SNP SCR SHR SSC TAE TE UV UNIP USDA V X gluc YPR Luria Bertani Molaire millimolaire micromolaire Metre millim tre centim tre m rist me apical racinaire Millions de paire de base kilo paire de base paire de base Acide 3 N morpholino pr
219. idopsis Genome Initiative 2000 Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana Nature 408 Becker J P Vos M Kuiper F Salamini and M Heun 1995 Combined mapping of AFLP and RFLP markers in barley Mol Gen Genet 249 65 73 Benfey Philip N Linstead Paul J Roberts Keith Schiefelbein John W Hauser Marie Theres and Aeschbacher Roger A 1993 Root development in Arabidopsis four mutants with dramatically altered root morphogenesis Development 119 57 70 Benfey Phylip N 2006 Unraveling the Dynamic Transcriptome The plant cell Vol 18 2101 2111 Benzecri J P 1973 L analyse des donn es Tome 2 L analyse des correspondances Dunod Bernatsky R and Tanksley S 1986 Toward a saturated linkage map in tomato based on isozymes and random C DNA sequences Genetics 112 887 898 Boisson Dernier A Andriankaja A Chabaud M Niebel A Journet E P Barker D and de Carvalho Neibel F 2005 MtENODI gene activation during rhizobial infection and 173 R f rences bibliographiques mycorrhizal arbuscule development requires a common AT rich containing regulatory sequence Mol Plant Microbe Interact 18 1269 76 Bolle C 2004 The role of GRAS proteins in plant signal transduction and development Planta 218 683 692 Bostein D White RL Skolnick M Davis RW 1980 Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms Am J Hum Genet 32 314
220. ifs comme le Mate qui ne s exprime qu au niveau des racines proteoides Les g nes d expression invariable ou marqueurs de m nages ou encore housekeeper genes choisis sont la polyubiquitine et l alphatubuline Ceux ci s expriment au m me degr au niveau des trois organes du lupin analys s les feuilles les racines normales et les racines proteoides Aussi le gene humain myosine est utilis comme marqueur n gatif 117 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Tableau II 1 Liste des tiquettes contigs utilis es dans cette tude Contigs Code ESTs Code NCBI Annotation Contig21 888_F CA410619 DEAD DEAH box helicase N terminal Contig 108 818_F CA410551 E080_F CA410807 Sigma 54 factor interaction region Contig119 889 _F CA410620 783_F CA410518 Myb DNA binding Contig 133 880_F CA410612 619_F CA410347 RNA binding region RNP 1 RNA recognition motif Contig165 37_F CA410119 285_F CA410024 Pathogenesis related transcriptional factor and ERF Contig 197 1021_F CA409485 135_F CA410468 No apical meristem NAM protein Contig254 E702_F CA411403 E732_F CA411433 1402_F CA409847 E647_F CA411349 138_F CA409834 HMG1 2 high mobility group box Contig96 545_F CA411250 1325_F CA409775 Histone core Contig304 411_F CA410149 625_F CA410353 637_F CA410365 365_F CA410107 Pathogenesis related transcrip
221. ion de la diversit Tableau II 7 Liste des marqueurs AFLP g n r s pour chaque amorce utilis e chez les quatre esp ces de lupin Esp ce Amorce Marqueurs Taille des PIC g n r s marqueurs obtenus L albus E ACC M CAG 16 155 07pb 1031pb 0 93 E ACC M CAT 21 158 79pb 1459pb 0 95 E ACC M CTA 23 145 43pb 1014pb 0 95 E ACG M CAC 18 141 19pb 971pb 0 94 E ACG M CAT 21 143 91pb 1047pb 0 95 E ACT M CAC 24 142 07pb 1895pb 0 95 E ACG M CAG 22 150 00pb 861 37pb 0 95 E ACT M CAG 33 141 00pb 1319pb 0 96 E ACT M CAT 31 138 28pb 1690pb 0 98 E AGG M CTC 25 143 81 pb 2157pb 0 96 Total 234 138 28pb 2157pb 0 952 0 0125 L angustifolius E ACC M CAG 29 159 29pb 1163pb 0 96 E ACC M CAT 33 134 26pb 1174pb 0 96 E ACC M CTA 31 136 36pb 1060pb 0 96 E ACG M CAC 25 141 19pb 971pb 0 96 E ACG M CAT 29 146 95pb 1047pb 0 96 E ACT M CAC 19 142 07pb 1460pb 0 95 E ACG M CAG 25 144 26pb 711 48pb 0 95 E ACT M CAG 33 141 00pb 1126pb 0 96 E ACT M CAT 36 138 28pb 1690pb 0 97 E AGG M CTC 17 148 97pb 2709pb 0 94 Total 277 134 26pb 2709pb 0 957 0 0078 L cosentinii E ACC M CAG 32 159 29pb 1163pb 0 96 E ACC M CAT 24 134 26pb 1390pb 0 95 E ACC M CTA 34 136 36pb 1060pb 0 97 E ACG M CAC 25 141 19 pb 971pb 0 96 E ACG M CAT 25 143 91pb
222. ion des LaSCRs a t li e avec le d veloppement des racines proteo des Cette expression s est r v l e ind pendante du niveau en phosphore chez les plantes Les g nes SCR du lupin se sont exprim s de fa on permanente au niveau de l endoderme et du centre quiescent La localisation de l expression a t abord e par une hybridation in situ et par l expression du promoteur g ne rapporteur GUS Enfin nous avons montr que le silen age de l expression du SCR au niveau des racines du Lupinus albus et de Medicago truncatula entraine une r duction remarquable du d veloppement racinaire chez ces deux plantes Plusieurs perspectives de recherches peuvent se d gager des r sultats obtenus dans ce travail de th se Pr ciser la structuration de la diversit des lupins marocains en analysant une collection plus large avec plus d accessions et en incluant l esp ce end mique L atlanticus Utiliser des marqueurs codominants comme les SSR et les SNP Exploiter les marqueurs uniques identifi s pour des approches de recherche de QTL des fins d am lioration g n tique et agronomique Confirmer les r sultats du profilage avec des tests similaires et des exp riences d expression Northern blots RT PCR et qPCR Confirmer les r gions cis r gulatrices identifi es aux niveaux des promoteurs avec des analyses par d l tions Confirmer la fonction du SCR par des tests de surexpression du g ne Etudier la structure e
223. ions of L albus L angustifolius L cosentinii and L luteus The ISSR and AFLP markers were very informative and generated a high level of polymorphism We scored an important similarity values between and within the studies lupine species We also detected some species specific markers The hierarchical clustering of lupine accessions basing on the Dice similarity coefficient shows the grouping of accessions independently of there geographical origin Also we isolated two Lupinus albus SCARECROW SCR genes LaSCRI and LaSCR2 In situ hybridization and gene promoter reporter staining showed LaSCR1 2 transcript accumulation in the endodermis of both normal and cluster roots Expression of LaSCRs was not directly responsive to P status of the plant but was a function of cluster root development Suppression of LaSCRI in transformed roots of lupine and Medicago via RNAi delivered resulted in decreased root mass Our results suggest we have characterized functional orthologs of AtSCR Key words Lupinus diversity AFLP ISSR SCARECROW cluster roots RNAi A C G T ABA Ac tosyringone ADN ADNc ADN T AFLP AIA ARN ARNase ARNm ARF ATP A r Aux BAC BET BSA bZIP CAPS CTAB COP1 DMSO DOF DEPC DIG DO DNAse dNTP EDTA EST FT GAs GAI RGA GRAS 8 mg H GUS h min s ISSR ITS JAE LaSCR ABRAVIATIONS Ad nine cytosine guanidine thymidine Acide abscissique 3 5 Dimethoxy 4 hydroxy acetophenone Acide d soxyr
224. iption initiation factor TFIID subunit 10 Transcription initiation factor TFIID 30 kDa subunit TAF D30 TAFII 30 mTAFII30 partial 7 E761_F CA411462 Histone core E771_F CA411470 Histone H1 H5 E817_F CA411515 GmTC203635_ similar to PIRIT46225 T46225 alpha NAC like protein Arabidopsis thaliana partial 71 E848_F CA411546 TIP49 C terminal Note ND non d pos es dans NCBI III 1 3 Conclusion Les r sultas des macroarrays obtenus dans le present travail montrent qu il existe une liste de g nes interessants qui sont potentiellement impliqu s dans les stress abiotiques tudi s Les macroarrays repr sentent un outil sans pr c dent pour tudier le profilage ou l expression en masse des g nes N anmoins des tests de validation de ces r sultats sont bien entendu n cessaires La validation des r sultats du profilage consiste en l tude de l expression de chaque g ne s paremment et ceci moyennant des tests comme du Northern blot de la RT PCR et de la PCR en temps r el 130 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc III 2 Le g ne SCARECROW chez le lupin blanc Partie 1 Clonage du gene SCARECROW 1 1 Choix d un EST A partir d une banque de facteurs de transcription du lupin nous avons choisi un EST de 1226pb Cet EST a t retenu du fait de sa grande similarit avec une partie du g ne Scarecrow En effet la recherche de
225. ique Le g ne Actine est utilis comme g ne de m nage ou transcrit invariant pour quilibrer la quantit d ARN entre les chantillons L expression du SCR a t v rifi e par une RT PCR en utilisant des amorces sp cifiques du g ne LaSCRI et LaSCR2 Les amorces utilis es LaSCRI F 5 CAA CAC TAG TGT CCC ACA GTA G3 et ZLaSCRI R S GCTGAGAATCTGGAAGATGC 3 ont permis d amplifier un fragment de 500pb du g ne 165 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc LaSCRI et les amorces LaSCR2 F 5 CTCACTCACCTTGGCTTCTCT 3 et LaSCR2 R 5 CTCAACAGTAGCACCGGTACTAG 3 ont permis d amplifier un fragment de 650 pb du g ne LaSCR2 Ces amorces permettent d amplifier des fragments diff rents du fragment du g ne utilis dans la construction du vecteur recombinant d ARNi La figure III 22 montre la sous expression du g ne LaSCRI au niveau de 7 chantillons racines chevelues SCRi obtenus apr s la transformation par la m thode d injection en comparaison avec 8 chantillons t moins Ainsi la transformation du lupin par le vecteur LaSCR ARNi a permis de r duire l expression du g ne LaSCRi au niveau racinaire Le degr d expression de SCR au niveau des plantes SCRi a t corr l avec le degr du ph notype obtenu r duction du nombre taille et masse du syst me racinaire De la m me mani re La figure HI 23 montre la sous expression des deux g nes SCR LaSCRI et LaSCR2 au niveau des chantil
226. ique est limit e l anti atlas et aux pieds de montagne du Haut atlas foothills marocains Des tudes port es auparavant sur des accessions collect es au nord dans les r gions 11 Revue bibliographique de Beni mellal ont r v l que ces plantes pr sentent de larges graines une germination pr coce et rapide et un fleurissement tardif Cowling et al 1998 1 4 Phylog nie du Lupin La grande diversit et la complexit du g nome du genre Lupinus a t sujet plusieurs tudes afin de clarifier en outre l origine de ce genre Des tudes mol culaires et non mol culaires ont permis d laborer deux principales hypoth ses sur l origine des lupins Une hypoth se bas e sur l utilisation des marqueurs mol culaires savoir les ADN nucl aire TS nrDNA et chloroplastique rbcL et trnF prouvent que les genist es contenant les Lupinus dans l ancien monde pr sentent une origine commune et que les esp ces du nouveau monde pr sentent un centre de diversification secondaire du lupin D autres tudes non mol culaires proposent des hypoth ses controvers es pour lesquelles 1 les Lupinus n appartiennent pas aux Genisteae 2 mais d rivent des Thermopsideae famille ancestrale du nord de l Am rique Plitmann 1981 3 les Lupinus sont originaires des Sophoreae primitifs de l Asie Cristofolini 1989 ou bien encore que 4 les Lupinus viennent des Crotalarieae du sud de l Am rique Dunn 1971 La classification hi
227. iques pour le groupe L aG 23 pour le groupe L aGII et 47 du groupe L aGIII o x 8 8 8 8 ee ee ee eee eee ee Alb08 AlbO7 a GI Alb06 Alb05 Alb10 jae Albo4 Alb03 Albo2 77 AlbOI L a GII Figure IL 12 Classification hi rarchique en UPGMA des accessions de Lupinus albus L a GI L albus groupe I L a GII L albus groupe II L a GII L albus groupe III 88 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Biplot axes F1 et F2 38 09 4 e272 3 267 124 119 AJb08 2 11 207 1b0 107 aes e 385 0198 e 5 o 353 og F2 15 06 1 97 2 AIb10 ng 2 A aas 16149 341 6 2948 2 4 138 92 5 4 3 2 1 0 1 2 F1 23 02 Y3 A La D Figure IL 13 Analyse factorielle ACP des populations de L albus sur la base des marqueurs ISSR 11 F1 503 34pb 26 F1 188 77pb 39 F2 738 41pb 42 F2 567 25pb 46 F2 448 75pb 49 F2 365 75pb 52 F2 333 37pb 66 F2 137 65pb 68 F3 1164pb 70 F3 872 30pb 78 F3 478 86pb 80 F3 403 34pb 89 F3 226 10pb 92 F4 2928pb 95 F4 1057pb 97 F4 867 12pb 99 F4 660 93pb 102 F4 584 32pb 103 F4 516 78pb 110 F4 325 34pb 119 FL1 770 80pb 124 FL1 581 54pb 148 FL1 127 09pb 156 FL2 254 50pb 161 FL2 137 90pb 183 FL3 370 25pb 198 FL3 151 62pb 207 FL4 548 49pb 209 FL4 467 29pb 216 FL4 302 73pb 220 FL4 218 83pb 246 FL6 486 90pb 260 FL7 568 35pb 263 FL7 467 24pb 267 FL7 349 68pb 271 FL7 220 1
228. isa sativa Kamiya N et al 2003 Dilaurenzio et al 1996 Pisum sativum Sassa et al 2001 Zea mais Lim J et al 2000 Lim J et al 2005 et Pinus sylvestris Laajanen K et al 2007 Chez A thaliana La mutation de type T DNA au niveau du g ne SCR entra ne l absence de diff renciation du cortex par rapport l endoderme Les cellules souches racinaires du cortex et endoderme connaissent deux types de divisions une division anticlinale et une seconde division periclinale responsables de la formation des deux couches cortex endoderme Figure I 15 La mutation au niveau du g ne SCR s accompagn e par la perte de la division periclinale ce qui engendre des racines avec une seule couche entre le pericycle et l piderme Cette couche pr sente les caract ristiques du cortex et de l endoderme d o le r le du SCR dans la sp cification de l endoderme Le r sultat de cette perte tissulaire se traduit par une tige agravitropique faute des cellules senseurs classiques Le ph notype obtenu se r sume en des plantes avec des racines courtes par rapport aux plantes sauvages Le SCR est donc particuli rement impliqu dans la diff rentiation radiale des tissus au niveau de la tige et de la racine 44 Revue bibliographique Dans le cas d une mutation de type ARNi on obtient aussi des plantes avec des racines courtes comme le cas des mutations T DNA Au niveau tissulaire on observe des racines avec plusieurs couches d en
229. itions d hybridation 10 ug d ADN g nomique totale du lupin est dig r par EcoRI et HindIII pendant toute une nuit 37 C Les ADN dig r s sont soumis a une l ctrophor se sur gel d agarose de 0 8 Le gel est ensuite trait pour d naturer les ADN En premier le gel est trait 10 a 15 min dans une solution de HCL 0 25M Ensuite les ADN sont trait s en placant le gel pendant 30min dans un bain de NaOH 0 5 N et de NaCl 1M Le gel est ensuite neutralis pendant 30 min dans du Tris HCl 1 5M PH 7 4 et NaCl 3M Les ADN sont ensuite transf r s sur une membrane Immobilon NY Millipore Bedford MA USA Le transfert est assur pendant toute une nuit dans le tampon SSC10X La membrane est ensuite s ch e et fix e par rayons ultra violets UV Hybridation Les membranes du southern blot sont pr hybrid es dans le tampon d hybridation pendant 1 heure 42C L hybridation se fait dans le tampon d hybridation additionn de sonde radioactive raison de 1 million cpm par ml de tampon Cette tape est r alis e pendant toute une nuit 42 C Rin age Les membranes sont soumises trois lavages successifs de 20 min chaque et 42 C Lavage 1 SSC 2X SDS 0 1 Lavage 2 SSC 0 5X SDS 0 1 Lavage 3 SSC 0 1X SDS 0 1 Les membranes sont ensuite bien couvertes dans du plastique et expos es a un film radioactif pendant un minimum de 24h Tampon d hybridation Formamide Naj HPO 1M PH 7 2 NaCl 4M
230. ix dimerisation region bHLH 679_F CA411184 Pathogenesis related transcriptional factor and ERF 719_F CA411191 Transcription factor ITA alpha beta subunit 756_F CA411197 Tubby 811_F CA411207 Ribonuclease CAF 1 842_F CA411208 KNOX1 875_F CA411484 HhH GPD 882_F CA410614 UniRef100_Q5VRX5 WRKY transcription factor 6 like Oryza sativa 90_F CA410642 Tubby 931 F CA410651 pfam_SRP19_SRP19 protein 93_F CA410673 UniRef100_Q9FNVI Somatic embryogenesis related protein Dactylis glomerata 120 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Tableau II 2 suite Liste des tiquettes singletons Code Code NCBI Description EST 942_F CA410676 Eukaryotic transcription factor DNA binding 993_F CA410723 UniRef100_Q9ZQ70 Probable WRKY transcription factor 3 Arabidopsis thaliana E063_F CA410792 MtTC96597_homologue to UPIQ6YBV9 Q6YB V9 Cryptochrome 1 apoprotein partial 50 E087_F CA410814 Homeobox E092_F CA410819 Zinc finger Dof type E135_F CA410860 Myb DNA binding E272_F CA410990 Histone H2B E333_F CA411045 GmTC205053_homologue to UPIQ8L5W2 Q8L5W2 BZIP transcription factor ATB2 partial 89 E368_F CA411079 Transcription factor jumonji aspartyl beta hydroxylase E385_F CA411094 Unikef100_Q3AFJ1_TPR domain protein Carboxydo E392 F CA411099 pfam_BTB_BTB POZ domain E3
231. ker et al 1995 Qi et al 1998 Shan et al 1999 le riz Mackill et al 1996 Maheswaran et al 1997 le soja Maughan et al 1996 Powell et al 1996 etc Les marqueurs AFLP ont contribu l tude de la diversit g n tique chez huit esp ces du genre Lupinus Ces marqueurs ont permis de r v ler quatre fois plus de polymorphisme que les marqueurs RAPD et ISSR et aussi de s parer les esp ces du nouveau monde et ceux de l ancien monde Talhinhas ef al 2003 Cette classification a t diff rente de celle obtenue par les marqueurs ITS Ainouche et al 2004 voir paragraphe I 4 Les marqueurs AFLP ont t aussi utilis s dans l tude de la relation phylog n tique entre deux esp ces de lupin L luteus et L cosentinii et les r sultats obtenus sugg rent que cette technique est tr s efficace pour la caract risation du germplasme du Lupin Qiu et al 1995 17 1 5 Les marqueurs Microsatellites ou SSR Les microsatellites ou s quences simples r p t es SSR sont des locus polymorphes constitu s de s quences r p t es en tandem 1 6 bp La variation du nombre de r p titions du motif de base constitue la base du polymorphisme Les SSR sont ubiquitaires chez les procaryotes et les eucaryotes et sont pr sents m me dans les g nomes bact riens les plus petits Field and wills 1996 Hancock 1996 Les microsatellites peuvent tre pr sents au niveau des s quences non codantes et aussi codantes La technique
232. l 68 1425_F CA409868 MtTC94757_similar to UPIQ43457 Q43457 Heat shock transcription factor 34 partial 86 147_F CA410642 GmTC217902_similar to UPIQ8S490 Q8S490 Transcription factor RAUI Fragment partial 69 160_F CA410651 Heat shock factor HSF type DNA binding 176_F CA410673 MtTC107060_similar to UPIQ69QY4 Q69QY4 ARF GAP like zinc finger containing protein like partial 51 204_F CA410676 StTC119999_similar to GBIAAM60832 11215365001AY084233 DNA binding WRKY like protein Arabidopsis thaliana partial 44 212_F CA410723 No apical meristem NAM protein 281_F CA410792 MtTC111111_similar to UPISUV1_ARATH Q9FF80 Histone lysine N methyltransferase H3 lysine 9 specific 1 Histone H3 K9 methyltransferase 1 H3 K9 HMTase 1 Suppressor of variegation 3 9 homolog 1 Su var 3 9 homolog 1 partial 7 325_F CA410814 UniRef100_Q9SK33 Probable WRKY transcription factor 60 Arabidopsis thaliana 368_F CA410819 SBP 369_F CA410860 Ribonuclease CAF 1 389_F CA410990 Myb DNA binding 407_F CA411045 Tubby 445_F CA411079 UniRef100_Q94705 DNA topoisomerase I Physarum polycephalum 493_F CA411094 Transcription factor MADS box 521_F CA411099 Transcription factor MADS box 523_F CA411104 UniRef100_Q8RYD6 Basic leucine zipper transcription factor Arabidopsis thaliana 524_F CA411106 Pathogenesis related transcriptional factor and ERF 526_F CA411170 Pathogenesis related transcriptional factor and ERF 558_F CA411179 Basic helix loop hel
233. l _ EREE E reren 144 2 1 1 Culture des plantes syst me hydroponique see ee ee eeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeees 144 2 12 Extraction de FARN 2 ect ht tenant oceans en DAS nt nn een 145 2 1 3 Pr paration des ADN compl mentaires ccccececeeeee eee tees eee teeta ee eneenees 145 2 2 Effet du stress phosphorique sur le profil d expression de LaSCR1 et LaSCR2 146 2 2 1 Mesure de l expression par PCR RT PCR see ceeeececeeeeeeeeeee eee eeeeeeeeeeeeeeaees 146 2 2 2 Mesure de l expression par la PCR en temps r el Q PCR 147 2 3 CONCIUSION 8 RS EN ERNST nr vl eee nn Re en PR Teener 148 Partie 3 Expression tissulaire de LaSCR1 et LaSCR2 au niveau des racines de Lupinus albus et de Medicago truncatula 3 1 Le promoteur pLaSCR2 dirige l expression du g ne LaSCR2 149 3 1 1 Promoteurs LaSCR1 et LaSCR2 iii 149 3 1 1a Caract risation des l ments r gulateurs des promoteurs de LaSCR1 et LaSCR2 149 3 1 1b Clonage du promoteur LaSCR2 en amont du g ne rapporteur GUS aseeseen 152 3 1 2 Pr paration de inoculum bact rien Agrobacterium rhizogenes 153 3 1 3 Test histochimique de l activit b glucuronidase GUS ss 154 3 1 3 1 Activit du pLaSCR2 GUS au niveau des racines transg nique du lupin blanc 154 3 1 3 1 a Pr paration et transformation des plantes par injection
234. lation de Rabat Cos14 Le groupe L c GII 3 qui regroupe cinq populations de la r gion de Rabat Cos01 Cos02 Cos03 Cos04 et Cos05 et une population de K nitra Cos06 A un pourcentage de similarit plus faible 38 on d finit deux clusters bien distincts L c GI et L c GIL Le cluster I regroupe en plus de l accession Cos15 de Kenitra les accessions appartenant la r gion allant de Rabat hay Menzeh vers Mohammedia Cos16 Cos17 Cos18 Cos19 Cos20 Cos21 Cos22 et Cos23 97 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit g g g 2 8 8 5 Cosl6 Cosl5 ic Cos17 Cos18 P Cos19 GI Cos23 Cos20 pie Cos22 Cos21 Cosi0 Cos09 Cos08 o Gui pm Cos07 Cos12 Cosl4 ie hE Cos13 me Cos02 Cos01 Cos03 Cos06 Cos05 Cos04 Figure IL 16 Dendrogramme obtenu avec le coefficient de Dice sur la base des r sultats ISSR obtenu pour les 22 accessions de L cosentinii 98 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Le cluster II comprend des accessions en provenance de la zone T mara ceinture verte vers Kenitra Cos01 Cosl1 et Cos14 On a aussi deux accessions qui sortent de cette ligne d chantillonnage Cos12 et Cos13 On remarque le chevauchement des deux groupes au niveau des accessions appartenant la r gion de T mara hay Menzeh Ceci pourrait supposer que cette zone est un lieu d change et de flux g nique entre les deux zones I et II Les cinq groupes d finis L c GI 1 L
235. le g ne rapporteur GUS au niveau des racines normales du lupin blanc Expression de LaSCR2 d tect e au niveau de l endoderme des racines normale en coupe transversale a et longitudinale b c Racine t moin 156 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Figure III 16 Localisation de l expression de LaSCR2 a diff rents stades de d veloppement des racines proteoides a Localisation du transcrit de LaSCR2 au niveau des primordia des proteoides b Coloration bleue de GUS au niveau des radicelles en d veloppement travers le cortex c Coupe longitudinale montrant la localisation du transcrit de LaSCR2 au niveau de l endoderme et des initiales des proteoides d e et f Racines proteoides en d veloppement et matitres La coloration bleue est visible au niveau de l endoderme et travers le centre quiescent des proteoides non totalement d velopp es 157 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 3 1 3 2 Activit du pLaSCR2 GUS au niveau des racines transg niques de Medicago truncatula Le promoteur de SCR du lupin a t utilis pour analyser l expression du SCR chez Medicago truncatula Medicago se pr te ais ment a la transformation avec des g nes du lupin 3 1 3 2 a Pr paration et transformation des plantes par trempage La surface des graines de M truncatula a t st rilis e avec de I acide sulfurique absolu pendant 6 min et rin
236. leurs caract ristiques structurales Les domaines de fixation d ADN constituent un ensemble de r sidus d acides amin s qui vont int ragir avec 1 les bases d ADN au niveau des l ments cis r gulateurs et qui vont ainsi d terminer la sp cificit de la prot ine ii les ADN de mani re non sp cifique sous forme d une interaction avec le phosphate ou d soxyribose On reconna t ainsi plusieurs familles de facteurs de transcription MADS box helix loop helix MYB finger basic Leu zipper etc D autres facteurs de transcription sont sp cifiques aux plantes APETALA2 EREBP ethylene response element binding protein WRKY proteine caract ris e par la grande conservation de la s quence de l acide amin WRK YGQK NAC no apical meristem cup shaped cotyl don Dof DNA binding with one finger ARF auxin response factor et Aux IAA auxin indole 3 acetic acid proteins Liu et al 1999 dont plusieurs s expriment sp cifiquement au niveau des racines Tableau I 6 et Figure I 13 Chez Arabidopsis thaliana plusieurs facteurs de transcription sont impliqu s dans le d veloppement racinaire normal a savoir la formation des racines lat rales la diff renciation des poils racinaires et la structuration racinaire radiale Figure 13 On reconnait deux facteurs de transcription Scarecrow SCR et Short root SHR qui sont impliqu s dans la structuration radiale et l activit m rist matique au niveau de la pointe racinaire SCR et SHR
237. lis e Figure II 9 Le dendrogramme obtenu illustre une classification probable entre les esp ces analys es de similarit O oO co D 100 L angustifolius L cosentinii L albus L luteus Figure II 9 Classification en UPGMA des quatre esp ces de lupin sur la base des marqueurs AFLP 80 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Biplot axes F1 et F2 48 54 2 ell r 1000 1 265 a B L angustifolius a L cosentinii 73 yo 1 e 262 78 273 359 257 116 486 501 e23 360 F2 23 27 0188 391 e a gt e 4 0 o 12 e L albus 37 30 187 ee 156 G 348 e 394 372 371 L luteu Se 213 0 122 17 4 Le 97 185 2 228 oe ee 2 385 435 479 C D 3 4 3 2 1 0 2 3 4 Figure IL 10 Analyse en composante principale ACP des quatre esp ces de lupin sur la base des marqueurs AFLP et sur les deux premiers axes F1 et F2 3 E ACC M CAG 1031pb 4 E ACC M CAG 975pb 8 E ACC M CAG 817 83pb 12 E ACC M CAG 675 75pb 37 E ACC M CAG 251 53pb 73 E ACC M CAT 410 30pb 75 E ACC M CAT 357 63pb 78 E ACC M CAT 325 89pb 80 E AGG M CTC 862 54pb 97 E ACC M CAT 148 37pb 100 E ACC M CAT 138 11pb 112 E ACC M CTA 758 21pb 114 E ACC M CTA 717 92pb 116 E ACC M CTA 664 64pb 130 E ACC M CTA 365 81pb 151 E ACC M CTA 164 52pb 185 E ACG M CAC 310 98pb 187 E ACG M CAC 302 29pb 188 E ACG M CAC 284 87pb 202 E ACG M CAC 156 78pb 213 E
238. ll 1 3 Les marqueurs TSOP see eens det AA NA AE RARES de St NN AA Dan RAS de tan 16 IT 4 Les marqueurs AFLP sets ae e a E EE EEEa 18 I1 1 5 Les marqueurs Microsatellites ou SSR is 20 ll t 6 Les marg e rs SNP ESS Bata e ee RS es aa etn ata Mn en 21 ll xAnal se dela variabilit cent erat date ae ed tah en et dE E eee Ak hahaa te 21 11 2 1 M thodes de classification eee een e enna ene e eee enna e ene anaes 22 ll 2 2 Analyse factorielle LR DCS dr ue rt Meade al 23 lll La g nomique structurale et fonctionnelle m thodes et applications 25 Ill 1 La GEnGMiQue SitUCtUFAle Shea hiomemn notre antennes 25 lil 1 1 Le s quen age syst matique 8 is e eee eee seen enaee 25 IIl 1 2 S quen age d tiquettes de s quences exprim es EST 28 Ill 2 La g nomique fonctionnelle 0 ccccececee cece eee eee eee eee eects ease esse eeee ee 30 lll 2 1 Analyse d AnSCADIOMC curseurs isa sn Meee 31 lll 2 2 Fonction des Ones LS a auauantinas dessa SEA SR tn Re Gas t 32 M DEPE fee transgenders eonia Ne SE A buh ees SA SE 33 E2 222 Mutation d Genes sn an Re en de Rens 34 IIl 2 2 3 Silen age post transcriptionnel ARNi 0ccceceeeeeeeeeeeeeeeeeeecaeeeeeaeeeeeaneeenaanees 35 lll 2 3 R gulation de la Tan SCH HON ss ath sve best raster irara seta tcivad a dee ur as
239. lles sont coup s avec un scalpel et les bouts des radicelles sont tremp s dans la culture d A rhizogenese contenant le vecteur recombinant d int r t pr par Six plantules sont ensuite mises en culture sur des boites claires de 222 X 222 mm Genetix USA Inc Boston MA USA contenant 200 ml d agarose inclin e 0 6 dans la solution Hoagland ou solution nutritive additionn e de Kanamycine 15 mg 1 La kanamycine est utilis e pour s lectionner les racines transg niques Les boites sont ensuite plac es verticalement dans la chambre de culture selon les conditions de temp rature lumi re d crites pr c demment Apr s 3 semaines environ 50 des plantes d veloppent des racines chevelues racines mergeant des points de sections Les plantes seront transf r es sur un milieu fraichement pr par et remises en culture pour 2 semaines de plus Seules les racines chevelues sont collect es et utilis es 3 1 3 1 c Localisation de l expression du promoteur LaSCR2 Les racines normales et proteo des transform es ont t incub es 37 C dans une solution de coloration 5 bromo 4 chloro 3 indolyle glucuronide X gluc annexe II 7 L activit glucuronidase r v l e par la coloration bleue a t observ e apr s 20 minutes d incubation Les racines ont t maintenues dans la solution X gluc pendant 60 min 90 min de plus Les racines bleues ont t transf r es dans une solution d eau pour arr ter la r action de c
240. logistes ont essay l alt ration de l expression des g nes par ARNi chez plusieurs organismes avec diff rents niveaux de succ s Chez C elegans la drosophile et les plantes l ARNi semble tre un moyen sp cifique et efficace pour la g n tique reverse Une autre classe d organismes comprenant le poisson z bre xenopus et la souris semble se pr ter pour DARNI mais avec des limitations Hammond S ef al 2001 Pour l homme l ARNi peut tre un moyen int ressant pour la lutte contre certains maladies 37 Revue bibliographique TII 2 3 R gulation de la transcription Chez les animaux comme chez les plantes la r gulation transcriptionelle joue un r le important dans leur d veloppement Les g nes s expriment de fa on pr f rentielle dans le temps diff rents stades de d veloppement ou en r ponse au stimulus ainsi que dans l espace pour un tissu donn Cette expression est li e des prot ines particuli res ou facteurs de transcription dont le r le est de stimuler ou inhiber l expression IIL 2 3 1 Les facteurs de transcription FT classification et importance Au niveau des plantes certains g nes s expriment de mani re constitutive alors que d autres g nes r pondent a des stimulations particuli res Ces deux sch mas d expression des g nes d pendent essentiellement de l int raction des facteurs de transcription avec des cis l ments et ou autres facteurs de transcription n cessaires pour l expression de g
241. lons racines chevelues SCRi obtenu apr s la transformation par la m thode de trempage racinaire Au niveau des chantillons SCRi on note diff rents degr s d expression des deux g nes SCR On remarque que l expression des deux g nes LaSCRI et LaSCR2 au niveau des chantillons SCRi3 SCRi4 et SCRi5 est nulle et correspond un silen age total de SCR Par contre l expression des deux g nes SCR au niveau des chantillons SCRil et SCRi2 est moyenne en comparaison avec celle au niveau des plantes t moins Par ailleurs la sous expression de LaSCRI et de LaSCR2 au niveau des chantillons SCRil SCRi5 traduit le silen age du SCR au niveau de ces chantillons Le fragment de LaSCRI utilis dans P ARNi a permis de silencer les deux g nes LaSCRI et LaSCR2 166 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Figure IIL 20 Ph notype des plantes LaSCR ARNi et Myo ARNi t moin du lupin obtenues par la m thode de transformation par immersion racinaire a b ie i a Q 8 2 3 9 E 2 T moin 3 c T D Q 3 a Q v T moin Figure III 21 Moyennes du nombre longueur et masse des racines transg niques des plantes ARNi du lupin en comparaison avec les plantes Myo t moins La barre d erreur indique la d viation standard 167 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Lu xO SEEE RE Se ee
242. lupin Mediterranean white lupin Italian lupino Anglais Wild albus lupin Anglais blue lupine narrow leafed lupin Anglais yellow lupin 50 40 52 52 52 Revue bibliographique Tableau I 2 Groupe d esp ces de lupin graines rugueuses avec synonymes botanique noms vernaculaires et nombre de chromosomes Esp ce Synonyme botanique Nom vernaculaire Nombre de chromosomes L cosentinii Guss L digitatus Lojac 32 L varius Caruel L pilosus Murr L pilosus Murr Subsp Cosentinii Guss Rouy et Fouc L pilosus Murr Subsp Digitatus Fiori et paol L digitatus Forsk L tassilicus Maire 36 L pilosus subsp Tassilicus Maire Quezel et Santa L princei Harms L hirsutus L 38 L pilosus Murr L varius L 42 L varius L subsp Orientalis Franco et P Silva L palaestinus Boiss 42 L atlanticus Gladst Lupin d Atlas 38 L somaliensis Baker I 3 Le lupin du Maroc On reconna t six esp ces de lupins au Maroc L albus L luteus L angustifolius L consentinii L pilosus et l esp ce L atlanticus qui est end mique au maroc 1 3 1 Lupinus albus Le lupin blanc ou Lupinus albus est une plante annuelle qui pr sente des feuilles compos es avec cinq sept folioles et pouvant atteindre un m tre de hauteur Les fleurs pouvant tre de couleur blanche rose ou bleu Figure I la Les graines de lupin sont larges circulaires et de couleur blanche
243. lved in adaptation to P stress The Plant Journal 44 840 853 Van Zhong G and Burns J K 2003 Profiling ethylene regulated gene expression in Arabidopsis thaliana by microarray analysis Plant Mol Biol 53 117 131 Vance C P 2001 Symbiotic nitrogen fixation and phosphorus acquisition plant nutrition in a world of declining renewable resources Plant Physiology 127 390 397 Vance C P Uhde Stone C amp Allan D L 2003 Phosphorus acquisition and use critical adaptations by plants for securing a nonrenewable resource New Phytologist 57 423 447 Velculescu VE Zhang L Vogelstein B Kinzler KW 1995 Serial analysis of gene expression Science 270 484 487 Venter J Craig et al 2001 The sequence of the human genome Science vol 291 no 5507 pp 1304 1351 Vos PRH Bleeker M Rejians M de Lee T Hornes et M Freijters A 1995 AFLP a new technique for DNA finger printing Nucleic Acids Res 23 4407 4414 Watson JD et Crick FHC 1953 Molecular structure of nucleic acids Nature 171 737 738 Watt M amp Evans J R 1999 Proteoid roots Physiology and development Plant Physiology 121 317 323 Weder J K P 2002 Influence of experimental conditions on the reproducibility of RAPD PCR identification of legumes and cereals Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 35 233 238 187 R f rences bibliographiques Weisskopf L Fromin N Tomasi N Aragno M amp Martinoia E 2005 Secretion activit
244. macroarrays nous avons analys l expression de 161 tiquettes ESTs expressed sequence tags isol es de racines proteoides en r ponse une carence d azote N de fer Fe ou de phosphore P Parmi les ESTs analys es un clone a t int ressant de part sa grande similarit avec le g ne SCARECROW SCR et de ce fait a t choisi pour une tude plus approfondie Le g ne SCR code pour un facteur de transcription appartenant la famille GRAS Pysh et al 1999 et connu pour son r le important dans la structuration radiale des cellules et dans le maintien des cellules souches Scheres ef al 1995 DiLaurenzio et al 1996 Wysocka Diller et al 2000 Kamiya et al 2003 Sabatini et al 2003 Heidstra et al 2004 Cette th se est pr sent e en trois chapitres Le chapitre I dresse une analyse bibliographique assez d taill e sur le lupin et une introduction au travail r alis Le chapitre II r sume les r sultats du travail men sur la diversit du lupin du Maroc Ce travail a t enti rement r alis au laboratoire de microbiologie et de biologie mol culaire de la facult des sciences Rabat Le chapitre III pr sente le lupin blanc en tant que plante mod le pour l tude du stress phosphorique Ce chapitre focalise sur les r sultats de analyse mol culaire des deux g nes SCR chez le lupin blanc LaSCRI et LaSCR2 Cette partie du travail a t r alis e au d partement d Agronomy and plant Geneti
245. mann amp Martinoia 2002 Vance et al 2003 Lambers et al 2006 En r ponse une carence en phosphore le lupin blanc d veloppe des racines sp ciales appel es racines prot oides Ces racines pr sent es sous forme de radicelles denses sont caract ris es par une croissance d termin e Dinkelaker ef al 1995 Johnson et al 1996 Watt et al 1999 Les racines proteoides d veloppent un m canisme d adaptation sp cial pour I acquisition du phosphore du sol Ainsi les racines proteoides s cr tent des citrates et malates Dinkelaker ef al 1995 Shane amp Lambers 2005 des phosphatases acides Miller et al 2001 Gilbert et al 2000 et des protons Marschner et al 1986 Neumann amp Romheld 1999 Neumann et al 2000 Ces exsudats permettent d augmenter la disponibilit du phosphore dans la rhizosph re Aussi un certain nombre de g nes sont exprim s au niveau des racines proteo des et sont impliqu s dans acquisition du phosphore Uhde Stone et al 2003 Cette partie du travail s inscrit dans le cadre d un projet de recherche visant l tude des g nes impliqu s dans le d veloppement racinaire du lupin en r ponse une carence phosphorique Ce projet a t financ par une bourse Fulbright attribu e par la commission Maroco Am ricaine Introduction g n rale pour les Echanges Educatifs et Culturels un projet USDA NRI projet N 2005 35 100 16007 et USDA ARS Par le biais de filtres ADN
246. marqueur dans l tude de la structuration radiale et la r g n ration du m rist me apical racinaire MAR apr s excision partielle ou totale de la pointe de la racine L expression du SCR a facilit la d finition des diff rentes tapes durant le processus de r g n ration La dynamique et la haute expression du SCR sugg re que ce g ne joue un r le important dans le maintient et l tablissement du profil radiale correct du MAR Lim J et al 2005 Chez le Pin sylvestre SCR joue aussi un r le important dans l tablissement du profil radiale au niveau des racines courtes dichotomiques nouvellement form es Laajanen K ef al 2007 IV Le lupin blanc et les stress abiotiques L un des soucis de l agriculteur aujourd hui est de trouver une solution aux cultures des plantes limit es par des facteurs abiotiques tels que le d ficit hydrique l exc s d eau la toxicit ou la 45 Revue bibliographique pr sence de sels dans le sol Une tape cl pour r soudre le probl me des cultures dans le monde est la compr hension des m canismes de tol rance et d adaptation des plantes dans les diff rentes conditions de stress En effet les populations natives d une r gion quelconque pr sentent des m canismes d adaptation physiologiques et mol culaires aux stress rencontr s Les premier travaux sur l adaptation des plantes au stress environnemental ont t initi s par le Professeur Tony Bradshaw FRS en 1960 et depuis
247. mbre de ces marqueurs est variable d une esp ce une autre Chez L albus des 76 marqueurs g n r s 17 22 3 ont t sp cifiques avec une moyenne de 1 5 marqueurs sp cifiques par amorce Chez L angustifolius des 74 marqueurs obtenus 24 32 4 se sont r v l s sp cifiques pour cette esp ce avec en moyenne 2 18 marqueurs sp cifiques par amorce Chez L cosentinii des 93 marqueurs obtenus 34 36 5 ont t sp cifiques cette esp ce avec une moyenne de 3 09 marqueurs par amorce utilis e Chez L luteus des 67 marqueurs obtenus 11 16 4 ont t sp cifiques pour cette esp ce avec une moyenne de un marqueur sp cifique par amorce La diversit des quatre esp ces de lupin r v l e par les marqueurs ISSR a t valu e en utilisant l indice de diversit de Nei Iji La plus grande diversit a t observ e chez L cosentinii ij 0 01076 suivi de L angustifolius 0 010747 et de L albus 0 010746 La plus faible diversit a t not e chez L luteus avec 0 1073 comme valeur de l indice de Nei Toutefois on remarque que ces valeurs de diversit sont tr s proches 12 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit IT 2 1 2 a Distances g n tiques Les distances g n tiques ont t calcul es a partir des marqueurs ISSR g n r s en utilisant V indice de Dice et sont repr sent es dans le tableau II 5 On remarque une similarit importante entre les quatre esp ces de lupin La
248. ment for improved global security In H Tiessen ed Phosphorus in the Global Environment Transfers Cycles and Management John Wiley amp Sons New York pp 27 42 Sabatini S Heidstra R Wildwater M Scheres B 2003 SCARECROW is involved in positioning the stem cell niche in the Arabidopsis root meristem Genes and Development 17 354 358 Sanger F Air GM Barrell BG Brown NL Coulson AR Fiddes CA Hutchison CA Slocombe PM Smith M 1977 Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA Nature 24 265 5596 687 95 Sassa N Matsushita Y Nakamura T Nyunoya H 2001 The molecular characterization and in situ expression pattern of pea SCARECROW gene Plant and Cell Physiology 42 385 394 Sato N Ohshima K Watanabe A Ohta N Nishiyama Y Joyard J amp Douce R 1998 Molecular characterization of the PEND protein a novel bZIP protein present in the envelope membrane that is the site of nucleoid replication in developing plastids Plant Cell 10 8594872 Schena M Shalon D Davis R W and Brown P O 1995 Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray Science 270 467 470 185 R f rences bibliographiques Scheres B Di Laurenzio L Willemsen V Hauser M T Janmaat K Weisbeek P amp Benfey P N 1995 Mutations affecting the radial organization of the Arabidopsis root display specific effects throughout the embryonic axis Development 121 53 62
249. ments polymorphes Chez L albus 76 bandes ont t engendr es avec 6 33 bandes par amorce Le nombre de fragments varie de 5 FL1 8 F1 F2 FL4 et FL6 La taille de ces fragments varie entre 110 28pb et 1126pb Tableau II 4 Chez L angustifolius 74 bandes ont t d tect es avec 6 16 bandes par amorce ISSR utilis Le nombre des bandes varie de 5 F2 8 F1 et FL5 La taille des bandes observ es varie entre 51 95 pb et 873 35 pb Tableau II 4 Chez L cosentinii 93 bandes ont t obtenues moyennant les marqueurs ISSR avec comme moyenne 7 75 bandes par amorce Le nombre de bandes varie de 5 F2 et FL1 10 FL3 et FLA La taille des fragments g n r s oscille entre 110 28 pb et 817 44 pb Tableau IL 4 Chez L luteus 67 bandes ont t g n r es par les marqueurs ISSR avec une moyenne de 5 58 bandes par amorce Le nombre de bandes varie entre 4 F2 FL1 et FL4 et 8 F1 et FL6 La taille des bandes obtenues varie entre 110 28 pb et 775 85 pb Tableau IL 4 70 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau II 4 Liste des amorces ISSR utilis es dans l tude inter sp cifique des quatre esp ces de lupin les marqueurs g n r s pour chaque amorce ISSR et la taille des marqueurs engendr s Esp ce Amorce Marqueurs Taille des bandes PIC marqueurs g n r s obtenues sp cifi
250. ml de 10 de SDS et 10 ml de ph nol Homog n iser le m lange pendant 5 10 minutes Ajouter 10 ml de Chloroforme alcool isoamylic l homog nat et m langer pendant 5 10 minutes Centrifuger pendant 10 min a 10000g Au surnageant r cup r ajouter 5 ml de ph nol 5 ml de chloroforme alcool isoamylic 24 1 et m langer pendant 5 10 min Centrifuger pendant 10 min 10000g Au surnageant r cup r ajouter 10 ml de chloroforme alcool isoamylic et m langer pendant 5 10 min Centrifuger pendant 10 min 10000g Au surnageant r cup r ajouter le 1 3 du volume de LiCl 8 M M langer et incuber 4 C toute une nuit Centrifuger pendant 30 min 8000g Laver le culot r cup r avec 3 ml of LiCl 2 M ensuite 2 fois avec de 70 l thanol froid S cher le culot sous vide Suspender les ARN dans de l eau DEPEC Conserver les ARN 70 C Les ARN sont trait s la DNAase avant de les utiliser dans les PCR quantitatives La quantit des ARN est calcul e suite au dosage par spectrophotom tre 260 et 280 nm La qualit des ARN est valu e sur un gel d agarose formamide d naturant 221 Annexes Annexe III 2 Expression des facteurs de transcriptions en r ponse au diff rents stress analys s ee ee ee G nes 0180 0 163 0 810 0 658 2ISO8 0 232 1 834 0 150 1 547 1 590 Yer 001 611 084 15576 use 045 ous on20 on97 op 1 77 moe 1 405 1 314 1
251. n Conservation et Valorisation des Ressources G n tiques de l Institut National de la Recherche Agronomique de Rabat dans le cadre du projet PROTARS I PST2 13 L un des objectifs de ce programme tant la gestion des ressources g n tiques du lupin au Maroc visant leur conservation et utilisation durable La caract risation de la diversit g n tique du lupin par le biais des outils mol culaires contribuera d une part l tude fondamentale de la variabilit g n tique et de la structure de la diversit de cette ressource phytog n tique et d autre part l laboration d une m thodologie de conservation in situ et ex situ Introduction g n rale Dans le cadre de ce travail les marqueurs ISSR Inter Simple Sequence Repeat et AFLP Amplified Fragment Lenght Polymorphism ont t utilis s pour l valuation de la diversit g n tique inter et intra sp cifique de quatre esp ces de lupin marocains L albus L cosentinii L luteus et L angustifolius Allemagne 110 000 Chili 37 000t France 27 000t Pologne 21 000t Afrique du Sud 17 400t Russie 16 000t Maroc 14 000t Se P rou 10 000 Espagne 300t Egypte 4 000t Australie 1 210 000 Figure 1 Les Productions mondiales du Lupin en tonnes Source UNIP 2001 D un autre c t nous nous sommes int ress s au le lupin blanc L albus en tant que plante mod le pour tudier l adaptation des plantes aux carences phosphoriques Neu
252. n Par ailleurs et exception du groupe II L I GIT les autres groupes ont t caract ris s par un certain nombre de marqueurs uniques Ainsi on retrouve 80 marqueurs ISSR sp cifiques au groupe L l GI et 30 au groupe L I GIIT 108 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau II 27 Information diversit et Marqueurs ISSR uniques des sous groupes de L luteus Groupes Accessions Marqueurs Diversit Marqueurs sp cifiques L I GI Lut05 Lut06 Lut07 450 0 004686 F1 556 09pb F1 534 33pb F1 425 78pb F1 343 48pb F1 224 01pb F1 123 27pb F2 791 20pb F2 546 30pb F2 346 99pb F2 166 18pb FL1 791 77pb FL1 298 59pb FL1 254 35pb FL1 227 14pb FL2 524 04pb FL2 388 42pb FL2 307 07pb FL2 213 50pb FL2 153 28pb FL3 489 67pb FL3 362 23pb FL3 285 82pb FL4 1703pb FL4 1236pb FL4 936pb FL4 759 31pb FL4 559 54pb FL4 523 03pb FL4 153 38pb FL5 1334pb FL5 1178pb FL5 907pb FL5 885 30pb FL5 532 68pb FL5 450 76pb FL5 410 86pb FL5 351 32pb FL6 582 05pb FL6 555 26pb FL6 496 40pb FL7 126 70pb FL7 117 22pb FL10 542 60pb FL10 182 14 FL10 155 11pb FL11 572 65pb FL8 1406pb FL8 787 44pb FL8 678 73pb FL8 576 22pb FL8 549 16pb FL8 437 70pb FL8 173 48pb FL8 133 83pb FL9 1613pb FL9 1449pb FL9 551 03pb FL9 457 95pb FL9 337 19pb FL9 206 52pb FL9 142 52pb FL9 125 98pb FL10 1112pb FL10 319 13pb FL10 296 27pb FL10 249 44pb FL11 987pb FL11 869 11pb FL11 760 41
253. n e des ARN sens et anti sens entra ne des r sultats 10 fois plus efficaces que l introduction de l un ou de T autre s par ment Ces travaux ont permis d expliquer les r sultats obtenus pour le p tunia La couleur blanche de la fleur obtenue a t due l inhibition transcriptionnelle de l activit de la chalcone synthase Le processus de ARNi est 35 Revue bibliographique initi par enzyme Dicer qui est une endoribonucl ase de la famille des ARNaselIT qui dig re les mol cules d ARN double brin en petits fragments de 21 26 paires de bases appell s ARNsi small interfering ARN L un des brins de chaque fragment dig r joue le r le du brin guide et sera incorpor au niveau d un complexe appell RISC RNA induced silencing complex a D gradation par ARNsi Formation DICER RISC ARNsi AN WNINININININI gt gt gt ARNdb YAS NN SININ b Reconnaissance ARNm D gradation AAAAA IN AN AV Figure 1 12 Sch ma montrant les deux tapes du m canisme d ARNi a Une tape d initiation de ARNi avec la d gradation des ARN doubles brins en fragments de 21 26 pb ou ARNsi et l incorporation du brin guide dans le complexe RISC b le complexe RISC va reconnaitre et d truire les ARNm 36 Revue bibliographique Le brin guide sera utilis comme sonde pour d tecter et sapparier avec toute s quence compl mentaire et assurer sa d gradation Figure I 12 Ainsi la d gradation des ARN messagers
254. n barley Theor Appl Genet 96 376 384 Qiu J van Santen E and Tuzun S 1995 Optimization of DNA amplification fingerprinting techniques to study genetic relationships of white lupin germplasm Plant Breed 114 525 529 Quandt H J P hler A and Broer I 1993 Transgenic root nodules of Vicia hirsuta a fast and efficient system for the study of gene expression in indeterminate type nodules Mol Plant Microbe Interact 6 699 706 Raghothama KG 1999 Phosphate acquisition Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50 665 693 184 R f rences bibliographiques Ravel C Praud S Canaguier A Dufour P Giancola S Balfourier F Chalhoub B Brunel D Linossier L Dardevet M Beckert M Rousset M Murigneux A Charmet G 2004 DNA sequence polymorphism and their application in bread wheat In Vollmann J Grausgruber H Ruckenbauer P eds Genetic variation for plant breeding Eucarpia Tulln Austria pp 177 181 Reiter R S J G K Williams K A Feldmann J A Rafalski S V Tingey and P A Scolnik 1992 Global and local genome mapping in Arabidopsis thaliana by using recombinant inbred lines and random amplifed polymorphic DNAs Proc Natl Acad Sci USA 89 1477 1481 Rensing SA Lang D Zimmer AD et al 2008 The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants Science journal 319 5859 64 9 Runge Metzger A 1995 Closing the cycle obstacles to efficient P manage
255. na Affymetrix gene chips determined plant responses to phosphate starvation Proc Natl Acad Sci USA 102 11934 11939 Monteiro R and P E Gibbs 1986 A taxonomic revision of the unifoliolate species of Lupinus Leguminosea in Brazil Notes from the Royal Botanic Garden Edinburgh 44 71 104 Gre gory Montiel Pascal Gantet1 Christian Jay Allemand1 and Christian Breton 2004 Transcription Factor Networks Pathways to the Knowledge of Root Development Plant Physiology Vol 136 pp 3478 3485 182 R f rences bibliographiques Muller R Morant M Jarmer H Nilsson L amp Nielsen T H 2007 Genome wide analysis of the Arabidopsis leaf transcriptome reveals interaction of phosphate and sugar metabolism Plant Physiology 143 156 171 Naganowska Barbara Wolko Bogdan Sliwinska Elwira and Kaczmarek Zygmunt 2003 Nuclear DNA content variation and species Relationships in the Genus Lupinus Fabaceae Naganowska B Wolko B liwin E S Z Kaczmarek ska and Schifino Wittmann M T 2006 2C DNA variation and relationships among New World species of the genus Lupinus Fabaceae Pl Syst Evol 256 147 157 Nelson J C M E Sorrells A E van Deynze Y H Lu M Atinkson M Bernard P Leroy J D Faris and J A Anderson 1995 Molecular mapping of wheat Major genes and rearrangements in homoeologous groups 4 5 and 7 Genetics 141 721 731 Nesbitt K A B M Potts R E Vaillancourt A K West
256. ne and ITS 1 2 regions of rDNA Plant Syst Evol 208 139 167 Laajanen Kaisa Irmeli Vuorinen Vanamo Salo Jarmo Juuti and Marjatta Raudaskoski 2007 Cloning of Pinus sylvestris SCARECROW gene and its expression pattern in the pine root system mycorrhiza and NPA treated short roots New phytologist 175 230 243 Lagudah E S Appels R and McNeil D 1991 The Nor D3 locus of Triticum tauschii Natural variation and genetic linkage to markers in chromosome 5 Genome 34 387 394 Lambers H Shane M W Cramer M D Pearse S J amp Veneklaas E J 2006 Root structure and functioning for efficient acquisition of phosphorus matching morphological and physiological traits Ann Bot 67 659 670 Lamoril J Ameziane N Deybach J C Bouizegar ne P Bogard M 2008 Les techniques de s quencage de l ADN une r volution en marche Premi re partie DNA sequencing technologies A revolution in motion Part one Immuno analyse et biologie sp cialis e 2008 23 260 279 Lamont B B 2003 Structure ecology and physiology of root clusters a review Plant and Soil 248 1 19 Lee Y Tsai J Sunkara S et al 2005 The TIGR Gene Indices clustering and assembling EST and known genes and integration with eukaryotic genomes Nucleic Acids Res 33 Database issue D71 4 Lee Mi H Kim B Song S K Heo J O Yu N Lee S A Kim M Kim D G Sohn S Lim C E C K Suk Lee M M Lim J 2008 Large scale analysis of
257. nent l te benne Ann saone 38 IIl 2 3 1 Les facteurs de transcription FT classification et importance 38 IIl 2 3 2 Exemple d une famille de facteurs de transcription famille GRAS 42 IIl 2 3 2a Le facteur de transcription SCARECROW SCR cccceeee cence eee eens 44 IV Le lupin blanc et les stress abiotiques 45 INA Stress ADIOIQUES a aszseaecuy ene seen ete Re tn ant sn tn aue diesem tcuee se s ries 46 IV 2 Le lupins blanc plante mod le pour l tude de l adaptation au stress phosphorique 47 IV 2 1 Adaptation morphologique Racines proteo des 49 IV 2 2 Adaptation BIOCHIMIQUOS 2 es terne un en otre nee DR Gee petite 50 IV 2 3 Adaptation g n tique ES Se RS UI ne LS Cee ee nes 51 CHAPITRE II Le lupin au Maroc Structuration de la diversit INTRODUCTION SES A nent ete ee ae Rene a nec ne AN RU n oueni aun dU en ren Ge 52 ll 1 Mat riel et m thodes a tate t Eee 54 Il 1 1 Pr sentation de la collection Marocaine du lupin utilis e 54 Il 1 2 Protocole d extraction des ADN du lupin anaes 56 11 1 2 1 Extraction de l ADN total du lupin selon le protocole de BERNATSKY et TANKSLEY 19
258. nes Les facteurs de transcription sont d finis comme tant des prot ines interm diaires entre la fixation de DARN polym rase et l initiation de la transcription Gregory et al 2004 Shao et al 2006 Les l ments cis r gulateurs sont des s quences d ADN reconnus au niveau du promoteur s quence en amont de la s quence du g ne Cette interaction facteur de transcription l ment cis r gulateur permet la r gulation de l activit cellulaire en assurant la stimulation ou inhibition de la r gulation d une cascade de g nes Liu L ef al 1999 Cette r gulation est responsable d importants changements morphologiques physiologiques et ou m taboliques Gregory et al 2004 Shao et al 2006 Ainsi l alt ration de l expression des facteurs de transcription est le r sultat de grands changements chez la plante Liu L et al 1999 Plusieurs g nes de facteurs de transcription ainsi que leurs produits ont t bien caract ris s grace aux techniques de manipulation des plantes et l ing nieurie des g nes La plupart des facteurs de transcription connus chez les plantes ont t pr c demment identifi s chez les animaux En effet la d termination des domaines fonctionnels des facteurs de transcription chez les plantes se fait par comparaison de la s quence des acides amin s des ADNc en question avec leurs homologues chez les animaux Les tudes des domaines fonctionnels potentiels par les analyses fonctionnelles et de mutations
259. nes LaSCR1 et LaSCR2 1 3 1 Isolement de ADN g nomique ADNg LaSCR1 et LaSCR2 1 3 1 a Pr paration d une banque ADNg du lupin blanc Une banque ADNc partielle du lupin blanc a t pr par e l aide du Kit lambda DASH II ECORI Stratagene comme d crit pr c demment par Liu et al 2001 A partir de feuilles jeunes de L albus Y ADN total a t extrait purifi et dig r par EcoRI Ces fragments dig r s sont ins r s dans le vecteur de clonage lambda DASHI capable d int grer des inserts de 2 32 kilobases kb Les lambda DASH II recombinantes sont clon s dans les souches XL1 Blue MRA d Escherichia coli et empaquet s dans les bact riophages VCS257 et multipli s pour plusieurs amplifications 1 3 1 b Criblage de la banque d ADNg Les deux fragments ADNc de LaSCRI et LaSCR2 ont t utilis s et marqu s s par ment comme sondes pour cribler la banque ECORI de l ADNg Le criblage a t r alis selon les tapes d crites dans le manuel d instructions du Kit Lambda DASHII Stratagene Apr s trois tapes de criblage plusieurs clones ont t isol s et l ADN lambda a t extrait et purifi Les inserts ont t isol s par digestion du Lambda par ECORI et clon s dans le pbluescript pour faciliter le s quen age et la digestion 1 3 2 S quencage A partir des clones isol s plusieurs r actions de s quen age ont t r alis es comme r sum au niveau des figures IIL6 et IIL7 Les s quences o
260. nf re une bonne valeur nerg tique N anmoins le lupin n a pas t largement utilis pour l alimentation humaine en raison de la pr sence d alcalo des qui donnent aux lupins sauvages un go t tr s am re Aujourd hui la culture du lupin dans le monde entier est limit e aux vari t s douces Les productions mondiale du lupin augmentent chaque ann e malgr le fait que les grandes productions restent restreintes dix pays Anonyme 2001 Figure 1 L Australie couvre la majorit des productions mondiale savoir 82 correspondant 1210000 tonnes par an L Europe assure 11 8 des productions avec 174300 tonnes dont 110000 tonnes 63 de la production europ enne est couverte par l Allemagne Par ailleurs les productions africaines se limitent 2 41 correspondant 35400 tonnes par an Ces productions sont principalement assur es par le Maroc l Afrique du sud et l Egypte Anonyme 2001 Au Maroc le d veloppement du lupin l tat spontan et son importance agronomique et socio conomique en particulier en tant qu une ressource en prot ine alternative la f ve et au pois a suscit un grand int r t de la part des chercheurs En effet le lupin a fait partie d un programme de pr servation des ressources g n tiques marocaines tablis en collaboration entre le Laboratoire de Microbiologie et de Biologie Mol culaire de la Facult des Sciences de Rabat et l unit de recherche Am lioratio
261. ns et 14 d l tions d acides amin s au niveau de la partie N terminale Par contre au niveau de la partie C terminale les deux prot ines sont tr s similaires Ainsi on note que la prot ine LaSCR2 pr sente en comparaison avec la prot ine LaSCR1 21 substitutions 1 insertion et 6 d l tions d acides amin s L analyse de ces deux prot ines montre qu elles pr sentent cinq domaines fonctionnels caract ristiques du g ne SCR Di Laurenzio et al 1996 Pysh et al 1999 Les deux Leucine Heptad Repeats LHRI et LHRII le motif VHIID le motif PFYRE et le motif SAW Figure IIL 4 La pr sence des motifs LHRI et LHRII au niveau des prot ines de la famille de GRAS sugg re que ces prot ines peuvent fonctionner comme des multim res Hurst 1994 Pysh et al 1999 Chez A thaliana les motifs LHRI LHRI et VHIID d AtSCR jouent un r le dans les interactions prot ine prot ine entre SCR et SHORT ROOT Cui et al 2007 1 2 3 c Comparaison avec Arabidopsis thaliana SCR AtSCR La comparaison des deux prot ines LaSCR1 et LaSCR2 avec AtSCR sur la base des cing domaines fonctionnels est r sum e au niveau du tableau III 4 On note que LaSCRI et LaSCR2 pr sentent une similarit faible respectivement de 40 4 et 42 avec AtSCR au niveau de leurs parties N terminales Homopolymeric repeats Par contre on note une similarit importante de 75 7 et 93 5 entre LaSCR1 2 et AtSCR sur la base des cinq domaines fonctionnels 134 Stress a
262. nt la s quence est 5 GACTGCGTACCAATTC 3 et l amorce Msel primer 0 dont la s quence est 5 GATGAGTCCTGAGTAA 3 L amplification est optimis e dans 15 ul de m lange r actionnel contenant Sul des produits de la ligation dilu s 10 fois avec 10 mM Tris HCl et 0 1 mM EDTA pH 8 0 50 ng d amorce EcoRI 50 ng d amorce Msel 10 mM de dNTP 25 mM MgCl 1 unit s de Taq polym rase promega La PCR est optimis e dans l amplificateur Amplitron II selon le programme suivant 19 cycles avec une tape de d naturation a 94 C pendant 30s une hybridation 56 C pendant 30s et une longation 72 C pendant 1 mn L amplification est v rifi e par visualisation des amplifiats par lectrophor se sur gel d agarose 1 2 La quatri me tape d AFLP consiste en une amplification s lective a partir des produits pr amplifi s positifs en utilisant 25 combinaisons d amorces Tableau II 3 La PCR est optimis e dans 25 ul de m lange r actionnel contenant 50 ng d amorce EcoRI 3 50 ng d amorce Msel 3 25 mM MgCh 10 mM dNTP 1 Unit s de Taq polym rase Promega et avec 5 ul des produits d amplification de la PCR 1 dilu s 10 fois avec 10 mM Tris HCl et 0 1 mM EDTA pH 8 0 La PCR est ensuite r alis e selon le programme suivant 11 cycles d une tape de d naturation de 30 s a 94 C une tape d hybridation de 30 s 64 C 0 7 C cycle et une tape d longation de 1 mn 72 C Ceci suivit par 23 cycles av
263. nt de v rifier la normalisation des r sultats d une exp rience une autre On note que pour chaque courbe des points sortent de la ligne de pente Ces points situ s en haut ou en bas de la ligne de normalisation repr sentent respectivement des g nes induits ou r prim s A B 16 a 027 i st hes ge i D n Bos e a u 02 mn i 0 gt us Tt Tt gta D o sp te 7 o2 a o 1 2 3 4 s 5 Feuilles P 3 Racines proteoides P Figure II 1 Courbes de r gression lin aire montrant l analyse de variabilit de l intensit des signaux A et B repr sentent les moyennes d intensit s des signaux de quatre filtres ADN ind pendants 125 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 180 G nes induits 160 o G nes inhib s 140 120 100 60 40 20 P P N P Fe P P P N P Fe P P P N P Fe P Feuilles Racines normales Racines proteoides Figure II 2 Comparaison de l expression des g nes au niveau des feuilles racines proteoides et racines normales du lupin en r ponse aux trois stress P carence en phosphore P pr sence de phosphore N carence d azote et Fe carence de fer 126 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Des rapports d intensit s ont t calcul s pour v rifier l expression des g nes en r ponse aux diff rents traitements de stress savoir l absence de pho
264. oloration Les tissus ont t observ s sous microscope lectronique Au niveau des racines normales l expression du transcrit LaSCR2 a t localis e au niveau de Vendoderme et au niveau du centre quiescent Figure IIL 15 Les plantes t moins transform es avec le plasmid pBI sans promoteur ne montrent aucune coloration GUS Ce profil d expression au niveau de l endoderme et le centre quiescent est caract ristique du g ne SCR En effet le g ne SCR pr sente le m me profil d expression chez plusieurs esp ces de plantes Malamy amp Benfey 1997 Lim et al 2000 Sassa et al 2001 Kamiya et al 2003 et Laajanen et al 2007 La coloration de GUS bleue a t localis e aussi au niveau des racines proteoides a diff rents stades de d veloppement Figure III 16 On note que l expression du LaSCR2 est observ e depuis le d veloppement des premi res cellules m ristematiques des proteoides La coloration du LaSCR2 g ne rapporteur a t marqu e au niveau des radicelles en cours d longation et aussi au niveau des racines proteoides compl tement d velopp es Le profil d expression du LaSCR2 au 155 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc niveau des racines proteo des est similaire celui des racines normales En effet l expression du LaSCR2 promoteur GUS a t d tect e au niveau de l endoderme des proteo des Figure III 15 Expression du promoteur de LaSCR2 dirig e par
265. olution contenant du paraformaldehyde 4 glutaraldehyde 0 25 Tween 20 0 05 et du phosphate de sodium 50mM PH 7 2 La fixation est optimis e sous vide pendant 2 a 3 min Les tissus sont plac s a 4 C pendant 12 a 20h La deuxi me tape de la pr paration des tissus consiste remplacer l eau des tissus par de la r sine Ceci permet de sectionner convenablement les tissus Lors de la d shydratation l eau des tissus sera remplac e progressivement par des solvants organiques hydrophobes dans ce cas le xyl ne Ces solvants permettent de solubiliser la r sine ou cirre paraffine et d assurer sa p n tration dans les tissus Ces derniers sont ensuite sectionn s dans les blocs de paraffine Les sections de 10 um d paisseur obtenues sont fix es sur des lames pr trait es avec un adh sif Poly lysine pour viter la perte des tissus au cours de l hybridation 3 2 2 Utilisation de sondes froides digoxigenine Les sondes marqu es ont t pr par es partir des ADNc de LaSCRI de 1224pb 2292pb correspondant aux domaines les plus conserv s du g ne SCR savoir la Leucine heptad I and IT VHIID et une partie importante du motif PFYRE Le fragment de LaSCRI1 choisit pr sente 93 d identit avec l ADNc de LaSCR2 Ce fragment de 1068 pb a t amplifi l aide des deux amorces la SCR F 5 CAATGTGCTGAAGCAGTTTCAGC 3 et la SCR R 5 GGGAGGTTCTCCAGCAGAAAG 3 Ce fragment a t soumis une ligation avec le
266. ome ARNm ARN ribosomale ARNs de r gulation ba Proteome 4 gt Proteines 4 Modifications post translationelles DNS Metabolome M tabolites primaires M tabolites secondaires Activit biologique sa qissod 2 04U02 ap sjul04 Figure I 11 Les diff rents niveaux de contr le des processus cellulaires Christopher A cullis plant genomics and proteomics 2004 30 Revue bibliographique IIL 2 1 Analyse du transcriptome L tude du transcriptome permet l analyse de l expression d une masse de g nes travers une vari t de conditions biologiques L utilisation des techniques de profilage transcriptionnel permet d analyser l expression des g nes dans diff rents tissus des moments particuliers et en r ponse a diff rents stimuli ou apr s un traitement particulier Les techniques de profilage transcriptionnel peuvent tre class es en deux cat gories la premi re bas e sur le s quencage comme le cas de l analyse en s rie de l expression ou SAGE et aussi du s quencage par la technologie 454 La deuxi me cat gorie est bas e sur des techniques d hybridation exemple des puces ADN La m thode SAGE a t mise au point et publi e en 1995 par Dr Victor Velculescu du centre d oncologie de l Universit de John Hopkins Cette technique est bas e sur l extraction des ARNm tiquettes de diff rents chantillons la synth se des ADNc correspondant et leurs
267. onsable de la galle du collet ou Crown gall des plantes et l Agrobacterium rhizogenes qui induit le chevelu racinaire ou Hairy roots Seule la transformation g n tique par Agrobacterium rhizogenese sera discut e en d tail dans ce chapitre L Agrobacterium rhizogenes est une bact rie Gram n gative appartenant a la famille des Rhizobiaceae Cette bact rie est capable de transf rer a la plante son ADN T DNA 4 partir de son plasmide Ri plasmide a travers des blessures Le Ri T DNA contient des g nes root locus rol responsables de la prolif ration racinaire A l tat naturel l infection de la plante par A rhizogenes est stimul e par la synth se de compos s ph noliques comme l acetosyringone par la plante Ce syst me de transformation 33 Revue bibliographique permet de g n rer des plantes dites chim res Ces plantes pr sentent un syst me de chevelu racinaire li une partie a rienne non transform e La g n ration des plantes transg niques est de l ordre de quelques semaines d o l avantage par rapport la transformation par A tumefaciens qui n cessite 4 6 mois pour g n rer des plantes transg niques Cette technique est tr s bien adapt e aux proc dures bas es sur l utilisation de DARN d interf rence pour tudier la fonction des g nes Limpens ef al 2004 dans les analyses fonctionnelles de promoteurs Boisson Dernier et al 2005 et pour les tests de compl mentation des mutants de plantes avec
268. opane sulfonique G ne codant pour la n omycine phospho transf rase r sistance a la kanamycine no apical meristem cup shaped cotyledon Haploide diploide triploide nuclear localisation signal Organismes g n tiquement modifi s Phosphate Phosphate buffered saline Polymerase Chain Reaction Potentiel hydrog ne Quantitative traits loci Quantit suffisante pour Random amplified polymorhism DNA Restriction fragment length polymorphism RNA interference Ribonucl ase Rotation par minute Reverse transcription PCR Dodium Dod cyl Sulfate Simple Sequence Repeat Single nucleotide polymorphism SCARECROW SHORT ROOT Salt Sodium Citrate Tris Ac tate EDTA Tampon Tris EDTA Ultraviolet Union Nationale Interprofessionnelle des Plantes United States Department of Agriculture Volt 5 bromo 4 chloro 3 indolyl beta D glucuronic acid Young proteoid roots Liste des figures Figure 1 Les Productions mondiales du Lupin Figure I 1 Lupinus albus Figure I 2 Lupinus cosentini Figure I 3 L pilosus montrant les feuilles et inflorescence bleue Figure I 4 Lupinus angustifolius Figure LS Lupinus luteus Figure L6 Diagramme repr sentant la relation phylog n tique du genre Lupinus bas e sur les marqueurs ITS Figure I 7 Sch ma pr sentant les tapes de la technique RFLP Figure I 8 Sch ma pr sentant le principe des ISSR Figure I 9 Les quatre tapes de la technique AFLP Figure 1 10 Sch ma repr
269. orcuera L J 2002 Differential gene expression in proteoid root clusters of white lupin Lupinus albus Physiol Plant 116 28 36 Peng J Carol P Richards DE King KE Cowling RJ Murphy GP Harberd NP 1997 The Arabidopsis GAI gene defines a signaling pathway that negatively regulates gibberellin responses Genes Dev 11 3194 3205 Phillips LL 1957 Chromosome numbers in Lupinus Madrono 14 30 36 Planchuelo A M and Dunn D B 1984 The simple leaved lupines and their relatives in Argentina Annals of the Missouri Botanical Garden vol 71 n 1 pp 92 103 Plitmann U 1981 Evolutionary history of the Old World lupines Taxon 30 2 430 437 Plitmann U et Pazy B 1984 Cytogeographical distribution of the Old World Lupinus vol 38 pp 531 539 Powell W M Morgante C Andre M Hanafey J Vogel S Tingey and A Rafalsky 1996 The comparison of RFLP RAPD AFLP and SSR microsatellite markers for germplasm analysis Mol Breed 2 225 238 Purnell HM 1960 Studies of the family Proteaceae I Anatomy and morphology of the roots of some Victorian species Aust J Bot 8 38 50 Pysh LD Wysocka Diller J Camilleri C Bouchez D Benfey PN 1999 The GRAS gene family in Arabidopsis sequence characterization and basic expression analysis of the SCARECROW LIKE genes Plant J 18 111 119 Qi X P Stan and P Lindhout 1998 Use of locus specific AFLP markers to construct a high density molecular map i
270. ours apr s mergence 131 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc JAE ont t combin s et trait s avec l hydroxyde du m thylmercure Ensuite ces ARN ont t utilis s dans la construction de la banque d ADNc et ont permis d engendrer 1 6 X10 transformants Cette banque d ADN a t amplifi e et stock e 80 C pour plusieurs utilisations 1 2 1 b Criblage de la banque d ADNc Afin d isoler les ADNc de LaSCR1 et LaSCR2 la banque ADNc des racines proteo des a t cribl e en utilisant le fragment EST de 1226 pb comme sonde Le fragment d EST a t marqu avec l isotope radioactif P dATP comme expliqu dans l annexe II 3 La sonde marqu e a t utilis e dans le criblage de la banque d ADNc comme d crit dans le manuel d instructions du Kit de Lambda ZAPII Stratagene Apr s trois tapes de criblages les clones isol s sont excis s in vivo et les inserts sont transf r s dans le vecteur pbluescript Stratagene USA La taille des inserts est valu e par digestion a l aide de l enzyme EcoRI et seuls les inserts de grandes tailles sont maintenus pour le s quen age 1 2 2 S quencage Les clones ou inserts obtenus ont t s quenc s l aide des amorces universelles T3 et T7 A partir des s quences g n r es d autres amorces ont t dessin es et utilis es pour d terminer la s quence des clones 1 2 3 R sultats 1 2 3 a Analyse des s quences
271. pb 1 369 0 499 381 ISSR FL6 264 pb 1 369 0 499 341 ISSR FL5 452 pb 1 369 0 499 382 ISSR FL6 251 pb 0 511 0 194 342 ISSR FL5 252 pb 0 237 1 202 383 ISSR FL6 237 pb 1 369 0 499 343 ISSR FL5 148 pb 1 369 0 499 384 ISSR FL6 233 pb 0 621 0 897 344 ISSR FL5 502 pb 1 369 0 499 385 ISSR FL6 217 pb 0 536 2 656 345 ISSR FL5 386 pb 1 232 0 281 386 ISSR FL6 209 pb 2 154 2 383 346 ISSR FL5 291 pb 0 573 0 658 387 ISSR FL6 192 pb 0 892 0 938 347 ISSR FL5 245 pb 0 083 1 173 388 ISSR FL6 179 pb 1 414 0 164 348 ISSR FL5 132 pb 0 083 1 173 389 ISSR FL6 163 pb 0 799 0 914 349 ISSR FL5 696 pb 0 083 1 173 390 ISSR FL6 153 pb 1 049 1 876 850 ISSR FL5 273 pb 0 098 1 671 391 ISSR FL6 148 pb 0 083 1 173 351 ISSR FL5 257 pb 1 369 0 499 392 ISSR FL6 138 pb 0 511 0 194 352 ISSR FL5 207 pb 1 049 1 876 393 ISSR FL6 132 pb 0 712 0 016 353 ISSR FL5 171 pb 0 511 0 194 394 ISSR FL6 120 pb 0 810 1 648 354 ISSR FL5 424 pb 0 351 0 649 395 ISSR FL6 116 pb 0 573 0 658 355 ISSR FL5 353 pb 0 083 1 173 396 ISSR FL6 110 pb 0 755 1 156 356 ISSR FL5 163 pb 1 346 0 272 397 ISSR FL7 780 pb 0 511 0 194 357 ISSR FL5 652 pb 2 001 1 059 398 ISSR FL7 729 pb 2 631 0 946 358 ISSR FL5 538 pb 2 752 1 489 399 ISSR FL7 675 pb 0 393 0 491 359 ISSR FL5 442 pb 0 374 0 024 400 ISSR FL7 602 pb 0 33
272. pb FL11 693 70pb FL11 459 43pb L l GII LutO1 Lut02 Lut03 341 0 004680 Absent L l GII Lut08 Lut09 592 0 004687 F1 247 58pb F2 258 14pb F3 934pb F3 837 74pb FL1 708 76pb FL1 600 32pb FL1 179 39pb FL2 FL3 658 06pb FL3 260 67pb 186 02pb FL4 475 49pb FL5 987pb FL5 491 59pb FL5 150 54pb FL5 116 30pb FL6 108 58pb FL6 106 78pb FL8 635 30pb FL9 1355pb FL10 487 61pb FL10 366 83pb FL10 222 58pb FL10 104 92pb FL11 727 52pb FL11 647 38pb FL11 439 00 FL11 436 16 109 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit IT 2 2 3 c Analyse en composantes principales Une analyse en composantes principales ACP a t labor e afin d avoir une autre vision sur la structuration des diff rentes accessions de L luteus Figure II 21 Cette repr sentation a t effectu e selon les deux axes les plus informatifs F1 et F2 qui ont apport 32 76 de variabilit On arrive clairement retrouver les trois groupes pr d fini L I GI L I GII et L l GIII En plus cette nouvelle distribution a permis de rep rer les marqueurs ISSR ou variables 58 contribuant et appuyant la structuration des populations La contribution de l ensemble des marqueurs ISSR dans la structuration des populations de luteus selon les axes F1 et F2 est r sum e dans l annexe II 6 11 2 2 3 d Distribution tridimensionnelle Une distribution tridimensionnelle ou multidimensional scaling MDS a t labor
273. pb 0 318 0 252 53 ISSR F4 1057 pb 1 795 0 225 11 ISSR F2 247 pb 0 280 0 026 54 ISSR F4 911 pb 0 231 0 014 12 ISSR F2 234 pb 0 028 0 000 55 ISSR F4 867 pb 0 198 0 072 13 ISSR F2 223 pb 0 341 0 485 56 ISSR F4 745 pb 1 580 0 008 14 ISSR F2 212 pb 0 484 0 020 57 ISSR F4 661 pb 0 000 0 377 15 ISSR F2 189 pb 0 318 0 252 58 ISSR F4 638 pb 0 048 0 506 16 ISSR F2 175 pb 0 455 0 067 59 ISSR F4 606 pb 0 010 0 113 17 ISSR F2 148 pb 0 156 0 003 60 ISSR F4 584 pb 0 252 0 220 18 ISSR F2 142 pb 0 050 0 003 61 ISSR F4 517 pb 0 003 0 356 19 ISSR F2 138 pb 0 059 0 157 62 ISSR F4 496 pb 0 046 0 260 20 ISSR F3 1276 pb 0 245 0 235 63 ISSR F4 496 pb 0 335 0 021 21 ISSR F3 1164 pb 0 175 0 007 64 ISSR F4 475 pb 0 109 0 248 22 ISSR F3 1039 pb 0 082 0 531 65 ISSR F4 398 pb 0 558 0 485 23 ISSR F3 872 pb 0 176 0 007 66 ISSR F4 380 pb 0 009 0 471 24 ISSR F3 801 pb 0 175 0 007 67 ISSR F4 343 pb 0 265 0 510 25 ISSR F3 762 pb 0 305 0 002 68 ISSR F4 325 pb 1 428 0 003 26 ISSR F3 715 pb 0 146 0 071 69 ISSR F4 314 pb 0 188 0 320 27 ISSR F3 694 pb 0 417 0 025 70 ISSR F4 285 pb 0 041 0 448 28 ISSR F3 645 pb 0 005 0 053 71 ISSR F4 274 pb 0 001 0 128 29 ISSR F3 591 pb 0 119 0 307 72 ISSR F4 264 pb 0 035 0 862 30 ISSR F3 570 pb 0 047 0 104 73 ISSR F4 232 pb 0 300 1 173 31 ISSR F3 479 pb 1 795 0 225 74 ISSR F4 213 pb 0 293 1 386 32 ISSR F3 694 pb 0 417 0 025 75
274. population j Par la suite une analyse en composante principale ACP a t effectu e partir des matrices pr sence absence et en utilisant le logiciel XLSTAT 2009 66 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit E2 E3 E4 G2 63 I2 I3 I4 H3 H4 H5 Figure II 3 Profils RAPD de L luteus r v l s par 11 amorces E2 4 G2 G3 12 4 H3 H4 et H5 L cosentinii L luteus Sod Podee Figure IL 4 Profils RAPD de L luteus et de L cosentinii r v l s par 5 amorces C10 D1 3 et E1 67 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit II 2 R sultats II 2 1 Analyse de la diversit inter sp cifique 2 Dans l tude de la diversit inter sp cifique les ADN des trois esp ces de lupin L albus L cosentini et L luteus ont t utilis s sous forme de bulk Pour chacune des esp ces l ADN a t extrait partir de feuilles des diff rentes accessions part gale L ADN bulk de L albus a t extrait partir des feuilles des 10 accessions de cette esp ce celui de L luteus a t extrait partir des 9 accessions de cette esp ce et l ADN bulk de L cosentinii a t extrait partir des 22 accessions de cette esp ce Pour L angustifolius nous avons utilis l ADN extrait partir des feuilles de la seule accession mise notre disposition par l INRA II 2 1 1 Polymorphisme r v l par les marqueurs RAPD Au cours de cette tude pr liminaire les marqueurs RAPD ont
275. premi re vue on peut diviser le nuage de points en quatre domaines A B C et D Dans le domaine A L angustifolius est appuy e par 8 marqueurs Au niveau du domaine B L cosentinii est appuy par 14 marqueurs Dans le domaine C 17 marqueurs contribuent la repr sentation de L luteus Aussi 10 marqueurs contribuent la repr sentation de L albus dans le domaine D Tableau IL 10 Valeurs propre variabilit et pourcentage cumul des deux premiers axes de V ACP bas e sur les marqueurs ISSR Axe F1 Axe F2 Valeur propre 1 175 1 045 Variabilit 25 27 23 27 cumul 25 27 48 54 82 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit b Albio AlbO7 Alb01 Alb04 A b03 Alb06 A b0B Alb05 Alb09 AlbO2 Albai Albo9 Albo3 AIbO2 Alb05 Alb04 Alb06 Alb07 AIbOB Albi0 7 Figure IL 11 Profils lectrophor tiques ISSR d accessions de L albus obtenus moyennant l amorce F1 a F2 b F3 c et F4 d et les classifications hi rarchiques correspondantes Tableau IL 11 Marqueurs ISSR g n r s pour les dix accessions de L albus et par amorce Amorce ISSR Nombre de marqueurs g n r s AlbO1 Alb06 Alb04 Alb03 Alb10 Alb07 Alb08 Alb05 A1b09 Alb02 F1 8 10 8 10 11 12 14 14 12 6 F2 17 15 17 14 13 6 12 15 16 15 F3 13 9 10 11 8 9 10 9 11 11 F4 14 12 11 13 9 10 7 14 10 13 FL1 11 10 11 11 9 10 10 9
276. proteoides Cette expression a t observ e au niveau de tous les stades de d veloppement des proteoides et a t tr s marqu e au niveau des racines proteoides matures Le profil d expression du SCR au niveau deux esp ces tudi es a t similaire celui observ chez d autres esp ces v g tales Malamy amp Benfey 1997 Lim ef al 2000 Sassa ef al 2001 Kamiya ef al 2003 Laajanen ef al 2007 Nous avons aussi d tect une r duction de l expression de LaSCRI au niveau des cellules filles du cortex comme cela a t observ chez le riz DiLaurenzio et al 1996 Kamiya et al 2003 L expression du SCR au niveau de l endoderme constitue un m canisme tr s conserv entre l ensemble des esp ces tudi es jusque l Ceci peut aussi expliquer qu il excite toujours une seule couche d endoderme chez les plantes N anmoins cette hypoth se reste prouver Partie 4 Analyse de la fonction du g ne SCR 4 1 ARN d interf rence ARNi Silen age du SCR 4 1 1 Pr paration du vecteur LaSCR1i ARNi 4 1 1 a Choix de la s quence du g ne utiliser Un fragment de l ADNc de LaSCR1 de 1875 pb 2338 pb correspondant la partie la plus conserv e du g ne a t amplifi e l aide des amorces LaSCRIi F 5 AAGCTGTTGCTGTCCATTGG 3 et LaSCR1i R CAACCAAGTTTGAGGATGC 3 Ce fragment a t introduit en orientation sens et antisens dans le vecteur pHellsgate 8 Helliwell et al 2002 indui
277. quantification de l expression de LaSCRI et LaSCR2 par la PCR en temps r el nous avons dessin des amorces sp cifiques pour chacun des deux g nes Pour LaSCR1 un fragment de 183 pb a t amplifi en utilisant les amorces SCRIF 5 ACACTAGTGTCCCACAGTAG 3 et SCRIR 5 AACAGTCCTGGCCATTGAAG 3 De m me pour LaSCR2 un fragment de 163pb a t g n r par les amorces SCR2F 5 TTTCCTCGTCGAAGCAGCAG 3 et SCR2R 5 GGGGTTTGGAACAACATGGG 3 L amplification a t r alis e dans un volume final de 25 ul contenant le m lange r actionnel ou PCR master mix 1Taq SYBR Green Supermix with ROX Bio Rad Hercules CA USA 5 ul d ADNc dilu et 40 pmoles de chacune des deux amorces L amplification et la d tection du signal fluorescent ont t optimis es dans le syst me de d tection de s quences ABI PRISM 7000 Applied Biosystems Carlsbad CA USA Les conditions de l amplification r alis e ont t de 1 cycle de 2 min 50 C 1 cycle de 10 min 95 C suivis de 40 cycles de 15 s 95 C et de 1 min 60 C L analyse a t r alis e en trois r plications Apr s la fin de la r action PCR et de V lectrophor se du gel d agarose une courbe de dissociation a t optimis e Cette courbe permet de v rifier la sp cificit des produits de la r action PCR 147 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Fold difference in SCR expression relative to PN PZ1 PZ2 PZ
278. quences avec les s quences d ADNcC et aussi par l utilisation de certains programmes bioinformatiques de pr diction Depuis la d couverte de l ADN double h lice par Watson et Crick en 1953 les tudes portant sur l ADN se sont succ d es Et depuis le s quen age du premier g nome d Haemophylus influenzae en 1995 plusieurs organismes ont t s quen s IIL 1 1 Le s quencage syst matique Le s quen age est un moyen de d codage des acides nucl iques permettant la d couverte des g nes d un organisme Le s quen age de l ADN a t invent aux ann es 70 par deux quipes travaillant s par ment l quipe de Walter Gilber et l quipe de Frederick Sanger L quipe am ricaine et allemande ont re u le prix Nobel de la chimie en 1980 Les m thodes de s quen age propos es sont bas es sur des techniques diff rentes En effet La m thode de Sanger est bas e sur la synth se enzymatique s lective alors que celle de Gilbert est bas e sur la d gradation chimique s lective Actuellement la majorit des s quen ages r alis s se basent sur la m thode de Sanger Le s quen age de g nomes tire avantage des techniques de biologie mol culaire ainsi que des outils de la bioinformatique Ainsi on reconna t deux grandes techniques de s quen age bas es essentiellement sur la fragmentation partielle du g nome et le clonage des fragments g nomiques 25 Revue bibliographique dans des vecteurs de clonage Figure I
279. ques Albus F1 8 159 43pb 568 95pb 0 88 180 64pb F2 8 137 62pb 304 32pb 0 85 304 32pb 272 02pb FLI 5 147 21pb 1126pb 0 91 1126pb 422 49pb 378 90pb 350 1 Ipb 238 96pb FL2 6 143 26pb 543 48pb 0 93 543 48pb 162 22pb FL3 7 139 19pb 992pb 0 94 992pb 864 75pb FL4 8 156 50pb 621 09pb 0 89 0 FL5 7 142 02pb 637 87pb 0 92 637 87pb 468 73pb 354 81pb FL6 8 124 05pb 538 95pb 0 92 219 25pb FL7 6 155 09pb 371 60pb 0 92 233 12 pb FL9 6 110 28pb 323 63pb 0 911 0 FL12 7 159 30pb 775 85pb 0 93 0 Total 76 110 28pb 1126pb 0 909 17 0 026 Angustifolius F1 8 51 95pb 154 73pb 0 88 ee eee 3p F2 5 137 62pb 282 80pb 0 85 282 80pb 221 93pb FLI 6 147 21pb 625 52pb 0 91 625 52pb 495 50pb 255 62pb 196 32pb FL2 7 143 26pb 332 48pb 0 93 263 06pb 172 86pb FL3 6 139 19pb 389 33pb 0 94 0 FL4 7 183 20pb 621 09pb 0 89 457 21 pb 396 50pb 310 24pb FLS 8 142 02pb 783 18pb 0 92 783 18pb 613 93pb 551 96pb 404 37pb 341 19pb FL6 7 134 13pb 538 95pb 0 92 0 FL7 6 155 09pb 371 60pb 0 92 0 FL9 7 119 79pb 323 63pb 0 911 119 79pb FL12 7 126 43pb 873 35pb 0 93 873 35pb 645 81 pb 551 38pb 126 43pb Total 74 51 95pb 873 35pb ie 24 Cosentinii FI 7 159 43pb 568 95pb 0 88 0 F2 5 137 62pb 317 59pb 0 85 317 59pb FL1 5 165 30pb 654 92pb 0 91 654 92pb 444 85pb 285 76pb FL2 7 143 26pb 525 90pb 0 93 525 90pb 150 20pb FL3 10 139 19pb 677 40pb 0 94 344 56pb 278 00pb 238 31 pb 193 99pb FL4 10 130 53pb 926pb 0 89 AE De 201 61pb 130 53p
280. r PCR en utilisant la polym rase KOD qui permet de diminuer les erreurs au cours de l amplification Pour ceci deux amorces sp cifiques ont t utilis es et auxquelles nous avons rajout deux sites de restriction le site de restriction de Venzyme Sall ajout au niveau de l amorce sens et le site de restriction de BamHI au niveau de l amorce antisens comme suit CRE L 1 Les fragments amplifi s ont t dig r s par Sall BamHI et clon s dans le plasmide pBI 101 2 ouvert par digestion avec Sall BamHI comme pr sent dans la figure III 14 La r ussite de l insertion a t v rifi e par diff rentes r actions de s quen age en utilisant des amorces sp cifiques au promoteur ou au g ne GUS Ces plasmides ont t clon s dans Escherichia coli multipli s et conserv s dans du glyc rol 80 C Sal I BamHI DE Promoteur Dr kon ren gt Figure III 14 Sch ma d une partie du plasmide pBI 102 avec le promoteur de LaSCR2 ins r en cadre avec le g ne rapporteur GUS Nos ter un site de polyadenylation de la nopaline synthase Kan g ne de r sistance la Kanamycine 3 1 2 Pr paration de inoculum bact rien Agrobacterium rhizogenes Les plasmides recombinant pLaSCR2 GUS et les plasmides t moins pBI 101 2 sans promoteur ont t lectropor s dans deux souches d Agrobacterium rhisogenese lectro comp tentes La souche A4T pour la transformation de L albus et la souche A
281. racines lat rales IAA28 AUX IAA Arabidopsis Initiation des racines lat rales SLRI TAA14 AUX IAA Arabidopsis Initiation des racines lat rales KNAT6 KNOX Arabidopsis Initiation des racines lat rales ANRI MADS Arabidopsis Initiation des racines lat rales induites par du nitrate AGL21 MADS Arabidopsis Initiation des racines lat rales D apr s Montiel et al 2004 41 Revue bibliographique IIL 2 3 2 Exemple d une famille de facteurs de transcription famille GRAS La famille GRAS est une importante famille de facteurs de transcription nomm e selon les trois premiers g nes membres identifi s Gibberellin intensive GAI Repressor of gal 3 RGA et Scarecrow SCR Di Laurenzio et al 1996 Peng et al 1997 Silverstone et al 1998 Aujourd hui on reconnait chez Arabidopsis thaliana 33 Prot ines de la famille GRAS dont seulement quelques unes qui ont t caract ris es Lee et al 2008 Selon les tudes phylog n tiques pr c dentes Pysh L et al 1999 et Bolle C 2004 les prot ines GRAS se divisent sept groupes DELLA SCARECROW SCR LATERALE SUPPRESEURE Ls HAIRY MERISTEM HAM PAT1 SHORT ROOT SHR et le groupe de SCARECROW LIKE SCRL9 Les proteines de la famille GRAS sont connues pour leurs r les tr s importants dans plusieurs processus savoir la transduction la maintenance du m rist me et le d veloppement Bolle C 2004 Les prot ines de cette famille sont typiquement compos
282. rant les s quences non transcrites Cette technique permet d avoir de l information ind pendamment de la taille du g nome tudi En comparaison avec le s quen age syst matique le s quen age d EST permet d acc der aux s quences codantes avec un effort et un co t moindres En pratique on clone les ADNc issus de la r tro transcription des ARNm dans des vecteurs plasmidiques de clonage formant ainsi des banques d ADNc Les clones sont partiellement s quenc s sur l une des extr mit s 3 ou 5 Les s quences obtenues sont class es en groupes correspondant au m me g ne on parle de contigs Ainsi on peut obtenir la s quence compl te d un g ne par la combinaison des s quences de plusieurs clones Actuellement la banque de g nes GenBank avec sa division sp ciale pour la banque de donn es EST comprend pr s de 52 millions CEST Tableau I 5 Adams M et al 1991 D autres bases de donn es pour les EST contigs sont disponibles sur le web citons le TIGR gene indices 28 Revue bibliographique http compbio dfci harvard edu tgi tgipage html Lee Y et al 2005 Unigene http www ncbi nlm nih gov unigene Stanton JA et al 2003 et STACK Christoffels A et al 2001 Chez Lupinus albus il existe actuellement 8418 s quences EST disponibles dans GenBank Ces s quences ont t isol es de racines proteoides d velopp es sous stress phosphorique La banque EST du lupin blanc se divise en deux cat
283. rarchique du genre Lupinus a t abord e par plusieurs auteurs moyennant plusieurs techniques mol culaires Ainouche et Bayer 1999 ont utilis les marqueurs d ADN ribosomal ou ITS pour analyser la phylog nie du lupin Kass and Wink 1997 ont choisi de comparer les s quences des r gions ITS et le g ne chloroplastique rbcL Talhinhas et collaborateurs 2003 ont par contre choisi les marqueurs mol culaires AFLP ISSR et RAPD pour tudier la diversit g n tique et la phylog nie de huit esp ces de lupin Naganowska B et al 2003 Naganowska B et al 2006 ont utilis la composition des ADN nucl aires pour aborder la phylog nie du lupin L ensemble de ces travaux ont permis d avoir des r sultats d hi rarchisation similaires ou on observe une claire s paration des esp ces du nouveau monde et celles de l ancien Le travail le plus r cent sur la phylog nie du genre Lupinus a t remarquablement trait par Ainouche et al 2004 L tude a concern 44 esp ces de lupin de l ancien et du nouveau monde Dans ce travail les marqueurs ITS se sont montr s plus informatifs que d autres marqueurs et ont permis de dresser le dendrogramme repr sent en Figure I 6 Lors de cette tude Ainouche 12 propose une hypoth se sur l volution du lupin Revue bibliographique pour laquelle les lupins ont volu en cing lineages A E Chaque lin age repr sente une r gion g ographique d finie A Am rique de
284. re III 19 Partie de ADNc de LaSCRI utilis e dans la construction du vecteur d ARNi Figure IIL 20 Ph notype des plantes LaSCR ARNi et Myo ARNi Figure III 21 Moyennes du nombre longueur et masse des racines transg niques des plantes ARNi du lupin en comparaison avec les plantes Myo t moins Figure IIL 22 Une RT PCR des ARN isol s de plantes SCRi et Myoi transform es par la m thode de trempage racinaire Figure IIL23 RT PCR des ARN isol s de plantes de lupin SCRi et Myoi transform es par la m thode d injection Figure IIL 24 Ph notype des plantes RNAi de Medicago truncatula Figure IIL 25 RT PCR des ARN des plantes LaSCRi de Medicago truncatula Liste des tableaux Tableau I 1 Groupe d esp ces de lupin graines lisses Tableau I 2 Groupe d esp ces de lupin graines rugueuses Tableau I 3 Comparaison de la composition des graines de lupin blanc bleu et jaune Tableau I 4 Exemple de quelques esp ces de plantes dont le g nome a t s quenc Tableau I 5 Nombre d EST disponibles et connus chez quelques esp ces de plantes en comparaison avec Caenorhabditis elegans et Homo sapiens Tableau I 6 Liste de Facteurs de transcription s exprimant au niveau du syst me racinaire Tableau IL 1 Accessions de lupin du Maroc tudi es avec codes et sites de collecte Tableau II 2 Liste des 16 amorces ISSR utilis es dans l tude de la diversit intra et inter sp cifique du lupin marocain Tableau I
285. riables des variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 1 E ACC M CAG 1163 pb 0 235 0 237 43 E ACC M CAG 204 pb 0 236 0 383 2 E ACC M CAG 1126 pb 0 007 0 487 44 E ACC M CAG 204 pb 0 060 0 006 3 EACC M CAG 1031 pb 0 002 0 238 45 E ACC M CAG 195 pb 0 041 0 025 4 E ACC M CAG 975 pb 0 661 0 000 46 E ACC M CAG 189 pb 0 025 0 018 5 EACC M CAG 975 pb 0 235 0 237 47 E ACC M CAG 180 pb 0 135 0 018 6 E ACC M CAG 910 pb 0 025 0 018 48 E ACC M CAG 159 pb 0 594 0 006 7 E ACC M CAG 841 pb 0 235 0 237 49 E ACC M CAG 155 pb 0 016 0 606 8 E ACC M CAG 818 pb 0 060 0 006 50 E ACC M CAT 1459 pb 0 016 0 606 9 EACC M CAG 747 pb 0 002 0 238 51 E ACC M CAT 1390 pb 0 025 0 018 10 E ACC M CAG 721 pb 0 236 0 383 52 E ACC M CAT 1316 pb 0 016 0 606 11 E ACC M CAG 721 pb 0 235 0 237 53 E ACC M CAT 1174 pb 0 235 0 237 12 E ACC M CAG 676 pb 0 060 0 006 54 E ACC M CAT 1111 pb 0 135 0 018 13 E ACC M CAG 626 pb 0 235 0 237 55 E ACC M CAT 1019 pb 0 135 0 018 14 E ACC M CAG 596 pb 0 002 0 238 56 E ACC M CAT 943 pb 0 007 0 487 15 E ACC M CAG 576 pb 0 016 0 606 57 E ACC M CAT 882 pb 0 040 0 003 16 E ACC M CAG 525 pb 0 135 0 018 58 E ACC M CAT 832 pb 0 007 0 487 17 E ACC M CAG 503 pb 0 594 0 006 59 E ACC M CAT 759 pb 0 007 0 487 18 E ACC M CAG 483 pb 0 040 0 003 60 E ACC M CAT 724 pb 0 040 0 003 19 E ACC M CAG 455 pb 0 135 0 018 61 E ACC M CAT 704 pb 0 007 0 166 20 E ACC M CAG 426 pb 0 661 0 000 62
286. rqual pour la transformation de Medicago truncatula Les cellules d A rhizogenese ont t cultiv es sur milieu trypton yeast TY additionn d acetosyringone 100 mM et de glucose 1 Aussi un antibiotique est ajout selon la souche d Agrobacterium utilis e la Rifampicine 100 mg ml pour la souche A4T et la 153 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Streptomycine 50 mg ml pour la souche Arqual Les cellules sont cultiv es pendant 2 jours a 30 C Ces cellules sont imm diatement utilis es pour transformer les racines de L albus ou M truncatula 3 1 3 Test histochimique de l activit 6 glucuronidase GUS 3 1 3 1 Activit du pLaSCR2 GUS au niveau des racines transg niques du lupin blanc 3 1 3 1 a Pr paration et transformation des plantes par injection Les plantes destin es a la transformation g n tique subissent un traitement de pr transformation particulier Les surfaces des graines du lupin sont st rilis es 10 min avec de l thanol 90 et rin es 3 fois l eau distill e st rile Les graines sont ensuite plac es dans de l eau de javel a 10 v v et rinc es 3 fois avec de l eau distill e Les graines sont mises en germination Vobscurit et sur un milieu d agarose 0 6 Apr s que les radicelles aient atteint une longueur de 10 mm les plantules sont transf r es sur de la vermiculite imbib e d eau et laiss es germer a l obscurit et temp rat
287. s Dunn et Gillet 1966 adapt es diff rentes conditions cologiques et pr sentes sur des sols neutres acides Les lupins ont largement t utilis s comme plantes ornementales et dans l alimentation humaine et celle du b tail On reconna t deux groupes majeures qui sont g ographiquement s par s et isol s les esp ces du nouveau monde et les esp ces de l ancien monde Plusieurs centaines d esp ces sont reconnues dans le nouveau monde o elles s tendent de I Alaska jusqu I Argentine Dunn 1984 Seules 12 esp ces sont connues dans le groupe de l ancien monde Ces esp ces sont s par es en deux types esp ces aux graines lisses et d autres aux graines rugueuses Une grande part de la diversit a t largement discut e par Plitmann 1981 Dunn 1984 Planchuelo amp Dunn 1984 et Monteiro amp Gibbs 1986 Les esp ces du nouveau monde pr sentent g n ralement de petites graines lt 60 mg et sont caract ris es par une allogamie Revue bibliographique Les esp ces de l ancien monde ont par contre de large graines gt 60 mg et se caract risent par leur autopollinisation Plitmann 1981 Cowlings ef al 1998 rapporte que c est gr ce aux caract ristiques cit es que les lupins de l ancien monde sont exploit s dans l agriculture L esp ce L mutabulis constitue une exception chez les lupins du nouveau monde avec de large graines et c est pour ceci qu elle a t s lectionn e par les fermiers
288. s Qu ils sachent que j ai beaucoup appris leurs c t s Mes remerciements aux enseignants du LMBM Mr Jamal AURAG Mr Elbekkay BERRAHO Mme Jamila MAATALAH et Mme Ilham BOUHMOUCHE Je remercie particuli rement Mme Bouchra BELKADI pour les encouragements et soutien perp tuels Un merci tout particulier s adresse mes deux coll gues et amis Dr Leila MEDRAOUT et Dr Konate IBRAHIM pour toutes les anecdotes et motions qu on a partag dans la salle BM Je leur souhaite une bonne continuation dans leur vie familiale et professionnelle Je remercie encore une fois Leila MEDRAOUI pour son amiti et aussi d tre toujours pr sente au bon moment Je d sire terminer en remerciant mes cing sources de joie et de force mon p re Mohammed SBABOU ma m re Jmia CHAHBOUNE ma s ur Amira et mes deux fr res Rida et Achraf Merci de m avoir soutenue et encourag pendant les moments de doutes PREAMBULE Le travail r alis s inscrit dans le cadre des projets suivants PROTARS I P5T2 13 IRD Aire D veloppement Project No 01 2 MAR 28 1 USDA NRI projet N 2005 35 100 16007 et USDA ARS Publications SBABOU L BRUNA B MILLER S LIU J BRHADA F FILALI MALTOUF A ALLAN D VANCE C Molecular analysis of white lupin SCARECROW genes expressed in cluster roots Journal of Experimental Botany Vol 61 No 5 pp 1351 1363 2010 2009 Genetic diversity of Moroccan Lupinus germplasm investigated using ISSR and
289. s AFLP a t premi rement optimis chez les plantes g nome de taille petite 5X10 bp a 6X10 bp Ma and Lapitan 1998 Ces marqueurs se sont r v l s tr s informatifs et ont permis de r v ler jusqu 16 fois plus de loci que les marqueurs RFLP Cette technique a t largement utilis e pour la d tection du polymorphisme g n tique et la d termination des liaisons en analysant des individus de populations isol es 18 Revue bibliographique GAATTC NNN NNN TTAA CTTAAG NNN NNN AATT A Etape 1 Digestion EcoRI Msel AATTC NNN NNN T G NNN NNN AAT Etape 2 Ligation aux adaptateurs EcoRI Msel CTOGTAGACTGOGTACC AATTC NNN NINN M TACTCAGGACTICAT CAICTGACGCRATGGTTAR G NNN NNN AATGAGTCCTGAGTAGCAG Etape 3 Pr amplification 1 base s lective memes GACT GCGTACCAATTC NNN NNNTTACTCAGGACTCAT I I M EE ES LE ng _ Etape 4 Amplification 3 bases s lectives UE GACTGCGTACCAATTC NNN NNN TTACTCAGGACTCAT GAGCATCTGACGCATGGGTTAAG NNN NIN AATGAGTCCTGAGTAGCAG ca Figure I 9 Les quatre tapes de la technique AFLP 1 la digestion du g nome par EcoRI Msel 2 Ligation des fragments dig r s par les adaptateurs EcoRI Msel 3 La pr amplification ou PCR 1 4 La PCR2 ou amplification s lective 19 Revue bibliographique Les AFLP ont t largement utilis s dans l tude de plusieurs plantes cultiv es comme le cas de l orge Bec
290. s de l ACP bas e sur les marqueurs ISSR Tableau IL 17 Marqueurs obtenus pour les 23 accessions de L cosentinii tudi s par ISSR Tableau II 18 Marqueurs ISSR g n r s pour les accessions de L cosentinii et par amorce Tableau IL 19 Marqueurs ISSR sp cifiques aux diff rentes accessions de L cosentinii Tableau II 20 Matrice de similarit entre les 22 accessions de L cosentinii sur la base des marqueurs ISSR Tableau IL 21 Marqueurs ISSR sp cifiques pour chaque groupe de L cosentinii Tableau II 22 Information et variabilit des deux axes F1 et F2 Tableau IL 23 Nombre taille et diversit des marqueurs ISSR g n r s par les 8 populations de L luteus Tableau IL 24 Marqueurs ISSR g n r s pour les accessions de L luteus pour chaque amorce Tableau IL 25 Marqueurs ISSR sp cifiques des populations de Lupinus luteus Tableau II 26 Pourcentages de similarit s obtenus entre les populations de L luteus Tableau IL 27 Information diversit et Marqueurs ISSR uniques des sous groupes de L luteus Tableau II 1 Liste des tiquettes contigs utilis es dans cette tude Tableau III 2 Liste des tiquettes singletons Tableau II 3 Liste des marqueurs d expression utilis s dans les filtres ADN Tableau II 4 Comparaison de LaSCR1 et LaSCR2 avec AtSCR sur la base des domaines fonctionnels et de la partie N terminale Tableau II 5 Motifs potentiels pr sents au niveau des prot ines LaSCRI et LaSCR2 Tabl
291. s ef al 1995 ont t choisis dans l tude de la diversit inter sp cifique Le protocole AFLP de base a t adopt apr s une s rie de modifications Les marqueurs ISSR Zietkiewicz et al 1994 ont constitu des marqueurs de choix pour les avantages qu ils pr sentent Aussi ces marqueurs ont t utilis s dans une tude sur la caract risation du lupin Talhinhas 2003 Ces marqueurs ISSR ont permis d avoir une bonne s paration des esp ces de lupin tudi es ainsi que de r v ler un niveau lev de polymorphisme Nous avons donc adopt ce protocole ISSR en effectuant quelques mises au point pour assurer une bonne reproductibilit des r sultats Ces marqueurs ISSR ont servit l tude de la variabilit inter et intra sp cifique du lupin 52 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit N Racheta wabe ad i 5 m A m albus eL luteus aL cosentinii and L angustifolius Figure II 1 Sites de collecte des accessions marocaine de lupin utilis es dans cette tude 53 II 1 Mat riel et m thodes Le lupin au Maroc Structuration de la diversit II 1 1 Pr sentation de la collection Marocaine du lupin utilis e Les chantillons du lupin utilis s dans cette tude comportent 44 accessions sites de collecte avec quatre esp ces de Lupin Tableau II 1 et Figure II 1 L albus repr sent e par 10 accessions L angustifolius par une accession L cosentinii par 24 accession
292. s en absence de phosphore b la g n ration d un profil d expression diff rentiel en condition de P au niveau des racines proteo des des racines normales et des feuilles Les g nes surexprim s sont suppos s tre impliqu s particuli rement dans l acquisition et l assimilation du phosphate inorganique Pi du carbone et des m tabolites secondaires et dans les processus de d veloppement Uhde stone et al 2003 III 2 2 Fonction des g nes L un des soucis majeurs des biologistes aujourd hui est la compr hension de la fonction des g nes Ceci n cessite d abord l identification des g nes gr ce aux progr s de la g nomique structurale et des outils de la bioinformatique N anmoins pour analyser comment l information port e par ces g nes est transcrite r gul e et traduite des techniques li es l ing nierie des plantes s impose En pratique afin de comprendre la fonction dun g ne on manipule l expression de ce g ne L alt ration de la transcription des g nes se fait g n ralement au niveau transcriptionnel mutation des g nes ou post transcriptionnel ARN d interf rence et gr ce l utilisation de la transgen se 32 Revue bibliographique III 2 2 1 La transgen se La transformation g n tique consiste en l introduction de mat riel g n tique tranger un ou plusieurs g nes ou transgenes dans un organisme vivant entrainant la modification du mat riel g n tique de cet organisme organisme g n
293. s et L luteus repr sent e par 9 accessions L chantillonnage de cette collection a t r alis entre 1998 et 1999 par l institut National de la recherche Agronomique sous la direction de Mme Imane thami alami Les graines de certaines accessions ont t achet es comme cit dans le tableau II 1 L chantillonnage des plantes sauvage a port sur des gousses matures Tableau II 1 Liste des diff rents chantillons de lupin du Maroc tudi es avec codes et sites de collecte Esp ce Codes chantillon Site de collecte INRA Utilis s Lupinus 024 Alb01 Souk Larb a albus 028a Alb02 6 Km apr s Bouznika vers Benslimane champ 1 028b Alb03 6 Km apr s Bouznika vers Benslimane champ 2 029 Alb04 1 Km avant Benslimane 030 Alb05 Douar Beni Moussa a Ain Dakhla 031 Alb06 Mekn s 032 Alb07 Mekn s 033 Alb08 El Jadida 034a Alb09 Marrakech 034b Alb10 Marrakech Lupinus 016 Angl 20 Km apr s Kenitra vers Larache angustifolius Lupinus 025 Lutl Souk Larb a luteus 026 Lut2 15 Km avant K nitra sur la route de Souk Larbaa vers K nitra 037 Lut3 Touazite Kasmiine sur la route qui croise 232 5 Km de Sidi Yahya vers Tiflet Graines achet es des r gions cit es 54 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Tableau II 1 Suite Liste des diff rentes accessions de lupin du Maroc tudi es avec code et sites de collecte Esp ce Codes accessions Si
294. s marqueurs AFLP dans les deux axes F1 et F2 de DACP r alis e dans l analyse intersp cifique Contributions Contributions des des variables variables Code Marqueur F1 F2 Code Marqueur F1 F2 252 E ACG M CAT 584 pb 0 040 0 003 294 E ACT M CAC 1895 pb 0 016 0 606 253 E ACG M CAT 563 pb 0 661 0 000 295 E ACT M CAC 1706 pb 0 016 0 606 254 E ACG M CAT 543 pb 0 278 0 321 296 E ACT M CAC 1599 pb 0 025 0 018 255 E ACG M CAT 508 pb 0 135 0 018 297 E ACT M CAC 1460 pb 0 040 0 003 256 E ACG M CAT 489 pb 0 007 0 487 298 E ACT M CAC 1380 pb 0 025 0 018 257 E ACG M CAT 475 pb 0 040 0 003 299 E ACT M CAC 1139 pb 0 135 0 018 258 E ACG M CAT 448 pb 0 025 0 018 300 E ACT M CAC 1043 pb 0 236 0 383 259 E ACG M CAT 432 pb 0 196 0 489 301 E ACT M CAC 886 pb 0 135 0 018 260 E ACG M CAT 417 pb 0 278 0 321 302 E ACT M CAC 809 pb 0 040 0 003 261 E ACG M CAT 405 pb 0 007 0 487 303 E ACT M CAC 739 pb 0 594 0 006 262 E ACG M CAT 399 pb 0 041 0 025 304 E ACT M CAC 659 pb 0 278 0 321 263 E ACG M CAT 384 pb 0 594 0 006 305 E ACT M CAC 603 pb 0 007 0 166 264 E ACG M CAT 367 pb 0 235 0 237 306 E ACT M CAC 575 pb 0 135 0 018 265 E ACG M CAT 353 pb 0 002 0 238 307 E ACT M CAC 544 pb 0 025 0 018 266 E ACG M CAT 345 pb 0 007 0 166 308 E ACT M CAC 513 pb 0 0
295. s ont t extraits purifi s et les inserts ont t isol s par PCR L amplification a t optimis e dans un volume de 100 ul contenant 20 ng d ADN plasmidique tampon PCR 10X Promega 10uM d amorce universelle T3 et 10uM d amorce universelle T7 10mM de dNTP 5 Unit s de Taq polym rase La PCR a t r alis e selon le programme suivant 2 min 95 C 35 cycles de 30 s 95 C suivis de 30 s 55 C puis 2 min a 72 C et avec une tape d longation de 7 min a 72 C Les amplifias sont s par s par lectrophor se sur un gel d agarose 1 et seuls les chantillons pr sentant des bandes uniques et nettes sont maintenus A partir des produits PCR 42 clones ont t pris au hasard et s quenc s afin de v rifier le r sultat de amplification Les produits PCR ou sondes ont t d pos s raison de 0 2 ul et quatre r p titions sur des membranes de Nylon charg es positivement Amersham Hybon Le d p t a t effectu par un automate Q bot Genetix Les membranes ont t d pos es face en haut sur du papier Whatman Whatman Clifton NJ imbib d une solution de d naturation 5 M NaCL et 0 5 M NaOH pendant 10 min et d une solution de neutralisation 1 5 M NaCL 0 5 M Tris HCL PH 7 2 et 1 mM EDTA pendant 5 min Les membranes ont t s ch es et expos es 120 joules cm sous rayons UV cross linker afin de fixer les ADN II 1 1 2 Pr paration des cibles radioactives Les plantes du
296. s pr sentent l avantage d tre ind pendants l environnement d o la possibilit de les caract riser diff rents stades de d veloppement de la plante Ces marqueurs ont t aussi adopt s pour toutes les tudes de g n tique des populations et cologie Haig 1998 pour une revue permettant l analyse de la structure et du niveau de la diversit des populations l laboration d hypoth ses sur le flux des g nes et la s lection des 14 Revue bibliographique esp ces Les marqueurs mol culaires sont actuellement tr s utilis s pour la caract risation des germplasmes et l identification g n tique des esp ces en particulier dans le but de la tra abilit 11 1 1 Les marqueurs RFLP Les marqueurs RFLP ou polymorphisme de longueur des fragments de restrictions constituent des marqueurs mol culaires bas s sur les techniques d hybridation Les RFLP sont les premiers marqueurs mol culaires d velopp s et ont t utilis s en 1980 dans la construction de la carte g n tique humaine Bostein et al 1980 Quelques ann es plus tard ces marqueurs sont adopt s pour la cartographie du g nome v g tal Helentjaris et al 1986 et particuli rement celui du bl Triticum aestivum Chao et al 1989 et Nelson ef al 1995 et Aegilops tauschii Lagudah et al 1991 et Gill B S et al 1993 Cette technique est bas e sur la restriction enzymatique des ADN par des endonucl ases reconnaissant des s quences courtes
297. sant l ARNi en utilisant le syst me GATEWAY Invitrogen 163 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Les domiaines conserv s de la famille GRAS eel eee LHRI VHIID LHRI PFYRE SAW TAA 3 2581 bp 1875 bp 2338 bp Figure III 19 Partie de ADNc de LaSCRI utilis e dans la construction du vecteur d ARNi 4 1 1 b Clonage du fragment LaSCRI1 dans le vecteur Sphellsgate Le fragment de 500 pb de PADNc de LaSCRI a t amplifi par PCR dans un m lange r actionnel de 50 ul contenant 20 ng du plasmide contenant Il ADNc de LaSCR1 tampon 10X pour la PCR additionn de MgCl Prom ga 0 2 mM de dNTP 10 ng de chacune des deux amorces et 1 2 U ul de Taq polym rase La r action PCR a t optimis e selon le programme d amplification suivant 3 min a 94 C et 35 cycles de 1 min 94 C 1 min 55 C et 1 min 72 C et avec une tape d longation de 5 min 72 C Les produits de l amplification sont v rifi s sur gel d agarose 1 Les amplifias sont ensuite soumis une r action de Vent polym risation qui consiste mousser les bouts des fragments amplifi s pour permettre leurs insertions dans le vecteur pENTR Le fragment d ADN ins r est ensuite transf r du pENTR au vecteur Sphellsgate par une r action de recombinaison entre les sites attL1 et attL2 du pENTR et les sites attR1 et attR2 du Sphellsgate L ADN est ins r dans le Sphellsgate en orientations
298. sens et antisens L insertion et l orientation des fragments d ADN dans le Sphellsgate sont v rifi es par des r actions de s quen age en utilisant les amorces HG1236 et HG1237 Le plasmide recombin est ensuite lectropor dans lAgrobacterium rhizogenese A4T pour la transformation du lupin et dans Arqual pour la transformation de Medicago 4 2 Silen age du g ne LaSCR chez L albus 4 2 1 R sultats Le lupin blanc a t transform par lA rhisogenese contenant le vecteur d ARNi pr par en utilisant les deux m thodes de transformation du lupin pr alablement d taill es La 164 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc transformation du lupin par injection des hypocotyles a t r p t e sept fois et la transformation par trempage racinaire a t r p t e 3 fois En parall les des tests t moins ont t r alis s En effet les plantes de lupin t moins ont t transform es par A rhizogenese contenant le vecteur Sphellsgate avec une partie du g ne Myo comme insert 4 2 1 a Analyse morphologique des racines transg niques des mutants LaSCRi La transformation du lupin par A rhizogenese a permis de g n rer des plantes composites avec un syst me racinaire transg nique et une partie a rienne non transg nique Ainsi 5 7 semaines apr s la transformation du lupin les racines transg niques ou racines chevelues racines mergeant du site d injection ou du point de coup
299. silane en essuyant la plaque avec de l thanol et de l eau distill e 3 fois Laisser s cher Traitement de la grande plaque par le sigmacote Dim thyl dichlorosilane Etaler 1ml de sigmacote pur sur toute la plaque avec du sopalin S cher la plaque 56C pendant 30 min Enlever l exc s du sigmacote en essuyant la plaque avec de l eau distill e une fois Laisser s cher 2 Pr paration de la solution d acrylamide 6 M langer 22 5ml d acrylamide 20 7 5 ml de TBE 1X 31 5g d ur e et q s p 75 ml d eau pure st rile Avant de couler le gel ajouter 37ul de TEMED et 1875 ul de persulfate d ammonium Note pr parer la solution d acrylamide 20 avec 19g d acrylamide et lg de bisacrylamide dans 100 ml d eau pure st rile 192 Annexes D sioniser cette solution an ajoutant 2g d Amberlite et agiter pendant 10 min St riliser la solution par filtration Stocker la solution 4C et l obscurit 3 Coulage du gel et migration lectrophor tique Monter les deux plaques en utilisant les espaceurs et les pinces Couler le gel doucement entre les deux plaques tout en vitant la formation de bulles Placer le peigne et maintenir le gel dans une position horizontale Laisser polym riser pendant 2 heures minimum Enlever le peigne et bien rincer les puis avec de l eau distill e st rile Monter les plaques sur le syst me d lectrophor se et bien couvrir les puis avec
300. similarit la plus faible de 74 a t enregistr e entre L cosentinii et L angustifolius Et la similarit la plus lev e a t not e entre L albus et L luteus avec 78 1 Tableau ILS5 Similarit s calcul es entre les quatre esp ces de lupin sur la base des marqueurs ISSR L albus L luteus L angustifolius L cosentinii L albus 100 L luteus 78 1 100 L angustifolius 76 2 77 8 100 L cosentinii 75 4 76 3 74 0 100 11 2 1 2 b Classification hi rarchique La classification hi rarchique en UPGMA Figure II 6 des quatre esp ces de lupin a t g n r e sur la base des distances g n tique de Dice Le r sultat est pr sent dans le dendrogramme suivant Similarit 100 a oo oe albus luteus angustifolius F f Peer cosentinii Figure II 6 Classification en UPGMA des quatre esp ces de lupin sur la base des marqueurs ISSR 73 Biplot axes F1 et F2 62 40 Le lupin au Maroc Structuration de la diversit 6 2 1 e 7 z 9 8 10 3 F 4 L luteus 1 L cosentini 11 F2 30 40 12 i L albus O 17 15 o L angustifolius 18 6 2927 28 32 23 24 31 25 37 ba SR 3g 26 2s 40 3 36 42 41 43 45 46 49 47 50 2 F1 32 00 48 3 2 1 0 1 2 3 Figure IL 7 Analyse en composante principale ACP des quatre esp ces de lupin selon les marqueurs ISSR 1 FL3
301. sp cifiques Les fragments d ADN obtenus sont s par s par lectrophor se sur gel d agarose et ensuite transf r s sur une membrane selon la proc dure de southern blot La taille des fragments est d termin e par hybridation des membranes avec des sondes fragments d ADN marqu es Figure I 7 Les sondes peuvent tre des s quences d ADN courtes et simples de faibles copies d ADN g nomique ou encore des clones d ADN compl mentaire Les mutations dans le g nome entra nent la modification de certains sites de restriction d o la g n ration de diff rents profils de restriction entre diff rents chantillons Chaque fragment de taille diff rente engendr est consid r comme all le et peut tre utilis en analyse g n tique Cas Normal Sites de restrictions k t Digestion S paration me Mutation qui fait perdre le site de striction Cas de Maladie gt gt 5 c trophor ie sthern Figure I 7 Sch ma pr sentant les tapes de la technique RFLP sur deux chantillons normale et maladie 15 Revue bibliographique 17 1 2 Les marqueurs RAPD L amplification des ADN par les marqueurs RAPD ou Random amplified polymorhism DNA Williams ef al 1990 Welsh and Mac Clelland 1991 constitue amplification de s quences s lectionn es au hasard dans le g nome par l utilisation d amorces non sp cifiques Sa principale variante consiste utiliser comme amorce un s
302. sphore P l absence d azote N et l absence de fer Fe annexe III 2 Les g nes ont t consid r s comme induits ou inhib s des valeurs de rapport d intensit s respectivement sup rieures 2 ou inf rieures 0 5 La fr quence des g nes induits et inhib s par organe et selon la condition de stress est r sum e dans la Figure IIL 2 On remarque que dans les conditions de carences phosphorique d azote et de fer l expression de plusieurs g nes est inhib e au niveau des racines Au niveau des feuilles trois g nes ont t surexprim s en absence de phosphore 90 F E491_F et 285_F et un seul g ne stimul en absence de fer 90_F Au niveau des racines proteo des d velopp es en conditions de carences d azote huit g nes ont t surexprim s savoir E080 880 _F YPR_005_FI1 _092 ab1 YPR_008_A08 _054 ab1 YPR_003_A05 _033abl YPR_002_D11 _090 ab1 ES98_F et E771_F en condition de carence en fer 41 g nes ont t surexprim s 888_F YPR_O11_E05 _036 ab1 YPR_OOI_GI1 _084 YPR_013_H02 _016 abl EO80_F E647_F YPR_005_E05 _036 ab1 YPR_008_A04 _022 ab1 889_F 783_F YPR_002_H07 _060ab1 YPR_009_ COI _002 ab1 YPR_OOS_C12 _087 ab1 YPR_005_F11 _092 ab1 YPR_OO8_A08 _054 ab1 YPR_009_G07_052 ab1 625_F YPR_O10_HO8 _073 ab1 YPR_O03_A05 _033ab1 YPR_002_D11 _090 ab1 365_F 931_F 93_F E385_F E392_F 735 F 1182_F 1358_F 137_F 1425_F E529_F E541
303. t Cap Figure I 15 a Repr sentation sch matique de l anatomie de la racine d Arabidopsis thaliana en coupe longitudinale et transversale b repr sentation sch matique de l anatomie de la racine du mutant SCR d Arabidopsis thaliana en coupe longitudinale et transversale c Les deux divisions asym triques des cellules initiales donnant naissance au cortex endoderme In initial Da cellule fille E endoderme C cortex Di Laurenzio L 1996 Malamy J et Benfey P 1997 43 Revue bibliographique Le motif PFYRE moins conserv que les motifs VHIID et SAW est reconnaissable par les r sidus P F Y R E Pro Phe Tyr Arg Glu et avec le r sidu P qui est le plus conserv Le motif SAW est reconnaissable par trois pairs de r sidus tr s conserv s R E Arg Glu W G Trp Gly and W W Trp Trp Les prot ines GRAS d crites au niveau physiologique et mol culaire sont tr s importantes dans les m canismes de r gulation chez les plantes III 2 3 2a Le facteur de transcription SCARECROW SCR Scarecrow est un facteur de transcription appartenant la famille de GRAS et aussi le premier g ne identifi dans ce groupe Ce facteur de transcription est impliqu dans la r gulation de la division asym trique des cellules initiales au niveau de la racine Le g ne SCR a t pr alablement tudi chez Arabidopsis thaliana Di laurenzio 1996 Sabatini S et al 2003 J E Malamy and P N Benfey 1997 Cui H et al 2007 Or
304. t l expression du SCR chez les autres esp ces de lupin 175 R f rences bibliographiques REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 176 R f rences bibliographiques Adams MD Kelley JM Gocayne JD et al 1991 Complementary DNA sequencing expressed sequence tags and human genome project Science 252 5013 1651 6 Ainouche A K and Bayer R j 1999 Phylogenetic relationships in Lupinus Fabaceae papilionoideae based on internal transcribed spacer sequences ITS of nuclear ribosomal DNA American Journal of Botany 86 4 590 607 Ainouche A K Bayer R J 2000 Genetic evidence supports the new anatolian lupine accession Lupinus anatolicus as an Old World roughseeded lupine Section Scabrispermae related to L pilosus Fol Geobot 35 83 95 Ainouche A K Bayer R J Cubas P MissetM T 2003 Phylogenetic relationships within tribe Genisteae Papilionoideae with special reference to genus Ulex In Klitgaard B B Bruneau A eds Advances in Legume systematics part 10 Higher Level Systematics Royal Botanic Gardens Kew pp 239 252 Ainouche A Bayer R J and Misset M T 2004 Molecular phylogeny diversification and character evolution in Lupinus Fabaceae with special attention to Mediterranean and African lupines Plant Syst Evol 246 211 222 Anderson JA Churchill GA Sutrique JE Tanksley SD and Sorrells ME 1993 Optimizing parental selection for genetic linkage maps Genome 36 181 186 Arab
305. t les cinq domaines fonctionnels LHRI LHRU VHIID PFYRE et SAW caract ristiques des g nes de la famille de GRAS Une tude phylog n tique a t r alis e pour comparer les genes SCR du lupin aux diff rents g nes de la famille de GRAS 31 et aux autres g nes SCR connus Cette analyse montre l emplacement de LaSCRI et LaSCR2 dans le groupe SCR L ensemble de ces r sultats nous permet de d finir les deux g nes SCR du lupin LaSCRI et LaSCR2 comme tant deux orthologues de AtSCR Partie 2 Expression du g ne Scarecrow au niveau du syst me racinaire du lupin blanc 2 1 Mat riel v g tal 2 1 1 Culture des plantes syst me hydroponique Des plantes de L albus ont t cultiv es en conditions de carence phosphorique P et en conditions normales P dans un syst me hydroponique Ce syst me permet aux plantes d tre en permanence en contact avec la solution nutritive Les plantes sont r colt es 14 jours apr s mergence Les feuilles les racines normales et les racines proteo des sont collect es et mises dans l azote liquide puis stock es 80 C Aussi plusieurs zones des racines proteo des ont t r colt es savoir la zone 1 la zone 2 la zone 3 la zone 4 et la zone 5 Ces zones correspondent aux diff rents stades de d veloppement des racines proteo des La Zone 1 d finit la pointe racinaire la zone 2 d finit l mergence des primordia des radicelles partir de l endoderme
306. tc L importance des phosphates et le stress phosphorique sera trait e en d tail dans la partie IV 2 ii D autres facteurs li s la topographie altitude pente gravite etc sont aussi importants Un des stress tr s limitant pour les plantes tant le stress hydrique du fait que la s cheresse est l un des probl mes majeurs de l agriculture dans le monde En effet quatre dixi mes des terrains agricoles dans le mondes se situent dans des r gions arides semi arides D autres r gions agricoles re oivent des quantit s d eau tr s faibles n cessitant une irrigation continue pour maintenir les cultures On se trouve donc dans la n cessit de d velopper des cultures avec une faible exigence en eau et un rendement acceptable 46 Revue bibliographique Les plantes mod les pour l adaptation au stress hydrique ou encore plantes reviviscentes sont des plantes capables de survivre dans les conditions de s cheresse extr me Ces plantes sont capables de d velopper des m canismes d adaptations physiologiques et mol culaires IV 2 Le lupins blanc plante mod le pour l tude de l adaptation au stress phosphorique Le phosphore est l un des six macronutriments essentiels pour les plantes savoir l azote N le potassium K le calcium Ca le magn sium Mg et le soufre S Le phosphore joue un r le important dans plusieurs processus tels que la photosynth se la r gulation des enzymes la synth se des acides nucl iques
307. te de collecte INRA Utilis s Lupinus 039 Lut05 Sal Douar Zriwil luteus 040 Lut06 R gion de khenifra sur la route de Tiflet vers Sidi Abderrazek Sidi Ammar 041a Lut07 Khemisset A Sidi Allal M ssedar Sebt Ait Abou champ 1 041b Lut08 Khemisset A Sidi Allal M ssedar Sebt Ait Abou champ 2 042 Lut09 Ouazzane sur la route d Ouazzane vers Ain Dfali Lupinus 001 Cos01 Rabat R serve naturelle ceinture verte cosentinii 002 Cos02 Rabat Hay Riad sur la grande route avant le parc zoologique 003 Cos03 Rabat l int rieur de Hay Riad 004 Cos04 Sur la route Rabat vers Sidi Yahya Za r 005 Cos05 De Rabat sur P2 vers K nitra au bord de la route 006 Cos06 La sortie de Kenitra vers Rabat 007 Cos07 Sur Autoroute Rabat K nitra 008 Cos08 Sidi Ayach Kenitra champ 1 009 Cos09 Sidi Ayach Kenitra champ 2 010 Cos10 Sidi Ayach Kenitra champ 3 011 Cos11 15 Km avant Kenitra sur la route de Souk Larb a vers Kenitra 012 Cos12 Oued Yquem champ 1 013 Cos13 Oued Yquem champ 2 014 Cos14 L hippodrome du prince h ritier Sidi Mohamed 017 Cos15 10 km de Kenitra vers Larach 018 Cos16 T mara ceinture verte 019 Cos17 Hay Menzah ceinture verte champ 1 020 Cos18 Hay Menzah ceinture verte champ 2 021 Cos19 Hay Menzah ceinture verte champ 3 022 Cos20 D but Autoroute Rabat vers casa 027 Cos21 10 km de Rabat vers Casablanca sur Auto route 035 Cos22 30 km de Rabat vers Casablanca sur Auto route 036 Cos23 Mohammedia 55 Le lupin
308. te des amorces utilis es Amorce S quence 5 3 T3 AATTAACCCTCACTAAAGGG T7 CATTATGCTGAGTGATATCCCG SCRF CAATGTGCTGAAGCAGTTTCAGC SCRFF GTAATGCTGCCACTCAAGCCAGC SCRF1 GTGCTAATGTTGAGGTGGCTG SCRF2 GCACACTCACAGTCAGAAGC SCRF5 GGAGGAGAGGTGAATTTATTAG SCRF6 CTCACTCACCTTGGCTTCTCT SCRF7 GATCTCCCATATCACCCACCGTG SCRF8 GATATGTCTATGAGTGTATGG SCRRI1 CCACCATCAGGAAACTGATCAC SCRR2 GGAATGTTGTAACCAACCAATGGAC SCRR4 GCTCATGTCCTGCTCTACCACCG SCRRS GAGGCACTAGCTACTAGCTAC LS01 CACCAAGCTGTTGCTGTCCATTGG HG1236 TTCGCAACACCCTTCCTCTA HG1237 TTCGTCTTACACATCACTTGTCA Annexes 232
309. tendance ros tre Figure I 1b selon la concentration en alcalo des Ses graines sont les plus larges graines des lupins avec 8 12 mm de diam tre 10 14 mm de long et 3 5 mm d paisseur La culture des lupins blanc pour la consommation date de l poque pr romaine et le temps des grecques Gladstones 1970 Hondelmann 1984 et les vari t s L albus var albus caract ris es par de faibles taux d alcalo des et une maturit pr coce ont t d velopp es en Europe du nord apr s la seconde guerre mondiale Hackbarth and Troll 1956 De nos jours le lupin blanc est cultiv dans plusieurs pays pour l alimentation et aussi comme plante ornementale Revue bibliographique Les lupins blancs sauvages L albus var graecus pr sentent des graines et gousses plus petites que celles des vari t s albus La vari t graecus est tr s rare aux balkan et a probablement introgress avec la var albus au centre des les grecques o on rencontre des types interm diaires Cowling 1986 Simpson 1986 Au Maroc on rencontre le lupin blanc sur des sols sableux et sablo limoneux de type acide ou proche de la neutralit Graines de Lupinus albus Figure I 1 Lupinus albus a plante avec feuilles fleurs blanches et gousse b graines Unit 0 5 cm 1 3 2 Lupinus cosentinii Le lupin violet ou Lupinus cosentinii est l une des esp ces de l ancien monde dont le nombre de chromosomes est le plus faible parmi ce groupe ave
310. tional factor and ERF Contig 165 37_F CA410119 285_F CA410024 pfam_AP2_AP2 domain Contig358 405_F CA410142 739_F CA410472 53 F CA410272 UniRef100_Q9M4Y9 AP2 related transcription factor 86_F CA410601 Mesembryanthemum crystallinum 88_F CA410621 Contig258 E137_F CA410862 Homeobox Contig390 E560_F CA411265 DEAD DEAH box helicase N terminal 118 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Tableau III 1 suite Liste des tiquettes contigs utilis es dans cette tude et non encore d pos es dans la banque de g ne Contig Code ESTs Annotation Contig383 YPR_005_E05_036 ab1 YPR_009_H08_064 ab1 YPR_009_D11_090 ab1 Methyl CpG binding YPR_008_A08_054 ab1 YPR_008_A07_050 ab1 YPR_003_A05_033 ab1 Contig421 YPR_ 010 _E03_020 ab1 YPR_008_D10_079 ab1 YPR_013_F04_031 abl YPR_013_E04_023 ab1 YPR_013_E07_051 abl YPR_001_B03_025 ab1 YPR_008_E12_088 ab1 adi FER OOO BITOR ab US YPR_006_D12_095 ab1 YPR_002_C05_034 ab1 YPR_007_F07_059 ab1 YPR_010_B03_026 ab1 YPR_002_F06_047 ab1 YPR_009_G08_056 ab1 YPR_007_H10_080 ab1 YPR_001_G03_020 ab1 YPR_006_A05_034 ab1 Contig331 YPR_008_A04_022 ab1 YPR_010_A05_034 abl Basic leucine zipper YPR_009_CO1_002 ab1 YPR_008_C12_087 ab1 Contig276 YPR_009_G07_052 ab1 YPR_010_H08_073 ab1 Contig216 YPR_002_D11_090 ab1 UniRef100_Q2QWI0 RNA polymerase YPR_003_E10_071 ab1 Rpb3 Rpb11 dim Contig415 YPR_006_G10_081 ab1 YPR_010_F10_080 ab1 YPR_00
311. tipule que plus deux entit s sont similaires plus elles ont de chance faire partie du m me groupe Pour r aliser un bon clustering nous devons choisir le coefficient ou indice de similarit ad quat Celui ci d pend essentiellement du type de donn es a analyser On distingue ainsi les indices de similarit s binaires traitant les donn es discr tes de type pr sence absence et les indices de similarit s quantitatifs Ces indices sont aussi Class s selon qu ils traitent ou pas la co occurrence du z ro ou double absence comme tant une ressemblance On parle ainsi d indices sym triques pour le cas des indices qui consid rent la double absence comme de la double pr sence par opposition aux autres indices asym triques a Indices de similarit s binaires sym triques L indice repr sentant cette cat gorie est l indice de SOKAL et MICHENER qui repr sente le nombre de pr sences ou d absences simultan es divis par le nombre total de relev s b Indices de similarit s binaires asym triques Les indices repr sentant cette cat gorie sont l indice de Jaccard et Sorensen L indice de JACARD le plus utilis repr sente le nombre de cas de pr sences simultan es des deux chantillons consid r s divis par le nombre de cas o au moins l un des deux est pr sent L indice de SORENSEN est assez similaire l indice de JACARD avec une pond ration par 2 du terme de co occurrence A partir des indices de similarit s bin
312. tivit biologique d une cellule ou d un tissu et aussi de la combinaison de la fonction de DARN prot ines et m tabolites Figure I 11 Le g nome tant identique au niveau de toutes les cellules d un organisme il est consid r comme le support de l information de base Le g nome avec ses s quences codantes et non codantes est tr s complexe et nous offre beaucoup d informations utilis es plusieurs niveaux a savoir en volution diversit etc L ensemble des r gions de l ADN transcrites en ARN constitue le transcriptome Le transcriptome comprend donc toutes les s quences d ADN formant les composants de l ARN d un organisme Sachant qu une partie seulement de l information contenue au niveau de I ADN est transcrite en ARN le transcriptome est moins compliqu que le g nome Les produits de la traduction du transcriptome constituent le prot ome Sachant que seule une partie des ARN est traduite en prot ines le prot ome est moins compliqu que le transcriptome N anmoins des modifications post traductionnelle peuvent augmenter la complexit du prot ome Les prot ines dont le r le est la synth se des m tabolites primaires et secondaires forment donc le m tabolome L ensemble de ces modalit s de mesures ont pour objectif la quantification des diff rents processus biologiques et l am lioration de notre compr hension de la fonction des g nes et prot ines ainsi que leurs interactions G nome 4 gt ADN lt Transcript
313. ubtropicales des r gions centrales du sud d Am rique avec quelques repr sentant dans le sud est des Etats Unis Dunn 1984 Planchuelo et Dunn 1984 Monteiro et Gibbs 1986 Revue bibliographique Tableau I 1 Groupe d esp ces de lupin graines lisses avec leurs synonymes botanique noms vernaculaires et nombre de chromosomes Esp ce Synonyme botanique Nom vernaculaire Nombre de chromosomes Graine lisse L albus L Var albus Gladstone Var graecus Boiss et Sprun Gladstone L angustifolius L L luteus L L hispanicus Boiss et reut Subsp Hispanicus subsp Bicolor Merino gladst L micranthus Guss L termis Forsk L sativus Gater L varius gaertn L prolifer desr L hirsitus Eichw L albus L L albus subsp albus L albus L var termis Forsk Alef L albus L subsp Termis Forsk Caruel L albus L subsp Graecus Boiss et Spruner Franco et P Silva L graecus Boiss Et Sprun L jugoslavicus Kazimierski et Nowacki L vavilovi Atabek Et Maissurjan L varius L L sylvestris Lam L linifolius Roth L reticulatus Desv L leucospermus boiss L philistaeus Boiss L cryptanthus Shuttlew Ex Campb L opsianthus Atabek L odoratus L luteus var bicolor Merino L hispanicus var bicolor Merino L bicolor Merino Rothm L rothmaleri Klink L versicolor cabal L hirsutus L Francais lupin blanc Anglais white
314. udhi S Nandi J C Xu A Parco D C Yang and N Huang 1997 Polymorphism distribution and segregation of AFLP markers in a doubled haploid rice population Theor Appl Genet 94 39 45 Malamy J E and Benfey P N 1997 Organization and cell differentiation in lateral roots of Arabidopsis thaliana Development 124 33 44 Malboobi MA and Lefebvre DD 1995 Isolation of cDNA clones of genes with altered expression levels in phosphate starved Brassica nigra suspension cells Plant Mol Biol 28 859 870 Marschner H R mheld V Horst W J amp Martin P 1986 Root induced changes in the rhizosphere importance for mineral nutrition of plants Z Pflanzenern hr Bodenkd 149 441 456 Matsuzaki M Misumi O Shin I T ef al 2004 Genome sequence of the ultrasmall unicellular red alga Cyanidioschyzon merolae 10D Nature 428 6983 653 7 Maughan P J M A Saghai Maroof G R Buss and G M Huestis 1996 Amplifed fragment length polymorphism AFLP in soybean species diversity inheritance and near isogenic analysis Theor Appl Genet 93 392 401 Miller SS Liu JQ Allan DL Menzhuber CJ Fedorova M Vance CP 2001 Molecular control of acid phosphatase secretion into the rhizosphere of proteoid roots from phosphorus stressed white lupin Plant Physiol 127 594 606 Mission J Raghothama K G Jain A Jouhet J Block M A Bligny R ef al 2005 A genome wide transcriptional analysis using Arabidopsis thalia
315. uminium Al Uhde stone et al 2005 Actuellement on utilise le gene LaMATE comme marqueur g n tique des racines proteoides d velopp es en absence de phosphore Plusieurs travaux ont montr que les racines proteoides d velopp es en carence phosphorique synth tisent dans la rhizosphere un ensemble de prot ines impliqu es dans l acquisition du Pi du sol On note l acide phosphatase LaAP Miller S et al 2001 les transporteurs de phosphate les phosphoenolpyruvate carboxylases PEP Goldstein 1992 Malboobi and Lefebvre 1995 Johnson et al 1996 Neumann et al 1999 et malate dehydrogenase Uhde stone et al 2003 51 CHAPITRE IT Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Le lupin au Maroc Structuration de la diversit INTRODUCTION L tude de la diversit du genre Lupinus a t abord e dans quelques travaux ant rieures Ainouche et al 1999 2000 2003 2004 et Talhinhas 2003 N anmoins la diversit g n tique du lupin marocain n a jusqu pr sent fait l objet d aucune tude Le pr sent travail constitue la premi re approche de la variabilit g n tique des populations du lupin marocain Pour r aliser cette tude nous avons choisi trois marqueurs mol culaires Les marqueurs RAPD Williams ef al 1990 constituent l un des premiers marqueurs mol culaires utilis s et qui ont ainsi largement servi dans les tudes de la diversit des plantes Les marqueurs AFLP Vo
316. un m canisme par lequel l expression de g nes est inhib e au stade de la traduction L ARNi est une partie vitale de la r ponse immunitaire contre les virus et autre mat riel g n tique tranger particuli rement chez les plantes il pr vient contre l auto propagation par les transposons L ARNi a t d couvert par l quipe de Rich Jorgensen en essayant de modifier la couleur de la fleur p tunia Ces chercheurs ont introduit une copie suppl mentaire d un g ne codant pour la chalcone synthase une enzyme cl pour la pigmentation des fleurs p tunia normalement rose ou violettes La surexpression du g ne t suppos e engendrer des fleurs sombres mais au lieu de cela ces chercheurs ont obtenu des fleurs moins pigment es enti rement ou partiellement blanches Jorgensen et al 1996 Quelques ann es apr s d autres travaux ont t men s par l quipe de Guo et Kemphues sur le verre Caenorhabditis elegans L injection de l ARN antisens au niveau du C elegans engendre la l talit embryonnaire un ph notype identique celui observ en cas d injection de DARN sens chez le t moin Fire ef al 1998 Ce paradoxe rappelle les r sultats obtenus chez le p tunia et r solu par Fire et Mello travail pour lequel ils ont re u le Prix Nobel en biologie en 2006 En effet ces deux chercheurs avancent que l introduction des ARN en sens ou anti sens entra ne l inhibition de la fonction de g ne Ils montrent aussi que l introduction simulta
317. ur de LaSCR2 dirig e par le g ne rapporteur GUS au niveau des racines de Medicago pr sente un profil tr s similaire celui obtenu pour le lupin La coloration GUS a t tr s marqu e au niveau de l endoderme des racines primaires et aussi des racines lat rales Figure III 17 Le transcrit de LaSCR2 a aussi t observ au niveau des m rist mes des racines lat rales 158 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc Figure III 17 Localisation de l expression du SCR dirig e par GUS au niveau des racines de Medicago truncatula a Expression au niveau de l endoderme travers le centre quiescent b Racine t moin c Coloration de GUS au niveau de l endoderme en anneau coupe transversale d Expression du transcrit de SCR au niveau des initiales des racines lat rales e et f Localisation du transcrit de SCR au niveau des racines lat rales 159 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc 3 2 L hybridation in situ du LaSCR1 chez le lupin blanc Une hybridation in situ a t perform e afin de d terminer la localisation cellulaire du transcrit de SCR au niveau des pointes racinaires du lupin blanc 3 2 1 Traitement des tissus Des racines du lupin cultiv dans le sable et selon les conditions d crites pr c demment sont collect es Des fragments de 0 3 0 5 mm de la pointe racinaire sont coup s avec un scalpel Les tissus sont fix s dans une s
318. ure sont collect es La transformation du lupin par A rhizogenese h bergeant le vecteur LaSCR ARNi en utilisant la technique de trempage racinaire se traduit par un ph notype visible diff rent de celui des plantes t moins Figure III 20 Les plantes silen es LaSCRi montrent une diminution au niveau de la masse totale des racines chevelues en comparaison avec les plantes t moins Myoi Pour chaque plante SCRi et Myoi le nombre la masse et la longueur des racines chevelues ont t mesur s La comparaison des plantes SCRi et t moins a t r alis e par le calcul de la moyenne de chacune des trois mesures La figure III 21 r sume la combinaison de l ensemble des exp riences de transformation r alis es On remarque une diminution significative du nombre de la longueur et de la masse des racines chevelues au niveau des plantes LaSCRi en comparaison avec les plantes t moins 4 2 1 b Mesure de l expression du LaSCR au niveau des racines transg niques Afin de v rifier si la transformation du lupin par LaSCRi a engendr la r duction de l expression du g ne SCR une RT PCR a t r alis e partir des racines transg niques Figure III 22 Pour ceci les ARN ont t isol s partir de chaque racine transg nique ARNi et ont t reversement transcrits Une amplification a t r alis e moyennant des amorces sp cifiques au dsRED une partie du vecteur Sphellsgate pour v rifier la r ussite de transformation g n t
319. ure III 10 montre qu il n y a aucune diff rence d expression de LaSCRI et LaSCR2 dans les conditions de culture en absence ou en pr sence de phosphore On note aussi clairement que l expression de LaSCRI est plus lev e que celle de LaSCR2 Au niveau des feuilles on remarque que l expression des deux g nes est faible nulle Au niveau des diff rentes zones des racines proteoides on note une expression diff rentielle En effet au niveau des zones avec une activit m rist matique zone 1 zone 2 et zone 3 l expression des deux g nes est importante Par contre on remarque une diminution de cette expression au niveau des racines proteoides d velopp es zone 5 Cette expression diff rentielle est li e au r le du SCR dans la r gulation de la division asym trique Au niveau des racines normales on note que l expression de LaSCRI est plus importante en conditions de carence phosphorique 146 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc P P Pr Pr Dm Type d organe Traitement LaSCR1 500 bp LaSCR2 650 bp Figure IIL 10 Expression de LaSCR1 et LaSCR2 au niveau des feuilles F des racines normales RN et des cinq zones des racines proteo des Pr en conditions de carence phosphorique P et en conditions normales P Le marqueur Tubuline tub est utilis comme transcrit invariant 2 2 2 Mesure de l expression par la PCR en temps r el Q PCR Pour optimiser la
320. ure ambiante pendant 3 jours Les plantules sont ensuite mises cro tre 2 3 jours de plus en pr sence de la lumi re et 4 C Ainsi les plantules deviennent pr tes la transformation g n tique Une solution d Agrobacterium la culture d A r avec le vecteur recombinant d int r t dilu e dans 2ml d une solution de phosphate buffered saline PBS est inject e au niveau de l hypocotyle des plantules pr par es l aide d une aiguille de ponction de 25ga Les plantes sont ensuite mises en culture dans la chambre de culture selon les conditions d crites pr c demment Apr s 3 semaines de culture les racines non transform es en dehors des sites d injection sont enlev es et les plantes sont remises dans une vermiculite fraiche en s assurant que les racines transg niques sont bien couvertes Apr s 2 semaines les plantes sont r colt es et seules les racines chevelues hairy roots mergeant des points d injections sont collect es 3 1 3 1 b Pr paration et transformation des plantes par trempage racinaire Les gaines du lupin destin es la transformation par trempage racinaire sont aussi trait es a l thanol chlore et mises en germination sur un milieu d agarose comme d crit pr c demment Les plantules avec des radicelles de 10 mm de long sont transform es dans des conditions 154 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc st riles Ainsi 3 mm des pointes des radice
321. urs pr sentent des limites majeures en comparaison avec les marqueurs mol culaires Les marqueurs morphologiques tant polymorphes peuvent interf rer avec d autres caract res et sont parfois influenc s par le milieu Les marqueurs biochimiques quant eux pr sentent l inconv nient d tre faiblement polymorphes Les marqueurs mol culaires dont le nombre ne cesse de cro tre avec le d veloppement des techniques de biologie mol culaire depuis les RFLP RAPD AFLP SSR ISSR jusqu aux SNP ont fait un large consensus en mati re de g n tique selon leurs avantages respectifs L utilisation de ces marqueurs est bas e sur la notion du bon marqueur mol culaire qui doit tre Polymorphe codominant non pistatique et ind pendant du milieu Le choix d un bon marqueur par le chercheur est aussi bas sur la technicit et le co t de l exp rience qui doivent tre abordables en vue d une manipulation grande chelle Les marqueurs mol culaires ont t largement utilis s chez les animaux et les plantes pour des tudes de base ainsi qu appliqu es L une des utilisations majeurs des marqueurs mol culaires tant l laboration physique et g n tique des cartes chromosomiques Ces marqueurs ont contribu aux travaux d am lioration des plantes Lefort Buson ef al 1990a et 1990b en assurant une s lection indirecte moyennant des marqueurs mol culaires li s des caract res d int r t ou quantitative traits loci QTL Ces marqueur
322. us L cosentinii et L luteus Dans ce volet de travail les marqueurs ISSR ont t hautement informatifs de part les valeurs de l indice de diversit ou PIC calcul es Ces valeurs ont t proches de 1 avec 0 927 pour L albus 0 94 pour L luteus et de 0 956 pour L cosentinii Le nombre de bandes ISSR g n r es a t important On note 358 fragments ISSR r v l s chez L luteus 402 chez L albus et 547 chez L cosentinii Le niveau de variabilit g n tique des trois esp ces tudi es sur la base des marqueurs ISSR s est av r tr s important En effet le taux de polymorphisme r v l tait tr s lev avec 100 de polymorphisme chez L luteus et L cosentinii et 97 7 chez L albus Chacune des trois esp ces de lupin a t caract ris e par des marqueurs ISSR uniques A un niveau plus fin d analyse chaque population repr sentant une r gion g ographique donn e a t caract ris e par au moins un marqueur sp cifique Ainsi chaque population peut tre consider e comme une entit conserv e Au sein de chaque esp ce une comparaison des diff rentes populations sur la base de leurs similarit s a t effectu e selon l indice de diversit de Dice Les distances g n tiques entre les populations tudi es ont t valu es a partir des pourcentages de similarit s calcul s A la lumi re de ces r sultats une classification hi rarchique ainsi qu une repr sentation tridimensionnelle ont t
323. usieurs esp ces citons le cas du Mais Kantety R ef al 1995 du riz Joshi et al 2000 des bananes Godwin D et al 1997 la pomme de terre Huang amp Sun 2000 du Sorgho Yang W et al 1996 et du lupin Talhinhas P ef al 2003 Les ISSR ont t tr s int ressant pour l identification de certains cultivars comme dans le cas du chrysanthemun Wolff K et al 1995 et encore pour la d termination de l origine g nomique de certaines esp ces comme c est le cas de l leusine Eleusine corocana Ces marqueurs ont contribu l valuation de la diversit g n tique chez le genre Lupinus et ont permis une s paration claire des esp ces du nouveau et de l ancien monde Talhinhas P ef al 2003 11 1 4 Les marqueurs AFLP La technique AFLP Amplified fragments length polymorphism est une variante de la PCR d velopp e en 1995 par Vos et collaborateurs Cette technique est bas e sur la d tection par des amplifications s lectives de fragments d ADN g nomique dig r s Les ADN g nomique sont doublement dig r s par des endonucleases et les fragments obtenus sont sujet une ligation avec des adaptateurs sp cifiques Les produits de la ligation sont ensuite amplifi s s lectivement moyennant des amorces compl mentaires aux adaptateurs utilis s Figure I 9 Les produits de la PCR sont s par s par lectrophor se sur gel de polyacrylamide d natur et r v l s par radiographie ou au nitrate d argent Le Kit de
324. usieurs fragments en communs N anmoins l exception de l accession Cos03 toutes les autres accessions ont t caract ris es par au moins un marqueur sp cifique Le nombre des marqueurs sp cifiques a t variable d une accession une autre et allait de 1 Cos15 Cos02 Cos04 et Cos22 7 Cos09 Tableau IL 19 Tableau IL 17 Marqueurs obtenus pour les 23 accessions de L cosentinii tudi s par les 15 amorces ISSR Amorce Marqueurs Taille des Marqueurs PIC g n r s ins ee polymorphes Fl 34 975 3846 34 0 95 F2 34 821 72 115 16 34 0 95 F3 31 1111 164 83 31 0 95 F4 44 2164 174 46 44 0 97 FLI 51 1482 115 53 SI 0 96 FL2 40 1696 111 14 40 0 96 FL3 43 1773 125 37 43 0 96 FL4 26 639 53 99 88 26 0 94 FLS 40 800 32 116 26 40 0 96 FL6 35 896 37 110 00 35 0 96 FL7 42 1826 108 33 42 0 96 FL8 32 1228 144 11 32 0 95 FL9 36 1095 100 17 36 0 96 FLIO 34 1183 150 50 34 0 96 FLI1 25 598 19 136 29 25 0 95 Total 547 99 88 1826 547 0 956 0 0073 95 Tableau IL 18 Marqueurs ISSR g n r s pour les accessions de L cosentinii et par amorce Le lupin au Maroc Structuration de la diversit Amorce Nombre de marqueurs g n r s ISSR Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos Cos 10 15 16 17 03 21 07 02 05 23 18 20 12 04 24 2
325. xpos es aux crans d intensification contenant du phosphore pendant 4 jours temp rature ambiante Les crans de phosphore sont scann s et les images trait es par le programme 124 Stress abiotique et facteurs de transcription chez le lupin blanc ImageQuant Les points obtenus ou spots sont rep r s et convertis en valeurs num riques pour quantifier l expression des g nes Les r sultats bruts sont pr sent s sous forme de fichier Excel III 1 2 R sultats et discussion Les r sultats obtenus sont organis s en s parant les transcrits invariants ou houskeeping genes Ubiquitine ou Alphatubuline les g nes expression connue Mate Cytokinine oxidase et les g nes dont on veut tudier l expression Le r sultat des exp riences est ensuite normalis afin de minorer les variations artefactuelles des intensit s Ceci consiste appliquer une correction math matique aux donn es brutes pour que les chantillons t moins et exp riences soient comparables Le but est de rapprocher les distributions des intensit s de fluorescence d une loi normale pour proc der ensuite aux calculs statistiques Ainsi les courbes de r gression en nuage de points sont bas es sur la comparaison des intensit s des signaux des exp riences deux deux en utilisant le Log2 ratio d intensit s La figure II 1 pr sente des courbes de r gression de quatre exp riences ind pendantes compar es deux deux Ces courbes permette
326. y of white lupin s cluster roots influences bacterial abundance function and community structure Plant and Soil 268 181 194 Welsh J and M McClelland 1991 Nucleic Acids Res 19 303 Wolff K E Zietkiewicz amp H Hofstra 1995 Identification of chrysanthemum cultivars and stability of DNA fingerprint patterns Theor Appl Genet 91 439 447 Williams J G K A R K Kubelik J L Livak J A Rafalski and S V Tingey 1990 DNA polymorphisms amplifed by random primers are useful as genetic markers Nucl Acids Res 18 6531 6535 Withers PJA Edwards AC Foy RH 2001 Phosphorus cycling in UK agriculture and implications for phosphorus loss from soil Soil Use Manag 17 139 149 Wysocka Diller J W Helariutta Y Fukaki H Malamy J E amp Benfey P N 2000 Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot Development 127 595 603 Yang W A C de Oliveira I Godwin K Schertz amp J L Bennetzen 1996 Comparison of DNA marker technologies in characterizing plant genome diversity variability in Chinese sorghums Crop Sci 36 1669 1676 Yu J Hu S Wang J ef al 2002 A draft sequence of the rice genome Oryza sativa L ssp indica Science journal 296 5565 79 92 Zhu YL Song QJ Hyten DL Van Tassell CP Matukumalli LK Grimm DR Hyatt SM Fickus EW Young ND Cregan PB 2003 Single nucleotide polymorphisms in soybean Genetics 163 1123 1134 Zietkiewicz E

Melle Laila SBABOU Melle Laila SBABOU

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents