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1. e Demander un Num ro d Autorisation de Retour avant de retourner l appareil 17 CHAPITRE IV CONSEILS ET TECHNIQUES D UTILISATION DESINTEGRATION DES CELLULES La d sint gration de cellules est une tape importante de l extraction et de la pr paration des produits intracellulaires Du stade de la recherche jusqu la production de nombreux domaines de la biotechnologie en particulier les technologies de recombinaison n cessitent l utilisation des ultrasons pour la d sint gration cellulaire Bien que certains produits biologiques soient s cr t s par la cellule ou rel ch s pendant l autolyse de nombreux autres n cessitent une sonification pour lib rer le mat riel intracellulaire La d sint gration cellulaire permet plus particuli rement d obtenir le produit d sir pr sent l int rieur de la cellule c est la paroi cellulaire qui doit tre rompue pour permettre l extraction du contenu cellulaire Les organismes unicellulaires micro organismes sont constitu s d une paroi cellulaire externe semi perm able solide et rigide entourant la membrane protoplasmique cytoplasmique et le cytoplasme Le cytoplasme est constitu d acides nucl iques prot ines glucides lipides enzymes ions inorganiques vitamines pigments inclusions et d environ 80 d eau Pour isoler et extraire ces substances de l int rieur de la cellule il est n cessaire de briser la paroi cellulaire et la membrane protoplasmique Dans2. et r gler l amplitude sur 100 La sonde tant l air libre hors de l chantillon l indicateur de puissance doit indiquer moins de 10 watts Si la lecture d passe 10 watts appuyer sur la touche O lt t d connecter la sonde du convertisseur 5 Appuyer sur la touche Si l indicateur de puissance indique moins de 10 watts la sonde est d faillante ou d r gl e suite une rosion excessive et doit tre remplac e si l indicateur de puissance indique plus de 10 watts le convertisseur ou l alimentation est d faillant et le sonificateur complet doit tre retourn pour r paration 16 CONDITION DE SURCHARGE Si le sonificateur s arr te de fonctionner et que l indication OVERLOAD surcharge appara t l cran v rifier les causes possibles d crites dans le paragraphe pr c dent puis appuyer sur la touche O pour teindre l appareil et sur la touche remettre sous tension RETOUR DE L APPAREIL Nous conseillons de retourner l usine un appareil n cessitant une r paration Afin de b n ficier d une r paration rapide contacter toujours l usine avant de retourner un appareil Pr ciser la date d achat le num ro du mod le et le num ro de s rie Faire attention emballer soigneusement l appareil pour viter tout dommage ventuel pendant le transport L appareil doit tre adress l attention du Service Apr s Vente avec les frais de port pay s et l exp dition en retour indiqu
3. partir du sol ou des s diments Par exemple une m thode n cessite de m langer le sol avec de la terre de diatom e et du tampon de lyse puis de soniquer L chantillon est ensuite centrifug pour retirer les d bris solides 21 Toujours ins rer la sonde suffisamment profond ment en dessous de la surface de l chantillon pour viter la formation d a rosol ou de mousse la mousse diminuant consid rablement la cavitation Un traitement une puissance plus faible sans mousse est beaucoup plus efficace qu un traitement une puissance plus lev e avec mousse La diminution de la puissance l augmentation de la dur e du processus et l abaissement de la temp rature de l chantillon emp chent g n ralement l apparition d a rosol et de mousse Ne pas utiliser d agent anti moussant ou de surfactant Des radicaux libres se forment pendant la cavitation Si on laisse ces radicaux libres s accumuler ceux ci peuvent affecter de fa on importante l int grit biologique de l chantillon en r agissant avec les prot ines les polysaccharides ou les acides nucl iques La formation de radicaux libres au cours de traitements de courte dur e n est normalement pas consid r e comme un probl me Pour des traitements prolong s il peut tre b n fique d ajouter des fixateurs de radicaux libres comme le dioxyde de carbone N20 la cyst ine la glutathione r duite le dithiothr itol ou d autres compos s SH La saturation de l chanti
4. rer la fiche de la p dale dans la prise jack situ e sur le panneau arri re S assurer que la fiche est enti rement et fermement ins r e 3 Si le montage convertisseur sonde n est pas encore assembl utiliser les cl s fournies visser correctement la sonde sur le convertisseur 4 Installer le montage convertisseur sonde sur un statif Fixer la pince uniquement sur la partie sup rieure du capot du convertisseur Ne pas fixer la pince sur la sonde 5 Connecter le c ble du convertisseur l alimentation lectrique UTILISATION DU SONIFICATEUR Un r gulateur de vitesse sur une automobile peut dans une certaine mesure tre compar un sonificateur Le r gulateur est con u pour maintenir le v hicule une vitesse constante Lorsque le terrain change les besoins de puissance changent galement Le r gulateur de vitesse d tecte ces besoins et ajuste automatiquement la quantit de puissance d livr e par le moteur pour compenser ces conditions sans cesse changeantes Plus l inclinaison est importante plus la r sistance du v hicule au mouvement augmente et plus importante sera la puissance d livr e par le moteur pour compenser cette r sistance Le processeur ultrasonique est con u pour d livrer une amplitude constante Lorsque la r sistance au mouvement de la sonde augmente l alimentation lectrique d livre plus de puissance afin de maintenir constante le d placement de la sonde L utilisation d une
5. alimentation plus puissante ne d livrera pas plus de puissance au liquide C est plut t la r sistance au mouvement de la sonde qui d termine la puissance d livrer l chantillon La commande d AMPLITUDE permet de r gler les vibrations ultrasoniques la pointe de la sonde sur le niveau d sir Bien que le degr de cavitation n cessaire pour traiter l chantillon puisse ais ment tre d termin l il nu la quantit de courant n cessaire ne peut pas tre pr d termin e Un r seau sensible contr le en continu les exigences de sortie et ajuste automatiquement la puissance pour maintenir l amplitude sur le niveau pr s lectionn Plus la r sistance au mouvement de la sonde due une forte viscosit est importante plus la sonde est immerg e profond ment dans l chantillon plus la diam tre de la sonde est lev ou plus la pression est lev e plus la quantit de courant d livr la sonde sera importante Le r glage de la commande d AMPLITUDE enti rement dans le sens horaire n entra nera pas la distribution de la puissance maximale l chantillon La puissance maximale 130 watts que le processeur ultrasonique est capable de d livrer sera uniquement d livr e lorsque la r sistance au mouvement de la sonde est suffisamment lev e pour soutirer la quantit de watt maximale Ce ph nom ne peut tre d montr de la fa on suivante Appuyer la sonde contre un morceau de bois Plus la pression exe
6. et le lysozyme avec les bact ries Un traitement enzymatique est g n ralement suivi par une sonification dans un tampon de lyse GITC La collag nase peut tre utilis e avec le collag ne la lysostaphine avec les staphylocoques et la trypsine hyaluronidase avec le foie et le rein Si l utilisation d enzyme n est pas possible les proc dures suivantes peuvent tre essay es cong lation de l chantillon 70 C pendant la nuit puis d cong lation dans l eau imm diatement avant la sonification La plupart des tissus animaux peuvent tre trait s frais non congel s Il est important de garder les tissus frais au froid et de les traiter rapidement dans les 30 minutes apr s dissection Si l utilisateur travaille sur des tissus frais les cellules doivent tre soniqu es imm diatement au moment de l ajout de la solution de lyse GITC Ceci peut se faire en versant la solution de lyse dans le tube en ajoutant le tissus et en soniquant imm diatement Ne jamais laisser reposer les tissus dans la solution de lyse sans les d sint grer Les chantillons importants de tissus durs doivent d abord tre trait s dans un mixeur ou un homog n isateur m canique Les tissus animaux ayant t congel s apr s pr l vement doivent tre d sint gr s en les broyant dans l azote liquide avec un mortier et un pilon Pendant cette proc dure il est important de conserver le mat riel et les tissus des temp ratures cryog niques Les
7. puis d augmenter ou de diminuer selon les besoins Les levures les bact ries Gram Positives et dans une moindre mesure les bact ries Gram N gatives poss dent une paroi cellulaire beaucoup plus solide que les cellules animales et n cessitent une puissance relativement lev e pour d sint grer les cellules 18 Les bact ries Gram N gatives n cessitent g n ralement 10 15 minutes de traitement alors que les staphylocoques n cessitent 20 30 minutes Les micro organismes sont tr s diff rents dans leur sensibilit la d sint gration ultrasonique Par exemple les plus facilement d sint gr s sont ceux en forme de b tonnet bacilles alors que les organismes sph riques coques sont beaucoup plus r sistants Le groupe des mycobact ries auquel appartient le micro organisme responsable de la tuberculose est particuli rement difficile d sint grer G n ralement les cellules animales sont plus facilement d sint gr es que les cellules v g tales et les globules rouges sont plus facilement d sint gr s que les cellules musculaires car ces cellules ne poss dent pas de paroi cellulaire protectrice La d sint gration cellulaire constitue la premi re tape pour l extraction des ARN et une des tapes les plus cruciales concernant le rendement et la qualit des ARN isol s G n ralement la d sint gration cellulaire doit tre rapide et approfondie Une d sint gration lente par exemple en pla ant
8. pulsation choisi et cycle de pulsation r el par ex Pulse 02 01 01 Ol pulsation 02 01 01 01 d Puissance en watts et quantit d nergie accumul e en JOULES d livr es la sonde par ex 20 watts 0000000 Joules e Temps coul depuis le d but du traitement par ex Elapsed time 0 44 20 temps coul 0 44 20 REMARQUE La quantit d nergie affich e correspond un cycle uniquement L initialisation d un nouveau cycle remet l affichage z ro IMPORTANT Il est essentiel d apporter un soin particulier la sonde pour assurer un fonctionnement fiable Une cavitation intense entra nera apr s une p riode prolong e une rosion de la pointe et provoquera une baisse de puissance sans que cela soit visible sur l indicateur de puissance Plus la pointe est lisse et propre plus grande sera la puissance transmise l chantillon Une rosion de la pointe de la sonde acc l re le processus d rosion Nous conseillons pour cette raison d examiner la pointe apr s 5 ou 6 heures d utilisation et si n cessaire de la polir d licatement avec de la toile meri ou avec une meule La sonde tant syntonis e pour vibrer une fr quence sp cifique il est tr s important d liminer uniquement la surface contamin e Cette proc dure peut tre r p t e tant que l indicateur de puissance indique moins de 10 watts lorsque la sonde est hors de l chantillon l AMPLITUDE tant r gl e sur 100 Si l indicateur de puissance indiq
9. GUIDE D UTILISATION SONIFICATEUR HAUTE INTENSITE SERIE AUTOTUNE PILOT PAR MICROPROCESSEUR Mod le 130 watts R f rence 75186 SOMMAIRE Garantie Mesures de s curit importantes Liquides faible tension de surface Solvants organiques CHAPITRE 1 INSTALLATION Inspection Alimentation lectrique Installation de l homog n iseur ultrasons CHAPITRE II FONCTIONNEMENT Principes de la d sint gration ultrasonique Fonctions des touches indicateurs et connecteurs Pr paration avant utilisation Utilisation du sonificateur CHAPITRE III MAINTENANCE Condition de surcharge Retour de l appareil CHAPITRE IV CONSEILS ET TECHNIQUES D UTILISATION Le sonificateur livr avec ce manuel d instructions est fabriqu avec les meilleurs mat riaux et la transformation r pond aux normes de fabrication les plus lev es Il a t soigneusement test et inspect avant de quitter l usine et il assurera l utilisateur de nombreuses ann es de fonctionnement fiable et en toute s curit s il est utilis en respectant les proc dures d crites dans ce manuel Rev April 2004 GARANTIE Notre sonificateur est garanti par le fabricant pour une p riode de trois ans partir de la date d exp dition contre tout d faut de mat riel et vice de fabrication pour une utilisation normale telle que d crite dans ce manuel d instructions Pendant la p riode de garantie le fabricant r parera ou remplacera sans frais de pi ce
10. L contr le de l amplitude l cran puis appuyer sur la touche A ou M selon le cas REMARQUE Toute combinaison de fonctions peut tre choisie dans n importe quel ordre Pour effacer une mauvaise saisie appuyer sur la touche CLEAR effacer REMARQUE Si l utilisateur appuie sur la touche SSSR et qu aucune limite de temps n a t r gl e le traitement continuera jusqu ce que la touche SIKOJ soit actionn e Si l utilisateur appuie sur la touche SENS et qu une limite de temps a t r gl e le traitement continuera jusqu expiration du temps r gl ou si la touche SKO est press e quel que soit le premier v nement survenu En cas d utilisation d une p dale et si aucune limite de temps n a t r gl e le traitement continuera tant que l utilisateur appuie sur la p dale En cas d utilisation d une p dale et si une limite de temps a t fix e le traitement continuera jusqu expiration de la limite de temps ou si la p dale est rel ch e quel que soit le premier v nement survenu La touche SIMS et la p dale sont mutuellement exclusives Si le traitement est d marr avec la touche PAi la p dale devient inop rante Si la sonification est d marr e l aide de la p dale la touche S K6 devient inop rante 12 Immerger la microsonde moiti dans l chantillon Si la sonde est immerg e une profondeur insuffisante de l air sera inject dans l chantillon ce qui le fera mo
11. ance de sortie d livr e la sonde en watts et en pourcentage de la puissance totale de 130 watts Dur e de traitement s lectionn e Ecran LCD Temps de traitement effectif Temps coul Dur e d impulsion Quantit d nergie accumul e en joules d livr e par la sonde Tawis Saisie des chiffres 0 9 Lauchie effacer Efface la saisie pr c dente CLEAR i ari entrer visualiser Saisit les donn es dans le programme et s lectionne 5 diff rents param tres pour l affichage sur l cran LCD REVIEW D i S Touche minuterie Utilis e avec les touches num riques pour r gler la dur e de l application des ultrasons de 1 seconde 9 heures 59 minutes 59 secondes Touche pulseur Utilis e avec les touches num riques pour r gler le mode de pulsation Le cycle ON sonification et le cycle OFF relaxation peuvent tre r gl s ind pendamment de 01 seconde 59 secondes L indicateur rouge s allume lorsque le g n rateur d impulsions est dans la partie OFF du cycle Touche d marrer arr ter D marre ou arr te les ultrasons En mode STOP START STOP l indicateur rouge s teint Touche Met l appareil sous tension Touche O Met l appareil hors tension Contr le l amplitude des vibrations la pointe de la sonde AMPL Utilis e avec la touche AMPL lorsque l appareil est en attente pour r gler l amplitude des vibrations la pointe de la sonde Egalement
12. appareil peuvent tre alt r es Pour le montage de la sonde toujours fixer le capot du convertisseur Ne jamais fixer la sonde V rifier que le sonificateur est correctement reli la terre avec une fiche 3 broches Une haute tension est pr sente au niveau de l alimentation Le capot ne doit tre retir que par un r parateur qualifi Pour viter les chocs lectriques d brancher le cordon d alimentation avant de retirer le capot pour effectuer une r paration Ne jamais faire fonctionner le g n rateur s il n est pas connect au convertisseur Ne rien fixer sur la sonde sauf au point nodal point de non activit Ne jamais toucher une sonde vibrante Ne jamais laisser une microsonde vibrer l air libre pendant plus de 10 secondes Ne jamais faire fonctionner une sonde extr mit filet e sans embout interchangeable Refroidir le convertisseur avec de l air lorsque la temp rature de l chantillon d passe 100 C et pour une utilisation haute intensit pendant plus de 30 minutes Nous conseillons l utilisation d une cabine anti bruit ou d un casque anti bruit pendant le fonctionnement du sonificateur ATTENTION LIQUIDES A FAIBLE TENSION DE SURFACE SOLVANTS ORGANIQUES Les sondes embout fixe ou amovible sont ajust es pour r sonner une certaine fr quence En cas d utilisation d une sonde de 1 2 13 mm embout amovible si la pointe amovible est retir e ou isol e du reste de la sond
13. certains cas la cellule peut s cr ter la substance d sir e sans assistance mais dans la plupart des cas les cellules doivent tre lys es et soniqu es pour que ces substances soient lib r es La destruction des membranes cellulaires et la lib ration du contenu repr sentent un d fi certain Le processus doit tre rapide et approfondi pour optimiser le rendement en prot ine L nergie appliqu e devant tre suffisamment importante pour briser les membranes ou parois cellulaires mais rester suffisamment douce pour viter d endommager physiquement ou chimiquement le contenu cellulaire le Vibra Cell avec sa capacit faire varier l intensit est id al pour cette application Le niveau d intensit devant tre utilis d pend de l application Par exemple une intensit lev e peut tre conseill e pour briser les cellules mais ne doit jamais tre utilis e lorsque la lib ration de composants intracellulaires n est pas d sir e comme par exemple l isolement d organelles La possibilit de contr ler l amplitude au niveau de la pointe de la sonde est une condition n cessaire l optimisation du processus Et comme chaque application n cessite ses propres param tres de traitement du fait des variations de volume et de composition l amplitude optimale ne peut tre d termin e qu empiriquement Pour le traitement d un nouvel chantillon nous conseillons de r gler d abord l amplitude sur 50 30 avec une microsonde
14. de doit entrer en contact avec un chantillon solide utiliser un tube de centrifugation en acier inoxydable standard de 20 mm 4 de diam tre coup une longueur de 70 mm 3 Ne pas utiliser de tube en verre Les micropointes ne doivent jamais entrer en contact avec autre chose que le liquide car la tension r sultante au point de contact avec une surface dure briserait la micropointe M me si les sondes plus grandes ne se brisent pas si elles entrent en contact avec un r cipient en verre elles peuvent cependant briser le r cipient Avant chaque exp rience placer la pointe de la sonde dans l eau ou l alcool et mettre l alimentation sous tension pendant quelques secondes pour retirer tout r sidu En cas de risque de contamination par une utilisation pr c dente nettoyer la sonde avec une solution de Virkon 20 et rincer l eau distill e Pour les application cruciales il est possible d autoclaver les sondes Pour viter la perte d chantillon pouvant s accrocher la paroi du tube essai enduire le tube de silicone de la fa on suivante laver et s cher soigneusement le tube essai enduire de silicone puis s cher l air Le Sigmacote fabriqu par Sigma Chemical Co 3050 Spruce Street St Louis Missouri 63103 USA t l phone 314 771 5765 convient parfaitement cette proc dure Une viscosit et une concentration lev es sont probl matiques 2000 cp et une concentration de 15 en poids constitu
15. e l l ment ne r sonnera plus cette fr quence et l alimentation sera d faillante Contrairement aux solutions aqueuses base d eau qui posent rarement probl me les chantillons contenant des solvants ou des liquides faible tension de surface sont probl matiques Ces liquides p n trent dans l espace entre la sonde et l embout amovible et am nent les particules dans la partie filet e isolant la pointe de la sonde TOUJOURS utiliser une sonde embout fixe pour traiter des chantillons contenant des solvants ou des liquides faible tension de surface CHAPITRE 1 INSTALLATION INSPECTION Avant d installer le sonificateur inspecter visuellement le colis et relever toute trace de dommage qui aurait pu survenir pendant le transport Avant de jeter l emballage v rifier soigneusement qu il ne contient pas de petites pi ces Le processeur ultrasonique a t soigneusement emball et inspect avant de quitter notre usine La responsabilit de sa livraison en bon tat est assum e par le transporteur du fait de l acceptation du transport Les r clamations pour perte ou dommage cons cutifs au transport doivent de ce fait tre adress es au transporteur En cas de dommage contacter le transporteur dans les 48 heures compter de la date de livraison NE PAS FAIRE FONCTIONNER UN APPAREIL ENDOMMAGE Conserver tous les mat riaux d emballage pour une future exp dition ALIMENTATION ELECTRIQUE Le processeur u
16. en aval Le traitement d un lysat de tissu v g tal avec du polyvinylpyrrolidone PVP permet de faire pr cipiter ces composants probl matiques pour les extraire du lysat avant d effectuer la purification d ARN r elle Chaque fois que cela est possible les tissus doivent tre coup s en tout petits morceaux pour permettre leur mouvement dans le liquide Les tissus r sistants comme la peau et les muscles doivent d abord tre liqu fi s dans un mixer ou un quivalent pendant environ 10 secondes et transvas s dans un petit r cipient pendant le traitement ultrasonique Si l utilisateur d sire des particules sub cellulaires intactes r gler la commande d amplitude assez bas et augmenter le temps de traitement Les levures peuvent tre extr mement difficiles d sint grer car leur paroi cellulaire peut former des capsules ou des spores presque indestructibles Pour traiter des levures soniquer dans un tube contenant l chantillon du tampon de lyse base de guanidine et des petites billes de verre 0 5 1 mm Un pr traitement la zymolase glucalase et ou lyticase pour donner des sph roplastes pouvant tre facilement lys s peut tre utile Pour d sint grer les champignons filamenteux gratter le myc lium dans un mortier froid ajouter de l azote liquide et broyer avec un pilon pour obtenir une poudre fine La poudre peut ensuite tre soigneusement soniqu e dans du tampon de lyse pour la solubiliser compl tement Co
17. ent les limites maximales Les ondes soniques des ultrasons se propageant travers l chantillon si l chantillon est trop pais pour tre vers ou circuler facilement 1l est trop pais et ne peut pas tre trait par ultrasons Utiliser une chambre Cup Horn pour le traitement d chantillons pathog nes radioactifs et pr sentant un risque biologique en isolement complet sans introduction de sonde Les tubes plastiques ayant tendance absorber les vibrations il est pr f rable quand cela est possible d utiliser des tubes en acier inoxydable ou en verre pour travailler avec une chambre Cup Horn Pour activer le traitement ajouter des billes de verre l chantillon Si l utilisateur le d sire il peut ajouter de la glace pil e dans l eau l int rieur de la chambre Cup Horn pour optimiser le refroidissement Le traitement d chantillons dans une chambre Cup Horn prend g n ralement 4 fois plus de temps qu avec la m thode directe par introduction de sonde 23
18. et la r duction du phosphomolybdate acide phosphotungstique dans le r actif de Folin par les acides amin s aromatiques pr sents dans la prot ine trait e La fraction prot ique lib r e Rp est calcul e l aide de l quation suivante et en multipliant le r sultat par 100 Rp Cf Cb Ct Cb Cf Prot ines libres Ct Prot ines totales Cb Prot ines de fond Ceci donne le pourcentage de d sint gration r elle en tenant compte des niveaux de fond en prot ines avant la d sint gration 22 La plus grande concentration d nergie se situant proximit imm diate de la sonde il est imp ratif de garder l chantillon aussi pr s que possible de la pointe Les liquides sont facilement trait s car les cellules libres circulent sans cesse sous la sonde Les mat riaux solides cependant ont tendance tre repouss s par les ultrasons et doivent tre trait s dans des r cipients suffisamment larges pour contenir la sonde mais galement suffisamment petits pour restreindre le mouvement de l chantillon Pour les petits chantillons nous conseillons d utiliser des tubes essai de forme conique Le contact de la sonde avec le r cipient diminue la puissance d livr e et entra ne la migration de toutes petites particules de verre dans le liquide M me si ces particules de verre n affectent pas la composition chimique de l chantillon elles formeront une fine couche grise lors de la centrifugation Si la son
19. g n rateur ultrasonique convertit la tension du secteur 50 60 Hz en nergie lectrique de haute fr quence Cette nergie lectrique de haute fr quence est transmise un transducteur pi zo lectrique dans le convertisseur o elle est chang e en vibrations m caniques Les vibrations du convertisseur sont intensifi es par la sonde cr ant des ondes de compression dans le liquide Cette action g n re des millions de bulles microscopiques cavit s qui se propagent pendant la phase de pression n gative et qui implosent violemment pendant la phase de pression positive Lorsque les bulles implosent elle provoquent des millions d ondes de choc et de remous qui irradient vers l ext rieur du site de d pression ainsi que des pressions et des temp ratures extr mes sur les sites d implosion Bien que ce ph nom ne connu sous le nom de cavitation ne dure que quelques microsecondes et que la quantit d nergie d gag e par chaque bulle individuelle soit minime le cumul d nergie dissip e est extr mement lev Plus la pointe de sonde est grande plus le volume pouvant tre trait sera important mais une intensit plus faible Pour des informations concernant la capacit de traitement de chaque sonde consulter les tableaux ci dessous FONCTIONS DES TOUCHES COMMANDES INDICATEURS ET CONNECTEURS PANNEAU FRONTAL Affiche les messages et les param tres de contr le suivants Amplitude s lectionn e Puiss
20. i basse que possible de pr f rence juste au dessus de son point de cong lation Ceci peut tre r alis en immergeant le r cipient contenant l chantillon dans un bain de glace et d eau sal e L l vation de temp rature peut galement tre r duite en utilisant le pulseur La d sint gration des cellules peut tre am lior e en augmentant la pression hydrostatique habituellement 1 4 bar 15 60 psi et la viscosit Pour les micro organismes l addition de billes de verre d une taille comprise entre 0 5 et 1 mm favorise la d sint gration des cellules Les billes sont pratiquement indispensables pour la d sint gration de spores ou de levures Le bon dosage est de un volume de billes pour deux volumes de liquide Les billes de verre sont disponibles chez Cataphote Inc P O Box 2369 Jackson Mississippi 39225 2369 USA t l phone 800 221 2574 ou 601 19 939 4612 fax 601 932 5339 Jayco Inc 675 Rahway Ave Union NJ 07083 USA t l phone 908 688 3600 fax 908 688 6060 ou Sigmund Lindner GmbH P O Box 29 D 95483 Warmensteinach Allemagne T l phone 49 0 92 77 9 94 10 fax 49 0 92 77 9 94 99 Pour le traitement de cellules difficiles telles que les levures un pr traitement par une enzyme peut tre b n fique Les digestions au lysozyme hyaluronidase glycosidase glucalase lyticase zymolase et lysostaphine font partie des m thodes enzymatiques les plus fr quemment utilis es avec les levures
21. i la phase de relaxation du cycle d passe deux secondes un message d avertissement Sonics in OFF Cycle sonics en relaxation appara t sur l cran pour avertir l utilisateur qu il ne doit pas toucher la sonde ultrasonique Pour r gler le pulseur appuyer sur la touche AUS L cran LCD affiche Pulse on sec sonification sec relaxation sec A l aide des touches num riques r gler la phase de sonification ON du cycle et appuyer sur la touche ENTER REVIEW entrer visualiser L cran affiche Pulse on 01 sec par ex zii sonification O1 sec relaxation sec A l aide des touches num riques r gler la phase de relaxation OFF du cycle L cran affiche Pulse on 01 sec par ex D EE sonification O1 sec relaxation O1 sec Appuyer sur la touche ENTER REVIEW L cran affiche Time 0 30 00 Temps Pulsation Amplitude 14 VISUALISER la fonction REVIEW visualiser met la disposition de l utilisateur une fen tre ouvrant sur le processus en affichant diff rents param tres de fonctionnement sans interrompre le processus Appuyer plusieurs fois sur la touche ENTER REVIEW entrer visualiser pendant le traitement pour afficher la suite les informations suivantes a Amplitude choisie par ex Amplitude 40 b Temps de traitement r gl et temps de traitement coul par ex Set 0 30 00 Time 0 22 10 r gl 0 30 00 coul 0 22 10 c Cycle de
22. les cellules ou les tissus dans une solution de lyse l isothiocyanate de guanidine GITC pendant une p riode prolong e avant la sonification peut entra ner une d gradation des ARN par lib ration interne des ARNases Ceci pose particuli rement un probl me pour le traitement de tissus contenant beaucoup d ARNases tels que la rate ou le pancr as La d sint gration de tissus congel s n cessite plus de temps et d efforts que le traitement de tissus frais mais la cong lation des chantillons est parfois n cessaire Les chantillons sont g n ralement congel s quand 1 ils sont r cup r s sur une p riode prolong e et ne peuvent par cons quent pas tre trait s simultan ment 2 il y a de nombreux chantillons 3 les chantillons sont pr lev s sur le terrain ou 4 le traitement m canique des chantillons frais est insuffisant pour une d sint gration approfondie Un mortier et un pilon ou un sac et un marteau sont g n ralement utilis s lorsque le produit de d part est congel L ARN reste intact dans les tissus pendant une journ e 37 C une semaine 25 C et un mois 4 C et ind finiment des temp ratures inf rieures z ro Avec le traitement par ultrasons l agitation mol culaire dans l chantillon provoque g n ralement une l vation de temp rature surtout avec de petits volumes Les temp ratures lev es r duisant la cavitation la temp rature de l chantillon doit tre conserv e auss
23. llon par une atmosph re protectrice d h lium ou d azote gazeux ou l ajout d un petit bout de glace carbonique dans l chantillon diminue souvent la formation de radicaux libres Bien qu il soit vrai qu un gaz est n cessaire une d sint gration cellulaire efficace il n est pas n cessaire que la phase vapeur soit constitu e d oxyg ne ou d air car n importe quel gaz l exception du dioxyde de carbone marche aussi bien Diff rentes m thodes peuvent tre utilis es pour mesurer l efficacit de la d sint gration Par exemple un comptage visuel peut tre fait sous microscope Pour une meilleure pr cision il est possible d effectuer un dosage des prot ines Cette proc dure est largement reconnue comme tant une bonne m thode de mesure de la d sint gration cellulaire en tenant compte de la quantit de prot ine lib r e apr s d sint gration Les cellules d sint gr es sont ensuite test es et v rifi es en fonction de ce nombre pour obtenir le pourcentage de cassure Il existe plusieurs types de dosages des prot ines Un commun ment utilis est la m thode de la r action de Folin dosage de Lowry car il est comparativement simple et donne des r sultats coh rents Cette m thode colorim trique d veloppe une sensibilit pour les prot ines d environ 8 ug mL dans la solution dos e Ce dosage vire au bleu en pr sence de prot ines suite la r action des ions cuivre dans la solution alcaline avec les prot ines
24. ltrasonique n cessite une prise de courant monophas 3 broches reli e la terre quip e d un fusible capable de d livrer 50 60 Hz 100 volts 115 volts 220 volts ou 240 volts suivant l option de tension choisie Pour les exigences lectriques se r f rer l tiquette l arri re de l appareil S il est n cessaire de convertir l appareil pour adapter son fonctionnement d autres tensions proc der de la fa on suivante D connecter le cordon d alimentation de la prise Ouvrir le support de fusibles en utilisant un petit tournevis plat Retirer le support de fusibles rouge de son logement Pour passer de 100 115 V 220 240 V remplacer les deux fusibles action lente de 3 A par des fusibles de 1 6 A Pour passer de 220 240 V 100 115 V inverser la proc dure ci dessus 6 Tourner le support de fusibles de 180 par rapport sa position d origine et le r ins rer dans son logement Pour un fonctionnement en 100 115 V la tension affich e doit tre 115 Pour un fonctionnement en 220 240 V la tension affich e doit tre 220 7 Changer le cordon d alimentation si n cessaire MUR a Un INSTALLATION DE L HOMOGENEISEUR A ULTRASONS Installer le sonificateur dans un endroit l abri d un exc s de poussi re de salet de vapeurs explosives et corrosives et des conditions extr mes de temp rature et d humidit CHAPITRE II FONCTIONNEMENT PRINCIPES DE LA DESINTEGRATION ULTRASONIQUE Le
25. mme les champignons peuvent galement tre riches en polysaccharides un pr traitement au polyvinylpyrrolidone PVP peut tre b n fique Les bact ries comme les plantes sont extr mement diverses par cons quent il est difficile d mettre une recommandation applicable toutes les bact ries Un traitement ultrasonique lysera la plupart des bact ries Gram Positives et Gram N gatives y compris les mycobact ries Bien qu il soit conseill d utiliser des billes de verre et une solution de lyse il est possible de lyser certaines bact ries Gram N gatives en les soniquant dans la solution de lyse sans billes Les parois cellulaires des bact ries n cessitent une digestion plus rigoureuse et des temps de traitement plus longs Les sph roplastes sont ensuite lys s par sonification dans du tampon de lyse GITC Les d sint gration de cellules trouv es dans les sols et les s diments peut se faire de deux fa ons Une technique isole les cellules bact riennes du reste avant d isoler l ARN Ceci se fait en homog n isant le sol humide dans un homog n isateur m canique suivi par une centrifugation basse vitesse pour extraire la biomasse fongique et les d bris du sol Le surnageant est nouveau centrifug une plus grande vitesse pour s dimenter les cellules bact riennes Les cellules peuvent ensuite tre lys es comme d crit pr c demment pour les bact ries D autres techniques d crivent l extraction d ARN directement
26. ni de main d uvre son choix et comme unique recours la les pi ce s d clar e s d fectueuse s condition que l appareil nous soit renvoy correctement emball tous frais de port pay s Les sondes ultrasoniques sont garanties contre tout d faut pendant une p riode de un an partir de la date d exp dition Une sonde d fectueuse sera remplac e gratuitement en cas de d faillance pendant la p riode de garantie L usure r sultant de l rosion par cavitation est une cons quence normale du traitement ultrasonique et n est pas couverte par cette garantie Le fabricant n assume ni n autorise personne assumer pour lui aucune autre obligation ou responsabilit en relation avec la vente de ce produit Le fabricant rejette par la pr sente toute garantie de marchandisage ou d aptitude un but particulier Aucune personne ni entreprise n est autoris e changer modifier ou amender les termes de cette garantie de quelque fa on que ce soit Le fabricant n est en aucun cas responsable vis vis du distributeur ou d aucune autre personne pour tout dommage direct ou indirect ou perte de client le production ou profit r sultant de tout dysfonctionnement ou d faillance de ce produit Cette garantie ne s applique pas un quipement ayant subi une r paration non autoris e une utilisation incorrecte ou abusive une n gligence ou un accident Un quipement qui montre des signes d utilisation en violation des instructio
27. ns d utilisation ou dont le num ro de s rie est alt r ou retir ne pourra pas b n ficier d une r paration sous garantie Toutes les sondes sont fabriqu es conform ment aux caract ristiques exactes et sont ajust es pour r sonner une certaine fr quence L utilisation d une sonde non ajust e peut endommager l quipement et peut annuler la garantie Le fabricant n accepte aucune responsabilit pour les sondes fabriqu es par un tiers ni pour les dommages cons cutifs r sultant de leur usage Les dispositions susmentionn es ne rallongent pas la p riode de garantie originale d un produit ayant t r par ou remplac par le fabricant MESURES DE SECURITE IMPORTANTES LIRE ATTENTIVEMENT AVANT D INSTALLER OU DE FAIRE FONCTIONNER CET APPAREIL Ce processeur ultrasonique a t con u pour assurer un maximum de s curit l utilisateur Cependant aucune conception ne peut assurer une protection totale en cas de mauvaise utilisation qui peut entra ner des blessures corporelles et ou des dommages mat riels Pour la protection de l utilisateur et de l appareil respecter les avertissements suivants tout moment lire attentivement les instructions de fonctionnement avant de tenter de faire fonctionner l appareil et conserver ce manuel d instructions pour le consulter plus tard Si le sonificateur est utilis d une mani re contraire celle pr cis e dans ce manuel d instructions les protections con ues dans l
28. rc e vers le bas est importante et par cons quent plus la r sistance au mouvement de la sonde est lev e plus la quantit de courant d livr e par l alimentation lectrique est importante 10 Appuyer sur la touche i L cran affiche la puissance du sonificateur et les param tres de contr le suivants Temps Pulsation Amplitude 11 AMPLITUDE L amplitude est le seul param tre qui doit tre r gl pour permettre au sonificateur de fonctionner Les autres param tres de r gulation le temps et les pulsations n ont pas besoin d tre r gl s pour un fonctionnement en continu AMPL affiche l amplitude choisie par exemple 40 Pour r gler l amplitude lorsque les ultrasons sont coup s appuyer sur la touche AMPE et sur les touches num riques pour afficher 40 l cran Ampl 40 puis appuyer sur la touche ENTER REVIEW entrer visualiser L cran indique Time Pulse Ampl 40 Le sonificateur est maintenant pr t pour une utilisation en continu Pour activer les ultrasons appuyer sur la touche SAFARA d marrer ou sur la p dale Pour arr ter les ultrasons appuyer sur la touche SBKQZ ou rel cher la p dale Pour utiliser les fonctions de Temps ou de Pulsation se r f rer au x paragraphe s appropri s ci dessous Pour augmenter ou diminuer l amplitude par petits incr ments lorsque les ultrasons sont en cours appuyer sur la touche AMPE pour afficher AMPLITUDE CONTRO
29. tissus doivent tre secs et poudreux apr s broyage Le broyage doit tre suivi par une sonification approfondie dans du tampon de lyse GITC Cette fa on de traiter les tissus congel s est longue et fastidieuse mais efficace Les cellules de culture sont normalement faciles d sint grer Les cellules cultiv es en suspension sont r cup r es par centrifugation rinc es au PBS pour liminer le milieu de culture puis lys es en les soniquant dans du tampon de lyse GITC Placer le r cipient sur la glace pendant le lavage et la lyse des cellules pour am liorer la protection des ARN contre les ARNases endog nes lib r es pendant le processus de d sint gration Les tissus v g taux mous et frais peuvent souvent tre d sint gr s en les soniquant dans du tampon de lyse Les autres tissus v g taux comme les aiguilles de pin doivent tre broy es sec sans azote liquide Certaines mati res v g tales dures de type bois n cessitent une cong lation et un broyage dans l azote liquide avant d tre trait s par ultrasons Les cultures de cellules v g tales en suspension et les cals sont g n ralement soniqu s dans un tampon de lyse en moins de 2 minutes La diversit des plantes et tissus v g taux rend impossible des conseils uniques applicables tous Cependant la plupart 20 des tissus v g taux contiennent g n ralement des polysaccharides et des poly ph nols pouvant co pr cipiter avec l ARN et inhiber les tests
30. ue plus de 10 watts remplacer la sonde ou l embout amovible par une nouvelle 15 CHAPITRE III MAINTENANCE Ce sonificateur a t con u pour assurer une fiabilit et une s curit d utilisation pendant de nombreuses ann es Cependant du fait de la d faillance d un composant ou d une mauvaise utilisation 1l est possible qu il ne fonctionne pas comme il devrait qu il se coupe suite une surcharge ou qu il s arr te compl tement de fonctionner Les causes les plus probables de dysfonctionnement sont d crites ci dessous et doivent tre v rifi es gt L appareil est connect une prise de courant d livrant une tension diff rente de celle requise Voir Alimentation lectrique gt La sonde et ou la microsonde n est pas fix e correctement gt Sila sonde est quip e d un embout amovible la pointe n est pas correctement fix e ou la sonde a t utilis e avec des chantillons contenant des solvants ou des liquides faible tension de surface gt Un plusieurs fusible s a ont claqu Si un fusible a claqu proc der de la fa on suivante 1 Mettre l appareil hors tension en appuyant sur la touche O et d connecter le cordon d alimentation de la prise de courant 2 Ouvrir le couvercle du support de fusibles l aide d un petit tournevis et extraire le support de fusibles de son logement 3 Remplacer le s fusible s 4 Reconnecter le cordon d alimentation dans la prise appuyer sur la touche
31. usser L amplitude n cessaire tant d pendante de l application et fonction du volume et de la composition de l chantillon nous conseillons d optimiser l amplitude empiriquement pendant le traitement de l chantillon MINUTERIE en mode puls la dur e du traitement est diff rente du temps coul car la fonction de temps de traitement surveille et contr le uniquement les portions de sonification du cycle Par exemple pour 1 heure de traitement le temps coul sera de 2 heures si les cycles de sonification ON et de relaxation OFF sont tous les deux r gl s sur 1 seconde Pour r gler le temps de traitement appuyer sur la touche minuterie L cran LCD affiche r glage du temps A l aide des touches num riques r gler le temps de traitement sur la valeur d sir e Par ex IW entrer visualiser L cran affiche Temps Pulsation Amplitude 13 PULSEUR en inhibant l accumulation de chaleur dans l chantillon la fonction de pulsation permet un traitement haute intensit en toute s curit des chantillons thermosensibles De plus les pulsations am liorent le traitement en permettant au produit de revenir sous la sonde apr s chaque d charge Les dur es des sonifications ON et relaxations OFF peuvent tre r gl es ind pendamment de 1 seconde 59 secondes Pendant la phase de relaxation du cycle l indicateur rouge sur la touche pulseur s allume S
32. utilis e pour Touche augmenter ou diminuer l amplitude par petits incr ments pendant le AY fonctionnement de l appareil Pour cela appuyer sur la touche AMPE pour afficher AMPLITUDE CONTROL contr le de l amplitude puis appuyer sur la touche A ou W selon le cas FONCTIONS DES TOUCHES COMMANDES INDICATEURS ET CONNECTEURS suite PANNEAU ARRIERE Sous connecteur D 9 Se connecte au dispositif de commande externe et permet l activation et le broches contr le de la fr quence Jack pour p dale Se connecte au c ble de la p dale Connecteur coaxial Se connecte au convertisseur Module d alimentation Se connecte au cordon d alimentation lectrique et abrite le s fusible s SOUS CONNECTEUR D A 9 BROCHES N de broche Description Non connect e Non connect e Non connect e Permet une connexion un compteur de fr quence Permet une connexion un contr leur de puissance externe 5 mV 1 watt Terre Su AJY N Excite les ultrasons quand connect la terre Permet de r gler l intensit distance l aide d un potentiom tre 10k externe 8et9 Voir ci dessous vers broche 9 10K lt vers broche 8 vers broche 6 PREPARATION AVANT UTILISATION 1 Brancher le cordon d alimentation dans la prise de courant si l appareil est d j sur marche appuyer sur la touche 2 Si la p dale optionnelle est utilis e ins
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