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Biotechnology Explorer - Bio-Rad

1. Cours 2 Amplification par PCR 1 Sortez le tube contenant votre ADN matrice du r frig rateur Centrifugez le tube avec bouchon vis pendant 2 minutes 6000 x g 5 minutes 2000 x g dans une centrifugeuse Inscrivez vos initiales sur un tube de PCR et sur un microtube essai sans bouchon Placez le tube de PCR dans le tube sans bouchon comme il est illustr et placez les deux tubes dans le support en mousse Transf rez 20 pl de l ADN matrice le surnageant du tube avec bouchon vis dans le fond du tube de PCR Prenez soin de ne pas transf rer des billes de la matrice dans le tube de PCR Placez le tube de la solution d amplification jaune sur de la glace et transf rez 20 pl de la solution d amplification dans le tube de PCR M langez en aspirant et en expulsant 2 ou 3 fois avec une pipette Bouchez bien le tube de PCR Le m lange doit tre jaune Placez le tube de PCR dans le thermocycler A ce moment l placez galement les r actions contr les pr par es par l enseignant dans la machine de PCR Les r actions doivent tre soumises 40 cycles d amplification par PCR 36 ADN matrice Centrifugeuse 1 J tr Tube Tube de sans PCR bouchon ccC Vers Surnageant Fr Y Matrice V fi A sl dpt Solution d amplification Bulletin n 4110052FR Cours 3 Electrophor se des chantillons de PCR amplifi s et coloration de
2. M lange des amorces Solution d amplification Aliquotez 95 pi de la solution d amplification compl te dans les 8 microtubes essai tiquet s SA en distribuant un tube pour chaque poste de travail des l ves 1 8 Gardez la solution d amplification compl te restant pour les r actions des contr les positifs Placez ces tubes sur de la glace jusqu leur utilisation Installez les r actions de PCR contr les A Etiquetez les tubes de PCR contr les et Si vous utilisez le kit entier sur une seule p riode de TP installez 4 tubes de chaque contr le soit un total de 12 tubes Si vous divisez le kit entre deux p riodes de TP installez 2 tubes de chaque contr le soit un total de 6 tubes Les solutions contr les inutilis es doivent tre stock es dans le cong lateur jusqu leur utilisation e Pipetez 20 il de la matrice dans chaque tube de PCR e Pipetez 20 il de la matrice dans chaque tube de PCR e Pipetez 20 il de la matrice dans chaque tube de PCR Pipetez 20 Hi de solution d amplification compl te dans chacun des tubes contr les Utilisez un nouvel embout pour chaque tube Placez les tubes sur de la glace jusqu ce que vous soyez pr t les charger dans le Gene Cycler ou le MyCycler Amplifiez les chantillons contr les de PCR avec les chantillons des l ves durant ce cours voir le mode op ratoire Pr parez les gels d agarose Ces m
3. Microcentrifugeuse ou minicentrifugeuse Cours 4 Analyse et interpr tation des r sultats Postes de travail des l ves Film de support de gel facultatif Feuilles d ac tate transparente pour le tra age des gels facultatif Copie du mode op ratoire Poste de travail de l enseignant Aucun n cessaire Quantit par poste 1 1 par l ve 1 tube 1 1 de chaque 1 tube 12 1 2 1 1 pour 2 postes 120 ml pour 2 postes 1 1 DDOCDDDDDDECLECCECLECLE 1 5 2 pour 2 postes H 1 3 pour 2 postes U 1 m 1 Q Quantit par classe 275 ml par cuve n 12 m 1 Q 1 Q 4 Q Quantit par poste v 1 1 1 Selon le mode op ratoire de coloration suivi rapide ou pendant une nuit Fortement recommand 15 D O Bulletin n 4110052FR Pr paration pr alable par l enseignant Cette partie d crit la pr paration r aliser par l enseignant avant l exercice Une estimation du temps de pr paration est incluse dans chaque partie Cours 1 Pr paration de l ADN matrice Pr paration pr alable x Objectifs Aliquotage de la matrice InstaGene Installation des postes de travail des l ves et de l enseignant R glage des bains marie 56 et 100 C Temps requis 30 minutes Mat riaux requis Tubes avec bouchon vis Microtubes essai Matrice InstaGene Pinces pour pr p foll pileux Micropipette P 20 2 20 yl Ciseaux pour pr p foll pileux Embouts
4. filtre 2 20 pl Cupules pour pr p cell joue Micropipette P 200 20 200 ul Prot ase pour pr p foll pileux Embouts filtre 20 200 pl Vortex Modes op ratoires 1 Aliquotez la matrice InstaGene pr paration de cellules de joue A Homog n isez la matrice InstaGene en agitant la bouteille doucement ou en la passant au vortex plusieurs fois pour remettre la matrice en suspension Assurez vous que la matrice est bien m lang e lorsque vous l aliquotez Les billes se d posent rapidement dans la solution aussi homog n isez doucement la bouteille plusieurs fois au cours de l aliquotage B Pipetez 200 ul de matrice InstaGene dans chaque tube avec bouchon vis Distribuez un tube chaque l ve Chaque poste de travail des l ves doit disposer de 4 tubes de matrice pour 4 l ves 2 Pr parez et aliquotez la matrice InstaGene avec la prot ase mode op ratoire pour les follicules pileux A Pr parez une solution de matrice InstaGene contenant 66 ug ml de prot ase La prot ase r f rence 166 2003EDU est fournie une concentration de 20 mg ml Pour obtenir 66 ug ml diluez la prot ase m re au 1 300 en volume dans la matrice InstaGene Par exemple pour fabriquer 5 ml de matrice InstaGene contenant 66 ug ml de prot ase suffisamment pour approximativement 20 l ves e Aliquotez 5 ml de matrice InstaGene dans un nouveau tube assurez vous d homog n iser le puits de InstaGene avant l
5. otidiques diff rentes s hybrident chacune de leurs s quences de paires de bases compl mentaires respectives sur la matrice Les deux amorces sont con ues et synth tis es au laboratoire avec une s quence sp cifique de nucl otides de telle mani re qu elles peuvent s hybrider aux extr mit s oppos es et sur les brins oppos s de l longation d ADN double brin brin matrice amplifier Bulletin n 4110052FR Avant de pouvoir amplifier une r gion d ADN on doit identifier et d terminer la s quence d un morceau d ADN en amont et en aval de la r gion d int r t Ces r gions sont ensuite utilis es pour d terminer la s quence des amorces oligonucl otidiques qui seront synth tis es et utilis es comme points de d part pour la r plication de l ADN Les amorces sont compl mentaires des r gions en amont et en aval de la s quence amplifier aussi elles collent ou shybrident ces r gions Les amorces sont n cessaires parce que les ADN polym rases ne peuvent ajouter des nucl otides qu l extr mit d une cha ne pr existante L ADN polym rase utilis e dans la PCR doit tre une polym rase thermostable parce que la r action en cha ne de la polym rase passe par des cycles de temp ratures entre 60 C et 94 C L ADN polym rase thermostable Taq utilis e dans la PCR a t isol e partir d une bact rie thermophile Thermus aquaticus qui vit dans les conduits de vapeur temp rature lev e tels que ceux
6. transf r s dans un bloc thermique ou dans un bain marie r gl 72 C pendant 2 minutes Quarante cycles de PCR manuelle doivent prendre 3 heures C est fastidieux mais cela fonctionne Bonne chance 27 Bulletin n 4110052FR Cours 3 Electrophor se sur gel des chantillons de PCR amplifi s et coloration des gels d agarose Pr paration des chantillons pour l lectrophor se Avant de soumettre les chantillons amplifi s une lectrophor se les l ves doivent ajouter 10 ul de tampon de charge PV92 XC 5X dans chacun de leurs tubes de PCR Le tampon de charge d ADN contient du glyc rol qui augmente la densit de l chantillon et assure qu il sombre dans le puits du gel d agarose En outre le tampon de charge d ADN contient un colorant appel le Xyl ne Cyanole qui co migre la m me vitesse qu un fragment d ADN de 4000 pb vers l anode Quel volume d chantillon de PCR vaut il mieux charger sur les gels Pour une visibilit optimale vous devez charger 10 ul de chaque chantillon contr le 10 pl de marqueurs de poids mol culaire EZ Load standard d ADN et 20 ul des chantillons amplifi s des l ves sur chaque gel Un mod le de gel est fourni ci dessous et la configuration du gel est galement d crite Figure 7 Contr les chantillons des l ves MMR F 7 Configuration du gel 1 gel pour 4 l ves 8 gels pour 32 l ves Couloir Echantillon Volume de chargement 1
7. ves Avant le Cours 3 Pr paration du colorant d ADN Fast Blast 20 min Installation des postes de travail des l ves Avant le Cours 4 Installation des postes de travail des l ves 10 min Remarque Choisissez l une des deux options de pr paration de l ADN matrice Liste de contr le quotidien des l ments des postes de travail Postes de travail des l ves Les mat riaux et les consommables n cessaires pour chaque poste de travail des l ves avant l exercice sont list s ci dessous Les composants fournis dans ce kit sont suffisants pour 8 postes de travail avec 4 l ves chaque poste Poste de travail commun de l enseignant Les mat riaux les consommables et les instruments n cessaires un emplacement accessible tous les l ves sont galement list s ci dessous C est l enseignant de d cider si les l ves auront acc s aux solutions tampons instruments communs ou si l enseignant aliquotera les solutions et fera fonctionner les instruments Cours 1 Pr paration de l ADN matrice Postes de travail des l ves Quantit par poste V Microtubes essai de 1 5 ml pour le MO pour les cellules de la joue 4 m Tubes avec bouchon vis avec la matrice InstaGene pour le MO 4 n pour les cellules de la joue 7 Tubes avec bouchon vis avec la matrice InstaGene et la prot ase 4 n pour le MO pour les follicules pileux Supporfs de microtubes essai en mousse 2 Q Micropipette P 20 pour le MO p
8. viter de colorer vos v tements Eliminez les solutions colorantes selon les modes op ratoires suivis sur votre site Utilisez soit de l eau de Javel 10 soit une solution d alcool 70 pour liminer le Fast Blast de la plupart des surfaces V rifiez que ces solutions ne sont pas nocives pour la surface avant de les utiliser 1 Pour pr parer du colorant 100X pour la coloration rapide diluez 100 ml de Fast Blast 500X avec 400 ml d eau distill e ou d min ralis e dans un ballon ou une bouteille de taille appropri e et m langez Couvrez le ballon et stockez le temp rature ambiante jusqu ce que vous soyez pr t l utiliser 2 Pour pr parer du colorant 1X pour la coloration pendant une nuit diluez 1 ml de Fast Blast 500X avec 499 mi d eau distil e ou d min ralis e dans un ballon ou une bouteille de taille appropri e et m langez Couvrez le ballon et stockez le temp rature ambiante jusqu ce que vous soyez pr t l utiliser Note e Nous recommandons l utilisation de 120 mi de Fast Blast dilu pour colorer deux gels d agarose de 7 x 7 cm ou de 7 x 10 cm dans des plateaux de coloration individuels fournis dans le kit vous pouvez souhaiter faire une encoche aux coins des gels pour une identification Si vous utilisez d autres plateaux de coloration ajoutez un volume suffisant de solution colorante pour submerger compl tement les gels __ Apr s l lectrophor se vous devez retirer les gels d agarose de
9. D naturation 94 C 5 Fragments de 5 3 longueur pr cise Hybridation des amorces 60 C 3 5 Marsanta 5 5 ne mn mL LEE 3 Extension des nouveaux brins 72 C x 5 ST CCCCCCLLLLLLLLLLLLL bi ES 3 f TTTTTLTTTTTTTFLLLtLTLTttr n 5 5 3 Total de 40 cycles Fig 5 G n ration de fragments de longueur pr cise Ce sont les brins matrices de la longueur pr cise qui sont amplifi s exponentiellement X o X le nombre de brins matrices d origine et n le nombre de cycles Il y a toujours un jeu de mol cules d ADN matrice de la longueur d origine qui n est pas totalement dupliqu Apr s chaque cycle thermique deux brins de longueur interm diaire sont produits mais parce qu ils ne peuvent tre g n r s qu partir des brins matrices d origine les brins interm diaires ne sont pas amplifi s exponentiellement Ce sont les brins de longueur pr cise g n r s partir des brins interm diaires qui s amplifient exponentiellement chaque cycle Par cons quent si 20 cycles thermiques ont t conduits partir d une mol cule d ADN double brin il y aura 1 jeu de brins d ADN g nomique matrice d origine 20 jeux de brins matrices interm diaires et 1 048 576 jeux de brins matrices de la longueur pr cise Apr s 40 cycles 1 jeu de brins d ADN g nomique matrice d origine 40 jeux de brins matrices interm diaires et 1 1 x 10 jeux de brins matrices de la longueur pr cise Figure 6
10. O O D D D D D Film de support de gel pour agarose R f rence 170 2984EDU 1 Plate forme basculante R f rence 166 0719EDU Vortex Feuilles d ac tate pour le tra age des gels 1 1 8 0 0 0 D Stockage et stabilit Bien que le kit soit exp di dans des conditions ambiantes les composants sont garantis pendant 1 an partir de la date d achat lorsqu ils sont stock s dans les conditions appropri es Le kit contient des composants sensibles la chaleur Ouvrez imm diatement le kit et stockez les composants soit 20 C soit 4 C soit temp rature ambiante selon les indications Bulletin n 411005 2FR Contexte pour les enseignants Introduction la PCR En 1983 Kary Mullis de Cetus Corporation a d velopp la technique de biologie mol culaire qui depuis a r volutionn la recherche en g n tique ce qui lui a valu le Prix Nobel en 1993 Cette technique appel e la technique d amplification PCR a transform la biologie mol culaire en outil de recherche multidisciplinaire Nombre de techniques de biologie mol culaire utilis es avant la PCR taient laborieuses demandaient beaucoup de temps et r clamaient un niveau lev d exp rience technique En outre travailler avec seulement des traces d ADN rendait difficile pour les chercheurs dans d autres domaines biologiques pathologie botanique zoologie pharmacie etc d incorporer la biologie
11. Pinces pour le mode op ratoire pour le follicule pileux Ciseaux ou lame de rasoir pour le mode op ratoire pour le follicule pileux LICICIC L ODDO OD Installation de l enseignant ou instruments des TP Quantit par ki Micropipettes P 20 2 20 ul R f rence 166 0506EDU 1 Micropipettes P 200 20 200 ul R f rence 166 0507EDU 1 Micropipettes P 1000 100 1000 ul R f rence 166 0508EDU 1 Embouts de pipette Xcluda type filtre de PCR 1 2 20 ul R f rence 211 2006EDU 3 portoirs 20 200 ul R f rence 211 2016EDU 3 portoirs 100 1000 ul R f rence 211 2021EDU 1 portoir Thermocycler Gene CyclerTM R f rence 170 6700EDU ou 1 Thermocycler MyCyclerTM R f rence 170 9701EDU 1 Four micro ondes 1 Bain marie 56 et 100 C R f rence 166 0504EDU 1 de chaque Prot ase R f rence 166 2003EDU uniquement pour le mode op ratoire pour le follicule pileux 1 3 ml Solution saline 0 9 500 ml Eau distil e ou d min ralis e 500 mi Ballon dErlenmeyer de 1000 ml pour pr parer l agarose 1 Ballon ou b cher de 500 ml pour la coloration de l ADN 1 Bande adh sive de TP pas du Scotch 1 Microcentrifugeuse R f rence 166 0612EDU ou 1 Minicentrifugeuse R f rence 166 0613EDU 4 Accessoires facultatifs Quantit par class iDO DDD DD
12. aliquotage e Ajoutez 17 ul de prot ase m re aux 5 ml de matrice InstaGene B Pipetez 200 ul de matrice InstaGene avec la prot ase dans chaque tube avec bouchon vis Distribuez un tube chaque l ve Chaque poste de travail des l ves doit disposer de 4 tubes matrice pour 4 l ves 3 Pr parez et aliquotez la solution saline mode op ratoire pour les cellules de la joue A Pr parez une solution saline 0 9 Une bouteille de 500 ml d eau potable ajoutez 4 5 grammes de sel non iod Le sel de table est recommand Retournez la bouteille jusqu ce que le sel entre en solution B Pour chaque l ve placez 10 ml de solution saline dans un r cipient s par Chaque poste de travail d l ves doit disposer de 4 r cipients de solution saline Choisissez l une des deux m thodes 16 Bulletin n 4110052FR Cours 2 Amplification par PCR Pr paration pr alable pour 8 postes de travail d l ves Objectifs Pr paration de la solution d amplification compl te en y m langeant les amorces et aliquotez pas plus de 30 minutes avant les cycles de PCR Installation des r actions de PCR contr les Programmation du thermocycler Gene Cycler ou MyCycler Couler les gels d agarose Si vous demandez vos l ves de couler leurs propres gels au cours du TP pr parez l agarose l avance L agarose une fois fondu peut tre conserv dans un bain marie r gl 45 50 C jusqu ce que les l ves l utilis
13. ballon contenant l agarose et le tampon Chauffez le m lange jusqu bullition tout en agitant sur une plaque br lante magn tique Les bulles ou la mousse doivent se rompre avant de s lever vers le col du ballon Portez la solution bullition jusqu la dissolution de toutes les petites particules transparentes d agarose Avec la petite fiole toujours en place mettez l agarose de c t pour refroidir 60 C avant de couler les gels M thode du four micro ondes Placez la solution d agarose dans le four micro ondes Desserrez le bouchon de la bouteille s il y en a un Utilisez une puissance moyenne et r glez sur 3 minutes Arr tez le four micro ondes toutes les 30 secondes et faites tourner le ballon pour mettre en suspension l agarose non dissous Cette technique est le moyen le plus rapide et le plus s curitaire pour dissoudre l agarose Portez bullition et faites tourner la solution jusqu la dissolution de toutes les petites particules transparentes d agarose Avec la petite fiole toujours en place mettez l agarose de c t pour refroidir 60 C avant de couler les gels Des gels d agarose pr coul s pratiques r f rence 161 3057EDU sont disponibles chez Bio Rad Ce sont des gels de TAE 1 2 x 8 puits 19 Bulletin n 4110052FR Mode op ratoire pour le moulage des gels En utilisant le syst me Mini Sub Cell GT de Bio Rad les gels peuvent tre coul s directement dans la cuve en utilisant des b
14. dATP dTTP dCTP et dGTP du tampon et de la Taq ADN polym rase La solution d amplification compl te est pr par e en ajoutant des amorces la solution d amplification juste avant la p riode de travaux pratiques Ainsi lorsqu un aliquot de 20 pl du lysat de cellules de la joue ou de follicules pileux qui fournit l ADN matrice est ajout un aliquot de 20 yl de solution d amplification compl te tous les composants n cessaires pour une r action de PCR de 40 yl sont pr sents La solution d amplification 2X contient 0 05 unit s ul de Tag ADN polym rase 3 mM de MgCl 1 6 mM de dNTP et 1 uM de chaque amorce La concentration finale 1X ou de travail de ces composants dans le tube de PCR apr s l association des amorces de la solution d amplification et de la matrice sera sup rieure de la moiti des valeurs ci dessus Remarque Une fois que la solution d amplification et les amorces ont t m lang s ils doivent tre conserv s sur de la glace et utilis s dans les 15 30 minutes Ces r actifs sont extr mement sensibles 26 Bulletin n 4110052FR Pourquoi les amorces sont elles jaunes Le m lange des amorces contient un colorant compatible avec la PCR appel la tartrazine qui co migre avec de l ADN de 50 pb Ce colorant jaune a t ajout pour permettre aux l ves de visualiser facilement l chantillon La PCR dans un thermocycler L amplification par PCR a lieu dans un thermocycler qui effectue des cycles d
15. enzymes qui sont naturellement pr sentes dans les suspensions cellulaires et qui pourraient d grader l ADN g nomique et inhiber les r actions de PCR Le chauffage des chantillons de cellules 100 C rompt les membranes cellulaires lib rant de cette mani re le contenu cellulaire qui comprend l ADN g nomique L ADN g nomique sert de matrice dans les r actions de PCR D Dois je liminer la matrice InstaGene avant la PCR Il est extr mement important de transformer en culot les billes de InstaGene compl tement au fond du tube avant de pr lever un aliquot du lysat pour la r action de PCR Les billes se fixent aux cations bivalents tels que Mg qui sont essentiels la fonction de la Tag ADN polym rase Ainsi si des billes sont transport es dans la r action de PCR celle ci pourrait tre inhib e La matrice InstaGene peut tre transform e en culot de mani re efficace par centrifugation 6000 x g pendant 5 min Le surnageant au dessus des billes qui contient l ADN g nomique est pr lev pour la r action de PCR Pr levez soigneusement 20 pl du surnageant sans d ranger la matrice InstaGene et transf rez les dans un tube de PCR qui est d pos dans un adaptateur sans bouchon Surnageant Matrice ADN matrice Cours 2 Amplification par PCR des chantillons d ADN g nomique Solution d amplification Qu est ce que c est La solution d amplification contient un m lange de nucl otides ou dNTP
16. exp dition 1 Pr parez la solution d amplification compl te en ajoutant les amorces Pour obtenir les meilleurs r sultats vous devez r aliser les tapes suivantes dans les 15 30 minutes qui suivent la r action de PCR A Pipetez 1100 ul de la solution d amplification dans un microtube essai tiquet Si vous choisissez d amplifier 16 chantillons d l ve ou moins divisez la solution d amplification dans deux tubes avec 550 ul chacun Un tube sera imm diatement utilis et la solution d amplification restant peut tre de nouveau congel pour un usage ult rieur Pour 32 l ves ou 8 postes de travail d l ves divisez en deux pour 16 l ves tiquetez 8 microtubes essai SA et placez les tubes sur de la glace Ajoutez 22 ul du m lange des amorces aux 1100 ui de la solution d amplification Passez au vortex pendant 10 secondes pour homog n iser Il est imp ratif que la solution d amplification soit uniform ment homog n is apr s l addition des amorces La solution doit tre jaune 17 Bulletin n 4110052FR Les amorces sont fournies sous la forme d une solution jaune concentr e dans un tampon Tris Puisque les amorces sont beaucoup plus stables sous une forme concentr e ajoutez les amorces la solution d amplification juste avant de commencer l exercice des travaux pratiques Pas plus de 15 30 minutes avant l amplification par PCR Le g el sanh EEE g VJ Y
17. leurs plateaux avant de les d poser dans la solution colorante Ceci s accomplit facilement en tenant la base du plateaux de gels d une main et en expulsant doucement le gel avec le pouce de l autre main e Parce que le gel est fragile faites particuli rement attention lorsque vous le manipulez Nous vous recommandons fortement d utiliser une grande spatule ou une autre surface de support pour transf rer le gel d un r cipient un autre au cours des tapes de d coloration impliqu es dans le mode op ratoire de coloration rapide La d coloration pour le mode op ratoire de la coloration rapide n cessite l utilisation d au moins un r cipient de grand volume pouvant contenir au moins 500 ml chaque poste de travail des l ves Chaque groupe d l ves peut utiliser des r cipients de lavages s par s pour chaque tape de lavage ou ils peuvent simplement utiliser un seul r cipient qui est vid apr s chaque lavage et rempli pour le lavage suivant l est important que vous secouiez les gels doucement et de mani re intermittente durant la coloration pendant une nuit dans du colorant d ADN Fast Blast les petits fragments d ADN tendent diffuser sans agitation Le Fast Blast 100X peut tre r utilis au moins 7 fois e l n est pas n cessaire de laver ou de d colorer lorsque vous suivez le mode op ratoire de coloration pendant une nuit 22 Bulletin n 4110052FR Cours 4 Analyse et interpr tation des r
18. mol culaire dans leurs sch mas de recherche La PCR a eu un impact sur quatre domaines principaux de la biotechnologie la cartographie des g nes le clonage le s quen age de l ADN et la d tection de g nes La PCR est pr sent utilis e comme outil de diagnostic m dical pour d tecter des mutations sp cifiques qui peuvent tre responsables de maladies g n tiques dans des enqu tes criminelles et des tribunaux pour identifier des suspects un niveau mol culaire et dans le s quen age du g nome humain Avant la PCR l utilisation de techniques de biologie mol culaire pour des objectifs th rapeutiques m dico l gaux pharmaceutiques ou m dicaux n tait pas pratique ou elle tait on reuse Le d veloppement de la technologie de la PCR a fait passer ces aspects de la biologie mol culaire d une science difficile l un des outils les plus accessibles et les plus largement utilis s en recherche g n tique et m dicale La PCR et la biotechnologie Qu est ce que c est et pourquoi cela a t il r volutionn toute une communaut de recherche La PCR produit des quantit s exponentiellement importantes d un fragment sp cifique d ADN partir de traces de mat riau de d part matrice La matrice peut tre toute forme d ADN double brin tel que de l ADN g nomique Un chercheur peut pr lever des traces d ADN partir d une goutte de sang d un simple follicule pileux ou d une cellule de la joue et utiliser la PCR po
19. tape d hybridation tape d longation Bulletin n 4110052FR D naturation des brins 94 C 0 kh E SNINE AAN Hybridation des amorces 60 C La Taq polym rase reconna t les extr mit s 3 des arnorees Extension 72 C Synth se d un nouveau brin R p tition du cycle 40 fois Fig 4 Un cycle complet de PCR Habituellement le cycle thermique continue pendant environ 40 cycles Apr s chaque cycle thermique le nombre de brins de la matrice double ce qui entra ne une augmentation exponentielle du nombre de brins de l ADN matrice Apr s 40 cycles il y aura 1 1 x 10 copies de plus du nombre d origine de mol cules d ADN matrice La PCR g n re de l ADN d une longueur et d une s quence pr cises Lors du premier cycle les deux amorces s hybrident aux brins de l ADN g nomique matrice d origine aux extr mit s oppos es et sur les brins oppos s Au terme du premier cycle de temp ratures deux nouveaux brins sont g n r s lesquels sont plus courts que les brins matrices d origine mais cependant plus longs que la longueur de l ADN que le chercheur souhaite amplifier Ce n est pas avant le troisi me cycle thermique que des fragments de la longueur pr cise sont g n r s Figure 5 Bulletin n 4110052FR 5 AE EE EEE EEE ET F Etape d extension du cycle 1 4 4 D naturation 94 C 5 Houvelles matrices interm diaires 5 Hybridation des amorces 60 C
20. 5 Biotechnology Explorer Kit PCR Chromosome 16 PV92 R f rence 166 2100EDU http explorer bio rad fr Remarque Le kit contient des r actifs sensibles la chaleur A l arriv e ouvrez imm diatement et stockez les composants 20 C ou 4 C comme il est indiqu La duplication de toute partie de ce document n est autoris e que pour l usage en classe Pour le service technique composez le 01 47 95 69 64 Bulletin n 4110052FR Bienvenue au programme Biotechnology Explorer Les avanc es techniques de ces quelques derni res d cennies ont cr une nouvelle branche de la science la biotechnologie qui a transform et r volutionn la recherche en sciences de la vie Des techniques puissantes d isolement d analyse et de manipulation de l ADN l l ment structural de base de la vie ont d j permis de nombreuses d couvertes pour comprendre des processus biologiques des tats pathologiques humains et des m thodologies th rapeutiques Pour ces raisons il est devenu de plus en plus important de pr senter ces concepts aux l ves Dans les d cennies venir lorsqu une visite de routine au m decin de la famille pourra comprendre toute une batterie de tests de diagnostic sur l ADN et que les empreintes g n tiques deviendront la forme d finitive de l identification personnelle la compr hension de ces principes sera aussi importante que les enseignements sur l hygi ne et la nutrition Pour en
21. 500X qui doit tre dilu avant utilisation Le colorant peut tre utilis comme un colorant rapide lorsqu il est dilu 100X pour permettre la visualisation de l ADN en 12 15 minutes ou il peut tre utilis comme un colorant pendant une nuit lorsqu il est dilu 1X Lorsqu un gel d agarose est immerg dans du colorant d ADN Fast Blast les mol cules de colorant se fixent aux mol cules d ADN pi g es dans le gel d agarose Lorsque les bandes d ADN sont visibles vos l ves peuvent d terminer leurs g notypes pour l insert Alu Le colorant d ADN Fast Blast est une alternative pratique sans risque et non toxique au bromure d thidium pour la d tection de l ADN dans des gels d agarose apr s l lectrophor se Fast Blast contient un compos cationique qui appartient la famille de colorants des thiazines Les mol cules de colorant charg es positivement sont attir es par et se lient aux groupes phosphates charg s n gativement sur l ADN La formule d pos e du colorant colore l ADN en bleu profond dans les gels d agarose et fournit des r sultats tr s nets et coh rents 21 Bulletin n 4110052FR AVERTISSEMENT Bien que le colorant d ADN Fast Blast soit non toxique et non canc rig ne vous devez porter des gants en latex ou en vinyle lors de la manipulation du colorant ou des gels color s pour emp cher vos mains de devenir bleues Vous devez porter des blouses de laboratoire ou d autres v tements de protection pour
22. Bulletin n 4110052FR D part Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 Nombre final apr s 20 cycles ADWnaiioc 1 ADN interm diaire 20 Aide longueur pr cise 1048576 Fig 6 Sch ma de l amplification par PCR de fragments d ADN 10 S A 5 k th Cycle 6 Bulletin n 4110052FR 11 Bulletin n 4110052FR Contenu sugg r des cours Il y a quatre cours dans ce programme sur la PCR Tous les cours sont con us pour tre r alis s en p riodes cons cutives de 50 minutes Les cours 1 et 2 pr sentent des points d arr t pratiques et deux options Les enseignants doivent choisir la pr paration d ADN de cellules de la joue ou de follicule pileux Les enseignants peuvent souhaiter pr senter aux l ves l une ou l autre m thode en option ou ils peuvent choisir de r aliser un mode op ratoire particulier selon les restrictions locales Les chantillons peuvent tre stock s pendant plusieurs jours pour concilier les week ends et les TP qui se d roulent tous les deux jours Emploi du temps des l ves Cours 1 Activit Cours 1 Activit Cours 2 Activit Cours 3 Activit Cours 4 Activit Pr paration de l ADN matrice de cellules de la joue Isolement de cellules de la joue Pr paration d ADN g nomique provenant de cellules de la joue Point d arr t Pr paration de l ADN matrice de follicules pileux Isolement de cheveux Pr paration d ADN g n
23. MPM 10 yl 2 Contr le homozygote 10 pl 3 Contr le homozygote 10 pl 4 Contr le h t rozygote 10 pl 5 El ve 1 20 pl 6 El ve 2 20 pl 7 El ve 3 20 pl 8 El ve 4 20 yl MPM marqueurs de poids mol culaire standard d ADN Fig 7 Mod le de gel et ordre sugg r de chargement des chantillons 28 Bulletin n 4110052FR Coloration des gels Des instructions d taill es sur l utilisation du colorant d ADN Fast Blast sont incluses dans le manuel de l l ve A cause de l paisseur des gels un mouvement de bascule doux sur une table agitation produit une coloration plus efficace Les gels peuvent tre galement color s et visualis s avec du bromure d thidium non inclus dans le kit Si vous utilisez du bromure d thidium comme colorant les gels doivent contenir 0 05 ug ml de bromure d thidium dans l agarose Cette concentration de bromure d thidium produit un contraste maximal des bandes amplifi es Remarque Le colorant d ADN Fast Blast stoppe la coloration du bromure d thidium aussi il vous faut visualiser avec le bromure d thidium avant le colorant Fast Blast Cours 4 Analyse et interpr tation des r sultats Une fois que le gel a t color avec le colorant d ADN Fast Blast en utilisant le mode op ratoire de coloration soit rapide soit pendant une nuit il sera analys Parce que les bandes palissent l g rement lors du s chage du gel il vaut mieux analyser les gels co
24. ai avec bouchons attach s 1 5 ml 60 n Supports de microtubes essai en mousse 16 n Plateaux de coloration des gels 4 m Manuel a Recharges disponibles s par ment Recharge TS de kit PV92 PCR 166 2119EDU comprend des amorces de PCR des contr les positifs des marqueurs de poids mol culaire d ADN de la solution d amplification contenant des dNTP du tampon de l ADN polym rase Recharge TR du kit PV92 PCR 166 2139EDU comprend la matrice InstaGene le tampon de charge PV92 XC ADN le colorant d ADN Fast Blast l agarose du TAE 50X Bulletin n 4110052FR Accessoires n cessaires Non inclus dans ce kit Poste de travail des l ves Quantit par poste Micropipettes P 20 2 20 ul R f rence 166 0506EDU ou pipette volume fixe de 10 ul 1 et pipette volume fixe de 20 ul 1 Embouts de pipette Xcluda type filtre 2 20 ul R f rence 211 2006EDU 1 portoir Chambre d lectrophor se Mini Sub Cell GT avec plateau de gel de 7 x 7 cm peigne pour 8 puits R f rence 166 4400EDU Alimentation lectrique PowerPac Junior R f rence 165 5048EDU ou Alimentation lectrique PowerPac Basic R f rence 164 5050EDU Seau de glace avec de la glace en cubes ou pil e Marqueur permanent Grands r cipients pour la d coloration si applicable R cipients avec 10 ml de solution saline 0 9 Copie du mode op ratoire
25. arri res de coul es avec le plateau de gels Si vous ne disposez pas de barri res de coul es utilisez la m thode avec du scotch autoclave pour le moulage des gels telle que pr sent e ci dessous D autres m thodes sont d taill es dans le manuel d instructions du Bio Rad Sub Cell GT Etape 1 Scellez bien les extr mit s du plateau de gels avec du scotch autoclave Pressez fermement sur le scotch aux bords du plateau de gels pour former un joint tanche aux liquides Etape 2 Uniformisez le plateau de gels sur une table d uniformisation ou une paillasse en utilisant le niveau bulle fourni avec l instrument Etape 3 Pr parez la concentration et la quantit souhait es d agarose dans du tampon d lectrophor se TAE 1X Portez l agarose bullition jusqu dissolution Etape 4 Refroidissez l agarose au moins 60 C avant de verser Etape 5 Alors que l agarose refroidit 60 C placez le peigne dans la fente appropri e du plateau de gels Les peignes doivent tre plac s 2 cm de l extr mit du plateau de moulage des gels pas au milieu du gel Etape 6 Laissez le gel se solidifier temp rature ambiante pendant 10 20 minutes il est translucide lorsqu il est pr t l emploi Etape 7 Retirez le peigne avec pr caution du gel solidifi Retirez le scotch des bords du plateau de gels Etape 8 Placez le plateau sur la cuve d lectrophor se d ADN niveau de mani re ce que les puits de
26. de la solution d amplification et de l ADN g nomique diminue l efficacit de l amplification Les thermocyclers de Bio Rad ont t d velopp s pour fonctionner sans huile De l huile n est pas n cessaire dans les puits des blocs thermiques ou dans les tubes des chantillons Les puits des chantillons ont une certaine forme permettant un contact uniforme avec la plupart des tubes de PCR paroi fine de 200 yl N utilisez pas des microtubes essai paroi fine de 500 pi avec ces thermocyclers Le couvercle chauffant du bloc des chantillons maintient une temp rature sup rieure au bloc des chantillons tout moment au cours d un programme de cycles thermiques Ceci emp che la vapeur d eau de se condenser sous le bouchon du tube chantillon r duisant de cette mani re l vaporation des chantillons et liminant le besoin de surcouches d huile dans les tubes La PCR manuelle Il est possible de r aliser manuellement la PCR sans un thermocycler automatis bien que la PCR ne soit pas aussi efficace Pour une amplification par PCR manuelle les r actions doivent tre r alis es dans des tubes avec des bouchons vis et surmont es d une goutte d huile min rale pour emp cher l vaporation Les tubes sont d pos s dans un bloc thermique ou dans un bain marie r gl 95 C pendant 1 minute puis ils sont transf r s manuellement dans un bloc thermique ou un bain marie r gl 60 C pendant 1 minute et finalement ils sont
27. de travail des l ves de mani re ce que les aliquots contiennent des quantit s quivalentes de billes Chaque l ve pr parera de l ADN g nomique partir de cellules de la joue isol es en utilisant un bain de bouche salin ou partir de follicules pileux Pour les l ves utilisant le mode op ratoire pour les cellules de la joue 1 mi de cellules recueillies en utilisant du bain de bouche procure suffisamment de mat riau pour la pr paration de l ADN Certains l ves peuvent avoir besoin d utiliser 2 ml ou plus de bain de bouche salin pour obtenir suffisamment de cellules pour pr parer l ADN Veuillez noter il n est pas recommand d utiliser plus de 3 ml de bain de bouche salin pour pr parer l ADN voir Interpr tation des r sultats et Guide de d pannage la page 30 Une fois que les cellules ont t centrifug es dans une centrifugeuse un culot cellulaire d environ la taille d une t te d allumette devra fournir assez de cellules pour les tapes suivantes Il n est pas recommand de manger avant le recueil des cellules car les particules alimentaires peuvent rendre la pr paration des cellules plus difficile Si vous ne disposez pas d une micropipette P 1000 les l ves peuvent verser soigneusement 1 ml de la solution saline utilis e pour se rincer la bouche dans un microtube essai Les gradations figurant sur le c t du microtube essai peuvent tre utilis es pour juger de la quantit de liquide dans
28. e de la cuve Retirez soigneusement le plateau de gels et le gel de la cuve Faites attention le gel est tr s glissant D logez le gel du plateau de gels avec votre pouce et glissez le soigneusement dans votre plateau de coloration en plastique 37 Bulletin n 4110052FR 2 ll existe deux modes op ratoires pour la coloration de votre gel Votre enseignant vous dira lequel suivre Mode op ratoire 1 Coloration rapide n cessite 12 15 minutes a Ajoutez 120 ml de colorant Fast Blast 100X dans votre plateau de coloration 2 gels par plateau Colorez les gels pendant 2 minutes avec une agitation douce Gardez le colorant utilis pour un usage ult rieur Le colorant peut tre r utilis au moins 7 fois Transf rez les gels dans un grand r cipient de lavage et rincez avec de l eau du robinet chaude 40 55 pendant approximativement 10 secondes D colorez en les lavant chacun deux fois dans de l eau du robinet chaude pendant 5 minutes en agitant doucement pour obtenir les meilleurs r sultats Placez le gel sur un fond clair et enregistrez votre r sultat Avec un marqueur permanent tracez les puits et les aspects des bandes sur une feuille de plastique transparent ou une feuille d ac tate Avec l aide de votre enseignant d terminez si vous tes homozygote ou h t rozygote pour l insertion de Alu D coupez tous les couloirs vides du gel avec un couteau ou une lame de rasoir Pour obtenir un e
29. ent Installation des postes de travail des l ves et de l enseignant Temps requis 1 1 5 heure selon comment vous choisissez de pr parer les gels d agarose Pr paration de la solution d amplification et installation des chantillons vers la fin de la pr paration pr alable Mat riaux requis Microtubes essai avec bouchons attach s Tubes avec bouchons vis Solution d amplification M lange des amorces Contr le PV92 homozygote Contr le PV92 homozygote Contr le PV92 h t rozygote 12 tubes de PCR Cuves d lectrophor se plateaux de moulage et peignes Tampon d lectrophor se TAE 50X Poudre d agarose Micropipettes P 20 et P 200 Embouts filtre 20 200 ul et 100 1000 pl Le thermocycler Gene Cycler peut recevoir 24 chantillons tandis que le thermocycler MyCycler supporte 96 chantillons Si vous utilisez le Gene Cycler vous devrez faire fonctionner la machine de PCR plus d une fois s il y a plus de 24 chantillons y compris les chantillons contr les positifs Pour obtenir les meilleurs r sultats ne pr parez pas les r actions des l ves et les chantillons contr les plus de 30 minutes avant les cycles de PCR Modes op ratoires Remarque Avant d ouvrir l un quelconque des tubes de r actif centrifugez le contenu 3 secondes dans une centrifugeuse pour entra ner le contenu au fond des tubes Le contenu se loge souvent sous les bouchons au cours de l
30. eux conscience et comprennent mieux les applications de la biotechnologie qui influencera de plus en plus leur vie et affectera leurs d cisions personnelles et communautaires D velopp s sur cinq ans en collaboration avec le San Francisco Bay Area Biotechnology Educational Consortium Rutgers University Maxygen Inc et le Stanford Human Genome Center Education Program nos cours et nos kits ont t cr s par des enseignants et des scientifiques qui ont travaill ensemble Nous nous effor ons continuellement d am liorer nos cours et nos produits Votre contribution est extr mement importante pour nous Vos histoires commentaires et suggestions sont les bienvenus L quipe Bio Education Bio Rad division Bio Recherche 3 bd Raymond Poincar 92430 Marnes la Coquette Bulletin n 4110052FR Sommaire Page Guide de l enseignant Liste de contr le de la composition du kit 2 27 112111331235 5551 1 111kg re 1 Contexte pour les enseignants Q2 2126116 n2 E1 101 5 10 t n He s4 t c n Hi 3 Cont nu sugg r deS COUS s62 21262 21165008 4511844 000584 61a 10004213843 238 Lao c2 L S C kg bg 2 c ere 12 G n ralit s sur la pr paration pr alable par l enseignant c c2 s xxx 13 Pr paration pr alable par l enseignant 16 PointS du cours a souligner 2224 rite Re tn M On Let Et ta 25 Interpr tation des r sultats et guide de d pannage ccS BS 30 Modes
31. goureusement pendant 30 secondes Recrachez la solution saline dans le r cipient Transf rez 1 ml de votre solution saline dans le microtube essai PAS le tube avec bouchon vis portant vos initiales Si vous ne disposez pas de micropipette P 1000 versez soigneusement 1 mi de votre rin age salin dans votre microtube essai utilisez les graduations figurant sur le c t du microtube essai pour estimer 1 m Centrifugez votre tube dans une centrifugeuse quilibr e pleine vitesse pendant 2 minutes Lorsque la centrifugeuse s est compl tement arr t e retirez votre tube Vous devez observer un culot de cellules blanch tres de la taille d une t te d allumette au fond du tube Si vous n observez pas un culot de cette taille d cantez la solution saline remplissez votre tube avec davantage de rin age oral et r p tez la centrifugation Apr s la formation d un culot de vos cellules d versez la solution saline En prenant soin de ne pas perdre votre culot s chez bri vement votre tube sur une serviette en papier ou un tissu II ny a pas de probl me si une petite quantit de solution saline lt 50 pi environ la m me taille que votre culot demeure au fond du tube Remettre le culot en suspension avec un vortex ou en tapotant le tube de mani re ce qu aucun agr gat cellulaire ne demeure En utilisant une micropipette volume ajustable de 2 20 lil r gl e sur 20 li transf rez la to
32. homozygotes cause d une bande sup rieure p le Un examen soigneux des gels est n cessaire pour faire la distinction entre des individus h t rozygotes et homozygotes Ou bien l utilisation de bromure d thidium et un instrument de photodocumentation le syst me de documentation de gels de Bio Rad augmentera la sensibilit et rendra plus facile la visualisation des chantillons h t rozygotes p les 2 Bande plus grosse dans les chantillons Les chantillons h t rozygotes contiendront souvent des bandes plus grosses qui migrent 1100 pb et 1700 pb dans le gel voir les bandes indiqu es par des fl ches sur le gel ci dessous Ces bandes sont des h t roduplex qui se forment entre les brins de 641 et 941 nucl otides et qui contiennent la structure secondaire qui fait que les bandes d ADN migrent une vitesse plus lente dans le gel Figure 8 S1 s2 s3 S4 A Insert Alu 300 bases 341 bases 641 bases Fig 8 H t roduplex form entre les brins de 641 et 941 nucl otides 31 Bulletin n 4110052FR 3 Formation de dim res d amorces Certaines r actions PCR peuvent montrer la formation de dim res d amorces Les dim res d amorces sont des bandes que l on observe en bas des gels et qui correspondent des complexes des deux amorces La formation de dim res d amorces est plus intense dans les r actions qui montrent peu ou pas de produit amplifi Ainsi la fo
33. icule pileux 1 Inscrivez vos initiales sur 1 tube avec bouchon vis contenant 200 ul de matrice InstaGene plus prot ase Pr levez 2 cheveux sur vous m me Choisissez des cheveux qui pr sentent une gaine visible rev tement de cellules pith liales pr s de la base du cheveu soit une racine de bonne taile base du cheveu en forme de bulbe Coupez le cheveu en laissant les 2 demiers cm de la base du cheveu D posez les cheveux coup s dans le tube avec bouchon vis portant vos initiales Placez votre tube dans le support de microtubes essai en mousse et incubez 56 C pendant 10 minutes dans un bain marie Au milieu de la p riode 5 minutes agitez ou passez doucement au vortex puis remettez le dans le bain marie 56 C pour les 5 minutes restantes 4 Retirez les tubes agitez les doucement ou passez les au vortex et d posez les dans un bain marie 100 C Incubez 100 C pendant 5 minutes Retirez les tubes du bain marie bouillant et agitez ou passez au vortex le contenu pour remettre en suspension Transformez la matrice en culot par centrifugation 6000 x g pendant 5 minutes ou 2000 x g pendant 10 minutes dans une centrifugeuse Stockez votre tube avec bouchon vis dans le r frig rateur jusqu la p riode de travaux pratiques suivante ou passez l tape 2 du cours 2 35 56 C 10 min 100 C 5 min Centrifugeuse Bulletin n 4110052FR Mode op ratoire
34. ifugeuse 14 Quantit par classe 1 1 bo te 1 bo te 1 de chaque 1 4 1 Quantit par poste 4 4 1 tube 1 1 de chaque N Oo 1 Quantit par classe 1 pour 2 postes 40 ml par gel 1 par poste 1 Bulletin n 4110052FR DDDLDLDLL D DO UK DDULDELELLLELB DUDLDLB Cours 3 Electrophor se sur gel des chantillons de PCR amplifi s et coloration des gels d agarose Postes de travail des l ves Gel d agarose Echantillons de PCR Tampon de charge d ADN PV92 XC Micropipette P 20 ou pipettes de volume fixe de 10 ul et 20 ul Marqueurs de poids mol culaire EZ Load standards Embouts de pipette type filtre 2 20 pi Marqueur permanent Support de microtubes essai en mousse Cuves et alimentation lectrique Plateau de coloration des gels Colorant d ADN Fast Blast solution 1X ou 100X Film de support de gel facultatif Feuilles dac tate transparente pour le tra age des gels facultatif Eau du robinet chaude pour la d coloration des gels pour le mode op ratoire de coloration rapide Grands r cipients pour la d coloration pour le mode op ratoire de coloration rapide R cipient d chets Copie du mode op ratoire Poste de travail de l enseignant Tampon d lectrophor se TAE 1X Echantillons contr les positifs amplifi s 4 de chaque PV92 homozygote PV92 homozygote PV92 h t rozygote Plate forme basculante facultatif
35. le tube Si les chantillons d ADN ne sont pas amplifi s dans les 24 heures vous pouvez les stocker dans le r frig rateur dans la matrice InstaGene pendant 1 semaine Pour un stockage plus long d posez les chantillons dans le cong lateur pour emp cher la d gradation de l ADN Avant d utiliser les chantillons dans la PCR les billes doivent tre remises en culot par centrifugation juste avant de constituer les r actions de PCR Toutefois il est recommand de traiter les chantillons dans les 24 heures Voir les tapes suivantes pour des conseils de traitement B Pr paration d ADN g nomique partir de cellules de la joue ou de follicules pileux Pour les l ves suivant le mode op ratoire pour l ADN de cellules de la joue les cellules sont recueillies en utilisant un bain de bouche salin Pour les l ves suivant le mode op ratoire pour l ADN des follicules pileux il est recommand aux l ves de recueillir deux cheveux pour la pr paration de l ADN g nomique Bulletin n 4110052FR 25 C Incubation Quelles sont les fonctions de chaque tape d incubation L tape de pr incubation est r alis e 56 C et elle a deux fonctions 1 Le chauffage de la suspension cellulaire aide rompre le tissu conjonctif qui maintient les cellules ensemble La rupture du tissu rend la lyse des cellules plus facile au cours de l tape d incubation suivante 100 C 2 La pr incubation 56 C inactive les ADNases des
36. lor s avant le s chage Les gels peuvent tre clair s par en dessous pour amplifier la visualisation des bandes a D posez votre gel sur un fond clair et enregistrez vos r sultats en faisant un sch ma comme suit Placez une feuille transparente de plastique ou d ac tate sur le gel Avec un marqueur permanent tracez les puits et les aspects des bandes sur la feuille en plastique pour fabriquer une image qui r plique votre gel Retirez la feuille en plastique pour une analyse ult rieure Ou bien les gels peuvent tre photocopi s sur une feuille jaune de film transparent pour un contraste optimal b S chez le gel d agarose comme enregistrement permanent de l exp rience i D coupez tous les couloirs non charg s avec un couteau ou une lame de rasoir Coupez votre gel du haut vers le bas pour liminer les couloirs dans lesquels vous n avez pas charg des chantillons ii D posez le gel directement sur le c t hydrophile d un morceau de film de support de gel L eau formera des billes sur le c t hydrophobe d un morceau de film de support de gel Centrez le gel et liminez les bulles qui peuvent se former entre le gel et le film D posez le film sur une serviette en papier et laissez le s cher dans une zone bien ventil e en vous assurant d viter une exposition directe la lumi re Alors que le gel s che il se fixera au film mais ne r tr cira pas S il n est pas d rang sur le film de support le gel s che
37. mbre parmi les individus On pense que les s quences des introns sont le r sultat de l accumulation diff rentielle tout au long de l volution de mutations qui sont transmises silencieusement aux descendants par le code h r ditaire C est cette diff rence dans les s quences des introns qui nous permet de d terminer la diversit g n tique humaine L identification de ces caract ristiques distinctives dans l ADN repr sente la base mol culaire de l identification humaine et de la g n tique d une population Tout au long de l volution les s quences des introns ont t la cible d insertions al atoires par des l ments dispers s r p titifs courts galement appel s SINE Les SINE se sont retrouv s ins r s au hasard au sein de nos introns au cours des millions d ann es Un de ces l ments r p titifs est appel la s quence Alu Figure 2 Il s agit d une s quence d ADN d environ 300 paires de bases de long qui est r p t e une copie la fois presque 500000 fois au sein du g nome humain L origine et la fonction de telles s quences r p t es de mani re al atoire ne sont pas encore connues Le nom Alu vient du site de reconnaissance de l enzyme de restriction Alu qui se trouve dans cette s quence Fig 2 Emplacement d une insertion Alu au sein d un intron Certains de ces l ments Alu pr sentent des caract ristiques qui les rendent tr s utiles pour les g n ticiens S ils sont pr sents au sein d in
38. minez les bulles qui peuvent se former entre le gel et le film D posez le film sur une serviette en papier et laissez le s cher assurez vous d viter toute exposition directe la lumi re Alors que le gel s che il se fixera au film mais ne r tr cira pas S il n est pas d rang sur le film de support le gel s chera compl tement temp rature ambiante apr s 2 3 jours Le r sultat sera un enregistrement plat transparent et durable de l exp rience Film de support de gel Remarque Evitez une exposition prolong e des gels s ch s la lumi re directe pour viter le palissement des bandes Toutefois les bandes d ADN r appara tront si les gels s ch s sont stock s l obscurit pendant 2 3 semaines apr s le palissement 23 Bulletin n 4110052FR Cours 5 Analyse des r sultats de la classe en utilisant la bioinformatique Pr paration pr alable Objectifs Se familiariser avec le Allele Server sur le site web du Dolan DNA Learning Center Inscription pour tablir un compte personnel gratuit Temps requis 30 45 minutes Mat riaux requis Aucun D marrage sur le Allele Server Remarque Le site web du Dolan DNA Learning Center est continuellement mis jour Certaines des informations suivantes peuvent changer 1 2 3 4 Sur votre explorateur internet allez vector cshl org Cliquez sur Resources Cliquez sur BioServers Sous Allele Server cliquez sur Register L inscriptio
39. n est gratuite et vous permet d tablir un compte personnel Il n est pas n cessaire de vous inscrire chaque fois que vous retournez sur ce site Utilisation du Allele Server 1 2 Connectez vous au Allele Server en utilisant le nom d utilisateur et le mot de passe que vous avez enregistr s Une fois que vous tes connect suivez les instructions fournies dans la fen tre d affichage pour utiliser le Allele Server Vous pouvez galement ouvrir une nouvelle fen tre et aller dnalc org help sad topic_3 html pour obtenir davantage d informations d taill es Suivez les instructions d taill es sur comment peupler l espace de travail analyser des groupes comparer des groupes et interroger la base de donn es Souvenez vous qu en tant qu utilisateur enregistr vous pouvez stockez tous les groupes que vous avez charg s dans votre base personnelle de Allele Server et les analyser votre convenance 24 Bulletin n 4110052FR Points du cours souligner Questions fr quemment pos es Cette partie d crit les tapes des modes op ratoires exp rimentaux qui peuvent poser des probl mes du point de vue technique ou qui sont extr mement importantes pour le r sultat global et la compr hension des exp riences Les enseignants doivent attirer l attention de leurs l ves sur ces points et lorsque c est possible montrer la technique avant que les l ves la tentent Le manuel de l l ve et le mode op ratoire contie
40. nnent des descriptions d taill es et des sch mas de toutes les tapes et techniques de travaux pratiques employ es dans chaque cours Reportez VOUS y si vous avez des questions propos des modes op ratoires exp rimentaux utilis s dans les TP Cours 1 Pr paration des chantillons Traitement des chantillons de cellules de la joue et de follicules pileux pour obtenir un ADN g nomique matrice pour la PCR A Matrice InstaGene Quelle est sa fonction La matrice InstaGene est constitu e d une suspension de billes microscopiques Chelex charg es n gativement qui fixent les cations bivalents comme le magn sium Mg II est important d liminer les cations bivalents des chantillons d ADN g nomique des l ves parce que les cations aident les enzymes qui d gradent l ADN matrice Lorsque des cellules de la joue ou des follicules pileux sont lys s et port s bullition en pr sence de matrice InstaGene les cations bivalents lib r s des cellules se fixent aux billes et la chaleur inactive les enzymes de d gradation de l ADN Les billes sont ensuite transform es en culot par centrifugation Le sumageant qui contient l ADN g nomique intact propre peut tre utilis comme matrice dans les r actions de PCR Les billes de la matrice InstaGene se d posent rapidement dans la solution Il est extr mement important que le flacon de matrice soit parfaitement homog n is avant de pipeter des aliquots pour chaque poste
41. nregistrement permanent s chez l air le gel sur le film de support du gel Collez le gel s ch dans votre cahier de TP Eviter toute exposition du gel color une lumi re directe qui fera p lir les bandes Mode op ratoire 2 Coloration pendant une nuit a Ajoutez 120 ml de colorant d ADN Fast Blast 1X dans votre plateau de coloration 2 gels par plateau Laissez les gels se colorer pendant une nuit avec une agitation douce pour obtenir les meilleurs r sultats Aucune d coloration n est n cessaire Le jour suivant videz le colorant dans un b cher d chet Placez le gel sur un fond clair et enregistrez votre r sultat Avec un marqueur permanent tracez les puits et les aspects des bandes sur une feuille de plastique transparent ou une feuille d ac tate Avec l aide de votre enseignant d terminez si vous tes homozygote ou h t rozygote pour l insertion de Alu D coupez tous les couloirs vides du gel avec un couteau ou une lame de rasoir Pour obtenir un enregistrement permanent s chez l air le gel sur le film de support du gel Collez le gel s ch dans votre cahier de TP Eviter toute exposition du gel color une lumi re directe qui fera p lir les bandes Bulletin n 4110052FR Bulletin n 4110052FR
42. odes op ratoires peuvent tre r alis s 1 ou 2 jours au pr alable par l enseignant ou durant le cours par les quipes individuelles des l ves A Pr parez le tampon d lectrophor se Le tampon d lectrophor se est fourni sous la forme d une solution concentr e 50X Vous avez besoin de tampon TAE 1X pour fabriquer le gel d agarose et galement pour chaque chambre d lectrophor se Trois litres de tampon TAE 1X suffiront pour faire fonctionner 8 chambres d lectrophor se et pour couler 8 gels d agarose Pour fabriquer 3 de TAE 1X partir de TAE concentr 50X ajoutez 60 ml de concentr 2 94 d eau distill e Fabriquez la solution d agarose La concentration de gel recommand e pour cette application en classe est de l agarose 1 Cette concentration d agarose produit une s paration excellente et minimise le temps de fonctionnement requis pour la s paration lectrophor tique des fragments de PCR Pour fabriquer une solution 1 ajoutez 1 g d agarose 100 ml de tampon d lectrophor se TAE 1X Pour 8 gels vous aurez besoin d approximativement 350 ml d agarose fondu 3 5 g d agarose pour 350 mi de tampon TAE 1X L agarose doit tre fabriqu en utilisant du tampon d lectrophor se pas de l eau 18 Bulletin n 4110052FR Ajoutez la poudre d agarose dans un r cipient appropri par exemple un ballon dErlenmeyer de 1000 ml une bouteille de Wheaton etc Ajoutez la quantit appropri e de tam
43. omique provenant des follicules pileux Point d arr t Amplification par PCR Installation et r alisation des r actions de PCR Couler les gels d agarose ceci peut tre r alis par l enseignant au cours de la pr paration pr alable Point d arr t Electrophor se sur gel des chantillons amplifi s de PCR et coloration des gels d agarose Chargement et migration sur les gels Coloration des gels Remarque si vous suivez le mode op ratoire de coloration rapide enregistrez les r sultats et s chez les gels Analyse et interpr tation des r sultats Enregistrement des r sultats et s chage des gels si vous suivez le mode op ratoire de coloration pendant une nuit Analyse et discussion des r sultats 12 Bulletin n 4110052FR G n ralit s sur la pr paration pr alable par l enseignant Cette partie pr sente l emploi du temps recommand pour la pr paration pr alable par l enseignant Un guide d taill de la pr paration pr alable est fourni aux pages 16 24 Quand Activit Temps requis Imm diatement Lecture du manuel de PCR 2 heures Avant le Cours 1 Aliquotage de la matrice InstaGene 30 min Installation des postes de travail des l ves Avant le Cours 2 Pr paration de la solution d amplification 1 heure Installation des r actions de PCR contr les Pr paration du tampon TAE Pr paration de l agarose fondu Programmation du Gene Cycler ou MyCycler Installation des postes de travail des l
44. op ratoires ses 33 Bulletin n 4110052FR Liste de contr le de la composition du kit Cette partie liste les composants fournis dans le kit PV92 PCR Elle liste galement les accessoires n cessaires Chaque kit contient suffisamment de mat riaux pour 8 postes de travail d l ves avec 4 l ves chaque poste Veuillez utiliser cette liste pour contr ler votre mat riel avant de commencer ces TP Remarque Si vous pr parez de l ADN g nomique en utilisant le mode op ratoire pour les follicules pileux il faut commander de la prot ase R f rence 166 2003EDU s par ment du kit Composition du kit Quantit v Stockez 20 C composants sensibles la temp rature Contr le PV92 homozygote 100 pi 1 flacon m Contr le PV92 homozygote 100 pl 1 flacon n Contr le PV92 h t rozygote 100 ul 1 flacon m Solution d amplification ANTP Taq ADN polym rase tampon 2X 1 2 ml 1 flacon n M lange d amorces directe et r verse 50X 25 pl 1 flacon m Marqueurs de poids mol culaire EZ Load standards d ADN 100 Hi 1 flacon A stocker 4 C Tampon TAE 50X 100 ml 1 Agarose en poudre 5 g 1 n Colorant d ADN Fast Blast 500X 100 ml 1 bouteille n Matrice InstaGene 20 ml 1 bouteille n Tampon de charge PV92 XC 5X 1 ml 1 flacon n A stocker temp rature ambiante m Tubes de PCR 50 Tubes avec bouchon vis 1 5 ml 50 m Microtubes essai sans bouchon 1 5 ml 50 m Microtubes ess
45. our la pr paration de l ADN g nomique L un implique le recueil de cellules pith liales orales l aide d un bain de bouche salin L autre isole l ADN g nomique partir de follicules pileux Les deux m thodes sont tr s peu invasives et produisent des produits de PCR robustes Les enseignants doivent choisir l un ou l autre des modes op ratoires d apr s leur pr f rence personnelle ou celle de leurs l ves ou d apr s des restrictions locales Bulletin n 4110052FR La PCR tape par tape La PCR implique une s rie r p titive de cycles dont chacun est constitu de la d naturation de la matrice de l hybridation d une amorce et de l longation de l amorce hybrid e par la Taq ADN polym rase Avant de commencer l amplification de l ADN l ADN g nomique est pr par partir des cellules des l ves Apr s la pr paration des chantillons l ADN matrice les amorces oligonucl otidiques l ADN polym rase thermostable Taq les quatre d soxynucl otides A T G C et le tampon de la r action sont m lang s dans un seul microtube essai Le tube est plac dans le thermocycler Gene Cycler ou MyCycler Ces thermocyclers contiennent un bloc en aluminium qui renferme les chantillons et qui peut tre rapidement chauff et refroidi travers des diff rences de temp rature extr mes Le chauffage et le refroidissement rapides de ce bloc thermique sont appel s le cycle de temp ratures ou le cycle thermique La
46. our les cellules de la joue uniquement 1 n Embouts de pipette type filtre 2 20 ul pour le MO pour les 4 n cellules de la joue uniquement Marqueur permanent 1 n R cipient d chets 1 Q Copie du mode op ratoire 1 n R cipients avec 10 ml de solution saline 0 9 pour le MO pour les 4 n cellules de la joue uniquement Pinces pour le MO pour les follicules pileux 1 n Ciseaux ou lame de rasoir pour le MO pour les follicules pileux 1 n Choisissez l une des deux m thodes 13 Bulletin n 4110052FR Poste de travail commun de l enseignant Micropipette P 1000 ou micropipette P 200 Embouts de pipette type filtre 20 200 pi ou embouts de pipette type filtre 100 1000 yl Bains marie 56 et 100 C Microcentrifugeuse ou minicentrifugeuse Vortex facultatif Cours 2 Amplification par PCR Poste de travail des l ves Tubes de PCR Microtubes essai sans bouchon Solution d amplification compl te contenant les amorces sur glace Micropipette P 20 ou pipettes volume fixe de 10 yl et 20 yl Embouts de pipette type filtre 2 20 yl Supports de microtubes essai en mousse Seau rempli de glace Marqueur permanent Copie du mode op ratoire R cipient d chets Poste de travail commun de l enseignant Plateaux de gels Agarose fondu voir la pr paration pr alable Scotch autoclave pour les plateaux de gels Thermocycler Gene Cycler ou MyCycler Microcentrifugeuse ou minicentr
47. pon d lectrophor se TAE 1X et faites tourner pour mettre en suspension la poudre d agarose dans le tampon Si vous utilisez un ballon d Erlenmeyer retournez une fiole d Erlenmeyer de 50 ml sur l ouverture du ballon dErlenmeyer de 1000 ml contenant l agarose La petite fiole fonctionne comme une chambre de reflux permettant une bullition sans une grosse perte de volume de tampon L agarose peut tre fondu pour mouler le gel sur une plaque br lante magn tique ou dans un four micro ondes voir ci dessous Chauffez le m lange jusqu bullition en utilisant un four micro ondes ou un bain marie br lant jusqu la dissolution compl te de la poudre d agarose Il est n cessaire d observer soigneusement pour d terminer lorsque la poudre est compl tement dissoute Tenez le ballon contre la lumi re et recherchez de petits paquets transparents d agarose en suspension Ces particules indiquent que l agarose n est pas compl tement dissous Vous devez poursuivre le chauffage et la rotation jusqu ce que vous ne puissiez plus voir ces particules transparentes Pr caution Utilisez des gants de protection des gants pour le four des lunettes de protection et une blouse de TP comme il convient lors de la pr paration et du moulage des gels d agarose L agarose fondu bouillant ou les r cipients contenant l agarose br lant peuvent causer des br lures s v res M thode de la plaque br lante magn tique Ajoutez un b ton magn tique dans le
48. premi re tape de la technique du cycle de temp ratures de la PCR implique le chauffage de l chantillon 94 C A cette temp rature lev e les brins de la matrice se s parent se d naturent Ceci est appel l tape de d naturation Ensuite le thermocycler refroidit rapidement 60 C pour permettre aux amorces de shybrider aux brins s par s de la matrice Ceci est appel l tape d hybridation Les deux brins d origine de la matrice peuvent s hybrider de nouveau l un l autre ou entrer en comp tition avec les amorces pour les sites de liaison compl mentaires des amorces Toutefois les amorces sont ajout es en exc s de telle mani re que les amorces l emportent sur les brins d origine de l ADN pour les sites de liaison compl mentaires des amorces Enfin le thermocycler chauffe l chantillon 72 C pour que la Tag ADN polym rase tende les amorces et fabrique des copies compl tes de chaque brin de l ADN matrice Ceci est appel l tape d longation La Taq polym rase fonctionne de la mani re la plus efficace cette temp rature Deux nouvelles copies de chaque brin compl mentaire sont cr es Il y a maintenant deux jeux d ADN double brin Il est maintenant possible d utiliser ces deux jeux d ADN double brin pour un autre cycle et la synth se subs quente de brins A ce stade un cycle de temp ratures complet cycle thermique a t compl t Figure 4 Cycle de temp ratures tape de d naturation
49. r amener les billes en suspension Si aucune bille n a t transf r e dans le tube des l ves les cations bivalents ne seront pas limin s de la pr paration d ADN g nomique et la r action de PCR sera inhib e 4 Le transfert de matrice InstaGene dans la r action de PCR Bien que les billes de la matrice InstaGene soient n cessaires pour la pr paration de l ADN matrice il est important que la matrice InstaGene ne soit pas transf r e dans la r action de PCR Si des billes sont transf r es dans le tube de PCR les ions magn sium dont la Taq polym rase a besoin seront limin s et la r action de PCR sera inhib e Surnageant contient l ADN matrice Matrice ADN matrice 30 Bulletin n 4110052FR Interpr tation des chantillons h t rozygotes 1 Comp tition au cours de l amplification L amplification des chantillons h t rozygotes est plus difficile que les deux amplifications d homozygotes cause de la comp tition entre les r actions qui produisent les bandes plus petites 641 pb et plus grosses 941 pb Parce que la bande plus petite de 641 pb est amplifi e plus efficacement que la bande de 941 pb les chantillons h t rozygotes sur les gels d agarose montreront la bande plus petite comme tant plus intense que la bande plus grosse voir la bande indiqu e par un ast risque sur le gel ci dessous Pour cette raison les chantillons h t rozygotes peuvent tre souvent interpr t s comme des
50. r amplifier un fragment de 941 paires de bases si l l ment Alu est pr sent ou un fragment de 641 paires de bases si l l ment Alu est absent L lectrophor se sur gel d agarose des produits de la PCR est suffisante pour faire la distinction entre les homozygotes pour la pr sence de la r p tition Alu produit de 941 paires de bases uniquement les homozygotes pour l absence de la r p tition Alu produit de 641 paires de bases uniquement et les h t rozygotes ayant la fois les produits de 641 et de 941 paires de bases PV92 G notype Taille des produits de PCR Au Homozygote 941 paires de bases ALU Homozygote 641 paires de bases ALU H t rozygote 941 et 641 paires de bases ms Fig 3 Pr sence ou absence de l insert Alu au sein du locus PV92 sur le chromosome 16 Remarques importantes pour l enseignant Veuillez noter que puisque les all les PV92 sont h rit s des parents et que potentiellement ils peuvent r v ler des informations propos de relations familiales nous attirons votre attention contre la g n ration de donn es g notypiques partir de plusieurs membres d une famille Si la confidentialit est un souci nous sugg rons l enseignant de m langer les chantillons des l ves pour assurer l anonymat Les chantillons des l ves peuvent tre randomis s tout moment apr s la r colte des cellules Deux modes op ratoires sont fournis p
51. ra compl tement temp rature ambiante apr s 2 3 jours Le r sultat sera un enregistrement plat transparent et durable de l exp rience O Film de support de gel 29 Bulletin n 4110052FR Interpr tation des r sultats et guide d pannage Explications pour les couloirs vides ou les chantillons non amplifi s Des explications multiples peuvent justifier les chantillons des l ves qui ne sont pas amplifi s dans les r actions de PCR 1 Un recueil inad quat des cellules de la joue Un culot cellulaire visible d environ la taille d une t te d allumette doit tre obtenu apr s la centrifugation du bain de bouche salin Si aucun culot cellulaire n est visible ou si le culot est trop petit davantage de solution saline utilis e pour se rincer la bouche peut tre centrifug e jusqu l obtention d un culot de la taille souhait e Toutefois il n est pas recommand de recueillir plus de 3 mI de cellules voir le point ci dessous 2 Un nombre excessif de cellules Tout comme trop peu de cellules ne produiront pas assez d ADN g nomique un nombre excessif de cellules saturera la capacit de la matrice InstaGene entra nant une petite ou aucune amplification 3 La matrice InstaGene non transf r e Chaque poste de travail est quip de tubes de matrice InstaGene qui ont t aliquot s par l enseignant et d pos s sur de la glace Ces tubes de matrice doivent tre homog n is s avant chaque pipetage pou
52. ranscrites en ARN mais la fin elles ne fabriquent pas une prot ine Les s quences qui codent pour des prot ines sont appel es exons A la fois les introns et les exons sont initialement transcrits puis les introns sont piss s en dehors de l ARN pour cr er de l ARN messager ARNm Chez les eucaryotes l ADN g nomique est transcrit en mol cules d ARN contenant la fois des introns et des exons pour un g ne particulier Alors que l ARN est encore dans le noyau avant d tre transport hors du noyau les introns in qui demeurent au sein du noyau doivent tre retir s de l ARN alors que les exons ex qui sortent du noyau sont piss s ensemble pour former la s quence codante compl te pour la prot ine Figure 1 Ce processus est appel l pissage d ARN Certains g nes peuvent contenir quelques introns d autres peuvent en contenir des douzaines Bulletin n 4110052FR Intron 1 Intron 2 s Erant Expnz Exon y ADH g nomiqu Transcription 5 txonT L txon2 3 Pr RHm G notype Epissage CExonT Exonz Exon3 RHm Traduction Prot ine Ph notype Fig 1 Epissage d introns partir de g nes Comme nous en avons discut des segments fonctionnels de g nes exons codent pour des prot ines des mol cules qui ex cutent la plupart des fonctions cellulaires Les s quences des exons sont donc similaires parmi les individus D autre part les introns varient souvent en taille et en no
53. rmation de dim res d amorces est plus susceptible de survenir dans des tubes r actionnels avec une contamination avec de la matrice InstaGene peu ou pas de matrice ou dans des chantillons qui ont t pr par s bien en avance du d p t dans le thermocycler La fl che sur la figure ci dessous montrent des dim res d amorces S1 S2 s3 S4 s5 S6 s S8 L _ vaag b m th 4 Des bandes semblent p lir Le colorant bleu dans le colorant d ADN Fast Blast est sujet un blanchiment r versible lorsqu il est expos des lumi res brillantes dans la pi ce Lorsque les gels s ch s sont examin s 3 5 jours apr s le s chage les bandes peuvent sembler p lir Le placement des gels dans un endroit sombre dans une bo te ou coll s dans un cahier ferm et leur examen plusieurs heures plus tard fourniront les bandes les plus intenses Le plus pratique est de laisser les gels s cher sur la paillasse des TP pendant 3 5 jours de les coller dans un cahier de TP et d examiner les gels le jour suivant 32 Bulletin n 4110052FR Mode op ratoire Cours 1 Pr paration d ADN matrice de cellules de la joue 1 Etiquetez un microtube essai de 1 5 ml avec vos initiales Etiquetez un tube avec bouchon vis contenant 200 ul de matrice InstaGene avec vos initiales Demandez votre enseignant un r cipient contenant de la solution saline Versez la solution saline dans votre bouche et rincez vi
54. s chantillons soient l extr mit de la cathode noire de la base Les chantillons d ADN migreront vers l extr mit de l anode rouge de la base durant l lectrophor se 4 Programmez le thermocycler Gene Cycler ou MyCycler Le thermocycler doit tre programm pour 3 tapes dans le cycle 2 qui se r p tera 40 fois Le cycle 3 final assure que la r action d longation finale arrive son terme et que tous les produits de PCR possibles sont fabriqu s La r action de PCR prendra approximativement 3 5 heures Cycle Etape Fonction Temp rature Temps 1 Etape 1 Pre d naturation 94 C 2 minutes R p tition 1 fois 2 Etape 1 D naturation 94 C 1 minute Etape 2 Hybridation 60 C 1 minute Etape 3 Elongation 72 C 2 minutes R p tition 40 fois 3 Etape 1 Elongation finale 72 C 10 minutes R p tition 1 fois Reportez vous au manuel d instructions du Gene Cycler ou du MyCycler pour obtenir des instructions de programmations sp cifiques 20 Bulletin n 4110052FR Cours 3 Electrophor se des chantillons de PCR amplifi s et coloration des gels d agarose Pr paration pr alable Objectifs Pr paration des chantillons contr les positifs amplifi s Aliquotage du tampon de charge PV92 XC Aliquotage des marqueurs de poids mol culaire EZ Load standards d ADN Installation des postes de travail des l ves et de l enseignant Pr paration du colorant d ADN Fast Blast soit 1X soit 100X selon si vous sui
55. s gels d agarose 1 Sortez votre tube de PCR du thermocycler et placez le dans le microtube essai sans bouchon Centrifugez le tube pendant 3 secondes 2000 x g 2 Ajoutez 10 ul de tampon de charge PV92 XC Centrifugeuse dans votre tube de PCR et m langez doucement 3 Placez un gel d agarose dans l appareil d lectrophor se V rifiez que les puits des gels d agarose se trouvent pr s de l lectrode noire et que la base du gel se trouve pr s de l lectrode rouge 4 Remplissez la chambre d lectrophor se et couvrez le gel de tampon TAE 1X Ceci n cessitera 275 ml de tampon 1X 5 En utilisant un embout propre pour chaque chantillon chargez les chantillons dans 8 puits du gel dans l ordre suivant Echantillon Volume de chargement 1 MPM standards d ADN 10 yl 2 Contr le homozygote 10 yl 3 Contr le homozygote 10 yl 4 Contr le h t rozygote 10 yl 5 El ve 1 20 yl 6 El ve 2 20 yl 7 El ve 3 20 yl 8 El ve 4 20 yl 6 Fixez le couvercle sur la cuve Le couvercle ne se fixera sur la base que dans une seule orientation rouge sur rouge et noir sur noir Branchez les fils lectriques l alimentation lectrique 7 Allumez l alimentation lectrique et soumettez vos chantillons une lectrophor se 100 V pendant 30 minutes Coloration des gels d agarose 1 Lorsque l lectrophor se est termin e teignez le courant et retirez le couvercl
56. seigner aux l ves des facult s des coll ges et des lyc es les technologies et les applications de la biotechnologie Bio Rad a d velopp toute une s rie de kits ducatifs faciles d emploi tay s par des cours bas s sur des tudes des instruments et des consommables Le programme Biotechnology Explorer est devenu le programme de choix pour les enseignants la fois d butants et exp riment s cherchant faire la liaison entre la science en classe et la science dans le monde r el Du fait de l utilisation croissante de la technique d amplification PCR en m decine et science modernes et de l impact potentiel sur chaque membre de la soci t il est important de bien faire comprendre aux l ves les principes de base et les applications de la PCR Dans ce kit les l ves r alisent une PCR pour amplifier un segment de leur propre ADN Le segment d ADN qu ils vont amplifier est pr sent dans les g nes de nombreux individus mais pas de tous L analyse des donn es g n r es en travaux pratiques ouvrira la porte l enseignement des principes de base de la biologie mol culaire de la g n tique de la population et des empreintes g n tiques et elle illustrera comment la PCR est utilis e dans de nombreux autres domaines de la biologie Le programme Biotechnology Explorer est tout fait unique et extr mement innovant Nos activit s base de travaux pratiques capturent l imagination en faisant que les l ves prennent mi
57. sultats Pr paration pr alable Objectifs Pas de pr paration pr alable n cessaire Mat riaux requis Film de support de gel pour le mode op ratoire de coloration pendant une nuit Ac tate pour le tra age des gels pour le mode op ratoire de coloration pendant une nuit Obtention d un enregistrement permanent du gel avant le s chage Pour obtenir un enregistrement permanent du gel avant qu il soit s ch soit vous tracez le contour du gel y compris les puits et les bandes d ADN sur un morceau de papier ou d ac tate et vous prenez une photographie l aide d un appareil et d un film standard syst me de documentation de gels standard de Bio Rad r f rence 170 3742EDU soit vous photocopiez le gel color Remarque Le s chage des gels d agarose n cessite l utilisation d agarose pour analyse de r sistance lev e sp cialement formul de Bio Rad D autres milieux de gel peuvent ne pas tre appropri s pour cet objectif Nous vous recommandons d utiliser le film de support de gel exclusif de Bio Rad r f rence 170 2984EDU pour s cher les gels d agarose Retirez le gel d agarose color de son plateau de coloration et d coupez tous les couloirs non charg s avec un couteau ou une lame de rasoir D posez le gel directement sur le c t hydrophile d un morceau de film de support de gel L eau formera des billes sur le c t hydrophobe mais s talera sur le c t hydrophile du film Centrez le gel sur le film et li
58. talit de vos cellules remises en suspension dans le tube avec bouchon vis contenant la matrice InstaGene Vissez fermement le bouchon sur le tube Agitez ou passez au vortex pour m langer le contenu du tube 33 ont IE l SG Centrifugeuse Bulletin n 4110052FR 9 10 11 12 Lorsque tous les membres du groupe ont recueilli leurs chantillons d posez les tubes dans le support des microtubes essai en mousse et incubez 56 C pendant 10 minutes dans un bain marie mi temps 5 minutes agitez ou passez au vortex les tubes doucement puis remettez les dans le bain marie 56 C pendant les 5 minutes restantes Retirez les tubes agitez ou passez au vortex_ et d posez les tubes dans un bain marie bouillant 100 C Incubez 100 C pendant 5 minutes Retirez les tubes du bain marie bouillant et agitez ou passez au vortex le contenu pour__ remettre en suspension Transformez la matrice en culot par centrifugation 6000 x g pendant 5 minutes ou 2000 x g pendant 10 minutes dans une centrifugeuse Stockez votre tube avec bouchon vis dans le r frig rateur jusqu la p riode de travaux pratiques suivante ou passez l tape 2 du Cours 2 34 y Bain marie Bain marie Centrifugeuse 56 C 10 min 100 C 5 min Bulletin n 4110052FR Mode op ratoire Cours 1 Pr paration de l ADN matrice de foll
59. tapes de chauffage et de refroidissement en alternance Ces TP utilisent un cycle trois tapes l ADN subit une d naturation 94 C pendant 1 minute une hybridation 60 C pendant 1 minute et une longation 72 C pendant 2 minutes Ce cycle est r p t 40 fois au cours de la progression de l amplification par PCR Au cours de la d naturation les deux brins de l ADN matrice sont fondus et s par s pour donner acc s aux amorces de la PCR Au cours de l tape d hybridation les amorces de la PCR reconnaissent et se lient l ADN matrice Une fois que les amorces sont li es la Tag ADN polym rase tend les amorces pour r pliquer le segment d ADN au cours de l tape d longation La r action de PCR prendra approximativement 3 5 heures pour tre compl te Les tubes de PCR sont tr s petits et demandent des pr cautions lorsqu ils sont manipul s Il est important de boucher soigneusement et compl tement les tubes avant de les d poser dans le thermocycler Si les tubes ne sont pas compl tement ferm s une vaporation substantielle peut avoir lieu et l amplification par PCR sera inhib e Pour obtenir les meilleurs r sultats si vous devez faire fonctionner le thermocycler plus d une fois c est dire si vous avez plus de 24 chantillons et que vous utilisez le thermocycler Gene Cycler de Bio Rad pr parez chaque groupe de r actions des l ves pas plus de 30 minutes avant les cycles de la PCR Une incubation prolong e
60. trons de g nes associ s des pathologies particuli res ils peuvent de cette mani re tre associ s cette maladie Lorsqu ils sont pr sents au sein des introns de g nes les r p titions de Alu peuvent tre galement utilis es pour estimer la parent parmi des individus Dans cette activit l analyse des r p titions de Alu est utilis e pour estimer la fr quence d un insert dans une population et il s agit d une mesure simple de variation g n tique mol culaire sans rapport avec une maladie ou une parent parmi des individus Bulletin n 4110052FR Ce kit fournit un d pistage simple bas sur la PCR d une seule s quence Alu au sein du locus PV92 sur le chromosome 16 Cet intron Alu particulier est dimorphe Cela signifie que l l ment est pr sent chez certains individus mais pas chez d autres Figure 3 Certaines personnes ont l insert dans le locus PV92 de l un de leurs chromosomes 16 d autres peuvent avoir l insert dans les deux chromosomes homologues deux all les et certains n ont l insert dans aucun des chromosomes La pr sence ou l absence de cet insert peut tre d tect l aide de la r action en cha ne de la polym rase suivie d une lectrophor se sur gel d agarose Dans cette activit les l ves isoleront leur propre ADN g nomique partir de leurs cellules Ils utiliseront des amorces qui flanquent l insertion Alu enti re 300 paires de bases de long et 641 paires de bases du locus PV92 pou
61. trouv s dans le Yellowstone National Park Deux nouveaux brins matrices sont cr s partir de la matrice double brin d origine chaque cycle complet de la r action de synth se de brin Ceci provoque une croissance exponentielle du nombre de mol cules matrices c est dire du nombre de doubles brins d ADN chaque cycle Par cons quent apr s 30 cycles il y aura 2 ou plus de 1 milliard de fois plus de copies qu au d but Une fois que la matrice a t suffisamment amplifi e on peut la visualiser Ceci permet aux chercheurs de d terminer la pr sence ou l absence des produits souhait s de la PCR et de d terminer les similarit s et les diff rences entre l ADN d individus Selon la s quence d ADN analys e les diff rences parmi les individus peuvent tre aussi grandes que des centaines de paires de bases ou aussi petites qu une seule paire de bases ou une simple mutation ponctuelle G nes et ADN On estime que les 23 paires de chromosomes au total 46 chromosomes du g nome humain contiennent un total de 30000 50000 g nes Chaque g ne d tient le code pour une prot ine particuli re De mani re int ressante ces 30000 50000 g nes ne constituent que 5 d ADN chromosomique Les autres 95 sont de l ADN non codant Cet ADN non codant se trouve non seulement entre les g nes mais galement au sein des g nes les divisant en segments Chez les eucaryotes ces s quences au sein des g nes appel es introns sont t
62. ur produire des millions de copies d un fragment d ADN souhait En th orie un seul brin de matrice est n cessaire pour produire des millions de nouvelles mol cules d ADN Avant la PCR il tait impossible de r aliser des tudes m dico l gales ou g n tiques avec cette petite quantit d ADN La possibilit d amplifier la s quence pr cise d ADN qu un chercheur souhaite tudier ou manipuler est la v ritable puissance de la PCR L amplification par PCR n cessite la pr sence d au moins un brin d ADN matrice Dans ce kit l ADN g nomique humain isol partir des propres cellules des l ves sera la source des brins matrices L une des principales raisons pour lesquelles la PCR est un outil si puissant est sa simplicit et sa sp cificit Tout ce dont on a besoin ce sont des tampons de r action peu co teux quatre sous unit s de l ADN les d soxynucl otides triphosphates d ad nine de guanine de thymine et de cytosine une ADN polym rase deux amorces d ADN et des quantit s minimes du brin matrice que l on souhaite amplifier La sp cificit provient de la capacit cibler et amplifier un segment sp cifique de l ADN parmi un g nome complet La PCR utilise deux processus de base en g n tique mol culaire 1 Hybridation de brin d ADN compl mentaire 2 Synth se de brin d ADN par l interm diaire d une ADN polym rase Dans le cas de la PCR l hybridation de brin compl mentaire a lieu lorsque deux amorces oligonucl
63. vez le mode op ratoire de coloration rapide ou pendant une nuit Temps requis 40 minutes Mat riaux requis 8 microtubes essai avec des bouchons attach s Micropipettes P 20 P 200 et P 1000 et des embouts filtre 8 tubes avec des bouchons vis Eau distil e ou d min ralis e pour pr parer le colorant d ADN Fast Blast Film de support de gel pour le mode op ratoire de coloration rapide Ac tate pour le tra age des gels pour le mode op ratoire de coloration rapide Ballon de 500 ml Modes op ratoires 1 Pr parez les chantillons contr les positifs Ajoutez 10 ul de tampon de charge PV92 XC dans chaque chantillon contr le positif amplifi D posez les tubes sur le poste de travail de l enseignant Soit vous soit un groupe d l ves chargera les chantillons contr les positifs et n gatifs sur chaque gel comme il est indiqu la page 28 Aliquotez les standards de taille d ADN Aliquotez 11 ul des marqueurs de poids mol culaire EZ Load dans 8 microtubes et tiquetez MPM Les tailles des bandes des standards d ADN sont de 1000 pb 700 pb 500 pb 200 pb et 100 pb Aliquotez le tampon de charge PV92 XC Etiquetez 8 tubes avec bouchons vis TC avec du tampon de charge et aliquotez 50 ul dans chaque tube Distribuez aux postes de travail des l ves Pr parez le colorant d ADN Fast Blast Le colorant d ADN Fast Blast est fourni sous la forme d un concentr

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