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1. REMARQUES Enzo Manuel GLOBAL HEADQUARTERS EUROPE ASIA Enzo Life Sciences Inc Enzo Life Sciences ELS AG 10 Executive Boulevard Industriestrasse 17 Farmingdale NY 11735 CH 4415 Lausen Toll Free 1 800 942 0430 Switzerland Phone 631 694 7070 Phone 41 0 61 926 89 89 Fax 631 694 7501 Fax 41 0 61 926 89 79 info usa enzolifesciences com info ch enzolifesciences com For local distributors and detailed product information visit us online www enzolifesciences com Catalog Number ENZ 42671 French Rev 11 02 2015 18
2. S chez a l air libre pendant 10 minutes ou dans un concentrateur centrifuge sous vide pendant 2 minutes Reprenez le culot dans 20ul d eau exempte de nucl ase et d terminez la concentration avec un spectrophotometre NanoDrop ND 1000 UV VIS dans le mode Acides Nucl iques 13 Enzo C Purification de l ADN d chantillons FFPE La proc dure qui suit est bas e sur le protocole d crit par Essen et Ylstra dans Methods in Molecular Biology Vol 938 Ed Feuk Lars 2012 XII 386 chapitre 16 1 Placez l chantillon FFPE dans un tube de micro centrifugeuse de 1 5ml exempt de nucl ase Si le tissu contient de l eau centrifugez pendant 5 minutes vitesse maximale et d cantez le surnageant Si n cessaire retirez la paraffine r siduelle comme suit a Ajoutez 1ml de xyl ne ou un substitut de xylene et incubez pendant 10 minutes 55 C Centrifugez pleine vitesse pendant 2 minutes temp rature ambiante et d cantez le surnageant R p tez cette tape deux fois de plus b Ajoutez 1ml de m thanol et incuber pendant 5 minutes temp rature ambiante Centrifugez vitesse maximale et d canter le surnageant R p tez cette proc dure une fois de plus c Ajoutez 1ml d thanol 96 100 vortexez centrifugez pendant 5 minutes et d canter le surnageant R p tez cette proc dure une fois de plus Puis s chez l air le culot Ajoutez 500ul d une solution de NaSCN 1M ou 1ml si la taille du tis
3. cette tape le protocole suivant est inclus dans le manuel des colonnes de purification 3 Binding Buffer avec indicateur de pH Le pH optimal permettant la liaison de petits fragments d ADN la membrane de silice est autour de 5 6 Le Binding Buffer est tamponn pour maintenir ce pH Toutefois un indicateur de pH a t ajout afin de s assurer que ce pH est correct Cet indicateur de pH n interf re pas avec la liaison de l ADN et est compl tement limin lors de la purification La couleur jaune est galement b n fique pour l extraction a partir de gel afin d identifier facilement les morceaux d agarose non dissous Pour restaurer des conditions de pH correctes ajoutez plus de Binding Buffer ac tate de sodium pH 5 0 ou de petits volumes d acide chlorhydrique jusqu ce que la couleur redevienne jaune Jaune conditions correctes Vert pH l g rement trop lev ajustement recommand Bleu pH trop lev ajustement n cessaire 4 Pr paration des solutions a Le Wash Buffer contient des sels chaotropiques Portez des gants et des lunettes de protection b Le Wash Buffer 1X doit tre pr par avant de commencer le protocole de purification de votre ADN Ajoutez de l thanol 96 100 au Wash Buffer 5X Par exemple pour 20 pr parations ajoutez 32ml d thanol 96 100 a 8ml de Wash Buffer 5X pour un volume total de 40ml de Wash Buffer 1X Enzo 5 Ajustez les conditions de liaison de Il A
4. rature ambiante pendant 5 minutes puis centrifugez a pleine vitesse pendant 1 minute 9 Placez une colonne QlAamp dans un tube QlAamp Appliquez le volume total de l chantillon sur la colonne par palier de 600ul a chaque fois 10 Centrifugez pendant une minute 6 000 x g et d cantez le filtrat Si la colonne n est pas exempte de gouttelettes centrifugez de nouveau apr s le retrait du filtrat 11 Transf rez la colonne dans un nouveau tube QlAamp puis ajoutez 500ul de tampon AW1 du kit QlAamp et pr par e selon le protocole du fabricant la colonne Centrifugez pendant 1 minute a 6000 x g Si la colonne n est pas libre de gouttelettes centrifugez une seconde fois apr s le retrait du filtrat 12 Transf rez la colonne dans un nouveau tube QlAamp puis ajoutez 500ul de tampon AW2 du kit QlAamp et pr par e selon le protocole du fabricant la colonne Centrifugez vitesse maximale pendant 1 minute D cantez le filtrat Centrifugez vitesse maximale pendant 3 minutes pour faire s cher compl tement la membrane 13 Placez la colonne dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1 5ml exempt de nucl ase puis luez l ADN en ajoutant 20 a 30ul de tampon AE a la colonne Incubez pendant un minimum de 5 minutes a temp rature ambiante Centrifugez vitesse maximale pendant 3 minutes 14 Jetez la colonne et proc dez a la quantification de l ADN et son marquage 15 Enzo Manuel REMARQUES Enzo Manuel
5. est une m thode d amplification g nomique isotherme utilis e pour valuer la qualit des chantillons d ADN Les chantillons d ADN FFPE appropri s pour l analyse CGH sont identifi s par des rendements lev s lors de la r action d amplification Les chantillons d ADN 1 2 5ug amplifi s par le kit BIOSCORE Screening and Amplification peuvent tre marqu s pour analyse CGH faible densit sans digestion de restriction Les ADN g nomiques de r f rence et d chantillon doivent tre soumis une amplification avant leur marquage Chaque amplification de l ADN diminue la qualit de l analyse CGH Si l ADN est de bonne qualit nous recommandons d utiliser l ADN non amplifi 200ng suffisent pour la r action de marquage Enzo Isolation d ADN g nomique Isolez l ADN g nomique en utilisant un protocole tabli ou un kit disponible sur le march Une m thode sugg r e pour la purification d ADN g nomique a partir d chantillons FFPE se trouve a l annexe C D terminez la concentration et la puret de l ADN g nomique par mesure de l absorbance a 260nm et 280nm Nous recommandons l utilisation du spectrophotom tre NanoDrop ND 1000 UV VIS ou quivalent Le ratio A260 A280 doit tre environ d 1 8 et le ratio A260 A230 doit tre sup rieur ou gal 2 0 Un cart significatif de ces ratios sugg re la pr sence de contaminants et indique que l chantillon devrait tre purifi nouveau L ADN g nom
6. 99 C ou une PCR couvercle chauffant 3 Bain de glace ou bloc froid 0 4 C 4 Colonnes de purification d ADN PCR amp Gel Clean up Columns R f Cat Enzo ENZ GEN100 Facultatif les enzymes de restriction A ul Rsal et le tampon appropri R f Cat Enzo ENZ GEN108 et ENZ GEN109 Facultatif tampon TE Tris 10mM EDTA 1mM pH 8 0 Facultatif bain marie suppl mentaire bloc de chauffage incubateur r gl 65 C ou une PCR couvercle chauffant Enzo METHODES ET PROCEDURES Quantit d ADN requis Le kit de marquage CGH pour Oligo Arrays est optimis pour une utilisation avec une quantit d ADN g nomique de 0 25 a 2 5ug comme mati re premi re pour les Oligo Arrays d Agilent En g n ral 0 5ug d ADN g nomique sont suffisants pour le marquage et l hybridation a tous les formats d Oligo Arrays d Agilent Des quantit s plus lev es d ADN d entr e 1 a 2 5ug peuvent conduire de meilleurs r sultats avec les plus grands formats d hybridation d Oligo Arrays Nous recommandons Putilisation de plus grandes quantit s d ADN 1 2 5pg lors de l analyse CGH d ADN g nomique isol de tissus fix s au formol et paraffin s FFPE Dans des conditions o l ADN g nomique de g nomique est limit lt 200ng et ou isol partir de tissus FFPE nous recommandons l utilisation du kit BIOSCORE Screening and Amplification d Enzo R f Cat ENZ 42440 Le kit BIOSCORE Screening and Amplification
7. ADN et associez les amorces al atoires 1 Combinez 0 25 2 5ug d ADN g nomique jusqu 19pl avec 20ul de tampon Amorces R action tube 1 et ajoutez suffisamment d eau tube W pour amener le m lange r actionnel 39ul 2 Chauffez 99 C pendant 10 minutes et placez sur glace pendant 5 minutes Centrifugez bri vement et placez de nouveau sur glace Allongez les amorces avec l ADN polym rase Klenow Exo 1 Laissez les tubes sur glace et ajoutez 10ul du m lange appropri de nucl otides marqu s la cyanine tube 2 ou 3 et 1ul d ADN polym rase Klenow Exo tube 4 l chantillon d ADN associ aux amorces al atoires M langez d licatement le contenu du tube en le fliquant Centrifugez bri vement 2 Incubez la r action 37 C pendant 4 heures 7 Enzo Remarque Avec un ADN de bonne qualit le temps d incubation peut tre raccourci a 2 heures sans baisser significativement la quantit d ADN g n r Toutefois une diminution de l activit sp cifique peut tre observ e 3 Ajoutez 5ul du tampon stop tube 5 m langez et centrifugez bri vement Chauffez le tube pendant 10 minutes 65 C pour d sactiver l enzyme puis centrifugez bri vement Purification et caract risation de l ADN marqu Purifiez l ADN marqu 1 Purifiez chaque r action de marquage s par ment 2 Les colonnes de purification PCR amp Gel Clean up d Enzo R f Cat Enzo ENZ GEN100 sont recommand es pour
8. DN a M langez l chantillon marqu avec 110ul deux volumes de Binding Buffer 6 Liez ADN a Placez la colonne de purification dans un tube de r cup ration de 2ml et ajoutez votre chantillon b Centrifugez pendant 30 secondes a 11 000 x g Eliminez l coulement et placez la colonne de purification a nouveau dans le tube de r cup ration 7 Lavez la membrane de silice a Ajoutez 700ul de Wash Buffer Centrifugez pendant 30 secondes 11 000 x g Eliminez l coulement et placez la colonne de purification a nouveau dans le tube de r cup ration b Facultatif nous recommandons d ajouter nouveau 700ul de Wash Buffer et de r p ter l tape de lavage pour liminer tous les sels 8 S chez la membrane de silice a Centrifugez pendant 2 minutes 11 000 x g pour liminer tout le Wash Buffer Le bout de la colonne ne doit pas entrer en contact avec l coulement lorsque vous la retirez de la centrifuge et du tube de r cup ration b L thanol r siduel du Wash Buffer peut inhiber les r actions suivantes et doit tre limin lors de cette tape L limination complete de l thanol peut tre obtenue en incubant les colonnes de purification pendant 2 a 5 minutes a 70 C avant lution 9 Eluez ADN a Placez la colonne de purification dans un tube d 1 5ml pour micro centrifuge non fourni Ajoutez 25ul d Elution Buffer et incubez pendant 1 minute a temp rature ambiante pour augmenter le rend
9. GEnzo Mani Kit de Marquage CGH pour Oligo Arrays Pour la pr paration d ADN marqu avec Cyanine 3 et Cyanine 5 pour puce d hybridation g nomique comparative Manuel d instructions ENZ 42671 K010 20 r actions pour marquage avec cyanine 3 dUTP et cyanine 5 dUTP ENZ 42671 K100 200 r actions pour marquage avec cyanine 3 dUTP et cyanine 5 dUTP Note e Le kit de 20 r actions contient les r actifs suffisant pour effectuer 20 r actions 10 r actions de marquage Cyanine 3 dUTP et 10 r actions de marquage Cyanine 5 dUTP e Le kit de 200 r actions contient les r actifs suffisant pour effectuer 200 r actions 100 r actions de marquage Cyanine 3 dUTP et 100 r actions de marquage Cyanine 5 dUTP Enzo UTILISATION A OBJECTIF DE RECHERCHE UNIQUEMENT Ce produit est fabriqu et vendu par Enzo Life Sciences Inc uniquement pour la recherche et n est pas destin des fins diagnostiques ou une utilisation th rapeutique L achat n inclut pas un droit ou une licence d utilisation de d velopper ou exploiter ce produit commercialement Toute utilisation commerciale d veloppement ou exploitation de ce produit sans autorisation crite pr alable de la part d Enzo Life Sciences Inc est strictement interdite GARANTIE LIMITEE Ces produits sont propos s sous une garantie limit e Les produits sont garantis r pondre aux sp cifications correspondantes d crites dans la notice au moment de l exp dition La
10. ement Centrifugez pendant 1 minute a 11 000 x g b R p tez a nouveau cette derni re tape avec 25ul d Elution Buffer pour un volume final de 5OpI Remarque Sur la base des exigences de votre plate forme d hybridation la r duction du volume peut tre n cessaire Enzo Manuel D terminez le rendement et l incorporation Nous recommandons d utiliser un spectrophotom tre NanoDrop ND 1000 UV VIS dans le mode de mesure de Puces ADN pour d terminer le rendement et l incorporation de la cyanine Utilisez 1 5ul de chaque chantillon mesurer Pour une r action de marquage classique avec une quantit de d part de 850ng d ADN g nomique de haute qualit le rendement attendu doit tre au moins de 4ug Cet ADN devrait contenir au moins 200pmol de Cyanine 3 ou au moins 130pmol de Cyanine 5 10 Enzo PROBLEMATIQUES POTENTIELLES 1 Faible rendement et incorporation Un faible marquage refl te souvent au d part la faible qualit de l ADN Cela peut tre d a la pr sence de contaminants provenant de la purification de l ADN g nomique et ou la pr sence d ADN d grad et ou d ADN r ticul isol partir de tissus FFPE Mauvais ratio signal bruit malgr une bonne incorporation Un faible signal peut tre caus par des conditions d hybridation inappropri es tampon trop stricte ou temp rature excessive ou lorsque la dur e d hybridation est trop courte Un bruit de fond trop important peut t
11. ication et caract risation de l ADN marqu 8 Probl matiques potentielleS een nnte nenene een 10 AC 11 A Pr paration de l ADN marqu pour l hybridation sur des Oligo Arrays d Agiienti ee 11 B Protocole de pr cipitation ac tate de sodium thanol pour ABN SO venian donar 12 C Purification de l ADN d chantillons FFPE 13 Informations de Contact 18 Enzo Manue INTRODUCTION Le kit de marquage CGH pour Oligo Arrays d Enzo Life Sciences a t optimis pour marquer l ADN destin des essais d hybridation g nomique comparative sur Oligo Arrays d Agilent Tous les r actifs n cessaires sont fournis y compris un m lange optimis de nucl otides contenant soit cyanine 3 dUTP soit cyanine 5 dUTP REACTIFS FOURNIS ET STOCKAGE Le kit de marquage CGH pour Oligo Arrays est exp di en carboglace D s sa r ception stockez tous les r actifs 20 C dans un cong lateur sans d givrage Evitez la cong lation et la d cong lation r p t e des r actifs du kit Nous recommandons d aliquoter les r actifs de ce kit dans des volumes pratiques pour votre travail lors de la premi re utilisation Les m langes d soxynucl otidiques cyanine 3 et cyanine 5 sont sensibles la lumi re Prot gez contre les effets de la lumi re tout moment Le produit est stable pendant un an part
12. ique de haute qualit et de haut poids mol culaire peut tre utilis directement pour le marquage la cyanine et l hybridation sans digestion de restriction Digestion et purification de l ADN g nomique facultatif Agilent recommande que l ADN g nomique de r f rence et de l chantillon soit soumis a une digestion de restriction afin de r duire la taille avant le marquage La digestion de restriction n est pas n cessaire lors de l utilisation du kit de marquage CGH pour Oligo Arrays Toutefois elle est requise lors d hybridations avec des arrays CGH SNP L ADN g nomique isol partir de tissus FFPE et l ADN de r f rence ne doivent pas tre dig r s Lorsque la digestion est effectu e la fois les ADN de r f rence et de l chantillon doivent tre dig r s par la combinaison d Alul R f Cat Enzo ENZ GEN108 et Rsal R f Cat Enzo ENZ GEN109 La taille moyenne des ADN dig r s doit tre lt 5kb en longueur d termin e par lectrophor se sur gel d agarose Le produit de la digestion avec les enzymes de restriction peut tre utilis directement pour le marquage si le volume total est inf rieur 19ul Nous recommandons de dig rer l ADN comme suit ADN jusqu 16 34ul 1 9ul de tampon de restriction 10X 0 34pl d Alul 0 34ul de Rsal Enzo Manuel Compl tez jusqu 19ul avec de l eau exempte de nucl ase Incubez a 37 C pendant 2 heures puis arr
13. ir de la date de r ception si les recommandations de stockage sont correctement suivies Volume minimum fourni R actif Identit du tube ENZ 42671 ENZ 42671 K010 K100 Tampon 1 400pl 4m amorces r action M lange nucl otide Cyanine 3 dUTP ex BON ana M lange nucl otide Cyanine 5 dUTP 3 a ui ADN Polym rase veni 4 20ul 200ul Tampon Stop 5 100ul 1ml Eau sans nucl ase W 1ml 10ml Enzo AVERTISSEMENTS ET PRECAUTIONS DE SECURITE Ce produit est strictement r serv a la recherche Il n est pas destin au diagnostic de maladies chez l humain ou l animal Pour viter le photo blanchiment des nucl otides marqu s la cyanine effectuez toutes les manipulations dans des tubes ambr s ou prot g s de la lumi re par d autres moyens L ADN polym rase Klenow Exo contient du dithiothr itol DTT DTT provoque une irritation de la peau des yeux et des voies respiratoires Il est nocif en cas d ingestion ou d inhalation Si la solution venait en contact avec la peau ou les yeux lavez imm diatement avec de l eau AUTRES MATERIELS NECESSAIRES 1 ADN de r f rence a Pour une analyse CGH SNP utilisez FADN g notyp HapMap Coriell Institute b Pour une analyse CGH sans SNP nous recommandons l ADN g nomique humain m le R f Cat Enzo ENZ GEN106 et femelle R f Cat Enzo ENZ GEN107 2 Bain marie bloc de chauffage ou un incubateur fix 37 C et
14. re caus par un blocage insuffisant et ou des conditions de lavage inappropri es Des quantit s excessives d ADN marqu peuvent galement se traduire par un bruit de fond lev D excellents DLRs dans le rapport de contr le qualit de lPanalyse CGH mais certains oligos montrent un plissage ou un cart significatif du ratio log attendu Assurez vous que l ADN Cot 1 soit ajout en quantit suffisante Dig rez l ADN g nomique avec Alul et Rsal avant marquage peut galement aider avec ces d viations mineures Un Oligo Array jaune vif avec une amplitude r duite des variations pr vues Ceci peut tre d un manque d ADN Cot 1 des agents de blocage ou des conditions d hybridation et de lavage qui ne sont pas assez strictes Des scores DLRs lev s Les scores lev s de DLR peuvent tre caus s par le marquage d ADN amplifi Si l ADN est de mauvaise qualit l ADN amplifi peut tre utilis mais les r sultats ne seront pas de haute qualit Le marquage d ADN de pauvre qualit conduit souvent de meilleurs r sultats qu un marquage d ADN amplifi 200ng d ADN g nomique de bonne qualit suffisent pour le marquage 11 GE nzo Manue ANNEXE A Pr paration de l ADN marqu pour l hybridation sur des Oligo Arrays d Agilent 1 M langez les luats d ADN marqu la cyanine 3 et cyanine 5 Amenez le volume final des luats une fois combin s au volume sp cifi par Agilent pour l Oligo A
15. rray choisi avec de l eau exempte de nucl ase Remarque Si le volume des luats combin s plus l ADN Cot 1 d passe le volume sp cifi par Agilent pour l Oligo Array choisi le volume peut tre r duit par lyophilisation partielle dans un concentrateur centrifuge sous vide ou par pr cipitation l aide d ac tate de sodium thanol et reconstitution dans l eau Voir Annexe B Ajoutez l ADN Cot 1 les agents de blocage et le tampon d hybridation 2X comme indiqu par Agilent pour l Oligo Array choisi Effectuez la pr hybridation l hybridation le lavage de POligo Array et la num risation de celui ci comme indiqu par Agilent pour l Oligo Array choisi Remarque Utilisez la quantit d ADN Cot 1 recommand e par Agilent 12 Enzo Manue B Protocole de pr cipitation ac tate de sodium thanol pour l ADN Cot 1 1 Combinez les ADN marqu s et l ADN Cot 1 dans un tube s par d 1 5ml Ajoutez 1 10 me du volume soit 25ul d ac tate de sodium 3M pH 5 2 et 2 5 volumes soit 625ul d thanol a 100 glac Bien m langez et stockez la nuit 20 C ou 1 heure 70 C Centrifugez pendant 10 minutes 16 000 x g dans une microcentrifugeuse 4 C Retirez d licatement le surnageant ajoutez 500ul d thanol a 70 glac et centrifugez pendant 5 minutes 16 000 x g a temp rature ambiante Retirez d licatement le surnageant centrifugez pendant 1 minute et liminez le liquide r siduel
16. seule obligation d Enzo Life Sciences est de remplacer les produits la mesure du prix d achat Toutes r clamations doivent tre faites Enzo Life Sciences Inc dans les cinq jours suivant la r ception de la commande MARQUES ET BREVETS Plusieurs des produits d Enzo et les applications de ces produits sont couverts par des brevets aux tats Unis et l tranger et des brevets en instance Enzo et BIOSCORE sont des marques d Enzo Life Sciences Inc NOTE COMPLEMENTAIRE Le kit de marquage CGH pour Oligo Arrays contient de la cyanine 3 dUTP et de la cyanine 5 dUTP sp cialement d velopp es par Enzo Ces nucl otides sont pr par s en utilisant un nouveau groupe allylique r actif contenant un bras de liaison semi rigide pour la fixation directe du fluorochrome au nucl otide POUR UTILISATION EN RECHERCHE UNIQUEMENT L utilisateur est responsable de l obtention des autorisations n cessaires aupres des autorit s comp tentes avant toute utilisation en diagnostic Enzo Manuel TABLE DES MATIERES A eres ieai 2 R actifs Fournis et Stockage i 2 Avertissements et Pr cautions de S curit 3 Autres Mat riels N cessaires n 3 M thodes et Proc dures in 4 Quantit d ADN IEQUIS Lu 4 Isolation d ADN g nomique 5 Digestion et purification de ADN g nomique facultatif 5 Marquage de l ADN 7 Purif
17. su d passe 1cm Assurez vous que le tissu est dans le liquide tout moment M langez par inversion ne pas vortexer et incubez 38 40 C jusqu au lendemain Centrifugez vitesse maximale pendant une heure ou plus si le culot ne s est pas form Pipetez avec pr caution le surnageant Pour supprimer le NaSCN r siduel centrifugez a vitesse maximale pendant une minute puis d cantez Ajoutez 160ul de tampon ATL du kit QlAamp et 40ul de prot inase K 20mg ml du kit QlAamp vortexez pendant 15 secondes et incubez pendant une nuit 55 C Vortexez environ toutes les heures pendant la journ e Si la proc dure a t lanc e dans la matin e ajoutez un montant suppl mentaire de 20pl de prot inase K a la fin de la journ e Dans le cas contraire ajoutez 20ul suppl mentaire de prot inase K le lendemain matin Puis continuez l incubation 55 C toute l apres midi Vortexez le lysat pendant 15 secondes V rifiez que tout le tissu a t dig r Le lysat doit tre clair Si le tissu n est 14 Enzo pas dig r ajoutez 20ul suppl mentaires de prot inase K Centrifugez vitesse maximale pendant 1 minute 7 Incubez a 98 C pendant 10 minutes pour r duire l activit de la prot inase K Puis centrifugez a vitesse maximale pendant 1 minute 8 Ajoutez 200pl de tampon AL du kit QlAamp et vortexez pendant 15 secondes Puis ajoutez 200ul d thanol 96 100 et vortexez pendant 15 secondes Incubez temp
18. tez la r action en chauffant 65 C pendant 15 minutes e Pour la purification de l ADN dig r par Alul et Rsal nous recommandons l utilisation des colonnes de purification PCR amp Gel clean up R f Cat Enzo ENZ GEN100 Ne chargez pas les colonnes avec plus de 25pg d ADN par colonne D terminez la concentration et la puret de l ADN dig r en mesurant l absorbance 260nm et 280nm Nous recommander l utilisation du spectrophotom tre NanoDrop ND 1000 UV VIS ou quivalent Enzo Marquage de l ADN L ADN marqu est pr par par l incorporation de nucl otides conjugu s de la cyanine selon le mode op ratoire d crit ci dessous et r sum dans le tableau 1 la page 7 Pour chaque paire d ADN g nomique comparer marquer un chantillon la cyanine 3 et l autre la cyanine 5 Si une validation suppl mentaire est souhait e les marquages peuvent tre chang s lors d une exp rience en parall le ou ult rieure Tableau 1 Apercu du protocole de r action standard Etape Composant Condition Quantit 1 Ajoutez ADN 0 25 2 5ug jusqu 19pl 2 Ajoutez Tampon Amorces R action tube 1 20ul 3 Ajoutez Eau tube W Jusqu a 39ul 4 Incubez 99 C 10 minutes 5 Incubez Glace 5 minutes 6 Ajoutez M lange de Nucl otides tube 2 ou 3 10ul 7 Ajoutez ADN polym rase Klenow tube 4 1pl 8 Incubez 37 C 4 heures 9 Ajoutez Tampon Stop tube 5 Sul D naturez l

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