Conservation - Savyon Diagnostics
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1. 60 63x100 95 34 35x100 97 94 98x100 96 Tableau 6 Sensibilit et sp cificit du test Sero CP IgG compar au test MIF d un centre de r f rence Une tude a t r alis e dans un centre de r f rence pour les chlamydia La technique utilis e est une technique en MIF Les r sultats ainsi obtenus donnent n 176 patients une sensibilit de 96 15 une sp cificit de 100 Pr cisions Intra essai pr cision du SeroCP IgG est montr e ci dessous Positif N gatif Echantillon inati CV Positif 5 9 N gatif 10 0 165 6 4 10 Bibliography i M191 01F 05 10 13 Myhra W Mordhors C H Wang S P Grayston J T 1990 Clinical features of Chlamydia pneumoniae strain TWAR infection in Denmark 1975 1987 In Bowie WR Caldwell HD Jones RP et al eds Chlamydial infections Cambridge UK Cambridge University Press 422 425 Saikku P Leinonen M Tenkanen L Linnanmaki E Ekman M R Manninen V Manttari M Frick M H and Huttunen J K 1992 Chronic Chlamydia pneumoniae infection as a risk factor for coronary heart disease in the Helsinki heart study Ann Intern Med 116 273 278 Sarov l Kleinman D Cevenini R Hocberg G Potashnik G Sarov B and Insler V 1986 Specific IgG and IgA antibodies to Chlamydia trachomatis in infertile women In J Fertil 31 3 193 197 Campbell L A 1993 PCR detection of Ch2. 4 Tous les composants de la trousse ont t test s par lot Ne pas m langer les composants de diff rents lots et ne pas utiliser d l ments provenant d autres fournisseurs an et Stabilit des R actifs Tous les composants de la trousse doivent tre conserv s entre 2 8 C Dans ces conditions les r actifs non ouverts sont stables jusqu la date de p remption indiqu e sur l tiquette L exposition des composants munis de leur bouchon d origine ou sc ll s la temp rature ambiante durant quelques heures ne peut pas endommager les r actifs NE PAS CONGELER 2 Une fois le coffret ouvert les l ments se conservent pendant 90 jours 3 Le sachet d aluminium contenant les barrettes doit tre soigneusement referm sans oublier le sachet d shydratant 4 Diluer le tampon de lavage concentr au 1 20 dans l eau distill e Exemple pour une barrette pr parer 100ml de tampon de lavage 5ml de tampon de lavage concentr 95ml d eau distill e La solution reconstitu e est stable 21 jours 2 8 C Pr l vement des chantillons Recueillir les chantillons de s rum en respectant l asepsie Ne pas utiliser de s rums inactiv s par la chaleur ll est recommand de ne pas utiliser de s rums pr sentant une lip mie ou troubles Les particules et les pr cipit s contenus dans le s rum peuvent fausser les r sultats De tels chantillons doivent tre clarifi s par centrifugation ou filtrage avant analy
3. O savyonnacnosnics AE d REF A191 01M TM SeroCP IgG REF B191 01M Test ELISA pour la detection IVD d ti IgG C es anticorps lg gt anti Chlamydia pneumoniae dans le s rum humain Pour usage professionnel uniquement CE ass seroCP IgG Utilisation Le coffret SerocP est destin a la d tection des anticorps IgG sp cifiques de Chlamydia pneumoniae dans le s rum humain Le kit SeroCP IgG est un test immunoenzymatique utilisant un antig ne adsorb ELISA La trousse Savyon SeroCP IgG est utilis e comme aide dans le diagnostic d un infection a C pneumoniae Pour usage diagnostique in vitro Generalites Chlamydia pneumoniae TWAR est l un des agents infectieux associ de nombreuses pathologies incluant des infections du syst me respiratoire des voix basses et hautes 1 Bien que C pneumoniae puisse provoquer de graves infections telles que des pharyngites des sinusites des bronchites aigu s et des pneumonies communautaires la majorit des infections sont b nignes asymptomatiques et donc d un diagnostic difficile Ces infections si elles ne sont pas d cel es ni trait es peuvent conduire a des affections prolong es et persistantes Des tudes r centes montrent une association possible entre C pneumoniae et des infections chroniques 2 La pr valence des anticorps s riques de C pneumoniae chez les enfants d ge pr scolaire est faible et augmente jusqu 50 chez
4. 1 20 avec de l eau distill e Par exemple pour pr parer un litre de tampon de lavage ajouter 50m de tampon de ae lavage concentr a 950ml d eau distill e Conservation une fois dilu e la solution peut tre conserv e une temp rature comprise entre 2 et 8 C durant 21 jours maximum Note lors d une conservation au froid des cristaux peuvent se former dans le tampon de lavage concentr 20x Il s agit d un ph nom ne parfaitement normal Faire dissoudre ces cristaux en ramenant le tampon 37 C avant de le diluer 3 Incubation des chantillons de s rums et des contr les 3 1 Diluer chaque s rum analyser a 1 105 avec le diluant de s rum fourni comme suit Introduire 10ul de s rum 200ul de diluant de s rum 1 21 puis continuer la dilution en ajoutant 25ul de dilution 1 21 100ul de diluant de s rum 3 2 D poser 50ul de contr le positif liquide pr t l emploi 50ul de contr le n gatif liquide pr t l emploi et 50ul de s rum dilu au 1 105 dans des puits s par s Le contr le n gatif doit tre d pos dans deux puits s par s 3 3 Couvrir les plaques avec un couvercle pour plaque et mettre incuber durant 1h 37 C dans une chambre humide 3 4 Jeter le liquide contenu dans les puits 3 5 Etapes de lavage remplir ras bord chaque puit avec du liquide de lavage 300 3501 puis liminer ce liquide R p ter encore deux fois pour un total de trois tapes de lavage 3 6 Eli
5. indiquer une infection en cours ou chronique Le test SeroCPTM mis au point par Savyon Diagnostics Ltd est un test ELISA utilisant des corps l mentaires d antig nes de C pneumoniae TWAR 183 ce qui permet un diagnostic plus pr cis des anticorps sp cifiques de C pneumoniae Pour le diagnostic complet d une infection pr sente chronique ou pass e il est recommand de d terminer les anticorps IgG IgM et IgA sp cifique de C pneumoniae Dans le cas d une r infection le niveau des anticorps IgA et IgG augmente rapidement le plus souvent d s la premi re ou la deuxi me semaine 8 Principe du Test Des plaques de micro titration SeroCPTM sont enduites de corps l mentaires purifi s d antigenes de C pneumoniae TWAR 183 Le s rum a tester est dilu puis mis incuber dans les plaques pr enduites du test SeroCP Lors de cette tape Les anticorps sp cifiques de C pneumoniae de l chantillon de s rum vont se fixer aux antig nes immobilis s Les anticorps non sp cifiques sont limin s par lavage On introduit une IgG anti humaine conjugu e de la peroxydase de raifort HRP Durant cette tape le conjugu HRP va se fixer au complexe antig ne anticorps fix auparavant Le conjugu non li est limin par lavage L introduction de substrat de TMB provoque l hydrolyse du substrat par la peroxydase ce qui donne une solution bleue de substrat r duit On introduit la solution
6. les adultes Cependant la difficult d effectuer des pr l vements au niveau des sites infect s affecte les performances du d pistage direct de C pneumoniae Aussi la m thode utilis e en routine pour le diagnostic de C pneumoniae est la s rologie La s rologie est un outil non invasif pour le d pistage des infections chroniques C pneumoniae 3 pour lesquelles les m thodes de d pistage direct sont peu efficaces 4 Lors d une primo infection il se produit une r ponse rapide des anticorps IgM souvent en une ou deux semaines L apparition des isotypes IgG et IgA peut ne survenir que 6 8 semaines apr s Les anticorps IgM diminuent entre le 2 me et le 6 me mois apr s une infection aigu 5 Le taux des anticorps IgG augmente puis diminue lentement les anticorps IgA ont tendance dispara tre rapidement 6 En cas de r activation les anticorps IgM peuvent ne pas appara tre ou n appara tre qu un titre faible aussi l absence des anticorps IgM n exclue pas une infection en cours 7 Le taux des anticorps IgG et IgA augmente rapidement entre la premi re et la deuxi me 2 semaine qui suit une r activation 3 La persistance de taux lev en IgA peut tre le signe d une infection chronique C pneumoniae 6 Les anticorps IgG persistent longtemps et diminuent tr s lentement Leur pr sence indique un contact un moment ind termin avec le C pneumoniae Cependant des taux lev s peuvent
7. solution tampon pr te l emploi Contient moins de 0 05 de proclin comme conservateur 1 flacon de 60ml Diluant de conjugu vert solution tampon pr te l emploi Contient moins de 0 05 de proclin comme conservateur 1 flacon de 80ml Contr le n gatif s rum humain n gatif en IgG sp cifiques de C pneumoniae pr t l emploi Contient moins de 0 05 de proclin et moins de 0 1 d azide de sodium comme conservateur 1 flacon de 2 4ml Contr le positif s rum humain positif en IgG sp cifiques de C pneumoniae pr t l emploi Contient moins de 0 05 de proclin et moins de 0 1 d azide de sodium comme conservateur 1 flacon de 1 25ml Conjugu HRP concentr 300x IgG anti humaine sp cifique de la cha ne gamma conjugu e la peroxydase de raifort HRP Contient moins de 0 05 de proclin comme conservateur 1 flacon de 0 2ml 8 Substrat TMB solution pr te a l emploi Contient de la 3 3 5 5 t tram thylbenzidine comme chromog ne et du peroxyde comme substrat 1 flacon de 24ml 9 Solution d arr t solution pr te l emploi Contient de l Acide sulfurique dilu 1M H S0 1 flacon de 30ml 10 Couvercle de plaque 2 11 Manuel d instructions 1 Mat riel n cessaire mais non fourni Tubes essais et portoirs pour pr parer les dilutions des s rums de patients Flacon en plastique pour la dilution du HRP conjugu anti humaine IgG Micropipettes ou pipettes multi can
8. un r sultat n gatif et que les r sultats de l analyse des IgG reste identique valeur limite l chantillon doit tre consid r comme n gatif Une augmentation du titre au moins gale 40 entre le premier et le deuxi me pr l vement est en faveur d une infection en cours Os F L interpr tation des r sultats en fonction de la combinaison des anticorps IgG IgA et IgM est pr sent e au Tableau 2 Tableau 2 Interpr tation des r sultats en fonction de la combinaison des anticorps IgG IgA et IgM Taux d anticorps sp cifiques aux chlamydiae IgG IgM N gatif N gatif N gatif N gatif N gatif ou positif Positif Indication d une primo infection Positif Positif ou n gatif Positif Indication d une primo infection Interpr tation des r sultats Positif N gatif N gatif Indication d une infection en cours Ou pass e Positif ou limite Positif N gatif Indication d une infection en cours r cente ou chronique N gatif Positif N gatif Il est n cessaire de proc der d autres analyses l aide d une autre m thode s rologique L obtention de r sultats similaires pourrait alors indiquer une infection aigu ou en cours Limite de la technique 1 On ne peut tablir un diagnostic d finitif sur la base d une seule analyse s rologique Il convient de prendre en compte toutes les donn es cliniques et les r sultats de laboratoire 2 Les chantillons pr lev s
9. aux 5 50 50 200 et 200 1000 avec embouts jetables Tube volum trique de 1 litre Une fiole jaug e de 50ml Bouteille pour la solution de lavage Papier absorbant Agitateur vortex Bain Marie 37 C ou une chambre humide plac e dans un incubateur 37 C 10 Lecteur ELISA quip d un filtre 450nm 11 Eau distill e en bouteille OHmNOOR WH Pr cautions D emploi Diagnostique IN VITRO Ce kit contient des s rums humains qui ont t test s par des techniques approuv es par la FDA et CE lls ont t trouv s d pourvus d antigene HBs d ac VIH 1 et 2 et anti HCV Comme aucune technique ne peux garantir linnocuit absolue des mat riels test s ceux ci doivent donc tre manipul s comme potentiellement infectieux selon les recommandations publi es dans le manuel S curit biologique dans les laboratoires de microbiologie et de biologie m dicale 1988 de CDC NIH National Institute of Health Institut National de la Sant am ricain 2 La solution de substrat TMB est une substance irritante pour la peau et les muqueuses Eviter tout contact direct 3 Lacide sulfrique dilu 1M H SO est un agent irritant pour les yeux et la peau En cas de contact avec les yeux laver imm diatement et abandamment avec de l eau et consulter un sp cialiste Ne jamais verser de l eau dans ce produit En cas d accident ou de malaise consulter imm diatement un m decin si possible lui montrer l etiquette
10. d arr t la couleur bleue vire au jaune puis on la lit a l aide d un lecteur ELISA a une longueur d onde de 450nm L absorbance est proportionnelle la quantit d anticorps sp cifiques fix s aux antig nes de l enduit Sch ma de la proc dure du test SeroCP IgG Puits de plaque de micro titration Te d antig nes de C pneumoniae Introduction de 2 x 50ul de contr les n gatifs Introduction de 1 x 50ul de ue positif et de sp cimens dilu s Couvrir la plaque et laisser incuber 1h 37 C dans une chambre humide Laver 3 fois avec le en de lavage 300 3501 introduire 50ul de ir HRP dilu a 1 300 Couvrir la plaque et laisser incuber i h a 37 C dans une chambre humide Laver 3 fois avec le ee de lavage 300 3501 Introduire oni substrat TMB Couvrir la plaque et laisser incuber ae 15 mn a temp rature ambiante Ajouter 100ul si solution d arr t Lire ea a 450nm Calculer et interpr ter les r sultats Composition des Reactifs Coffret de 96 tests R f rence SAV 191 096 1 Plaque de micro titration enduite d antig nes de C pneumoniae 96 puits s cables enduits d antig nes de C pneumoniae plac s dans un sachet d aluminium contenant une carte de dess chant 1 plaque 2 Tampon de lavage concentr 20x tampon PBS Tween 1 flacon de 100ml 3 Diluant de s rum bleu solution tampon pr te l emploi Contient moins de 0 05 de proclin comme conservateur 1 flacon de 30ml 4 Diluant de conjugu ve
11. lamydia pneumoniae In Diagnostic Molecular Microbiology Principles and Applications Persing D H Smith T F Tenover F C and White T J Eds ASM Press pp 247 252 Henry Suchet J Askienazy Elbhar M Thibon M Revol C and Akue B A 1994 Post therapeutic evolution of serum chlamydia antibody titers in women with acute salpingitis and tubal infertility Fertility and Sterility 62 No 3 Saikku P Matila K Nieminen M S Huttunen J K Leinon M Eckman M R Makela P H and Valtonen V 1988 Serological Evidence of an Association of a Novel Chlamydia TWAR with Chronic Coronary Heart Disease and Acute Myocardial Infarction Lancet 2 983 986 Grayston J T Cambell L A Mordhorst C H Saikku P Thom D and Wang S P 1989 A New Respiratory Pathogen Chlamydia pneumoniae Strain TWAR J Inf Dis 161 618 625 Saikku P Leinonen M Tenkanen L Linnanmaki E Ekman M R Mannin V Manttari M Frick M H and Huttunen J K 1992 Chronic Chlamydia pneumoniae Infections as a Risk Factor for Coronary Heart Disease in the Helsinki Heart Study Ann of Int Med 116 273 278 del EE SAVYON DIAGNOSTICS Ltd Obelis s a European Authorized Representative 3 Habosem St Ashdod 77610 Israel Boulevard G n ral Wahis 53 1030 Brussels Belgium Tel 32 2 732 59 54 Fax 32 2 732 60 03 Tel 972 8 8562920 Fax 972 8 8523176 e mail mail obelis net e mail support savyondiagnostics com
12. miner le liquide r siduel en tapotant doucement la plaque sur du papier absorbant propre 4 Incubation avec le conjugu 4 1 Peu avant de l utiliser diluer le concentr de conjugu HRP pour obtenir la solution voulue Diluer le concentr de conjugu HRP au 1 300 avec le diluant de conjugu Par exemple pour deux barrettes pr parer un minimum de 3ml de conjugu HRP dilu m langer 10ul de concentr de conjugu HRP 3ml de diluant de conjugu bien m langer 4 2 D poser 50ul de conjugu dilu dans chaque puits 4 8 Couvrir les plaques avec un couvercle pour plaques et mettre incuber durant 1 heure 37 C dans une chambre humide 44 Jeter le liquide contenu dans les puits et laver comme d crit l tape 3 5 45 Eliminer le liquide r siduel en tapotant doucement la plaque sur du papier absorbant propre 5 Incubation avec du substrat TMB Note le substrat TMB est pr t l emploi 5 1 D poser 100ul de substrat TMB dans chaque puits Couvrir les plaques avec un couvercle pour plaques et mettre incuber durant 15 minutes temp rature ambiante 5 2 Arr ter la r action en introduisant 100pl de solution d arr t 1M H SO dans chaque puits 6 D termination des r sultats Essuyer soigneusement le dessous de la plaque v rifier l absence de bulles d air dans les puits et lire 450nm dans les 30 minutes qui suivent l arr t de la r action oe Crit res d acceptabilite du test Le test peut tre
13. rt solution tampon pr te l emploi Contient moins de 0 05 de proclin comme conservateur 1 flacon de 40ml Contr le n gatif s rum humain n gatif en IgG sp cifiques de C pneumoniae pr t l emploi Contient moins de 0 05 de proclin et moins de 0 1 d azide de sodium comme conservateur 1 flacon de 2 5 ml Contr le positif s rum humain positif en IgG sp cifiques de C pneumoniae pr t l emploi Contient moins de 0 05 de proclin et moins de 0 1 d azide de sodium comme conservateur 1 flacon de 2 0ml Conjugu HRP concentr 300x IgG anti humaine sp cifique de la cha ne gamma conjugu e la peroxydase de raifort HRP Contient moins de 0 05 de proclin comme conservateur 1 flacon de 0 2ml Substrat TMB solution pr te l emploi Contient de la 3 3 5 5 t tram thylbenzidine comme chromog ne et du peroxyde comme substrat 1 flacon de 14ml 9 Solution d arr t solution pr te l emploi Contient de l acide sulfurique dilu 1M H SO 1 flacon de 15ml 10 Couvercle de plaque 1 11 Manuel d instructions 1 Coffret de 192 tests R f rence SAV 191 192 Plaque de micro titration enduite d antig nes de C pneumoniae 96 puits s cables enduits d antig nes de C pneumoniae plac s dans un sachet d aluminium contenant une carte de dess chant 2 plaques Tampon de lavage concentr 20x tampon PBS Tween 2 flacons de 100ml Diluant de s rum bleu
14. se Conservation Les chantillons tester peuvent tre conserver 7 jours 2 8 C rajouter de de l azide de sodium 0 1 Si le dosage est pr vu dans un d lai plus long conserver les pr l vements 20 C Il est recommand de ne pas effectuer des d cong lations successives pour cela fractionner le s rum en plusieurs aliquots R alisation du test Manuelle Proc dure sur automate disponible sur demande 1 Amener tous les r actifs et les chantillons cliniques analyser temp rature ambiante Bien m langer le contr le positif le contr le n gatif et les chantillons avant usage 1 1 D terminer le nombre total d chantillons analyser Outre les chantillons inclure les r actifs suivants dans chaque analyse deux puits pour le contr le n gatif et un puits pour le contr le positif 1 2 Retirer la plaque de micro titration de son sachet d aluminium en coupant l extr mit du sachet pr s de la partie scell e Laisser le nombre de barrettes voulues dans le portoir de 96 puits Conservation les barrettes non utilis es doivent tre replac es dans le sachet d aluminium avec le dess chant puis sceller le sachet en roulant l extr mit ouverte et en collant un ruban adh sif sur toute la longueur de l ouverture Note la dur e de conservation des plaques une fois replac es dans un sachet scell est de 90 jours dater du jour de premi re ouverture 2 Diluer le tampon de lavage concentr
15. trop t t lors d une primo infection peuvent ne pas contenir d anticorps d celables Si l on soup onne une infection chlamydiae effectuer un deuxi me pr l vement 14 21 jours plus tard et proc der une nouvelle analyse 10 Performances Caract ristiques Tableau 3 Sensibilit du test SeroCP IgG pour des populations choisies compar un test MIF du commerce L tude a t men e par un laboratoire de r f rence sur des patients atteints d affections respiratoires chez lesquels on soupconnait une infection C pneumoniae Population test e N des SeroCP MIFCp IgG Sensibilit s rums Patients positifs au 28 test PCR Enfants souffrant de pneumonie Enfants avec titre d IgG lev par test MIF Tableau 4 Sp cificit du test SeroCP IgG pour une population saine compare un test MIF du commerce L tude a t men e sur 35 chantillons de s rum provenant d enfants ne pr sentant pas d anticorps IgG sp cifiques ni de C pneumoniae ni de C trachomatis r sultat obtenu par test MIFCp et MIFCt MIFCp IgG SeroCP IgG Sp cificit Pos Pos 0 0 Neg 35 j 34 35 x 100 97 Tableau 5 Sensibilit et sp cificit du test SeroCP IgG compar au test SeroFlA MIF Savyon L tude portait sur une population de 98 s rums SeroCP IgG Sp cificit Sensibilit Concordance
16. valid d apr s les conditions suivantes Si ces conditions ne sont pas remplies le test doit tre refait 1 Contr le Positif La valeur d absorbance du contr le positif doit tre gt 0 8 450nm 2 Contr le N gatif La valeur d absorbance du contr le n gatif effectu en double doit tre ntre 0 1 lt NC lt 0 4 450nm Calcul de la valeur seuil COV et de l index COI La valeur seuil COV est calcul e selon la formule suivante COV NC x 2 NC Moyenne des absorbances du contr le n gatif pass en double exemplaire 450nm Pour normaliser les r sultats obtenus nous vous conseillons de rendre les r sultats en index COI en calculant tout simplement un ratio COI Absorbance de I chantillon 450nm D O COV Interpr tation des R sultats Tableau 1 Correlation entre l absorbance 450nm et la pr sence des anticorps IgG C pneumoniae Absorbance a 450nm R sultats D O lt COV N gatif Pas d anticorps IgG sp cifiques de C pneumoniae d celables COV lt D O lt COV x 1 1 Valeur limite Pr sence de taux faibles d anticorps IgG sp cifiques de C pneumoniae 1 D O gt COV x 1 1 Positif Taux d celables d anticorps IgG sp cifiques de C pneumoniae 1 Note Il convient d effectuer une analyse des anticorps IgA et IgM ou d analyser un second chantillon de s rum pr lev 14 21 jours apr s le premier test Si l analyse des IgA et des IgM donne
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