Contrôles PeliCluster
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1. Sanquin Reagents Plesmanlaan 125 1066 CX Amsterdam The Netherlands Phone 31 20 512 3599 Fax 31 20 512 3570 E mail reagents sanquin nl Website www sanquinreagents com Contr les PeliCluster R actifs l anticorps monoclonal murin conjugu utiliser comme contr le n gatif Forme Clone IgG1 FITC M1453 CLB 203 IgG1 PE M1628 CLB 203 IgG2a FITC M1454 CLB 713 IgG2a PE M1697 CLB 713 IgG2a PE Cy5 M1748 UPC 10 IgG2b FITC M2190 Gc198 IgG2b PE M2230 Gc198 X0033 513fra 2103061215 m ce 1 INDICATION Les anticorps murins PeliCluster sont con us pour le diagnostic in vitro en tant que r actifs de contr le n gatif pour cytom trie de flux Pour viter toute interf rence avec les rythrocytes pendant l analyse le traitement par r actif PeliLyse du sang complet num ro de r f rence M7101 6 est recommand Le cytom tre de flux doit tre quip pour d tecter la diffusion de la lumi re et la fluorescence appropri e et quip du logiciel ad quat pour l acquisition et l analyse des donn es Se r f rer au manuel d utilisation de l instrument Applications valuation de la fixation non sp cifique d anticorps monoclonaux murins aux antig nes de surface des cellules sanguines humaines dans une cytom trie de flux 2 COMPOSITION Le clone CLB 203 a t d riv partir d un luide d ascites provenant de souris porteuses de tumeur et appartient une sous classe d IgG1 muri2. l abri de la lumi re Ne pas utiliser au del de la date de p remption Ne pas congeler le r actif ni l exposer la lumi re directe lors de son stockage ou de l incubation avec des cellules Conserver le flacon de r actif sec Ne pas utiliser les r actifs en cas de signe de d t rioration augmentation de compensation ou perte importante de r activit 4 REACTIFS OU MATERIEL NECESSAIRES MAIS NON FOURNIS Solution de lyse PeliLyse num ro de commande M7101 6 Tampon de lavage et de dilution pour cellules mononucl es solution saline tamponn e au phosphate contenant 0 2 d ASB p v PBS ASB Tampon de lavage et de dilution pour plaquettes Tampon Sequestrine Seq conservation 1 mois entre 2 et 8 C Solution m re 10 x dissoudre dans un litre d eau distill e Na2HPO4 H20 31 3 g Na2EDTA 2H20 33 3 g NaCl 90 0 g Avant utilisation diluer dans de l eau distill e ajouter de l ASB jusqu une concentration finale de 0 2 p v M langer et ajuster le pH 6 8 Tampon de fixation PFA ASB Paraformald hyde 1 dans PBS contenant 0 2 d ASB pH 7 2 Plaques micropuits 96 puits fond en V ou tubes en plastique pour cytom trie de flux Cytom tre de flux Se r f rer au manuel d utilisation de l instrument pour plus d informations La proc dure utilise un fixatif le formald hyde Eviter tout contact avec la peau ou les muqueuses 5 ECHANTILLON S Les ch
3. lyse soit termin e 7 Analyser les chantillons dans les 90 minutes qui suivent w Si l analyse ne peut tre effectu e dans les 90 minutes centrifuger les tubes 500 x g pendant 5 minutes Aspirer le surnageant du pellet de cellules et remettre les cellules en suspension dans 1 ml de tampon pour une analyse dans les 8 heures ou dans 1 ml de PFA 1 Sanquin Reagents recommande de pratiquer ensuite l analyse dans les 24 heures Cette m thode a t mise au point pour les chantillons sanguins pr sentant une num ration leucocytaire normale et en utilisant PeliLyse A1 solution de lyse num ro de r f rence M7101 6 Il peut tre n cessaire d ajuster la quantit de sang pour des chantillons pr sentant une num ration leucocytaire tr s lev e ou tr s basse C Cytom trie de flux et microscopie de la membrane plaquettaire 1 Transf rer 45 ul de suspension plaquettaire 1 x 10 cellules ml sur la plaque micropuits ou dans des tubes puis ajouter 5 ul d anticorps monoclonal M langer doucement puis incuber pendant 30 minutes entre 2 et 8 C 2 Rincer en m langeant puis en ajoutant un tampon Sequestrine Seq la plaque micropuits 150 yl au premier lavage 200 l au second ou aux tubes 2 ml Centrifuger 1000 x g pendant 5 minutes aspirer le surnageant puis renouveler une fois cette proc dure 3 Pr parer les cellules pour l analyse Pour la cytom trie de flux remettre les cellul
4. de cellules suspension trop faible de chantillon frais une concentration plus lev e refaire la coloration et analyse Mauvais D panner fonctionneme l instrument nt du cytom tre BIBLIOGRAPHIE 1 Clinical Applications of Flow Cytometry Quality Assurance and Immunophenotyping of Lymphocytes Approved Guideline Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H42 A 2 Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture Fourth Edition Approved Standard Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1998 NCCLS document H3 A4 3 Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue Tentative Guideline Villanova PA National Committee for Clinical Laboratory Standards 1991 NCCLS document M29 T2 4 Centers for Disease Control Update universal precautions for prevention of transmission of human immunodeficiency virus hepatitis B virus and other bloodborne athogens in health care settings MMWR 1988 37 377 388 5 Nicholson JK Browning SW Orloff SL McDougal JS Inactivation of HIV infected H9 cells in whole blood preparations by ysing fixing reagents used in flow cytometry J Immunol Methods 1993 160 215 218 6 Jackson AL Warner NL Preparation staining and analysis by flow cytometry of peripheral blood leukocytes Rose NR Friedman H Fahey JL
5. eds Manual of Clinical Laboratory Immunology 3 ed Washington DC American Society for Microbiology 1986 226 235
6. reproductibilit intra chantillon Tableau 2 R p tabilit de l intensit de fluorescence moyenne de cellules cibles dans des lots diff rents N et pour des donneurs multiples N Intensit de Ecart type CV fluorescence group group moyenne IgG1 FITC 4 9 55 0 80 8 4 IgG1 PE 5 18 83 2 33 12 4 IgG2a FITC 3 19 60 0 91 9 5 IgG2a PE 3 18 42 2 30 27 3 IgG2a PE Cy5 9 10 28 1 05 10 2 IgG2b FITC 3 10 30 1 82 17 6 IgG2b PE 3 125 3 14 8 58 6 N nombre d chantillons 8 LIMITES Les conjugu s avec des fluorochromes plus brillants PE PE Cy5 donnent une s paration plus importante que les conjugu s avec d autres colorants FITC Lorsque les populations se chevauchent le calcul du pourcentage positif pour les marqueurs peut tre affect par le choix du fluorochrome L utilisation d anticorps dans le cadre du traitement du patient peut interf rer avec la reconnaissance d antig nes cible par des r actifs CD Cela doit tre pris en compte lors de l analyse d chantillons de patients trait s de cette mani re Sanquin Reagents n a pas caract ris l effet de la pr sence d anticorps th rapeutiques sur les performances de ce r actif Comme les r actifs peuvent tre utilis s dans diff rentes associations les laboratoires doivent se familiariser avec les propri t s de chaque anticorps en association avec d autres marqueurs dans des chantillons
7. ORMANCES Sp cificit L anticorps monoclonal avec la sous classe d IgG1 clone CLB 203 est dirig contre des allerg nes v g taux Il n y a pas de r activit avec les cellules sanguines humaine et les immunoglobulines L anticorps monoclonal avec la sous classe d IgG2a clone CLB 713 est isol partir d une souris non immunis e Il n y a pas de r activit avec les cellules sanguines humaine et les immunoglobulines L anticorps monoclonal avec la sous classe d IgG2b clone GC198 r agit avec la prot ine de la membrane plasmique de certaines souches de gonorrh e Neisserria Aucune r action n a t observ e la surface des cellules humaines ni avec les composants plasmatiques Cependant il se peut qu il y ait une fixation sur les r cepteurs Fc Reproductibilit R p tabilit Pour d terminer la r p tabilit de la coloration avec chaque r actif les chantillons ont t color s avec plusieurs lots de r actifs Les diff rents chantillons utilis s pour l valuation ont donn une valeur d intensit de fluorescence moyenne pr sent e dans le tableau 2 Pour chaque chantillon deux lots diff rents de r actifs ont g n r une paire de r sultats Les carts type individuels ont t d termin s partir des r sultats group s en paire de chaque chantillon Les carts type ont t combin s pour d river un cart type group pour chaque r actif qui fournit une estimation de la
8. antillons de sang peuvent tre pr par s pour l analyse par cytom trie de flux en utilisant des proc dures de pr paration de CMSP La pr paration des CMSP donne des r sultats qui d pendent plus de la technique tn Pr lever le sang de mani re aseptique par ponction veineuse 1 2 dans des tubes de recueil de sang st riles KsEDTA Au moins 1 ml de sang complet est n cessaire pour la m thode sur sang complet et au moins 2 ml de sang complet sont n cessaires pour la pr paration des CMSP Conserver le sang anti coagul temp rature ambiante 18 25 C AVERTISSEMENT Consid rer tous les chantillons biologiques ainsi que le mat riel qui entre en contact avec eux comme pr sentant un risque biologique Les chantillons doivent tre manipul s comme des chantillons potentiellement infectieux 3 4 et limin s en appliquant les pr cautions n cessaires conform ment aux r glementations f d rales d tat et locales Ne pas pipeter la bouche Porter des v tements et des gants de protection adapt s Il a t rapport que la fixation d sactive le VIH 5 6 Proc dures A M thode avec cellules purifi es ficoll 1 Pr parer une suspension de cellules mononucl es une concentration de 1 x 107 cellules ml 2 Ajouter 40 ul de suspension de cellules dans des puits de microtitration ou des tubes 3 Ajouter 10 ul des anticorps non dilu s aux puits de microtitration ou aux tubes et m langer douce
9. es en suspension en ajoutant 200 yl de Seq la plaque micropuits ou aux tubes En cas d utilisation d une plaque micropuits le contenu est transf r dans des tubes appropri s Pour une microscopie fluorescence remettre les cellules en suspension dans 50 ul de produit d inclusion transf rer les cellules sur une lame de microscope puis d poser une lame de protection En r gle g n rale il est possible d utiliser 5 yl d anticorps monoclonal non dilu Alternativement il est possible de d terminer une dilution optimale Il est n cessaire de toujours utiliser un contr le n gatif de m me isotype pour d terminer la fluorescence d arri re plan R sultats de l analyse Une fluorescence obtenue l aide de ces contr les n gatifs atteste de la pr sence d une certaine fixation asp cifique d anticorps murins l chantillon de cellules qui ne doit pas affecter plus de 5 des cellules compt es Cytom trie de flux Agiter les cellules soigneusement faible vitesse pour limiter l agr gation avant de faire passer les cellules sur le cytom tre de flux 6 Acqu rir et analyser les donn es en mode liste l aide d un logiciel appropri Avant l acquisition des chantillons ajuster le seuil pour minimiser les d bris et assurer que les populations concern es sont incluses La figure 1 pr sente des donn es repr sentatives obtenues sur des lymphocytes tri s Excitation du laser 488 nm 7 PERF
10. ment 4 Incuber pendant 30 minutes entre 2 et 8 C 5 Ajouter 150 ul de tampon aux puits de microtitration ou 2 ml de tampon aux tubes et centrifuger 500 x g pendant 5 minutes 6 Aspirer le surnageant du pellet de cellules et remettre les cellules en suspension 7 Ajouter 200 ul de tampon aux puits de microtitration ou 2 ml de tampon aux tubes et centrifuger 500 x g pendant 5 minutes 8 Aspirer le surnageant du pellet de cellules et remettre les cellules en suspension 9 Analyse sur cytom tre de flux Ajouter 200 yl de tampon aux puits de microtitration et transf rer cette suspension finale de cellules dans des tubes essai appropri s ou ajouter 200 ul de tampon dans les tubes 10Si l analyse ne peut tre pratiqu e dans les huit heures qui suivent ajouter 200 ul de PFA 1 au lieu de tampon au point 9 Sanquin Reagents recommande de pratiquer ensuite l analyse dans les 24 heures B M thode sur sang total 1 Pr lever le sang dans un tube de recueil de sang contenant de l EDTA 2 Verser 100 l de sang complet soigneusement m lang au fond de chaque tube essai Ajouter 10 ul des anticorps non dilu s au fond du tube essai et m langer fermement pendant 30 secondes 4 Incuber pendant 15 30 minutes temp rature ambiante 5 M langer les tubes et ajouter 2 ml de solution de lyse PeliLyse A1 dilu e 10 x 6 Incuber pendant 10 15 minutes temp rature ambiante jusqu ce que la
11. nes L anticorps est conjugu isom re 1 de l isothiocyanate de fluoresc ine FITC Le rapport molaire F P est compris entre 5 et 10 L anticorps est conjugu s par ment la phyco rythrine R PE Le rapport molaire F P est compris entre 1 0 et 2 0 Le clone 713 a t d riv partir d un fluide d ascites provenant de souris porteuses de tumeur et appartient une sous classe d IgG2a murines L anticorps est conjugu l isom re 1 de l isothiocyanate de fluoresc ine FITC Le rapport molaire F P est compris entre 5 et 10 L anticorps est conjugu s par ment la phyco rythrine R PE Le rapport molaire F P est compris entre 1 0 et 2 0 Le clone UPC 10 a t d riv partir d un luide d ascites provenant de souris porteuses de tumeur et appartient une sous classe d IgG2a murines L anticorps est conjugu un colorant tandem constitu de phyco rythrine R i e de mani re covalente de la cyanine 5 1 Le rapport molaire F P est compris entre O 7 et 1 0 Le clone GC198 a t d riv partir d un fluide d ascites provenant de souris porteuses de tumeur et appartient une sous classe d IgG2b murines L anticorps est conjugu l isom re 1 de l isothiocyanate de fluoresc ine FITC Le rapport molaire F P est compris entre 5 et 10 L anticorps est conjugu s par ment la phyco rythrine R PE Le rapport molaire F P est compris entre 1 0 et 2 0 Les antic
12. normaux et anormaux Les performances des r actifs ont t classiquement valu es sur sang trait l EDTA Les performances des r actifs peuvent tre affect es par l utilisation d autres anticoagulants DEPANNAGE Probl me Cause Solution possible Faible Interaction Pr parer et distinction avec d autres colorer un entre les cellules et autre d bris et les avec les chantillon lymphocytes plaquettes Mauvaise V rifier la manipulation viabilit des de la cellules pr paration de centrifuger cellules es cellules une vitesse lus faible R glage Respecter les inad quat de proc dures l instrument de r glage de instrument optimiser les r glages de instrument selon les besoins Coloration Concentration V rifier et faible ou de cellules ajuster la diminuant trop forte lors concentration de l tape de de cellules ou coloration e volume de chantillon colorer avec de chantillon frais Quantit Refaire la insuffisante de coloration en r actif utilisant une quantit plus importante d anticorps Cellules non R p ter la analys es coloration dans les 8 avec de heures suivant l chantillon la coloration frais analyser rapidement Pr paration Utiliser du incorrecte du conservateur milieu oubli dans le milieu du de coloration conservateur et lors des tapes de avage Peu ou pas Concentration Remettre en de cellules
13. orps ont t purifi s par chromatographie sur colonne chromatographie par change d ions et ou chromatographie d affinit Ingr dients du r actif Les r actifs sont fournis dans 1 ml de tampon TRIS 20 mM et NaCI 150 mM pH 8 0 ou une solution saline tamponn e au phosphate PBS contenant de l ASB 1 w v et ou une autre prot ine stabilisante et du NaNs 0 1 p v servant de conservateurs voir le tableau 1 La concentration et le rapport F P de nos contr les ont t ajust s selon nos anticorps monoclonaux Tableau 1 Contenu des flacons FITC 100 tests par ml dans du TRIS PE 100 tests par ml dans du TRIS PE Cy5 100 tests par ml dans du PBS AVERTISSEMENT L azide de sodium est nocif s il est ing r R22 Conserver hors de port e des enfants S2 Conserver l cart de tout aliment boisson et aliment pour animaux S13 Porter des v tements de protection adapt s S36 En cas d ingestion consulter imm diatement un m decin et lui montrer cette bo te ou la notice S46 Le contact avec des acides lib re un gaz tr s toxique R32 Les compos s d azide doivent tre limin s avec de grandes quantit s d eau afin d viter des d p ts sur les conduites de plomb ou de cuivre qui constituent des risques d explosion 3 CONSERVATION ET MANIPULATION Le r actif est stable jusqu la date de p remption imprim e sur l tiquette lorsqu il est conserv entre 2 et 8 C
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